CN113444699B - 一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用 - Google Patents
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Abstract
一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过定点突变的方法，将乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸变为天冬氨酸，将乙酰丙酮裂解酶突变体用于乙酰丙酮的合成后，提高了乙酰丙酮的产量，达到86.7mg/L，本发明对乙酰丙酮裂解酶的工程改造和乙酰丙酮的生物合成提供了良好范例。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用。
背景技术
乙酰丙酮，又名2,4-戊二酮（CAS NO. 123-54-6）。其广泛应用于燃料添加剂、染料中间体、树脂改性剂、金属提炼等，国内90％的乙酰丙酮用于医药和兽药的生产。近年来，乙酰丙酮下游医药出口形势越来越好，需求得到快速增长。当前乙酰丙酮的生产，主要是以化学合成法为主。但化学合成乙酰丙酮步骤繁琐，存在能耗高（500-600℃）、污染重等瓶颈问题，不符合当今低碳经济的需求。
生物法合成效率高、能耗低、能够避免大量污染物的生成，和化学法相比优势明显。但乙酰丙酮的生物合成方法尚未引起广泛关注。乙酰丙酮可以被约翰逊不动杆菌Acinetobacter johnsonii降解利用，但是可逆反应是否能实现，还没有相关研究。在中国专利CN201810865467.0中，通过对来自Acinetobacter johnsonii的乙酰丙酮裂解酶基因核苷酸序列进行优化，在大肠杆菌体内过表达后，首次实现了乙酰丙酮的生物合成。但是，乙酰丙酮的合成效率还比较低，产量只有53mg/L。
发明内容
为了提高生物法合成乙酰丙酮的合成效率，本发明提供了一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用。具体技术方案如下：
一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体，所述乙酰丙酮裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，是将SEQ ID NO.3所示乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸替换为天冬氨酸获得的。
本发明还提供了编码上述乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸，所述核苷酸序列为下述的一种：
1). SEQ ID No.2所示核苷酸序列；
2). 与SEQ ID No.2所示核苷酸序列互补的核苷酸序列；
3). 与1)或2)所述核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与1)或2)的核苷酸序列不同的核苷酸序列。
本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体的出发质粒为pETDuet-1。
本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组菌。
在本发明的一个实施例中，所述重组菌的出发菌株为大肠杆菌。
本发明还提供了上述乙酰丙酮裂解酶突变体在生产乙酰丙酮中的应用。
本发明还提供了上述编码乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸在生产乙酰丙酮中的应用。
本发明还提供了上述重组载体在生产乙酰丙酮中的应用。
本发明还提供了上述重组菌在生产乙酰丙酮中的应用。
在本发明的一个实施例中，生产乙酰丙酮的方法如下：将重组菌菌株接种到发酵培养基中（内含100μg·mL-1氨苄青霉素），30～37℃，振荡培养至OD600为0.5-0.8，然后加入 IPTG进行诱导24-72h，制备获得生产乙酰丙酮。
优选地，上述生产乙酰丙酮的方法如下：将重组菌菌株接种到发酵培养基中（内含100μg·mL-1氨苄青霉素），30℃，振荡培养至OD600为0.6，然后加入 IPTG进行诱导24h，制备获得生产乙酰丙酮。
有益效果：
本发明通过定点突变的方式，将乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸变为天冬氨酸，将改造后的酶在E.coli BL21(DE3)内表达后，乙酰丙酮产量提高了63.1%，达到86.7mg/L。
具体实施方式
定义和缩写
本发明中使用下列的缩写或简称：
乙酰丙酮裂解酶基因：dke1
大肠杆菌(Escherichia coli)：E. coli
Dke1A60D代表乙酰丙酮裂解酶突变体，右上角“A60D”代表野生型乙酰丙酮裂解酶基因dke1编码的氨基酸中第60位的丙氨酸突变为天冬氨酸。
下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收 DNA 片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
LB液体培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH 7。
LB固体培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，15g/L琼脂，pH 7。
摇瓶发酵培养基：20 g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH 7。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg•mL-1氨苄青霉素。
实施例1.制备提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体编码基因的表达载体
对来源于约翰逊不动杆菌的乙酰丙酮裂解酶基因序列进行密码子优化，并通过苏州金唯智公司合成该基因（SEQ ID NO.4）。以合成的基因为模板，利用定点突变，设计引物。
通过PCR扩增分别获得dke1基因上游片段（引物为F：CGGGATCCGATGGACTACTGCAACA和R：CAGCGTGGATGTGAGAATCGAAAGAAGAACCAGCC）和下游片段（引物为F：GGCTGGTTCTTCTTTCGATTCTCACATCCACGCTG和R：CGGAATTCTTAAGCAGCTTCGTTTTTGGTA），再利用回收试剂盒回收目的片段。以获得的上下游片段为底物，通过搭桥PCR（引物为F：CGGGATCCGATGGACTACTGCAACA和R：CGGAATTCTTAAGCAGCTTCGTTTTTGGTA）获得第60位的丙氨酸变为天冬氨酸的乙酰丙酮裂解酶突变基因序列Dke1A60D，序列如SEQ ID NO.2所示，使SEQ ID NO.4所示的编码乙酰丙酮裂解酶的基因的第179位碱基变为腺嘌呤，突变后的乙酰丙酮裂解酶氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，相对于未突变的乙酰丙酮裂解酶（如SEQ ID NO.3所示序列）第60位丙氨酸变为天冬氨酸。
PCR条件为95℃ 3min,35个循环（95℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 1min），72℃5min，16℃保温。
PCR扩增体系为模板1μL，上下游引物各1μL，2×Prime STAR max 25μL，ddH2O 22μL。
将获得的Dke1A60D片段和质粒pETDuet-1用BamHI和EcoRI酶切，回收酶切产物；再进行连接：回收的载体与dke1基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上；回收连接产物，得到提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体编码基因的表达载体，命名为pETDuet-Dke1A60D。
实施例2 .制备表达提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体编码基因的重组菌。
将实施例1中获得的载体pETDuet-Dke1A60D导入E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，涂布在含有100μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。挑取单克隆在固体LB平板上划线，37℃恒温培养箱继续培养至再次长出单克隆，以单克隆为模板，通过菌落PCR验证（引物为F：GATGCGTCCGGCGTAGAGC和R：GCTAGTTATTGCTCAGCGG），验证正确后，获得含有乙酰丙酮裂解酶突变体的重组大肠杆菌E. coli BL21（pETDuet-Dke1A60D）。
实施例3.表达提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌在生产乙酰丙酮中的应用
将实施例2获得的重组大肠杆菌E. coli BL21（pETDuet-Dke1A60D）单克隆在LB培养中进行活化，活化后的菌株按活化液与发酵培养基体积比1:100的比例接种到含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中（内含100μg·mL-1氨苄青霉素），37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.05mM IPTG进行诱导，诱导后24h终止发酵。
乙酰丙酮产物的检测：
发酵结束后，取1mL发酵液高速离心保留上清。通过GC-MS进样1μL进行产物分析，对乙酰丙酮产物定性证明。GC-MS的气相色谱柱为HP-5MS 5%Phenyl Methyl Silox(30m×0.25mm,0.25μm)，程序升温从50℃开始保持5min，以15℃/min 的速度升温到240℃，保持5min。利用HPLC对乙酰丙酮产物进行定量分析。液相色谱色谱柱为HPX-87H，280nm紫外检测器，流动相为5mM H2SO4，流速0.6ml/min，温度60℃，进样量50μL，测得乙酰丙酮产量为86.7mg/L，相比利用未突变酶进行生产提高了63.1%。
对比例1.按照与实施例1相同的策略，将乙酰丙酮裂解酶第101位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸，上游片段扩增引物为F：CGGGATCCGATGGACTACTGCAACA和R：GTTTTACCGTGCAGAGCATCAGAAGATTCCAAACCGT
，下游片段扩增引物为F：ACGGTTTCGAATCTTCTGATGCTCTGCACGGTAAAAC
和R：CGGAATTCTTAAGCAGCTTCGTTTTTGGTA，搭桥PCR引物为F：CGGGATCCGATGGACTACTGCAACA和R：CGGAATTCTTAAGCAGCTTCGTTTTTGGTA,得到乙酰丙酮裂解酶突变体编码基因的表达载体，命名为pETDuet-Dke1G101D。
按照实施例2相同的策略制备获得重组大肠杆菌E. coli BL21（pETDuet-Dke1G101D）。
按照实施例3的发酵方法生产乙酰丙酮，获得乙酰丙酮的产量为4.0mg/L，相比利用未突变酶进行生产降低了87.5%。
上述实施例中所述“未突变酶”为对照组，是指参照实施例1所述的构建方法，以大肠杆菌BL21为出发菌株，导入经密码子优化后的乙酰丙酮裂解酶基因（SEQ ID NO.4）构建乙酰丙酮裂解酶未突变的表达载体，然后参照实施例2的方法获得重组菌，参照实施例3的方法进行乙酰丙酮的发酵生产。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、
重组菌及应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> 乙酰丙酮裂解酶突变体
<400> 1
Met Asp Tyr Cys Asn Lys Lys His Thr Ala Glu Glu Tyr Val Lys Ile
1 5 10 15
Ser Asp Asn Asn Tyr Val Pro Phe Pro Glu Ala Phe Ser Asp Gly Gly
20 25 30
Ile Thr Trp Gln Leu Leu His Ser Ser Pro Glu Thr Ser Ser Trp Thr
35 40 45
Ala Ile Phe Asn Cys Pro Ala Gly Ser Ser Phe Asp Ser His Ile His
50 55 60
Ala Gly Pro Gly Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Gly Lys Met Glu Val Arg
65 70 75 80
Gly Gly Glu Gln Glu Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Pro Ser Tyr Gly
85 90 95
Phe Glu Ser Ser Gly Ala Leu His Gly Lys Thr Phe Phe Pro Val Glu
100 105 110
Ser Gln Phe Tyr Met Thr Phe Leu Gly Pro Leu Asn Phe Ile Asp Asp
115 120 125
Asn Gly Lys Val Ile Ala Ser Ile Gly Trp Ala Glu Ala Gln Gly Ala
130 135 140
Trp Leu Ala Thr Lys Asn Glu Ala Ala
145 150
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> 编码乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸
<400> 2
atggactact gcaacaaaaa acacaccgct gaagaatacg ttaaaatctc tgacaacaac 60
tacgttccgt tcccggaagc gttctctgac ggtggtatca cctggcagct gctgcactct 120
tctccggaaa cctcttcttg gaccgctatc ttcaactgcc cggctggttc ttctttcgat 180
tctcacatcc acgctggtcc gggtgaatac ttcctgacca aaggtaaaat ggaagttcgt 240
ggtggtgaac aggaaggtgg ttctaccgct tacgctccgt cttacggttt cgaatcttct 300
ggtgctctgc acggtaaaac cttcttcccg gttgaatctc agttctacat gaccttcctg 360
ggtccgctga acttcatcga cgacaacggt aaagttatcg cttctatcgg ttgggctgaa 420
gctcagggtg cttggctggc taccaaaaac gaagctgctt aa 462
<210> 3
<211> 153
<212> PRT
<213> 未突变的乙酰丙酮裂解酶
<400> 3
Met Asp Tyr Cys Asn Lys Lys His Thr Ala Glu Glu Tyr Val Lys Ile
1 5 10 15
Ser Asp Asn Asn Tyr Val Pro Phe Pro Glu Ala Phe Ser Asp Gly Gly
20 25 30
Ile Thr Trp Gln Leu Leu His Ser Ser Pro Glu Thr Ser Ser Trp Thr
35 40 45
Ala Ile Phe Asn Cys Pro Ala Gly Ser Ser Phe Ala Ser His Ile His
50 55 60
Ala Gly Pro Gly Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Gly Lys Met Glu Val Arg
65 70 75 80
Gly Gly Glu Gln Glu Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Pro Ser Tyr Gly
85 90 95
Phe Glu Ser Ser Gly Ala Leu His Gly Lys Thr Phe Phe Pro Val Glu
100 105 110
Ser Gln Phe Tyr Met Thr Phe Leu Gly Pro Leu Asn Phe Ile Asp Asp
115 120 125
Asn Gly Lys Val Ile Ala Ser Ile Gly Trp Ala Glu Ala Gln Gly Ala
130 135 140
Trp Leu Ala Thr Lys Asn Glu Ala Ala
145 150
<210> 4
<211> 462
<212> DNA
<213> 密码子优化后的乙酰丙酮裂解酶基因
<400> 4
atggactact gcaacaaaaa acacaccgct gaagaatacg ttaaaatctc tgacaacaac 60
tacgttccgt tcccggaagc gttctctgac ggtggtatca cctggcagct gctgcactct 120
tctccggaaa cctcttcttg gaccgctatc ttcaactgcc cggctggttc ttctttcgct 180
tctcacatcc acgctggtcc gggtgaatac ttcctgacca aaggtaaaat ggaagttcgt 240
ggtggtgaac aggaaggtgg ttctaccgct tacgctccgt cttacggttt cgaatcttct 300
ggtgctctgc acggtaaaac cttcttcccg gttgaatctc agttctacat gaccttcctg 360
ggtccgctga acttcatcga cgacaacggt aaagttatcg cttctatcgg ttgggctgaa 420
gctcagggtg cttggctggc taccaaaaac gaagctgctt aa 462
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> dke1基因上游片段引物F
<400> 5
cgggatccga tggactactg caaca 25
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> dke1基因上游片段引物R
<400> 6
cagcgtggat gtgagaatcg aaagaagaac cagcc 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> dke1基因下游片段引物为F
<400> 7
ggctggttct tctttcgatt ctcacatcca cgctg 35
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> dke1基因下游片段引物R
<400> 8
cggaattctt aagcagcttc gtttttggta 30
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物F
<400> 9
gatgcgtccg gcgtagagc 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物R
<400> 10
gctagttatt gctcagcgg 19
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物R
<400> 11
gttttaccgt gcagagcatc agaagattcc aaaccgt 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物F
<400> 12
acggtttcga atcttctgat gctctgcacg gtaaaac 37
Claims (10)
1.一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体，其特征在于，所述乙酰丙酮裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，是将SEQ ID NO.3所示乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸替换为天冬氨酸获得的。
2.一种编码权利要求1所述的乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.含有权利要求2所述的核苷酸的重组载体。
4.含有权利要求2所述的核苷酸的重组菌。
5.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发质粒为pETDuet-1。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌株为大肠杆菌。
7.权利要求1所述的乙酰丙酮裂解酶突变体在生产乙酰丙酮中的应用。
8.权利要求2所述的编码乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸在生产乙酰丙酮中的应用。
9.权利要求3所述的重组载体在生产乙酰丙酮中的应用。
10.权利要求4所述的重组菌在生产乙酰丙酮中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 定点突变技术的研究进展;张浩等;《免疫学杂志》;20000731;第16卷(第4期);全文 * |
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| CN113444699A (zh) | 2021-09-28 |
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