CN106701843A

CN106701843A - 一种以邻苯二酚为底物的咖啡酸高效生物合成方法

Info

Publication number: CN106701843A
Application number: CN201610928662.4A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 陈坚; 吕永坤; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明公开了一种以邻苯二酚为底物的咖啡酸高效生物合成方法，属于生物化工领域。本发明中，酪氨酸苯裂合酶以邻苯二酚、丙酮酸和氨作为底物，合成左旋多巴，酪氨酸氨基裂合酶将左旋多巴转化为反‑咖啡酸和NH₃。由于邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵均为相对廉价的化合物，因此本发明是一种具有较大潜力的咖啡酸生物合成方法。与以往的以L‑酪氨酸为底物的转化方法相比，该方法所用的底物更加廉价且易于大规模生产。与化学合成方法相比，该方法的产物为单一的反‑咖啡酸，不需要对同分异构体进行进一步的分离。

Description

一种以邻苯二酚为底物的咖啡酸高效生物合成方法

技术领域

本发明涉及一种以邻苯二酚为底物的咖啡酸高效生物合成方法，属于生物化工领域。

背景技术

咖啡酸是一种高价值的芳香类化合物，结构上可划分为羟基肉桂酸，其同时具有酚羟基和丙烯酸2个官能团。体内和体外研究表明，咖啡酸具有一系列生理功能。例如，通过氧化机制，咖啡酸可以抑制癌细胞增殖；咖啡酸具有免疫调节和抗炎活性；咖啡酸亦可作为抗氧化剂，且优于其他天然化合物；另外，咖啡酸还具有抗病毒、抗抑郁、治疗糖尿病等活性。

作为木质素合成的关键中间代谢产物，咖啡酸存在于几乎所有植物中。该途径以L-酪氨酸或L-苯丙氨酸为前体，涉及到反-肉桂酸4-单加氧酶(CYP73A)、苯丙氨酸/酪氨酸氨基裂合酶、对香豆酸3-羟化酶等。然而，咖啡酸在植物中的含量普遍很低，因此提取困难。另一方面，化学方法合成的咖啡酸为顺势咖啡酸和反式咖啡酸的混合物；且由于结构的相似性，完全分离纯化出单一的任一化合物都较为困难。通过合成生物学途径策略，将咖啡酸在植物中的合成途径平移至微生物底盘中，构建具有咖啡酸合成能力的工程菌是目前主要的研究思路。

然而，由于酪氨酸等底物的溶解性较差，该类工程菌的咖啡酸产量和对底物的转化率均较低。通过以L-酪氨酸高产菌株作为咖啡酸异源合成途径的底盘，有助于解决该问题，然而效果并不理想，其表现为生产周期较长，且产量并未显著提高。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种咖啡酸的生物合成方法，为此，本发明首先提供了一种共表达酪氨酸苯裂合酶CfTPL和酪氨酸氨基裂合酶TcXAL的重组大肠杆菌。所构建的重组菌株在较宽的底物浓度范围及反应条件下，均能有效合成咖啡酸。

所述的酪氨酸苯裂合酶CfTPL来源于弗劳地柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii，酪氨酸苯裂合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码酪氨酸苯裂合酶的基因序列如SEQID NO.3所示。

所述的酪氨酸氨基裂合酶基因TcXAL来源于皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)，酪氨酸氨基裂合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码酪氨酸氨基裂合酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所用的表达载体为pET28a(PB)，该载体用于单独表达CfTPL或通过ePathBrick构建CfTPL和TcXAL的共表达结构。其DNA序列为SEQ ID NO.5。

在本发明的一种实施方式中，基因CfTPL和TcXAL通过ePathBrick策略构建不同的共表达结构。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是通过pET28a(PB)以假操纵子的结构顺序表达基因CfTPL和TcXAL。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是通过pET28a(PB)以单顺反子的结构顺序表达基因CfTPL和TcXAL。

本发明还提供应用所述重组大肠杆菌以邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵等低值化合物作为底物，通过全细胞转化合成咖啡酸的方法。

在本发明的一种实施方式中，重组大肠杆菌的培养使用TB培养基。

在本发明的一种实施方式中，全细胞转化的反应介质是磷酸盐缓冲液，重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1，邻苯二酚浓度范围为10–100mM，NH₄Cl、丙酮酸钠和邻苯二酚的浓度的比例为13：1：1；反应温度25–42℃。

在本发明的一种实施方式中，全细胞转化的反应介质是50mM的磷酸盐缓冲液，重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1，底物的浓度为NH₄Cl 0.65M、丙酮酸钠50mM和邻苯二酚50mM；37℃、220rpm条件下反应。

本发明中，酪氨酸苯裂合酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)以邻苯二酚、丙酮酸和氨作为底物，合成3,4-二羟基L-苯丙氨酸(L-DOPA，左旋多巴)。来源于皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)的酪氨酸氨基裂合酶TcXAL将左旋多巴转化为反-咖啡酸和NH₃，如式(1)所示：

3,4-二羟基L-苯丙氨酸反-咖啡酸+NH₃ (1)。

由于邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵均为相对廉价的化合物，因此该方法是一种具有较大潜力的咖啡酸生物合成方法。总的来说，本发明创建了一种将低值化合物转化为咖啡酸的生物合成方法。与以往的以L-酪氨酸为底物的转化方法相比，该方法所用的底物更加廉价且易于大规模生产。与化学合成方法相比，该方法的产物为单一的反-咖啡酸，不需要对同分异构体进行进一步的分离。

附图说明

图1、将邻苯二酚、丙酮酸和氨转化为咖啡酸的技术路线。

图2、pET28a(PB)的结构。

图3、CfTPL和TcXAL的不同共表达结构。

图4、左旋多巴的色谱图和质谱图。其中，A为色谱图，B为一级质谱图，C为二级质谱图。

图5、strCL-1转化左旋多巴合成的产量曲线。

图6、咖啡酸的色谱图。其中，1为咖啡酸对应的色谱峰。

图7、咖啡酸的质谱图。其中，A为负离子模式下m/z＝179.0350对应的提取粒子流，B为一级质谱图，C为二级质谱图。

图8、含有不同共表达结构的重组大肠杆菌对应的最大咖啡酸产量。

具体实施方式

材料与方法

邻苯二酚、左旋多巴(L-DOPA)和咖啡酸标准品购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，分析纯邻苯二酚、左旋多巴(L-DOPA)、氯化铵和丙酮酸钠购自生工生物工程(上海)有限公司。来源于弗劳地柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii的酪氨酸苯裂合酶基因CfTPL和来源于皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum的酪氨酸氨基裂合酶基因TcXAL由金斯瑞生物科技有限公司优化并合成。酪氨酸苯裂合酶、酪氨酸氨基裂合酶的氨基酸序列分别为SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，编码酪氨酸苯裂合酶、酪氨酸氨基裂合酶的DNA序列分别为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4。

TB培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油4ml/L，磷酸二氢钾17mM，磷酸氢二钾72mM。为防止沉淀，将磷酸二氢钾/磷酸氢二钾配制成10倍浓度的母液，过滤除菌，使用前加入。其他成分121℃高压蒸汽灭菌15min。

50mM磷酸盐缓冲液PBS：分别配置50mM的NaH₂PO₄和50mM的Na₂HPO₄，以NaH₂PO₄滴定Na₂HPO₄至不同的pH。

全细胞转化的样品分析：将样品12000rpm离心2min，取上清，以甲醇稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过滤。样品分析使用Shimadzu LC-MS/MS-IT-TOF，进样体积10μL，使用自动进样器进样。使用C18反向色谱柱(Thermo scientific,ODS-2HYPERSIL,Dim.(mm)250×4.6,particle size 5μm)对样品进行分离。流动相A为水，流动相B为甲醇。使用梯度洗脱，0min 5％B，8min 25％B，9min 5％B，维持该浓度至12min。流速为1mL/min。柱温：40℃。使用紫外检测器，λ＝323nm测定咖啡酸，λ＝280nm测定左旋多巴。质谱分析使用负离子模式，以提取离子流(extracted ion chromatograms,EIC)m/z＝179.0350检测咖啡酸，以提取离子流m/z＝196.0615检测左旋多巴。二级质谱MS/MS分析的前体分别为：咖啡酸179.0350m/z，左旋多巴196.0615m/z；宽度设置为1Da。通过与标准品的保留时间、一级质谱、二级质谱图进行比对，确定目标物质。使用液相色谱图的峰面积对咖啡酸和左旋多巴进行定量分析。

实施例1重组大肠杆菌的构建方法

基因CfTPL(SEQ ID NO.3)和TcXAL(SEQ ID NO.4)由金斯瑞生物科技有限公司优化合成，并克隆至pUC57-Simple，重组质粒命分别名为pUC57-CfTPL和pUC57-TcXAL。pET28a(PB)是以pET-28a(+)为基础构建的ePathBrick表达载体，该载体包含同尾酶Avr II、XbaI、Spe I和Nhe I及下游的Sal I，可以通过ePathBrick策略构建不同的共表达结构。pET28a(PB)的结构如图2，DNA序列为SEQ ID NO.5。

分别使用限制性内切酶Bam HI/HindIII消化重组载体pUC57-CfTPL、pUC57-TcXAL和表达载体pET28a(PB)，使用琼脂糖凝胶电泳分离没切产物，并分别回收目的基因CfTPL(1371bp)、TcXAL(2070bp)和表达载体(5371bp)。按照摩尔比4:1分别将目的基因和表达载体pET28a(PB)混合，使用T4连接酶在16℃条件下连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。通过菌落PCR验证阳性转化子，所用引物序列为SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7。

将阳性转化子转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养后提取质粒。经Bam HI/Hind III双酶切验证正确的重组质粒分别标记为pET-CfTPL和pET-TcXAL。根据4种同尾酶Avr II、Xba I、SpeI、Nhe I及Sal I的组合，分别通过酶切、连接构建不同结构的共表达载体。分别通过酶切位点SpeI/Sal I和Xba I/Sal I对pET-CfTPL和pET-TcXAL进行双酶切，分别回收大小为6.7kb和2.1kb的片段，通过T4核酸连接酶连接后得到重组质粒pTXe1。分别通过酶切位点Nhe I/Sal I和Avr II/Sal I对pET-CfTPL和pET-TcXAL进行双酶切，分别回收大小为6.7kb和2.1kb的片段，通过T4核酸连接酶连接后得到重组质粒pTXe3。不同的表达结构如图3所示。所构建的共表达载体经Sanger测序验证正确后，分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建得到一系列工程菌株，如表1所示。

表1含有不同共表达结构的重组大肠杆菌菌株

重组大肠杆菌的培养方法：将平板划线分离的单菌落转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养。以1％(v/v)的接种量转接至装有25mL TB培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素。37℃、220rpm培养4h后，添加终浓度为500μM的IPTG诱导CfTPL和TcXAL的表达，将三角瓶转移至25℃、220rpm，继续培养10h。将菌液收集到离心管中，4000rpm、4℃离心5min收集菌体。

咖啡酸的全细胞转化方法：以25mL PBS洗涤收集的菌体，离心后重悬于等体积的PBS(50mM,pH 7.0)中，菌体浓度为OD₆₀₀＝18±1。同时添加0.65M NH₄Cl、50mM丙酮酸钠和50mM邻苯二酚作为底物进行反应，该反应在恒温摇床上进行。在不同的时间点取样进行分析。

实施例2重组大肠杆菌strCL-1催化左旋多巴合成能力分析

为了验证表1中的重组大肠杆菌E.coli strCL-1催化邻苯二酚合成左旋多巴的能力，按照实施例1中的转化方法，以含有空质粒pET28a(PB)的大肠杆菌BL21(DE3)作为空白对照，以PBS(50mM,pH 7.0)作为反应介质，在37℃、220rpm条件下反应，特定时间点取样，测定左旋多巴的合成情况。

结果表明，以E.coli strCL-1催化的反应体系中有左旋多巴的合成，而空白对照中则未检测到左旋多巴。该结果验证了CfTPL催化邻苯二酚合成左旋多巴的能力，且在没有酪氨酸苯裂合酶存在的情况下该合成过程不能自发进行。左旋多巴的色谱图和质谱图如图4，其中，A为左旋多巴的色谱图，B为一级质谱图，C为二级质谱图。通过左旋多巴的产量对取样时间点作图，可以确定在转化0.5小时左旋多巴即达到最大产量1.64g/L，如图5所示。

实施例3重组大肠杆菌催化邻苯二酚合成咖啡酸能力验证

为了验证表1所列重组大肠杆菌转化邻苯二酚、丙酮酸和氯化铵合成咖啡酸的能力，以25mL PBS洗涤收集的菌体，离心后重悬于等体积的PBS(50mM,pH 7.0)中，菌体浓度为OD₆₀₀＝18±1。同时添加0.65M NH₄Cl、50mM丙酮酸钠和50mM邻苯二酚作为底物进行反应，该反应在37℃、220rpm恒温摇床上进行。以含有空质粒pET28a(PB)的大肠杆菌BL21(DE3)作为空白对照。在不同的时间点取样进行分析测定咖啡酸的合成情况。以0-10小时内咖啡酸的最大产量作为该菌株对应的最大产量。

结果表明，除strXTe2外，重组大肠杆菌均能够催化邻苯二酚、丙酮酸和氯化铵合成咖啡酸；且空白对照的转化体系中不能检测到咖啡酸的合成。样品分析的色谱图如图6所示，其中咖啡酸对应的色谱峰为(1)；样品分析的质谱图如图7所示，其中A为负离子模式下m/z＝179.0350对应的提取粒子流，B为一级质谱图，C为二级质谱图。

strTXe1对应的咖啡酸产量最高，说明该重组大肠杆菌对应的CfTPL和TcXAL共表达结构能够平衡底物到咖啡酸的代谢流。

表2不同重组大肠杆菌所携带的外源基因结构及咖啡酸产量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种以邻苯二酚为底物的咖啡酸高效生物合成方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> 弗劳地柠檬酸杆菌

<400> 1

Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val

1 5 10 15

Ser Met Ile Pro Arg Asp Glu Arg Leu Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly

20 25 30

Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu

35 40 45

Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met

50 55 60

Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu

65 70 75 80

Glu Arg Thr Val Gln Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr

85 90 95

His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys

100 105 110

Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr

115 120 125

His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Val Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu

130 135 140

Ala His Asp Ala Gly Leu Asn Ile Ala Phe Lys Gly Asp Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala

165 170 175

Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val

180 185 190

Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Ala Ala His Gly

195 200 205

Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe

210 215 220

Ile Lys Glu Gln Glu Gln Gly Phe Glu Asn Lys Ser Ile Ala Glu Ile

225 230 235 240

Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys

245 250 255

Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Asp

260 265 270

Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met

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290 295 300

Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys

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Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe

340 345 350

Cys Glu His Leu Thr Gln Asp Glu Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala

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<212> PRT

<213> 皮状丝孢酵母

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Ala His Ser Gln Ala Thr Lys Thr Val Ser Ile Asp Gly His Thr Met

35 40 45

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65 70 75 80

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Phe

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<211> 1371

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ctggaagtcc tgcagagctt tgccgatttc attaatcgtg gtctggttcc gtgcgtcccg 540

ctgcgtggta ccatcagtgc atccggtgac ctgtcaccgc tgtcgtatat tgctggcgcg 600

atctgtggtc atccggatgt taaagtcttc gacaccgcag cttcaccgcc gaccgttctg 660

acgtcgccgg aagcaattgc aaaatatggc ctgaaaaccg tcaaactggc gagcaaagaa 720

ggcctgggtc tggttaacgg tacggcagtc tctgcggcgg caggtgctct ggcactgtac 780

gatgccgaat gcctggcaat catgagtcag accaatacgg tgctgaccgt tgaagctctg 840

gacggccatg ttggttcctt tgcaccgttc attcaggaaa tccgtccgca cgcgggccaa 900

attgaagctg cgcgtaacat ccgccatatg ctgggcggtt caaaactggc cgtgcacgaa 960

gaatcggaac tgctggctga tcaggacgcg ggtattctgc gtcaagatcg ctacgccctg 1020

cgtaccagtg cacagtggat cggtccgcaa ctggaagccc tgggtctggc acgccagcaa 1080

attgaaacgg aactgaactc caccacggat aatccgctga tcgacgtgga aggcggtatg 1140

tttcatcacg gcggtaactt ccaggcgatg gcggtcacca gtgctatgga ttccgcgcgc 1200

attgtgctgc agaatctggg taaactgtca tttgcacaag tgaccgaact gatcaactgc 1260

gaaatgaatc atggcctgcc gtcgaacctg gcgggtagcg aaccgtctac caattatcat 1320

tgtaaaggcc tggatattca ctgcggtgcc tactgtgcag aactgggctt tctggcgaac 1380

ccgatgagca atcatgttca gtctaccgaa atgcacaacc agagcgtgaa cagcatggcg 1440

ttcgcaagcg cacgtcgcac gatggaagcg aacgaagttc tgagtctgct gctgggttcc 1500

cagatgtatt gtgctaccca agcgctggat ctgcgcgtca tggaagtgaa atttaaaatg 1560

gccattgtga aactgctgaa tgaaaccctg acgaaacatt ttgccgcatt cctgaccccg 1620

gaacagctgg cgaaactgaa cacccacgct gcgatcacgc tgtacaaacg tctgaatcag 1680

accccgtcat gggattcggc accgcgcttt gaagacgccg caaaacatct ggtgggcgtt 1740

attatggatg cgctgatggt taacgatgac atcaccgacc tgacgaatct gccgaaatgg 1800

aagaaagaat ttgccaaaga agcaggtaac ctgtatcgta gcattctggt ggctaccacg 1860

gcggatggcc gcaatgacct ggaaccggcc gaatatctgg gtcagacccg tgccgtgtac 1920

gaagcagttc gcagcgaact gggcgtcaaa gtgcgtcgcg gtgatgttgc ggaaggcaaa 1980

agcggtaaat ctattggcag ctctgtcgct aaaatcgtgg aagcaatgcg tgacggtcgc 2040

ctgatgggtg cagtgggtaa aatgttttaa 2070

<210> 5

<211> 5371

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 60

atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 120

gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 180

ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 240

cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 300

ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg 360

atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 420

acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 480

atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 540

tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 600

ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 660

tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 720

cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 780

agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt 840

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 900

cctgaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 960

tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 1020

gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 1080

tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 1140

ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 1200

agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 1260

aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 1320

accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc aatccggagt 1380

cgactcctcc tttcgctagc aaaaaacccc tcaagacccg tttagaggcc ccaaggggtt 1440

atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag ccaactcagc ttcctttact agtttgttag 1500

cagccggatc tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagtgc ggccgcaagc ttgtagacgg 1560

agctcgaatt cggatccgcg acccatttgc tgtccaccag tcatgcttgc catatggctg 1620

ccgcgcggca ccaggccgct gctgtgatga tgatgatgat ggctgctgcc catggtatat 1680

ctccttctta aagttaaaca aaattatttc tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc 1740

ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg atcgagatct cgatcctcta cgccggacgc 1800

atcgtggccg gcatcaccgg cgcctaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca 1860

ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta 1920

tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc 1980

ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt 2040

cgcataaggg agagcgtcga gatcccggac accatcgaat ggcgcaaaac ctttcgcggt 2100

atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg 2160

ttatacgatg tcgcagagta tgccggtgtc tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac 2220

caggccagcc acgtttctgc gaaaacgcgg gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg 2280

aattacattc ccaaccgcgt ggcacaacaa ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc 2340

gttgccacct ccagtctggc cctgcacgcg ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct 2400

cgcgccgatc aactgggtgc cagcgtggtg gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa 2460

gcctgtaaag cggcggtgca caatcttctc gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac 2520

tatccgctgg atgaccagga tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg 2580

ttatttcttg atgtctctga ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac 2640

ggtacgcgac tgggcgtgga gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta 2700

gcgggcccat taagttctgt ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc 2760

actcgcaatc aaattcagcc gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt 2820

tttcaacaaa ccatgcaaat gctgaatgag ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc 2880

aacgatcaga tggcgctggg cgcaatgcgc gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt 2940

gcggatatct cggtagtggg atacgacgat accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg 3000

ttaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg 3060

caactctctc agggccaggc ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa 3120

agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 3180

ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat 3240

taatgtaagt tagctcactc attaggcacc gggatctcga ccgatgccct tgagagcctt 3300

caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac 3360

tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg 3420

cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat 3480

cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa 3540

gcaggccatt atcgccggca tggcggcccc acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt 3600

gaggacccgg ctaggctggc ggggttgcct tactggttag cagaatgaat caccgatacg 3660

cgagcgaacg tgaagcgact gctgctgcaa aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat 3720

ggtcttcggt ttccgtgttt cgtaaagtct ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat 3780

tatgttccgg atctgcatcg caggatgctg ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt 3840

attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac 3900

cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg 3960

tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg tatcattacc cccatgaaca gaaatccccc 4020

ttacacggag gcatcagtga ccaaacagga aaaaaccgcc cttaacatgg cccgctttat 4080

cagaagccag acattaacgc ttctggagaa actcaacgag ctggacgcgg atgaacaggc 4140

agacatctgt gaatcgcttc acgaccacgc tgatgagctt taccgcagct gcctcgcgcg 4200

tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 4260

tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 4320

gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac 4380

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tatgcggtgt gaaataccgc 4440

acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 4500

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 4560

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 4620

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 4680

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 4740

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4800

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 4860

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 4920

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 4980

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 5040

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 5100

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 5160

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 5220

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 5280

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gaacaataaa actgtctgct 5340

tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg a 5371

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagaaagcga aaggagcggg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccatacccac gccgaaacaa 20

Claims

1.一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，以共表达酪氨酸苯裂合酶CfTPL和酪氨酸氨基裂合酶TcXAL的重组大肠杆菌，催化底物邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵合成咖啡酸。

2.根据权利要求1所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述的酪氨酸苯裂合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述酪氨酸氨基裂的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1～3任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.根据权利要求1～3任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所用的表达载体为pET28a(PB)。

6.根据权利要求1～5任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是通过pET28a(PB)以假操纵子的结构顺序表达基因CfTPL和TcXAL。

7.根据权利要求1～5任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是通过pET28a(PB)以单顺反子的结构顺序表达基因CfTPL和TcXAL。

8.根据权利要求6或7所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，全细胞转化的反应介质是磷酸盐缓冲液，重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1，邻苯二酚浓度范围为10–100mM，NH₄Cl、丙酮酸钠和邻苯二酚的浓度的比例为13：1：1；反应温度25–42℃。

9.根据权利要求6或7所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，全细胞转化的反应介质是50mM的磷酸盐缓冲液，重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1，底物的浓度为NH₄Cl 0.65M、丙酮酸钠50mM和邻苯二酚50mM；37℃、220rpm条件下反应。

10.一种重组大肠杆菌，其特征在于，共表达酪氨酸苯裂合酶CfTPL和酪氨酸氨基裂合酶TcXAL，通过pET28a(PB)以假操纵子或单顺反子的结构顺序表达EhTPL和TcXAL基因。