JPH01500960A - ヒト白血球インターフェロンα‐Ｉ１の生合成をコードする組換えプラスミドＤＮＡ ｐＶＮ２２及びそれを含むヒト白血球インターフェロンα‐Ｉ１の生産体であるシュードモナスＳＰ．３１（ｐＶＮ２２）菌株 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒト白血球インターフェロンα−１１の生合成をコードする組換えプラスミドＤ ＮＡｐＶＮ２２及びそれを含むヒト白血球インターフェロンα−１１の生産体で あるシュードモナス５１）、３１　（ｐＶＮ２２）菌株発明の分野 本発明は遺伝子工学及びバイオテクノロジーの技術に関し、より詳しくはヒト白 血球インターフェロンα−１１の生合成をコードする新規なｉｎ　ｖｉｔｒｏで 作り出された組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２．及びこのプラスミドを含有 するヒト白血球インターフェロンα−１１を産生ずる新規菌株シュードモナス５ ｍ）、３１ＣＰｓｅｕｄｏａｏｎａｓ　ｓｐ、３１　）　（ｐ　ＶＮ　２２）に 関する。

従来技術 インターフェロンはウィルス感染に応答して並びにその他の何れかの因子の結果 に応答しである種の細胞により産生されるタンパク質である。インターフェロン は抗ウイルス効果及び多くのその他の性質を示す：細胞生育の抑制、それらの分 化に及ぼす影響、マクロファージの活性化、抗体−独立キラー細胞の数の増加な ど。ヒト白血球により産生されるインターフェロンは白血球インク−フェロン（ インターフェロンα）と称され、１６６個（一つの場合は１６５個）のアミノ酸 部分を含有する関連タンパク質の族よりなる。異なったインターフェロンαに対 するアミノ酸配列の相同は８０％以上の高いものである。いずれのインターフェ ロンαともそれ自体の遺伝子によりコード化され、対応する因子によるインター フェロン合成の誘発後インターフェロンαの混合物が血液血漿中に放出される。

ウィルスの作用から細胞を保護する能力により決定される異なったインターフェ ロンαの生物学的活性は相当に異なり、それらのその他の生物学的及び物理化学 的性質も又異なる。医薬目的のためのインターフェロンαの製造において供与者 の血液が通常用いられる。しかしながら、この源は高純度インターフェロンにお ける要求に完全に合致することができるものではない。分子クローニング及び遺 伝子工学の方法により創り出される細菌生産体、即ち菌株の使用はインターフェ ロンαを実質的に任意の必要量にて製造することを可能にする。しかしながら、 いずれの個々の生産体も数多くのインターフェロンαからただ１種のインターフ ェロンを与えるに過ぎない。天然化合物の性質に近似した性質を有する医薬製剤 を得るためには、高純度インターフェロンαがヒトの血液に通常支配的であるよ うな割合で更に混合されるように各種インターフェロンα（例えば、α−Ａ５α −Ｂ１α−Ｃ１α−１など）を合成する全範囲の生産体を保有する必要がある。

インターフェロンαのある種のサブタイプの十分に活性な細菌生産体が既に遺伝 子工学の方法により調製されている。即ち、インターフェロンα−Ａ１α−Ｆ、 α−になどの生合成をＥ、コリ（Ｅ、ｅｏｌｉ）の細胞内で確実にする組換えプ ラスミドが作り出されている。しかしながら、これは、供与者の血液から得られ るインターフェロンαの混合物の効果を完全に再生する製剤を得るためには十分 ではない。

ベクターｐＢＲ３２２に基づいて合成され、インターフェロンα−Ｌの生合成を コードする組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＬｅＩＦ−ｒＬが公知であり、又、この プラスミドを含有する菌株エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈ−１ａｃｏ ｌｉ）２９４　（ＥＰＡ２　００７２５４１）も又公知である。インターフェロ ンα−Ｌの遺伝子はファージλＨａｒｏｎ　４Ａを用いてヒト遺伝子のライブラ リーから調製される。プラスミドｐＬｅｌＦ−ｒＬにおいてはインターフェロン α−Ｌの合成は誘発性トリプトファンプロモーターにより制御される。

この菌株は、細菌の迅速な生育を確実にするために通常用いられる比較的高含量 のトリブトアアンを有する富化培地（ＬＢ−培地、ホッティンガーのブロス）で の発酵に際して目的生成物の低割合の生合成が観察されることにより特徴付けら れる。この欠点は、インターフェロンα−Ｌの合成が、操作が誘発されなければ ならないトリプトファンプロモーターの調節領域の制御下に行われるという事実 に関連している。インターフェロンα−Ｌの高割合の生合成を達成するためには 培養ブロスは最少塩培地により２０〜４０倍に稀釈されるべきである。培地中に おけるトリプトファン濃度の相当な減少の結果、遺伝子の転写の正常化及びイン ターフェロンの合成の２０〜５０倍の強度化が生ずる。工業的規模の製造におい は、その様な生育培養物の稀釈は極めて困難であり、Ｅ、コリ培養物の食細胞溶 解を避けるために稀釈時に厳格な無菌状態が観察されるべきであるので一層困難 である。更に、Ｅ、コリー条件によっては病原性の微生物であり、製造における その使用は望ましくない。

発明の開示 組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２及びシュードモナスｓ　ｐ、３１　（ｐＶ Ｎ２２）菌株−白血球インターフェロンα−１１の生産体、は新規であり、従来 文献において知られていない。

本発明は、ヒト白血球インターフェロンα−１１の生合成をコードする新規組換 えプラスミドＤＮＡ、及び新規菌株、即ちそれを含有し白血球インターフェロン α−１１の高収率での製造を確実にする生産体、の提供に向けられたものである 。

この目的は、本発明によるヒト白血球インターフェロンα−１１の生合成をコー ドする組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２が１０．８５ｔ、ｐ、ｂ、（数千の 塩基対）の大きさを有し、及び次の単位により構成されることにより達成される ニ ー９．４５ｔ、ｐ、ｂ、の大きさを有するブラミスドｐＡＹＣ３７のＥｃｏＲＩ −Ｈｉｎｄｍ−断片；−次の構成員よりなる１４　ｐ、ｏ、ｂ、の大きさを有す るＨｉｎｄＩｆｆ−ＥｃｏＲＩ−断片； −ファージψ×１７４の遺伝子りの８節範囲を有する０　、２５　ｔ、ｐ、ｂ、 のＤＮＡ断片及びインターフェロンαの遺伝子の第１コドン； −０，５ｔ、ｐ、ｂ、の大きさのインターフェロンα−１１の遺伝子： ０　、　６５　ｔ、ｐ、ｂ、の大きさのヒトゲノムＤＮＡの領域。

上記組換えプラスミドＤＮＡは次の遺伝子マーカーを有し：アンビシリンに対す る耐性を保障する遺伝子ＡｐＲ；ストレプトマイシンに対する耐性を保障するＳ ｍＲ；それは次の制限酵素認識の独特の領域を含み：Ｈｉ　ｎ　ｄ　［−０、Ｅ 　ｃ　ｏ　ＲＩ　−１，４ｔ、ｐ、ｂ、、ＢａｍＨｌ　−１０，８２ｔ、ｐ、ｂ 、　：それは全連邦抗生物質研究所（Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔｌｂｉｏｔｉｃｓ）の微生物培養物収集機関 に寄託され、受託番号１７８８Ａ１で登録されている。

本発明によるプラスミドはＥ、コリ、シュードモナスなどの各秤グラムー陰性細 菌内で複製されることができ、又それｊ＝位ｉ３４．５５．１６１における３個 のアミノ酸置換により公知のインターフェロンα−１と異なるヒト白血球インタ ーフェロンα−１１の生合成を確実に行う。

本発明によるプラスミド内に導入され０　、　５０　ｔ、ｐ、ｂ。

の大きさを有するインターフェロンα−１１の遺伝子は下記構造のものであるニ スタート Ｌ−ｅｔ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔ”ｃｒ　Ｅ：ｉｓ　Ｓ ｅＸ”　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｘ。

ＡＴＧ　’］’ＧＴ　ＧＡ’Ｉ’　ＣＯＧ　ＣＣ↑ＣＡＧ　ＡＣＣＣＡＣＡＧＣ ＣＴＧη！Ａｓｎ　ＡｒｇＡｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　 Ａｌａ　Ｇｌｎ　２０ＡＡ？　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＧＣＣＴ’Ｘ’Ｇ　ＡＴＡ　Ｃ ＴＣＣ％　ＧＣＡ　ＣＡＡＭｅｔ　ｃ−１ｙ　Ａｒｇ；　工１ｅ　Ｓｅｒ　Ｐｌ ”ＯＦｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｉ、ｅｕ　３゜ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＡＴＣ ＴＩＪ　ＣＣＴ　ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣ’ＩＩＧＬｙｓ　Ａｓｐ　Ａｒ６　Ｈｉ ｓ　Ａｓｐ　Ｆｈｅ　Ｇ１７　Ｌｅｕ　Ｐｒｅ　Ｇｉｎ　４０Ｔ：：ｒ　Ｇｌｎ 　Ａｌａ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｉａｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　ｌ’４ｔ　６０Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｓ　Ｐ’ｏｅ　Ｓｅｒ　Ｔａｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ｔｙｒ　９０Ｃ’ＸＣＣＴＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　”τりτＣＣＡＣＸ　ＧＪ％Ａ 　ＣｔヱτλＣＧｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａ ｌａ　Ｃｙｓ　Ｖａｎ　１００ＣＡＧ　ＣＡｊ　Ｃ’ｌＣｆｉＪｔ’ｒ　ＡＡＣ Ｃ’ｆｆＧ　Ｃ−ＡＡ　ＧＣＡ　テＧ？　Ｇ１’ＧＬｅｕ　ｕｅｔ　Ａｓｈ　Ｇ ｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　１２０Ｃτ’Ｇ　Ａ ％　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣでＣＣＡＴＣＣ’Ｉ’Ｇ　ＧＣＴ　Ｇ冷ＡｒｇＬｙ ｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔ’ｎｒ　Ｌｅｕ　Ｘｙｒ　１ ３０ＡＣ−Ｇ　ＡＡＡ　ＴＡＣＴ’Ｉ’ＣＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＴＣＡＣＴ　Ｃ’ Ｉ’Ｔ　ＴＡ’ｌ’Ｌｅｕ　’Ｉ’ｎｒ　Ｇｌｕ　Ｌ７Ｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ｄ ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　１４０ＣＴＡ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡ Ａ　ＴＡＣＡＧＣＣＣＴ　ＴＧＴ　ＧＣＣ′Ｉ″ｒｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ 　Ａｒｇ　Ｊｕａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍ、ｅｔ　Ａｒｇ　１５０りＧＧ　ＧＡＧ 　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＡテＣＡ’Ｉ’Ｇ　ＡＧＡＳｅｒ　 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐ’ａｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ 　１６０ＴＣＣＣＴＣＴＣＴ　？ＴＴ　ＴｃＡ　ＡＣＡ　ＡＪｉＣＴＴＧ　ＣＡ Ａ　ＡＡＡＡｒｇＬｅｕ　ＡｒｇＡｒｇＬｙｓ　ＡｓｐＡＧＡ　ＴＴＡ　ＡＧＧ 　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＧＡτりＧＡ本発明は又新規シュードモナスＳｐ’、３１　 （ｐＶＮ２２）菌株−上記組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２を含有するヒト 白血球インターフェロンα−１１の生産体にも関する。シュードモナス族のｗＪ 茜中にＭｉ換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２を導入することによる遺伝子工学 の方法によって製造された本発明の方法による菌株は、全連邦抗生物質研究所の 微生物培養物の収集機関に１９８６年２月４日に受託番号１７８８Ａで寄託され た。

合成が誘発性プロモーターによりコントロールされる公知のプラスミドｐＬｅｌ Ｆ−ｒＬとは対照的に本発明によるプラスミドｐ　Ｖ　Ｎ　２２においてはイン ターフェロンα−工１の合成は発酵プロセスを単純化するファージψＸ１７４の 遺伝子りの構成プロモーターによりコントロールされる。広いスペクトルの宿主 を有するプラスミドｐＡＹＣ３７［チガンコフＹ、Ｄ、　（Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ 　Ｙ、Ｄ、）、チストセルドフＡ、Ｙ、　（Ｃｈｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖ　Ａ、Ｙ 、）、プラスミド１、Ｙ、　（Ｐｌａｓｏｉｄ　１．Ｙ、）　、１１８−１２５ ．１９８５）のベクターとしての使用は、公知のプラスミドの製造に用いられる より安定性の低いベクターｐＢＲ３２２と対照的に、それに基づいて製造される 本発明による組換えプラスミドｐＶＮ２２の安定性を増大させる。本発明による プラスミドｐＶＮ２２は、培養培地に対して抗生物質の添加なしでも各種菌株内 に安定に維持されるのに対し、ｐＢＲ３２２に基づいて製造された従来技術のプ ラスミドｐＬｅｌＦ−ｒＬはむしろその様な条件下においては迅速に除去される 。本発明による菌株シュードモナスｓ　ｐ、３１　（ｐＶＮ２２）の生産体とし テノ使用は、インターフェロンα−１１の活性を０．７〜２．５×１０９ＭＵ／ 培養液ｇまで増大させることを可能にする。

インターフェロンα−１１の合成のための本発明による菌株の使用は、発酵プロ セス時の食細胞溶解の可能性を相当に低下させる。更に、本発明による菌株はＥ 、コリの菌株とは対照的に、条件によって病原体となる微生物ではない。従って 、本発明の使用は、単純な製造プロセスによりヒト白血球インターフェロンα− １１を高収率で得ることを可能にする。

発明を実施するための最良の形態 本発明による組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２の創製方法は次の工程から成 る。

グラム−陰性細菌内に維持されることのできるプラスミドベクターｐＡＹＣ３７ は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩによって切断され、ファージφｘ１７ ４の遺伝子りのプロモーターのコントロール下にある、インターフェロンα−■ １の遺伝子がその中に位置する、１、４ｔ、ｐ、ｂ、の大きさを有するＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏｒＩ断片がＤＮＡ−リガーゼによって導入される。

上記１．４ｔ、ｐ、ｂ、の大きさのＨｉｎｄＩＩ［−Ｅｃｏｒｌ断片は次の単位 により構成されるニ ーファージψＸ１７４の遺伝子りの調節分封及びインターフェロンαの遺伝子の 第１コドンを有する０、２５ｔ、ｐ、ｂ、の大きさのＤＮＡ断片、 −０，５ｔ、ｐ、ｂ、の大きさのインターフェロンα−１１の遺伝子、 −０、６５Ｌ、ｐ、ｂ、の大きさのヒトゲノムＤＮＡの領域；上記プラスミド組 換えＤＮＡは次の遺伝子マーカーを有するニアンピシリンに対して耐性を保障す る遺伝子ＡｐＲ、ストレプトマイシンに対して耐性を保障する遺伝子ＳｍＲ；そ れは次の制限酵素認識の独特の部位を有する：Ｈｉｎｄｍ−０、Ｅ　ｃ　ｏ　ｒ 　Ｉ　−１，４ｔ、ｐ、ｂ、、Ｂ　ａ　ｍＨＩ　−１０，８２ｔ、ｐ、ｂ、。

得られた組換えプラミドは形質転換によりＥ、コリに８０２及びＣ６００などの 異種のＥ、コリ菌株中に導入される。形質転換体の選択はそれらの中のアンピシ リン及びストレプトマイシンに対する耐性の出現に従って行われ、この場合の遺 伝子ＳｍＲはファージφ×１７４の遺伝子りのプロモーターから転写される。そ の様な形質転換体は生物学的活性を相当な量で有するインターフェロンα−１１ を合成する。この様にしてｐＶＮ２２と称されるプラスミドを含有する菌株Ｅ、 コリＣ６００が得られた。菌株Ｅ、コリＣ６００（ｐＶＮ２２）はインターフェ ロンα−１１を１×１０８ＭＵ／ｇまでの活性をもって合成する。プラスミドｐ ＶＮ２２は接合性プラスミドによる動員転移が可能である。ｐＶＮ２２の動員の ためにトリメタブリムに対する耐性を保障するプラスミドＲ７５１が複合化１． ：、にりＥ、：ＩＩＪＣ６００（ｐＶＮ２２）菌株中に導入される。その後Ｅ、 コリＣ６００（ｐＶＮ２２、Ｒ７５１）　及ＣＦ　シュ）’　％　すＸ　ｓ　ｐ 　。

３１間に極間複合化が行われる。細菌の混合物がアンピシリン、ストレプトマイ シン、及びアミノ酸スレオニンを含有する最小アダムス塩培地を有する皿中に接 種され、３０℃の温度で培養される。その様な条件下においては、供与体菌株Ｅ 、：１ｌＪＣ６００（Ｒ７５１、ｐ　ＶＮ　２２）の生育のためにはスレオニン に加えてロイシンも又必要であるのでシュードモナスｓｐ、３１　（Ｒ７５１、 ｐＶＮ２２）の細胞のみが生育する。更にもう一つの研究においては、プラスミ ドＲ７５１の存在は生産菌株に必要でないので菌株シェードモナスｓｐ、３１　 （ｐＶＮ２２）の存在する培地にはトリメタブリムは添加されない。

菌株シュートモｆ−スＳＴ）、３１　（ｐＶＮ２２）ｉ；Ｌ２．５×１０９ＭＵ ／培養液ｇ程度に高い高割合のインターフェロンα−１１の生合成を確実に行う 。

ヒト白血球インターフェロンα−１１を産生ずる本発明Ｉ：−ヨルＷＭ株シュー 　Ｆモナスｓ　ｐ、３１　（ｐ　ＶＮ　２２）は次の特徴によって特性化される 。

形態学的特徴。３〜５μ長の画形の直線状細胞、グラム−陰性、非−胞子形成。

培養特徴。細胞は単純栄養培地上で良く生育する。

２５〜３０℃の温度において肉−ペプトン寒天上での２４時間後の生育後に凹凸 エツジを有する大きいコロニー（３〜４ｍｍ直径）を形成し、表面は粗面であり 、薄縁色である。ホッティンガーブロス或いは液体培地Ｍ９上で生育時に均一な スライムが形成される。通気と共にホッティンガーブロス上で２４時間生育後に 培養物は薄縁色を帯び、ややオパールのような光を発するようになる。

生理学的及び生化学的特徴。シュードモナスｓｐ。

３１　（ｐＶＮ２２）ｃｉ’）細胞は１０〜３５℃の範囲の温度で生育し、最適 条件は６．７〜７．５のｐＨにおいて３０℃である。炭素源ニゲルコース、アラ ビノース。窒素源：アンモニウム塩、尿素；又アミノ酸、ペプトン、トリプトン なども用いられる。

抗生物質に対する耐性。シュードモナスｓｐ、３１（ｐＶＮ２２）の細胞は４０ ０〜５００　μｇ　／　ｍ　１のストレプトマイシン及び１５０〜２００μｇ　 ／　ｍ　１のアンピシリンに対して耐性を有する。

このプラスミドは、シュードモナスｓｐ、３１（ｐ　Ｖ　Ｎ　２２　）の細胞を アンピシリン及びストレプトマイシンを対応濃度でａｍする寒天培地上で６ｔ月 間維持ＬＪ：際１．’ｚニー　Ｆ％＋スｓ　ｐ、３１　（ｐ　ＶＮ　２２）菌株 内で安定であり、プラスミドの損失或いは再配列は見られなかった。

本発明をより良く理解するために、プラスミドＤＮＡｐＶＮ２２の創製及び本発 明による菌株の製法の態様を例示する以下の実施例を示す。

例　１ 本発明による組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２の創製のために以下の方式に 従ってプラスミドｐＡＹＣ３７及びプラスミドｐＶＮ６０９の断片を用いる。

二つの中間プラスミドｐＶＮ１９２及びｐＶＮ６１を予備調製し、その後プラス ミドｐＶＮ６０９の創製を行う。

プラスミドｐＶＮ１９２の創製操作は添附図面の第１図に図示する。

０．１μｇのプラスミドｐＵｃ１９のＤＮＡ及び１μｇのプラスミドｐＧＡ４６ を次の条件下に制限酵素Ｐｓｔｌ及びＨｉｎｄｍにより切断する：６ｍＭのＴｒ 　ｉ　５−ＨＣＬ　ｐＨ７，６，６ｍＭの２−メルカプトエタノール、及び５０ ｍＭ　ＮａＣ１，Ｐｓｔｌ−１活性単位、ＨｉｎｄＩＩＩ−１活性単位、反応混 合物容量は２０μｌである。反応を３７℃の温度で１時間行い、６５℃の温度で ２０分間加熱することにより停止する。

次いで得られた断片の連結を次の条件下においてファージＴ４のＤＮＡ−リガー ゼにより行う：６０ｍｋｉのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６，１０ｍ　Ｍ　Ｍ　 ｇ　ＣＩ　２．１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．４ｍＭのアデノシン トリリン酸、ＤＮＡ−リガーゼ−２活性単位、反応混合物容積−２５μｍ。連結 は１２〜１４℃の温度において９０分間行い、その後その様な混合物を形質転換 によりＥ、コリＪ　Ｍ　８３の細胞中に導入する。形質転換は次の様にして行う ：Ｅ、コリＪ　Ｍ　８３の一昼夜の培養物を液体培地ＬＢにより５００倍に稀釈 して細胞培養液につき０，４〜０．６単位の５５０ｎｍにおける光学密度を達成 するまで３７℃において通気下に培養し、その後細胞を水浴上で冷却し、引続く 操作を全て２〜４℃において行う；１０ｍ１の冷却細胞懸濁液を遠心分離し、上 澄液を完全に除去し、細胞を１０ｍ１の０．１ＭＣａ　Ｃ１２中に２〜４℃の温 度において懸濁させ、３０分間維持する−次いで細胞を遠心分離により集め、０ ．５ｍｌの０．１ＭのＣａ　Ｃ１２中に再懸濁させる；１００μｍのこの様にし て調製された細胞に連結後にＤＮＡの溶液２５μｍを添加する；０．１ＭＣａ　 Ｃ１２中の細胞懸濁液及び添加ＤＮＡ溶液を十分に混合し、２〜４℃の温度にお いて３０分間放置し、次いで４２℃の温度で４〜５分間加熱し、その後再び水浴 上に２０分間置く；次いで懸濁液を培地ＬＢで１０倍に稀釈し、３７℃の温度に おいてサーモスタット中に３０分間置＜；短時間後生前する５０〜１００μｌの 細胞懸濁液を選択培地を有する血中に接種する。プラスミドｐＵｃ１９上の断片 のクローニングの際に得られた形質転換体の選択時の選択培地は下記成分を含有 する：α−寒天、アンピシリン−１００μｇ／ｍｌ、イソプロピルチオガラクト シド−１０ｍＭ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−β−ガラクト シド−４０μｇ／ｍ１．非−着色コロニーを選択する。青色着色コロニーは連結 の結果としてもたらされたベクターｐＵｃ１９を有する。プラスミドＤＮＡはビ ルンボイム及びドリイ法により非−着色コロニーから回収され、認識単位ＢｇＩ ｎが出現するプラスミドが選択される。制限反応は前記方法と同様にして行われ 、その結果は、ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、０． １Ｍホウ酸、０．００２Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）中における１ ％アガロースゲル内でのＤＮＡの電気泳動、次いで長波長ＵＶスペクトル内での ＤＮＡの可視化を可能にするようにエチジウムブロマイドによるゲルの着色を行 って分析する。この様にして分析された全てのコロニーはその内部に認識単位Ｂ ｇ■を有するプラスミドＤＮＡＧａ有した。この様にして次の制限酵素の単一の 認識単位を含有するベクタープラスミドｐＶＮ１９２が得られた：Ｈｉｎｄｍ、 ＢｌｇＩＩ、Ｐｓｔｌ乃至ＥｃｏＲＩのＰｓｔ　（ｐＵｃ１９からのポリリンカ ー系列を含有する）。

次いでプラスミドｐＶＮ６１（第２図）の創製を行う。

３０μｇのプラスミドｐＴ１を次の条件下に制限酵素Ｈｉｎｄｍ及びＥｃｏＲＩ により切断する：ｔｍｋｉＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６，６ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　 ＣＩ　２．６　ｍ　Ｍの２−メルカプトエタノール及び５０　ｍ　Ｎ１ＮａＣ１ ；ＥｏｃＲ及びＨｉｎｄｍ−３０活性単位、拌しながら２時間行い、６５℃の温 度で２０分間加熱する二とにより停止する。ＤＮＡの切断の完全性は上記方法と 同様にして１％アガロースゲル内におけるＤＮＡの電気泳動によりチェックする 。チェック後、残存ＤＮＡを１９６アガロースゲル上に堆積し、断片を電気泳動 的に分割する。次いで必要な断片を電気溶出により得る。得られた断片を制限酵 素５ａｕ３Ａによる制限加水分解に付す。この目的のために酵素をインキュベー ション緩衝液により稀釈する。０．５ｍｇの純粋断片を含有する各試料中に０． １活性単位の５ａｕ３Ａを添加し、断片が部分的にのみ切断される時間が選ばれ る（インキュベーションは２分、４分、６分などと行う）。反応は試料を６８℃ の温度を有する水サーモスタット中に２０時間置くことにより停止する。切断の 完全性は、試料全体のたった１／４の容積のみの適用を可能にする超微細ゲル内 における電気泳動によりコントロールされる。得られた断片を制限酵素Ｂｇｍ及 びＥｃｏＲＩにより処理されたプラスミドｐＶＮ１９２中に組込む。この目的の ために、ｐＶＮ１９２（７）ＤＮＡ　（２／Ｊｇ）を次の条件下に制限酵素Ｂｇ ｌＩＩ及びＥｃｏＲＩにより切断する：１００ｍｍのＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩＳｐ Ｈ７，５，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＮａＣ１、ＥＣ０ＲＩ−２活性単位、Ｈｉｎｄｍ−２活性単位、Ｈ２Ｏ−３０μ ｍまで。反応は３７℃の温度において１時間行われ、試料を６５℃の湿度のサー モスタット内に置くことにより停止する。次いでファージＴ４のＤＮＡ−リガー ゼを用いて、Ｂｇｌｍ及びＥｃｏＲｌｌ、ニオ１．’テ切断されたＤＮＡ　ｐＶ Ｎ１９２と、５ａｕ３Ａにより切断されたｐｌＴＩからのＤＮＡ　ＨｉｎｄＩＩ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片との連結を行う。反応は前記と同様の方法により行い、ＤＮ Ａ含量は、０，１μｇのｐＶＮ１９２．０．４μｇのＤＮＡ断片、最終容ｆｆ１ ２０μｇである。得られた混合物を形質転換によりＥ、コリＪ　Ｍ２Ｓ中に導入 し、細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する寒天培地上に接種する。

インターフェロンの遺伝子の断片を有するクローンの探索はｉｎ　５１ｔｕハイ ブリダイゼーシヨン法により行う。

この目的のために、コロニーを０．４５μｍの口径のニトロセルロースフィルタ ー上で生育させる。次いでフィルター上のコロニーを溶解に付し、ハイブリダイ ゼーションをインターフェロンα−Ａの遺伝子の単位よりなる標識化Ｘ３２ｐプ ローブを用いて行う。これはインターフェロンα−Ａの遺伝子のＤＮＡがインタ ーフェロンα−ＩＩの遺伝子のそれと同様なヌクレオチド順序（系列）を有する ので可能である。ハイブリダズしているコロニーはラジオオートグラフィーによ り示される。プローブとハイブリダイズしたクローンからプラスミドＤＮＡを回 収し、制限分析によりこれらプラスミドか認識単位Ｂｇｌｎを含有することが示 される。この様にしてプラスミドｐＶＮ６１が得られる。次いでプラスミドｐＶ Ｎ６０９の創製を行う（第３図）。ファージψＸ１７４の遺伝子りのプロモータ ー、５−Ｄ −遺伝子りの系列、並びにＡＴＧ及びＴＧＴ−インターフェロンα−Ａの成熟遺 伝子のコドンを有する０、２５ｔ、ｐ、ｂ、の大きさのＤＮＡのＨｉｎｄＩｆｆ −８ａ　ｕ　３Ａ断片の０．１μｇを上記条件と同様な条件下に制限酵素Ｈｉｎ ｄｍ及びＢｇｌＩＩにより予め切断したＤＮＡ　ｐＶＮ６１　０．５ｔ１ｇと酵 素的に連結する。

次いで連絡から得られた混合物を形質転換によりＥ。

コリ３Ｍ８３中に導入し、インターフェロンα−１１の生物学的活性を形質転換 体中でめる。この様にしてＥ。

コリ細胞内にファージφ−１７４の遺伝子りのプロモーターの制御下に成熟イン ターフェロンα−１１の合成を確実に行うプラスミドｐＶＮ６０９を含有するク ローンを同定する。

次いで、プラスミドｐＶＮ２２の創製を行う（第４図）。０．２μｇのプラスミ ドｐＡＹＣ３７のＤＮＡ及び１μｇのプラスミドｐＶＮ６０９のＤＮＡを次の条 件下に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍを用いて切断する：６ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、、ｐＨ７，６，６ｍＭ５０ｍＭ　ＮａＣ】；ＥｃｏＲＩ−２活性単位 、ＨｉｎｄＩ［Ｉ−２活性単位；反応混合物の容ｆｆ１−３０μｌ。

反応は３７℃の温度で４０分間行い、６５℃の温度で１５分間加熱することによ り停止する。次いで得られた断片をファージＴ４のＤＮＡ−リガーゼを用いて連 結する。連結は１２〜１４℃の温度で１２０分間行い、その後混合物をＥ、コリ Ｃ６００中に形質転換により導入する。長時間の前生育（２，５時間）後の形質 転換細胞を選択マーカーとしてストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有 する寒天ＬＢ培地上に接種する。ベクタープラスミドｐＡＹＣ３７はストレプト マイシンに対しては耐性を有さないので減数分裂時にその様な培地上で形質転換 体を与えることができない。ストレプトマイシン耐性の発現を担うプロモーター はｐＡＹＣ３７中には不存在である。インターフェロンα−１１を有するブロモ −９−−含有断片をｐＶＮ６０９からｐＡＹＣ３７中にクローニングすると、ス トレプトマイシンに対する耐性の変形が生じ、それは必要とされるプラスミドを 含有するクローンの容品な選択を可能にする。その様なりローンからプラスミド ＤＮＡが回収され、プラスミド構造は上記と同様の条件下に制限酵素Ｈｉｎｄｌ ｌｒ及びＥｃｏＲＩによりチェックされる。得られた断片の分析は標準的Ｔｒｉ ｓ−ホウ酸緩衝波緩衝液中アガロースゲル中における電気泳動の後、ゲルのエチ ジウムブロマイドによる着色により行われる。この様にしてプラスミドｐＶＮ２ ２が同定された。

例　２ インターフェロンα−１１を産生ずる菌株シュードモナスｓ　ｐ、３１　（ｐＶ Ｎ２２）の調製は次の様にして行う。プラスミドｐＶＮ２２のシニードモナスｓ ｐ、３１中への導入のために、二つの逐次複合化を用いる。先ず第一に、菌株Ｅ 、コリＣ６００（ｐＶＮ２２）中にプラスミドＲ７５１を複合化により導入する 。プラスミドＲ７５１はトリメタブリムに対する耐性を保障する。

複合体の接種は次の成分を含有する最小寒天アダム塩培地上で行うニゲルコース ４　ｍｇ／　ｍ　１　ｓチアミン塩酸塩５μｇ／ｍｌ、スレオニン５０ｕｇ／ｍ ｌ、ロイシン５０μｇ／ｍｌ、アンピシリン７５μｇ／ｍｌ−ストレプトマイシ ン７５μｇ／ｍｌ、）リメタブリム（７５μｇ／ｍｌ）。これらの条件下におい てはＥ、コリＣ６００の複合体ノミカ生育ｔ６（Ｒ７５１、ｐＶＮ２２）。次い で複合化をＥ、コリＣ６００（Ｒ７５１、ｐＶＮ２２）とシュードモナスｓｐ、 ３１の間で欠損遺伝子ｔｈｒＡを用いて行う。これらの複合体は次の組成の最小 寒天塩培地上に生育するニゲルコース４　ｍｇ／　ｍ　１、チアミン塩酸塩５μ ｇ／ｍｌ、スレオニン５０μｇ／ｍｌ、アンピシリン７５μｇ／ｍｌ、ストレプ トマイシン２００μｇ／ｍｌ、　トリメタブリム７５ｔｔｇ／ｍｌ。

複合体の生育温度は３０℃である。Ｅ、コリＣ６００（Ｒ７５１、ｐ　’Ｊ　Ｎ 　２２　）の菌株−供与体はスレオニンに加えてロイシンも又必要とするので、 それはその様な培地上では生育しない。その結果、０．７〜２．５×１０９ＭＵ ／Ｉの活性を有するインターフェロンａ−１１の合成を確実にするプラスミドを 含有する菌株シュードモナスＳｐ、３］、（ｐＶＮ２２）が得られる。

例　３ 菌株シュードモナスＳｐ、３１　（ｐＶＮ２２）の培養を抗生物質アンピシリン （７５μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）を含有する斜面 寒天標準ホッティンガー培地上において２８℃の温度で１４時間生育させること により行う。プラスミドＲ７５１の存在はインターフェロンの産生に影響を及ぼ さないので、トリメタブリムは培地には添加されない。斜面培地上で生育された バイオマスを接種材料の調製に用いる。この目的のために、１００ｍ１の上記培 地を有するが、寒天は含まない７５０ｍ１の三角フラスコに菌株を移し、２８℃ の温度で振盪器内で撹拌（２４Ｏｒ、ｐ、ａ＋、）　Ｌ、なから数時間生育させ る。接種培養物の光学密度は５５０ｎｍにおいて約１〜２．５単位に等しくある べきである。

発酵は温度、ｐＨ，撹拌速度及び通気速度の制御系並びに溶存酸素の分圧のセン サーを付したファーメンタ−内で行う。接種培養物は上記培地を有するファーメ ンタ−内に５容量％の量で導入する。細胞はｐＨ−６，７〜６．９．２８±０． ５℃の温度において２〜４単位の光学密度（標準条件下）まで生育させる。この プロセスは激しい通気及び撹拌下に行う。通気及び撹拌条件は培養物の生育が溶 存酸素の濃度により制限されないように選ばれ、そのために酸素の分圧の値は飽 和濃度の５〜１０９６の割合に維持される。

ｐＨの安定化のために、アンモニア水が用いられる。

バイオマスの生育は培養培地の光学密度の変化によりコントロールされる。発酵 完了時にインターフェロンの活性は１．２×１０９ＭＵ／１）に等しい。

産業上の利用可能性 本発明によるヒト白血球インターフェロンα−ＩＩの生合成をコードする組換え プラスミドＤＮＡｐＶＮ２２は高活性を有するヒト白血球インターフェロンα− １１の菌株生産体の製造において有用である。

本発明による菌株シュードモナスｓｐ、３１　（ｐＶＮ２２）−α−１１−ヒト 白血球インターフェロンの生産体は他の公知の白血球インターフェロンと組合わ せて及び単独のいずれでも、医学実践において用いることのできるインターフェ ロンα−１１の製造のために微生物及Ｆｌ（ｊ、　Ｌｒ 手続補正書彷式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＳＵ　８７１０００５２ ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 フセソユーズヌイ、ナウチノー イスレドワーチェルスキー、インスチツート、（ブニーゲネチ力）　（ほか７名 ） ４、代　理　人　（郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 電話東京（２１１）２３２１大代表 国際調査報告　ＰＣＴ／Ｓυ８７１０００５２［株］・発　明　者　モナステイ ルスカヤ、カリナセルグーエフナ ○発明者　スペルドロフ、エフゲニー　ダビドウイツチ ［株］・発　明　者　ドルガノフ、グリゴリー　ミノ１イロウイツチ ＠発明者　ツアレフ、セルゲイ　アナトリエウイツチ ■ａｉＲ人　インスチツート　ビオオルガニチェスコイ　ヒミイイメーニ エム、エム、シエミアキナ　ア 力デミーナウク　ニスニスニス エル ソビエト連邦モスクワ、ウーリツツア、チェルタノフスカヤ、デー、２ｇＸ　コ ルプス、１、カーベー、１２６ソビエト連邦モスクワ、ウーリツツア、マトウエ ーフスカヤ、デー、１０、コルプス、４、カーベー、３５７ソビエト連邦モスク ワ、ウーリツツア、ミクルホーマクラヤ、デー、５１、コルプス、１、カーベー 、２４８ソビエト連邦モスクワ、ノボヤセネフスキー、プロスペクト、デー、１ ９．フルブス、４、カーベー、３２６ソビエト連邦モスクワ、ウーリツツア、ミ クルホーマクラヤ、デー、１６／１０

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト白血球インターフェロンα−１１の生合成をコードする組換えプラスミ ドＤＮＡ　ｐＶＮ２２であって、それが１０．８５ｔ．ｐ．ｂ．の大きさを有し 、下記単位により構成され： −ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−９，４５ｔ．ｐ．ｂの大きさを有するプラスミ ドｐＡＹＣ３７の断片、−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ−下記単位により構成さ れる１．４ｔ．ｐ．ｂ．の大きさの断片：−ファージφ×１７４の遺伝子Ｄの調 節分野、及びインターフェロンαの遺伝子の第１コドンを有する０．２５ｔ．ｐ ．ｂ．の大きさのＤＮＡの断片、−０．５ｔ．ｐ．ｂ．の大きさのインターフェ ロンα−Ｉ１の遺伝子、 −０．６５ｔ．ｐ．ｂ．の大きさのヒトゲノムＤＮＡの領域；該組換えプラスミ ドＤＮＡが次の遺伝子マーカーを有し；アンピシリンに対する耐性を保障するゲ ノムＡｐＲ、ストレプトマイシンに対する耐性を保障するゲノムＲＲ ＳｍＲ；次の制限酵素の認識の独特の領域を含有し：ＨｉｎｄＩＩＩ−０；Ｅｃ ｏＲＩ−１．４ｔ．ｐ．ｂ．、ＢａｍＨＩ−１０．８２ｔ．ｐ．ｂ．；全連邦抗 生物質研究所の微生物培養物の収集機関に寄託され、及び受託番号１７８８ＡＩ として登録されていることを特徴とする組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２。
2. ２．遺伝子工学の方法により組換えプラミスドＤＮＡ　ｐＶＮ２２をシュードモ ナス属の細菌中に導入することにより製造され、全連邦抗生物質研究所の微生物 培養物収集機関に１９８６年２月４日に寄託され受託番号１７８８Ａとして登録 された請求の範囲第１項記載の組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＶＮ２２を含有する ヒト白血球インターフェロンα−Ｉ１の生産体である菌株シュードモナスｓｐ． ３１（ｐＶＮ２２）。