CN109897845B - 一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌BL21作为宿主，表达重组质粒pET‑28(a)‑TPL及25个酪氨酸酚解酶突变体，得到了含有突变质粒生产L‑DOPA的重组大肠杆菌，利用获得的重组菌全细胞转化生产L‑DOPA，其中表达pET‑28(a)‑TPL(E313M)的重组菌生产L‑DOPA产量达到54.9g/L，相比对照菌株提高了142.9％，其表达的酪氨酸酚解酶的在20℃，40℃，60℃条件下的半衰期分别提高至37.9min，17.1min，14.6min，为代谢工程改造大肠杆菌生产L‑DOPA奠定了基础。

Description

一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
左旋多巴(L-DOPA)是氨基酸的一种衍生物，也是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物，又称3,4-二羟基苯基丙氨酸，是一种重要的活性物质。L-DOPA是新型的生化药品，在食品、医药和保健品等领域都具有广泛应用。L-DOPA的衍生物——多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。
Birkmayer于1961年用L-DOPA治疗帕金森氏病获得明显疗效。L-DOPA及复方L-DOPA(如美多芭)已成为治疗常见老年病——帕金森氏病的主要药物。L-DOPA还可用来治疗弱视；利用酪氨酸酶将L-酪氨酸转化，经L-DOPA形成黑色素，可用于毛发染色；此外，人们还发现L-DOPA有抗衰老的功效。基于L-DOPA在医药卫生、保健美容等诸多领域的显著功效，L-DOPA的生产很早就被人们所关注。
根据文献报道，L-DOPA的制备方法主要有提取法、化学合成法和酶转化法。
1、提取法
L-DOPA在自然界中主要存在于蚕豆、毛豆等植物中，提取法中免去了与手性异构体D-DOPA的拆分工艺，并且L-DOPA的提取得率也相应得到了一些提高，但由于受到原料来源少、产量低的限制，因而生产成本高，从植物中提取L-DOPA难以大规模生产，远不能满足市场需求。
陈勇等(中草药，1993，24(6)：294)用薄层扫描法测定广西东兰猫豆M.pruriens，广西药用植物园及云南西双版纳藜豆M.macrocarpa Wall中L-DOPA的含量在4.16％～4.94％之间。
刘新民等(中药材，1994，17(10)：31)发现产自云南、四川的黎豆属植物Mucunasempervirens Hemsl中L-DOPA含量为6.65％。
蒋伟哲等(中草药，2000，31(11)：860)发现采自广西宜州市、百色市、北海市、东兰县、田东县五个产地的猫豆中L-DOPA的含量为5.62％～6.83％，而去皮后L-DOPA在种肉中的含量高达6.99％～9.35％，在种皮中的含量仅为0.25％～0.43％。
2、化学合成法
自从Monsanto团队(2004，Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，Weinheim，p(21-38))首次采用香草醛和乙内酰脲为原料通过不对称法合成L-DOPA以来，化学法被广泛应用于L-DOPA的商业化生产，但化学合成过程中需要大量的铅等金属作为催化剂，并且过程繁杂，产物的转化效率和对映选择性均较低，同时具有成本高、环境污染严重等问题。
3、酶转化法
3.1酪氨酸酶
酪氨酸酶(tyrosinase，E.C.1.14.18.1)可以酪氨酸直接作为底物，催化合成L-DOPA。该酶同时具有单酚氧化酶和二酚氧化酶氧化还原作用，其中单酚氧化酶催化单酚羟基化，二酚氧化酶可将二酚类化合物氧化为醌类化合物，为了防止L-DOPA被氧化可引入化学还原剂，如抗坏血酸。该反应需要铜离子作为催化剂，而且以酪氨酸为底物成本较高，由于酪氨酸和L-DOPA结构的相似性，使产品分离提取困难，操作工艺较复杂，不利于产业化。
Krishnaveni等(Current Microbiology，2009，58(2)：122-128)利用真菌Acremonium rutilum酪氨酸酶转化酪氨酸合成L-DOPA，在25℃，pH 5.5条件下连续培养120h，最大产量为0.89g/L。
Surwase等(Appl Biochem Biotechnol，2012，167(5)：1015–1028)利用Brevundimonas sp.SGJ酪氨酸酶转化酪氨酸合成L-DOPA，在40℃，pH8.0条件下获得L-DOPA最高产量，3.81g/L。
3.2对羟基苯乙酸酯3-羟化酶
对羟基苯乙酸酯3-羟化酶(p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH，E.C.1.14.14.9)以酪氨酸为底物催化合成L-DOPA，该反应需要外源添加NADH作为辅酶，辅酶NADH价格较高，因此，该方法不适合应用于工业化生产，需要通过有效的辅酶NADH再生系统来降低生产成本。
Figure GDA0002632452490000021
等(Microbiol Biotechnol，2011，38(11)：1845–1852)利用E.coli表达对羟基苯乙酸酯3-羟化酶，并采用代谢工程改造积累转化底物酪氨酸，获得L-DOPA产量为1.51g/L。
3.3酪氨酸酚解酶
酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol-lyase，TPL，EC4.1.99.2)可以丙酮酸、铵盐、邻苯二酚为底物合成L-DOPA，反应具有可逆性，需要5-磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶。该酶广泛存在于假单胞菌属、真菌、链霉菌等微生物中，其中草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)中的酪氨酸酚裂解酶活性较高。
李华钟等(工业微生物，2002，32(2)：5-9)在10g/L丙酮酸、12g/L邻苯二酚、20g/L乙酸铵、1g/L EDTA、2g/L亚硫酸钠，pH 8.0反应体系中，利用酪氨酸酚裂解酶酶法合成L-DOPA，15℃反应16h，产物L-DOPA达到16.5g/L。
Lee等(Microbiol Biotechnol，1996，6(2)：98–102)通过E.coli表达来源于耐热型菌株Symbiobacterium的酪氨酸酚裂解酶，以丙酮酸钠、邻苯二酚、氯化铵为底物，反应条件为37℃，pH 8.3，反应6h产物L-DOPA达到29.8g/L。
以上酶法转化合成L-DOPA的路线中以酪氨酸酚裂解酶活性最高，最接近工业化应用，但当反应底物之一邻苯二酚浓度高于0.1M时，其对酪氨酸酚裂解酶活性具有抑制作用，对细胞也具有一定的毒性，目前主要采用底物流加补料策略，因此，解除邻苯二酚的抑制作用和毒性是实现酪氨酸酚裂解酶酶法制备L-DOPA产业化的关键。
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，它作为一种模式微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化发酵生产中，如谷氨酸、缬氨酸等。近年来学者们开始研究利用大肠杆菌全细胞转化法生产非氨基酸物质。大肠杆菌具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它在生物技术领域发挥着重要作用。在大肠状杆菌中因为不存在酪氨酸酚解酶，不存在通过丙酮酸钠、邻苯二酚和铵盐为底物合成L-DOPA的途径。因此，提供一种能够高效表达外源酪氨酸酚解酶基因的大肠杆菌，对于左旋多巴的生产应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种酪氨酸酚解酶突变体，含SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。其中，酪氨酸酚解酶突变体E313M氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，酪氨酸酚解酶突变体E313W氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码上述酪氨酸酚解酶突变体的基因。其中，编码酪氨酸酚解酶突变体E313M的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码酪氨酸酚解酶突变体E313W的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体或细胞。
本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，表达上述的酪氨酸酚解酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，以pET系列载体为表达载体。
本发明的第五个目的是提供一种生产酪氨酸酚解酶的方法，应用上述基因工程菌进行发酵生产。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是先在35-38℃下发酵2-4h，再加入诱导剂0.2-0.5mM的IPTG并降温至20-25℃，继续发酵10-14h。
本发明的第六个目的是提供一种左旋多巴的全细胞转化制备方法，是以上述基因工程菌为全细胞催化剂，以丙酮酸钠、邻苯二酚、铵盐为底物，进行全细胞转化。所述方法具体包括以下步骤：
(1)应用上述方法制备获得发酵液，离心收集湿菌体；
(2)将(1)中得到的湿菌体加入到转化液中，转化液中湿菌体的终浓度为60-65g/L，转化液含有丙酮酸钠15-18g/L，邻苯二酚8-10g/L，乙酸铵25-30g/L，Na2SO3 2-4g/L，EDTA1-2g/L，5-磷酸吡哆醛30-50μM，氨水调节pH为8.0-8.5；
(3)转化反应条件为15-20℃，180-200rpm，避光，反应前3h每隔1-1.5h补加丙酮酸钠9-12g/L，邻苯二酚6-8g/L，补加两次；反应3至8h每隔1.5-2h补加丙酮酸钠6-8g/L，邻苯二酚4-6g/L，补加两次；
(4)转化反应8h后，向反应液中按10％-20％体积量加入0.1M的盐酸溶液，制备获得的反应液10000-11000rpm，离心2-4min，收集上清。
本发明的第七个目的是提供上述的酶突变体在制备左旋多巴或含左旋多巴的产品中的应用。
本发明以大肠杆菌BL21作为宿主，表达重组质粒pET-28(a)-TPL及25个酪氨酸酚解酶突变体，得到了含有突变质粒生产L-DOPA的重组大肠杆菌，利用获得的重组菌全细胞转化生产L-DOPA，其中表达pET-28(a)-TPL(E313M)的重组菌生产L-DOPA产量达到54.9g/L，相比对照菌株提高了142.9％，其表达的酪氨酸酚解酶的在20℃，40℃，60℃条件下的半衰期分别提高至37.9min，17.1min，14.6min，为代谢工程改造大肠杆菌生产L-DOPA奠定了基础。
附图说明
图1为构建重组pET-28(a)-TPL质粒图谱。
图2为不同菌株的酪氨酸酚解酶表达情况，其中，泳道0为空白对照，泳道1、2分别为含有质粒pET-28(a)-TPL菌株表达胞内上清蛋白和纯化的酪氨酸酚解酶，泳道3、4分别为含有质粒pET-28(a)-TPL(E313M)菌株表达的胞内上清蛋白和纯化的酪氨酸酚解酶，泳道5、6分别为含有质粒pET-28(a)-TPL(E313W)菌株表达的胞内上清蛋白和纯化的酪氨酸酚解酶。
图3为不同菌株转化的L-DOPA产量。
图4为不同菌株表达酪氨酸酚解酶的催化活性。
图5为不同菌株表达酪氨酸酚解酶的热稳定性。
具体实施方式
(一)L-DOPA的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260,UV检测器，NX-C18柱(4.6×250mm)，流动相:含有0.08％甲酸的水/乙腈＝92.4％/7.6％，流速0.8mL/min，柱温40℃，进样体积为10μL。
(二)培养基
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，营养琼脂15.0-20.0。
TB(发酵)培养基(g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4，KH2PO4 2.31，K2HPO4 12.54，pH 7.5。
灭菌条件：115℃，15min，所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入50mg/L硫卡那霉素。
实施例1重组质粒pET-28(a)-TPL和25个突变重组质粒的构建。
基于来自柠檬酸杆菌的酪氨酸酚解酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的3D模型TPL-PLP(PDB:2YHK，
Figure GDA0002632452490000051
)，通过Discovery Studio(DS)的Calculate Mutation Energy(Stability)模块对TPL活性中心周围
Figure GDA0002632452490000052
范围内的氨基酸进行虚拟突变确定关键氨基酸为Gly32，Gly73，Lys155，Gly326，Gly342，Gly189和Glu313，再次通过Discovery Studio(DS)的Calculate Mutation Energy(Stability)模块对关键氨基酸进行虚拟饱和突变，由突变能量表(表1)预测得到25株表达热稳定型酪氨酸酚解酶的菌株。
表1突变能量及预测突变效果
Figure GDA0002632452490000053
Figure GDA0002632452490000061
酪氨酸酚解酶(TPL)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)由南京金唯智公司合成，使用质粒pET-28(a)+作为表达载体，使用的酶切位点是BamH I和Hind III，酶切体系为：质粒16μL，BamH I 1μL，Hind III 1μL，10×Buffer 2μL。进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物或回收目的片段。同时将质粒pET-28(a)+做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。
连接插入片段和质粒，采用连接试剂盒。将载体和插入片段按1∶1到1∶10的分子数比混合，16℃下采用T4连接酶连接8h。然后转化E.coli.BL21(DE3)感受态细胞，感受态制备方法详见Takara大肠杆菌感受态试剂盒(货号：9139)说明书。挑选菌落PCR正确的转化子，得到重组质粒pET-28(a)-TPL(图1)。
以构建的质粒pET-28(a)-TPL为模板，使用全质粒扩增引物(表2)，PCR条件为：95℃预变性3min；98℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸4min，反应30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，获得25个突变重组线性质粒。
采用磷酸化试剂盒(购于Takara公司，货号：6127A)对线性质粒末端进行磷酸化，PCR纯化产物1μL，10×Blunting Kination Buffer 1μL，Blunting Kination Enzyme Mix0.5μL，ddH2O7.5μL，37℃反应10min，70℃热处理10min获得磷酸化产物，将5μL磷酸化产物与5μL的Ligation Solution I混合，16℃下反应8h。然后转化E.coli.JM109感受态细胞。挑选菌落PCR正确的转化子测序验证，得到25个突变重组质粒，然后转化E.coli.BL21(DE3)感受态细胞。
表2.构建25个突变体的引物
Figure GDA0002632452490000071
Figure GDA0002632452490000081
注：下划线表示酶切位点，下划线且加粗字母表示突变位点。
实施例2重组大肠杆菌全细胞转化法生产L-DOPA
将测序结果正确的分别含有质粒pET-28(a)-TPL和25个突变重组质粒的大肠杆菌菌株接种到LB平板(添加硫卡那霉素50mg/L)中，划线，37℃倒置培养12h左右长出大量菌落。
接种一环单菌落至LB培养基进行种子培养，37℃下220rpm培养12h左右。
按1％的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，37℃，220rpm培养2h后加入诱导剂0.4mM的IPTG并降温至20℃继续发酵10h，不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况相似，OD600均在25左右。
制备获得的发酵液6000rpm离心10min，收集湿菌体。将制备获得的湿菌体加入到转化液中，装液量50mL每500mL三角瓶，转化液中湿菌体的终浓度为60g/L，转化液含有丙酮酸钠16g/L，邻苯二酚10g/L，乙酸铵30g/L，Na2SO3 4g/L，EDTA 2g/L，5-磷酸吡哆醛30μM，氨水调节pH至8.5。反应条件为20℃，180rpm，避光，反应前3h每隔1h补加丙酮酸钠9g/L，邻苯二酚6g/L，补加两次，反应3至8h每隔2h补加丙酮酸钠6g/L，邻苯二酚4g/L，补加两次。反应8h后，向反应液中按20％体积量加入0.1M的盐酸，制备获得的反应液10000rpm离心3min，收集上清。
以含有质粒pET-28(a)-TPL的重组菌为对照，在相同条件下培养、发酵、全细胞转化，8h后L-DOPA产量为22.6g/L，而在25个突变重组菌株中，含有质粒pET-28(a)-TPL(E313W)和pET-28(a)-TPL(E313M)的菌株8h后L-DOPA产量分别为47.5g/L，54.9g/L，相比对照菌株分别提高了110.2％，142.9％(图3)。其他23个突变重组菌株相比于对照菌株，L-DOPA产量均无提高甚至有所下降。
实施例3重组大肠杆菌的酪氨酸酚解酶表达情况
将含有质粒pET-28(a)-TPL，pET-28(a)-TPL(E313W)和pET-28(a)-TPL(E313M)的菌株发酵液8000rpm离心3min收集菌体，使用PB缓冲液(pH 8.5，50mM KH2PO4-K2HPO4)洗涤细胞2-3次，超声破碎至菌液完全破碎呈透明状，9000rpm离心3min收集上清。采用镍柱Ni-NTA Superflow Cabridge(5mL)和AKTA纯化仪进行蛋白纯化。收集纯化获得的蛋白液，采用脱盐柱Sephadex-G(2mL)和AKTA纯化仪进行脱盐纯化，采用Enhanced BCA Protein AssayKit蛋白定量试剂盒(购于碧云天，货号：P0009)检测蛋白浓度，通过SDS-PAGE分析胞内蛋白表达及蛋白纯化情况(图2)，与含有质粒pET-28(a)-TPL的菌株相比，含有突变质粒pET-28(a)-TPL(E313M)和pET-28(a)-TPL(E313W)的菌株的酪氨酸酚解酶表达情况无明显差别。
实施例4不同菌株表达的酪氨酸酚解酶催化活性与热稳定性
通过L-DOPA的合成反应来测定酪氨酸酚解酶催化活性，定义一个酶活单位为每分钟合成1μmol L-DOPA的酶量。酶催化反应底物含有丙酮酸钠15g/L，邻苯二酚10g/L，乙酸铵30g/L，Na2SO3 4g/L，EDTA 2g/L，5-磷酸吡哆醛30μM，氨水调节pH 8.5，向900μL反应底物中加入100μL纯酶液激活酶催化反应开始，反应温度分别为20，30，40，50，60℃，避光，反应20min后向反应液中加入200μL的0.1mol盐酸终止反应。
不同温度条件下的酶活结果(图4)表明，在20℃，30℃，40℃条件下，含有突变质粒pET-28(a)-TPL(E313M)和pET-28(a)-TPL(E313W)的菌株表达的酪氨酸酚解酶酶活与含有质粒pET-28(a)-TPL的菌株表达的酪氨酸酚解酶酶活相近，而在50℃条件下，含有突变质粒pET-28(a)-TPL(E313M)和pET-28(a)-TPL(E313W)的菌株表达的酪氨酸酚解酶酶活比含有质粒pET-28(a)-TPL对照菌株表达的酪氨酸酚解酶酶活分别高60.3％，57.1％。在60℃，70℃温度条件下，含有突变质粒pET-28(a)-TPL(E313M)和pET-28(a)-TPL(E313W)的菌株表达的酪氨酸酚解酶酶活依然接近于最高酶活，而含有质粒pET-28(a)-TPL对照菌株表达的酪氨酸酚解酶几乎不具有催化活性。
将纯酶液分别于20，40，60℃水浴中分别保温10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min，90min，100min后进行酶催化反应，将在4℃条件下保存酪氨酸酚解酶的酶活定义为100％参考值，酶催化反应底物含有丙酮酸钠15g/L，邻苯二酚10g/L，乙酸铵30g/L，Na2SO3 4g/L，EDTA 2g/L，5-磷酸吡哆醛30μM，氨水调节pH 8.5，向900μL反应底物中加入100μL纯酶液激活酶催化反应开始，反应温度为20℃，避光，反应20min后向反应液中加入200μL的0.1M盐酸终止反应。
不同菌株表达的酪氨酸酚解酶热稳定性情况(图5)表明，经不同水浴温度保存，随着保存时间的延长，含有质粒pET-28(a)-TPL对照菌株表达的酪氨酸酚解酶酶活降低速率明显快于含有突变质粒pET-28(a)-TPL(E313M)和pET-28(a)-TPL(E313W)的菌株表达的酪氨酸酚解酶。经计算，对照菌株在20℃，40℃，60℃条件下的半衰期分别是7.84min，6.72min，0.38min；含有突变质粒pET-28(a)-TPL(E313M)的菌株表达的酪氨酸酚解酶的在20℃，40℃，60℃条件下的半衰期分别是37.9min，17.1min，14.6min；含有突变质粒pET-28(a)-TPL(E313W)的菌株表达的酪氨酸酚解酶的在20℃，40℃，60℃条件下的半衰期分别是21.7min，13.3min，7.7min。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用
<160> 58
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val
1 5 10 15
Ser Met Ile Pro Arg Asp Glu Arg Leu Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly
20 25 30
Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met
50 55 60
Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu
65 70 75 80
Glu Arg Thr Val Gln Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr
85 90 95
His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys
100 105 110
Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr
115 120 125
His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Val Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu
130 135 140
Ala His Asp Ala Gly Leu Asn Ile Ala Phe Lys Gly Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala
165 170 175
Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val
180 185 190
Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Ala Ala His Gly
195 200 205
Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe
210 215 220
Ile Lys Glu Gln Glu Gln Gly Phe Glu Asn Lys Ser Ile Ala Glu Ile
225 230 235 240
Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys
245 250 255
Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Asp
260 265 270
Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met
275 280 285
Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile
290 295 300
Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys
305 310 315 320
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Ala Ala Gly Val Pro Ile
325 330 335
Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe
340 345 350
Cys Glu His Leu Thr Gln Asp Glu Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala
355 360 365
Ser Ile Tyr Val Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Gly Arg Asn Asn Val Thr Gly Glu His His Arg Pro Lys Leu
385 390 395 400
Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His
405 410 415
Met Asp Val Val Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu
420 425 430
Asp Ile Arg Gly Leu Lys Phe Ile Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe
435 440 445
Phe Thr Ala Arg Phe Asp Tyr Ile
450 455
<210> 2
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val
1 5 10 15
Ser Met Ile Pro Arg Asp Glu Arg Leu Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly
20 25 30
Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met
50 55 60
Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu
65 70 75 80
Glu Arg Thr Val Gln Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr
85 90 95
His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys
100 105 110
Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr
115 120 125
His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Val Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu
130 135 140
Ala His Asp Ala Gly Leu Asn Ile Ala Phe Lys Gly Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala
165 170 175
Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val
180 185 190
Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Ala Ala His Gly
195 200 205
Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe
210 215 220
Ile Lys Glu Gln Glu Gln Gly Phe Glu Asn Lys Ser Ile Ala Glu Ile
225 230 235 240
Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys
245 250 255
Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Asp
260 265 270
Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met
275 280 285
Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile
290 295 300
Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Met Tyr Ile Glu His Arg Val Lys
305 310 315 320
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Ala Ala Gly Val Pro Ile
325 330 335
Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe
340 345 350
Cys Glu His Leu Thr Gln Asp Glu Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala
355 360 365
Ser Ile Tyr Val Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Gly Arg Asn Asn Val Thr Gly Glu His His Arg Pro Lys Leu
385 390 395 400
Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His
405 410 415
Met Asp Val Val Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu
420 425 430
Asp Ile Arg Gly Leu Lys Phe Ile Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe
435 440 445
Phe Thr Ala Arg Phe Asp Tyr Ile
450 455
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<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val
1 5 10 15
Ser Met Ile Pro Arg Asp Glu Arg Leu Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly
20 25 30
Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu
65 70 75 80
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85 90 95
His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys
100 105 110
Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr
115 120 125
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Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val
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275 280 285
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355 360 365
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Met Asp Val Val Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu
420 425 430
Asp Ile Arg Gly Leu Lys Phe Ile Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe
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Phe Thr Ala Arg Phe Asp Tyr Ile
450 455
<210> 4
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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atcccgcgcg acgaacgtct gaaaaagatg caggaagcgg gttataacac ctttctgctg 120
aacagcaaag acatctacat cgacctgctg accgattctg gtaccaacgc gatgtccgat 180
aaacagtggg ctggtatgat gatgggcgac gaagcatacg cgggtagcga aaacttttac 240
cacctggaac gtaccgttca ggaactgttt ggcttcaaac acattgttcc gacccatcaa 300
ggtcgcggtg cagaaaatct gctgagtcag ctggcaatta aaccgggtca gtacgttgcc 360
ggtaacatgt acttcaccac cacccgctat catcaggaga aaaacggcgc ggtcttcgtc 420
gatattgttc gcgacgaagc acacgacgca ggtctgaata tcgcgttcaa aggcgacatc 480
gacctgaaaa aactgcagaa actgatcgac gagaaaggcg cagaaaacat tgcgtatatc 540
tgcctggcag ttaccgttaa tctggcaggc ggtcaaccgg tttctatggc aaatatgcgc 600
gcagttcgcg aactgaccgc agcacacggt attaaagtct tttacgacgc tacccgttgc 660
gttgaaaacg cgtacttcat caaagagcag gagcagggct tcgaaaacaa aagcatcgcg 720
gagatcgtcc acgaaatgtt tagctacgct gacggttgca ccatgtctgg caaaaaagac 780
tgcctggtca acattggcgg ctttctgtgc atgaacgacg acgaaatgtt cagcagcgcg 840
aaagaactgg tcgttgttta cgaaggtatg ccgtcttacg gtggtctggc tggtcgcgat 900
atggaagcaa tggcaattgg tctgcgcgaa gcaatgcagt acgagtacat cgagcatcgc 960
gtcaaacagg ttcgctatct gggcgacaaa ctgaaagcag caggtgttcc gattgttgaa 1020
ccggtaggcg gtcacgcagt ttttctggac gcacgtcgtt tttgcgaaca tctgacccag 1080
gacgaatttc cggcacaaag tctggcagca agcatttacg ttgaaaccgg cgtccgtagt 1140
atggaacgcg gtattattag cgcgggtcgt aataacgtta ccggcgaaca tcatcgtccg 1200
aaactggaaa ccgttcgtct gaccattccg cgtcgcgttt atacctacgc gcacatggac 1260
gttgtcgcgg acggtatcat caaactgtac cagcataaag aggacatccg cggcctgaaa 1320
ttcatctacg agccgaaaca gctgcgcttt ttcaccgcgc gcttcgacta tatctaaaag 1380
ctt 1383
<210> 5
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 6
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<212> DNA
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<400> 8
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 12
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 14
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<400> 18
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<212> DNA
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<400> 19
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gtactgcatt gcttcgcgca gaccaattgc c 31
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gtactgcatt gcttcgcgca gaccaattgc c 31
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 50
gtactgcatt gcttcgcgca gaccaattgc c 31
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tttgacaaac tgaaagcagc aggtgttccg 30
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caggacaaac tgaaagcagc aggtgttccg 30
<210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
cagatagcga acctgtttga cgcgatgctc g 31
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
acccacgcag tttttctgga cgcacg 26
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gcctaccggt tcaacaatcg gaacacc 27

Claims (10)

1.一种酪氨酸酚解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述酪氨酸酚解酶突变体的基因。
3.含权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.一种基因工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的酪氨酸酚解酶突变体。
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。
6.如权利要求4或5所述的基因工程菌，其特征在于，以pET系列载体为表达载体。
7.一种生产酪氨酸酚解酶的方法，其特征在于，应用权利要求5～6任一所述的基因工程菌进行发酵生产。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是先在35-38℃下发酵2-4h，再加入诱导剂0.2-0.5mM的IPTG并降温至20-25℃，继续发酵10-14h。
9.一种左旋多巴的全细胞转化制备方法，其特征在于，以权利要求4～6任一所述的基因工程菌为全细胞催化剂，以丙酮酸钠、邻苯二酚、铵盐为底物，进行全细胞转化。
10.权利要求1所述的酶突变体在制备左旋多巴或含左旋多巴的产品中的应用。
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