CN107988176B - 一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法 - Google Patents

一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将187位氨基酸由缬氨酸突变成苏氨酸得到的。本发明的突变体酶的纯酶比酶活较突变前提高了38％，60℃的半衰期(t1/2)较突变期提高了2.9倍。本发明表明10位氨基酸残基突变成半胱氨酸与天然酪氨酸酶的30位半胱氨酸残基形成正确的二硫键从而提高了酶的稳定性和催化效率，加强了该酶的工业应用潜力。

Description

一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
酪氨酸酶(Tyrosinase,EC 1.14.18.1)是一种含有双铜离子的金属酶。酪氨酸酶是多功能酶，在氧气的参与下可以催化单酚生成二元酚(一元酚酶活性)；催化二元酚生成相应的醌(二元酚酶活性)。而醌在经过一系列酶催化及非酶催化的氧化还原反应后最终生成黑色素。酪氨酸酶广泛的存在于动植物及微生物中。一般认为人类的毛发、眼睛、皮肤上的颜色都是由酪氨酸酶决定的，因而大多数化妆品行业通过研究酪氨酸酶酶抑制剂来开发美白产品。人体内如果酪氨酸酶代谢异常将会导致一系列疾病的发生，例如白癜风和白化病等。同时禽类的羽毛，及昆虫甲壳的颜色也酪氨酸酶相关，它的产物黑色素可以与蛋白交联结合成坚硬的支架，起到保护作用。在植物体内，酪氨酸酶可以催化生成一些对人体有益的物质，例如茶多酚。此外，水果表面受损时的褐变也与酪氨酸酶相关，食品行业研究开发酪氨酸酶抑制剂来保鲜水果。此外，酪氨酸酶在工业上也有重要的应用。首先，酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成左旋多巴等有益的酚类物质，左旋多巴是效果良好的抗颠麻痹药，已经被广泛的应用于临床。此外，酪氨酸酶还可以用于制备生物传感器，用来检测环境中酚类化合物的浓度。由于工业污染，导致大量的酚类化合物被排放到自然环境中(主要是水源)，导致严重的污染，而大部分酚类化合物对人体有毒害作用，而酪氨酸酶由于底物的广谱性，大部分的酚类化合物均可以被酪氨酸酶催化，因此，酪氨酸酶还可以被用来清除污染环境中的酚类化合物。随着CboFDH三维结构的精确解析，使得对其理性设计和精确的分子改造成为可能。
Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株酪氨酸酶生产菌株(保藏编号为：CCTCC M 2012432)，对S.kathirae SC-1所产的酪氨酸酶的稳定性较低，因此需要提高酪氨酸酶的稳定性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其制备方法等。
本发明的第一个目的是提供一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将187位氨基酸由缬氨酸突变成苏氨酸得到的。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第187位的缬氨酸的密码子突变成编码苏氨酸的密码子而得到的。
本发明的第三个目的是提供含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述酪氨酸酶突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pET28a。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为E.coli BL21。
本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第187位的缬氨酸的密码子突变成编码苏氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌BL21宿主菌中即得到重组基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：
(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因V187T。
(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pET28a表达载体中，得到重组质粒pET28a-V187T，重组质粒化转化E.coli BL21，获得重组工程菌株，命名为pET28a-V187T/E.coli BL21。
本发明的第六个目的是提供所述突变体、编码所述突变体的核苷酸序列、含有编码所述突变体的核苷酸序列的载体、表达所述突变体的基因工程菌在医药、食品、环境中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，包括酪氨酸酶参与的生物合成。
本发明的有益效果：
本发明在天然酪氨酸酶的基础上，通过定点突变生物技术改造酪氨酸酶分子结构，本发明的突变体酶的纯酶比酶活较突变前提高了38％，60℃的半衰期(t1/2)较突变期提高了2.9倍。改突变体在酪氨酸酶参与的生物合成中具有良好的应用前景。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
发酵培养基：可溶性淀粉4g·L-1，酵母膏37g·L-1，氯化钠5g·L-1，氯化钙0.1g·L-1，调节pH 6.0。
酶活定义：定义每分钟催化生成1μM多巴醌的酶量定义为一个酶活单位(U)。酶比活力定义为单位蛋白的酶活U/mg。
酪氨酸酶酶活测定方法：反应体系为50mmol/LpH 6.2的磷酸钾缓冲液中含15μmol/L硫酸铜，10mmol/L左旋多巴。加入适量的酶液启动反应，30℃反应10分钟，每隔1分钟测定475nm吸光度的值并记录数据。根据反应液在475nm吸光值增量，计算出酶活力。
实施例1：含酪氨酸酶突变体的重组载体的构建
(1)酪氨酸酶突变体V187T的获得：以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)和Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因。
(2)将重组基因与pET28a分别用DpnI酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化E.coli BL21感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pET28a-V187T。测序工作由上海生工完成。
实施例2：产酪氨酸酶突变体重组大肠杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pET28a-V187T化转至E.coli BL21感受态细胞，方法如下：
(1)转化实验所需试剂如下：
LB培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶解,加入去离子水至总体积为1L，分装，高压灭菌20min。
LB琼脂培养基：先按上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入琼脂1％-2％。
100mmol/L CaCl2(灭菌)、50％甘油(灭菌)、50EP管，1.5mL EP管
(2)挑取大肠杆菌单菌落接种于10mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
(3)按1％接种量接种至50mL LB培养基中，37℃180r/min振荡培养1.5-2h至有些微菌丝体生成。
(4)将100mmol/LCaCl2、50％甘油、50EP管，1.5mL EP管事先放冰上冷却并置于超净台中灭菌。
(5)于超净台中分装菌液至2个50EP管中，配平，于5000r/min 5min.。
(6)在超净台中去上清，用0.1M CaCl2悬浮细胞，放置冰上15min，离心(5000r/min5min)，再同样操作1-2次。最后一次0.1M CaCl2和50％甘油按照2:1的比例去悬浮细胞，最后分装至1.5mL EP管，每管150-200μL。加入5μL重组质粒L484M-pET28a-M至一管感受态中，轻轻混匀，经过冰上放置45min，42℃水浴90s，冰上放置5min，加入800μL LB，37℃、180r/min培养1.5-2h，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌pET28a-V187T/E.coli BL21。
实施例3：重组菌pET28a-V187T/E.coli BL21表达酪氨酸酶及酶活测定
将实施例2构建的重组菌pET28a-V187T/E.coli BL21与表达未突变的野生酶melC1(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的对照菌株pET28a-melC1/E.coli BL21分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于发酵培养基中，37℃培养4h后加入0.5mM的IPTG于24度诱导16小时。离心收集细胞并破碎，细胞破碎上清液(粗酶液)用于酶活力的测定。
实施例4：不同突变体酶学特性比较
如实施例1所述的酪氨酸酶突变体和实施例2所述的产酪氨酸酶突变体重组大肠杆菌工程菌的构建，不同之处在于分别将野生酶melC1的第7位的谷氨酰胺突变为赖氨酸、第95位的精氨酸突变为酪氨酸、第123位的甘氨酸突变为色氨酸和第234位的甘氨酸突变为脯氨酸，分别获得酪氨酸酶突变体Q7K、R95Y、G123W和G234P。采用t1/2及T50来表征酶的温度稳定性，酪氨酸酶及其突变体的T50结果如表1所示，野生型酪氨酸酶MelC的T50为59℃，Q7K、R95Y、G123W及G234P突变体的T50较野生型酪氨酸酶的T50，分别提高了6、1、2及8℃，而突变体V187T提高了12℃，显著提高了酪氨酸酶的耐热性；野生型酪氨酸酶MelC在60℃的半衰期t1/2为7.3min，Q7K、R95Y、G123W及G234P的半衰期t1/2分别为12.5分钟、9.7分钟、13.1分钟、15.7分钟，而突变体V187T的半衰期t1/2达到28.5分钟。突变体V187T的纯酶比酶活较突变前提高了38％，60℃的半衰期(t1/2)较突变期提高了2.9倍。由此可见，将野生酶MelC的第187位氨基酸由缬氨酸突变成苏氨酸后所获突变体V187T的酶活和稳定性均得到明显提高。
表1 酪氨酸酶及其突变体酶学特征比较
Figure BDA0001510771140000041
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法
<130> BAA170831A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Val Arg Lys Asn Gln Ala Ser Leu Thr Ala Asp Glu Lys Arg
1 5 10 15
Trp Phe Val Ala Ala Val Leu Glu Leu Lys Arg Ser Gly Arg Tyr Asp
20 25 30
Ala Phe Val Thr Thr His Asn Gly Phe Ile Met Ser Asp Met Asp Asn
35 40 45
Ser Glu Arg Thr Gly His Arg Ser Pro Ser Phe Leu Pro Trp His Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Leu Asp Phe Glu Arg Ala Leu Gln Ser Val Asp Ala Ser
65 70 75 80
Val Ala Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Ala Asp Arg Thr Val Arg Ala
85 90 95
Ser Leu Trp Ala Pro Asp Phe Leu Gly Gly Thr Gly Arg Ser Ser Asp
100 105 110
Gly Arg Val Met Asp Gly Pro Phe Ala Ala Gly Ala Gly Asn Trp Pro
115 120 125
Leu Asn Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Arg Arg Ser Leu Gly
130 135 140
Gly Arg Cys Pro Arg Ala Ala Asp Arg Ala Glu Val Asp Ser Val Leu
145 150 155 160
Ala Leu Thr Thr Tyr Asp Met Ala Pro Trp Asn Ser Ala Ser Asp Gly
165 170 175
Phe Arg Asn His Leu Glu Gly Trp Arg Gly Thr Asn Leu His Asn Arg
180 185 190
Val His Val Trp Val Gly Gly Gln Met Gly Thr Gly Val Ser Pro Asn
195 200 205
Asp Pro Val Phe Trp Leu His His Ala Phe Ile Asp Lys Leu Trp Ala
210 215 220
Asp Trp Gln Arg Arg His Pro Gly Ala Gly Tyr Ala Pro Thr Gly Gly
225 230 235 240
Thr Pro Asp Val Val Asp Leu Asn Asp Thr Met Lys Pro Trp Asn Asp
245 250 255
Val Arg Pro Ala Asp Leu Leu Asp His Thr Lys Phe Tyr Thr Phe Asp
260 265 270
Val
<210> 2
<211> 273
<212> PRT
<213> Streptomyces kathirae
<400> 2
Met Thr Val Arg Lys Asn Gln Ala Ser Leu Thr Ala Asp Glu Lys Arg
1 5 10 15
Trp Phe Val Ala Ala Val Leu Glu Leu Lys Arg Ser Gly Arg Tyr Asp
20 25 30
Ala Phe Val Thr Thr His Asn Gly Phe Ile Met Ser Asp Met Asp Asn
35 40 45
Ser Glu Arg Thr Gly His Arg Ser Pro Ser Phe Leu Pro Trp His Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Leu Asp Phe Glu Arg Ala Leu Gln Ser Val Asp Ala Ser
65 70 75 80
Val Ala Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Ala Asp Arg Thr Val Arg Ala
85 90 95
Ser Leu Trp Ala Pro Asp Phe Leu Gly Gly Thr Gly Arg Ser Ser Asp
100 105 110
Gly Arg Val Met Asp Gly Pro Phe Ala Ala Gly Ala Gly Asn Trp Pro
115 120 125
Leu Asn Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Arg Arg Ser Leu Gly
130 135 140
Gly Arg Cys Pro Arg Ala Ala Asp Arg Ala Glu Val Asp Ser Val Leu
145 150 155 160
Ala Leu Thr Thr Tyr Asp Met Ala Pro Trp Asn Ser Ala Ser Asp Gly
165 170 175
Phe Arg Asn His Leu Glu Gly Trp Arg Gly Val Asn Leu His Asn Arg
180 185 190
Val His Val Trp Val Gly Gly Gln Met Gly Thr Gly Val Ser Pro Asn
195 200 205
Asp Pro Val Phe Trp Leu His His Ala Phe Ile Asp Lys Leu Trp Ala
210 215 220
Asp Trp Gln Arg Arg His Pro Gly Ala Gly Tyr Ala Pro Thr Gly Gly
225 230 235 240
Thr Pro Asp Val Val Asp Leu Asn Asp Thr Met Lys Pro Trp Asn Asp
245 250 255
Val Arg Pro Ala Asp Leu Leu Asp His Thr Lys Phe Tyr Thr Phe Asp
260 265 270
Val
<210> 3
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaccgtac gcaagaacca ggccagcctg accgccgacg agaagcggtg gttcgtcgcc 60
gccgtcctcg aactcaagcg cagcggacgc tacgacgcgt tcgtcacgac gcacaacggc 120
ttcatcatgt ccgacatgga caactccgag cggaccgggc accgttcacc gtccttcctg 180
ccctggcacc gcagattcct gctcgacttc gaacgggcgc tgcagtcggt ggacgcgtcg 240
gtggcgctgc cgtactggga ctggaccgcc gaccgcacgg tccgcgcctc cctgtgggcg 300
cccgacttcc tcggcggcac gggacgcagc tcggacggcc gggtgatgga cgggccgttc 360
gccgcgggcg ccgggaactg gccgctcaac gtgcgggtgg acggccgtac ttatctgcgc 420
aggtcgctcg gcggccggtg tccgcgagcc gccgaccgcg ccgaggtcga ctccgtgctg 480
gcgctgacga cgtacgacat ggcgccctgg aacagcgcct cggacggctt ccgcaaccat 540
ctggagggct ggcgcgggat aaacctgcac aaccgggtcc acgtctgggt cggcgggcag 600
atgggcaccg gtgtctcccc caacgacccg gtgttctggc tgcaccacgc cttcatcgac 660
aagctgtggg cggactggca gcgccggcac ccgggggcgg gttacgcgcc gaccggcggg 720
actccggacg tggtcgacct gaacgacacg atgaagccgt ggaacgacgt gcggccggcg 780
gatctgctgg accacacgaa gttctacacg ttcgacgtct ga 822
<210> 4
<211> 822
<212> DNA
<213> Streptomyces kathirae
<400> 4
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actccggacg tggtcgacct gaacgacacg atgaagccgt ggaacgacgt gcggccggcg 780
gatctgctgg accacacgaa gttctacacg ttcgacgtct ga 822
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggcgcgggt ataacctgca ca 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accgcgccca tattggacgt gttg 24

Claims (9)

1.一种酪氨酸酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.一种表达权利要求1所述酪氨酸酶突变体的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。
6.权利要求1所述的酪氨酸酶突变体在医药、食品、环境中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是用于酪氨酸酶参与的生物合成。
8.一种制备权利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法是在SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的基础上，将187位氨基酸由缬氨酸突变成苏氨酸，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到大肠杆菌基因工程菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，以序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的引物，进行PCR，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的V187T突变体基因序列；(2)将步骤(1)得到的重组基因序列，连接到pET28a表达载体中，得到重组质粒pET28a-V187T，重组质粒化转化到大肠杆菌宿主中，获得重组大肠杆菌基因工程菌株。
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Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成关键酶酪氨酸酶基因的克隆表达及分子改造;郭静;《中国博士学位论文全文数据库基础科学辑》;20151115(第11期);第62页最后1段，第77页最后1段至第78页第1段，第79页最后一段，第85页第1段，第86页第2-3段，第90页倒数第2段，第91页第1段，表6-1，表6-3，表6-4 *

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