CN101220367B

CN101220367B - 红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列及其应用

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Publication number: CN101220367B
Application number: CN2008100521944A
Authority: CN
Inventors: 李明春; 朱玥明; 王宇凡; 魏东盛; 邢来君; 张峻; 陈晓云; 陈颖; 齐欣; 魏雪生
Original assignee: Nankai University; Tianjin Forestry and Fruit Tree Institute
Current assignee: Nankai University; Tianjin Forestry and Fruit Tree Institute
Priority date: 2008-01-29
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2028-01-29
Also published as: CN101220367A

Abstract

本发明涉及一种从红色亚栖热菌中分离的编码海藻糖合酶的核苷酸序列及其应用。它是SEQID NO：1所示的核苷酸序列或编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列及其多肽。本发明包括编码海藻糖合酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行功能性表达的重组表达载体以及含有本发明重组表达载体的大肠杆菌细胞及其后代细胞。用上述的核苷酸序列或多肽序列或含有本发明重组表达载体的大肠杆菌细胞及其后代细胞生产海藻糖的方法。

Description

红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列及其应用

【技术领域】：本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及从一种嗜热菌-亚栖热菌属的红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)中克隆海藻糖合酶基因，具体讲是红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列及其应用。将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码海藻糖合酶产生海藻糖的方法和应用。

【背景技术】：海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷链相连而成的非还原性双糖，广泛地存在于微生物、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、虾类、昆虫、植物等，特别是在那些能抗脱水作用的生物中起着重要作用。海藻糖具有独特的生物学功能，能够对生物大分子起到一定的保护作用。研究表明，海藻糖可以提高生物体对脱水、干旱、高温、冷冻和渗透压的抗性，该性质使其在生物制品、食品、医药、化妆品、作物育种及精细化工等领域广阔的应用前景日益显现。如，用海藻糖保护的血液制品、菌苗、疫苗、抗体、激素、酶等生物制品在常温下存放即可，无需冷冻保存，待复水后均能恢复活力，这给生物制品的保存、运输与使用带来极大的方便；在食品加工过程中，由于海藻糖保护蛋白质、脂类物质、多糖类成分等在低温、高温两种极端条件下不受破坏，因此可广泛地应用于海产品的速冻保鲜、便携式食品的干燥加工、奶制品的高温喷雾干燥等，经这些加工过程后食品的原有风味基本不变；以海藻糖对小麦、水稻幼苗和大豆等农作物进行处理，可提高农作物的耐旱、抗寒及耐盐性；用于化妆品可保护皮肤免受日晒和冷冻伤害，也可防止皮肤干燥；此外，用海藻糖代替常用的血浆作为生物制品的稳定剂，还可防止因血液污染而引起的乙肝和艾滋病的传播，保证生物制品的质量和安全性。但生物体内海藻糖的含量甚微，过去主要是从干酵母中提取，由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用。随着人类社会的发展和进步，海藻糖的应用领域会更加广泛，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。

株式会社林原生物化学研究所在中国专利CN1106065A(1995年)中讲述了一种海藻糖制造方法。该法从Pimelobacter、Psceudomonas和Thermus三种菌属中分离纯化了海藻糖合酶(trehalosesynthase，TreS)，该酶能够以麦芽糖为原料制成海藻糖。这为廉价制造适合应用于食品、农业等需量大的领域的低价位海藻糖产品提供了极大的可能性。1996年，株式会社林原生物化学研究所的K.Tsusaki等人披露了克隆自Pimelobacter sp R48和Thermus aquaticus的海藻糖合酶基因的DNA序列及其构成该酶的氨基酸序列(K.Tsusaki，etal.，1996，Biochim.Biophys.Acta，1290：1-3；K.Tsusaki，etal.，1997，Biochim.Biophys.Acta，1334：28-32)。2000年，De Smet等人通过生物信息学的方法从测序完成的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis CDC1551)的基因组中分离，鉴定了海藻糖合酶基因(K、A、L、De Smet etal.，2000.Microbiology，146：199-208)。发现它与来自Pimerlobacter sp R48的TRES在组成该酶的氨基酸序列有70％的同源性，而DNA水平上的同源性为69％，分离自Thermusaquaticus(水栖嗜热菌)的海藻糖合酶是一种大分子酶蛋白，由963个氨基酸的单键多肽组成。Thermus aquaticus的海藻糖合酶与Pimerlobacter sp R48的海藻糖合酶的氨基酸序列的同源性是55％，而DNA的同源性是36.4％。来自ThermuscaldophilusGK24的海藻糖合酶与Thermus aquaticus的非常相似。它由965个氨基酸组成，两者的氨基酸同源性为99％，DNA的同源性为98.9％，很可能是在进化进程中基因平移(genelateral transfer)造成的结果。

【发明内容】：本发明的目的之一是提供从亚栖热菌属的红色亚栖热菌中分离的编码海藻糖合酶的核苷酸序列。

本发明的目的之二是提供该核苷酸序列所编码的海藻糖合酶多肽。

本发明的目的之三是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能性表达的重组表达载体。

本发明的目的之四是提供含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代。

本发明的目的之五是提供一种用含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞或该核苷酸序列所编码的海藻糖合酶多肽制备海藻糖的方法。

本发明的目的之六是提供一种获得基因侧翼未知序列的方法。

本发明第一方面提供的是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

分离的海藻糖合酶基因的核苷酸序列，它选自下组的一种核苷酸序列：(1)编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；(2)与核苷酸序列(1)互补的核苷酸序列。准确地，该核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供分离的上述核苷酸序列所编码的多肽，该多肽是SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

本发明提供了一种新的分离的核苷酸序列-即编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列，是由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的，其特征是：该序列长为2892bp(碱基)。

本发明还提供了由编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的活性多肽分离的核苷酸序列，具体地，本发明的核苷酸序列是SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

编码SEQ ID NO：2活性多肽的核苷酸序列包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明的核苷酸序列可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或是简并的变异体。

本发明中的多肽和核苷酸序列优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。本发明涉及一种获得已知基因侧翼未知序列的新方法。该方法通过构建红色亚栖热菌的基因组文库，利用混合质粒PCR筛选的方法获得红色亚栖热菌的海藻糖合酶的全长基因。

本发明还提供了一种新的多肽序列-红色亚栖热菌海藻糖合酶的氨基酸序列，其基本上是由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物)细胞中产生。

本发明的第三、第四方面，提供了含有上述基因核苷酸序列的重组表达载体，以及被上述核苷酸序列或重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。这些宿主细胞包括细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞。

本发明也涉及含有编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列和外源性调节序列元件结合进行功能性表达的重组表达载体。能够影响基因表达产物的序列元件包括有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等[Sambroook，et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989]。所述的编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的P_L启动子：真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录。如腺病毒增强子。

本发明还涉及用含有本发明编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列的重组表达载体或直接用编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列经基因工程产生的宿主细胞。本发明中，编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组表达载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组表达载体的基因工程化宿主细胞。宿主细胞的代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组表达载体转化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域是众所周知的。也可用MgCl₂，电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。

本发明还涉及用上述转基因宿主细胞生产海藻糖的方法，根据宿主细胞，用本领域技术人员所共知的方法生长或培养。比如微生物细胞通常是在0-100℃，优选10-60℃，同时还要氧气。培养基中含有碳源，如葡萄糖；氮源，通常是有机氮的形式，如酵母提取物、氨基酸；盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、镁盐；如果需要的话还有维生素。在此期间培养基的pH可以保持固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以分批培养、半不连续培养或连续培养形式进行。在培养之后，收集细胞，破碎或直接使用，通过本领域技术人员熟知的方法从细胞中提取海藻糖。

本发明的第五方面，提供了一种用含有该基因的核苷酸序列、或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞、或用该核苷酸序列所编码的海藻糖合酶多肽制备海藻糖的方法。

该方法是这样实现的，将麦芽糖与SEQ ID NO：2一起培养，即可将麦芽糖转化为海藻糖。

本发明还涉及用上述方法制备海藻糖，以及将其应用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品用途。

本发明的第六方面，提供了一种通过构建细胞基因组DNA文库，利用混合质粒PCR筛选的方法获得已知基因片段侧翼未知序列的方法。具体方法简述如下：提取红色亚栖热菌基因组DNA，随机断裂为3-5kb的片段，将这些片段连接于SmaI酶切的pUC18载体，连接产物转化大肠杆菌DH5a。用牙签将转化子转接到LB培养基平板，每个转化子同时接到两块平板上，每块平板含有96个转化子(12×8)，并确保每个转化子在平板上的位置相同。这两块平板其中一块用于混合质粒筛选，另一块为保留板。将筛选平板上的96个转化子分为4个部分(每部分12×2)，用无菌水将每部分培养基上的所有菌落冲下，并混合均匀，提取混合质粒。根据已知的红色亚栖热菌的海藻糖合酶序列设计相应引物，对混合质粒进行PCR。如果结果阳性则说明该混合质粒中可能含有未知的海藻糖合酶的侧翼序列。进而提取保留平板对应位置的所有转化子质粒，用该引物按上述条件进行PCR扩增，具有阳性结果的质粒可能含有未知的海藻糖合酶的侧翼序列。

本发明的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明所涉及的技术术语的含义：

“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列和多肽是没有分离纯化的，但同样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。

“分离的核苷酸序列”是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化的。

“编码红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列”是指包括编码红色亚栖热菌海藻糖合酶多肽的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列。

“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。

“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

本发明的优点和积极效果：

本发明获得了红色亚栖热菌的海藻糖合酶基因，并将其克隆表达于大肠杆菌细胞中。由于该酶来源于一种嗜热菌，对高温有一定的耐受性。这对通过基因重组和表达技术的大规模工业化生产十分有利，有很强的竞争力。

【附图说明】：

图1是混合质粒PCR筛选基因组文库方法中96接种平板图。

图2是显示所构建的大肠杆菌重组表达载体pET21TreS。

图3A是显示麦芽糖、海藻糖标准物的高效液相色谱图。

图3B是含pET-21a空载体的转基因大肠杆菌的高效液相色谱图。

图3C是含重组质粒pET21aTreS的转基因大肠杆菌的高效液相色谱图。

【具体实施方式】：

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

实施例1.从红色亚栖热菌中分离海藻糖合酶的核苷酸序列

利用细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取培养24小时的红色亚栖热菌的基因组DNA。根据所发表的海藻糖合酶同源序列的保守区氨基酸序列设计兼并引物(引物1和引物2)，以上述提取的DNA为模板在T-Gradient PCR仪(Biometra公司)上进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：

引物1：5’-TACGTSTGGWSSGACACC-3’(SEQ ID NO：3)

引物2：5’-CATSCCGATCTCGTCSCCG-3’(SEQ ID NO：4)

反应组分加入量终浓度

模板DNA 1μl

缓冲液(10×)

(含20mmol/LMgCl₂) 5μl 1×

dNTP(2.5mmol/L) 4μl 0.4mmol/L

引物1(10μmol/L) 1μl 0.2μmol/L

引物2(10μmol/L) 1μl 0.2μmol/L

Taqase(2.5u/μl) 1μl 2.5u/反应

H₂O 37μl

总体积 50μl

扩增条件：94℃变性5min，94℃1min，40℃1min，72℃1min进行5个循环，再用94℃1min，56℃1min，72℃1min进行25个循环，最后72℃10min。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增得到大小约750bp的片段，用柱式PCR产物纯化试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEM-T(Promega公司产品)中；连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(终浓度为60μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度为60μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold SpringHarbor Laboratory，New York，p19-21]提取质粒，经EcoRI和NotI双酶切和PCR扩增鉴定正确，测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。测序结果显示所扩增得到的片段大小为762bp，通过其编码的氨基酸序列在Genbank数据库中用Blast程序(Basic local Alignment seatch tool)[AltschulSF etal，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402]进行同源检索，检索结果表明与该片段最相似的同源片段为海藻糖合酶，但并不完全相同，证明所扩增片段为新的潜在海藻糖合酶基因的片段。

通过构建红色亚栖热菌的基因组文库，利用混合质粒PCR筛选的方法获得红色亚栖热菌的海藻糖合酶的全长基因。具体方法如下：提取红色亚栖热菌基因组DNA，随机断裂为3-5kb的片段，将这些片段连接于SmaI酶切的pUC18载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α。用牙签将转化子转接到LB培养基平板，每个转化子同时接到两块平板上，每块平板含有96个转化子(12×8，图1所示)，并确保每个转化子在平板上的位置相同。这两块平板其中一块用于混合质粒筛选，另一块为保留板。

混合质粒筛选方法：将筛选平板上的96个转化子分为4个部分(每部分12×2)，用无菌水将每部分培养基上的所有菌落冲下，并混合均匀，按碱裂解法(Sambroook，et al.，1989，MolecularCloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory，New York，p19-21)提取混合质粒。根据已知的红色亚栖热菌的海藻糖合酶序列设计引物3、引物4，对混合质粒进行PCR，反应所用引物、组分和扩增条件如下：

引物3：5’-CCTCACGGCTTCACCCTTTTCG-3’(SEQ ID NO：5)

引物4：5’-TGCAGCTGGAGGAGGGTGAG-3’(SEQ ID NO：6)

反应组分加入量终浓度

混合质粒DNA 1μl

缓冲液(10×)

(含20mmol/LMgCl₂) 2.5μl 1×

dNTP(2.5mmol/L) 2μl 0.4mmol/L

引物1(10μmol/L) 1μl 0.4μmol/L

引物2(10μmol/L) 1μl 0.4μmol/L

Taqase(2.5u/μl) 0.5μl 2.5u/反应

H₂O 17μl

总体积 25μl

扩增条件：94℃变性5min，再用94℃30min，56℃40min，72℃30min进行25个循环，最后72℃10min。如果结果阳性(获得300bp大小片段)则说明该混合质粒中可能含有未知的海藻糖合酶的侧翼序列。进而提取保留平板对应位置的所有转化子质粒，用引物3、引物4按上述条件进行PCR扩增，具有阳性结果的质粒可能含有未知的海藻糖合酶的侧翼序列。将所有具有阳性结果的转化子质粒进行测序。测序结果显示有3个转化子的质粒含有红色亚栖热菌的海藻糖合酶基因的全长序列，该基因大小为2892bp。

实施例2.所分离核苷酸序列的同源性搜索

将推测海藻糖合酶的氨基酸序列在Genbank上进行同源性搜索，所得同源序列大部分为编码海藻糖合酶的序列，其中与来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilys)同源性最高：相同性75％，二者比较如下：

MRTS VDPLWYKDAVIYQLHVRSFYDANDDGYGDFEGLRQKLPYLEALGVNTLWLMPFFQSPLRD

+DPLWYKDAVIYQLHVRSF+DAN+DGYGDFEGLR+KLPYLELGVNTLWLMPFFQSPLRD

TTTS MDPLWYKDAVIYQLHVRSFFDANNDGYGDFEGLRRKLPYLEELGVNTLWLMPFFQSPLRD

MRTS DGYDISDYYQILPVHGSLEDFKRFLDEAHEMGLRVIVELVLNHTSIDHPWFQEARKPGSP

DGYDISDYYQILPVHG+LEDFKRFLDEAHG++VI+ELVLNHTSIDHPWFQEARKPGSP

TTTS DGYDISDYYQILPVHGTLEDFKRFLDEAHGRGMKVIIELVLNHTSIDHPWFQEARKPGSP

MRTS MRDWYVWSDTPEKYKGVRVIFQDFETSNWTFDPVAGAYYWHRFYHHQPDLNWDNPEVEKA

MRDWYVWSDTPEKYKGVRVIF+DFETSNWTFDPVAAYYWHRFYHQPDLNWDNPEVEKA

TTTS MRDWYVWSDTPEKYKGVRVIFKDFETSNWTFDPVAKAYYWHRFYWHQPDLNWDNPEVEKA

MRTS MQEVMFFWADLGVDGFRLDAIPYLYEREGTSCENLPETIAAVKRLRAALEKRYGPGKILL

++VMFFWADLGVDGFRLDAIPYLYEREGTSCENLPETIAVKRLRALE+RYGPGKILL

TTTS IHQVMFFWADLGVDGFRLDAIPYLYEREGTSCENLPETIEAVKRLRKALEERYGPGKILL

MRTS AEANMWPEETLPYFGEGDGVHMAYNFPLMPRIFMALRREDRRPIEAMLQETEGIPESAQW

AEANMWPEETLPYFG+GDGVHMAYNFPLMPRIFMALRREDRPIEML+ETEGIPE+AQW

TTTS AEANMWPEETLPYFGDGDGVHMAYNFPLMPRIFMALRREDRGPIETMLKETEGIPETAQW

MRTS ALFLRNHDELTLEKVTEEEREFLWEIYAPDPRFRINLGIRRRLMPLLGGDRRRYELLQAL

ALFLRNHDELTLEKVTEEEREF++EYAPDP+FRINLGIRRRLMPLLGGDRRRYELLAL

TTTS ALFLRNHDELTLEKVTEEEREFMYEAYAPDPKFRINLGIRRRLMPLLGGDRRRYELLTAL

MRTS LLTLKGSPILYYGDEIGMGDNPFLGDRNGVRTPMQWYADRNAGFSRAPYHRLFLPPVSEG

LLTLKG+PI+YYGDEIGMGDNPFLGDRNGVRTPMQWDRNAGFSRAPYHLFLPPVSEG

TTTS LLTLKGTPIVYYGDEIGMGDNPFLGDRNGVRTPMQWSQDRNAGFSRAPYHALFLPPVSEG

MRTS PYSYHFVNVEAQQDNPHSLLNFNRRLLALRKRYAQVFGQGTLTLLPVENRRILAYLRTYG

PYSYHFVNVEAQ++NPHSLL+FNRRLALR++A++FG+G+LTLLPVENRR+LAYLR+

TTTS PYSYHFVNVEAQRENPHSLLSFNRRFLALRNQHAKIFGRGSLTLLPVENRRVLAYLREHE

MRTS EERLLVVANLSRYTQAFHLPLEAFQGLVPIELFSQNPFPPVTQPLYPMTLGPHGFTLFAL

ER+LVVANLSRYTQAFLPLEA+QGLVP+ELFSQPFPPV+Y+TLGPHGFLFAL

TTTS GERVLVVANLSRYTQAFDLPLEAYQGLVPVELFSQQPFPPV-EGRYRLTLGPHGFALFAL

MRTS ALPETI-RVSAPDWAEEVTPEM-LPQVPMEEGLESLFVETMADERARAAFLKALVQWLG

E+++PDWAEEPELP+VMGELV+T+ERRLALQL

TTTS KPVEAVLHLPSPDWAEEPAPEEADLPRVHMPGGPEVLLVDTLVHERGREELLNALAQTLK

MRTS ERSWLALKPQRGELYDALRFQKTSPLYLTLLQLEHHGRTLVFLPLAWDAEERESSGAFAR

E+SWLALKPQ+LDALRFQKPLYLTLLQLE+HVFLPLW+REGFAR

TTTS EKSWLALKPQKVALLDALRFQKDPPLYLTLLQLENHRTLQVFLPLLWSPQRREGPGLFAR

MRTS TRPREGYLYELSQDAGFYALLLRRLKEGFQGRSLKAYYRGEHRGPVPEELTLLRPGLAAG

T+GYYELSDGFYLLLRLKEGF+GRSL+AYYRGHGPVPE+LLRPGLAAG

TTTS THGQPGYFYELSLDPGFYRLLLARLKEGFEGRSLRAYYRGRHPGPVPEAVDLLRPGLAAG

MRTS DGVWLQLGLVQDGGLNRTLETLPRLDLPWILPPEGQLVWERGRERRVLALTGPLPEGKPQ

+GVW+QLGLVQDGGL+RTLPRLDLPW+LPEGLWERGRRVLALTGLPG+PQ

TTTS EGVWVQLGLVQDGGLDRTERVLPRLDLPWVLRPEGGLFWERGASRRVLALTGSLPPGRPQ

MRTS EAFALVQTLAAEGLARLRGQRLEEGGAGLLVEALRELESLARLLGVRLALLHQRLKQVEG

+FA++ELRLRGGGLLALEE+LRLLGVRLALLH+L+VEG

TTTS DLFAALEVRLLESLPRLRGH-TPGTPGLLPGALHETEALVRLLGVRLALLHRALGEVEG

MRTS EGEGVPLLGRGLGAFLEVSGELYLLALGPRGWGSPLEDLARMAYDLERAVELAWESLGEE

GPLLGRGLGAFLE+GE+YL+ALGG+EDLAR+AYD+ERAVLAE+LE

TTTS VEGGHPLLGRGLGAFLELEGEVYLVALGAEKRGAVEEDLARLAYDVERAVHLALEALEAE

MRTS EEGMSQAVGAFVVEALLGAYQDTVP-EPLDLEAWPGVMASWAEVQLQREERSIRLRILRR

++V++ALAY++PEL+WMAALREERRRIR

TTTS LWAFAEEVADYLHAAFLQAYRSALPEEALEEAGWTRHMAEVAAEHLHREERPARKRIHER

MRTS WKERA

W++A

TTTS WQAKA

MRTS：为本发明的红色亚栖热菌海藻糖合酶，

TTTS：为嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)海藻糖合酶。

以上比较显示了本发明的红色亚栖热菌海藻糖合酶和嗜热栖热菌(Thermus thermophiluS)海藻糖合酶(AAQ16097.1)的氨基酸序列同源性，相同的氨基酸在两个序列之间用单字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示，这说明本发明的新的核苷酸序列所编码的酶为潜在海藻糖合酶。

实施例3.大肠杆菌重组表达载体的构建

根据SEQ ID NO：1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物(引物5和引物6)分离其潜在开放阅读框序列：

引物5：5’-GGAATTCCATATGGGTGTGGAT℃CTCTTTGG-3’(SEQ ID NO：7)；

引物6：5’-CGGAATTCTCAGCGGGCCCGTTCCTTC-3` (SEQ ID NO：8)；

此两个引物的5端分别含有NdeI和EcoRI酶切位点。扩增条件为：94℃变性5min，94℃30min，56℃40min，72℃3min进行30个循环，最后72℃10min。扩增产物的测序结果显示和SEQID NO：1所示的序列一致。然后取50μl PCR产物和10μl pET-21a分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在4度冰箱中过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见附图2，所构建的含有海藻糖合酶基因的大肠杆菌质粒命名为pET21TreS。该质粒是由PET-21a(Invitrogen公司)和引物5和引物6的PCR产物构建而成。

实施例4.重组表达载体转化大肠杆菌细胞

1μg上例中的重组质粒pET21TreS转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌Rosetta gami(DE3)细胞，在含氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素(终浓度分别为60μg/ml、34μg/ml和15μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜。

实施例5：生产海藻糖的工程菌的诱导表达

挑取上例中在含氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素(终浓度分别为60μg/ml、34μg/ml和15μg/ml)的LB培养基平板上出现的阳性转化，接种于3ml含氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素(终浓度分别为200μg/ml、34μg/ml和15μg/ml)的LB培养基，37℃，160-170rpm过夜培养，以1％的接种量接入20ml以上LB培养基中，37℃，160-170rpm继续培养4-5h；待培养物O.D.＝0.6左右时，加入IPTG，使其终浓度为1.0mmol/L，30℃，120-130rpm继续培养3-4h。5000rpm离心收集菌体，用去离子水洗涤三次，用10mmol/L pH7.0的磷酸钾缓冲液重悬菌体，超声破碎，5000rpm离心收集上清液，并于60℃处理1h，5000rpm离心收集上清液，即为粗酶液。取1ml粗酶液与1ml 2％麦芽糖溶液(以10mmol/L pH7.0的磷酸钾缓冲液配制)于50℃反应24h，然后100℃处理1h灭活酶活性。用0.45mm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。

实施例6：高效液相色谱分析

按如下条件进行：

仪器为岛津LC-10AVP，柱子：HypersilNH₂4.6×250mm，流动相：80％乙腈，流速：1ml/min，柱温：室温，检测器：蒸发光检测器。以Sigma公司生产的麦芽糖和海藻糖为标准品，将上例得到的样品进行分析，上样量为5μl；分析软件：N2000高效液相色谱工作站。

色谱分析结果见附图3，附图3显示麦芽糖、海藻糖标准物(4A)、含pET-21a空载体的转基因大肠杆菌(4B)和含重组质粒pET21TreS的转基因大肠杆菌(4C)的高效液相色谱图。通过与麦芽糖、海藻糖标准品的保留时间进行比较鉴别出各个峰。图4C中保留时间为12.748min对应的峰即为红色亚栖热菌海藻糖合酶催化麦芽糖产生的海藻糖。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>红色亚栖热菌海藻糖合酶的核苷酸序列及其应用

<130>20071226

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2892

<212>DNA

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus tuber)

<400>1

ggtgtggatc ctctttggta caaggacgca gtcatctacc agctccacgt ccgctccttc 60

tacgatgcca acgacgacgg ctacggggac tttgagggcc taaggcagaa gctcccctac 120

ctcgaggccc tcggggtgaa caccctgtgg ctcatgccct tcttccaatc tcccttacgg 180

gacgacgggt acgacatctc cgactactac cagatcctcc cggtacacgg aagcctggag 240

gacttcaagc gctttttgga cgaggcccac gagatggggc tcagggtcat cgtggagctg 300

gtgctgaacc acacctccat agaccacccc tggttccagg aagcccgcaa acccggaagc 360

cccatgcggg actggtacgt ctggagcgac accccggaga agtataaggg ggtgcgggtc 420

atcttccagg actttgaaac ctccaactgg acctttgacc ccgtggccgg ggcctactac 480

tggcaccgct tctaccacca ccagccggat ctcaactggg acaaccccga ggtggaaaag 540

gccatgcagg aggtgatgtt cttctgggct gacctggggg tggacggctt ccggctggac 600

gccatccctt acctgtacga gcgggagggc acctcctgcg agaacctccc ggagaccatc 660

gccgcggtaa agcgcctgcg ggccgccctg gagaagcgct acggcccggg aaaaatcctc 720

ctggcggagg ccaacatgtg gccggaagaa accctcccct acttcgggga aggagacggg 780

gttcacatgg cctacaactt cccccttatg ccccgcatct tcatggccct gcgccgggag 840

gatcggcggc ccattgaggc catgctccag gaaacggagg gcatccccga aagcgcccag 900

tgggcgcttt tcctccgcaa ccacgacgag ctcaccctgg aaaaggtaac ggaagaggag 960

cgggagttcc tctgggagat ctacgccccc gatccccgct tccgcatcaa cctgggcatc 1020

cgccgccgcc taatgcccct tcttggggga gatcgccgac gctacgagct gctgcaggcc 1080

ctgctcctca cccttaaggg ctcccccatc ctctactacg gggacgaaat cggcatgggg 1140

gacaacccct tcctagggga ccgcaacggg gtgcgcaccc ccatgcagtg gtacgccgac 1200

cgcaacgccg ggttctcccg ggcaccctac caccggctct tcctgccccc ggtcagcgaa 1260

gggccttaca gctaccactt cgtcaacgtg gaagcccagc aggataaccc ccactccctg 1320

ctcaacttta accggcggct tttggccctg aggaagcggt acgcccaggt cttcggccag 1380

gggacgctca ccctcttacc cgtggaaaac cggcggatcc tggcctacct ccgcacctac 1440

ggagaagaac gccttttagt tgtggccaac ctcagccgct acacccaagc cttccacctc 1500

cccttggagg cgttccaggg cttagtgccc atagagctct tttcccaaaa ccccttcccc 1560

ccggtaaccc agccccttta ccccatgacc ctgggccctc acggcttcac ccttttcgcc 1620

ctcgcccttc cggaaaccat ccgcgtctct gccccggatt gggccgaaga ggtcaccccc 1680

gaaatgctcc cccaggttcc catggaggaa ggcctcgagt ccctcttcgt ggagaccatg 1740

gcggacgaaa gggccagggc tgccttccta aaggccctgg ttcagtggct gggggagcga 1800

agctggttgg ccctgaaacc ccagcggggg gagctttacg atgctttgcg gttccagaaa 1860

acgtcccccc tctacctcac cctcctccag ctggaacacc acggccgcac cctggtcttc 1920

ctccccctgg cctgggacgc cgaggaacgc gagagctcgg gggccttcgc ccgcacccgg 1980

cctcgagagg gctacctcta cgagctctcc caagacgcgg ggttttacgc cctcctgctc 2040

cgccggctca aggagggctt ccagggcagg agccttaagg cctactaccg aggggagcac 2100

cgggggcccg tccccgagga gctcaccctg ctgcggcccg gcctggccgc gggcgatggg 2160

gtctggctcc agctggggct ggttcaggac ggggggctga accgcaccct cgagaccctg 2220

ccccggctgg atctgccttg gatcctgccc ccagaggggc agctggtttg ggaacgcggg 2280

agggaacgcc gggtcctggc cctcacggga cccctcccgg aagggaagcc gcaggaggct 2340

ttcgccctgg tccagaccct agccgccgag ggtctggccc gcctgcgggg gcagcgcctc 2400

gaggagggag gggctgggct tctggtggaa gccctaaggg agctggaaag cctggcccgg 2460

ctccttggag tccgcctggc cctcctgcac cagcgcctta agcaggtgga gggggagggg 2520

gaaggggtgc ccctgctggg gcggggcctg ggggcttttc tggaggtctc gggggagctt 2580

tacctcctgg ccctggggcc ccggggctgg ggaagccccc tggaggacct ggcgcggatg 2640

gcctacgact tggagcgggc cgtggaatta gcctgggaga gcttgggaga agaggaggag 2700

ggcatgagcc aggccgtggg ggcgttcgtg gtggaggccc tgctcggcgc ctaccaggac 2760

accgtcccgg agcccctaga cctagaggct tggccgggtg tcatggcctc ctgggccgag 2820

gttcagctcc agcgggagga acgatccatc cgcctgcgca tcctccgccg gtggaaggaa 2880

cgggcccgct ag 2892

<210>2

<211>963

<212>PRT

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)

<400>2

Gly Val Asp Pro Leu Trp Tyr Lys Asp Ala Val Ile Tyr Gln Leu His

1 5 10 15

Val Arg Ser Phe Tyr Asp Ala Asn Asp Asp Gly Tyr Gly Asp Phe Glu

20 25 30

Gly Leu Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Leu Gly Val Asn Thr

35 40 45

Leu Trp Leu Met Pro Phe Phe Gln Ser Pro Leu Arg Asp Asp Gly Tyr

50 55 60

Asp Ile Ser Asp Tyr Tyr Gln Ile Leu Pro Val His Gly Ser Leu Glu

65 70 75 80

Asp Phe Lys Arg Phe Leu Asp Glu Ala His Glu Met Gly Leu Arg Val

85 90 95

Ile Val Glu Leu Val Leu Asn His Thr Ser Ile Asp His Pro Trp Phe

100 105 110

Gln Glu Ala Arg Lys Pro Gly Ser Pro Met Arg Asp Trp Tyr Val Trp

115 120 125

Ser Asp Thr Pro Glu Lys Tyr Lys Gly Val Arg Val Ile Phe Gln Asp

130 135 140

Phe Glu Thr Ser Asn Trp Thr Phe Asp Pro Val Ala Gly Ala Tyr Tyr

145 150 155 160

Trp His Arg Phe Tyr His His Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro

165 170 175

Glu Val Glu Lys Ala Met Gln Glu Val Met Phe Phe Trp Ala Asp Leu

180 185 190

Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Tyr Glu Arg

195 200 205

Glu Gly Thr Ser Cys Glu Asn Leu Pro Glu Thr Ile Ala Ala Val Lys

210 215 220

Arg Leu Arg Ala Ala Leu Glu Lys Arg Tyr Gly Pro Gly Lys Ile Leu

225 230 235 240

Leu Ala Glu Ala Asn Met Trp Pro Glu Glu Thr Leu Pro Tyr Phe Gly

245 250 255

Glu Gly Asp Gly Val His Met Ala Tyr Asn Phe Pro Leu Met Pro Arg

260 265 270

Ile Phe Met Ala Leu Arg Arg Glu Asp Arg Arg Pro Ile Glu Ala Met

275 280 285

Leu Gln Glu Thr Glu Gly Ile Pro Glu Ser Ala Gln Trp Ala Leu Phe

290 295 300

Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Lys Val Thr Glu Glu Glu

305 310 315 320

Arg Glu Phe Leu Trp Glu Ile Tyr Ala Pro Asp Pro Arg Phe Arg Ile

325 330 335

Asn Leu Gly Ile Arg Arg Arg Leu Met Pro Leu Leu Gly Gly Asp Arg

340 345 350

Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Leu Thr Leu Lys Gly Ser

355 360 365

Pro Ile Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Pro Phe

370 375 380

Leu Gly Asp Arg Asn Gly Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Tyr Ala Asp

385 390 395 400

Arg Asn Ala Gly Phe Ser Arg Ala Pro Tyr His Arg Leu Phe Leu Pro

405 410 415

Pro Val Ser Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr His Phe Val Asn Val Glu Ala

420 425 430

Gln Gln Asp Asn Pro His Ser Leu Leu Asn Phe Asn Arg Arg Leu Leu

435 440 445

Ala Leu Arg Lys Arg Tyr Ala Gln Val Phe Gly Gln Gly Thr Leu Thr

450 455 460

Leu Leu Pro Val Glu Asn Arg Arg Ile Leu Ala Tyr Leu Arg Thr Tyr

465 470 475 480

Gly Glu Glu Arg Leu Leu Val Val Ala Asn Leu Ser Arg Tyr Thr Gln

485 490 495

Ala Phe His Leu Pro Leu Glu Ala Phe Gln Gly Leu Val Pro Ile Glu

500 505 510

Leu Phe Ser Gln Asn Pro Phe Pro Pro Val Thr Gln Pro Leu Tyr Pro

515 520 525

Met Thr Leu Gly Pro His Gly Phe Thr Leu Phe Ala Leu Ala Leu Pro

530 535 540

Glu Thr Ile Arg Val Ser Ala Pro Asp Trp Ala Glu Glu Val Thr Pro

545 550 555 560

Glu Met Leu Pro Gln Val Pro Met Glu Glu Gly Leu Glu Ser Leu Phe

565 570 575

Val Glu Thr Met Ala Asp Glu Arg Ala Arg Ala Ala Phe Leu Lys Ala

580 585 590

Leu Val Gln Trp Leu Gly Glu Arg Ser Trp Leu Ala Leu Lys Pro Gln

595 600 605

Arg Gly Glu Leu Tyr Asp Ala LeuArg Phe Gln Lys Thr Ser Pro Leu

610 615 620

Tyr Leu Thr Leu Leu Gln Leu Glu His His GlyArg Thr Leu Val Phe

625 630 635 640

Leu Pro Leu Ala Trp Asp Ala Glu Glu Arg Glu Ser Ser Gly Ala Phe

645 650 655

Ala Arg Thr Arg Pro Arg Glu Gly Tyr Leu Tyr Glu Leu Ser Gln Asp

660 665 670

Ala Gly Phe Tyr Ala Leu Leu Leu Arg Arg Leu Lys Glu Gly Phe Gln

675 680 685

Gly Arg Ser Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Gly Glu His Arg Gly Pro Val

690 695 700

Pro Glu Glu Leu Thr Leu Leu Arg Pro Gly Leu Ala Ala Gly Asp Gly

705 710 715 720

Val Trp Leu Gln Leu Gly Leu Val Gln Asp Gly Gly Leu Asn Arg Thr

725 730 735

Leu Glu Thr Leu Pro Arg Leu Asp Leu Pro Trp Ile Leu Pro Pro Glu

740 745 750

Gly Gln Leu Val Trp Glu Arg Gly Arg Glu Arg Arg Val Leu Ala Leu

755 760 765

Thr Gly Pro Leu Pro Glu Gly Lys Pro Gln Glu Ala Phe Ala Leu Val

770 775 780

Gln Thr Leu Ala Ala Glu Gly Leu Ala Arg Leu Arg Gly Gln Arg Leu

785 790 795 800

Glu Glu Gly Gly Ala Gly Leu Leu Val Glu Ala Leu Arg Glu Leu Glu

805 810 815

Ser Leu Ala Arg Leu Leu Gly Val Arg Leu Ala Leu Leu His Gln Arg

820 825 830

Leu Lys Gln Val Glu Gly Glu Gly Glu Gly Val Pro Leu Leu Gly Arg

835 840 845

Gly Leu Gly Ala Phe Leu Glu Val Ser Gly Glu Leu Tyr Leu Leu Ala

850 855 860

Leu Gly Pro Arg Gly Trp Gly Ser Pro Leu Glu Asp Leu Ala Arg Met

865 870 875 880

Ala Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Val Glu Leu Ala Trp Glu Ser Leu Gly

885 890 895

Glu Glu Glu Glu Gly Met Ser Gln Ala Val Gly Ala Phe Val Val Glu

900 905 910

Ala Leu Leu Gly Ala Tyr Gln Asp Thr Val Pro Glu Pro Leu Asp Leu

915 920 925

Glu Ala Trp Pro Gly Val Met Ala Ser Trp Ala Glu Val Gln Leu Gln

930 935 940

Arg Glu Glu Arg Ser Ile Arg Leu Arg Ile Leu Arg Arg Trp Lys Glu

945 950 955 960

Arg Ala Arg

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)

<400>3

tacgtstggw ssgacacc 18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)

<400>4

catsccgatc tcgtcsccg 19

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)

<400>5

cctcacggct tcaccctttt cg 22

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)

<400>6

tgcagctgga ggagggtgag 20

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)

<400>7

ggaattccat atgggtgtgg atcctctttg g 31

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)

<400>8

cggaattctc agcgggcccg ttccttc 27

Claims

1.一种海藻糖合酶的核苷酸序列，其特征在于它是从红色亚栖热菌中分离得到的，是SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的核苷酸序列编码的多肽，其特征在于所述的多肽是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。

3.一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。

4.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于它是pET21TreS，是由PET-21a和引物5及引物6的PCR产物构建而成，其具体构建过程如下：

根据SEQ ID NO：1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物，引物5和引物6，分离其潜在开放阅读框序列：

引物5：5’-GGAATTCCATATGGGTGTGGATCCTCTTTGG-3’；

引物6：5’-CGGAATTCTCAGCGGGCCCGTTCCTTC-3`；

此两个引物的5`端分别含有NdeI和EcoRI酶切位点；扩增条件为：94℃变性5min，94℃30min，56℃40min，72℃3min进行30个循环，最后72℃10min；扩增产物的测序结果显示和SEQID NO：1所示的序列一致；然后取50μl PCR产物和10μl pET-21a分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在4度冰箱中过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，所构建的含有海藻糖合酶基因的大肠杆菌质粒命名为pET21TreS。

5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞：

(a)它是用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；

(b)它是用权利要求4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。

6.按照权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。

7.按照权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。

8.权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的氨基酸序列和权利要求3所述的重组表达载体应用于海藻糖生产的用途。