JPH0698776A - 細菌のエチレン生成酵素をコードするｄｎａ断片、及びその用途 - Google Patents
細菌のエチレン生成酵素をコードするｄｎａ断片、及びその用途Info
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- JPH0698776A JPH0698776A JP4275387A JP27538792A JPH0698776A JP H0698776 A JPH0698776 A JP H0698776A JP 4275387 A JP4275387 A JP 4275387A JP 27538792 A JP27538792 A JP 27538792A JP H0698776 A JPH0698776 A JP H0698776A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
- C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
Abstract
(57)【要約】
【目的】 エチレン生成能力が高く、取り扱いやすい細
菌を得る。 【構成】 大腸菌などの取扱いやすい細菌に、エチレン
生成酵素遺伝子を導入して形質転換し、その形質転換体
を使ってエチレンを生成させる。
菌を得る。 【構成】 大腸菌などの取扱いやすい細菌に、エチレン
生成酵素遺伝子を導入して形質転換し、その形質転換体
を使ってエチレンを生成させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細菌のエチレン生成酵
素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、そのＤＮＡ断
片を含有するベクター、そのベクターで形質転換させた
形質転換体、ならびに、その形質転換体を用いるエチレ
ン製造方法に関する。
素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、そのＤＮＡ断
片を含有するベクター、そのベクターで形質転換させた
形質転換体、ならびに、その形質転換体を用いるエチレ
ン製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】エチレンは原油や天然ガスから生成されて
いるのであるが、植物や微生物によっても造られること
が古くから知られていた。そして、Chouらは、かびの一
種であるペニシリウム・ジギタツム(Penicilliumdigita
tum)ではα−ケトグルタール酸(α−ＫＧ)又はＬ−グル
タミン酸(Glu)がエチレンの前駆物質であると報告し(Ar
ch.Biochem.Biophys.157,73,1973)、Gotoらは植物病原
菌の一種であるシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas
syringae)の無細胞抽出液でのエチレン生成系で、α−
ＫＧが基質であると報告Plant CellPhysiol.28,405,198
7)している。
いるのであるが、植物や微生物によっても造られること
が古くから知られていた。そして、Chouらは、かびの一
種であるペニシリウム・ジギタツム(Penicilliumdigita
tum)ではα−ケトグルタール酸(α−ＫＧ)又はＬ−グル
タミン酸(Glu)がエチレンの前駆物質であると報告し(Ar
ch.Biochem.Biophys.157,73,1973)、Gotoらは植物病原
菌の一種であるシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas
syringae)の無細胞抽出液でのエチレン生成系で、α−
ＫＧが基質であると報告Plant CellPhysiol.28,405,198
7)している。
【０００３】また、Primroseらは大腸菌であるエシェリ
ヒア・コリイ(Escherichia coli)の無細胞抽出液でのエ
チレン生成系では、Ｌ−メチオニン(Met)の代謝中間物
質である２−ケト−４−メチルチオ酪酸(ＫＭＢＡ)がエ
チレン生合成の前駆物質であると報告(J.Gen.Microbio
l.98,519,1977)している。
ヒア・コリイ(Escherichia coli)の無細胞抽出液でのエ
チレン生成系では、Ｌ−メチオニン(Met)の代謝中間物
質である２−ケト−４−メチルチオ酪酸(ＫＭＢＡ)がエ
チレン生合成の前駆物質であると報告(J.Gen.Microbio
l.98,519,1977)している。
【０００４】これらの報告では、いずれも、微生物の培
養菌体、又はその無細胞抽出液など、不純物を多量に含
有している材料を使って実験しているために、エチレン
生成反応の真の基質や生合成経路が確定されなかったも
のと考えられる。
養菌体、又はその無細胞抽出液など、不純物を多量に含
有している材料を使って実験しているために、エチレン
生成反応の真の基質や生合成経路が確定されなかったも
のと考えられる。
【０００５】そこで本発明者らは、まず微生物によるエ
チレン生合成経路とエチレン生成酵素反応を明確にする
ために、エチレン生成に関与する酵素を電気泳動的に単
一タンパク質まで精成した。その結果、ＫＭＢＡ経由の
エチレン生成反応は、実は活性酸素によるラジカル反応
であること(福田ら、FEMS Micrbiol.Lett.,60,107,198
9)、ペニシリウム・ジギタツム(Penicillium digitatu
m)ＩＦＯ９３７２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素と
その酵素反応(福田ら、FEMS Microbiol.Lett.,591,198
9)、さらに、Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
ＰＫ２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素とその性質
(長浜・福田ら、J.Gen.Microbiol.,137,2281,1991)をそ
れぞれ明らかにした。
チレン生合成経路とエチレン生成酵素反応を明確にする
ために、エチレン生成に関与する酵素を電気泳動的に単
一タンパク質まで精成した。その結果、ＫＭＢＡ経由の
エチレン生成反応は、実は活性酸素によるラジカル反応
であること(福田ら、FEMS Micrbiol.Lett.,60,107,198
9)、ペニシリウム・ジギタツム(Penicillium digitatu
m)ＩＦＯ９３７２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素と
その酵素反応(福田ら、FEMS Microbiol.Lett.,591,198
9)、さらに、Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
ＰＫ２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素とその性質
(長浜・福田ら、J.Gen.Microbiol.,137,2281,1991)をそ
れぞれ明らかにした。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、本発明
者らによって、微生物によるエチレン生成経路と関与す
る酵素、並びにそれらの性質などが明らかになったが、
これらエチレン生産菌のエチレン生成能力は必ずしも十
分なものではなかった。そこで、エチレン生産菌の遺伝
子操作による抜本的な育種改良を目的として、その対象
にPseudomonas syringae pv. phaseolicola ＰＫ２を選
び、そのエチレン生成酵素をコードする遺伝子領域を含
むＤＮＡを解明し、本発明を完成するに至った。
者らによって、微生物によるエチレン生成経路と関与す
る酵素、並びにそれらの性質などが明らかになったが、
これらエチレン生産菌のエチレン生成能力は必ずしも十
分なものではなかった。そこで、エチレン生産菌の遺伝
子操作による抜本的な育種改良を目的として、その対象
にPseudomonas syringae pv. phaseolicola ＰＫ２を選
び、そのエチレン生成酵素をコードする遺伝子領域を含
むＤＮＡを解明し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】 上述の目的を達成するために、本発明は、細菌に Met Thr Asn Leu Gln Thr Phe Glu Leu Pro Thr Glu Val Thr Gly Cys Ala Ala Asp Ile Ser Leu Gly Arg Ala Leu Ile Gln Ala Trp Gln Lys Asp Gly Ile Phe Gln Ile Lys Thr Asp Ser Glu Gln Asp Arg Lys Thr Gln Glu Ala Met Ala Ala Ser Lys Gln Phe Cys Lys Glu Pro Leu Thr Phe Lys Ser Ser Cys Val Ser Asp Leu Thr Tyr Ser Gly Tyr Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Thr Ala Gly Lys Pro Asp Phe Pro Glu Ile Phe Thr Val Cys Lys Asp Leu Ser Val Gly Asp Gln Arg Val Lys Ala Gly Trp Pro Cys His Gly Pro Val Pro Trp Pro Asn Asn Thr Tyr Gln Lys Ser Met Lys Thr Phe Met Glu Glu Leu Gly Leu Ala Gly Glu Arg Leu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Gly Phe Glu Leu Pro Ile Asn Thr Phe Thr Asp Leu Thr Arg Asp Gly Trp His His Met Arg Val Leu Arg Phe Pro Pro Gln Thr Ser Thr Leu Ser Arg Gly Ile Gly Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val Ile Ala Ala Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu Pro Trp Thr Phe Val Thr Pro Thr Pro Gly Val Trp Thr Val Phe Pro Gly Asp Ile Leu Gln Phe Met Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Thr Pro His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser Ala Asn Glu Arg Ile His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met Arg Cys Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Thr Gln Arg Ile Asn Lys Glu Asn Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala Thr Gly Ser で表されるアミノ酸配列をコードした遺伝子を導入することを特徴とす る。
【０００８】本発明のエチレン生成酵素をコードするＤ
ＮＡは、例えば、シュードモナス・シリンゲのエチレン
生成酵素を精製してプローブを作成し、このプローブを
用いて内在性プラスミドとサザン法でハイブリダイゼー
ションさせて内在性プラスミドＤＮＡにエチレン生成酵
素遺伝子がコードされていることを見出し、この内在性
プラスミドＤＮＡの制限酵素Hind III断片を用い、pUC1
9をベクターとして、エシェリヒア・コリイ(E.coli)を
形質転換後、遺伝子ライブラリーを作成し、その中から
サザン法によるハイブリダイゼーションにより、ポジテ
ィブクローンE.coli JM109(pEFE01)をスクリーニングす
ることにより形質転換体をうることができる。
ＮＡは、例えば、シュードモナス・シリンゲのエチレン
生成酵素を精製してプローブを作成し、このプローブを
用いて内在性プラスミドとサザン法でハイブリダイゼー
ションさせて内在性プラスミドＤＮＡにエチレン生成酵
素遺伝子がコードされていることを見出し、この内在性
プラスミドＤＮＡの制限酵素Hind III断片を用い、pUC1
9をベクターとして、エシェリヒア・コリイ(E.coli)を
形質転換後、遺伝子ライブラリーを作成し、その中から
サザン法によるハイブリダイゼーションにより、ポジテ
ィブクローンE.coli JM109(pEFE01)をスクリーニングす
ることにより形質転換体をうることができる。
【０００９】そして、このポジティブクローンE.coli J
M109(pEFE01)にはシュードモナス・シリンゲプラスミド
由来の約2.5kbpのHind III断片が挿入されており、この
ポジティブクローンE.coli JM109(pEFE01)にはエチレン
生成活性が見られた。また、エチレン生成酵素の抗体を
用いたウエスタンブロッティングによっても、ポジティ
ブクローンE.coli JM109(pEFE01)はシュードモナス・シ
リンゲのエチレン生成酵素蛋白質と区別できない蛋白質
を発現していた。
M109(pEFE01)にはシュードモナス・シリンゲプラスミド
由来の約2.5kbpのHind III断片が挿入されており、この
ポジティブクローンE.coli JM109(pEFE01)にはエチレン
生成活性が見られた。また、エチレン生成酵素の抗体を
用いたウエスタンブロッティングによっても、ポジティ
ブクローンE.coli JM109(pEFE01)はシュードモナス・シ
リンゲのエチレン生成酵素蛋白質と区別できない蛋白質
を発現していた。
【００１０】挿入された2.5kbp Hind III断片を切断し
て、種々の大きさの欠失変異株を作成した。その中で、
エチレン生成活性を保持しつつ、最も小さいpEFE01誘導
体を得た。その大きさは約1.5kbpであった。
て、種々の大きさの欠失変異株を作成した。その中で、
エチレン生成活性を保持しつつ、最も小さいpEFE01誘導
体を得た。その大きさは約1.5kbpであった。
【００１１】
【発明の効果】本発明では、無害で取り扱いの容易な大
腸菌等の細菌類を形質転換してエチレン生成能力の高い
細菌を得ることができる。また、この形質転換を行った
細菌を利用してエチレンを効率よく製造することができ
る。
腸菌等の細菌類を形質転換してエチレン生成能力の高い
細菌を得ることができる。また、この形質転換を行った
細菌を利用してエチレンを効率よく製造することができ
る。
【００１２】
【実施例】シュードモナス・シリンゲの染色体ＤＮＡの
抽出は、まずリゾチームとドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)を用いて細胞壁を溶解させた後、フェノール抽出
によって蛋白質を変性除去し、エタノール沈殿によって
ＤＮＡを回収した。また、シュードモナス・シリンゲの
プラスミドＤＮＡの抽出はアルカリ抽出法で行った。
抽出は、まずリゾチームとドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)を用いて細胞壁を溶解させた後、フェノール抽出
によって蛋白質を変性除去し、エタノール沈殿によって
ＤＮＡを回収した。また、シュードモナス・シリンゲの
プラスミドＤＮＡの抽出はアルカリ抽出法で行った。
【００１３】それぞれ抽出したＤＮＡを制限酵素Hind I
IIで切断し、０.７％アーガロースゲル電気泳動を行
い、電気泳動後のゲル中のＤＮＡをキャピラリー法によ
りナイロンメンブレンにトランスフアーさせ、乾熱処理
によりメンブレン上に結合させて、サザンハイブリダイ
ゼーションを行った。
IIで切断し、０.７％アーガロースゲル電気泳動を行
い、電気泳動後のゲル中のＤＮＡをキャピラリー法によ
りナイロンメンブレンにトランスフアーさせ、乾熱処理
によりメンブレン上に結合させて、サザンハイブリダイ
ゼーションを行った。
【００１4】ハイブリダイゼーションによりエチレン生
成酵素(ＥＦＥ)の構造遺伝子はプラスミド上に存在する
と思われるので、Hind IIIで切断したプラスミドＤＮＡ
のフラグメントを、Hind IIIで切断したのちアルカリホ
スファターゼ処理を施した大腸菌ベクター(pUC19)にラ
イゲーションし、キメラプラスミドを得る。このキメラ
プラスミドを塩化カルシウム法により調整したエシェリ
ヒア・コリイ(E.coliJM109)のコンピテントセルと混合
し、１時間氷中放置後、ヒートショックを与え、遠心分
離して、細胞内にキメラプラスミドを取り込ませ、E.co
li JM109を形質転換させる。この形質転換後のE.coli J
M109を、バクトトリプトン１６ｇ／リットル、バクト酵
母エキス１０ｇ／リットル、塩化ナトリウム５ｇ／リッ
トルからなる２ｘＹＴ培地にまき、１.５時間放置して
培養し、培養したE.coli JM109を遠心分離し、選択培地
に植菌する。
成酵素(ＥＦＥ)の構造遺伝子はプラスミド上に存在する
と思われるので、Hind IIIで切断したプラスミドＤＮＡ
のフラグメントを、Hind IIIで切断したのちアルカリホ
スファターゼ処理を施した大腸菌ベクター(pUC19)にラ
イゲーションし、キメラプラスミドを得る。このキメラ
プラスミドを塩化カルシウム法により調整したエシェリ
ヒア・コリイ(E.coliJM109)のコンピテントセルと混合
し、１時間氷中放置後、ヒートショックを与え、遠心分
離して、細胞内にキメラプラスミドを取り込ませ、E.co
li JM109を形質転換させる。この形質転換後のE.coli J
M109を、バクトトリプトン１６ｇ／リットル、バクト酵
母エキス１０ｇ／リットル、塩化ナトリウム５ｇ／リッ
トルからなる２ｘＹＴ培地にまき、１.５時間放置して
培養し、培養したE.coli JM109を遠心分離し、選択培地
に植菌する。
【００１５】選択培地に発現したキメラプラスミドをも
つコロニーをスクリーニングし、これらコロニーをバク
トトリプトン１０ｇ／リットル、バクト酵母エキス５ｇ
／リットル、塩化ナトリウム１０ｇ／リットルからなる
ＬＢ培地にチアミン塩酸塩５μｇ／ml、アンピシリンナ
トリウム５０μｇ／mlを添加して培養し、その中からプ
ラスミドＤＮＡ(キメラpUC19)をアルカリ抽出し、ＲＮ
Ａを除去してプラスミドＤＮＡを精製し、Hind IIIで処
理後、１％アガロースゲル電気泳動を行う。この電気泳
動したものをアルカリ変性させて中和し、ナイロンメン
ブレン上にブロッティングし、ハイブリダイゼーション
によりエチレン生成酵素遺伝子を保持するE.coliをスク
リーニングする。
つコロニーをスクリーニングし、これらコロニーをバク
トトリプトン１０ｇ／リットル、バクト酵母エキス５ｇ
／リットル、塩化ナトリウム１０ｇ／リットルからなる
ＬＢ培地にチアミン塩酸塩５μｇ／ml、アンピシリンナ
トリウム５０μｇ／mlを添加して培養し、その中からプ
ラスミドＤＮＡ(キメラpUC19)をアルカリ抽出し、ＲＮ
Ａを除去してプラスミドＤＮＡを精製し、Hind IIIで処
理後、１％アガロースゲル電気泳動を行う。この電気泳
動したものをアルカリ変性させて中和し、ナイロンメン
ブレン上にブロッティングし、ハイブリダイゼーション
によりエチレン生成酵素遺伝子を保持するE.coliをスク
リーニングする。
【００１６】ハイブリダイゼーションしたE.coliを、前
記ＬＢ培地にＬ−グルタミン酸ソーダ５ｇ／ml、チアミ
ン塩酸塩５μｇ／ml、アンピシリンナトリウム５０μｇ
／mlを添加して培養したところE.coli JM109(pEFE01)に
エチレン生成活性が認められ、そのエチレン生成速度は
２３０nl／ml培養液／hrであった。一方ホストとして使
用した前記E.coli JM109(一般によく知られた公開の菌
株)には、エチレン生成活性が認められず、また、エチ
レン生成速度も０nl／ml培養液／hrであった。ここにエ
チレン生成活性とは、培養菌体から調整した無細胞抽出
液によるin vitroエチレン生成能を示し、エチレン生成
速度とは培養液によるin vitroエチレン生成能を示すも
ので、これらの特性は前記文献(長浜・福田ら：J.Gen.M
icrobiol.,137,2281,1991)などに記載されている常法に
従って測定することができる。
記ＬＢ培地にＬ−グルタミン酸ソーダ５ｇ／ml、チアミ
ン塩酸塩５μｇ／ml、アンピシリンナトリウム５０μｇ
／mlを添加して培養したところE.coli JM109(pEFE01)に
エチレン生成活性が認められ、そのエチレン生成速度は
２３０nl／ml培養液／hrであった。一方ホストとして使
用した前記E.coli JM109(一般によく知られた公開の菌
株)には、エチレン生成活性が認められず、また、エチ
レン生成速度も０nl／ml培養液／hrであった。ここにエ
チレン生成活性とは、培養菌体から調整した無細胞抽出
液によるin vitroエチレン生成能を示し、エチレン生成
速度とは培養液によるin vitroエチレン生成能を示すも
ので、これらの特性は前記文献(長浜・福田ら：J.Gen.M
icrobiol.,137,2281,1991)などに記載されている常法に
従って測定することができる。
【００１７】ここに使用した形質転換体E.coli JM109(p
EFE01)は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第１３１６１号（ＦＥＲＭＰ−１３１６１）として寄
託されている。
EFE01)は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第１３１６１号（ＦＥＲＭＰ−１３１６１）として寄
託されている。
【００１８】また、ウエスタンブロッティングにより、
シユードモナス・シリンゲのエチレン生成酵素蛋白質と
同じものがE.coli JM109(pEFE01)中にも存在することが
解った。そして、挿入された2.5kbp Hind III断片を末
端から欠損させ、種々の大きさの欠失変異株を作成し
た。その中で、エチレン生成活性を保持しつつ、最も小
さいpEFE01誘導体を検索したところ、その大きさは約1.
5kbpであった。なお、この断片中には別のHind III切断
部位や他の制限酵素Pst I、Dra I、EcoR I、BamHIの切
断部位も存在しなかった。
シユードモナス・シリンゲのエチレン生成酵素蛋白質と
同じものがE.coli JM109(pEFE01)中にも存在することが
解った。そして、挿入された2.5kbp Hind III断片を末
端から欠損させ、種々の大きさの欠失変異株を作成し
た。その中で、エチレン生成活性を保持しつつ、最も小
さいpEFE01誘導体を検索したところ、その大きさは約1.
5kbpであった。なお、この断片中には別のHind III切断
部位や他の制限酵素Pst I、Dra I、EcoR I、BamHIの切
断部位も存在しなかった。
【００１９】そして、２.５kb Hind III断片内に含まれ
ているエチレン生成酵素遺伝子をジデオキシ法でシーケ
ンスして決定した塩基配列とアミノ酸配列を図１及び図
２に示す。この場合、５１９から１５６８までがエチレ
ン生成酵素の構造遺伝子である。
ているエチレン生成酵素遺伝子をジデオキシ法でシーケ
ンスして決定した塩基配列とアミノ酸配列を図１及び図
２に示す。この場合、５１９から１５６８までがエチレ
ン生成酵素の構造遺伝子である。
【図１】クローニングされたエチレン生成酵素遺伝子の
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の前半部
分である。
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の前半部
分である。
【図２】クローニングされたエチレン生成酵素遺伝子の
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の後半部
分である。
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の後半部
分である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 のうち、少なくとも５１９番から１５６８番の塩基配列
を有する請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の
細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片。
を有する請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の
細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来技術】エチレンは原油や天然ガスから生成されて
いるのであるが、植物や微生物によっても造られること
が古くから知られていた。そして、Chouらは、かびの一
種であるペニシリウム・ジギタツム(Penicilliumdigita
tum)ではα−ケトグルタール酸(α−ＫＧ)又はＬ−グル
タミン酸(Glu)がエチレンの前駆物質であると報告し(Ar
ch.Biochem.Biophys.157,73,1973)、Gotoらは植物病原
菌の一種であるシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas
syringae)の無細胞抽出液でのエチレン生成系で、α−
ＫＧが基質であると報告(Plant Cell Physiol.28,405,1
987)している。
いるのであるが、植物や微生物によっても造られること
が古くから知られていた。そして、Chouらは、かびの一
種であるペニシリウム・ジギタツム(Penicilliumdigita
tum)ではα−ケトグルタール酸(α−ＫＧ)又はＬ−グル
タミン酸(Glu)がエチレンの前駆物質であると報告し(Ar
ch.Biochem.Biophys.157,73,1973)、Gotoらは植物病原
菌の一種であるシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas
syringae)の無細胞抽出液でのエチレン生成系で、α−
ＫＧが基質であると報告(Plant Cell Physiol.28,405,1
987)している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】そこで本発明者らは、まず微生物によるエ
チレン生合成経路とエチレン生成酵素反応を明確にする
ために、エチレン生成に関与する酵素を電気泳動的に単
一タンパク質まで精製した。その結果、ＫＭＢＡ経由の
エチレン生成反応は、実は活性酸素によるラジカル反応
であること(福田ら、FEMS Micrbiol.Lett.,60,107,198
9)、ペニシリウム・ジギタツム(Penicillium digitatu
m)ＩＦＯ９３７２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素と
その酵素反応(福田ら、FEMS Microbiol.Lett.,591,198
9)、さらに、Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
ＰＫ２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素とその性質
(長浜・福田ら、J.Gen.Microbiol.,137,2281,1991)をそ
れぞれ明らかにした。
チレン生合成経路とエチレン生成酵素反応を明確にする
ために、エチレン生成に関与する酵素を電気泳動的に単
一タンパク質まで精製した。その結果、ＫＭＢＡ経由の
エチレン生成反応は、実は活性酸素によるラジカル反応
であること(福田ら、FEMS Micrbiol.Lett.,60,107,198
9)、ペニシリウム・ジギタツム(Penicillium digitatu
m)ＩＦＯ９３７２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素と
その酵素反応(福田ら、FEMS Microbiol.Lett.,591,198
9)、さらに、Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
ＰＫ２のα−ＫＧ経由のエチレン生成酵素とその性質
(長浜・福田ら、J.Gen.Microbiol.,137,2281,1991)をそ
れぞれ明らかにした。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】本発明のエチレン生成酵素をコードするＤ
ＮＡは、例えば、シュードモナス・シリンゲのエチレン
生成酵素を精製してプローブを作成し、このプローブを
用いて内在性プラスミドとサザン法でハイブリダイゼー
ションさせて内在性プラスミドＤＮＡにエチレン生成酵
素遺伝子がコードされていることを見出し、この内在性
プラスミドＤＮＡの制限酵素Hind III断片を用い、pUC1
9をベクターとして、エシェリヒア・コリイ(E.coli)を
形質転換後、遺伝子ライブラリーを作成し、その中から
サザン法によるハイブリダイゼーションにより、ポジテ
ィブクローンE.coli JM109(pEFE01)をスクリーニングす
ることによりうることができる。
ＮＡは、例えば、シュードモナス・シリンゲのエチレン
生成酵素を精製してプローブを作成し、このプローブを
用いて内在性プラスミドとサザン法でハイブリダイゼー
ションさせて内在性プラスミドＤＮＡにエチレン生成酵
素遺伝子がコードされていることを見出し、この内在性
プラスミドＤＮＡの制限酵素Hind III断片を用い、pUC1
9をベクターとして、エシェリヒア・コリイ(E.coli)を
形質転換後、遺伝子ライブラリーを作成し、その中から
サザン法によるハイブリダイゼーションにより、ポジテ
ィブクローンE.coli JM109(pEFE01)をスクリーニングす
ることによりうることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】そして、このポジティブクローンE.coli J
M109(pEFE01)の細胞のプラスミドpEFE01にはシュードモ
ナス・シリンゲプラスミド由来の約2.5kbpのHind III断
片が挿入されており、このポジティブクローンE.coli J
M109(pEFE01)にはエチレン生成活性が見られた。また、
エチレン生成酵素の抗体を用いたウエスタンブロッティ
ングによっても、ポジティブクローンE.coli JM109(pEF
E01)はシュードモナス・シリンゲのエチレン生成酵素蛋
白質と区別できない蛋白質を発現していた。
M109(pEFE01)の細胞のプラスミドpEFE01にはシュードモ
ナス・シリンゲプラスミド由来の約2.5kbpのHind III断
片が挿入されており、このポジティブクローンE.coli J
M109(pEFE01)にはエチレン生成活性が見られた。また、
エチレン生成酵素の抗体を用いたウエスタンブロッティ
ングによっても、ポジティブクローンE.coli JM109(pEF
E01)はシュードモナス・シリンゲのエチレン生成酵素蛋
白質と区別できない蛋白質を発現していた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】ハイブリダイゼーションしたE.coliを、前
記ＬＢ培地にＬ−グルタミン酸ソーダ５ｇ／ml、チアミ
ン塩酸塩５μｇ／ml、アンピシリンナトリウム５０μｇ
／mlを添加して培養したところE.coli JM109(pEFE01)に
エチレン生成活性が認められ、そのエチレン生成速度は
２３０nl／ml培養液／hrであった。一方ホストとして使
用した前記E.coli JM109(一般によく知られた公開の菌
株)には、エチレン生成活性が認められず、また、エチ
レン生成速度も０nl／ml培養液／hrであった。ここにエ
チレン生成活性とは、培養菌体から調整した無細胞抽出
液によるin vitroエチレン生成能を示し、エチレン生成
速度とは培養液によるin vivoエチレン生成能を示すも
ので、これらの特性値は前記文献(長浜・福田ら：J.Ge
n.Microbiol.,137,2281,1991)などに記載されている常
法に従って測定することができる。
記ＬＢ培地にＬ−グルタミン酸ソーダ５ｇ／ml、チアミ
ン塩酸塩５μｇ／ml、アンピシリンナトリウム５０μｇ
／mlを添加して培養したところE.coli JM109(pEFE01)に
エチレン生成活性が認められ、そのエチレン生成速度は
２３０nl／ml培養液／hrであった。一方ホストとして使
用した前記E.coli JM109(一般によく知られた公開の菌
株)には、エチレン生成活性が認められず、また、エチ
レン生成速度も０nl／ml培養液／hrであった。ここにエ
チレン生成活性とは、培養菌体から調整した無細胞抽出
液によるin vitroエチレン生成能を示し、エチレン生成
速度とは培養液によるin vivoエチレン生成能を示すも
ので、これらの特性値は前記文献(長浜・福田ら：J.Ge
n.Microbiol.,137,2281,1991)などに記載されている常
法に従って測定することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】ここに使用した形質転換体E.coli JM109(p
EFE01)は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第１３１６１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１６１）として
寄託されている。
EFE01)は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第１３１６１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１６１）として
寄託されている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】そして、２.５kbp Hind III断片内に含ま
れているエチレン生成酵素遺伝子をジデオキシ法でシー
ケンスして決定した塩基配列とアミノ酸配列を図１及び
図２に示す。
れているエチレン生成酵素遺伝子をジデオキシ法でシー
ケンスして決定した塩基配列とアミノ酸配列を図１及び
図２に示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 5/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 下記のアミノ酸配列 Met Thr Asn Leu Gln Thr Phe Glu Leu Pro Thr Glu Val Thr Gly Cys Ala Ala Asp Ile Ser Leu Gly Arg Ala Leu Ile Gln Ala Trp Gln Lys Asp Gly Ile Phe Gln Ile Lys Thr Asp Ser Glu Gln Asp Arg Lys Thr Gln Glu Ala Met Ala Ala Ser Lys Gln Phe Cys Lys Glu Pro Leu Thr Phe Lys Ser Ser Cys Val Ser Asp Leu Thr Tyr Ser Gly Tyr Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Thr Ala Gly Lys Pro Asp Phe Pro Glu Ile Phe Thr Val Cys Lys Asp Leu Ser Val Gly Asp Gln Arg Val Lys Ala Gly Trp Pro Cys His Gly Pro Val Pro Trp Pro Asn Asn Thr Tyr Gln Lys Ser Met Lys Thr Phe Met Glu Glu Leu Gly Leu Ala Gly Glu Arg Leu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Gly Phe Glu Leu Pro Ile Asn Thr Phe Thr Asp Leu Thr Arg Asp Gly Trp His His Met Arg Val Leu Arg Phe Pro Pro Gln Thr Ser Thr Leu Ser Arg Gly Ile Gly Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val Ile Ala Ala Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu Pro Trp Thr Phe Val Thr Pro Thr Pro Gly Val Trp Thr Val Phe Pro Gly Asp Ile Leu Gln Phe Met Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Thr Pro His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser Ala Asn Glu Arg Ile His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met Arg Cys Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Thr Gln Arg Ile Asn Lys Glu Asn Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala Thr Gly Ser で表わされる細菌のエチレン生成酵素をコー ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
- 【請求項２】 細菌がシュードモナス属菌である特許請
求の範囲第１項に記載のエチレン生成酵素をコードする
ＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 下記の塩基配列、 ATG ACC AAC CTA CAG ACT TTC GAG TTG CCT ACC GAG GTA ACC GGC TGC GCC GCC GAT ATC TCA TTG GGA AGG GCG CTG ATC CAA GCC TGG CAA AAA GAT GGC ATT TTT CAG ATC AAG ACC GAT AGT GAG CAG GAT CGC AAA ACG CAG GAA GCA ATG GCT GCT AGC AAG CAG TTT TGC AAG GAA CCG CTG ACT TTT AAG AGT AGC TGC GTT AGC GAT CTG ACC TAC AGC GGC TAT GTT GCG TCA GGC GAG GAA GTC ACA GCT GGT AAA CCT GAT TTC CCT GAA ATC TTC ACT GTC TGC AAG GAC TTG TCG GTA GGC GAT CAG CGT GTA AAA GCC GGC TGG CCT TGC CAT GGT CCG GTG CCA TGG CCA AAT AAC ACC TAT CAG AAA AGC ATG AAG ACC TTC ATG GAA GAG CTG GGT TTA GCG GGC GAA CGG TTG CTC AAA CTG ACA GCG CTC GGC TTT GAA CTA CCC ATC AAC ACG TTC ACC GAC TTA ACT CGC GAT GGT TGG CAC CAC ATG CGT GTA TTA CGC TTC CCG CCC CAA ACA TCC ACG CTG TCC CGT GGA ATT GGT GCG CAC ACT GAC TAT GGG TTG TTG GTA ATT GCC GCT CAG GAC GAT GTT GGT GGC TTA TAT ATT CGC CCT CCA GTC GAG GGA GAG AAG CGT AAT CGT AAC TGG TTG CCT GGT GAG AGC TCA GCA GGC ATG TTT GAG CAC GAT GAA CCT TGG ACC TTC GTG ACG CCC ACC CCA GGC GTG TGG ACA GTT TTC CCA GGT GAT ATC TTG CAG TTC ATG ACC GGC GGC CAG CTG CTT TCC ACT CCG CAC AAG GTT AAG CTC AAT ACC CGC GAA CGT TTC GCC TGC GCT TAT TTT CAT GAG CCT AAT TTT GAA GCA TCC GCC TAT CCG TTG TTC GAG CCC AGC GCC AAT GAG CGT ATT CAT TAT GGT GAG CAC TTT ACC AAC ATG TTT ATG CGT TGC TAT CCA GAT CGG ATC ACC ACC CAG AGG ATC AAC AAG GAG AAT CGC CTG GCG CAC TTG GAG GAC TTG AAG AAG TAT TCG GAC ACC CGC GCG ACA GGC TCA で表わされる請求項１又は請求項２に記載 した細菌のエチレン生成酵素をコードするＤＮＡ断片。
- 【請求項４】 下記の塩基配列 【化１】 のうち、少なくとも５１９番から１５６８番の塩基配列
を有する請求項１ないし至請求項３のいずれか１項に記
載の細菌のエチレン生成酵素をコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項５】 請求項１ないし請求項４のいずれか１項
に記載の細菌のエチレン生成酵素をコードするＤＮＡ断
片を含有するベクター。 - 【請求項６】 請求項５に記載のベクターで形質転換さ
せた形質転換体。 - 【請求項７】 請求項６に記載のベクターで形質転換さ
せた形質転換体を培養し、エチレンを生成させることを
特徴とするエチレンの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4275387A JPH0698776A (ja) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | 細菌のエチレン生成酵素をコードするｄｎａ断片、及びその用途 |
| US08/204,196 US5536659A (en) | 1992-09-18 | 1993-09-14 | DNA fragment comprising a gene encoding ethylene forming enzyme of bacteria and the use thereof |
| PCT/JP1993/001309 WO1994006914A1 (en) | 1992-09-18 | 1993-09-14 | Bacterial dna fragment containing gene which codes for ethylene-producing enzyme, and use thereof |
| GB9400219A GB2275472B (en) | 1992-09-18 | 1993-09-14 | DNA fragment comprising a gene encoding ethylene forming enzyme of bacteria and the use therof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4275387A JPH0698776A (ja) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | 細菌のエチレン生成酵素をコードするｄｎａ断片、及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698776A true JPH0698776A (ja) | 1994-04-12 |
Family
ID=17554788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4275387A Pending JPH0698776A (ja) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | 細菌のエチレン生成酵素をコードするｄｎａ断片、及びその用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5536659A (ja) |
| JP (1) | JPH0698776A (ja) |
| GB (1) | GB2275472B (ja) |
| WO (1) | WO1994006914A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010220498A (ja) * | 2009-03-19 | 2010-10-07 | Ritsumeikan | バイオオーグメンテーションにおける環境影響の評価方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103333885A (zh) | 2003-06-23 | 2013-10-02 | 先锋高级育种国际公司 | 将单基因控制的保绿潜力工程化进植物中 |
| WO2008100251A1 (en) * | 2007-02-13 | 2008-08-21 | Ls9, Inc. | Modified microorganism uses therefor |
| US20100242345A1 (en) | 2006-05-19 | 2010-09-30 | LS9, Inc | Production of fatty acids & derivatives thereof |
| US8110670B2 (en) | 2006-05-19 | 2012-02-07 | Ls9, Inc. | Enhanced production of fatty acid derivatives |
| CN111808892A (zh) | 2009-04-27 | 2020-10-23 | 基因组股份公司 | 脂肪酸酯的产生 |
| US9914947B2 (en) | 2011-07-27 | 2018-03-13 | Alliance For Sustainable Energy, Llc | Biological production of organic compounds |
| US20130203136A1 (en) * | 2011-07-27 | 2013-08-08 | Alliance For Sustainable Energy, Llc | Biological production of organic compounds |
| US10184138B2 (en) | 2014-06-09 | 2019-01-22 | The Regents Of The University Of California | Bacteria engineered for conversion of ethylene to ethanol |
| US20220411829A1 (en) * | 2019-12-03 | 2022-12-29 | Cemvita Factory, Inc. | Methods and compositions for producing ethylene from recombinant microorganisms |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6244187A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-02-26 | Norin Suisansyo Nogyo Seibutsu Shigen Kenkyusho | エチレンの製造法 |
-
1992
- 1992-09-18 JP JP4275387A patent/JPH0698776A/ja active Pending
-
1993
- 1993-09-14 WO PCT/JP1993/001309 patent/WO1994006914A1/ja active Application Filing
- 1993-09-14 GB GB9400219A patent/GB2275472B/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-14 US US08/204,196 patent/US5536659A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.GEN.MICROBIOL=1991 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010220498A (ja) * | 2009-03-19 | 2010-10-07 | Ritsumeikan | バイオオーグメンテーションにおける環境影響の評価方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB9400219D0 (en) | 1994-06-22 |
| GB2275472B (en) | 1995-12-06 |
| GB2275472A (en) | 1994-08-31 |
| US5536659A (en) | 1996-07-16 |
| WO1994006914A1 (en) | 1994-03-31 |
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