RU2795616C1 - Новый вариант малатдегидрогеназы и способ получения L-лизина с его применением - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептид, участвующий в продуцировании L-лизина, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой треонин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 272 в SEQ ID NO: 3, заменен изолейцином. Изобретение относится также к способу продуцирования L-лизина, включающему культивирование в среде микроорганизма Corynebacterium glutamicum, содержащего полипептид согласно изобретению или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид. Изобретение позволяет получать L-лизин с высокой степенью эффективности. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к новому варианту малатдегидрогеназы, штамму Corynebacterium glutamicum, содержащему данный вариант, и к способу продуцирования L-лизина с использованием данного штамма.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Проводят различные исследования для разработки высокоэффективных микроорганизмов и технологий способов ферментации для производства L-аминокислот и других полезных веществ. Например, главным образом, используют специфичный подход в отношении целевого вещества, при котором увеличивают экспрессию гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе L-лизина, или при котором удаляют гены, не являющиеся необходимыми для биосинтеза (WO 2008-082181 А1).

Однако все еще необходимо проводить исследования для эффективного увеличения способности к продуцированию L-лизина, так как возрастает спрос на L-лизин.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Целью настоящего раскрытия является предоставление варианта малатдегидрогеназы, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой треонин (Thr или Т), который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 272 в SEQ ID NO: 3, заменен изолейцином (Ile или I).

Другой целью настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-лизина.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление способа продуцирования L-лизина, который включает культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L- лизина.

Наилучший способ воплощения изобретения

Настоящее раскрытие будет подробно описано следующим образом. Тем временем, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в настоящем раскрытии, можно применять к другим описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации разных элементов, раскрытых в настоящем раскрытии, принадлежат к объему настоящего раскрытия. Кроме того, нельзя считать, что объем настоящего раскрытия ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, во всем настоящем описании изобретения приводятся ссылки целого ряда статей и патентных документов, и указываются их цитирования. Вся полнота содержания, раскрытого в процитированных статьях и патентных документах, включается в настоящее описание изобретения посредством ссылки для того, чтобы более ясно описать уровень технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен вариант малатдегидрогеназы, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой треонин (Thr или Т), который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 272 в SEQ ID NO: 3, заменен изолейцином (Ile или I).

Вариант по настоящему раскрытию может иметь, содержать или по существу состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.

В варианте по настоящему раскрытию аминокислота, соответствующая положению 272 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой изолейцин, и данный вариант может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1. Очевидно то, что варианты, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включают в объем настоящего раскрытия, при условии, что аминокислотные последовательности имеют такую гомологию или идентичность и демонстрируют эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.

Его примеры включают варианты, имеющие присоединение или делецию последовательности, которые не изменяют функцию варианта по настоящему раскрытию, на N-конце, С-конце аминокислотной последовательности и/или внутри данной аминокислотной последовательности, встречающуюся в природе мутацию, молчащую мутацию или консервативную замену.

Термин «консервативная замена» означает замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может существовать на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильно ста и/или амфипатической природе остатков. Обычно консервативная замена может слегка влиять или не влияет на активность белков или полипептидов.

В настоящем раскрытии термин «вариант» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности данного варианта перед модификацией посредством консервативной замены и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, но сохраняет функции или свойства. Такой вариант обычно может быть идентифицирован посредством модифицирования одной или более чем одной аминокислоты аминокислотной последовательности данного полипептида и осуществления оценки свойств данного модифицированного полипептида. Другими словами, способность данного варианта может быть увеличена, оставлена неизменной или снижена по сравнению со способностью полипептида перед изменением. Некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более чем одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие варианты могут включать варианты, в которых была удалена часть N- и/или С-конца от зрелого белка. Термин «вариант» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант, мутеин и дивергент, и не ограничивается ими, при условии, что он представляет собой термин, используемый со значением вариации. В целях настоящего раскрытия данный вариант может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой треонин (Thr, Т), который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 272 в SEQ ID NO: 3, заменен изолейцином (Ile, I).

Данный вариант может содержать делеции или присоединения аминокислот, которые имеют минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, с N-концом данного варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая котрансляционно или посттрансляционно участвует в транслокации белка. Данный вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами таким образом, чтобы его идентифицировать, очистить или синтезировать.

В настоящем раскрытии термин «гомология» или «идентичность» означает степень сходства между двумя данными аминокислотными последовательностями или последовательностями оснований и может быть выражена в виде процентной доли. Термины «гомология» и «идентичность» часто можно использовать взаимозаменяемо.

Гомологию или идентичность последовательности консервативного полинуклеотида или полипептида определяют стандартными алгоритмами выравнивания, и можно совместно использовать штраф за пропуск по умолчанию, установленный применяемой программой. По существу гомологичные или идентичные последовательности обычно способны к гибридизации со всей или с частью последовательности при условиях умеренной или высокой жесткости. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию полинуклеотида с полинуклеотидом, содержащим кодон общего типа или вырожденный кодон.

Имеют ли любые две последовательности полинуклеотида или полипептида гомологию, сходство или идентичность, можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа «FASTA», например, с использованием параметров по умолчанию как в Pearson et at, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et at, 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al, JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать BLAST Национального центра биотехнологической информации или ClustalW.

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять посредством сравнения информации по последовательности с использованием, например, компьютерной программы GAP, как, например, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как анонсировано, например, в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В заключение, результат программы GAP может быть определен как значение, полученное делением числа аналогичных выровненных символов (а именно: нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы GAP могут включать (1) матрицу двоичных сравнений (включающую значения 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и матрицу взвешенных сравнений Gribskov et al, (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4)), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф 10 за открытие пропуска, штраф 0,5 за удлинение пропуска); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски.

В качестве примера по настоящему раскрытию, вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность малатдегидрогеназы.

В настоящем раскрытии термин «малатдегидрогеназа» представляет собой фермент, который обратимо катализирует окисление малата до оксалоацетата посредством восстановления NAD+ до NADH. Конкретно, «малатдегидрогеназа» по настоящему изобретению может использоваться взаимозаменяемо с терминами «MDH» или «дегидрогеназа яблочной кислоты». В настоящем раскрытии последовательность малатдегидрогеназы может быть получена из GenBank NCBI - известной базы данных, например, из GenBank с номером доступа WP_011015079.1, YP_226625.1). В частности, малатдегидрогеназа может представлять собой полипептид, демонстрирующий активность малатдегидрогеназы, кодируемый геном NCgl2297 (или геном mdh), но не ограничивается им.

В настоящем раскрытии термин «соответствующий» относится к аминокислотным остаткам в положениях, перечисленных в полипептиде, или к аминокислотным остаткам, которые являются аналогичными, идентичными или гомологичными остаткам, перечисленным в данном полипептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может определяться специфической аминокислотой в последовательности, которая относится к специфической последовательности. Термин «соответствующая область» в том виде, в котором он здесь используется, обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или эталонном белке.

Например, произвольную аминокислотную последовательность выравнивают с SEQ ID NO: 3, и, на основе этого, каждый аминокислотный остаток данной аминокислотной последовательности может быть пронумерован по отношению к аминокислотному остатку SEQ ID NO: 3 и числовому положению соответствующего аминокислотного остатка. Например, алгоритм выравнивания последовательности, как описано в настоящем описании, может определять положение аминокислоты или положение, в котором происходит модификация, такая как замена, вставка или делеция, посредством сравнения с положением в запрашиваемой последовательности (также именуемой «эталонная последовательность»).

Для таких выравниваний, например, можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), программу Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) и тому подобные, но программа и алгоритм не ограничиваются ими, и подходящим образом можно использовать программу выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей и тому подобное, известные в данной области.

Другим аспектом настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.

В настоящем раскрытии термин «полинуклеотид» представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую определенную или большую длину, в качестве полимера нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединяются в длинную цепь ковалентными связями, и, более конкретно, означает фрагмент полинуклеотида, кодирующий данный вариант.

Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, может содержать последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В качестве примера по настоящему раскрытию полинуклеотид по настоящему раскрытию может иметь или содержать последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид по настоящему раскрытию может состоять или по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 2.

В другом воплощении в полинуклеотиде по настоящему раскрытию основание, соответствующее положению 815 на основе последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 в последовательности нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID NO: 2, представляет собой Т, и данный полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID NO: 2. Очевидно, что полинуклеотиды, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включены в объем настоящего раскрытия, при условии, что данные последовательности нуклеиновой кислоты имеют такую гомологию или идентичность и кодируют полипептид или белок, демонстрирующий эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.

В полинуклеотиде по настоящему раскрытию могут быть сделаны разные модификации в кодирующей области при условии, что аминокислотная последовательность варианта по настоящему раскрытию не изменяется при рассмотрении вырожденности предпочтительных кодонов в организмах, которые предназначены для экспрессии варианта по настоящему раскрытию. В частности, полинуклеотид по настоящему раскрытию имеет или содержит последовательность оснований, имеющую 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 или может состоять или по существу состоит из последовательности оснований, имеющей 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь ей. Здесь в последовательности, имеющей гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 272 в SEQ ID NO: 1, может представлять собой один из кодонов, кодирующих изолейцин.

Полинуклеотид по настоящему раскрытию может содержать зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, последовательности без ограничения при условии, что она представляет собой последовательность, которая может гибридизоваться с комплементарной последовательностью всей или части последовательности полинуклеотида по настоящему раскрытию при жестких условиях. «Жесткие условия» означают условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Данные условия конкретно описаны в документах (см. J. Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Их примеры включают условия, при которых полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, а именно: полинуклеотиды, имеющие 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, или 99%-ную или большую гомологию или идентичность, гибридизуются друг с другом, тогда как полинуклеотиды, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом, или условия, при которых промывка осуществляется один раз, в частности, от двух до трех раз при концентрации соли и температуре, эквивалентных 60°С, 1 × SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности, при 60°С, 0,1 × SSC, 0,1% SDS, более конкретно, при 68°С, 0,1 × SSC, 0,1% SDS, которые представляют собой условия промывки для обычной гибридизации по Саузерну.

Для гибридизации требуется то, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя и допускаются несоответствия между основаниями, в зависимости от жесткости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания связи между нуклеотидными основаниями, способными к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденин является комплементарным тимину, а цитозин является комплементарным гуанину. Следовательно, полинуклеотид по настоящему раскрытию также может содержать по существу аналогичные последовательности нуклеиновой кислоты, а также фрагменты выделенной нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными всей последовательности.

В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему раскрытию, может быть выявлен с использованием условий гибридизации, включая стадию гибридизации при значении T_m 55°С и вышеописанных условиях. Значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и его могут подходящим образом корректировать специалисты в данной области согласно цели.

Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотида зависит от длины и степени комплементарности данного полинуклеотида, и переменные хорошо известны в данной области (например, J. Sambrook et at, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему раскрытию. Данный вектор может представлять собой экспрессионный вектор для осуществления экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но не ограничивается им.

Вектор по настоящему раскрытию может включать ДНК-конструкцию, содержащую последовательность полинуклеотида, кодирующую интересующий полипептид, связанный функциональным образом с подходящей регуляторной областью экспрессии (или регуляторной последовательностью экспрессии) таким образом, что интересующий полипептид может экспрессироваться в подходящем хозяине. Регуляторная область экспрессии может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для осуществления регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. Данный вектор можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина, и затем он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может сам интегрироваться в геном.

Вектор, используемый в настоящем раскрытии, конкретно не ограничивается, но можно использовать любой вектор, известный в данной области. Примеры обычно используемых векторов включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и тому подобные, и в качестве плазмидного вектора можно использовать систему pDZ, систему pBR, систему pUC, систему pBluescript II, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему рЕТ и тому подобные. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC, и тому подобные.

Например, полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, можно вставлять в хромосому посредством вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставку данного полинуклеотида в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь ей. Данный вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Данный селективный маркер служит для отбора клеток, трансформированных векторами, то есть, для подтверждения вставки интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые придают селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде при обработке селективным агентом выживают или демонстрируют другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективный маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.

В настоящем раскрытии термин «трансформация» означает то, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, вводится в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый данным полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может локализоваться посредством вставки в хромосому клетки-хозяина или локализоваться вне хромосомы, при условии, что он может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Данный полинуклеотид содержит ДНК и/или РНК, кодирующую интересующий полипептид. Данный полинуклеотид может быть вставлен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и может экспрессироваться. Например, данный полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все элементы, требующиеся для автономной экспрессии. Данная экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, связанный функциональным образом с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Данная экспрессионная кассета может находиться в виде экспрессионного вектора, способного к автономной репликации. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и связан функциональным образом с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь ей.

В приведенном выше термин «связанный функциональным образом» означает то, что последовательность полинуклеотида функционально связана с последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего интересующий вариант по настоящему раскрытию.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.

Штамм по настоящему раскрытию может содержать модифицированный полипептид по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию.

В настоящем раскрытии «штамм (или микроорганизм)» включает все микроорганизмы дикого типа или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором ослаблен или усилен специфический механизм из-за вставки внешнего гена или усиления активности, или инактивации эндогенного гена, и он может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования интересующего полипептида, белка или продукта.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, содержащий любой один или более чем один вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид по настоящему раскрытию или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию; штамм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему раскрытию или полинуклеотида по настоящему раскрытию; штамм (например, рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию; или штамм (например, рекомбинантный штамм), демонстрирующий активность варианта по настоящему раскрытию, но не ограничивается ими.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, имеющий способность к продуцированию L-лизина.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой микроорганизм, имеющий в природе активность малатдегидрогеназы и/или способность к продуцированию L-лизина, или микроорганизм, в котором вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант (или вектор, содержащий данный полинуклеотид), вводят в родительский штамм, который не имеет активности малатдегидрогеназы или способности к продуцированию L-лизина, и/или в котором способность к продуцированию L-лизина придается родительскому штамму, но не ограничивается им.

Например, штамм по настоящему раскрытию представляет собой клетку или микроорганизм, который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему раскрытию, или полинуклеотидом, кодирующим вариант по настоящему раскрытию, и экспрессирует вариант по настоящему раскрытию. В целях настоящего раскрытия штамм по настоящему раскрытию может включать все микроорганизмы, которые содержат вариант по настоящему раскрытию и могут продуцировать L-лизин. Например, штамм по настоящему раскрытию может представлять собой рекомбинантный штамм, в котором полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, вводят в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм, продуцирующий L-лизин, для того, чтобы, таким образом, экспрессировать вариант малатдегидрогеназы и иметь повышенную способность к продуцированию L-лизина. Рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-лизина, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-лизина по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или микроорганизмом, не модифицированным малатдегидрогеназой (а именно: микроорганизмом, экспрессирующим малатдегидрогеназу дикого типа), но не ограничивается им. В качестве примера, микроорганизм, не модифицированный малатдегидрогеназой, который представляет собой целевой штамм для сравнения увеличения способности к продуцированию L-лизина, может представлять собой штамм АТСС13032 и/или штамм Corynebaterium glutamicum CA08-0072 CJ3P (US 9556463 B2; полное описание которого включено сюда посредством ссылки), но не ограничивается им.

Например, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-лизина, повышенную примерно на 1% или более, примерно на 2,5% или более, примерно на 5% или более, примерно на 6% или более, примерно на 7% или более, примерно на 8% или более, примерно на 9% или более, примерно на 10% или более, примерно на 10,5% или более, примерно на 11% или более, примерно на 11,5% или более, примерно на 12% или более, примерно на 12,5% или более, примерно на 13% или более, примерно на 13,5% или более, примерно на 14% или более, примерно на 14,5% или более, примерно на 15% или более, примерно на 15,5% или более, примерно на 16% или более, примерно на 16,5% или более, примерно на 17% или более, примерно на 17,5% или более, примерно на 18% или более, примерно на 18,5% или более, примерно на 19% или более, примерно на 19,5% или более, примерно на 20% или более, примерно на 20,5% или более, примерно на 21% или более, примерно на 21,5% или более, примерно на 22% или более, примерно на 22,5% или более, примерно на 23% или более, примерно на 23,5% или более, примерно на 24% или более, примерно на 24,5% или более, примерно на 25% или более, примерно на 25,5% или более, примерно на 26% или более, примерно на 26,5% или более, примерно на 27% или более, примерно на 27,5% или более, примерно на 28% или более, примерно на 28,5% или более, примерно на 29% или более, примерно на 29,5% или более, примерно на 30% или более, примерно на 31% или более, примерно на 32% или более, примерно на 33% или более, примерно на 34% или более, или примерно на 35% или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может составлять, например, примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 45% или менее, примерно 40% или менее, или примерно 35% или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-лизина, увеличенную примерно в 1,1 раза или более, примерно в 1,12 раза или более, примерно в 1,13 раза или более, примерно в 1,15 раза или более, примерно в 1,16 раза или более, примерно в 1,17 раза или более, примерно в 1,18 раза или более, примерно в 1,19 раза или более, примерно в 1,2 раза или более, примерно в 1,25 раза или более, или примерно в 1,3 раза или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может, например, быть примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, или примерно в 2 раза или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом. Более конкретно, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-лизина, повышенную примерно на 16,25% (или примерно в 1,16 раза) по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но показатель увеличения не ограничивается им. Термин «примерно» представляет собой интервал, включающий все из плюс/минус 0,5; плюс/минус 0,4; плюс/минус 0,3; плюс/минус 0,2; плюс/минус 0,1 и тому подобных, и включает все значения в интервале, равные или аналогичные значению после термина «примерно», но не ограничивается ими.

В настоящем раскрытии «немодифицированный микроорганизм» не исключает штаммы, содержащие мутацию, которая может случаться у микроорганизмов в природе, и может представлять собой штамм дикого типа или сам природный штамм, или может представлять собой штамм перед изменением признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Например, данный немодифицированный микроорганизм может представлять собой штамм, в который не вводится или еще не был введен вариант малатдегидрогеназы, описанный в настоящем описании изобретения. Термин «немодифицированный микроорганизм» можно использовать взаимозаменяемо с фразами «штамм перед модификацией», «микроорганизм перед модификацией», «неизмененный штамм»,

«немодифицированный штамм», «неизмененный микроорганизм» или «эталонный микроорганизм».

В другом примере настоящего раскрытия микроорганизм по настоящему раскрытию может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens.

В настоящем раскрытии «ослабление» активности полипептида включает оба случая, где активность снижена по сравнению с эндогенной активностью или отсутствует. Термин «ослабление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, недостаточность, понижающая регуляция, снижение, уменьшение и аттенюация.

Ослабление также может включать случай, когда активность самого полипептида снижена или устранена по сравнению с активностью полипептида, которым исходно обладал микроорганизм, посредством изменения полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, и тому подобного, случай, где общие уровень активности и/или концентрация (уровень экспрессии) полипептида в клетке ниже по сравнению с уровнем активности или концентрацией природного штамма посредством ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид, случай, где данный полинуклеотид совсем не экспрессируется, и/или случай, где активность полипептида не проявляется даже при экспрессии полинуклеотида. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака, или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм при изменении признака генетической вариацией из-за природных или искусственных факторов. Фразу «эндогенная активность» можно использовать взаимозаменяемо с фразой «активность перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида является «инактивированной, недостаточной, пониженной, подвергнувшейся понижающей регуляции, сниженной или ослабленной» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида снижается по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм.

Такое ослабление активности полипептида можно осуществлять любым способом, известным в данной области, но данный способ не ограничивается им, и ослабления можно достигнуть применением разных способов, хорошо известных в данной области (например, Nakashima N. et al, Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2):2773-2793, Sambrook et al, Molecular Cloning 2012, и тому подобные).

В частности, ослабление активности полипептида в настоящем раскрытии может представлять собой:

1) делецию всего или части гена, кодирующего полипептид;

2) модификацию регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;

3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеция/замена/присоединение одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности);

4) модификацию последовательности гена, кодирующей полипептид, для устранения или ослабления активности данного полипептида (например, делеция/замена/присоединение одного или более чем одного основания нуклеиновой кислоты в последовательности оснований нуклеиновой кислоты гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для устранения или ослабления активности данного полипептида);

5) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR (5'-нетранслируемая область) область;

6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;

7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединяться рибосома;

8) добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE); или

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) - (8), но, в частности, не ограничивается ими.

Например:

1) Делецией части или всего гена, кодирующего полипептид, может быть удаление всего полинуклеотида, кодирующего интересующий эндогенный полипептид в хромосоме, или замена полинуклеотидом, в котором некоторые нуклеотиды делетированы, или замена маркерным геном.

2) Модификацией регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) может быть делеция, вставка, неконсервативная или консервативная замена, или появление изменения в регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) из-за их комбинации, или замена последовательностью, демонстрирующей более слабую активность. Регуляторная область экспрессии содержит промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничивается ими.

3) Модификацией инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может быть, например, замена последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий меньшую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.

4) и 5) Модификацией аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может быть делеция, вставка или неконсервативная, или консервативная замена аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замена аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы демонстрировать более слабую активность, или аминокислотной последовательностью, или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы быть неактивной, таким образом, что активность данного полипептида ослабевает, но не ограничивается ими. Например, экспрессию гена можно ингибировать или ослаблять посредством введения изменения в последовательность полинуклеотида и образования терминирующего кодона, но модификация не ограничивается ей.

6) Для введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно сделать ссылку на документы, например, Weintraub, Н. et al, Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

7) Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно, гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединиться рибосома, для того, чтобы сделать невозможной трансляцию мРНК или для замедления скорости трансляции мРНК.

8) Добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE), может служить для ослабления активности посредством получения антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид.

В настоящем раскрытии термин «усиление» активности полипептида означает то, что активность полипептида увеличивается по сравнению с эндогенной активностью. Термин «усиление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение. Здесь активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как демонстрирование активности, которой исходно не обладали, так и демонстрирование улучшенной активности по сравнению с эндогенной активностью или активностью перед модификацией. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм при изменении признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Это можно использовать взаимозаменяемо с «активностью перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида «усиливается», «подвергается повышающей регуляции», «сверхэкспрессируется» или «увеличивается» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида улучшается по сравнению с активностью и/или концентрацией (уровнем экспрессии) конкретного полипептида, которой исходно обладает родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм.

Данное усиление может быть достигнуто посредством введения чужеродного полипептида или увеличения эндогенной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) данного полипептида. Усиление активности полипептида может быть подтверждено увеличением степени активности и уровня экспрессии полипептида или количества продукта, продуцируемого из данного полипептида.

Для усиления активности полипептида можно применять разные способы, хорошо известные в данной области, и данный способ не ограничивается, при условии, что активность интересующего полипептида может быть усилена по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известные специалистам в данной области, которые представляют собой традиционные способы молекулярной биологии, но данный способ не ограничивается ими (например, Sitnicka et al, Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16; Sambrook et al, Molecular Cloning 2012; и тому подобные).

В частности, усиление активности полипептида по настоящему раскрытию может представлять собой:

1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;

2) замену регуляторной области экспрессии гена на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность;

3) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область;

4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида для увеличения активности данного полипептида;

5) модификацию последовательности полинуклеотида, кодирующей полипептид, для усиления активности данного полипептида (например, модификацию последовательности полинуклеотида гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности данного полипептида);

6) введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность данного полипептида, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего данный полипептид;

7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;

8) анализ третичной структуры полипептида для отбора и модификации или химической модификации экспонированного сайта; или

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) (8), но конкретно не ограничиваясь ими.

Более конкретно:

1) Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть достигнуто посредством введения в клетку-хозяина вектора, который может реплицироваться и функционировать независимо от хозяина, и с которым полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, связан функциональным образом. В качестве альтернативы, увеличение может быть достигнуто введением одной копии или двух или более чем двух копий полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, в хромосому в клетке-хозяине. Введение в хромосому можно осуществлять введением вектора, способного вставлять полинуклеотид в хромосому в клетке-хозяине, в клетку-хозяина, но не ограничивается им. Данный вектор является таким, как описано выше.

2) Замена регуляторной области экспрессии гена (или регуляторной последовательности экспрессии) на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность, может представлять собой, например, делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замену последовательностью, демонстрирующей более сильную активность, таким образом, что активность регуляторной области экспрессии дополнительно усиливается. Регуляторная область экспрессии конкретно не ограничивается ими, но может содержать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции и тому подобные. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора сильным промотором, но не ограничивается ей.

Примеры известных сильных промоторов включают промоторы CJ1 - CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор 02 (US 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, но не ограничиваются ими.

3) Модификация инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующуего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может представлять собой, например, замену последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий более высокую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.

4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может представлять собой делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в данной последовательности из-за их комбинации или замены аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для демонстрации более сильной активности, или аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для того, чтобы быть более активной, таким образом, что активность данного полипептида усиливается, но не ограничивается ими. Данную замену можно конкретно осуществлять посредством вставки полинуклеотида в хромосому гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь ей. Используемый здесь вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.

6) Введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Данный чужеродный полинуклеотид не ограничивается по его происхождению или последовательности при условии, что он демонстрирует такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Введение можно осуществлять посредством подходящего выбора способа трансформации, известного специалистам в данной области. Поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, может продуцироваться полипептид и может увеличиваться его активность.

7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида таким образом, чтобы увеличивать транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов чужеродного полинуклеотида таким образом, чтобы осуществлять оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине.

8) Анализ третичной структуры полипептида для выбора и модификации или химическая модификация экспонированного сайта можно осуществлять, например, для определения шаблонного белка-кандидата согласно степени сходства последовательности посредством сравнения информации по последовательности полипептида, подлежащего анализу, с хранилищем информации по последовательностям известных белков базы данных для подтверждения структуры на основе этого и для выбора и модификации или химической модификации экспонированной части, подлежащей модификации или химической модификации.

Такое усиление активности полипептида может представлять собой увеличение активности или концентрации, или уровня экспрессии соответствующего полипептида на основе активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в микробном штамме дикого типа или в микробном штамме перед модификацией, или увеличение количества продукта, продуцируемого от полипептида, но не ограничивается ими.

В микроорганизме по настоящему раскрытию частичную или полную модификацию (например, модификация для кодирования варианта белка, как описано выше) полинуклеотида можно индуцировать (а) гомологичной рекомбинацией с использованием вектора для вставки в хромосому в микроорганизме или редактированием генома с использованием генетически модифицированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9), и/или (б) обработкой светом, таким как ультрафиолетовые лучи и излучение, и/или химическими агентами, но не ограничиваясь ими. Способ осуществления модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, посредством введения в микроорганизм нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную интересующему гену, для вызова гомологичной рекомбинации можно удалить часть гена или весь данный ген. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор может содержать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь им.

В микроорганизме по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, L-лизин и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ продуцирования L-аминокислоты, который включает культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может включать культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию, или вектор по настоящему раскрытию.

Кроме того, L-аминокислота по настоящему раскрытию может представлять собой L-лизин.

В настоящем раскрытии термин «культивирование» означает выращивание штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию при условиях среды, контролируемых подходящим образом. Способ культивирования по настоящему раскрытию можно осуществлять в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Такой способ культивирования можно легко корректировать и использовать специалистами в данной области согласно выбранному штамму. В частности, культивирование может быть периодического типа, непрерывного типа и/или типа с подпиткой, но не ограничивается ими.

В настоящем раскрытии термин «среда» означает смешанное вещество, содержащее питательные вещества, требующиеся для культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию в качестве главного компонента, и данная среда поставляет питательные вещества, факторы роста и тому подобное, включая воду, которые являются незаменимыми для выживания и развития. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, можно использовать любые без конкретного ограничения, при условии, что она представляет собой среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов. Штамм Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию можно культивировать в обычной среде, содержащей правильные источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, и тому подобное, при одновременном осуществлении контроля температуры, рН и тому подобного при аэробных условиях.

В частности, культуральную среду для штамма рода Corynebacterium можно найти в документе "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).

В настоящем раскрытии источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин; и тому подобное. Можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниок, остаток сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованные пред обработанные мелассы (а именно: мелассы, превращенные в восстанавливающий сахар), и можно использовать подходящие количества других источников углерода разными способами без ограничения. Данные источники углерода можно использовать одиночно или в комбинации с двумя или более чем двумя, но не ограничиваясь ими.

В качестве источников азота можно использовать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; и органические источники азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее разложения и обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения. Данные источники азота можно использовать одиночно или в комбинации двух или более чем двух, но не ограничиваясь ими.

Источники фосфора могут включать монокалия фосфат, дикалия фосфат или соответствующие им натрийсодержащие соли. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное. Помимо них могут содержаться аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники, и тому подобное. Данные компоненты или предшественники можно добавлять в среду порционно или непрерывно, но способ добавления не ограничивается ими.

Во время культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию рН среды можно корректировать добавлением в данную среду правильным способом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Во время культивирования пенообразование можно подавлять посредством применения пеногасителя, такого как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. В среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния данной среды, или газ можно не инъецировать, или можно инъецировать газообразный азот, водород или диоксид углерода для того, чтобы поддерживать анаэробное и микроаэробное состояния, но способ поддержания данного состояния не ограничивается ими.

При культивировании по настоящему раскрытию можно поддерживать температуру культивирования от 20°С до 45°С, в частности, от 25°С до 40°С, и данный штамм можно культивировать в течение примерно от 10 до 160 часов, но условия культивирования не ограничиваются ими.

L-аминокислота, продуцируемая посредством культивирования по настоящему раскрытию, может секретироваться в среду или может оставаться в клетках.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию получения штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, стадию приготовления среды для культивирования данного штамма или их комбинацию (в любом порядке), например, перед стадией культивирования.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию выделения L-аминокислоты из среды в соответствии с культивированием (среда, подвергнувшаяся воздействию культуры) или из штамма Corynebacterium glutamicum. После стадии культивирования может быть дополнительно включена стадия выделения.

Выделение может служить для сбора интересующей L-аминокислоты посредством подходящего способа, известного в данной области, согласно способу культивирования микроорганизма по настоящему раскрытию, например, способу периодического, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку осадителем кристаллизованного белка (высаливание), экстракцию, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрацию, диализ, разные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), или их комбинацию. Интересующую L-аминокислоту можно выделять из среды или микроорганизма посредством подходящего способа, известного в данной области.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию очистки. Очистку можно осуществлять посредством подходящего способа, известного в данной области. В одном примере, когда способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию включает и стадию выделения, и стадию очистки, данные стадии выделения и очистки можно осуществлять непрерывно или прерывисто, независимо от порядка, или можно осуществлять одновременно, или посредством объединения в одну стадию, но способ осуществления данных стадий не ограничивается ими.

В способе по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для продуцирования L-аминокислоты, которая содержит штамм Corynebacterium glutamicum, содержащий вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный вариант, вектор, содержащий данный полинуклеотид, или полинуклеотид по настоящему раскрытию; среду, в которой культивировали данный штамм Corynebacterium glutamicum; или комбинацию двух или более чем двух из них.

Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать произвольные подходящие эксципиенты, которые обычно примененяют в композициях для продуцирования аминокислот. Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буферизующий агент, стабилизатор или изотоничный агент, но не ограничиваются ими.

В композиции по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, L-аминокислота и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.

Полезные эффекты

В случае культивирования штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего новый вариант малатдегидрогеназы по настоящему раскрытию, возможна продукция L-лизина с более высоким выходом по сравнению со случаем существующих микроорганизмов, имеющих немодифицированные полипептиды.

Краткое описание графических материалов

ФИГ. 1. Схематичная диаграмма плазмиды pDCM2.

Способ осуществления изобретения

Ниже настоящее раскрытие будет более подробно описано посредством Примеров. Однако следующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для иллюстрации настоящего раскрытия и, таким образом, не предназначены для ограничения ими объема настоящего раскрытия. Тем не менее, технические вопросы, не описанные в настоящем описании изобретения, могут быть в достаточной степени поняты и легко воплощены специалистами в технической области настоящего раскрытия или в аналогичных технических областях.

Пример 1: конструирование плазмиды

Плазмида (pDCM2, ФИГ. 1, SEQ ID NO: 11) для вставки и замены генов в хромосоме Corynebacterium была сконструирована и синтезирована с использованием службы Gene-synthesis от BIONICS Co., Ltd. Данная плазмида была сконструирована так, чтобы она содержала сайт рестрикционного фермента для легкого применения для клонирования со ссылкой на общеизвестную статью по системе sacB (Gene, 145 (1994) 69-73). Плазмида pDCM2, синтезированная таким образом, имеет следующие свойства:

1) Плазмида pDCM2 имеет репликатор, который работает только в Е. coli, и автономная репликация, таким образом, возможна в Е. coli, но не в Corynebacterium.

2) Плазмида pDCM2 имеет ген устойчивости к канамицину в качестве селективного маркера.

3) Плазмида pDCM2 имеет ген левансахаразы (sacB) в качестве вторичного маркера положительного отбора.

4) В конечном сконструированном штамме не остается информации о гене, происходящем из плазмиды pDCM2.

Пример 2. Конструирование вектора для экспрессии варианта малатдегидрогеназы в микроорганизме

Для того, чтобы подтвердить влияние варианта (T272I; SEQ ID NO: 1), у которого треонин (Thr) в положении 272 малатдегидрогеназы последовательности SEQ ID NO: 3, был заменен изолейцином (Не), на продукцию L-лизина, конструировали вектор для конструирования штамма, экспрессирующего данный вариант, следующим образом.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) проводили с использованием гДНК (геномная ДНК) Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС13032 в качестве матрицы, пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и 6, и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. Вновь проводили ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием смеси двух фрагментов, полученных выше, в качестве матрицы и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и 8, с получением фрагмента. ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 5 минут; 30 циклов при 94°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 1 минуты 30 секунд; и 72°С в течение 5 минут. Плазмиду pDCM2 обрабатывали smaI, и ПЦР-продукт, полученный выше, клонировали в него посредством слияния. Клонирование посредством слияния проводили с использованием набора для клонирования hi-Fusion® HD (Clontech). Полученный вектор называли pDCM2-NCgl2297(T272I). Последовательности праймеров, используемых в данном примере, описаны в следующей Таблице 1:

Пример 3. Оценка способности к продуцированию L-лизина микроорганизма, экспрессирующего вариант малатдегидрогеназы

3-1. Конструирование штамма для осуществления экспрессии варианта малатдегидрогеназы

Вектор, сконструированный в Примере 2, трансформировали в Corynebacterium glutamicum CJ3P US 9556463 В2).

Штамм, в который был введен данный вариант, был выбран из штаммов, в которых происходила гомологичная рекомбинация с использованием SEQ ID NO: 9 и 10. Выбранный штамм называли CJ3P_NCgl2297_T272I (или СА01-7537), депонировали Корейский центр культуры микроорганизмов учреждение депонирования, работающее согласно Будапештскому соглашению, 22 декабря 2020 г., и ему был присвоен номер доступа KCCM12907P. Последовательности праймеров, использованных в данном примере, описываются в следующей Таблице 2:

3-2. Сравнение способности к продуцированию L-лизина штаммов, экспрессирующих вариант малатдегидрогеназы

Способность к продуцированию L-лизина анализировали посредством оценки титра ферментации в колбе каждого штамма, сконструированного в Примере 3-1, и контрольного родительского штамма.

Сначала каждый штамм инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащей 25 мл затравочной среды, и подвергали культивированию со встряхиванием при 200 об/мин при 30°С в течение 72 часов. Затем затравочную культуральную среду инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащей 24 мл продукционной среды, и подвергали культивированию со встряхиванием при 200 об/мин при 30°С в течение 72 часов. После завершения культивирования продукцию L-лизина анализировали посредством ВЭЖХ. Концентрация L-лизина, а также повышение уровня концентрации в культуральной среде для каждого штамма показаны в Таблице 3 ниже.

Затравочная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 0,1 мг биотина, 1 мг тиамин-НС1, 2 мг пантотената кальция, 2 мг никотинамида (на основе 1 литра дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 7,0)

100 г глюкозы, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г соевого белка, 5 г твердых веществ кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг хлорида тиамина, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃ (на основе 1 литра дистиллированной воды).

Данный эксперимент повторяли 3 раза, и средние значения результатов его анализа представлены в Таблице 3 ниже.

Как представлено в Таблице 3, штамм CJ3P_NCgl2297_T272I демонстрировал повышенную способность к продуцированию L-лизина по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина контрольной группы.

Из приведенного выше описания специалистам в технической области, к которой принадлежит настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в других конкретных формах без изменения его технической сущности и важных характеристик. В данном отношении следует понимать то, что воплощения, описанные выше, являются во всех отношениях иллюстративными и не ограничивающими. Объем настоящего раскрытия следует истолковывать как включающий все изменения или модифицированные формы, происходящие из значения и объема формулы изобретения, подлежащей описанию ниже, а не из приведенного выше подробного описания и эквивалентных ему идей.

--->

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ВАРИАНТ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

L-ЛИЗИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ

<130> OPP20211138KR

<150> KR 10-2021-0013623

<151> 2021-01-29

<160> 11

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (T272I)_малатдегидрогеназа

<400> 1

Met Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gln Ile Ser Tyr Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Asn Gly

20 25 30

Glu Val Phe Gly Thr Asp Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Leu Glu Ile

35 40 45

Pro Gln Ala Leu Gly Gly Ala Glu Gly Val Ala Met Glu Leu Leu Asp

50 55 60

Ser Ala Phe Pro Leu Leu Arg Asn Ile Thr Ile Thr Ala Asp Ala Asn

65 70 75 80

Glu Ala Phe Asp Gly Ala Asn Ala Ala Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro

85 90 95

Arg Gly Lys Gly Glu Glu Arg Ala Asp Leu Leu Ala Asn Asn Gly Lys

100 105 110

Ile Phe Gly Pro Gln Gly Lys Ala Ile Asn Asp Asn Ala Ala Asp Asp

115 120 125

Ile Arg Val Leu Val Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile

130 135 140

Ala Ser Ala Ala Ala Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Phe Asn Ala Met

145 150 155 160

Met Arg Leu Asp His Asn Arg Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Lys Leu

165 170 175

Gly Arg Gly Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Val Val Trp Gly Asn His

180 185 190

Ser Ala Thr Gln Phe Pro Asp Ile Thr Tyr Ala Thr Val Gly Gly Glu

195 200 205

Lys Val Thr Asp Leu Val Asp His Asp Trp Tyr Val Glu Glu Phe Ile

210 215 220

Pro Arg Val Ala Asn Arg Gly Ala Glu Ile Ile Glu Val Arg Gly Lys

225 230 235 240

Ser Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ile Asp His Met Arg Asp

245 250 255

Trp Val Gln Gly Thr Glu Ala Trp Ser Ser Ala Ala Ile Pro Ser Ile

260 265 270

Gly Ala Tyr Gly Ile Pro Glu Gly Ile Phe Val Gly Leu Pro Thr Val

275 280 285

Ser Arg Asn Gly Glu Trp Glu Ile Val Glu Gly Leu Glu Ile Ser Asp

290 295 300

Phe Gln Arg Ala Arg Ile Asp Ala Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ala Glu

305 310 315 320

Arg Glu Ala Val Arg Asp Leu Leu

325

<210> 2

<211> 987

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (T272I)_NCgl2297

<400> 2

atgaattccc cgcagaacgt ctccaccaag aaggtcaccg tcaccggcgc agctggtcaa 60

atctcttatt cactgttgtg gcgcatcgcc aacggtgaag tattcggcac cgacacccct 120

gtagaactga aacttctgga gatccctcag gctcttggcg gggcagaggg tgtggctatg 180

gaacttctgg attctgcctt ccccctcctg cgaaacatca ccatcaccgc ggatgccaat 240

gaggcattcg acggcgctaa tgcggcgttt ttggtcggtg cgaagcctcg cggaaaaggc 300

gaagagcgcg cagatttgct ggctaacaac ggcaagattt tcggacctca aggtaaagct 360

atcaatgaca acgccgcaga tgacattcgt gtcctagttg ttggaaaccc agcgaacacc 420

aacgcgttga ttgcttcagc tgcggcccca gatgttccag catcccgctt caacgcaatg 480

atgcgccttg atcacaaccg tgcgatctcc cagctggcca ccaagcttgg ccgtggatct 540

gcggaattta acaacattgt ggtctgggga aatcactccg caacccagtt cccagacatc 600

acctacgcaa ccgttggtgg agaaaaggtc actgacctgg ttgatcacga ttggtatgtg 660

gaggagttca ttcctcgcgt ggctaaccgt ggcgctgaaa tcattgaggt ccgtggaaag 720

tcttctgcag cttctgcagc atcctctgcg attgatcaca tgcgcgattg ggtacagggc 780

accgaggcgt ggtcctctgc ggcaattcct tccatcggtg catacggcat tcctgagggc 840

atttttgtcg gtctgccaac cgtatcccgc aacggtgagt gggaaatcgt tgaaggcctg 900

gagatttccg atttccagcg cgcccgcatc gacgcgaatg ctcaggaatt gcaggccgag 960

cgcgaggcag tgcgcgactt gctctaa 987

<210> 3

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (WT)_малатдегидрогеназа

<400> 3

Met Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gln Ile Ser Tyr Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Asn Gly

20 25 30

Glu Val Phe Gly Thr Asp Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Leu Glu Ile

35 40 45

Pro Gln Ala Leu Gly Gly Ala Glu Gly Val Ala Met Glu Leu Leu Asp

50 55 60

Ser Ala Phe Pro Leu Leu Arg Asn Ile Thr Ile Thr Ala Asp Ala Asn

65 70 75 80

Glu Ala Phe Asp Gly Ala Asn Ala Ala Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro

85 90 95

Arg Gly Lys Gly Glu Glu Arg Ala Asp Leu Leu Ala Asn Asn Gly Lys

100 105 110

Ile Phe Gly Pro Gln Gly Lys Ala Ile Asn Asp Asn Ala Ala Asp Asp

115 120 125

Ile Arg Val Leu Val Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile

130 135 140

Ala Ser Ala Ala Ala Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Phe Asn Ala Met

145 150 155 160

Met Arg Leu Asp His Asn Arg Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Lys Leu

165 170 175

Gly Arg Gly Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Val Val Trp Gly Asn His

180 185 190

Ser Ala Thr Gln Phe Pro Asp Ile Thr Tyr Ala Thr Val Gly Gly Glu

195 200 205

Lys Val Thr Asp Leu Val Asp His Asp Trp Tyr Val Glu Glu Phe Ile

210 215 220

Pro Arg Val Ala Asn Arg Gly Ala Glu Ile Ile Glu Val Arg Gly Lys

225 230 235 240

Ser Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ile Asp His Met Arg Asp

245 250 255

Trp Val Gln Gly Thr Glu Ala Trp Ser Ser Ala Ala Ile Pro Ser Thr

260 265 270

Gly Ala Tyr Gly Ile Pro Glu Gly Ile Phe Val Gly Leu Pro Thr Val

275 280 285

Ser Arg Asn Gly Glu Trp Glu Ile Val Glu Gly Leu Glu Ile Ser Asp

290 295 300

Phe Gln Arg Ala Arg Ile Asp Ala Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ala Glu

305 310 315 320

Arg Glu Ala Val Arg Asp Leu Leu

325

<210> 4

<211> 987

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (WT)_NCgl2297

<400> 4

atgaattccc cgcagaacgt ctccaccaag aaggtcaccg tcaccggcgc agctggtcaa 60

atctcttatt cactgttgtg gcgcatcgcc aacggtgaag tattcggcac cgacacccct 120

gtagaactga aacttctgga gatccctcag gctcttggcg gggcagaggg tgtggctatg 180

gaacttctgg attctgcctt ccccctcctg cgaaacatca ccatcaccgc ggatgccaat 240

gaggcattcg acggcgctaa tgcggcgttt ttggtcggtg cgaagcctcg cggaaaaggc 300

gaagagcgcg cagatttgct ggctaacaac ggcaagattt tcggacctca aggtaaagct 360

atcaatgaca acgccgcaga tgacattcgt gtcctagttg ttggaaaccc agcgaacacc 420

aacgcgttga ttgcttcagc tgcggcccca gatgttccag catcccgctt caacgcaatg 480

atgcgccttg atcacaaccg tgcgatctcc cagctggcca ccaagcttgg ccgtggatct 540

gcggaattta acaacattgt ggtctgggga aatcactccg caacccagtt cccagacatc 600

acctacgcaa ccgttggtgg agaaaaggtc actgacctgg ttgatcacga ttggtatgtg 660

gaggagttca ttcctcgcgt ggctaaccgt ggcgctgaaa tcattgaggt ccgtggaaag 720

tcttctgcag cttctgcagc atcctctgcg attgatcaca tgcgcgattg ggtacagggc 780

accgaggcgt ggtcctctgc ggcaattcct tccaccggtg catacggcat tcctgagggc 840

atttttgtcg gtctgccaac cgtatcccgc aacggtgagt gggaaatcgt tgaaggcctg 900

gagatttccg atttccagcg cgcccgcatc gacgcgaatg ctcaggaatt gcaggccgag 960

cgcgaggcag tgcgcgactt gctctaa 987

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl2297_1F

<400> 5

tcgagctcgg taccctttgc tggctaacaa cggca 35

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl2297_2R

<400> 6

caggaatgcc gtatgcaccg atggaaggaa ttgccgcaga g 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl2297_3F

<400> 7

ctctgcggca attccttcca tcggtgcata cggcattcct g 41

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl2297_4R

<400> 8

ctctagagga tccccaagtt ctgccatgcg acgct 35

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl2297_5F

<400> 9

tttgctggct aacaacggca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl2297_6R

<400> 10

aagttctgcc atgcgacgct 20

<210> 11

<211> 5803

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pDCM2_плазмида

<400> 11

gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag 60

ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 120

tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc 180

agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgaagctag cttttatcgc cattcgccat 240

tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 300

tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 360

cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 420

tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 480

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 540

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 600

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 660

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 720

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 780

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 840

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 900

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 960

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1020

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 1080

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1140

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1200

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1260

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 1320

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1380

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1440

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1500

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttgggg 1560

tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ctgatagaaa 1620

cagaagccac tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca 1680

tcacccgacg cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa 1740

ataaatcctg gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga 1800

gacgttgatc ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg 1860

ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctgata gaaacagaag ccactggagc 1920

acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt 1980

gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc 2040

ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg 2100

taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt 2160

tatcgagatt ttcaggagct ctttggcatc gtctctcgcc tgtcccctca gttcagtaat 2220

ttcctgcatt tgcctgtttc cagtcggtag atattccaca aaacagcagg gaagcagcgc 2280

ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 2340

tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 2400

caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 2460

ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 2520

ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 2580

aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 2640

gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 2700

tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agggcgtccc ggaaaacgat 2760

tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt 2820

gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaaaa ggttaggaat acggttagcc atttgcctgc 2880

ttttatatag ttcantatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca 2940

ataggatatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca 3000

aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc 3060

gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg 3120

acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta 3180

ggcggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt tcagcggctt gtatgggcca 3240

gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc 3300

gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt tgccgttcat tttaaagacg 3360

ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa tcagcggttt catcactttt 3420

ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag cgccgtttgc taactcagcc 3480

gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt 3540

ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt ggtagccatc ttcagttcca 3600

gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt ctacgtagtg aggatctctc 3660

agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga tgaactgctg tacattttga 3720

tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa 3780

gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca gtgtttgttt gccgtaatgt 3840

ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt cagatgtaaa tgtggctgaa 3900

cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat ttgcatcgaa tttgtcgctg 3960

tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag aagtttcgcc gactttttga 4020

tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat ctccggctaa tgcaaagacg 4080

atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt tttgtaatgg ccagctgtcc 4140

caaacgtcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg tggacgaatc aaattcagaa 4200

acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca gcatatcatg gcgtgtaata 4260

tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga 4320

gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac 4380

tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt 4440

ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata 4500

tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct 4560

ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg 4620

gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga 4680

ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata 4740

gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata 4800

tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcacc 4860

ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 4920

gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 4980

agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5040

acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5100

gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatccgc gccttgagcc tggcgaacag 5160

ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5220

ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5280

agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 5340

aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 5400

ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 5460

cacgatagcc gcgctgcctc gtcttggagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 5520

acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg 5580

attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 5640

gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat 5700

cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag 5760

ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccg 5803

<---

Claims (5)

1. Полипептид, участвующий в продуцировании L-лизина, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой треонин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 272 в SEQ ID NO: 3, заменен изолейцином.

2. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1.

3. Микроорганизм Corynebacterium glutamicum для продуцирования L-лизина, содержащий полипептид по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.

4. Микроорганизм по п. 3, который имеет повышенную способность к продуцированию L-лизина по сравнению с Corynebacterium glutamicum, содержащий полипептид SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.

5. Способ продуцирования L-лизина, включающий культивирование в среде микроорганизма Corynebacterium glutamicum, содержащего полипептид по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.

Images