KR20150131880A

KR20150131880A - 숙신산 생산성이 향상된 미생물 및 이를 이용한 숙신산 생산방법

Info

Publication number: KR20150131880A
Application number: KR1020140059300A
Authority: KR
Inventors: 이우용; 박진환; 조광명
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2015-11-25
Also published as: US20150329882A1

Abstract

외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분을 포함하거나, 및/또는 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현이 증가되어 있는 미생물에 관한 것이다.

Description

숙신산 생산성이 향상된 미생물 및 이를 이용한 숙신산 생산방법{A microorganism having enhanced productivity of succinate and a method for producing succinate using the same}

숙신산 생산성이 향상된 미생물 및 이를 이용한 숙신산 생산방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 속 미생물은 그람 양성 균주이고, 글루타메이트, 리신, 트레오닌과 같은 아미노산을 생산하는 용도로 널리 이용되고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 생장 조건이 단순하고, 유전체 구조가 안정적이며, 환경 유해성이 없어 산업용 균주로서의 장점을 갖추고 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰은 호기 세균으로, 산소 공급이 중단되거나 부족한 혐기 조건 하에서 최소한의 생존을 위한 에너지를 생산하는 외의 대사 과정이 중단되고, 에너지 생산을 위해 젖산, 아세트산, 숙신산 등을 생산하여 배출한다.

숙신산은 TCA 회로의 중간 대사 산물로서, 가장 단순한 이카르복실 유기산이다. 숙신산을 이용하여 여러가지 폴리에스테르 화합물을 제조할 수 있다.

따라서, 미생물을 이용한 숙신산의 효율적인 생산방법이 요구된다.

일 양상은 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분(E1 component)을 포함하거나, 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현이 증가되어 있거나, 또는 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분을 포함하고 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현이 증가되어 있는 미생물을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물을 이용하여 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 미생물은 고세균, 진정세균, 또는 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물을 포함할 수 있다. 상기 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

용어 "외인성(exogenous)" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈으로의 도입(integration) 등 숙주 세포 내로 도입된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 도입된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 도입되는 숙주 세포에 대하여 동종(homologous) 또는 이종(heterologous)일 수 있다.

상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 자연적으로는, 디히드로리포일 트란스아세틸라제 성분(dihydrolipoyl transacetylase component, E2) 및 디히드로리포일 데히드로게나제 성분(dihydrolipoyl dehydrogenase component, E3)과 함께, 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 피루베이트 데히드로게나제 복합체(pyruvate dehydrogenase complex, PDC)를 구성하는 서브유닛으로 존재할 수 있다. 상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 EC.1.2.4.1로 분류되는 효소일 수 있다. 또한, 상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 티아민 파이로포스페이트(thiamine pyrophosphate, TPP)를 보조인자로 이용할 수 있다.

상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 에세리키아(Escherichia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 또는 살모넬라(Salmonella) 속에서 유래한 것일 수 있다. 상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 조절 서열과 작동가능하게 연결되어 있는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결되어 있는(operably linked)"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기 조절 서열은 프로모터, 인헨서, 터미네이터, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.

상기 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분은, 유전적으로 조작되지 않은 미생물에서 트란스숙시닐라제 성분(transsuccinylase component, E2) 및 디히드로리포일 데히드로게나제 성분(dihydrolipoyl dehydrogenase component, E3)과 함께, 알파-케토글루타레이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 복합체(α-ketoglutarate dehydrogenase complex, α-KGDH complex)를 구성하는 서브유닛으로 존재할 수 있다. 상기 α-KGDH 복합체는 EC.1.2.4.2로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 α-KGDH 복합체는 또한, 옥소글루타레이트 데히드로게나제 복합체(oxoglutarate dehydrogenase complex)로 명명될 수 있다.

상기 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현 증가는 상기 E1 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현 증가는 발현 조절 영역(regulatory region)의 변이에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 E1 성분의 발현 증가는, 상기 E1 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코리네박테리움 속 유래일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

상기 미생물은 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실키나아제, 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제, 또는 그 조합의 발현이 증가된 것일 수 있다.

상기 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(phosphphoenolpyruvate carboxlyase, PEPC)는 포스포에놀피루베이트에 비카르보네이트가 첨가되어 옥살로아세테이트를 형성하는 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 PEPC는 EC.4.1.1.31로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 PEPC는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 포스포에놀피루베이트 카르복실라제의 발현 증가는 PEPC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가에 의한 것, 또는 PEPC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것일 수 있다.

상기 포스포에놀피루베이트 카르복실키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)는 옥살로아세테이트를 포스포에놀피루베이트로 전환시키는 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 PEPCK는 EC.4.1.1.32로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 PEPCK는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 포스포에놀피루베이트 카르복실키나아제의 발현 증가는 PEPCK를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가에 의한 것, 또는 PEPCK를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것일 수 있다.

상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(alpha-ketoglutarate decarboxylase, AKDC)는 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환시키는 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 AKDC는 EC.4.1.1.71로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 AKDC는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제의 발현 증가는 AKDC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가에 의한 것, 또는 AKDC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것일 수 있다.

상기 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 아세테이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "감소"는 조작되지 않은 미생물에 비하여 조작된 상기 미생물에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다.

상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 아세테이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 미생물은, L-락테이트 데히드로게나아제(L-lactate dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 피루베이트 옥시다아제(pyruvate oxidase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 포스포트란스아세틸라아제(phosphotransacetylase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세테이트 키나아제(acetate kinase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세테이트 조효소 A 트랜스퍼라아제(acetate coenzyme A transferase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다.

용어 "불활성화(inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감쇄(attenuation)"는 유전자의 발현이 야생 균주, 조작되지 않은 균주, 또는 모 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 감소되어 있는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 예를 들면, 상동 재조합에 의해 야기될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 예를 들면, 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선발 마커에 의해 선발함으로써 이루어질 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나아제는 EC.1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나아제는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트 옥시다아제는 EC.1.2.3.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트 옥시다아제는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 포스포트란스아세틸라아제는 EC.2.3.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 포스포트란스아세틸라아제는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 아세테이트 키나아제는 EC.2.7.2.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 아세테이트 키나아제는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 아세테이트 조효소 A 트랜스퍼라아제는 EC.2.8.3.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 아세테이트 조효소 A 트랜스퍼라아제는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 미생물은 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase, PC) 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 PC는 EC.6.4.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 PC는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트 카르복실라제의 발현 증가는 PC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가에 의한 것, 또는 PC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것일 수 있다.

또한, 상기 활성의 증가는 피루베이트 카르복실라제의 변이에 의하여 비활성(specific activity)이 증가된 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 변이는 피루베이트 카르복실라제의 아미노산 서열의 치환, 부가, 결실 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열의 치환은 예를 들면, 서열번호 12의 458번째 프롤린의 세린으로의 치환일 수 있다. 상기 활성의 증가는 무작위적인 돌연변이 또는 유전공학적인 조작에 의한 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는, 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

상기 배양은 호기성, 미호기성, 또는 혐기성 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 배양은 혐기성 조건에서 수행될 수 있다. 혐기성 조건은 예를 들면, 대기 산소 농도가 제어되는 배양기에 의해 조성될 수 있다. 혐기성 조건을 위한 대기 산소 농도는 1 내지 10%, 1.5 내지 8%, 1.8 내지 6%, 2 내지 4%, 또는 2.5 내지 3%일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다.

상기 숙신산의 회수는 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 이들의 조합에 의하여 이루어질 수 있다.

일 양상에 따른 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분을 포함하거나, 및/또는 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현이 증가되어 있는 미생물을 이용하여 효율적으로 숙신산을 생산할 수 있다.

다른 양상에 따른 숙신산을 생산하는 방법에 의하면 효율적으로 숙신산을 생산할 수 있다.

도 1은 pGSK+ 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 pGS-Term 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 3은 pGS-Ex2 EGFP-H6 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 4는 4HB, m4HB, Saline, CB, CB+CC, CGXII, 및 CGXII/0oxy 배양 조건에서 숙신산 생산량을 나타낸 그래프를 나타낸다.
도 5는 글루코스 소모량과 최종 도달 pH의 상관관계를 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 6은 숙신산 생산성 스크리닝 결과 및 주요 유전자를 표시한 그래프를 나타낸다.
도 7은 CGXII 배지 및 발효 배지에서 숙신산 생산성을 평가한 그래프를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유전자 발현 라이브러리 제작을 위한 숙주 균주 제조

(1) 치환 벡터( replacement vector )의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum, CGL) ATCC 13032의 L-락테이트 데히드로게나제(ldh), 피루베이트 옥시다제(poxB), 포스포트란스아세틸라제(pta), 아세테이트 키나제(ackA), 및 아세테이트 CoA 트란스퍼라제(actA) 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다. 상기 유전자들을 불활성화시키기 위한 벡터로 pK19 mobsacB(ATCC 87098) 벡터를 사용하였으며, 재조합에 사용될 두 상동 부위는 주형으로 CGL ATCC 13032의 게놈 DNA를 사용한 PCR을 통한 증폭에 의하여 얻었다.

ldh 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류(upstream) 및 하류(downstream) 부위로서, 각각 ldhA_5'_HindIII(서열번호 13) 및 ldhA_up_3'_XhoI(서열번호 14)의 프라이머 세트와, ldhA_dn_5'_XhoI(서열번호 15) 및 ldhA_3'_EcoRI(서열번호 16)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δldh 벡터를 제작하였다.

poxB 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 각각 poxB 5' H3(서열번호 17) 및 DpoxB_up 3'(서열번호 18)의 프라이머 세트와, DpoxB_dn 5'(서열번호 19) 및 poxB 3' E1(서열번호 20)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_ΔpoxB 벡터를 제작하였다.

pta-ackA 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 각각 pta 5' H3(서열번호 21) 및 Dpta_up_R1 3'(서열번호 22)의 프라이머 세트와, DackA_dn_R1 5'(서열번호 23) 및 ackA 3' Xb(서열번호 24)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 XbaI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δpta_ackA 벡터를 제작하였다.

actA 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 각각 actA 5' Xb(서열번호 25) 및 DactA_up_R4 3'(서열번호 26)의 프라이머 세트와, DactA_dn_R4 5'(서열번호 27) 및 actA 3' H3(서열번호 28)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 XbaI 및 HindIII 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_ΔactA 벡터를 제작하였다.

(2) CGL (Δ ldh , Δ poxB , Δ pta - ackA , Δ actA ) 제조

C. glutamicum ATCC13032에 전기천공(electroporation)을 통해 상기 치환 벡터들을 함께 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 아가 플레이트(agar plate)에 도말하여 30℃에서 배양하였다. LBHIS 아가 플레이트는 Difco LB^TM broth 25 g/L, 뇌-심장 침출배지(brain-heart infusion broth) 18.5 g/L, D-솔비톨(sorbitol) 91 g/L, 및 아가 15 g/L를 포함한다. 이하 LBHIS 배지의 조성은 이와 동일하다. 형성된 콜로니를 brain heart infusion powder 37 g/L 및 D-솔비톨 91 g/L를 포함하는 BHIS 배지(pH 7.0)에서 30℃에서 배양한 후, 배양액을 LB/Suc10 아가 플레이트에 도말하고 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. LB/Suc10 아가 플레이트는 Difco LB^TM broth 25 g/L, 아가 15 g/L 및 수크로스 100 g/L를 포함한다.

선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 유전자들의 결손 여부를 확인하였다. ldh 유전자의 결손 확인을 위해 ldhA_5'_HindIII 및 ldhA_3'_EcoRI의 프라이머 세트를 사용하였고, poxB 유전자의 결손 확인을 위해 poxB_up_for(서열번호 29) 및 poxB_dn_rev(서열번호 30)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 유전자 결손 여부를 확인하였다. 또한, pta-ackA 유전자의 결손 확인을 위해 pta_up_for(서열번호 31) 및 ackA_dn_rev(서열번호 32)의 프라이머 세트를 사용하였고, actA 유전자의 결손 확인을 위해 actA_up_for(서열번호 33) 및 actA_dn_rev(서열번호 34)의 프라이머 세트를 각각 사용하여 PCR을 통해 유전자 결손 여부를 확인하였다.

(3) CGL (Δ ldh , Δ poxB , Δ pta - ackA , Δ actA , pyc ^P458S ) 제조

C. glutamicum ATCC 13032의 피루베이트 카르복실라제(서열번호 12)의 458번 프롤린이 세린으로 치환된 변이체(이하 'PYC^P458S'라 함)를 제조하였다.

상기 변이체는 중첩 연장(overlap extension) PCR 방법에 의해 PYC 아미노산 서열 중 458번 프롤린을 암호화하는 코돈 CCG를 TCG로 치환하여 제조하였다.

CGL ATCC 13032의 게놈 DNA로부터, pyc-F1(서열번호 35) 및 pyc-R1(서열번호 36)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 산물을 얻고, pyc-F2(서열번호 37) 및 pyc-R2(서열번호 38)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 두 PCR 산물을 주형으로 pyc-F1 및 pyc-R2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 산물을 얻었다. 최종적으로 얻어진 PCR 산물을 pK19mobsacB 벡터의 XbaI 제한효소 위치로 클로닝하여 pK19mobsacB-pyc* 벡터를 제작하였다.

(2)의 CGL (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA) 균주에 상기 pK19mobsacB-pyc* 벡터를 도입하였다. pyc-F1 및 pyc-R2의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 수행하고, PCR 산물을 서열 분석하여 pyc 유전자의 치환 여부를 확인하였다.

실시예 2: 유전자 발현 라이브러리 제작

(1) pGS _ Ex2 벡터의 제작

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, cat.# M0530)를 사용하여 다음 4개의 PCR 산물을 얻었다. C. glutamicum의 프로모터 스크리닝용 벡터인 pET2(GenBank accession number: AJ885178.1)를 주형으로 하여 MD-616(서열번호 39) 및 MD-618(서열번호 40) 프라이머 세트와, MD-615(서열번호 41) 및 MD-617(서열번호 42) 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 또한, pEGFP-C1(Clontech)를 주형으로 MD-619(서열번호 43) 및 MD-620(서열번호 44) 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였고, pBluescriptII SK+를 주형으로 LacZa-NR(서열번호 45) 및 MD-404(서열번호 46) 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR 산물인 3010 bp, 854 bp, 809 bp, 및 385 bp 단편을 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clontech, cat.# 639690) 방법에 따라 원형의 플라스미드로 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25 mg/L 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전장 서열 분석을 통해 벡터 서열을 확인하였다. 상기 벡터를 pGSK+(도 1)로 명명하였다.

또한, 상기 pGSK+ 벡터에 C.glutamicum gltA (NCgl0795)의 3’UTR 및 E.coli rrnB의 rho-독립성 전사종결인자(rho-independent terminator)를 다음과 같은 방법으로 삽입하였다. C. glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 MD-627(서열번호 47) 및 MD-628(서열번호 48)의 프라이머 세트로 PCR 하여 gltA 3’UTR의 108bp PCR 단편을 얻었다. 또한, E.coli (MG1655) 게놈 DNA을 주형으로 MD-629(서열번호 49) 및 MD-630(서열번호 50) 프라이머 세트를 사용하여 rrnB 전사종결인자 292bp PCR 산물을 얻었다. 상기 2개의 증폭된 단편을 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clontech, cat.# 639690)를 사용하여 SacI으로 절단된 pGSK+에 삽입하였다. 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25 mg/L 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전장 서열 분석을 통해 벡터 서열을 확인하였다. 상기 벡터를 pGS-Term(도 2)으로 명명하였다.

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, cat.# M0530)를 사용하여 C.glutamicum ATCC13032 균주의 게놈 DNA로부터 MD-1452(서열번호 51) 및 MD-1453(서열번호 52) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 211 bp의 DNA 조각을 획득하였다. 이 DNA 조각을 KpnI 제한효소로 절단된 pGS-Term 벡터와 섞어 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clonetech, cat.# 639690) 방법에 따라 원형의 플라스미드로 클로닝하였다. 상기 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25 mg/L 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전서열 분석을 통해 벡터 서열을 확인하였다. 상기 벡터를 pGS-Ex2로 명명하였다.

pGS-Ex2 벡터는 NCgl1929 유전자의 프로모터와 인공 RBS (리보좀결합부위, ribosome binding site)를 포함하고 있으며, C.glutamicum gltA 3' UTR과 E.coli rrnB 터미네이터를 포함하고 있다. 또한 프로모터-RBS와 3'UTR-터미네이터 사이에는 MCS (multicloning site)를 포함하고 있다.

(2) 유전자 발현 벡터 및 라이브러리 제작

(1)에서 제작된 pGS-EX2 벡터의 KpnI 및 SacI 부위 사이에 코리네박테리움 글루타미쿰의 탄소 대사 관련 유전자를 포함한 총 64종의 유전자를 각각 클로닝하였다. 상기 유전자의 ORF 뒤에는 단백질 발현 확인을 위한 C-terminal His₆-tag 염기서열이 위치하도록 하여 64종의 유전자 각각에 대한 유전자 발현 벡터를 제작하였다.

이용된 유전자 64종을 하기 표 1에 나타내었다. ID*는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 데이터베이스의 entry 번호를 나타낸다. 유전자 이름 앞에 Ec. 또는 Kp.가 붙은 것은 각각 대장균 또는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 것을 나타낸다. EGFP 유전자는 Cormack 등의 1996년 논문에서 발표된 것으로 (Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S (1996). "FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)". Gene 173(1): 33-38.), Clontech 사의 pEGFP-C1 벡터 (cat. # 6048-1)에서 증폭하여 클로닝하였다. tagRFP 유전자는 Evrogen 사의 pTagRFP-C 벡터 (cat. # FP141)에서 증폭하여 클로닝하였다. sucA 유전자는 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)에서 유래한 것이다. Kp.lpd 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 것이다.

대조군으로 사용한 pGS-Ex2 EGFP-H6 벡터에서, EGFP 유전자는 하기의 방법으로 제작된 C-terminal Hisx6 epitope tagging vector인 MD0545를 주형으로 MD-1557(서열번호 53) 및 MD-1620(서열번호 54)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. Clonetech 사의 pEGFP-C1 벡터 (cat # 6048-1)를 주형으로 MD-1357(서열번호 55) 및 MD-1358(서열번호 56) 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 753bp의 DNA 조각(서열번호 57)을 얻었다. 이 조각을 BamHI과 XhoI으로 처리한 Novagen 사의 pET28a (cat. # 69864-3) 벡터의 단편에 Clontech 사의 In-fusion EcoDry PCR Cloning Kit (cat. # 639690)를 이용하여 클로닝하여 MD0545 벡터(서열번호 58)를 제작하였다. 얻어진 EGFP 유전자를, KpnI과 SacI으로 처리한 pGS-Ex2 벡터의 단편에 Clontech In-fusion EcoDry PCR Cloning Kit(cat. # 639690)를 이용하여 클로닝하여 대조군 벡터인 pGS-Ex2 EGFP-H6 벡터를 제작하였다.

도 3은 pGS-Ex2 EGFP-H6 벡터의 개열지도를 나타낸다.

유전자	ID* 또는 벡터	유전자	ID* 또는 벡터
aceA	NCgl2248	lpdA	NCgl0658
aceB	NCgl2247	mdh	NCgl2297
aceE	NCgl2167	mdh2	NCgl0631
aceF	NCgl2126	mez	NCgl2904
ackA	NCgl2656	mqo	NCgl1926
acn	NCgl1482	odhA	NCgl1084
actA	NCgl2480	odx	NCgl1241
devB	NCgl1516	pckG	NCgl2765
Ec.aceE	b0114	pfkA	NCgl1202
Ec.aceF	b0115	pgi	NCgl0817
Ec.lpd	b0116	pgk	NCgl1525
Ec.lpd(E354K)		poxB	NCgl2521
EGFP	pEGFP-C1	ppc	NCgl1523
eno	NCgl0935	pps	NCgl0529
fda	NCgl2673	prpC1	NCgl0666
fumC	NCgl0967	pta	NCgl2657
gabD1	NCgl2619	pyc	NCgl0659
gabD2	NCgl0463	pyk	NCgl2008
gabD3	NCgl0049	rpe	NCgl1536
gapA	NCgl1526	rpiA	NCgl2337
gapB	NCgl0900	sdhA	NCgl0360
gdh	NCgl1999	sdhB	NCgl0361
glnA	NCgl2133	sdhCD	NCgl0359
glnA2	NCgl2148	sucA	NP_854934
gltA	NCgl0795	sucC	NCgl2477
gltB	NCgl0181	sucD	NCgl2476
gnd	NCgl1396	sucE	NCgl0213
gpmA	NCgl0390	tagRFP	pTagRFP-C
icd	NCgl0634	tal	NCgl1513
Kp.lpd(E354K)		tkt	NCgl1512
ldhA	NCgl2810	tpiA	NCgl1524
lpd	NCgl0355	zwf	NCgl1514

실시예 1에서 제조한 CGL (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA, pyc^P458S) 균주에 상기 벡터를 도입하였다. CGL 균주로 벡터를 도입하는 작업은 van der Rest 등의 1999년 발표된 논문 (van der Rest ME, Lange C, Molenaar D (1999). "A heat shock following electroporation induces highly efficient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA". Appl Microbiol Biotechnol. 52(4): 541-545.)에 따라 수행되었다.

요약하면, LBG 배지(트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L, 포도당 20 g/L)에서 하룻밤 배양된 배양액 10 mL을 Epo 배지(트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L, 이소니코틴산 히드라지드(isonicotinic acid hydrazide) 4 g/L, 글리신 25 g/L, Tween 80 0.1%) 100 mL에 접종한 후 섭씨 18도에서 120 rpm으로 28시간 동안 배양하였다. 생장한 세포를 얼음에서 10분간 냉각시킨 후 섭씨 0도의 10% 글리세롤 용액으로 4번 세척한 후 최종적으로 500 ㎕의 10% 글리세롤 용액에 현탁하였다. 이렇게 제작된 세포 현탁액 100 ㎕에 1 ㎍의 벡터 DNA를 섞은 후 2.5 kV로 25 ㎌의 electroporation을 수행하였다. 그 직후 섭씨 46도의 BHIS 배지(뇌-심장 침출배지 37 g/L, D-솔비톨 91 g/L, pH 7.0) 1 mL을 첨가한 후 섭씨 46도에서 6분간 배양하였다. 이하 BHIS 배지의 조성은 이와 동일하다. 다시 섭씨 30도에서 1시간 동안 교반하여 배양한 후 배양액 중 10 ㎕를 LBHIS/Kan 한천 배지(트립톤 5 g/L, 효모 추출물 2.5 g/L, NaCl 5 g/L, 뇌-심장 침출배지 18.5 g/L, D-솔비톨 91 g/L, 아가 15 g/L, 카나마이신 25 mg/L)에 도말하여 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양하였다. 이하 LBHIS/Kan 한천 배지의 조성은 이와 동일하다.

그 결과, 총 64종의 유전자에 대한 발현 라이브러리를 제조하였다.

실시예 3: 배양 조건 실험

실시예 2에서 제작된 발현 라이브러리의 각 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가된 5 mL의 BHIS 배지에 접종한 후, 30℃에서 교반 하에 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 여러 조성의 배양 조건(4HB, m4HB, Saline, CB, CB+CC, CGXII, 및 CGXII/Ooxy)에서 숙신산 생산량을 비교하였다.

LBHIS/Kan 한천 배지에 형성된 C.glutamicum의 콜로니를 25 mg/L의 카나마이신이 첨가된 LB 액체 배지 3 mL에 접종하고, 30℃에서 밤새도록 교반함으로써 종 배양(seed culture)을 수행하였다.

4HB의 경우, 상기 종 배양액을 실온에서 3,700 rpm으로 5분 동안 원심분리 하여 세포를 수득하였다. 수득된 세포를 표 2의 4HB 및 m4HB에 대한 배지 조성을 갖는 발효 배지 25 mL 중에 재현탁하고, 125 mL의 벤트캡(vented cap) 플라스크에서 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양물을 유리 바이알로 옮기고 밀봉한 후, 다시 24시간 동안 혐기 배양을 수행하였다. 배양이 끝난 후, 세포를 수득하여 상등액을 HPLC를 통해 분석하였다.

m4HB, Saline, CB, CB+CC, CGXII, 및 CGXII/0oxy의 경우, 상기 종 배양액을 25 mg/L의 카나마이신이 첨가된 LB 액체 배지 30 mL에 접종하고, OD₆₀₀ > 3.0까지 5시간 동안 배양하였다. 배양물로부터 수득된 세포를 각각 표 2에 기재된 조성을 갖는 배지로 1회 세척한 후, 각 배지 1 mL에 재현탁하였다. 각 현탁액을 최종 1 mL의 OD₆₀₀= 30.0까지 희석한 후, 12-웰(well) 마이크로플레이트로 옮겼다. 그 후, m4HB, Saline, CB, CB+CC, CGXII의 경우 2.5% 산소 하에서, CGXII/0oxy의 경우 100% 질소 하에서, 교반 하에 24시간 동안 배양을 수행하였다. 배양이 끝난 후, 세포를 수득하여 상등액을 HPLC를 통해 분석하였다.

배양 조건	배지 조성	비고
4HB 및 m4HB	40 g/L D-글루코스, 10 g/L 옥수수 침지액(corn steep liquor, CSL), 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 1 g/L KH₂PO₄, 0.5 g/L MgSO₄-7H₂O, 10 mg/L FeSO₄-7H₂O, 10 mg/L MnSO₄-H₂O, 0.1 mg/L ZnSO₄-7H₂O, 0.1 mg/L CuSO₄-5H₂O, 3 mg/L 티아민염산염(thiamine-HCl), 0.3 mg/L 비오틴(biotin), 1 mg/L 판토텐산 칼슘(Ca-pantothenate), 5 mg/L 니코틴아마이드(nicotinamide), 30 g/L CaCO₃, pH 7.0
Saline	0.9% NaCl, 4% D-글루코스
CB	42 g/L 3-모르폴리노프로판설폰산(MOPS), 1 g/L KH₂PO₄, 1 g/L K₂HPO₄, 4% D-글루코스
CB+CC	42 g/L MOPS, 1g/L KH₂PO₄, 1g/L K₂HPO₄, 4% D-글루코스, 1% CaCO₃
CGXII 및 CGXII/Ooxy	20 g/L (NH₄)₂SO₄, 5 g/L 우레아, 1 g/L KH₂PO₄, 1 g/L K₂HPO₄, 0.25 g/L MgSO₄·H₂O, 10 mg/L CaCl₂, 10 mg/L FeSO₄·H₂O, 0.1 mg/L MnSO₄·H₂O, 1 mg/L ZnSO₄·H₂O, 0.2 mg/L CuSO₄·H₂O, 20 mg/L NiCl₂·H₂O, 0.2 mg/L 비오틴, 42 g/L MOPS, 4%(w/v) 포도당	Litsanov, et al., 2012

도 4는 4HB, m4HB, Saline, CB, CB+CC, CGXII, 및 CGXII/0oxy 배양 조건에서 숙신산 생산량을 나타낸 그래프를 나타낸다. 그 결과, CGXII 배양 조건에서 숙신산이 가장 많이 생산됨을 확인하였다.

실시예 4: 숙신산 생산성 평가 1

실시예 3의 배양 조건 실험 결과를 바탕으로, 실시예 2에서 제작된 라이브러리를 CGXII 배양 조건에서 배양하기로 하였다.

균주 별로 각각 30개 이상의 콜로니를 모아 25 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가된 5 mL의 BHIS 배지에 접종한 후, 30℃에서 교반하에 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 25 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가된 20 mL의 BHIS 배지에 접종한 후, 30℃에서 교반 하에 6시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 회수하여 CGXII 배지로 1회 이상 세척한 후, CGXII 배지에 OD₆₀₀ = 30.0까지 희석하였다. 이 세포 현탁액을 대기 산소 농도가 2.5%로 유지되는 배양기에 넣고 30℃에서 교반 하에 20시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 원심분리 및 필터링을 통해 세포가 모두 제거된 상층액을 회수하고, HPLC 분석을 통해 숙신산 생산량 및 포도당 잔량을 측정하였다.

또한, 회수된 상층액을 클로로페놀 레드(chlorophenol red)와 반응시킨 후 435nm 와 575nm에서의 흡광도를 분석하여 상층액의 최종 pH를 측정하였다. 도 5는 글루코스 소모량과 최종 도달 pH의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 글루코스 소모량에 대해 상층액의 pH는 일정한 경향을 갖는 것으로 나타났고, 이로부터 본 실험 결과를 신뢰할 수 있음을 확인하였다.

도 6은 숙신산 생산성 스크리닝 결과 및 주요 유전자를 표시한 그래프를 나타낸다. 그 결과, ppc, pyc, Ec.aceE, pckG, odhA 및 sucA 유전자를 과발현하는 CGL 균주의 경우, 대조군인 EGFP 균주에 비해 숙신산 생산성이 더 우수함을 확인하였다.

실시예 5: 숙신산 생산성 평가 2

실시예 4의 CGXII 배양 조건에서 대조군에 비해 숙신산 생산성이 50% 이상 향상된 균주에 대하여 발효 배지에서의 숙신산 생산성을 평가하였다. 사용된 발효 배지의 조성은 표 2에 기재된 4HB 및 m4HB의 배지 조성과 동일하다. 배지를 제외한 다른 배양 조건은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다. 배양 종료 후, 원심분리 및 필터링을 거쳐 세포를 모두 제거한 상층액을 회수하고, HPLC 분석을 통해 숙신산 생산량 및 포도당 잔량을 측정하였다.

도 7은 CGXII 배지 및 발효 배지에서 숙신산 생산성을 평가한 그래프를 나타낸다. Ec.aceE의 경우, CGXII 배지에서 대조군인 EGFP 균주에 비해 글루코스 소모량은 21.7% 증가하였고, 숙신산 생산량은 84.8% 증가하였다. 또한, 발효 배지에서 글루코스 소모량은 2.8% 증가하였고, 숙신산 생산량은 372.9% 증가하였다. 따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 Ec.aceE 유전자의 과발현은 숙신산 생산성을 현저하게 향상시킴을 확인하였다.

<110> SAMSUNG ELECTORNICS CO., LTD. <120> A microorganism having enhanced productivity of succinate and a method for producing succinate using the same <130> PN101407 <160> 58 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 887 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Glu Arg Phe Pro Asn Asp Val Asp Pro Ile Glu Thr Arg Asp 1 5 10 15 Trp Leu Gln Ala Ile Glu Ser Val Ile Arg Glu Glu Gly Val Glu Arg 20 25 30 Ala Gln Tyr Leu Ile Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ala Arg Lys Gly Gly 35 40 45 Val Asn Val Ala Ala Gly Thr Gly Ile Ser Asn Tyr Ile Asn Thr Ile 50 55 60 Pro Val Glu Glu Gln Pro Glu Tyr Pro Gly Asn Leu Glu Leu Glu Arg 65 70 75 80 Arg Ile Arg Ser Ala Ile Arg Trp Asn Ala Ile Met Thr Val Leu Arg 85 90 95 Ala Ser Lys Lys Asp Leu Glu Leu Gly Gly His Met Ala Ser Phe Gln 100 105 110 Ser Ser Ala Thr Ile Tyr Asp Val Cys Phe Asn His Phe Phe Arg Ala 115 120 125 Arg Asn Glu Gln Asp Gly Gly Asp Leu Val Tyr Phe Gln Gly His Ile 130 135 140 Ser Pro Gly Val Tyr Ala Arg Ala Phe Leu Glu Gly Arg Leu Thr Gln 145 150 155 160 Glu Gln Leu Asp Asn Phe Arg Gln Glu Val His Gly Asn Gly Leu Ser 165 170 175 Ser Tyr Pro His Pro Lys Leu Met Pro Glu Phe Trp Gln Phe Pro Thr 180 185 190 Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Ile Gly Ala Ile Tyr Gln Ala Lys Phe 195 200 205 Leu Lys Tyr Leu Glu His Arg Gly Leu Lys Asp Thr Ser Lys Gln Thr 210 215 220 Val Tyr Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Lys 225 230 235 240 Gly Ala Ile Thr Ile Ala Thr Arg Glu Lys Leu Asp Asn Leu Val Phe 245 250 255 Val Ile Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu Asp Gly Pro Val Thr Gly Asn 260 265 270 Gly Lys Ile Ile Asn Glu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Gly Ala Gly Trp 275 280 285 Asn Val Ile Lys Val Met Trp Gly Ser Arg Trp Asp Glu Leu Leu Arg 290 295 300 Lys Asp Thr Ser Gly Lys Leu Ile Gln Leu Met Asn Glu Thr Val Asp 305 310 315 320 Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ser Lys Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu 325 330 335 His Phe Phe Gly Lys Tyr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Val Ala Asp Trp 340 345 350 Thr Asp Glu Gln Ile Trp Ala Leu Asn Arg Gly Gly His Asp Pro Lys 355 360 365 Lys Ile Tyr Ala Ala Phe Lys Lys Ala Gln Glu Thr Lys Gly Lys Ala 370 375 380 Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys Gly Tyr Gly Met Gly Asp Ala 385 390 395 400 Ala Glu Gly Lys Asn Ile Ala His Gln Val Lys Lys Met Asn Met Asp 405 410 415 Gly Val Arg His Ile Arg Asp Arg Phe Asn Val Pro Val Ser Asp Ala 420 425 430 Asp Ile Glu Lys Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Pro Glu Gly Ser Glu Glu 435 440 445 His Thr Tyr Leu His Ala Gln Arg Gln Lys Leu His Gly Tyr Leu Pro 450 455 460 Ser Arg Gln Pro Asn Phe Thr Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Leu Gln 465 470 475 480 Asp Phe Gly Ala Leu Leu Glu Glu Gln Ser Lys Glu Ile Ser Thr Thr 485 490 495 Ile Ala Phe Val Arg Ala Leu Asn Val Met Leu Lys Asn Lys Ser Ile 500 505 510 Lys Asp Arg Leu Val Pro Ile Ile Ala Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly 515 520 525 Met Glu Gly Leu Phe Arg Gln Ile Gly Ile Tyr Ser Pro Asn Gly Gln 530 535 540 Gln Tyr Thr Pro Gln Asp Arg Glu Gln Val Ala Tyr Tyr Lys Glu Asp 545 550 555 560 Glu Lys Gly Gln Ile Leu Gln Glu Gly Ile Asn Glu Leu Gly Ala Gly 565 570 575 Cys Ser Trp Leu Ala Ala Ala Thr Ser Tyr Ser Thr Asn Asn Leu Pro 580 585 590 Met Ile Pro Phe Tyr Ile Tyr Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Ile 595 600 605 Gly Asp Leu Cys Trp Ala Ala Gly Asp Gln Gln Ala Arg Gly Phe Leu 610 615 620 Ile Gly Gly Thr Ser Gly Arg Thr Thr Leu Asn Gly Glu Gly Leu Gln 625 630 635 640 His Glu Asp Gly His Ser His Ile Gln Ser Leu Thr Ile Pro Asn Cys 645 650 655 Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Tyr Glu Val Ala Val Ile Met His 660 665 670 Asp Gly Leu Glu Arg Met Tyr Gly Glu Lys Gln Glu Asn Val Tyr Tyr 675 680 685 Tyr Ile Thr Thr Leu Asn Glu Asn Tyr His Met Pro Ala Met Pro Glu 690 695 700 Gly Ala Glu Glu Gly Ile Arg Lys Gly Ile Tyr Lys Leu Glu Thr Ile 705 710 715 720 Glu Gly Ser Lys Gly Lys Val Gln Leu Leu Gly Ser Gly Ser Ile Leu 725 730 735 Arg His Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Leu Ala Lys Asp Tyr Gly Val 740 745 750 Gly Ser Asp Val Tyr Ser Val Thr Ser Phe Thr Glu Leu Ala Arg Asp 755 760 765 Gly Gln Asp Cys Glu Arg Trp Asn Met Leu His Pro Leu Glu Thr Pro 770 775 780 Arg Val Pro Tyr Ile Ala Gln Val Met Asn Asp Ala Pro Ala Val Ala 785 790 795 800 Ser Thr Asp Tyr Met Lys Leu Phe Ala Glu Gln Val Arg Thr Tyr Val 805 810 815 Pro Ala Asp Asp Tyr Arg Val Leu Gly Thr Asp Gly Phe Gly Arg Ser 820 825 830 Asp Ser Arg Glu Asn Leu Arg His His Phe Glu Val Asp Ala Ser Tyr 835 840 845 Val Val Val Ala Ala Leu Gly Glu Leu Ala Lys Arg Gly Glu Ile Asp 850 855 860 Lys Lys Val Val Ala Asp Ala Ile Ala Lys Phe Asn Ile Asp Ala Asp 865 870 875 880 Lys Val Asn Pro Arg Leu Ala 885 <210> 2 <211> 1221 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu 1 5 10 15 Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp 20 25 30 Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Thr Thr Pro Ala Thr 35 40 45 Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro 50 55 60 Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro 65 70 75 80 Ala Asp Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln 85 90 95 Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys 100 105 110 Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr 115 120 125 Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met 130 135 140 Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr 145 150 155 160 His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp 165 170 175 Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val 180 185 190 Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp 195 200 205 Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met 210 215 220 Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Ala Arg Ser 225 230 235 240 Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser 245 250 255 Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu 260 265 270 Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro 275 280 285 Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val 290 295 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Corynebacterium glutamicum <400> 10 Met Ala Leu Ala Leu Val Leu Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Phe 1 5 10 15 Gln Leu Val Asn Pro Glu Asn Ser Ala Ile Asp Glu Pro Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Leu Val Glu Gln Ile Gly Glu Pro Asn Gly Arg Ile Val Leu Lys 35 40 45 Ile Glu Gly Glu Lys Tyr Thr Leu Glu Thr Pro Ile Ala Asp His Ser 50 55 60 Glu Gly Leu Asn Leu Ala Phe Asp Leu Met Asp Gln His Asn Cys Gly 65 70 75 80 Pro Ser Gln Leu Glu Ile Thr Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly 85 90 95 Gly Ile Leu Phe Ser Ala Pro Glu Leu Ile Thr Asp Glu Ile Val Glu 100 105 110 Met Ile Arg Asp Leu Ile Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn 115 120 125 Val Asp Gly Ile Asp Val Ala Arg Lys Ile Leu Pro Asp Val Pro His 130 135 140 Val Ala Val Phe Asp Thr Gly Phe Phe His Ser Leu Pro Pro Ala Ala 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Ala Ile Asn Lys Asp Val Ala Ala Glu His Gly Ile Arg 165 170 175 Arg Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Glu Phe Val Ser Lys Arg Val 180 185 190 Val Glu Ile Leu Glu Lys Pro Thr Glu Asp Ile Asn Thr Ile Thr 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Claims

외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분(E1 component)을 포함하거나, 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현이 증가되어 있거나, 또는 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분을 포함하고 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현이 증가되어 있는 미생물.
청구항 1에 있어서, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물인 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 대장균 유래인 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 외인성 피루베이트 데히드로게나제 E1 성분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현 증가는 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가에 의한 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현 증가는 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것인 미생물.
청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 미생물.
청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실키나아제, 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제, 또는 그 조합의 발현이 증가된 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 아세테이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것인 미생물.
청구항 11에 있어서, L-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 피루베이트 옥시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 포스포트란스아세틸라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세테이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세테이트 CoA 트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄된 것인 미생물.
청구항 12에 있어서, L-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 피루베이트 옥시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 포스포트란스아세틸라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세테이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 아세테이트 CoA 트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 7 내지 11의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제 활성이 증가된 것인 미생물.
청구항 14에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제는 서열번호 12에서 P458S 치환을 갖는 것인 미생물.
청구항 1의 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 배양물로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는, 숙신산을 생산하는 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 배양은 혐기 조건에서 이루어지는 것인 방법.