KR20220110249A - 재조합 미생물로부터 에틸렌을 생산하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 개시 내용은 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물, 이를 제조하는 방법, 및 에틸렌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 출원에서 개시된 재조합 미생물 및 방법의 이점은 미생물 배양으로부터의 에틸렌 생산 증가를 포함할 수 있다. 추가의 이점은 플라스틱, 섬유 및 화학 물질의 제조를 위한 공급 원료로서 유용한 바이오 에틸렌을 생산하고 다른 응용 분야에 사용하기 위한 이산화탄소의 용도일 수 있다. 본 출원에서 개시된 방법 및 시스템의 또 다른 이점은 환경으로부터의 과량의 이산화탄소의 감소를 포함할 수 있다.
Description
상호 참조
본 출원은 2019년 12월 3일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/942,895의 이익을 주장하며, 이는 본 출원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물, 이를 제조하는 방법, 및 이러한 재조합 유기체로부터 에틸렌을 수확하는 방법에 관한 것이다. 본 출원에서 개시된 재조합 미생물 및 방법의 이점은 미생물 배양으로부터의 에틸렌 생산 증가를 포함할 수 있다. 추가의 이점은 플라스틱, 섬유 및 화학 물질의 제조를 위한 공급 원료로서 유용한 바이오 에틸렌을 생산하고 다른 응용 분야에 사용하기 위한 이산화탄소의 용도일 수 있다. 본 출원에서 개시된 방법 및 시스템의 또 다른 이점은 환경으로부터의 과량의 이산화탄소의 감소를 포함할 수 있다.
전세계적인 전력 수요 증가는 석유 및 가스와 같은 화석 연료의 연소로부터 과량의 이산화탄소를 초래하여 많은 사람들이 지구 온난화 위기라고 부르는 것에 상당히 기여하였다. 산업계는 이산화탄소가 대기로 유입되는 것을 방지하는데 필사적이어서 이들은 이산화탄소를 배기 스트림과 대기로부터 격리하는 것에 의존하였다. 그 다음, 이들은 이산화탄소를 지하 환경에 저장한다. 그러나, 현재 공지된 모든 방법은 이산화탄소를 지하에 저장하여 대기로부터 제거한다. 이들은 실제로 이산화탄소를 임의의 다른 유용한 물질로 다시 전환하지 않는다.
제한된 석유 공급과 환경에 대한 이의 유해한 영향은 연료 및 화학 물질의 재생 가능한 공급원에 대한 개발을 촉진하였다. 에틸렌은 플라스틱, 용매 및 섬유를 비롯한 광범위한 산업 분야에 유용한 세계에서 가장 널리 생산되는 유기 화합물이다. 에틸렌은 현재 화석 연료를 증기 분해하거나 에탄을 탈수소화하여 생산된다. 그러나, 매년 수백만 톤의 에틸렌 생산으로 인해, 충분한 양 초과의 이산화탄소가 이러한 공정에 의해 생산되어 전세계 탄소 발자국에 크게 기여한다. 이에 따라, 재생 가능한 방법을 통한 에틸렌의 생산은 에너지 및 화학 산업의 막대한 수요를 충족시키는데 도움이 되면서 또한 환경을 보호하는데 도움이 될 것이다.
에틸렌은 잠재적으로 재생 가능한 공급 원료이기 때문에, 이산화탄소 및 바이오매스와 같은 재생 가능한 공급원으로부터 에틸렌을 생산하는 기술 개발에 많은 관심이 있었다. 바이오 에틸렌은 현재 옥수수 또는 사탕수수로부터 유래된 에탄올을 사용하여 생산되고 있다. 세균 및 진균을 비롯한 다양한 미생물은 자연적으로 소량의 에틸렌을 생성한다. 에틸렌 생성 효소의 이종 발현은 여러 미생물 종에서 입증되었으며, 숙주는 리그노셀룰로오스 및 이산화탄소를 비롯한 다양한 탄소원을 활용할 수 있었다.
현대사에 비추어 볼 때, 대기 중 과량의 이산화탄소는 이를 감소시키는 것이 수익성이 될 때까지 감소되지 않을 것이라고 말하는 것이 타당하다. 상업적 규모로 에틸렌을 생산하기 위해서는 미생물 바이오 에틸렌 시스템 및 공정의 개선이 필요하다. 보다 효율적인 재생 가능한 기술을 통해 탄화수소를 생산할 필요성이 남아 있다. 대기로부터 과량의 이산화탄소를 제거할 필요성이 남아 있다. 산업적 및 상업적 적용을 위한 재생 가능한 공급 원료로부터 에틸렌을 생산하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
요약
본 출원의 실시 형태는 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물에 관한 것이며, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 에틸렌 형성 효소(ethylene forming enzyme: EFE) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 1 (첨부된 부록 참조)과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 EFE 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다. 한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 또한 비-천연의 알파-케토글루타레이트 퍼미아제(alpha-ketoglutarate permease: AKGP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 2 (첨부된 부록 참조)와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 AKGP 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKGP 단백질의 양은 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다. 한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 5% 내지 약 200% 또는 그 이상 더 많다.
다양한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 시아노박테리아(Cyanobacteria), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus), 시네코코커스 레오폴리엔시스(Synechococcus leopoliensis), 시네코시스티스(Synechocystis), 아나베나(Anabaena), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 클라미도모나스 레인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii), 에세리키아(Escherichia), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 지오박테리아(Geobacteria), 조류, 미세조류, 전해합성(electrosynthesis) 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 또는 식물 세포를 포함한다.
한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 높은 카피 수의 세균 벡터 플라스미드, 유도성 프로모터를 갖는 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3 (첨부된 부록 참조)과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다.
한 실시 형태에서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 높은 카피 수의 세균 벡터 플라스미드, 유도성 프로모터를 갖는 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4 (첨부된 부록 참조)와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다.
한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 (첨부된 부록 참조)와 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현하며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6(첨부된 부록 참조)과 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현하며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입된다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 포스포에놀피루베이트 신타아제(phosphoenolpyruvate synthase: PEP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 15와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 PEP 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 PEP 단백질의 양은 비-천연의 PEP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 많고, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKG의 양은 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다. 이러한 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 포스포에놀피루베이트 신타아제(PEP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 15와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 PEP 단백질을 발현하고,
여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 PEP 단백질의 양은 상기 비-천연의 PEP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많고, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKG의 양은 상기 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 17과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 시트레이트 신타아제 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 시트레이트 신타아제 단백질의 양은 상기 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 이소시트레이트 데하이드로게나아제(isocitrate dehydrogenase: IDH) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 20과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 IDH 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 IDH 단백질의 양은 상기 비-천연의 IDH 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 많고, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKG의 양은 상기 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 발현 뉴클레오타이드 서열에서 결실을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 단백질의 양은 상기 결실을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 적다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 24와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 수크로오스 퍼미아제 단백질을 발현하고,
여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 수크로오스 퍼미아제 단백질의 양은 상기 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 24와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 수크로오스 퍼미아제 단백질을 발현하고,
여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 수크로오스 퍼미아제 단백질의 양은 상기 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 24와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 수크로오스 퍼미아제 단백질을 발현하고,
여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 수크로오스 퍼미아제 단백질의 양은 상기 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 서열 번호 26과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로오스 포스페이트 신타아제 단백질, 서열 번호 28과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로오스-6-포스파타아제 단백질, 서열 번호 30과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 글리코겐 포스포릴라아제 단백질, 및 서열 번호 32와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DTP-글루코오스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라아제 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 비-천연의 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 상기 적어도 하나의 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 상기 적어도 하나의 단백질의 양은 상기 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 상기 비-천연의 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많고, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 수크로오스의 양은 상기 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열에서 적어도 하나의 결실을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 34와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인버타아제 단백질, 서열 번호 36과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 글루코실글리세롤-포스페이트 신타아제 단백질, 및 서열 번호 38과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 글리코겐 신타아제 단백질로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 코딩하고, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 상기 적어도 하나의 단백질의 양은 상기 적어도 하나의 결실을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 적다.
본 출원의 실시 형태는 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시 형태에서, 상기 방법은 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열, 또는 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 미생물의 세균 플라스미드 내로 삽입하여 상기 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현한다. 또 다른 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7 (첨부된 부록 참조)과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
다양한 구체화된 방법에서, 상기 미생물은 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 또는 식물 세포를 포함한다.
한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 미생물은 클라미도모나스 종 세균이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 미생물은 에세리키아 종 세균이다. 또 다른 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현하며, 상기 미생물은 시네코코커스 종 세균이다. 또 다른 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 미생물은 시네코코커스 종 세균이다.
에틸렌을 생산하는 방법이 본 출원에서 구체화된다. 이러한 방법의 실시 형태는 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 재조합 미생물이 비-천연의 에틸렌 형성 효소(EFE) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 EFE 단백질을 발현하고, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양이 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 단계; 생물 반응기 배양 용기에서 에틸렌을 생산하기에 충분한 조건하에 상기 생물 반응기 배양 용기에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 에틸렌을 상기 생물 반응기 배양 용기로부터 수확하는 단계를 포함한다.
본 출원의 에틸렌을 생산하는 방법의 한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 상기 미생물의 세균 플라스미드 내로 삽입된, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열, 또는 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현한다.
본 출원의 에틸렌을 생산하는 다양한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 또는 식물 세포를 포함한다.
에틸렌을 생산하는 방법의 한 실시 형태는 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 위치한 상기 재조합 미생물을 함유하는 배양물에 적어도 하나의 활성화제를 첨가하여 에틸렌 생산량을 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시 형태에서, 이러한 방법은 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 함유된 배양 분위기에 CO2를 약 100 ml/분 내지 약 500 ml/분의 속도로 첨가하는 단계를 포함한다. 한 실시 형태에서, 이러한 방법은 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 위치한 상기 재조합 미생물을 함유하는 상기 세포 배양물로부터 적어도 하나의 분자 스위치를 제거하여 에틸렌 생산량을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시 형태에서, 이러한 방법은 상기 재조합 미생물을 배양할 때 적어도 하나의 영양소의 농도 또는 적어도 하나의 자극(제)의 양을 증가 또는 감소시켜 상기 미생물 배양으로부터 생산되는 에틸렌의 양을 조절하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 영양소의 농도 및 상기 적어도 하나의 자극의 양은 상기 미생물 배양에서 약 0.5~1.5 그램/리터 내지 약 0.1 mM의 비율이다. 한 실시 형태에서, 이러한 방법은 상기 에틸렌을 기체 상태에서 액체 상태로 응축시켜 상기 미생물 배양으로부터 생산되는 에틸렌의 양을 제거하는 단계를 추가로 포함하거나, 회수된 에틸렌의 양은 약 0.5 ml 내지 약 10 ml/리터/h이다.
본 출원의 실시 형태는 개선된 알파-케토글루타레이트(alpha-ketoglutarate: AKG) 생산 능력을 갖는 재조합 미생물에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 포스포에놀피루베이트 신타아제(PEP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 15와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 PEP 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 PEP 단백질의 양은 상기 비-천연의 PEP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 이소시트레이트 데하이드로게나아제(IDH) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 20과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 IDH 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 IDH 단백질의 양은 상기 비-천연의 IDH 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많고; 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKG의 양은 상기 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 17과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 시트레이트 신타아제 단백질을 발현하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 시트레이트 신타아제 단백질의 양은 상기 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 발현 뉴클레오타이드 서열에서 결실을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 단백질의 양은 상기 결실을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 적다.
특정 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물을 포함한다.
실시 형태에 대한 하기 상세한 설명 뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 정독할 때 보다 잘 이해될 것이다. 예시의 목적으로, 바람직할 수 있는 일부 실시 형태가 도면에 도시되어 있다. 묘사된 실시 형태는 도시된 정확한 세부 사항으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 달리 명시되지 않는다면, 도면은 축척에 맞지 않다.
도 1은 본 출원의 에틸렌을 생산하는 방법의 실시 형태를 도시하는 흐름도이다.
도 2는 본 출원의 실시 형태에 따른 에틸렌 형성 효소(EFE) 단백질의 발현을 위한 벡터 플라스미드의 예시이다.
도 3a는 본 출원의 실시 형태에 따른 EFE 단백질의 발현을 도시하는 SDS-PAGE 겔의 사진이다.
도 3b는 본 출원의 실시 형태에 따른 EFE 단백질의 발현을 도시하는 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 4a는 본 출원의 실시 형태에 따른 시간 경과에 따른 이. 콜라이(E.coli) BL 21 PUC19 EFE의 성장 속도를 도시하는 그래프이다.
도 4b는 본 출원의 실시 형태에 따른 이. 콜라이 BL 21 PUC19 EFE 배양물에 대한 시간 경과에 따른 에틸렌 수율을 도시하는 그래프이다.
도 5a는 본 출원의 실시 형태에 따른 세균 콜로니의 성장을 도시하는 사진이다.
도 5b는 본 출원의 실시 형태에 따른 세균 콜로니의 성장을 도시하는 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시 형태에 따른 AKG 및 수크로오스 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 7a는 본 발명의 실시 형태에 따른 수크로오스 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 7b는 본 출원의 실시 형태에 따른 플라스크 세균 배양물의 사진이다.
도 8a는 본 발명의 실시 형태에 따른 에틸렌 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 8b는 본 발명의 실시 형태에 따른 에틸렌 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 9a는 본 발명의 실시 형태에 따른 AKG 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 9b는 본 출원의 실시 형태에 따른 플라스크 세균 배양물의 사진이다.
도 1은 본 출원의 에틸렌을 생산하는 방법의 실시 형태를 도시하는 흐름도이다.
도 2는 본 출원의 실시 형태에 따른 에틸렌 형성 효소(EFE) 단백질의 발현을 위한 벡터 플라스미드의 예시이다.
도 3a는 본 출원의 실시 형태에 따른 EFE 단백질의 발현을 도시하는 SDS-PAGE 겔의 사진이다.
도 3b는 본 출원의 실시 형태에 따른 EFE 단백질의 발현을 도시하는 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 4a는 본 출원의 실시 형태에 따른 시간 경과에 따른 이. 콜라이(E.coli) BL 21 PUC19 EFE의 성장 속도를 도시하는 그래프이다.
도 4b는 본 출원의 실시 형태에 따른 이. 콜라이 BL 21 PUC19 EFE 배양물에 대한 시간 경과에 따른 에틸렌 수율을 도시하는 그래프이다.
도 5a는 본 출원의 실시 형태에 따른 세균 콜로니의 성장을 도시하는 사진이다.
도 5b는 본 출원의 실시 형태에 따른 세균 콜로니의 성장을 도시하는 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시 형태에 따른 AKG 및 수크로오스 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 7a는 본 발명의 실시 형태에 따른 수크로오스 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 7b는 본 출원의 실시 형태에 따른 플라스크 세균 배양물의 사진이다.
도 8a는 본 발명의 실시 형태에 따른 에틸렌 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 8b는 본 발명의 실시 형태에 따른 에틸렌 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 9a는 본 발명의 실시 형태에 따른 AKG 생산에 대한 클로닝 실험 결과를 도시하는 서던 블롯의 사진이다.
도 9b는 본 출원의 실시 형태에 따른 플라스크 세균 배양물의 사진이다.
달리 명시되지 않는다면, 모든 측정 값은 표준 미터법 단위이다.
달리 명시되지 않는다면, 한, 하나 또는 상기라는 단어의 모든 경우는 이들이 수식하는 단어의 하나 이상을 지칭할 수 있다.
달리 명시되지 않는다면, "적어도 하나"라는 문구는 대상의 하나 이상을 의미한다. 예를 들어, "적어도 하나의 영양소"는 하나의 영양소, 하나 이상의 영양소 또는 이들의 임의의 조합을 의미한다.
달리 명시되지 않는다면, "약"이라는 용어는 가장 가까운 정수로 반올림된 기재되는 비-백분율 숫자의 ±10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 100 ml/분은 90 내지 110 ml/분을 포함할 것이다. 달리 명시되지 않는다면, "약"이라는 용어는 백분율 숫자의 ±5%를 지칭한다. 예를 들어, 약 95%는 90 내지 100%를 포함할 것이다. "약"이라는 용어가 범위의 관점에서 논의될 때, 상기 용어는 하한 이상 및 상한 이하의 적절한 양을 지칭한다. 예를 들어, 약 100 내지 약 500 ml/분은 90 내지 550 ml/분을 포함할 것이다.
달리 명시되지 않는다면, 본 출원에서 기재된 바와 같은 측정 가능한 특성(높이, 너비, 길이, 비율 등)은 평균 측정값으로 이해된다.
달리 명시되지 않는다면, "제공하다", "제공된" 또는 "제공하는"이라는 용어는 본 출원의 임의의 실시 형태의 물질의 임의의 조성물, 방법 또는 시스템의 임의의 요소, 양, 성분, 시약, 정량, 측정 또는 분석의 공급, 생산, 구입, 제조, 조립, 형성, 선택, 배치, 전환, 도입, 추가 또는 혼입을 지칭한다.
서열 동일성은 본 출원에서 서열을 비교함으로써 결정된 때 2개 이상의 아미노산 (폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산 (폴리뉴클레오타이드) 서열 사이의 관계로서 정의된다. 일반적으로, 서열 동일성 또는 유사성은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 비교된다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한 경우에 따라 이러한 서열의 스트링들 사이의 일치에 의해 결정된 때 아미노산 또는 핵산 서열들 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환을 두 번째 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 다양한 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 한 실시 형태에서, 서열 동일성은 본 출원에서 확인되는 바와 같은 서열의 전체 길이를 비교함으로써 결정된다.
동일성을 결정하기 위한 예시적인 방법은 테스트되는 서열들 사이에서 최대 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성의 측정 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램으로 명문화되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터 프로그램 방법으로는, 예를 들어, NCBI 및 기타 출처 (문헌 [BLAST.RTM. Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894])로부터 공개적으로 이용 가능한 BestFit, BLASTP (Protein Basic Local Alignment Search Tool), BLASTN (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) 및 FASTA (문헌 [Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]가 포함된다. 사용되는 가장 모범적인 알고리즘은 EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite)이다. EMBOSS를 사용한 아미노산 서열 비교를 위한 예시적인 파라미터는 갭 개방 10.0, 갭 확장 0.5, Blosum 매트릭스이다. EMBOSS를 사용한 핵산 서열 비교를 위한 예시적인 파라미터는 갭 개방 10.0, 갭 확장 0.5, DNA 전체 매트릭스 (DNA 동일성 매트릭스)이다. 실시 형태에서, 유전자 은행, KEG, BLAST 및 Ensemble과 같은 온라인 데이터를 사용하여 서열의 상동성을 결정하기 위해 상이한 종들 사이의 DNA/단백질 서열을 비교하는 것이 가능하다.
임의로, 아미노산 유사성의 정도를 결정할 때, 통상의 기술자는 또한 통상의 기술자에게 명백한 바와 같은 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기로는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이 있다. 본 출원에서 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는, 개시된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 이의 자리에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게, 상기 아미노산 변경은 보존적이다. 자연 발생 아미노산 각각에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala을 ser으로; Arg을 lys으로; Asn를 gln 또는 his으로; Asp를 glu로; Cys을 ser 또는 ala으로; Gln을 asn으로; Glu을 asp로; Gly을 pro으로; His을 asn 또는 gln으로; Ile을 leu 또는 val으로; Leu을 ile 또는 val으로; Lys을 arg으로; gln 또는 glu; Met을 leu 또는 ile으로; Phe을 met, leu 또는 tyr으로; Ser을 thr으로; Thr을 ser으로; Trp을 tyr으로; Tyr을 trp 또는 phe으로; 및, Val을 ile 또는 leu으로.
달리 언급되지 않는다면, "적합화된" 또는 "코돈 적합화된"이라는 용어는 본 출원에서 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드의 "코돈 최적화"를 지칭하며, 이의 서열은 본래 또는 비-본래일 수 있거나, 다른 미생물에서의 발현을 위해 적합화될 수 있다. 코돈 최적화는 코딩된 폴리펩타이드에 대한 코돈 사용을 폴리펩타이드를 발현하는 유기체의 코돈 편향에 적합화한다. 코돈 최적화는 일반적으로 숙주 세포에서 코딩된 폴리펩타이드의 생산 수준을 증가시키는데 도움이 된다.
화석 연료의 사용으로 인한 이산화탄소 배출은 전세계적으로 계속해서 증가하고 있다. 대기 이산화탄소 수준의 감소는 기후 변화를 완화하거나 역전시키는 핵심이다. 탄소 포집 및 저장(carbon capture and storage: CCS)은 대기로부터 산업적 이산화탄소의 제거를 위한 탁월한 기술이며; 정제 및 기타 산업 공정으로부터 포집된 20조 톤 이상의 이산화탄소가 다양한 유형의 지하 환경 또는 저장 탱크로 운송 및 저장될 수 있는 것으로 추정된다. CCS가 현재 이용 가능한 다른 방법과 비교하여 이산화탄소 배출을 감소시키기 위한 비용 효율적이고 저렴한 방법이지만, 이산화탄소가 꺼내어 질 때까지 지하에 저장될 뿐이라는 문제가 남아 있다. 그러므로, CCS 방법은 대기 중 과량의 이산화탄소를 감소시키기 위한 지속 가능한 해결책을 제공하지 않는다. 또한, 환경 규제에 의해 강제되거나 비용을 비즈니스 모델의 일부로서 지불하지 않는다면, 이산화탄소를 지하 환경에 주입하는 산업체에 대한 재정적 인센티브가 거의 없다. 거의 틀림없이, 이산화탄소를 처분하는 것 보다 이산화탄소를 생산하는 것이 보다 수익성이 좋기 때문에, 지구 온난화는 위기이다.
대기로부터 과량의 이산화탄소를 보다 효율적이고 지속 가능한 방식으로 제거할 필요성이 남아 있다. 유용한 제품을 제조하기 위해 과량의 이산화탄소를 이용할 수 있는 기술, 및 산업 및 환경에 유익한 기타 응용 분야에 대한 필요성이 남아 있다.
제한된 석유 공급과 환경에 대한 석유 작업의 유해한 영향의 도전은 기존 자원으로부터의 생산량 극대화와 환경적 영향을 최소화할 수 있는 연료 및 화학 물질의 재생 가능한 공급원에 대한 개발에 대한 강조를 증가시켰다. 에틸렌은 잠재적으로 재생 가능한 공급 원료이기 때문에, 이산화탄소 및 바이오매스와 같은 재생 가능한 공급원으로부터 에틸렌을 생산하는 기술의 개발에 많은 관심이 있었다. 에틸렌은 플라스틱, 용매 및 섬유를 비롯한 광범위한 산업 분야에 유용한 세계에서 가장 널리 생산되는 유기 화합물이다. 에틸렌은 현재 화석 연료를 증기 분해하거나 에탄을 탈수소화하여 생산된다. 그러나, 매년 수백만 톤의 에틸렌 생산으로 인해, 충분한 양 초과의 이산화탄소가 이러한 공정에 의해 생산되어 전세계 탄소 발자국에 크게 기여한다. 이에 따라, 재생 가능한 방법을 통한 에틸렌의 생산은 에너지 및 화학 산업의 막대한 수요를 충족시키는데 도움이 되면서 또한 환경을 보호하는데 도움이 될 것이다.
옥수수 또는 사탕수수로부터 유래된 에탄올을 사용하여 바이오 에틸렌을 생산하는 통상적인 방법이 개발되었다. 그러나, 바이오매스 (예를 들어, 옥수수 및 사탕수수)로부터의 바이오 에틸렌 생산은 시간 소모적이고 비용 효율적이지 않은 과정이어서 토지, 운송 및 바이오매스 분해를 필요로 한다. 예를 들어, 그 자체로 CO2 배출을 유발하는 옥수수와 사탕수수의 재배 및 운송과 관련된 막대한 비효율이 있다. 세균 및 진균을 비롯한 다양한 미생물은 자연적으로 소량의 에틸렌을 생성한다. 이러한 미생물은 에틸렌 형성 효소(EFE)를 사용한다. 슈도모나스 시링가에 및 페니실리움 디지타툼(Penicillium digitatum)에서 발견되는 것과 같은 일종의 에틸렌 경로는 에틸렌 형성 효소에 의해 촉매되는 반응에서 기질로서 알파-케토글루타레이트(AKG)와 아르기닌을 사용한다. 단일 유전자의 발현이 에틸렌 생산에 충분할 수 있기 때문에, 에틸렌 형성 효소는 유망한 표적을 제공한다. EFE의 이종 발현을 이용하는 기술은 여러 미생물 종에서 입증되었으며, 미생물 숙주는 리그노셀룰로오스 및 이산화탄소를 비롯한 다양한 탄소원을 캘빈 회로에서 활용할 수 있었다. 또한, 최근 비용 효율적인 고처리량 유전자 서열 분석 기술의 발전은 미생물 유전자 발현에 대한 이해의 증가를 초래하였다. 그러나, 현재 이용 가능한 기술은 미생물 활성화를 통해 산업적 관련 양의 에틸렌을 생산하지 않는다. 상업적 규모로 에틸렌을 생산할 수 있는 미생물 바이오 에틸렌 시스템의 개선이 필요하다. 이산화탄소 공급 원료를 사용하는 산업적 및 기타 응용 분야에 유용한 에틸렌을 생산하는 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명의 실시 형태는 상업적으로 판매될 수 있는 가치 있는 유기 화합물을 생산하는 이점과 함께 환경으로부터 이산화탄소를 제거하는 이점을 제공할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용의 실시 형태는 재조합 미생물 기술을 사용하여 이산화탄소를 유용한 유기 화합물로서의 에틸렌으로 전환함으로써 통상적인 이산화탄소 저장에 대한 재생 가능한 대안을 제공할 수 있다. 본 개시 내용의 실시 형태의 하나의 이점은 상기 방법이 환경으로부터 이산화탄소를 제거하는 것을 석유 또는 천연 가스 회사에게 경제적으로 수익성 있도록 만들 수 있다는 점이다. 석유 회사 또는 이의 계약자는 이산화탄소를 지하 환경에 주입하거나 격리된 이산화탄소를 지하에 남겨두는 대신에 이산화탄소를 재조합 미생물 배양을 위한 탄소원으로서 사용하여 이산화탄소를 에틸렌으로 비용 효율적인 방식으로 전환할 수 있었다. 또한, 공정이 현장에서 실행될 수 있거나 생산하는 것보다 더 많은 이산화탄소를 소비할 것으로 예상되기 때문에, 운송에 의해 생성되는 많은 이산화탄소를 회피할 수 있다.
환경을 보호하기 위한 가장 효과적인 방법은 사람들이 실제로 사용하는 이러한 방법이다. 이러한 방법이 보다 수익성이 있을 수록, 사람들이 보다 많이 사용한다. 본 출원에서 개시된 방법의 이점 중 하나는 생물 반응기 시스템을 사용하는 비용 효율성이다. 본 개시 내용의 실시 형태는 산업적 규모로 에틸렌을 생산하기 위해 관련 대사적 신호 전달 경로를 적합화함으로써 광합성 에틸렌 생산 미생물을 조작하는 이점을 제공할 수 있다. 이러한 실시 형태는 대기로부터 이산화탄소를 제거하는 것과 미생물이 이전에는 상상할 수 없는 규모로 작업을 수행하는 동안 가치 있는 유기 화합물을 수동적으로 생성하는 것이 수익성이 되도록 만들 수 있다.
제일 먼저 이산화탄소를 생성하는 것보다 이산화탄소를 가치 있는 유기 화합물로 전환하는 것이 보다 수익성이 더 높거나 수익성이 비슷하다면 지구 온난화 위기는 어떻게 될까요? 본 개시 내용의 방법은 에너지 생산자를 지구 온난화 회사에서 지구 냉각 회사로 전환시킬 수 있다.
본 발명은 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 개시 내용은 본 출원의 다양한 실시 형태에 따라 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제공하는 단계를 포함하는, 에틸렌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 출원에서 개시된 방법의 일반적인 개요로서, 도 1을 참조하면, 상기 방법은 본 출원에서 개시된 실시 형태에 따른 적어도 하나의 EFE 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 제공하는 단계 (102); 생물 반응기 배양 용기에서 에틸렌을 생산하기에 충분한 조건하에 상기 생물 반응기 배양 용기에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계 (104); 상기 생물 반응기 배양 용기 내의 배양물에 적어도 하나의 활성화제를 첨가하거나 상기 생물 반응기 배양 용기 내의 배양 분위기에 이산화탄소를 첨가함으로써 에틸렌 생산량을 증가시키는 단계 (106); 상기 세포 배양물로부터 적어도 하나의 분자 스위치를 제거함으로써 에틸렌 생산량을 감소시키는 단계 (108); 상기 재조합 미생물을 배양할 때 적어도 하나의 영양소의 농도 또는 적어도 하나의 자극의 양을 증가 또는 감소시켜 미생물 배양으로부터 생산되는 에틸렌의 양을 조절하는 단계 (110); 및 상기 에틸렌을 기체 상태에서 액체 상태로 응축시켜 상기 미생물 배양으로부터 생산되는 에틸렌의 양을 제거하는 단계 (112)를 포함한다. 본 출원의 실시 형태에 따른 EFE 단백질의 발현을 위한 벡터 플라스미드의 예시로서, 도 2를 참조하면, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다. 본 출원에서 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물의 예시로서, 도 3a의 SDS-PAGE 겔의 예시 및 도 3b의 웨스턴 블롯의 예시를 참조하면, EFE 단백질은 화살표로 도시된 바와 같이 벡터 플라스미드 내로 삽입된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 갖는 에세리키아 종 세균의 벡터 플라스미드로부터 발현된다.
재조합 미생물의 실시 형태
본 개시 내용은 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물에 관한 것이다. 이러한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 에틸렌 형성 효소(EFE) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 EFE 단백질을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 슈도모나스 사바스타노이의 EFE를 코딩한다. 한 실시 형태에서, 상기 EFE 단백질은 서열 번호 1과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 EFE 단백질은 서열 번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 5% 내지 약 200% 또는 그 이상 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 50% 내지 약 150% 또는 그 이상 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 75% 내지 약 100% 또는 그 이상 더 많다.
한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 또한 비-천연의 알파-케토글루타레이트 퍼미아제(AKGP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 적어도 하나의 AKGP 단백질을 발현하고, 한 실시 형태에서, 상기 AKGP 단백질은 서열 번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 AKGP 단백질은 서열 번호 2와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 AKGP 단백질은 서열 번호 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 서열 번호 2에 대한 원래 서열은 슈도모나스 시링가에의 AKGP로부터 유래되었지만, 시네코코커스 엘롱가투스에서 이러한 서열의 발현을 개선하기 위해 서열 혁신을 수행하였다. 다양한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKGP 단백질의 양은 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKGP 단백질의 양은 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 5% 내지 약 200% 또는 그 이상 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKGP 단백질의 양은 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 50% 내지 약 150% 또는 그 이상 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 AKGP 단백질의 양은 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 75% 내지 약 100% 또는 그 이상 더 많다.
다양한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 또는 식물 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 트리코더마 비리데(Trichoderma viride), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 및 타바코(tobacco)가 포함될 수 있다.
한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
한 실시 형태에서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균 또는 에세리키아 콜라이 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 이러한 실시 형태에서, 상기 조합된 아미노산 서열은 하나 이상의 정제 태그를 포함할 수 있고; 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 히스티딘 태그를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 His-TEV 서열을 포함하고; 한 실시 형태에서, 상기 His-TEV 서열은 서열 번호 10을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 98% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시아노박테리아에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시네코코커스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
재조합 미생물을 제조하는 방법의 실시 형태
본 출원의 실시 형태는 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시 형태에서, 상기 방법은 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 미생물의 세균 플라스미드 내로 삽입하여 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 슈도모나스 사바스타노이의 EFE를 코딩한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 클라미도모나스 종 세균으로는 클라미도모나스 레인하르티이가 포함된다.
한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 에세리키아 종 세균으로는 이. 콜라이가 포함된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 N-말단 NdeI 클로닝 부위를 포함한다 (서열 번호 8 (부록 참조)). 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 정제 태그를 포함하고; 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 히스티딘 태그를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 C-말단에서 히스티딘 태그에 이어서, 정지 코돈 및 HindIII 클로닝 부위를 포함한다 (서열 번호 9 (부록 참조)).
한 실시 형태에서, 상기 방법은 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 미생물의 세균 플라스미드 내로 삽입하여 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 하나의 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 이러한 실시 형태에서, 상기 조합된 아미노산 서열은 하나 이상의 정제 태그를 포함할 수 있고; 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 히스티딘 태그를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 His-TEV 서열을 포함하고; 한 실시 형태에서, 상기 His-TEV 서열은 서열 번호 10 (부록 참조)을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 98% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시아노박테리아에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시네코코커스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
다양한 구체화된 방법에서, 상기 미생물은 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 또는 식물 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물로는 사카로마이세스 세레비지에, 슈도모나스 푸티다, 트리코더마 비리데, 트리코더마 리세이 및 타바코가 포함될 수 있다.
본 출원의 방법의 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
한 실시 형태에서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균 또는 에세리키아 콜라이 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 이러한 실시 형태에서, 상기 조합된 아미노산 서열은 하나 이상의 정제 태그를 포함할 수 있고; 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 히스티딘 태그를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 His-TEV 서열을 포함하고; 한 실시 형태에서, 상기 His-TEV 서열은 서열 번호 10을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 98% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입된다.
한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시아노박테리아에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시네코코커스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
에틸렌을 생산하는 방법의 실시 형태
에틸렌을 생산하는 방법이 본 출원에서 구체화된다. 이러한 방법의 실시 형태는 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제공하는 단계를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 에틸렌 형성 효소(EFE) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 EFE 단백질을 발현하고; 생물 반응기 배양 용기에서 에틸렌을 생산하기에 충분한 조건하에 상기 생물 반응기 배양 용기에서 상기 재조합 미생물을 배양하고; 에틸렌을 상기 생물 반응기 배양 용기로부터 수확하며, 여기서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 많다.
에틸렌을 생산하는 방법의 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 슈도모나스 사바스타노이의 EFE를 코딩한다. 한 실시 형태에서, 상기 EFE 단백질은 서열 번호 1과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 EFE 단백질은 서열 번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 5% 내지 약 200% 또는 그 이상 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 50% 내지 약 150% 또는 그 이상 더 많다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양은 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 75% 내지 약 100% 또는 그 이상 더 많다.
에틸렌을 생산하는 방법의 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 클라미도모나스 종 세균으로는 클라미도모나스 레인하르티이가 포함된다.
본 출원의 방법의 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 에세리키아 종 세균으로는 이. 콜라이가 포함된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 N-말단 NdeI 클로닝 부위를 포함한다 (서열 번호 8). 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 정제 태그를 포함하고; 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 히스티딘 태그를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 C-말단에서 히스티딘 태그에 이어서, 정지 코돈 및 HindIII 클로닝 부위를 포함한다 (서열 번호 9).
한 실시 형태에서, 에틸렌을 생산하는 방법은 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 미생물의 세균 플라스미드 내로 삽입하여 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 하나의 실시 형태에서, 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 이러한 실시 형태에서, 상기 조합된 아미노산 서열은 하나 이상의 정제 태그를 포함할 수 있고; 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 히스티딘 태그를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 His-TEV 서열을 포함하고; 한 실시 형태에서, 상기 His-TEV 서열은 서열 번호 10을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 98% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시아노박테리아에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시네코코커스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
다양한 구체화된 방법에서, 상기 미생물은 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 또는 식물 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물로는 사카로마이세스 세레비지에, 슈도모나스 푸티다, 트리코더마 비리데, 트리코더마 리세이 및 타바코가 포함될 수 있다.
본 출원의 방법의 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 클라미도모나스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
한 실시 형태에서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 에세리키아 종 세균 또는 에세리키아 콜라이 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
한 실시 형태에서, 상기 재조합 미생물은 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 이러한 실시 형태에서, 상기 조합된 아미노산 서열은 하나 이상의 정제 태그를 포함할 수 있고; 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 히스티딘 태그를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 정제 태그는 His-TEV 서열을 포함하고; 한 실시 형태에서, 상기 His-TEV 서열은 서열 번호 10을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 98% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시아노박테리아에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다. 한 실시 형태에서, 상기 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 상기 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열은 시네코코커스 종 세균에서의 발현을 위해 코돈 적합화된다.
본 출원의 에틸렌을 생산하는 실시 형태는 생물 반응기 배양 용기에서 에틸렌을 생산하기에 충분한 조건하에 상기 생물 반응기 배양에서 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 구체화된 방법에 따른 생물 반응기 배양물은 상기 재조합 미생물 배양물의 성장을 지원하기 위한 하나 이상의 적합한 시약 또는 성장 배지를 포함할 수 있다. 이러한 시약 또는 배양 배지로는 물, 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아미노산 또는 아미노산 유도체, 하나 이상의 완충액, 해수, 루리아 브로쓰(Luria broth), 루리아 베르타니 브로쓰(Luria Bertani broth), BG-11 배지, 이산화탄소, 빛, 온도, 전기 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
에틸렌을 생산하는 방법의 한 실시 형태는 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 위치한 상기 재조합 미생물을 함유하는 배양물에 적어도 하나의 활성화제를 첨가하여 에틸렌 생산량을 증가시키는 단계를 포함한다. 이러한 활성화제의 첨가는 재조합 미생물 배양에 의해 발현되는 EFE 효소의 하나 이상의 기질의 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 기질로는 알파-케토글루타레이트 또는 아르기닌, 또는 이들의 조합 뿐만 아니라 글리세롤 및 글루코오스와 같은 다른 탄소원이 포함될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 활성화제의 첨가는 분자 스위치를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 활성화제의 첨가는 EFE 유전자의 업스트림에 유도성 프로모터의 삽입을 포함할 수 있으며; 이러한 프로모터 중 하나는 IPTG 프로모터를 포함한다. 이러한 실시 형태에서, IPTG는 배양 배지에 분자 스위치로서 첨가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 활성화제의 첨가는 상기 배양물에 하나 이상의 영양소 또는 자극을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 영양소 또는 자극으로는 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아미노산 또는 아미노산 유도체, 하나 이상의 EFE 기질, 석시네이트, 이산화탄소, 빛, 온도, 전기, 글리세롤, 당 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 상기 배양물에 대한 하나 이상의 활성화제의 첨가는 에틸렌 생산 주기를 제어하고 에틸렌 생산 속도를 증진시키는 이점을 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산되는 에틸렌은 생산되는 대로 상기 생물 반응기 배양 용기로부터 제거될 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 상기 에틸렌의 제거는 기체로서 생산된 에틸렌을 액체 형태로 응축시켜 상기 생물 반응기 배양 용기로부터 제거하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시 형태에서, 에틸렌을 생산하는 방법은 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 함유된 배양 분위기에 CO2를 약 100 ml/분 내지 약 500 ml/분의 속도로 첨가하는 단계를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 방법은 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 함유된 배양 분위기에 CO2를 약 150 ml/분 내지 약 450 ml/분의 속도로 첨가하는 단계를 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 방법은 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 함유된 배양 분위기에 CO2를 약 250 ml/분 내지 약 350 ml/분의 속도로 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 실시 형태는 상기 생물 반응기 배양 용기에서 에틸렌 생산 속도를 증진 또는 제어하는 이점을 제공할 뿐만 아니라 CO2를 유용한 생성물로 전환시키는 이점을 제공할 수 있다.
한 실시 형태에서, 에틸렌을 생산하는 방법은 상기 생물 반응기 배양 용기 내에 위치한 상기 재조합 미생물을 함유하는 상기 미생물 배양물로부터 적어도 하나의 분자 스위치를 제거하여 에틸렌 생산량을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시 형태에서, 이러한 방법은 상기 재조합 미생물을 배양할 때 적어도 하나의 영양소의 농도 또는 적어도 하나의 자극의 양을 증가 또는 감소시켜 상기 미생물 배양으로부터 생산되는 에틸렌의 양을 조절하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 영양소의 농도 및 상기 적어도 하나의 자극의 양은 상기 미생물 배양에서 약 0.5~1.5 그램/리터 내지 약 0.1 mM의 비율이다. 한 실시 형태에서, 이러한 방법은 상기 에틸렌을 기체 상태에서 액체 상태로 응축시켜 상기 미생물 배양으로부터 생산되는 에틸렌의 양을 제거하는 단계를 추가로 포함하거나, 회수된 에틸렌의 양은 약 0.5 ml 내지 약 10 ml/리터/h이다. 이러한 실시 형태는 미생물 배양에서 캘빈 회로의 활성 속도를 조절하여 에틸렌 생산의 양을 조절하는 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 발현 시스템에서 성장 시스템으로 전환하는 것이 가능하며, 여기서, 상기 세포는 5~7일 동안 성장하도록 허용되고, 이의 성장 조건은 모니터링된다. 상기 세포가 대수 증식 조건 (상기 세포가 대사적으로 활성인 것을 의미함)에 도달할 때, 성장 시스템에서 발현 시스템으로 전환하는 것이 가능하며, 여기서, 상기 세포는 수확을 위해 에틸렌을 생산하기 위한 에틸렌 생산 주기로 전환된다. 이러한 발현 시스템은 7일 이상 유지될 수 있다.
실시예
실시예 1: 에틸렌 형성 효소 유전자 서열의 클라미도모나스 레인하르티이 벡터 플라스미드 내로의 클로닝
EFE(에틸렌 형성 효소) 단백질을 클라미도모나스 레인하르티이에서 발현 및 생산한다. 플라스미드 pChlamy_4-EFE를 성공적으로 생산하여 EFE 단백질 발현에 사용하였다 (Creative Enzymes, Shirley, NY).
슈도모나스 사바스타노이 피.브이. 파설리콜라(Pseudomonas savastanoi pv. Phaseolicola) EFE 단백질 (GenBank: KPB44727.1, 서열 번호 1)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 pChlamy_4 벡터 플라스미드 (ThermoFisher) 내로 클로닝하였다. 다른 시약 및 기기 사용은 Creative Biostructure에 의해 제공되었다.
슈도모나스 사바스타노이 피.브이. 파설리콜라 균주 유래의 에틸렌 형성 효소(EFE) 유전자 서열 (GenBank: KPB44727.1)을 EFE 재조합 단백질의 제조에 사용하였다. 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 클라미도모나스 레인하르티이에서의 발현을 위해 코돈 적합화 및 합성하였다 (서열 번호 3). EFE 작제물을 KpnI 및 PstI 제한 효소 부위를 갖는 pChlamy_4 벡터 내로 클로닝하였다.
pChlamy_4 벡터 특성에 따라, N-태그를 갖는 EFE를 설계 및 생성하였다. pChlamy_4 벡터는 인트론-1 Rbc S2의 제거 후 Shble 유전자의 시작 부분에서 발견되는 497~499번 위치에서 적절한 번역 개시를 위한 ATG 개시 코돈 (벡터 ATG)을 포함한다. 다중 클로닝 부위 1 (Multiple Cloning Site 1: MCS1)을 플랭킹하는 FMDV 2A 펩타이드 유전자는 Shble 유전자를 갖는 프레임 내에 있다. N-말단 6× His-V5-TEV 태그를 사용하기 위해, EFE 서열을 TEV 부위 이후의 프레임 내에서 KphI/PstI 분해된 pChlamy_4 벡터 내로 클로닝하였다. 적절한 번역 종료를 위해 TAA (정지 코돈)를 설계하였다. 생성된 서열 크로마토그램은 도 2에 도시되어 있으며; 도 2를 참조하면, EFE 단백질 유전자 코딩 서열은 "EFE 단백질"로 라벨링된 화살표에 도시되어 있다. 오픈 리딩 프레임 배향을 뉴클레오타이드 서열 분석에 의한 플라스미드 검증에 의해 확인하였다.
실시예 2: 이. 콜라이에서 EFE의 발현에 대한 단백질 발현 평가
슈도모나스 사바스타노이 피.브이. 파설리콜라 EFE 단백질 (GenBank: KPB44727.1, 서열 번호 1)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 pET-30a(+) 벡터 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이. 콜라이에서의 발현을 위해, C-말단에서 임의의 His 태그에 이어서 정지 코돈 및 Hindll 부위 (서열 번호 9)를 함유하는 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 코돈 적합화하였다 (서열 번호 4). 5-프라임 말단에서의 클로닝을 위해 NdeI 부위를 사용하였으며, 여기서, 상기 NdeI 부위는 ATG 개시 코돈을 포함한다 (서열 번호 8). 이. 콜라이 BL2l(DE3) 적격 세포를 재조합 플라스미드로 형질 전환시켰다. 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 단일 콜로니를 접종하였으며; 배양물을 37℃에서 200 rpm으로 인큐베이션하였다. 세포 밀도가 600 nm에서 OD = 0.6~0.8에 도달하면, 유도를 위해 0.5 mM IPTG를 도입하였다. EFE (약 44.5 kDa)_BL2l(DE3)의 파일럿 발현을 수행하였다. SDS-PAGE (도 3a) 및 웨스턴 블롯팅 (도 3b)을 사용하여 EFE 단백질 발현을 모니터링하였다 (GenScript USA, Inc., Piscataway, NJ). 도 3a 및 도 3b를 참조한다:
작제물 pET 30a(+)의 이. 콜라이 발현에서 EFE의 파일럿 발현의 SDS-PAGE (좌측) 및 웨스턴 블롯 (우측, 항 His 항체 (GenScript, 카탈로그 번호 A00186) 사용) 분석.
레인 M1: 단백질 마커
레인 M2: 웨스턴 블롯 마커
레인 PC1: BSA (1 μg)
레인 PC2: BSA (2 μg)
레인 NC: 유도를 갖지 않는 세포 용해물
레인 1: 15℃에서 16 시간 동안 유도를 갖는 세포 용해물
레인 2: 37℃에서 4 시간 동안 유도를 갖는 세포 용해물
레인 NC1: 유도를 갖지 않는 세포 용해물의 상청액
레인 3: 15℃에서 16 시간 동안 유도를 갖는 세포 용해물의 상청액
레인 4: 37℃에서 4 시간 동안 유도를 갖는 세포 용해물의 상청액
레인 NC2: 유도를 갖지 않는 세포 용해물의 펠릿
레인 5: 15℃에서 16 시간 동안 유도를 갖는 세포 용해물의 펠릿
레인 6: 37℃에서 4 시간 동안 유도를 갖는 세포 용해물의 펠릿
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 결과는 EFE가 이. 콜라이에서 발현되었다는 것을 나타냈다. 가장 높은 EFE 발현 조건은 5 mg/L의 발현 수준과 30%의 용해도를 초래하는 15℃에서 16 시간 동안의 유도로 밝혀졌다.
실시예 3: 시네코코커스 종 세균에서의 발현을 위해 적합화된 재조합 EFE 및 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열
시아노박테리아 종 시네코코커스 엘롱가투스 및 시네코코커스 레오폴리엔시스 (GenScript, Piscataway, NJ)에서의 발현을 위한 뉴클레오타이드 서열의 적합화 후, EFE 단백질을 발현하고 AKGP 단백질 (서열 번호 2)을 발현하기 위한 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합 (EFE_-P2A-aKGP, 서열 번호 7)을 생성하였다. 코돈 사용 편향, GC 함량, CpG 디뉴클레오타이드 함량, mRNA 2차 구조, 잠재 스플라이싱 부위, 조기 PolyA 부위, 내부 카이 부위 및 리보솜 결합 부위, 음성 CpG 섬, RNA 불안정성 모티프 (ARE), 반복체 서열 (직접 반복체, 역 반복체 및 Dyad 반복체), 및 클로닝을 방해할 수 있는 제한 부위를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 유전자 발현의 효율성에 중요한 다양한 파라미터를 적합화하는 코돈 적합화 분석 알고리즘을 사용하였다. 0.95의 생성된 코돈 적응 지수 (Codon Adaptation Index: CAI)와 함께 유전자 서열의 길이에 따른 코돈 사용 빈도의 분포를 사용하여 코돈 사용 편향 조정을 수행하였다. 1.0의 CAI는 목적하는 발현 유기체에서 완벽한 것으로 간주되며, 0.8 초과의 CAI는 높은 유전자 발현 수준의 관점에서 우수한 것으로 간주된다. 최적 코돈의 빈도 (Frequency of Optimal Codon: FOP)를 계산된 코돈 품질 그룹에서 유리한 코돈의 백분율 분포로서 측정하였으며, 목적하는 발현 유기체에서 주어진 아미노산에 대한 최대 사용 빈도를 갖는 코돈에 대해 100의 값을 설정하였다. 상기 코돈 중 80%의 결과가 91~100의 최고 코돈 품질 그룹에서, 3%가 81-90의 두 번째 최고 품질 그룹에서, 14%가 71~80의 세 번째 최고 품질 그룹에서 발견되었다. GC 함량 조정을 수행하여 56.46%의 평균 GC 함량을 생성하였으며, 이상적인 GC 함량의 백분율 범위는 30~70%이다. 하나의 임의의 HindIII 클로닝 부위 (서열 번호 12)를 서열의 1번 위치의 5-프라임 말단에 도입하였으며; 하나의 임의의 KpnI 클로닝 부위 (서열 번호 13)를 서열의 2524번 위치의 3-프라임 말단에 도입하였다.
서열 번호 7로 표현되는 상응하는 EFE와 AKGP 아미노산 서열의 조합은 EFE와 AKGP 아미노산 서열 사이에 삽입된 P2A 절단 서열 (서열 번호 11)을 갖는다. EFE 및 AKGP 서열을 함께 갖는 코딩된 아미노산 서열은 서열 번호 5 (EFE-P2A_pSyn_6 (His 없음))에 나타나 있다. 임의의 His-TEV 서열은 N-말단 (서열 번호 10)에 포함될 수 있으며, 이는 서열 번호 6 (EFE-P2A-aKGP_pSyn_6)의 아미노산 서열을 생성한다.
실시예 4: 실험실 규모 실험 절차
1. 합성 바이오 에틸렌 경로의 중요한 중간체를 코딩하는 맞춤형 설계된 DNA 작제물을 생성한다. 2. 그 다음, 클로닝 및 유전자 발현을 위해 신중하게 선택된 광합성 미생물을 확장한다. 3. 그 다음, 바이오 에틸렌의 지속적인 생산을 위해 미생물의 유전적 및 대사적 조작을 수행한다. 4. 그 다음, 생물 조작 미생물을 선택하고, 광 생물 반응기에서 확장한다. 5. 생물 반응기 배양 조건 (CO2 농도, 광 노출 시간 및 파장, 온도, pH 포함)을 적합화한다. 6. 샘플을 수집하고, HPLC로 분석하여 바이오 에틸렌 합성을 측정한다. 7. 유전자 조작 미생물에서 바이오 에틸렌 생산을 적합화한다. 8. 에틸렌 생산 공정을 규모 확대한다.
실시예 5: 시아노박테리아에서의 AKG 생산 조작
이전 연구는 glgC 유전자의 결실이 시아노박테리아에서 AKG 생산의 증가를 초래한다는 것을 나타냈다. 또한, 포스포에놀피루베이트 신타아제 (서열 번호 15)를 코딩하는 ppc 유전자 (서열 번호 14, Genbank P74299)와 시트레이트 신타아제 (서열 번호 17)를 코딩하는 gltA 유전자 (서열 번호 16, Genbank Q59977)의 과발현은 다른 화합물을 생산하기 위한 기질로서 AKG의 생산을 증진시킬 수 있는 것으로 나타났다. 본 연구를 바탕으로, ppc 및 gltA (과발현)를 비롯한 AKG 합성 및 분비 경로에 직접 관련되는 유전자와 글리코겐 합성 경로에서 중요한 역할을 하는 glgC (결실)를 비롯한 에너지 저장 경로에 관여하는 유전자를 포함하는 2가지 범주의 유전자를 선택하였다. 시네코코커스 엘롱가투스 내로의 통합과 형질 전환된 콜로니의 성장 전에 pSyn6 플라스미드 내로 클로닝하기 위한 ppc-p2A-gltA 작제물 (서열 번호 18)을 생성하였다. 시아노박테리아에서 작제물의 발현을 확인하기 위해 pSyn6-PPC-gltA 콜로니에 대해 PCR을 수행하였으며; 4621개 염기쌍의 PPC-gltA에 대한 예상 밴드 크기를 관찰하였다.
시아노박테리아에서의 AKG 과발현을 위해, IDH 유전자 (서열 번호 19)를 pSyn6 플라스미드에 클로닝하여 이소시트레이트 데하이드로게나아제 (서열 번호 20)를 코딩하는 상기 IDH 유전자의 작제물을 제조하였다. pSyn6-IDH 플라스미드 내로의 IDH 유전자의 성공적인 클로닝을 세균 콜로니의 성장 (도 5a)과 겔 전기 영동 및 DNA 분석 (도 6)에 의해 확인하였다. IDH 작제물을 통합하는 시네코코커스 엘롱가투스 균주 S2434-IDH를 세균 배양 성장 (도 9b)과 겔 전기 영동 및 DNA 분석 (도 9a)에 의해 확인하였다. 세포 배양 성장은 성장 배지 중의 중탄산염 농도를 0.5 g/L 또는 1.0 g/L 증가시킴으로써 상당히 개선되는 것으로 나타났다. 시아노박테리아에서 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 (서열 번호 22)를 코딩하는 glgC 유전자 (서열 번호 21, Genbank CP000I00.1) 결실을 위한 플라스미드도 또한 제작 및 확인하였다.
실시예 6: 시아노박테리아에서의 수크로오스 생산 조작
시아노박테리아에서의 수크로오스 생산을 위해, 이. 콜라이 유래의 cscB 유전자 (서열 번호 23, Genbank P300000)를 pSyn6 플라스미드에 클로닝하여 수크로오스 퍼미아제 (서열 번호 24)를 코딩하는 상기 cscB 유전자의 작제물을 제조하였다. pSyn6-cscB 작제물 내로의 cscB 유전자의 성공적인 클로닝을 세균 콜로니 성장 (도 5b)과 겔 전기 영동 및 DNA 분석 (도 6)에 의해 확인하였다. cscB를 통합하는 시네코코커스 엘롱가투스 균주 UTEX S2434 (S2434-cscB)를 세균 배양 성장 (도 7b)과 겔 전기 영동 및 DNA 분석 (도 7a)에 의해 확인하였다.
cscB 유전자의 과발현 및 glgC 유전자의 결실에 추가하여, 다른 유전자 표적은 중간체를 수크로오스로 경로를 변경시키기 위해 수크로오스 포스페이트 신타아제 (서열 번호 26)를 코딩하는 sps 유전자 (서열 번호 25, Genbank A0A0H3K0V9)의 과발현; 수크로오스-6-포스파타아제 (서열 번호 28)를 코딩하는 spp 유전자 (서열 번호 27, Genbank Q7BII3), 글리코겐 포스포릴라아제 (서열 번호 30)를 코딩하는 glgP 유전자 (서열 번호 29, Genbank Q31RP3), 및 UTP-글루코오스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라아제 (서열 번호 32)를 코딩하는 galU 유전자 (서열 번호 31, Genbank P0AEP3)를 포함한다. 또한, 인버타아제 (서열 번호 34)를 코딩하는 inv 유전자 (서열 번호 33, Genbank P74573)와 글루코실글리세롤-포스페이트 신타아제 (서열 번호 36)를 코딩하는 ggpS 유전자 (서열 번호 35, Genbank P74258)의 결실은 대체 생성물로의 전환을 방지할 것이며; 글리코겐 신타아제 (서열 번호 38)를 코딩하는 glgA 유전자 (서열 번호 37, Genbank P74521)의 결실은 잠재적으로 수크로오스 수율을 증가시킬 수 있는 글리코겐으로의 기질의 전환을 제거할 것이다.
실시예 7: 이. 콜라이에서의 에틸렌 생산 조작
이. 콜라이에서 에틸렌 생산을 조작하기 위해, 높은 카피 수의 플라스미드 pUC19에서 IPTG 유도성 프로모터 하에 에틸렌 형성 효소(EFE)를 코딩하는 유전자 작제물 pUC-EFE (서열 번호 39)를 제조하였다. 이. 콜라이에서의 PUC-EFE 플라스미드 발현을 암피실린, IPTG 및 X-gal로 보충된 한천 배지 상의 콜로니 성장과 겔 전기 영동 및 DNA 분석에 의한 2322개 염기쌍의 예상 밴드 크기의 관찰에 의해 확인하였다 (도 8a 및 도 8b). 도 8a에서, 화살표는 EFE DNA 작제물을 나타내며; 도 8b에서, 화살표는 플라스미드 카피 수를 조절하는 DNA 요소를 나타낸다. DNA 서열 분석 결과는 플라스미드의 존재를 확인하였다. EFE 생산을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 5 mg/L의 에틸렌 발현 수준과 30% 용해도는 섭씨 15도에서 16 시간의 유도 조건하에 관찰되었다.
이. 콜라이에서 에틸렌의 생산을 조작하기 위해, 이. 콜라이에서 EFE의 지속적인 생산을 위한 플라스미드를 작제하였다. 모든 접근법에서, EFE 발현은 엽록체 psbA 프로모터의 제어하에 있었다. 제1 작제물 EFE-AKGP-psbA (서열 번호 40)에서, EFE 및 AKGP 유전자는 psbA 프로모터 (서열 번호 41) 및 rmB 터미네이터 (서열 번호 42)의 제어하에 놓여 있었다. 제2 작제물 EFE-psbA (서열 번호 43)에서, EFE 유전자 발현만이 psbA 프로모터 (서열 번호 41) 및 T7 터미네이터 (서열 번호 44)의 제어하에 놓여 있었다. 이. 콜라이 BL21(DE3), DH5알파 또는 MG1655 세포주에서 단백질을 발현하기 전에, 높은 카피 수의 플라스미드를 이용하기 위해 두 작제물 모두를 pUC19 플라스미드 백본 내로 클로닝하였다. pUC-psb-EFE 플라스미드를 작제하였다 (서열 번호 45).
에틸렌 생산에 미치는 AKG 및 아르기닌 보충제 뿐만 아니라 성장 배지의 영향을 측정하였다. 그 결과는 이. 콜라이 BL 21 PUC19 EFE에 대한 0.037 lb/갤런/월의 최대 에틸렌 생산이 표 1에 나타낸 조건하에 발효될 때 수득되었다는 것을 나타냈다.
표 1. 30℃에서 이. 콜라이 BL 21 PUC19 EFE에 대한 에틸렌 생산 조건
배지 MOPS
글루코오스 4 g/L
IPTG 0.5 mM
아르기닌 3 mM
AKG 2 mM
유도 시작시 유도
이. 콜라이 BL 21 PUC19 EFE의 관찰된 성장률의 결과는 도 4a에 도시되어 있다. 표 1에 나타낸 조건하에 관찰된 에틸렌 수율은 도 4b에 도시되어 있다. 헤드 스페이스 샘플의 가스 크로마토그래피 분석은 이. 콜라이 배양에 의한 에틸렌 생산을 확인하였다.
부록
서열 번호 1: -
서열 번호 2: -
서열 번호 3: -
서열 번호 4: -
서열 번호 5: -
서열 번호 6: -
서열 번호 7: -
서열 번호 8: - 
서열 번호 9: - 
서열 번호 10: - 
서열 번호 11: - 
서열 번호 12: - 
서열 번호 13: - 
서열 번호 14: -
서열 번호 15: -
서열 번호 16: -
서열 번호 17: -
서열 번호 18: -
서열 번호 19: -
서열 번호 20: -
서열 번호 21: -
서열 번호 22: -
서열 번호 23: -
서열 번호 24: -
서열 번호 25: -
서열 번호 26: -
서열 번호 27: -
서열 번호 28: -
서열 번호 29: -
서열 번호 30: -
서열 번호 31: -
서열 번호 32: -
서열 번호 33: -
서열 번호 34: -
서열 번호 35: -
서열 번호 36: -
서열 번호 37: -
서열 번호 38: -
서열 번호 39: -
서열 번호 40: -
서열 번호 41: -
서열 번호 42: -
서열 번호 43: -
서열 번호 44: -
서열 번호 45: -
SEQUENCE LISTING
<110> CEMVITA FACTORY, INC.
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ETHYLENE FROM RECOMBINANT
MICROORGANISMS
<130> P12854WO
<140> PCT/US2020/062938
<141> 2020-12-02
<150> 62/942,895
<151> 2019-12-03
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 387
<212> PRT
<213> Pseudomonas savastanoi
<400> 1
Met Ile His Ala Pro Ser Arg Trp Gly Val Phe Pro Ser Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Ser Pro Asp Val Val Trp Asn Glu His Pro Ser Leu Tyr Met Asp
20 25 30
Lys Glu Glu Thr Ser Met Thr Asn Leu Gln Thr Phe Glu Leu Pro Thr
35 40 45
Glu Val Thr Gly Cys Ala Ala Asp Ile Ser Leu Gly Arg Ala Leu Ile
50 55 60
Gln Ala Trp Gln Lys Asp Gly Ile Phe Gln Ile Lys Thr Asp Ser Glu
65 70 75 80
Gln Asp Arg Lys Thr Gln Glu Ala Met Ala Ala Ser Lys Gln Phe Cys
85 90 95
Lys Glu Pro Leu Thr Phe Lys Ser Ser Cys Val Ser Asp Leu Thr Tyr
100 105 110
Ser Gly Tyr Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Thr Ala Gly Lys Pro Asp
115 120 125
Phe Pro Glu Ile Phe Thr Val Cys Lys Asp Leu Ser Val Gly Asp Gln
130 135 140
Arg Val Lys Ala Gly Trp Pro Cys His Gly Pro Val Pro Trp Pro Asn
145 150 155 160
Asn Thr Tyr Gln Lys Ser Met Lys Thr Phe Met Glu Glu Leu Gly Leu
165 170 175
Ala Gly Glu Arg Leu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Gly Phe Glu Leu Pro
180 185 190
Ile Asn Thr Phe Thr Asp Leu Thr Arg Asp Gly Trp His His Met Arg
195 200 205
Val Leu Arg Phe Pro Pro Gln Thr Ser Thr Leu Ser Arg Gly Ile Gly
210 215 220
Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val Ile Ala Ala Gln Asp Asp Val
225 230 235 240
Gly Gly Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg
245 250 255
Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu
260 265 270
Pro Trp Thr Phe Val Thr Pro Thr Pro Gly Val Trp Thr Val Phe Pro
275 280 285
Gly Asp Ile Leu Gln Phe Met Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Thr Pro
290 295 300
His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe
305 310 315 320
His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser
325 330 335
Ala Asn Glu Arg Ile His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met
340 345 350
Arg Cys Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Thr Gln Arg Ile Asn Lys Glu Asn
355 360 365
Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala
370 375 380
Thr Gly Ser
385
<210> 2
<211> 431
<212> PRT
<213> Pseudomonas syringae
<400> 2
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1 5 10 15
Arg Arg Arg Val Trp Ala Ile Val Ser Ala Ser Ser Gly Asn Leu Val
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Arg Arg Gly Arg Lys Thr Ser Met Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Glu Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Ala Met Gly Ala Ala Leu Ala Ile
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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420 425 430
<210> 3
<211> 1161
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
atgattcacg ccccgtcgcg ctggggcgtg tttccctcgc tgggcctgtg cagccccgac 60
gtggtgtgga acgagcaccc gagcctgtac atggacaagg aggagacgtc gatgaccaac 120
ctgcagacgt tcgagctgcc gaccgaggtg accggctgcg ccgccgacat ctccctgggc 180
cgggcgctga tccaggcgtg gcagaaggac ggcatcttcc agatcaagac cgacagcgag 240
caggaccgga agacccagga ggcgatggcg gcctccaagc agttctgcaa ggagcccctg 300
accttcaagt cgtcctgcgt cagcgacctg acctactcgg gctacgtggc ctcgggcgag 360
gaggtgaccg ccggcaagcc ggactttccg gagatcttca ccgtgtgcaa ggacctgagc 420
gtgggcgacc agcgggtcaa ggcgggctgg ccctgccacg gccccgtgcc gtggccgaac 480
aacacctacc agaagtccat gaagacgttc atggaggagc tgggcctggc cggcgagcgc 540
ctgctgaagc tgaccgcgct gggcttcgag ctgcccatca acacgttcac cgacctgacc 600
cgggacggct ggcaccacat gcgcgtcctg cggtttccgc cccagaccag cacgctgagc 660
cgcggcattg gcgcgcacac ggactacggc ctgctggtga ttgccgcgca ggacgacgtg 720
ggcggcctgt acattcgccc gccggtggag ggcgagaagc gcaaccggaa ctggctgccc 780
ggcgagtcct cggcgggcat gttcgagcac gacgagccct ggacgttcgt gacccccacg 840
ccgggcgtgt ggacggtgtt tcccggcgac atcctgcagt tcatgaccgg cggccagctg 900
ctgtcgacgc cgcacaaggt gaagctgaac acccgggagc gcttcgcctg cgcgtacttc 960
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atccactacg gcgagcactt caccaatatg tttatgcgct gctaccccga ccgcatcacc 1080
acccagcgca tcaacaagga gaatcgcctg gcgcacctgg aggacctgaa gaagtacagc 1140
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<210> 4
<211> 1161
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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ctgcagacct ttgaactgcc gaccgaagtg accggttgcg cggcggacat cagcctgggt 180
cgtgcgctga ttcaggcgtg gcaaaaggat ggtatcttcc agattaaaac cgacagcgag 240
caggatcgta agacccaaga agcgatggcg gcgagcaagc aattttgcaa agagccgctg 300
accttcaaaa gcagctgcgt tagcgacctg acctacagcg gttatgtggc gagcggcgag 360
gaagttaccg cgggcaagcc ggatttcccg gaaattttta ccgtgtgcaa ggacctgagc 420
gtgggcgatc agcgtgttaa agcgggttgg ccgtgccatg gtccggttcc gtggccgaac 480
aacacctatc aaaagagcat gaaaaccttt atggaggaac tgggtctggc gggcgagcgt 540
ctgctgaaac tgaccgcgct gggttttgaa ctgccgatca acaccttcac cgacctgacc 600
cgtgatggct ggcaccacat gcgtgtgctg cgtttcccgc cgcagaccag caccctgagc 660
cgtggtattg gtgcgcacac cgactacggt ctgctggtga ttgcggcgca agacgatgtt 720
ggtggcctgt atatccgtcc gccggtggag ggcgaaaagc gtaaccgtaa ctggctgccg 780
ggcgagagca gcgcgggcat gtttgagcac gacgaaccgt ggaccttcgt taccccgacc 840
ccgggtgtgt ggaccgtttt tccgggcgat attctgcagt tcatgaccgg tggccaactg 900
ctgagcaccc cgcacaaggt taaactgaac acccgtgaac gtttcgcgtg cgcgtacttt 960
cacgagccga acttcgaagc gagcgcgtat ccgctgttcg agccgagcgc gaacgaacgt 1020
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gacacccgtg cgaccggcag c 1161
<210> 5
<211> 838
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 5
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Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val Ile Ala Ala Gln Asp Asp Val
225 230 235 240
Gly Gly Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg
245 250 255
Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu
260 265 270
Pro Trp Thr Phe Val Thr Pro Thr Pro Gly Val Trp Thr Val Phe Pro
275 280 285
Gly Asp Ile Leu Gln Phe Met Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Thr Pro
290 295 300
His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe
305 310 315 320
His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser
325 330 335
Ala Asn Glu Arg Ile His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met
340 345 350
Arg Cys Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Thr Gln Arg Ile Asn Lys Glu Asn
355 360 365
Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala
370 375 380
Thr Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
385 390 395 400
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Glu Ser Ile Thr Ser Asn Gly
405 410 415
Thr Leu Val Ala Ser Asp Thr Arg Arg Arg Val Trp Ala Ile Val Ser
420 425 430
Ala Ser Ser Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Ser
435 440 445
Phe Cys Ser Leu Tyr Phe Ala His Ile Phe Phe Pro Ser Gly Asn Thr
450 455 460
Thr Thr Gln Leu Leu Gln Thr Ala Gly Val Phe Ala Ala Gly Phe Leu
465 470 475 480
Met Arg Pro Ile Gly Gly Trp Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Arg Arg
485 490 495
Gly Arg Lys Thr Ser Met Leu Ile Ser Val Cys Met Met Cys Phe Gly
500 505 510
Ser Leu Ile Ile Ala Cys Leu Pro Gly Tyr Asp Ala Ile Gly Thr Trp
515 520 525
Ala Pro Ala Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Phe Gln Gly Leu Ser Val
530 535 540
Gly Gly Glu Tyr Gly Thr Ser Ala Thr Tyr Met Ser Glu Ile Ala Leu
545 550 555 560
Glu Gly Arg Lys Gly Phe Tyr Ala Ser Phe Gln Tyr Val Thr Leu Ile
565 570 575
Gly Gly Gln Leu Leu Ala Ile Leu Val Val Val Ile Leu Gln Gln Ile
580 585 590
Leu Thr Asp Ser Gln Leu His Glu Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Ala
595 600 605
Met Gly Ala Ala Leu Ala Ile Val Ala Leu Trp Leu Arg Arg Gln Leu
610 615 620
Asp Glu Thr Ser Gln Lys Glu Val Arg Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser
625 630 635 640
Phe Lys Gly Leu Trp Arg Asn Arg Lys Ala Phe Leu Met Val Leu Gly
645 650 655
Phe Thr Ala Gly Gly Ser Leu Ser Phe Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Met
660 665 670
Gln Lys Tyr Leu Val Asn Thr Thr Gly Met His Ala Asn Val Ala Ser
675 680 685
Val Ile Met Thr Ala Ala Leu Phe Val Phe Met Leu Ile Gln Pro Leu
690 695 700
Ile Gly Ala Leu Ser Asp Lys Ile Gly Arg Arg Thr Ser Met Leu Ile
705 710 715 720
Phe Gly Gly Met Ser Ala Leu Cys Thr Val Pro Ile Leu Thr Ala Leu
725 730 735
Gln His Val Ser Ser Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Leu Val Met Leu Ala
740 745 750
Met Val Ile Val Ser Phe Tyr Thr Ser Ile Ser Gly Ile Leu Lys Ala
755 760 765
Glu Met Phe Pro Ala Gln Val Arg Ala Leu Gly Val Gly Leu Ser Tyr
770 775 780
Ala Val Ala Asn Ala Leu Phe Gly Gly Ser Ala Glu Tyr Val Ala Leu
785 790 795 800
Ser Leu Lys Ser Trp Gly Ser Glu Thr Thr Phe Phe Trp Tyr Val Thr
805 810 815
Ile Met Gly Ala Leu Ala Phe Ile Val Ser Leu Met Leu His Arg Lys
820 825 830
Gly Lys Gly Ile Arg Leu
835
<210> 6
<211> 854
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 6
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys Leu
1 5 10 15
Met Ile His Ala Pro Ser Arg Trp Gly Val Phe Pro Ser Leu Gly Leu
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225 230 235 240
Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val Ile Ala Ala Gln Asp Asp Val
245 250 255
Gly Gly Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg
260 265 270
Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu
275 280 285
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290 295 300
Gly Asp Ile Leu Gln Phe Met Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Thr Pro
305 310 315 320
His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe
325 330 335
His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser
340 345 350
Ala Asn Glu Arg Ile His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met
355 360 365
Arg Cys Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Thr Gln Arg Ile Asn Lys Glu Asn
370 375 380
Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
405 410 415
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Glu Ser Ile Thr Ser Asn Gly
420 425 430
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435 440 445
Ala Ser Ser Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Ser
450 455 460
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465 470 475 480
Thr Thr Gln Leu Leu Gln Thr Ala Gly Val Phe Ala Ala Gly Phe Leu
485 490 495
Met Arg Pro Ile Gly Gly Trp Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Arg Arg
500 505 510
Gly Arg Lys Thr Ser Met Leu Ile Ser Val Cys Met Met Cys Phe Gly
515 520 525
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Gly Lys Gly Ile Arg Leu
850
<210> 7
<211> 2517
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 7
atgattcatg ccccctcccg ctggggcgtg tttcccagtc tgggtctctg ctcccccgat 60
gtggtgtgga acgaacaccc cagcctgtac atggataagg aagagaccag tatgaccaat 120
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caagatcgca agacccaaga ggccatggcc gccagcaaac aattttgcaa ggaacccctg 300
acctttaaat ccagctgcgt gagcgatctc acctacagtg gctatgtggc cagtggtgaa 360
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aatacctatc aaaaatccat gaagaccttt atggaagaac tcggtctggc cggtgaacgc 540
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ggcgaaagtt ccgccggcat gtttgaacac gatgaaccct ggacctttgt gacgcccacg 840
cccggcgtgt ggaccgtgtt tcccggtgat attctgcaat ttatgaccgg cggtcaactg 900
ctctccacgc cccacaaagt gaagctcaac acccgcgaac gctttgcctg cgcctacttt 960
cacgaaccca attttgaggc cagtgcctat cccctgtttg aaccctccgc caacgagcgc 1020
attcactacg gcgagcactt taccaatatg tttatgcgct gctatcccga tcgcattacc 1080
acccaacgca ttaacaagga aaatcgcctg gcccacctcg aggatctgaa aaagtatagt 1140
gatacccgcg ccaccggtag tggtgccacc aactttagcc tgctcaaaca agccggcgat 1200
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tggtttgatt tttacgtgta tagcttttgc agtctctact ttgcccacat tttctttccc 1380
agtggcaata ccaccaccca actgctgcaa accgccggcg tgtttgccgc cggttttctg 1440
atgcgcccca ttggcggttg gctctttggc cgcattgccg atcgtcgcgg tcgcaagacc 1500
agcatgctga ttagcgtgtg catgatgtgc tttggctccc tgattattgc ctgcctcccc 1560
ggctatgatg ccattggcac ctgggccccc gccctgctcc tgctggcccg cctctttcaa 1620
ggcctgagcg tgggcggtga atacggcacc agcgccacct atatgagtga aattgccctg 1680
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ctcgccattc tcgtggtggt gattctccaa caaattctga ccgattccca actgcacgaa 1800
tggggctggc gcattccctt tgccatgggt gccgccctgg ccattgtggc cctgtggctc 1860
cgtcgccaac tcgatgaaac cagccaaaaa gaggtgcgcg ccctgaaaga agccggcagt 1920
tttaaaggtc tctggcgcaa ccgcaaggcc tttctcatgg tgctgggctt taccgccggc 1980
ggtagtctgt ccttttacac ctttaccacc tacatgcaaa aatatctcgt gaacaccacc 2040
ggcatgcacg ccaatgtggc cagcgtgatt atgaccgccg ccctgtttgt gtttatgctc 2100
attcaacccc tgattggcgc cctcagcgat aagattggtc gtcgcaccag tatgctgatt 2160
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<210> 8
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 8
catatg 6
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 9
caccaccacc atcatcatta atgaaagctt 30
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 10
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys Leu
1 5 10 15
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 11
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 12
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 12
aagctt 6
<210> 13
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 13
ggtacc 6
<210> 14
<211> 2757
<212> DNA
<213> Synechocystis sp.
<400> 14
atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60
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aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840
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agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020
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<211> 919
<212> PRT
<213> Synechocystis sp.
<400> 15
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Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala
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Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu
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Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala
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145 150 155 160
Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys
165 170 175
Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp
180 185 190
Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile
195 200 205
Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro
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Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu
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Gly Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly
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Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe
355 360 365
Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Lys Asp
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385 390 395 400
Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu
405 410 415
Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr
420 425 430
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435 440 445
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545 550 555 560
Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp
565 570 575
Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp
580 585 590
Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Asn Val
595 600 605
Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro
610 615 620
Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser
625 630 635 640
Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn
645 650 655
Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu
660 665 670
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675 680 685
Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala
690 695 700
Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser
705 710 715 720
Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser
725 730 735
Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp
740 745 750
Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly
755 760 765
Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr
770 775 780
Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Leu
785 790 795 800
Pro Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu
805 810 815
Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Thr Glu Val Ala
820 825 830
Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys
835 840 845
Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro
850 855 860
Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu
865 870 875 880
Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln
885 890 895
Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser
900 905 910
Thr Ala Val Arg Asn Ser Gly
915
<210> 16
<211> 1314
<212> DNA
<213> Synechocystis sp.
<400> 16
atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60
ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120
aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180
accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240
gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300
ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360
cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420
gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480
ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540
gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600
aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
<210> 17
<211> 437
<212> PRT
<213> Synechocystis sp.
<400> 17
Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
115 120 125
Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
225 230 235 240
Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
290 295 300
Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
325 330 335
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile
405 410 415
Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val
420 425 430
Pro Arg Glu Glu Arg
435
<210> 18
<211> 4148
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 18
atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60
gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120
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ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240
gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300
ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360
gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420
gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480
cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540
gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600
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ggtgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780
aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840
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agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020
acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080
ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140
gaatccaagg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200
agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260
gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320
gcagagaaac ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380
ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440
gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500
tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560
aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620
ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680
ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740
ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800
tgccgatcag ccggggtcaa cgttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860
ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920
gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980
cgccgaaacc tcgaagccct ggtctcagcc acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040
gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100
aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160
acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220
acctcctcgg tggaagattt gcgagccatc ccatgggtgc tcagctggtc acagtctcgt 2280
gtcatgctgc caggctggtt tggtgtcgga accgcattag agcagtggat tggcgaaggg 2340
gagcaggcca cccaacgcat tgccgagctg caaacactca atgagtcctg gccattttta 2400
ccctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460
ctctacgcag acctgatccc agatacggaa gtagccgagc gagtctattc cgtcatccgc 2520
gaggagtact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggctctga tgatctgctt 2580
gatgacaacc cacttctcgc acgctctgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640
aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagtg 2700
tcccgcaaca ttcagctgac catgaacggt ctttccactg cggtgcgcaa ctccggcgcc 2760
accaactcaa ctccggcgcc accaacttta gcctgctcaa acaagccggc gatgtggaag 2820
agaaccccgg tcccatgttt gaaagggata tcgtggctac tgataacaac aaggctgtcc 2880
tgcactaccc cggtggcgag ttcgaaatgg acatcatcga ggcttctgag ggtaacaacg 2940
gtgttgtcct gggcaagatg ctgtctgaga ctggactgat cacttttgac ccaggttatg 3000
tgagcactgg ctccaccgag tcgaagatca cctacatcga tggcgatgcg ggaatcctgc 3060
gttaccgcgg ctatgacatc gctgatctgg ctgagaatgc caccttcaac gaggtttctt 3120
acctacttat caacggtgag ctaccaaccc cagatgagct tcacaagttt aacgacgaga 3180
ttcgccacca cacccttctg gacgaggact tcaagtccca gttcaacgtg ttcccacgcg 3240
acgctcaccc aatggcaacc ttggcttcct cggttaacat tttgtctacc tactaccagg 3300
accagctgaa cccactcgat gaggcacagc ttgataaggc aaccgttcgc ctcatggcaa 3360
aggttccaat gctggctgcg tacgcacacc gcgcacgcaa gggtgctcct tacatgtacc 3420
cagacaactc cctcaatgcg cgtgagaact tcctgcgcat gatgttcggt tacccaaccg 3480
agccatacga gatcgaccca atcatggtca aggctctgga caagctgctc atcctgcacg 3540
ctgaccacga gcagaactgc tccacctcca ccgttcgtat gatcggttcc gcacaggcca 3600
acatgtttgt ctccatcgct ggtggcatca acgctctgtc cggcccactg cacggtggcg 3660
caaaccaggc tgttctggag atgctcgaag acatcaagag caaccacggt ggcgacgcaa 3720
ccgagttcat gaacaaggtc aagaacaagg aagacggcgt ccgcctcatg ggcttcggac 3780
accgcgttta caagaactac gatccacgtg cagcaatcgt caaggagacc gcacacgaga 3840
tcctcgagca cctcggtggc gacgatcttc tggatctggc aatcaagctg gaagaaattg 3900
cactggctga tgattacttc atctcccgca agctctaccc gaacgtagac ttctacaccg 3960
gcctgatcta ccgcgcaatg ggcttcccaa ctgacttctt caccgtattg ttcgcaatcg 4020
gtcgtctgcc aggatggatc gctcactacc gcgagcagct cggtgcagca ggcaacaaga 4080
tcaaccgccc acgccaggtc tacaccggca acgaatcccg caagttggtt cctcgcgagg 4140
agcgctaa 4148
<210> 19
<211> 1428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 19
atgtacgaga agattcaacc ccctagcgaa ggcagcaaaa ttcgctttga agccggcaag 60
ccgatcgttc ccgacaaccc gatcattccc ttcattcgtg gtgacggcgc tggcgttgat 120
atctggcccg caactgagcg cgttctcgat gccgctgtcg ctaaagccta tggcggtcag 180
cgcaaaatca cttggttcaa agtctacgcg ggtgatgaag cctgcgacct ctacggcacc 240
taccaatatc tgcctgaaga tacgctgaca gcgatccgcg agtacggcgt ggcaatcaaa 300
ggcccgctga cgacgccgat cggtggtggc attcgatcgc tgaacgtggc gctacggcaa 360
atcttcgatc tctatgcctg cgtccgcccc tgtcgctact acaccggcac accctcgccc 420
caccgcacgc ccgaacaact cgatgtggtg gtctaccgcg aaaacaccga ggatatctac 480
ctcggcatcg aatggaagca aggtgatccc accggcgatc gcctgatcaa gctgctgaac 540
gaggacttca ttcccaacag ccccagcttg ggtaaaaagc aaatccgttt ggattccggc 600
attggtatta agccgatcag taaaacgggt agccagcgtc tgattcgtcg tgcgatcgag 660
catgccctac gcctcgaagg ccgcaagcga catgtcaccc ttgtccacaa gggcaacatc 720
atgaagttca cggaaggtgc tttccgggac tggggctatg aactggccac gactgagttc 780
cgaaccgact gtgtgactga acgggagagc tggattcttg ccaaccaaga aagcaagccg 840
gatctcagct tggaagacaa tgcgcggctc atcgaacctg gctacgacgc gatgacgccc 900
gaaaagcagg cagcagtggt ggctgaagtg aaagctgtgc tcgacagcat cggcgccacc 960
cacggcaacg gtcagtggaa gtctaaggtg ctggttgacg atcgcattgc tgacagcatc 1020
ttccagcaga ttcaaacccg cccgggtgaa tactcggtgc tggcgacgat gaacctcaat 1080
ggcgactaca tctctgatgc agcggcggcg gtggtcggtg gcctgggcat ggcccccggt 1140
gccaacattg gcgacgaagc ggcgatcttt gaagcgaccc acggcgcagc gcccaagcac 1200
gctggcctcg atcgcattaa ccccggctcg gtcatcctct ccggcgtgat gatgctggag 1260
tacctaggct ggcaagaggc tgctgacttg atcaccaagg gcatcagcca agcgatcgct 1320
aaccgtgagg tcacctacga tctggctcgg ttgatggaac cggcggttga tcaaccactc 1380
aagtgctcgg aatttgccga agccatcgtc aagcatttcg acgattag 1428
<210> 20
<211> 475
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Met Tyr Glu Lys Ile Gln Pro Pro Ser Glu Gly Ser Lys Ile Arg Phe
1 5 10 15
Glu Ala Gly Lys Pro Ile Val Pro Asp Asn Pro Ile Ile Pro Phe Ile
20 25 30
Arg Gly Asp Gly Thr Gly Val Asp Ile Trp Pro Ala Thr Glu Arg Val
35 40 45
Leu Asp Ala Ala Val Ala Lys Ala Tyr Gly Gly Gln Arg Lys Ile Thr
50 55 60
Trp Phe Lys Val Tyr Ala Gly Asp Glu Ala Cys Asp Leu Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Gln Tyr Leu Pro Glu Asp Thr Leu Thr Ala Ile Arg Glu Tyr Gly
85 90 95
Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Thr Thr Pro Ile Gly Gly Gly Ile Arg
100 105 110
Ser Leu Asn Val Ala Leu Arg Gln Ile Phe Asp Leu Tyr Ala Cys Val
115 120 125
Arg Pro Cys Arg Tyr Tyr Thr Gly Thr Pro Ser Pro His Arg Thr Pro
130 135 140
Glu Gln Leu Asp Val Val Val Tyr Arg Glu Asn Thr Glu Asp Ile Tyr
145 150 155 160
Leu Gly Ile Glu Trp Lys Gln Gly Asp Pro Thr Gly Asp Arg Leu Ile
165 170 175
Lys Leu Leu Asn Glu Asp Phe Ile Pro Asn Ser Pro Ser Leu Gly Lys
180 185 190
Lys Gln Ile Arg Leu Asp Ser Gly Ile Gly Ile Lys Pro Ile Ser Lys
195 200 205
Thr Gly Ser Gln Arg Leu Ile Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Arg
210 215 220
Leu Glu Gly Arg Lys Arg His Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile
225 230 235 240
Met Lys Phe Thr Glu Gly Ala Phe Arg Asp Trp Gly Tyr Glu Leu Ala
245 250 255
Thr Thr Glu Phe Arg Thr Asp Cys Val Thr Glu Arg Glu Ser Trp Ile
260 265 270
Leu Ala Asn Gln Glu Ser Lys Pro Asp Leu Ser Leu Glu Asp Asn Ala
275 280 285
Arg Leu Ile Glu Pro Gly Tyr Asp Ala Met Thr Pro Glu Lys Gln Ala
290 295 300
Ala Val Val Ala Glu Val Lys Ala Val Leu Asp Ser Ile Gly Ala Thr
305 310 315 320
His Gly Asn Gly Gln Trp Lys Ser Lys Val Leu Val Asp Asp Arg Ile
325 330 335
Ala Asp Ser Ile Phe Gln Gln Ile Gln Thr Arg Pro Gly Glu Tyr Ser
340 345 350
Val Leu Ala Thr Met Asn Leu Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Asp Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Met Ala Pro Gly Ala Asn Ile Gly
370 375 380
Asp Glu Ala Ala Ile Phe Glu Ala Thr His Gly Thr Ala Pro Lys His
385 390 395 400
Ala Gly Leu Asp Arg Ile Asn Pro Gly Ser Val Ile Leu Ser Gly Val
405 410 415
Met Met Leu Glu Tyr Leu Gly Trp Gln Glu Ala Ala Asp Leu Ile Thr
420 425 430
Lys Gly Ile Ser Gln Ala Ile Ala Asn Arg Glu Val Thr Tyr Asp Leu
435 440 445
Ala Arg Leu Met Glu Pro Ala Val Asp Gln Pro Leu Lys Cys Ser Glu
450 455 460
Phe Ala Glu Ala Ile Val Lys His Phe Asp Asp
465 470 475
<210> 21
<211> 1293
<212> DNA
<213> Synechococcus elongatus
<400> 21
gtgaaaaacg tgctggcgat cattctcggt ggaggcgcag gcagtcgtct ctatccacta 60
accaaacagc gcgccaaacc agcggtcccc ctggcgggca aataccgctt gatcgatatt 120
cccgtcagca attgcatcaa cgctgacatc aacaaaatct atgtgctgac gcagtttaac 180
tctgcctcgc tcaaccgcca cctcagtcag acctacaacc tctccagcgg ctttggcaat 240
ggctttgttg aggtgctagc agctcagatt acgccggaga accccaactg gttccaaggc 300
accgccgatg cggttcgcca gtatctctgg ctaatcaaag agtgggatgt ggatgagtac 360
ctgatcctgt cgggggatca tctctaccgc atggactata gccagttcat tcagcggcac 420
cgagacacca atgccgacat cacactctcg gtcttgccga tcgatgaaaa gcgcgcctct 480
gattttggcc tgatgaagct agatggcagc ggccgggtgg tcgagttcag cgaaaagccc 540
aaaggggatg aactcagggc gatgcaagtc gataccacga tcctcgggct tgaccctgtc 600
gctgctgctg cccagccctt cattgcctcg atgggcatct acgtcttcaa gcgggatgtt 660
ctgatcgatt tgctcagcca tcatcccgag caaaccgact ttggcaagga agtgattccc 720
gctgcagcca cccgctacaa cacccaagcc tttctgttca acgactactg ggaagacatc 780
ggcacgatcg cctcattcta cgaggccaat ctggcgctga ctcagcaacc tagcccaccc 840
ttcagcttct acgacgagca ggcgccgatt tacacccgcg ctcgctacct gccgccaacc 900
aagctgctcg attgccaggt gacccagtcg atcattggcg agggctgcat tctcaagcaa 960
tgcaccgttc agaattccgt cttagggatt cgctcccgca ttgaggccga ctgcgtgatc 1020
caggacgcct tgttgatggg cgctgacttc tacgaaacct cggagctacg gcaccagaat 1080
cgggccaatg gcaaagtgcc gatgggaatc ggcagtggca gcaccatccg tcgcgccatc 1140
gtcgacaaaa atgcccacat tggccagaac gttcagatcg tcaacaaaga ccatgtggaa 1200
gaggccgatc gcgaagatct gggctttatg atccgcagcg gcattgtcgt tgtggtcaaa 1260
ggggcggtta ttcccgacaa cacggtgatc taa 1293
<210> 22
<211> 430
<212> PRT
<213> Synechococcus elongatus
<400> 22
Met Lys Asn Val Leu Ala Ile Ile Leu Gly Gly Gly Ala Gly Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Gln Arg Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Ala
20 25 30
Gly Lys Tyr Arg Leu Ile Asp Ile Pro Val Ser Asn Cys Ile Asn Ala
35 40 45
Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Val Leu Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser Leu
50 55 60
Asn Arg His Leu Ser Gln Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Gly Phe Gly Asn
65 70 75 80
Gly Phe Val Glu Val Leu Ala Ala Gln Ile Thr Pro Glu Asn Pro Asn
85 90 95
Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp Ala Val Arg Gln Tyr Leu Trp Leu Ile
100 105 110
Lys Glu Trp Asp Val Asp Glu Tyr Leu Ile Leu Ser Gly Asp His Leu
115 120 125
Tyr Arg Met Asp Tyr Ser Gln Phe Ile Gln Arg His Arg Asp Thr Asn
130 135 140
Ala Asp Ile Thr Leu Ser Val Leu Pro Ile Asp Glu Lys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Asp Phe Gly Leu Met Lys Leu Asp Gly Ser Gly Arg Val Val Glu Phe
165 170 175
Ser Glu Lys Pro Lys Gly Asp Glu Leu Arg Ala Met Gln Val Asp Thr
180 185 190
Thr Ile Leu Gly Leu Asp Pro Val Ala Ala Ala Ala Gln Pro Phe Ile
195 200 205
Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Lys Arg Asp Val Leu Ile Asp Leu
210 215 220
Leu Ser His His Pro Glu Gln Thr Asp Phe Gly Lys Glu Val Ile Pro
225 230 235 240
Ala Ala Ala Thr Arg Tyr Asn Thr Gln Ala Phe Leu Phe Asn Asp Tyr
245 250 255
Trp Glu Asp Ile Gly Thr Ile Ala Ser Phe Tyr Glu Ala Asn Leu Ala
260 265 270
Leu Thr Gln Gln Pro Ser Pro Pro Phe Ser Phe Tyr Asp Glu Gln Ala
275 280 285
Pro Ile Tyr Thr Arg Ala Arg Tyr Leu Pro Pro Thr Lys Leu Leu Asp
290 295 300
Cys Gln Val Thr Gln Ser Ile Ile Gly Glu Gly Cys Ile Leu Lys Gln
305 310 315 320
Cys Thr Val Gln Asn Ser Val Leu Gly Ile Arg Ser Arg Ile Glu Ala
325 330 335
Asp Cys Val Ile Gln Asp Ala Leu Leu Met Gly Ala Asp Phe Tyr Glu
340 345 350
Thr Ser Glu Leu Arg His Gln Asn Arg Ala Asn Gly Lys Val Pro Met
355 360 365
Gly Ile Gly Ser Gly Ser Thr Ile Arg Arg Ala Ile Val Asp Lys Asn
370 375 380
Ala His Ile Gly Gln Asn Val Gln Ile Val Asn Lys Asp His Val Glu
385 390 395 400
Glu Ala Asp Arg Glu Asp Leu Gly Phe Met Ile Arg Ser Gly Ile Val
405 410 415
Val Val Val Lys Gly Ala Val Ile Pro Asp Asn Thr Val Ile
420 425 430
<210> 23
<211> 1248
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 23
atggcactga atattccatt cagaaatgcg tactatcgtt ttgcatccag ttactcattt 60
ctctttttta tttcctggtc gctgtggtgg tcgttatacg ctatttggct gaaaggacat 120
ctaggattaa cagggacgga attaggtaca ctttattcgg tcaaccagtt taccagcatt 180
ctatttatga tgttctacgg catcgttcag gataaactcg gtctgaagaa accgctcatc 240
tggtgtatga gtttcattct ggtcttgacc ggaccgttta tgatttacgt ttatgaaccg 300
ttactgcaaa gcaatttttc tgtaggtcta attctggggg cgctcttttt tggcctgggg 360
tatctggcgg gatgcggttt gcttgacagc ttcaccgaaa aaatggcgcg aaattttcat 420
ttcgaatatg gaacagcgcg cgcctgggga tcttttggct atgctattgg cgcgttcttt 480
gccggtatat tttttagtat cagtccccat atcaacttct ggttggtctc gctatttggc 540
gctgtattta tgatgatcaa catgcgtttt aaagataagg atcaccagtg catagcggcg 600
gatgcgggag gggtaaaaaa agaggatttt atcgcagttt tcaaggatcg aaacttctgg 660
gttttcgtca tatttattgt ggggacgtgg tctttctata acatttttga tcaacaactc 720
tttcctgtct tttatgcagg tttattcgaa tcacacgatg taggaacgcg cctgtatggt 780
tatctcaact cattccaggt ggtactcgaa gcgctgtgca tggcgattat tcctttcttt 840
gtgaatcggg tagggccaaa aaatgcatta cttatcggtg ttgtgattat ggcgttgcgt 900
atcctttcct gcgcgttgtt cgttaacccc tggattattt cattagtgaa gctgttacat 960
gccattgagg ttccactttg tgtcatatcc gtcttcaaat acagcgtggc aaactttgat 1020
aagcgcctgt cgtcgacgat ctttctgatt ggttttcaaa ttgccagttc gcttgggatt 1080
gtgctgcttt caacgccgac tgggatactc tttgaccacg caggctacca gacagttttc 1140
ttcgcaattt cgggtattgt ctgcctgatg ttgctatttg gcattttctt cctgagtaaa 1200
aaacgcgagc aaatagttat ggaaacgcct gtaccttcag caatatag 1248
<210> 24
<211> 250
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 24
Met Ala Leu Asn Ile Pro Phe Arg Asn Ala Tyr Tyr Arg Phe Ala Ser
1 5 10 15
Ser Tyr Ser Phe Leu Phe Phe Ile Ser Trp Ser Leu Trp Trp Ser Leu
20 25 30
Tyr Ala Ile Trp Leu Lys Gly His Leu Gly Leu Thr Gly Thr Glu Leu
35 40 45
Gly Thr Leu Tyr Ser Val Asn Gln Phe Thr Ser Ile Leu Phe Met Met
50 55 60
Phe Tyr Gly Ile Val Gln Asp Lys Leu Gly Leu Lys Lys Pro Leu Ile
65 70 75 80
Trp Cys Met Ser Phe Ile Leu Val Leu Thr Gly Pro Phe Met Ile Tyr
85 90 95
Val Tyr Glu Pro Leu Leu Gln Ser Asn Phe Ser Val Gly Leu Ile Leu
100 105 110
Gly Ala Leu Phe Phe Gly Leu Gly Tyr Leu Ala Gly Cys Gly Leu Leu
115 120 125
Asp Ser Phe Thr Glu Lys Met Ala Arg Asn Phe His Phe Glu Tyr Gly
130 135 140
Thr Ala Arg Ala Trp Gly Ser Phe Gly Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Ala Gly Ile Phe Phe Ser Ile Ser Pro His Ile Asn Phe Trp Leu Val
165 170 175
Ser Leu Phe Gly Ala Val Phe Met Met Ile Asn Met Arg Phe Lys Asp
180 185 190
Lys Asp His Gln Cys Ile Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val Lys Lys Glu
195 200 205
Asp Phe Ile Ala Val Phe Lys Asp Arg Asn Phe Trp Val Phe Val Ile
210 215 220
Phe Ile Val Gly Thr Trp Ser Phe Tyr Asn Ile Phe Asp Gln Gln Leu
225 230 235 240
Phe Pro Val Phe Tyr Ala Gly Leu Phe Glu
245 250
<210> 25
<211> 2133
<212> DNA
<213> Synechococcus sp.
<400> 25
atggtggcag ctcaaaatct ctacattctg cacattcaga cccatggtct gctgcgaggg 60
cagaacttgg aactggggcg agatgccgac accggcgggc agaccaagta cgtcttagaa 120
ctggctcaag cccaagctaa atccccacaa gtccaacaag tcgacatcat cacccgccaa 180
atcaccgacc cccgcgtcag tgttggttac agtcaggcga tcgaaccctt tgcgcccaaa 240
ggtcggattg tccgtttgcc ttttggcccc aaacgctacc tccgtaaaga gctgctttgg 300
ccccatctct acacctttgc ggatgcaatt ctccaatatc tggctcagca aaagcgcacc 360
ccgacttgga ttcaggccca ctatgctgat gctggccaag tgggatcact gctgagtcgc 420
tggttgaatg taccgctaat tttcacaggg cattctctgg ggcggatcaa gctaaaaaag 480
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gaagtggagg agcaataccg cgtttacgat cgctacaacc cagagcgcaa acttgtcatt 660
ccaccgggtg tcgataccga tcgcttcagg tttcagccct tgggcgatcg cggtgttgtt 720
ctccaacagg aactgagccg ctttctgcgc gacccagaaa aacctcaaat tctctgcctc 780
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tggctgcgca aaaaagccaa ccttgtctta gtactgggca gccgccaaga catcaaccag 900
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cgcctagcgg ctcattccgg cggggtattc gtcaatccgg cgctgaccga accttttggt 1080
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cgcaatggca ttgaaaaagt tcccgcccat tacagctggg atcaacatgt caataccctg 1320
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cgcaaacgct tgattgatgc caaacgcctt gtcgttagtg acatcgacaa cacactgttg 1440
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agctacgagc gcgtctattt tgctgagggc cactatgcta atggcattct ggaagcctta 2100
aaacactatc gcttttttga ggcgatcgct taa 2133
<210> 26
<211> 710
<212> PRT
<213> Synechococcus sp.
<400> 26
Met Val Ala Ala Gln Asn Leu Tyr Ile Leu His Ile Gln Thr His Gly
1 5 10 15
Leu Leu Arg Gly Gln Asn Leu Glu Leu Gly Arg Asp Ala Asp Thr Gly
20 25 30
Gly Gln Thr Lys Tyr Val Leu Glu Leu Ala Gln Ala Gln Ala Lys Ser
35 40 45
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50 55 60
Arg Val Ser Val Gly Tyr Ser Gln Ala Ile Glu Pro Phe Ala Pro Lys
65 70 75 80
Gly Arg Ile Val Arg Leu Pro Phe Gly Pro Lys Arg Tyr Leu Arg Lys
85 90 95
Glu Leu Leu Trp Pro His Leu Tyr Thr Phe Ala Asp Ala Ile Leu Gln
100 105 110
Tyr Leu Ala Gln Gln Lys Arg Thr Pro Thr Trp Ile Gln Ala His Tyr
115 120 125
Ala Asp Ala Gly Gln Val Gly Ser Leu Leu Ser Arg Trp Leu Asn Val
130 135 140
Pro Leu Ile Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Arg Ile Lys Leu Lys Lys
145 150 155 160
Leu Leu Glu Gln Asp Trp Pro Leu Glu Glu Ile Glu Ala Gln Phe Asn
165 170 175
Ile Gln Gln Arg Ile Asp Ala Glu Glu Met Thr Leu Thr His Ala Asp
180 185 190
Trp Ile Val Ala Ser Thr Gln Gln Glu Val Glu Glu Gln Tyr Arg Val
195 200 205
Tyr Asp Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Lys Leu Val Ile Pro Pro Gly Val
210 215 220
Asp Thr Asp Arg Phe Arg Phe Gln Pro Leu Gly Asp Arg Gly Val Val
225 230 235 240
Leu Gln Gln Glu Leu Ser Arg Phe Leu Arg Asp Pro Glu Lys Pro Gln
245 250 255
Ile Leu Cys Leu Cys Arg Pro Ala Pro Arg Lys Asn Val Pro Ala Leu
260 265 270
Val Arg Ala Phe Gly Glu His Pro Trp Leu Arg Lys Lys Ala Asn Leu
275 280 285
Val Leu Val Leu Gly Ser Arg Gln Asp Ile Asn Gln Met Asp Arg Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Val Phe Gln Glu Ile Phe His Leu Val Asp Arg Tyr Asp
305 310 315 320
Leu Tyr Gly Ser Val Ala Tyr Pro Lys Gln His Gln Ala Asp Asp Val
325 330 335
Pro Glu Phe Tyr Arg Leu Ala Ala His Ser Gly Gly Val Phe Val Asn
340 345 350
Pro Ala Leu Thr Glu Pro Phe Gly Leu Thr Ile Leu Glu Ala Gly Ser
355 360 365
Cys Gly Val Pro Val Val Ala Thr His Asp Gly Gly Pro Gln Glu Ile
370 375 380
Leu Lys His Cys Asp Phe Gly Thr Leu Val Asp Val Ser Arg Pro Ala
385 390 395 400
Asn Ile Ala Thr Ala Leu Ala Thr Leu Leu Ser Asp Arg Asp Leu Trp
405 410 415
Gln Cys Tyr His Arg Asn Gly Ile Glu Lys Val Pro Ala His Tyr Ser
420 425 430
Trp Asp Gln His Val Asn Thr Leu Phe Glu Arg Met Glu Thr Val Ala
435 440 445
Leu Pro Arg Arg Arg Ala Val Ser Phe Val Arg Ser Arg Lys Arg Leu
450 455 460
Ile Asp Ala Lys Arg Leu Val Val Ser Asp Ile Asp Asn Thr Leu Leu
465 470 475 480
Gly Asp Arg Gln Gly Leu Glu Asn Leu Met Thr Tyr Leu Asp Gln Tyr
485 490 495
Arg Asp His Phe Ala Phe Gly Ile Ala Thr Gly Arg Arg Leu Asp Ser
500 505 510
Ala Gln Glu Val Leu Lys Glu Trp Gly Val Pro Ser Pro Asn Phe Trp
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Val Thr Ser Val Gly Ser Glu Ile His Tyr Gly Thr Asp Ala Glu Pro
530 535 540
Asp Ile Ser Trp Glu Lys His Ile Asn Arg Asn Trp Asn Pro Gln Arg
545 550 555 560
Ile Arg Ala Val Met Ala Gln Leu Pro Phe Leu Glu Leu Gln Pro Glu
565 570 575
Glu Asp Gln Thr Pro Phe Lys Val Ser Phe Phe Val Arg Asp Arg His
580 585 590
Glu Thr Val Leu Arg Glu Val Arg Gln His Leu Arg Arg His Arg Leu
595 600 605
Arg Leu Lys Ser Ile Tyr Ser His Gln Glu Phe Leu Asp Ile Leu Pro
610 615 620
Leu Ala Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ile Arg His Leu Ser Leu Arg Trp
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Arg Ile Pro Leu Glu Asn Ile Leu Val Ala Gly Asp Ser Gly Asn Asp
645 650 655
Glu Glu Met Leu Lys Gly His Asn Leu Gly Val Val Val Gly Asn Tyr
660 665 670
Ser Pro Glu Leu Glu Pro Leu Arg Ser Tyr Glu Arg Val Tyr Phe Ala
675 680 685
Glu Gly His Tyr Ala Asn Gly Ile Leu Glu Ala Leu Lys His Tyr Arg
690 695 700
Phe Phe Glu Ala Ile Ala
705 710
<210> 27
<211> 735
<212> DNA
<213> Synechocystis sp.
<400> 27
atgcgacagt tattgctaat ttctgacctg gacaatacct gggtcggaga tcaacaagcc 60
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<210> 28
<211> 244
<212> PRT
<213> Synechocystis sp.
<400> 28
Met Arg Gln Leu Leu Leu Ile Ser Asp Leu Asp Asn Thr Trp Val Gly
1 5 10 15
Asp Gln Gln Ala Leu Glu His Leu Gln Glu Tyr Leu Gly Asp Arg Arg
20 25 30
Gly Asn Phe Tyr Leu Ala Tyr Ala Thr Gly Arg Ser Tyr His Ser Ala
35 40 45
Arg Glu Leu Gln Lys Gln Val Gly Leu Met Glu Pro Asp Tyr Trp Leu
50 55 60
Thr Ala Val Gly Ser Glu Ile Tyr His Pro Glu Gly Leu Asp Gln His
65 70 75 80
Trp Ala Asp Tyr Leu Ser Glu His Trp Gln Arg Asp Ile Leu Gln Ala
85 90 95
Ile Ala Asp Gly Phe Glu Ala Leu Lys Pro Gln Ser Pro Leu Glu Gln
100 105 110
Asn Pro Trp Lys Ile Ser Tyr His Leu Asp Pro Gln Ala Cys Pro Thr
115 120 125
Val Ile Asp Gln Leu Thr Glu Met Leu Lys Glu Thr Gly Ile Pro Val
130 135 140
Gln Val Ile Phe Ser Ser Gly Lys Asp Val Asp Leu Leu Pro Gln Arg
145 150 155 160
Ser Asn Lys Gly Asn Ala Thr Gln Tyr Leu Gln Gln His Leu Ala Met
165 170 175
Glu Pro Ser Gln Thr Leu Val Cys Gly Asp Ser Gly Asn Asp Ile Gly
180 185 190
Leu Phe Glu Thr Ser Ala Arg Gly Val Ile Val Arg Asn Ala Gln Pro
195 200 205
Glu Leu Leu His Trp Tyr Asp Gln Trp Gly Asp Ser Arg His Tyr Arg
210 215 220
Ala Gln Ser Ser His Ala Gly Ala Ile Leu Glu Ala Ile Ala His Phe
225 230 235 240
Asp Phe Leu Ser
<210> 29
<211> 2535
<212> DNA
<213> Synechococcus elongatus
<400> 29
atgagtgatt ccaccgccca actcagctac gaccccacca cgagctacct cgagcccagt 60
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attcctgccg tcggctatgg cattcgctat gagttcggta tcttccacca agaactccac 540
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gagcggcgcg aacaggccgt ggaaattaag ttgggcggcc acacggaggc ctaccacgat 660
gcgcgaggcc gctactgcgt ctcttggatc cccgatcgcg tcattcgcgc catcccctac 720
gacacccccg taccgggcta cgacaccaat aacgtcagca tgttgcggct ctggaaggct 780
gagggcacca cggaactcaa ccttgaggct ttcaactcag gcaactacga cgatgcggtt 840
gccgacaaaa tgtcgtcgga aacgatctcg aaggtgctct atcccaacga caacaccccc 900
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gtggcagccc tgcatacgca actgctcaag caagaaaccc tgcgagattt ctacgagctt 1440
tggcccgaga aattcttcaa catgaccaac ggtgtgacgc cccgccgctg gctgctgcaa 1500
agtaatcctc gcctagccaa cctgatcagc gatcgcattg gcaatgactg gattcatgat 1560
ctcaggcaac tgcgacggct ggaagacagc gtgaacgatc gcgagttttt acagcgctgg 1620
gcagaggtca agcaccaaaa taaggtcgat ctgagccgct acatctacca gcagactcgc 1680
atagaagtcg atccgcactc tctctttgat gtgcaagtca aacggattca cgaatacaaa 1740
cgccagctcc tcgctgtcat gcatatcgtg acgctctaca actggctgaa gcacaatccc 1800
cagctcaacc tggtgccgcg cacttttatc tttgcgggca aagcggcccc gggttactac 1860
cgtgccaagc aaatcgtcaa actgatcaat gcggtcggga gcatcatcaa ccatgatccc 1920
gatgtccaag ggcgactgaa ggtcgtcttc ctacctaact tcaacgtttc cttggggcag 1980
cgcatttatc cagctgccga tttgtcggag caaatctcaa ctgcagggaa agaagcgtcc 2040
ggcaccggca acatgaagtt caccatgaat ggcgcgctga caatcggaac ctacgatggt 2100
gccaacatcg agatccgcga ggaagtcggc cccgaaaact tcttcctgtt tggcctgcga 2160
gccgaagata tcgcccgacg ccaaagtcgg ggctatcgac ctgtggagtt ctggagcagc 2220
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cgcacgatcg ctgactacag cgaacagatc tgggaggtca aaccagtccc cgtcagccta 2520
agcactagct tttag 2535
<210> 30
<211> 844
<212> PRT
<213> Synechococcus elongatus
<400> 30
Met Ser Asp Ser Thr Ala Gln Leu Ser Tyr Asp Pro Thr Thr Ser Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Pro Ser Gly Leu Val Cys Glu Asp Glu Arg Thr Ser Val Thr
20 25 30
Pro Glu Thr Leu Lys Arg Ala Tyr Glu Ala His Leu Tyr Tyr Ser Gln
35 40 45
Gly Lys Thr Ser Ala Ile Ala Thr Leu Arg Asp His Tyr Met Ala Leu
50 55 60
Ala Tyr Met Val Arg Asp Arg Leu Leu Gln Arg Trp Leu Ala Ser Leu
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Gln Gln Gln His Val Lys Val Val Cys Tyr Leu Ser Ala
85 90 95
Glu Phe Leu Met Gly Arg His Leu Glu Asn Cys Leu Ile Asn Leu His
100 105 110
Leu His Asp Arg Val Gln Gln Val Leu Asp Glu Leu Gly Leu Asp Phe
115 120 125
Glu Gln Leu Leu Glu Lys Glu Glu Glu Pro Gly Leu Gly Asn Gly Gly
130 135 140
Leu Gly Arg Leu Ala Ala Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asp
145 150 155 160
Ile Pro Ala Val Gly Tyr Gly Ile Arg Tyr Glu Phe Gly Ile Phe His
165 170 175
Gln Glu Leu His Asn Gly Trp Gln Ile Glu Ile Pro Asp Asn Trp Leu
180 185 190
Arg Phe Gly Asn Pro Trp Glu Leu Glu Arg Arg Glu Gln Ala Val Glu
195 200 205
Ile Lys Leu Gly Gly His Thr Glu Ala Tyr His Asp Ala Arg Gly Arg
210 215 220
Tyr Cys Val Ser Trp Ile Pro Asp Arg Val Ile Arg Ala Ile Pro Tyr
225 230 235 240
Asp Thr Pro Val Pro Gly Tyr Asp Thr Asn Asn Val Ser Met Leu Arg
245 250 255
Leu Trp Lys Ala Glu Gly Thr Thr Glu Leu Asn Leu Glu Ala Phe Asn
260 265 270
Ser Gly Asn Tyr Asp Asp Ala Val Ala Asp Lys Met Ser Ser Glu Thr
275 280 285
Ile Ser Lys Val Leu Tyr Pro Asn Asp Asn Thr Pro Gln Gly Arg Glu
290 295 300
Leu Arg Leu Glu Gln Gln Tyr Phe Phe Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp
305 310 315 320
Ile Ile Arg Arg His Leu Met Asn His Gly His Leu Glu Arg Leu His
325 330 335
Glu Ala Ile Ala Val Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Ser Val Ala Val
340 345 350
Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Ile Asp Glu His His Leu Thr Trp Asp
355 360 365
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370 375 380
Leu Leu Pro Glu Ala Leu Glu Arg Trp Pro Val Gly Met Phe Gln Arg
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Arg Leu Ser Leu Ile Glu Glu Gly Ala Glu Pro Gln Val Arg Met Ala
435 440 445
His Leu Ala Cys Val Gly Ser His Ala Ile Asn Gly Val Ala Ala Leu
450 455 460
His Thr Gln Leu Leu Lys Gln Glu Thr Leu Arg Asp Phe Tyr Glu Leu
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595 600 605
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Ser Leu Gly Gln Arg Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Leu Ser Glu Gln Ile
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Ser Thr Ala Gly Lys Glu Ala Ser Gly Thr Gly Asn Met Lys Phe Thr
675 680 685
Met Asn Gly Ala Leu Thr Ile Gly Thr Tyr Asp Gly Ala Asn Ile Glu
690 695 700
Ile Arg Glu Glu Val Gly Pro Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Leu Arg
705 710 715 720
Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Gln Ser Arg Gly Tyr Arg Pro Val Glu
725 730 735
Phe Trp Ser Ser Asn Ala Glu Leu Arg Ala Val Leu Asp Arg Phe Ser
740 745 750
Ser Gly His Phe Thr Pro Asp Gln Pro Asn Leu Phe Gln Asp Leu Val
755 760 765
Ser Asp Leu Leu Gln Arg Asp Glu Tyr Met Leu Met Ala Asp Tyr Gln
770 775 780
Ser Tyr Ile Asp Cys Gln Arg Glu Ala Ala Ala Ala Tyr Arg Asp Ser
785 790 795 800
Asp Arg Trp Trp Arg Met Ser Leu Leu Asn Thr Ala Arg Ser Gly Lys
805 810 815
Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Ser Glu Gln Ile Trp Glu
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Val Lys Pro Val Pro Val Ser Leu Ser Thr Ser Phe
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<210> 31
<211> 909
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 31
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ttaattcaat acgtcgtgaa tgaatgtatt gcggctggca ttactgaaat tgtgctggtt 180
acacactcat ctaaaaactc tattgaaaac cactttgata ccagttttga actggaagca 240
atgctggaaa aacgtgtaaa acgtcaactg cttgatgaag tgcagtctat ttgtccaccg 300
cacgtgacta ttatgcaagt tcgtcagggt ctggcgaaag gcctgggaca cgcggtattg 360
tgtgctcacc cggtagtggg tgatgaaccg gtagctgtta ttttgcctga tgttattctg 420
gatgaatatg aatccgattt gtcacaggat aacctggcag agatgatccg ccgctttgat 480
gaaacgggtc atagccagat catggttgaa ccggttgctg atgtgaccgc atatggcgtt 540
gtggattgca aaggcgttga attagcgccg ggtgaaagcg taccgatggt tggtgtggta 600
gaaaaaccga aagcggatgt tgcgccgtct aatctcgcta ttgtgggtcg ttacgtactt 660
agcgcggata tttggccgtt gctggcaaaa acccctccgg gagctggtga tgaaattcag 720
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gggaagagcc atgactgcgg taataaatta ggttacatgc aggccttcgt tgaatacggt 840
attcgtcata acacccttgg cacggaattt aaagcctggc ttgaagaaga gatgggcatt 900
aagaagtaa 909
<210> 32
<211> 302
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 32
Met Ala Ala Ile Asn Thr Lys Val Lys Lys Ala Val Ile Pro Val Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly Thr Arg Met Leu Pro Ala Thr Lys Ala Ile Pro Lys Glu
20 25 30
Met Leu Pro Leu Val Asp Lys Pro Leu Ile Gln Tyr Val Val Asn Glu
35 40 45
Cys Ile Ala Ala Gly Ile Thr Glu Ile Val Leu Val Thr His Ser Ser
50 55 60
Lys Asn Ser Ile Glu Asn His Phe Asp Thr Ser Phe Glu Leu Glu Ala
65 70 75 80
Met Leu Glu Lys Arg Val Lys Arg Gln Leu Leu Asp Glu Val Gln Ser
85 90 95
Ile Cys Pro Pro His Val Thr Ile Met Gln Val Arg Gln Gly Leu Ala
100 105 110
Lys Gly Leu Gly His Ala Val Leu Cys Ala His Pro Val Val Gly Asp
115 120 125
Glu Pro Val Ala Val Ile Leu Pro Asp Val Ile Leu Asp Glu Tyr Glu
130 135 140
Ser Asp Leu Ser Gln Asp Asn Leu Ala Glu Met Ile Arg Arg Phe Asp
145 150 155 160
Glu Thr Gly His Ser Gln Ile Met Val Glu Pro Val Ala Asp Val Thr
165 170 175
Ala Tyr Gly Val Val Asp Cys Lys Gly Val Glu Leu Ala Pro Gly Glu
180 185 190
Ser Val Pro Met Val Gly Val Val Glu Lys Pro Lys Ala Asp Val Ala
195 200 205
Pro Ser Asn Leu Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ala Asp Ile
210 215 220
Trp Pro Leu Leu Ala Lys Thr Pro Pro Gly Ala Gly Asp Glu Ile Gln
225 230 235 240
Leu Thr Asp Ala Ile Asp Met Leu Ile Glu Lys Glu Thr Val Glu Ala
245 250 255
Tyr His Met Lys Gly Lys Ser His Asp Cys Gly Asn Lys Leu Gly Tyr
260 265 270
Met Gln Ala Phe Val Glu Tyr Gly Ile Arg His Asn Thr Leu Gly Thr
275 280 285
Glu Phe Lys Ala Trp Leu Glu Glu Glu Met Gly Ile Lys Lys
290 295 300
<210> 33
<211> 1470
<212> DNA
<213> Synechocystis sp.
<400> 33
atgaaatccc cccaggctca acaaatccta gaccaggccc gccgtttgct ctacgaaaaa 60
gccatggtca aaatcaatgg gcaatacgtg gggacggtgg cggccattcc ccaatcggat 120
caccatgatt tgaactatac ggaagttttc attcgggaca atgtgccggt gatgatcttc 180
ttgttactgc aaaatgaaac ggaaattgtc caaaactttt tggaaatttg cctcaccctc 240
caaagtaagg gctttcccac ctacggcatt tttcccacta gttttgtgga aacggaaaac 300
catgaactca aggcagacta tggccaacgg gcgatcggtc gagtttgctc ggtggatgcg 360
tccctctggt ggcctatttt ggcctattac tacgtgcaaa gaaccggcaa tgaagcctgg 420
gctagacaaa cccatgtgca attggggcta caaaagtttt taaacctcat tctccatcca 480
gtctttcggg atgcacccac tttgtttgtg cccgacgggg cctttatgat tgaccgcccc 540
atggatgtgt ggggagcgcc gttggaaatc caaaccctgc tctacggagc cctgaaaagt 600
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ccttttgaca gcttcacgat ggagcagagt catcaattta acctgagtgt ggattggctc 720
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acagaaacca ttcccaactg gctccaggat tggctcggcg atcggggagg ctatttaatc 900
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<210> 34
<211> 489
<212> PRT
<213> Synechocystis sp.
<400> 34
Met Lys Ser Pro Gln Ala Gln Gln Ile Leu Asp Gln Ala Arg Arg Leu
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Val Phe Arg Asp Ala Pro Thr Leu Phe Val Pro Asp Gly Ala Phe Met
165 170 175
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180 185 190
Leu Leu Tyr Gly Ala Leu Lys Ser Ala Ala Gly Leu Leu Leu Ile Asp
195 200 205
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210 215 220
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Lys Lys Leu Arg Thr Tyr Leu Leu Lys His Tyr Trp Ile Asn Cys Asn
245 250 255
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Leu Val Leu Asn Asn Gln Arg Glu Leu Cys Ala Gln Met Pro Leu Arg
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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<211> 1500
<212> DNA
<213> Synechocystis sp.
<400> 35
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<210> 36
<211> 499
<212> PRT
<213> Synechocystis sp.
<400> 36
Met Asn Ser Ser Leu Val Ile Leu Tyr His Arg Glu Pro Tyr Asp Glu
1 5 10 15
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100 105 110
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Val His Asp Tyr Asn Leu Trp Leu Ala Pro Leu Tyr Ile Arg Gln Leu
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Val Asp Ile Phe Asn Ile Leu Pro Trp Arg Glu Ala Ile Val Glu Ser
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Leu Leu Ala Cys Asp Leu Cys Gly Phe His Ile Pro Arg Tyr Val Glu
195 200 205
Asn Phe Val Ala Val Ala Arg Ser Leu Lys Pro Val Glu Ile Thr Arg
210 215 220
Arg Val Val Val Asp Gln Ala Phe Thr Pro Tyr Gly Thr Ala Leu Ala
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Glu Pro Glu Leu Thr Thr Gln Leu Arg Tyr Gly Asp Arg Leu Ile Asn
245 250 255
Leu Asp Ala Phe Pro Val Gly Thr Asn Pro Ala Asn Ile Arg Ala Ile
260 265 270
Val Ala Lys Glu Ser Val Gln Gln Lys Val Ala Glu Ile Lys Gln Asp
275 280 285
Leu Gly Gly Lys Arg Leu Ile Val Ser Ala Gly Arg Val Asp Tyr Val
290 295 300
Lys Gly Thr Lys Glu Met Leu Met Cys Tyr Glu Arg Leu Leu Glu Arg
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325 330 335
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Arg Leu Ala Gly Lys Ile Asn Gly Arg Phe Ala Lys Leu Ser Trp Thr
355 360 365
Pro Val Met Leu Phe Thr Ser Pro Leu Ala Tyr Glu Glu Leu Ile Ala
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Leu Phe Cys Ala Ala Asp Ile Ala Trp Ile Thr Pro Leu Arg Asp Gly
385 390 395 400
Leu Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Val Ala Lys Asn Gly Glu Glu
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420 425 430
Asp Ala Val Leu Thr Asn Pro Tyr Ala Ser Ser Arg Met Asp Glu Ser
435 440 445
Ile Asp Gln Ala Leu Ala Met Asp Lys Asp Glu Gln Lys Lys Arg Met
450 455 460
Gly Arg Met Tyr Ala Ala Ile Lys Arg Tyr Asp Val Gln Gln Trp Ala
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Asn His Leu Leu Arg Glu Ala Tyr Ala Asp Val Val Leu Gly Glu Pro
485 490 495
Pro Gln Met
<210> 37
<211> 1434
<212> DNA
<213> Synechocystis sp.
<400> 37
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<210> 38
<211> 477
<212> PRT
<213> Synechocystis sp.
<400> 38
Met Lys Ile Leu Phe Val Ala Ala Glu Val Ser Pro Leu Ala Lys Val
1 5 10 15
Gly Gly Met Gly Asp Val Val Gly Ser Leu Pro Lys Val Leu His Gln
20 25 30
Leu Gly His Asp Val Arg Val Phe Met Pro Tyr Tyr Gly Phe Ile Gly
35 40 45
Asp Lys Ile Asp Val Pro Lys Glu Pro Val Trp Lys Gly Glu Ala Met
50 55 60
Phe Gln Gln Phe Ala Val Tyr Gln Ser Tyr Leu Pro Asp Thr Lys Ile
65 70 75 80
Pro Leu Tyr Leu Phe Gly His Pro Ala Phe Asp Ser Arg Arg Ile Tyr
85 90 95
Gly Gly Asp Asp Glu Ala Trp Arg Phe Thr Phe Phe Ser Asn Gly Ala
100 105 110
Ala Glu Phe Ala Trp Asn His Trp Lys Pro Glu Ile Ile His Cys His
115 120 125
Asp Trp His Thr Gly Met Ile Pro Val Trp Met His Gln Ser Pro Asp
130 135 140
Ile Ala Thr Val Phe Thr Ile His Asn Leu Ala Tyr Gln Gly Pro Trp
145 150 155 160
Arg Gly Leu Leu Glu Thr Met Thr Trp Cys Pro Trp Tyr Met Gln Gly
165 170 175
Asp Asn Val Met Ala Ala Ala Ile Gln Phe Ala Asn Arg Val Thr Thr
180 185 190
Val Ser Pro Thr Tyr Ala Gln Gln Ile Gln Thr Pro Ala Tyr Gly Glu
195 200 205
Lys Leu Glu Gly Leu Leu Ser Tyr Leu Ser Gly Asn Leu Val Gly Ile
210 215 220
Leu Asn Gly Ile Asp Thr Glu Ile Tyr Asn Pro Ala Glu Asp Arg Phe
225 230 235 240
Ile Ser Asn Val Phe Asp Ala Asp Ser Leu Asp Lys Arg Val Lys Asn
245 250 255
Lys Ile Ala Ile Gln Glu Glu Thr Gly Leu Glu Ile Asn Arg Asn Ala
260 265 270
Met Val Val Gly Ile Val Ala Arg Leu Val Glu Gln Lys Gly Ile Asp
275 280 285
Leu Val Ile Gln Ile Leu Asp Arg Phe Met Ser Tyr Thr Asp Ser Gln
290 295 300
Leu Ile Ile Leu Gly Thr Gly Asp Arg His Tyr Glu Thr Gln Leu Trp
305 310 315 320
Gln Met Ala Ser Arg Phe Pro Gly Arg Met Ala Val Gln Leu Leu His
325 330 335
Asn Asp Ala Leu Ser Arg Arg Val Tyr Ala Gly Ala Asp Val Phe Leu
340 345 350
Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ser Gln Leu Met Ala Met
355 360 365
Arg Tyr Gly Cys Ile Pro Ile Val Arg Arg Thr Gly Gly Leu Val Asp
370 375 380
Thr Val Ser Phe Tyr Asp Pro Ile Asn Glu Ala Gly Thr Gly Tyr Cys
385 390 395 400
Phe Asp Arg Tyr Glu Pro Leu Asp Cys Phe Thr Ala Met Val Arg Ala
405 410 415
Trp Glu Gly Phe Arg Phe Lys Ala Asp Trp Gln Lys Leu Gln Gln Arg
420 425 430
Ala Met Arg Ala Asp Phe Ser Trp Tyr Arg Ser Ala Gly Glu Tyr Ile
435 440 445
Lys Val Tyr Lys Gly Val Val Gly Lys Pro Glu Glu Leu Ser Pro Met
450 455 460
Glu Glu Glu Lys Ile Ala Glu Leu Thr Ala Ser Tyr Arg
465 470 475
<210> 39
<211> 5386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 39
tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc 60
gtaggacagg tggtacctac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 120
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 180
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 240
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 300
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 360
ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 420
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 480
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 540
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 600
ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 660
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 720
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 780
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 840
gagattatca aaaaggatct tcacctgcta gcgaagatcc tttgatcttt tctacggggt 900
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaac aataaaactg 960
tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtct 1020
tgctctaggc cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct 1080
cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg 1140
ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg 1200
gtcagactaa actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt 1260
actcctgatg atgcatggtt actcaccact gcgatccccg ggaaaacagc attccaggta 1320
ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc 1380
cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc 1440
gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag 1500
cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca 1560
ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg 1620
aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt 1680
gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa 1740
aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag 1800
tttttctaag aattaattca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 1860
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa acgttaatat 1920
tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga 1980
aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc 2040
agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac 2100
cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc 2160
gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg 2220
gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag 2280
ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc 2340
gccgctacag ggcgcgtccc attcgccaat ccggatatag ttcctccttt cagcaaaaaa 2400
cccctcaaga cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca 2460
gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatctcagtg gtggtggtgg 2520
tggtgctcga gtgcggccgc aagctttcat taatgatgat ggtggtggtg gctgccggtc 2580
gcacgggtgt cgctgtattt cttcaggtct tccaggtgcg ccagacggtt ttctttgtta 2640
atacgttggg tggtgatacg atccggatag caacgcataa acatgttggt gaagtgctcg 2700
ccgtagtgga tacgttcgtt cgcgctcggc tcgaacagcg gatacgcgct cgcttcgaag 2760
ttcggctcgt gaaagtacgc gcacgcgaaa cgttcacggg tgttcagttt aaccttgtgc 2820
ggggtgctca gcagttggcc accggtcatg aactgcagaa tatcgcccgg aaaaacggtc 2880
cacacacccg gggtcggggt aacgaaggtc cacggttcgt cgtgctcaaa catgcccgcg 2940
ctgctctcgc ccggcagcca gttacggtta cgcttttcgc cctccaccgg cggacggata 3000
tacaggccac caacatcgtc ttgcgccgca atcaccagca gaccgtagtc ggtgtgcgca 3060
ccaataccac ggctcagggt gctggtctgc ggcgggaaac gcagcacacg catgtggtgc 3120
cagccatcac gggtcaggtc ggtgaaggtg ttgatcggca gttcaaaacc cagcgcggtc 3180
agtttcagca gacgctcgcc cgccagaccc agttcctcca taaaggtttt catgctcttt 3240
tgataggtgt tgttcggcca cggaaccgga ccatggcacg gccaacccgc tttaacacgc 3300
tgatcgccca cgctcaggtc cttgcacacg gtaaaaattt ccgggaaatc cggcttgccc 3360
gcggtaactt cctcgccgct cgccacataa ccgctgtagg tcaggtcgct aacgcagctg 3420
cttttgaagg tcagcggctc tttgcaaaat tgcttgctcg ccgccatcgc ttcttgggtc 3480
ttacgatcct gctcgctgtc ggttttaatc tggaagatac catccttttg ccacgcctga 3540
atcagcgcac gacccaggct gatgtccgcc gcgcaaccgg tcacttcggt cggcagttca 3600
aaggtctgca ggttggtcat gctggtttcc tctttgtcca tgtacaggct cggatgctca 3660
ttccacacaa cgtccgggct gcataaccct agtgagggaa atactcccca tctacttgga 3720
gcgtgtatca tatgtatatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttct agaggggaat 3780
tgttatccgc tcacaattcc cctatagtga gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatcga 3840
tctcgatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 3900
ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 3960
tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg 4020
ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac 4080
tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc 4140
gaatggcgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg 4200
gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat 4260
cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa 4320
gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg 4380
ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg 4440
caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg 4500
atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa 4560
cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa 4620
gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac 4680
agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg 4740
ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt 4800
ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa 4860
ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc 4920
gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt 4980
accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggac atctcggtag tgggatacga cgataccgaa 5040
gacagctcat gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg 5100
caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag 5160
ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc 5220
tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 5280
agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc 5340
tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccgg 5386
<210> 40
<211> 3063
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 40
atttagcgtc ttctaatcca gtgtagacag tagttttggc tccgttgagc actgtagcct 60
tgggcgatcg ctctaaacat tacataaatt cacaaagttt tcgttacata aaaatagtgt 120
ctacttagct aaaaattaag ggttttttac acctttttga cagttaatct cctagcctaa 180
aaagcaagag tttttaacta agactcttgc cctttacaac ctcgaaggag cgtcagatct 240
catatgcacc accaccatca ccacgaaaac ctgtactttc agggcaagct tatgattcat 300
gccccctccc gctggggcgt gtttcccagt ctgggtctct gctcccccga tgtggtgtgg 360
aacgaacacc ccagcctgta catggataag gaagagacca gtatgaccaa tctgcaaacc 420
tttgaactgc ccaccgaggt gaccggttgc gccgccgata ttagcctcgg tcgcgccctg 480
attcaagcct ggcaaaagga tggcatcttc caaatcaaga ccgattccga acaagatcgc 540
aagacccaag aggccatggc cgccagcaaa caattttgca aggaacccct gacctttaaa 600
tccagctgcg tgagcgatct cacctacagt ggctatgtgg ccagtggtga agaggtgacc 660
gccggcaagc ccgattttcc cgagattttt accgtgtgca aggatctgag tgtgggtgat 720
caacgcgtga aagccggttg gccctgccat ggtcccgtgc cctggcccaa caatacctat 780
caaaaatcca tgaagacctt tatggaagaa ctcggtctgg ccggtgaacg cctgctcaaa 840
ctgaccgccc tcggctttga gctgcccatt aacaccttta ccgatctcac ccgcgatggt 900
tggcaccaca tgcgcgtgct gcgctttcct ccccaaacca gcaccctgag ccgcggtatt 960
ggtgcccaca ccgattacgg cctgctcgtg attgccgccc aagatgatgt gggcggtctg 1020
tatattcgcc ctcccgtgga aggcgagaaa cgcaaccgca attggctccc cggcgaaagt 1080
tccgccggca tgtttgaaca cgatgaaccc tggacctttg tgacgcccac gcccggcgtg 1140
tggaccgtgt ttcccggtga tattctgcaa tttatgaccg gcggtcaact gctctccacg 1200
ccccacaaag tgaagctcaa cacccgcgaa cgctttgcct gcgcctactt tcacgaaccc 1260
aattttgagg ccagtgccta tcccctgttt gaaccctccg ccaacgagcg cattcactac 1320
ggcgagcact ttaccaatat gtttatgcgc tgctatcccg atcgcattac cacccaacgc 1380
attaacaagg aaaatcgcct ggcccacctc gaggatctga aaaagtatag tgatacccgc 1440
gccaccggta gtggtgccac caactttagc ctgctcaaac aagccggcga tgtggaagag 1500
aaccccggtc ccatgaccga aagtattacc agcaatggca ccctggtggc cagtgatacc 1560
cgtcgccgcg tgtgggccat tgtgagtgcc agcagtggta acctggtgga gtggtttgat 1620
ttttacgtgt atagcttttg cagtctctac tttgcccaca ttttctttcc cagtggcaat 1680
accaccaccc aactgctgca aaccgccggc gtgtttgccg ccggttttct gatgcgcccc 1740
attggcggtt ggctctttgg ccgcattgcc gatcgtcgcg gtcgcaagac cagcatgctg 1800
attagcgtgt gcatgatgtg ctttggctcc ctgattattg cctgcctccc cggctatgat 1860
gccattggca cctgggcccc cgccctgctc ctgctggccc gcctctttca aggcctgagc 1920
gtgggcggtg aatacggcac cagcgccacc tatatgagtg aaattgccct ggagggccgc 1980
aaaggttttt acgccagttt tcaatatgtg accctgattg gcggtcaact gctcgccatt 2040
ctcgtggtgg tgattctcca acaaattctg accgattccc aactgcacga atggggctgg 2100
cgcattccct ttgccatggg tgccgccctg gccattgtgg ccctgtggct ccgtcgccaa 2160
ctcgatgaaa ccagccaaaa agaggtgcgc gccctgaaag aagccggcag ttttaaaggt 2220
ctctggcgca accgcaaggc ctttctcatg gtgctgggct ttaccgccgg cggtagtctg 2280
tccttttaca cctttaccac ctacatgcaa aaatatctcg tgaacaccac cggcatgcac 2340
gccaatgtgg ccagcgtgat tatgaccgcc gccctgtttg tgtttatgct cattcaaccc 2400
ctgattggcg ccctcagcga taagattggt cgtcgcacca gtatgctgat ttttggcggt 2460
atgagtgccc tctgcaccgt gcccattctc accgccctgc aacacgtgtc cagcccctac 2520
gccgcctttg ccctcgtgat gctggccatg gtgattgtgt ccttttatac cagcattagt 2580
ggcattctga aggccgaaat gtttcccgcc caagtgcgcg ccctgggcgt gggtctcagt 2640
tacgccgtgg ccaatgccct gtttggcggt tccgccgaat atgtggccct gtccctcaaa 2700
agctggggca gtgagaccac ctttttctgg tacgtgacca ttatgggtgc cctggccttt 2760
attgtgagcc tgatgctcca ccgcaaaggc aagggtattc gcctctaggg taccaggcaa 2820
acccatcccc aaccccctgc tgggcctgga tagcaccggt ggtggtcacc accaccatca 2880
ccactagagt actgtatgca tcgagtgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac 2940
cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat 3000
gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 3060
ctt 3063
<210> 41
<211> 223
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
psbA promoter sequence
<400> 41
atttagcgtc ttctaatcca gtgtagacag tagttttggc tccgttgagc actgtagcct 60
tgggcgatcg ctctaaacat tacataaatt cacaaagttt tcgttacata aaaatagtgt 120
ctacttagct aaaaattaag ggttttttac acctttttga cagttaatct cctagcctaa 180
aaagcaagag tttttaacta agactcttgc cctttacaac ctc 223
<210> 42
<211> 158
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
rrnB terminator sequence
<400> 42
tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 60
gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 120
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctt 158
<210> 43
<211> 1578
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 43
gaggttgtaa agggcaagag tcttagttaa aaactcttgc tttttaggct aggagattaa 60
ctgtcaaaaa ggtgtaaaaa acccttaatt tttagctaag tagacactat ttttatgtaa 120
cgaaaacttt gtgaatttat gtaatgttta gagcgatcgc ccaaggctac agtgctcaac 180
ggagccaaaa ctactgtcta cactggatta gaagacgcta aatggtacct acgatctcat 240
atgatacacg ctccaagtag atggggagta tttccctcac tagggttatg cagcccggac 300
gttgtgtgga atgagcatcc gagcctgtac atggacaaag aggaaaccag catgaccaac 360
ctgcagacct ttgaactgcc gaccgaagtg accggttgcg cggcggacat cagcctgggt 420
cgtgcgctga ttcaggcgtg gcaaaaggat ggtatcttcc agattaaaac cgacagcgag 480
caggatcgta agacccaaga agcgatggcg gcgagcaagc aattttgcaa agagccgctg 540
accttcaaaa gcagctgcgt tagcgacctg acctacagcg gttatgtggc gagcggcgag 600
gaagttaccg cgggcaagcc ggatttcccg gaaattttta ccgtgtgcaa ggacctgagc 660
gtgggcgatc agcgtgttaa agcgggttgg ccgtgccatg gtccggttcc gtggccgaac 720
aacacctatc aaaagagcat gaaaaccttt atggaggaac tgggtctggc gggcgagcgt 780
ctgctgaaac tgaccgcgct gggttttgaa ctgccgatca acaccttcac cgacctgacc 840
cgtgatggct ggcaccacat gcgtgtgctg cgtttcccgc cgcagaccag caccctgagc 900
cgtggtattg gtgcgcacac cgactacggt ctgctggtga ttgcggcgca agacgatgtt 960
ggtggcctgt atatccgtcc gccggtggag ggcgaaaagc gtaaccgtaa ctggctgccg 1020
ggcgagagca gcgcgggcat gtttgagcac gacgaaccgt ggaccttcgt taccccgacc 1080
ccgggtgtgt ggaccgtttt tccgggcgat attctgcagt tcatgaccgg tggccaactg 1140
ctgagcaccc cgcacaaggt taaactgaac acccgtgaac gtttcgcgtg cgcgtacttt 1200
cacgagccga acttcgaagc gagcgcgtat ccgctgttcg agccgagcgc gaacgaacgt 1260
atccactacg gcgagcactt caccaacatg tttatgcgtt gctatccgga tcgtatcacc 1320
acccaacgta ttaacaaaga aaaccgtctg gcgcacctgg aagacctgaa gaaatacagc 1380
gacacccgtg cgaccggcag ccaccaccac catcatcatt aatgaaagct tgcggccgca 1440
ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 1500
gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 1560
gtcttgaggg gttttttg 1578
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
T7 terminator sequence
<400> 44
caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctag 48
<210> 45
<211> 3943
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 45
gagcgtgtat catatgagat ctgacgctcc ttcgaggttg taaagggcaa gagtcttagt 60
taaaaactct tgctttttag gctaggagat taactgtcaa aaaggtgtaa aaaaccctta 120
atttttagct aagtagacac tatttttatg taacgaaaac tttgtgaatt tatgtaatgt 180
ttagagcgat cgcccaaggc tacagtgctc aacggagcca aaactactgt ctacactgga 240
ttagaagacg ctaaatggta cctacgatct catatgatac acgctccaag tagatgggga 300
gtatttccct cactagggtt atgcagcccg gacgttgtgt ggaatgagca tccgagcctg 360
tacatggaca aagaggaaac cagcatgacc aacctgcaga cctttgaact gccgaccgaa 420
gtgaccggtt gcgcggcgga catcagcctg ggtcgtgcgc tgattcaggc gtggcaaaag 480
gatggtatct tccagattaa aaccgacagc gagcaggatc gtaagaccca agaagcgatg 540
gcggcgagca agcaattttg caaagagccg ctgaccttca aaagcagctg cgttagcgac 600
ctgacctaca gcggttatgt ggcgagcggc gaggaagtta ccgcgggcaa gccggatttc 660
ccggaaattt ttaccgtgtg caaggacctg agcgtgggcg atcagcgtgt taaagcgggt 720
tggccgtgcc atggtccggt tccgtggccg aacaacacct atcaaaagag catgaaaacc 780
tttatggagg aactgggtct ggcgggcgag cgtctgctga aactgaccgc gctgggtttt 840
gaactgccga tcaacacctt caccgacctg acccgtgatg gctggcacca catgcgtgtg 900
ctgcgtttcc cgccgcagac cagcaccctg agccgtggta ttggtgcgca caccgactac 960
ggtctgctgg tgattgcggc gcaagacgat gttggtggcc tgtatatccg tccgccggtg 1020
gagggcgaaa agcgtaaccg taactggctg ccgggcgaga gcagcgcggg catgtttgag 1080
cacgacgaac cgtggacctt cgttaccccg accccgggtg tgtggaccgt ttttccgggc 1140
gatattctgc agttcatgac cggtggccaa ctgctgagca ccccgcacaa ggttaaactg 1200
aacacccgtg aacgtttcgc gtgcgcgtac tttcacgagc cgaacttcga agcgagcgcg 1260
tatccgctgt tcgagccgag cgcgaacgaa cgtatccact acggcgagca cttcaccaac 1320
atgtttatgc gttgctatcc ggatcgtatc accacccaac gtattaacaa agaaaaccgt 1380
ctggcgcacc tggaagacct gaagaaatac agcgacaccc gtgcgaccgg cagccaccac 1440
caccatcatc attaatgaaa gcttgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga 1500
gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa 1560
taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga 1620
ggaactatat ccggattggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 1680
gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 1740
tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 1800
gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 1860
attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 1920
cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 1980
ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 2040
aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa 2100
tttcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 2160
tacattcaaa tatgtatccg ctcatgaatt aattcttaga aaaactcatc gagcatcaaa 2220
tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc 2280
tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 2340
tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata 2400
aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt 2460
ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca 2520
ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga 2580
tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc 2640
agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt 2700
ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg 2760
atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca 2820
tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca 2880
tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca 2940
tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctag agcaagacgt ttcccgttga 3000
atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat 3060
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 3120
caaaggatct tcgctagcag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 3180
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 3240
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 3300
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 3360
gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 3420
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 3480
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 3540
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 3600
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 3660
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 3720
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 3780
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 3840
cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 3900
tatcccctga ttctgtggat aaccgtaggt accatttagc gtc 3943
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 46
His His His His His His
1 5
Claims (33)
- 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물로서, 재조합 미생물이 비-천연의 에틸렌 형성 효소(EFE) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 EFE 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양이 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물. - 제1항에 있어서, 재조합 미생물이 비-천연의 알파-케토글루타레이트 퍼미아제(AKGP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 AKGP 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 AKGP 단백질의 양이 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물. - 제1항에 있어서, 재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양이 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 약 5% 내지 약 200% 또는 그 이상 더 많은, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 재조합 미생물이 시아노박테리아(Cyanobacteria), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus), 시네코코커스 레오폴리엔시스(Synechococcus leopoliensis), 시네코시스티스(Synechocystis), 아나베나(Anabaena), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 클라미도모나스 레인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii), 에세리키아(Escherichia), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 지오박테리아(Geobacteria), 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물을 포함하는, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 세균 벡터 플라스미드, 높은 카피 수의 세균 벡터 플라스미드, 유도성 프로모터를 갖는 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입되는, 재조합 미생물.
- 제2항에 있어서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 세균 벡터 플라스미드, 높은 카피 수의 세균 벡터 플라스미드, 유도성 프로모터를 갖는 세균 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합 내로 삽입되는, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 클라미도모나스 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입되는, 재조합 미생물.
- 제2항에 있어서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 에세리키아 종 세균의 벡터 플라스미드 내로 삽입되는, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현하며, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입되는, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 조합된 아미노산 서열을 발현하며, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 및 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 시네코코커스 종 세균의 세균 플라스미드 내로 삽입되는, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 재조합 미생물이 비-천연의 포스포에놀피루베이트 신타아제(PEP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 15와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 PEP 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 PEP 단백질의 양이 비-천연의 PEP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 AKG의 양이 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물. - 제11항에 있어서, 재조합 미생물이 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 17과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 시트레이트 신타아제 단백질을 발현하고, 재조합 미생물에 의해 생산되는 시트레이트 신타아제 단백질의 양이 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 재조합 미생물이 비-천연의 이소시트레이트 데하이드로게나아제(IDH) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 20과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 IDH 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 IDH 단백질의 양이 비-천연의 IDH 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 AKG의 양이 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물. - 제13항에 있어서, 재조합 미생물이 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 발현 뉴클레오타이드 서열에서 결실을 함유하고, 재조합 미생물에 의해 생산되는 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 단백질의 양이 상기 결실을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 적은, 재조합 미생물.
- 제11항에 있어서, 재조합 미생물이 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물을 포함하는, 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 재조합 미생물이 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 24와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 수크로오스 퍼미아제 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 수크로오스 퍼미아제 단백질의 양이 비-천연의 수크로오스 퍼미아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물. - 제1항에 있어서, 재조합 미생물이 서열 번호 26과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로오스 포스페이트 신타아제 단백질, 서열 번호 28과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로오스-6-포스파타아제 단백질, 서열 번호 30과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 글리코겐 포스포릴라아제 단백질, 및 서열 번호 32와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 UTP-글루코오스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라아제 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을, 상기 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 비-천연의 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 적어도 하나의 단백질의 양이 상기 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 비-천연의 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 수크로오스의 양이 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물. - 제17항에 있어서, 재조합 미생물이 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열에서 적어도 하나의 결실을 함유하고, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 34와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인버타아제 단백질, 서열 번호 36과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 글루코실글리세롤-포스페이트 신타아제 단백질, 및 서열 번호 38과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 글리코겐 신타아제 단백질로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 코딩하고, 재조합 미생물에 의해 생산되는 상기 적어도 하나의 단백질의 양이 상기 적어도 하나의 결실을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 적은, 재조합 미생물.
- 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제조하는 방법으로서,
비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열, 또는 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 미생물의 세균 플라스미드 내로 삽입하여 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하고,
비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는
조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현하거나; 또는
조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제조하는 방법. - 제19항에 있어서, 미생물이 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제19항에 있어서, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 미생물이 클라미도모나스 종 세균이거나; 또는
비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 미생물이 에세리키아 종 세균이거나; 또는
조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현하고, 미생물이 시네코코커스 종 세균이거나; 또는
조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 미생물이 시네코코커스 종 세균인, 방법. - 에틸렌을 생산하는 방법으로서,
개선된 에틸렌 생산 능력을 갖는 재조합 미생물을 제공하는 단계로서, 재조합 미생물이 비-천연의 에틸렌 형성 효소(EFE) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 EFE 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 EFE 단백질의 양이 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은 것인 단계;
생물 반응기 배양 용기에서 에틸렌을 생산하기에 충분한 조건하에 생물 반응기 배양 용기에서 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
생물 반응기 배양 용기로부터 에틸렌을 수확하는 단계
를 포함하는, 에틸렌을 생산하는 방법. - 제22항에 있어서, 재조합 미생물이, 미생물의 세균 플라스미드 내로 삽입된, 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는
조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 7과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖거나; 또는
조합된 비-천연의 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열과 비-천연의 AKGP 발현 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 발현하는, 방법. - 제22항에 있어서, 미생물이 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제22항에 있어서, 생물 반응기 배양 용기 내에 위치한 재조합 미생물을 함유하는 배양물에 적어도 하나의 활성화제를 첨가하여 에틸렌 생산량을 증가시키는 단계; 또는 생물 반응기 배양 용기 내에 함유된 배양 분위기에 CO2를 약 100 ml/분 내지 약 500 ml/분의 속도로 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제22항에 있어서, 생물 반응기 배양 용기 내에 위치한 재조합 미생물을 함유하는 세포 배양물로부터 적어도 하나의 분자 스위치를 제거하여 에틸렌 생산량을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제22항에 있어서, 재조합 미생물을 배양할 때 적어도 하나의 영양소의 농도 또는 적어도 하나의 자극의 양을 증가 또는 감소시켜 미생물 배양물로부터 생산되는 에틸렌의 양을 제어하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제22항에 있어서, 적어도 하나의 영양소의 농도 및 적어도 하나의 자극의 양이 미생물 배양물에서 약 0.5~1.5 그램/리터 내지 약 0.1 mM의 비율인, 방법.
- 제22항에 있어서, 에틸렌을 기체 상태에서 액체 상태로 응축시켜 미생물 배양물로부터 생산되는 에틸렌의 양을 제거하는 단계를 추가로 포함하거나, 회수된 에틸렌의 양이 약 0.5 ml 내지 약 10 ml/리터/h인, 방법.
- 개선된 알파-케토글루타레이트(AKG) 생산 능력을 갖는 재조합 미생물로서,
재조합 미생물이 비-천연의 포스포에놀피루베이트 신타아제(PEP) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 15와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 PEP 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 PEP 단백질의 양이 비-천연의 PEP 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많거나; 또는
재조합 미생물이 비-천연의 이소시트레이트 데하이드로게나아제(IDH) 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 20과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 IDH 단백질을 발현하고,
재조합 미생물에 의해 생산되는 IDH 단백질의 양이 비-천연의 IDH 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많고;
재조합 미생물에 의해 생산되는 AKG의 양이 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 개선된 AKG 생산 능력을 갖는 재조합 미생물. - 제30항에 있어서, 재조합 미생물이 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 서열 번호 17과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 시트레이트 신타아제 단백질을 발현하고, 재조합 미생물에 의해 생산되는 시트레이트 신타아제 단백질의 양이 비-천연의 시트레이트 신타아제 발현 뉴클레오타이드 서열을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 많은, 재조합 미생물.
- 제30항에 있어서, 재조합 미생물이 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 발현 뉴클레오타이드 서열에서 결실을 포함하고, 재조합 미생물에 의해 생산되는 글루코오스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라아제 단백질의 양이 상기 결실을 결여한 대조군 미생물에 대해 생산되는 양보다 더 적은, 재조합 미생물.
- 제30항에 있어서, 재조합 미생물이 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나베나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르티이, 에세리키아, 에세리키아 콜라이, 지오박테리아, 조류, 미세조류, 전해합성 세균, 광합성 미생물, 효모, 사상 진균 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물을 포함하는, 재조합 미생물.
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