FI65446C - Foerfarande foer framstaellning av en bakterie som innehaolleren foer insulin kodande nukleotidsekvens - Google Patents

Description

1 6S446

Menetelmä insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän bakteerin valmistamiseksi

Jakamalla erotettu hakemuksesta 781675 5 Tämä keksintö koskee menetelmää insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän bakteerin valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomais- 10 ta, että a) mRNA eristetään haimakudoksen saarekesoluista homogenoimalla ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi noin 4 mol/1 guanidiniumtiosyanaattia ja 0,05...1,0 mol/1 /J-mer- 15 kaptoetanolia sisältävää liuosta pH:ssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNA:n ribonukleaasihajoamista ei tapahdu, b) valmistetaan saadusta mRNA:sta sinänsä tunnetulla tavalla käänteistransskriptaasientsyymin avulla sellainen cDNA, jolla on insuliinia koodaava nukleotidisekvenssi, 20 ja mainittu cDNA muutetaan kaksisäikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistus-kohtasekvenssit saadun kaksisäikeisen cDNA:n päihin sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin restriktioendonukleaasina on sama entsyymi kuin seuraavassa kohdassa d), jonka jälkeen 25 cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, d) avataan bakteerin plasmidivektori restriktioendonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind III:n, Hsu I:n tai Eco Rl:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla esimerkiksi in- 30 kuboimalla pH:ssa 7,6 37°C:ssa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jolla on kohesiiviset päät, e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivek-torin 5'-fosfaattipääteryhmät käsittelemällä esimerkiksi alkalisella fosfataasilla pH:ssa 8,0 65°C:ssa 30 minuutin 35 ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset päät eivät 2 65446 voi liittyä toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plas-midivektori ja kohdassa c) saatu cDNA sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa, 5 esimerkiksi pH:ssa 7,6 14°C:ssa tunnin ajan, käyttäen plas-midivektorin moolista ylimäärää, ja g) sekoitetaan bakteeri, kuten E. coli-bakteeri, esimerkiksi E. coli X-1776, ja kohdassa f) saatu reaktiotuote, jotta saadaan insuliinia koodaavan nukleotidi-sekvenssin sisältävä bakteeri.

Tässä selityksessä käytetään seuraavia symboleja ja lyhenteitä: DNA - deoksiribonukleiinihappo 15 RNA - ribonukleiinihappo

cDNA - komplentaarinen DNA

(syntetisoitu entsymaattisesti mRNA-sekvenssistä) mRNA - lähetti-RNA tRNA - siirtäjä-RNA

20 dATP - deoksiadenosiinitrifosfaatti dTTP - deoksitymidiinitrifosfaatti dGTP - deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP - deoksisytidiinitrifosfaatti A - adeniini 25 T - tyrniini G - guaniini C - sytosiini

Tris - 2-amino-2-hydroksietyyli-1,3-propaanidioli EDTA - etyleenidiamiinitetraetikkahappo 30 ATP - adenosiinitrifosfaatti TTP - tymidiinitrifosfaatti 3 65446

Hind ΙΙΙ-tunnistuskohta -‘sekvenssi A AGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hind ΙΙΙ-endonukleaasin avulla Hsu I-tunnistuskohta - sekvenssi A IaGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hsu I-endonukleaasin avulla.

5 Hae ΙΙΙ-tunnistuskohta - sekvenssi GG Ice, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae ΙΙΙ-endonukleaasin avulla.

Col El - kolisiini El:ää muodostava plasmidi poly dA - polydeoksiadenylaatti 10 oligo fl^i2-i8 “ oligodeoksitymidylaatti (12-18 emästä)

Alu I-tunnistuskohta - sekvenssi AG ^CT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Alu I-endonukleaasin avulla.

BAm HI-tunnistuskohta - sekvenssi G |GATCC, spesifisesti 15 lohkaistu nuolen Bam HI - endonukleaasin avulla.

Bgl I-tunnistuskohta - sekvenssi GCCNNNN ^NGGC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Bgl I-endonukleaasin avulla (Huom: N tarkoittaa nukleotidia).

Eco Rl-tunnistuskohta - sekvenssi G ^AATTC, spesifisesti 20 lohkaistu nuolen kohdalla Eco RI-endonukleaasin avulla.

Eco RII-tunnistuskohta - sekvenssi icCAGG tai IcCTGG, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Eco RlI-endonukleaasin avulla.

Hae II-tunnistuskohta - sekvenssi AGCGcIt, AGCGC<tc, 25 GGCGC >It tai GGCGclc, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae II-endonukleaasin ävulla.

Hinc II-tunnistuskohta - sekvenssi GTTAAC, GTTGAC, GTCAAG tai GTCGAC, spesifisesti lohkaistu Hinc II-endonukleaasin avulla.

30 Pst I-tunnistuskohta - sekvenssi CTGCA^G, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Pst I-endonukleaasin avulla.

Sai I-tunnistuskohta - sekvenssi G jrTCGAC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sal I-endonukleaasin avulla.

4 65446

Sst I - tunnistuskohta - sekvenssi GAGCT^, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sst I-endonukleaasin avulla.

DNA:n emässekvenssin biologinen merkitys on siinä, että se on geneettisen informaation säilytyspaikka. On 5 tunnettua, että DNA:n emässekvenssi on koodi, jonka mukaisesti kaikkien solun valmistamien proteiinien aminohappojen järjestys määräytyy. Lisäksi sekvenssin osilla saattaa olla tehtävänä säädellä proteiinin valmistusajankohtaa ja määrää. Säätely-yksiköiden luonne tunnetaan vaillinaisesti. 10 Kunkin säikeen emässekvenssiä käytetään templaattina, kun DNA replikoituu solunjakaantumisessa.

Tapa, jolla DNA:n emässekvenssi-informaatiota käytetään proteiinien aminohappojärjestyksen määräämiseen, on pääpiirteiltään sama kaikilla elävillä organismeilla.

15 On osoitettu, että jokainen proteiineissa tavallisesti esiintyvä aminohappo määräytyy yhden tai useamman trinukleo-tidin eli triplettisekvenssin mukaan. Näin ollen jokaista proteiinia varten on olemassa vastaava DNA-segmentti, joka sisältää proteiinin aminohappojärjestystä vastaavan 20 triplettisekvenssin. Geneettinen koodi on esitetty seu-raavassa taulukossa.

Geneettinen koodi

Fenyylialaniini (Phe) TTK Histidiini (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJ

25 Isoleusiini (Ile) ATM Asparagiini (Asn) AAK

Metioniini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJ

Väliini (Vai) GTL Asparagiinihappo (Asp) GAK

Seriini (Ser) QRS Glutamiinihappo (Glu) CAJ

Proliini (Pro) CCL Kysteiini (Cys) TGK

30 Treoniini (Thr) ACL Tryptofaani (Try) TGG

Alaniini (Ala) GCL Arginiini (Arg) WGZ

Tyrosiini (Tyr) TAK Glysiini (Gly) GGL

Päätesignaali TAJ

Päätesignaali TGA

35 Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti tarkoittaa DNA:n trinukleotidia, jossa on 5’-pää vasemmalla ja 3 *-pää .5 65446 ' oikealla; kirjaimet edustavat puriini- ja pyrimidiiniemäk-siä, joista nukleotidisekvenssi muodostuu.

A = adeniini G = guaniini 5 C = sytosiini T = tyrniini

X = T tai C, jos Ϊ on A tai G X = G, jos Y on C tai T Y = A, G, C tai T, jos X on C 10 Y = A tai G, jos X on T

W = C tai A, jos Z on A tai G W = C, jos Z on C tai T Z = A, G, C tai T, jos W on C Z ® A tai G, jos W on A 15 QR = TC, jos S on A, G, C tai T

QR = AG, jos S on T tai C S = A, G, C tai T, jos QR, on TC S = T tai C, jos QR on AG J = A tai G 2 0 K = T tai C

L = A, T, C tai G M = A, C tai T

Transskriptioksi nimitetään ensimmäistä vaihetta siinä biologisessa prosessissa, jolla nukleotidisekvenssi-25 informaatio transformoidaanaminohapposekvenssiksi. Tässä vaiheessa kopioidaan ensin RNA:lla se DNA-segmentti, jonka sekvenssi määrittelee valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksi-riboosi on korvattu riboosilla ja tymiinin tilalla käyte-30 tään urasiilia. RNA:n emäkset voivat asettua samanlaisiksi emäspareiksi kuin DNA:n emäkset. Näin ollen DNA-nukleo-tidisekvenssin RNA-transskriptio on komplementaarinen kopioitavan sekvenssin kanssa. Tällainen RNA on nimeltään lähetti-RNA (mRNA), koska sen tehtävänä on toimia välittä- 6 65446 jänä solun geneettisen järjestelmän ja proteiineja syntetisoivan järjestelmän välillä.

Solun sisällä käytetään mRNA:ta templaattina siinä monimutkaisessa prosessissa, johon sisältyy lukuisia entsyy-5 mejä ja solujärjestelmiä, ja joka johtaa tietyn aminohapposekvenssin syntymiseen. Tätä prosessia nimitetään mRNA:n translaatioksi.

Usein esiintyy myös lisävaiheita, joissa translaatio-prosessissa syntetisoitu aminohapposekvenssi muunnetaan 10 funktionaaliseksi proteiiniksi. Insuliini on esimerkki tästä.

Insuliinin välitön prekursori on yksittäinen poly-peptidi, nimeltään proinsuliini, joka sisältää kaksi insuliiniketjua, A ja B, joita yhdistää peptidi C 15 Cks. Steiner, D.F., Cunningham, D., Spigelman, L. ja Aten, B. Science 157 , 697 (1967 )). Viimeaikaisen tiedon mukaan insuliinin mRNA:n alkuperäinen translaatiotuote ei ole proinsuliini vaan preproinsuliini, joka sisältää 20 lisäami-nohappoa proinsuliinin aminopäässä Cks. Cahn., S.J., 20 Keim, P. ja Steiner D.F., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73, 196H (1976) ja Lomedico, P.T. ja Saunders, G.F., Nucl.

Acids. Res. 3, 381 (197 6)). Preproinsuliinin rakenne voidaan esittää seuraavasti: NH2(pre-peptidi)-ketju B-(ketju O-ketju A-C00H.

25 Monet lääketieteen tai tutkimuksen kannalta merkit tävät proteiinit sijaitsevat korkeampien organismien, kuten selkärankaisten, soluissa tai ovat näiden solujen valmistamia. Näitä ovat mm. insuliinihormoni, muut peptidihor-monit, kuten kasvuhormoni, verenpainetta säätelevät hor-30 monit ja monet teollisesti, lääketieteellisesti tai tutkimuksellisesti merkittävät hormonit. Näitä proteiineja on usein vaikea eristää käyttökelpoisia määriä, ja tämä ongelma on varsin vaikea ihmisistä peräisin olevien proteiinien kohdalla. Näin ollen tarvitaan menetelmiä, 35 joilla tällaisia proteiineja voidaan valmistaa riittäviä määriä soluissa organismin ulkopuolella. Tietyissä tapauk- 7 65446 sissa on mahdollista saada aikaan sopivia solulinjoja, joita voidaan pitää elossa kudosviljelytekniikalla. Kudosviljely on kuitenkin hidasta, elatusaine kallista, olosuhteiden säätely tarkkaa ja saanto pieni. Lisäksi on usein vaikeata 5 säilyttää solulinja vakiona siten, että halutut erityisominaisuudet säilyvät.

Sitä vastoin mikro-organismeja, kuten bakteereja, on suhteellisen helppo viljellä kemiallisesti määritellyissä elatus-aineissa. Fermentointitekniikka on pitkälle kehittynyttä. Organis-mien viljeleminen nopeasti ja suurilla saannoilla on mahdollista. Lisäksi eräät mikro-organismit ovat·geeniensä ja ominaisuuksiensa puolesta perusteellisesti tutkittuja ja tunnettuja.

Näin ollen on erittäin toivottavaa pystyä siirtämään lääketieteellisesti merkittävän proteiinin.geneettinen koodi organismis-ta, joka tavallisesti tekee proteiinin,, sopivaan mikro-organismiin. Tällä tavalla mikro-organismi voi syntetisoida proteiinia säädellyissä kasvuolosuhteissa ja'proteiinia voidaan'., saada haluttu, määrä. Valmistuskustannuksia voidaan ehkä myös oleellisesti pienentää, jos proteiinia syntetisoidaan tällaisella menetelmällä. Lisäksi, mahdollisuus 2Q eristää ja siirtää tietyn proteiinin valmistuksen määrittelevä geneettinen sekvenssi mikro-organismiin, jonka geneettinen tausta ·» tunnetaan hyvin, tarjoaa suuriarvoisen tutkimuskeinon, kun halutaan tietää, kuinka tämän proteiinin synteesi on säädelty ja kuinka proteiinia muokataan synteesin jälkeen. Geneettisiä sekvenssejä voidaan. 23 myös transformoida niin, että saadaan terapeuttisilta, tai funktionaalisilta ominaisuuksiltaan muuntuneita proteiineja.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä on monivaiheinen menetelmä, joka sisältää entsyymien katalysoimia reaktioita. Näiden entsyymi-3Q reaktioiden luonnetta selostetaan tähän mennessä tiedossa olevien seikkojen perusteella.

Käänteistransskriptaasi (DNA-polymeraasi) katalysoi RNA-templaattisäikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesiä RNA-templaatin, DNA-templaatin ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin, 33 dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, läsnäollessa. Reaktio lähtee käyntiin DNA-templaatin ei-kovalenttisella sitoutumisella mRNA:n 3'-päähän ja sen jälkeen seuraa tarvittavien deoksinukleotidien asteittainen liittäminen kasvavan ketjun 3r-päähän mRNA-nukleotidisekvenssin 8 65446 määritteleminä emäspareina. Saatua molekyyliä voidaan pitää hiusneularakenteena, joka sisältää alkuperäisen RNA:n liittyneenä yksittäise?.lä DNA-säikeellä komplementaariseen DNA-säikeeseen. Käänteistransskriptaasi kykenee myös kata-5 lysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä DNA-templaattia, jolloin saatu tuote on kaksisäikeinen DNA-hiusneula, jonka toisessa päässä säikeitä yhdistää yksisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972) ja Efstratiadis, A., Kafatos, 10 F.C., Maxam, A.F. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).

Restriktioendonukleaasit ovat entsyymejä, jotka pystyvät hydrolysoimaan fosfodiesterisidoksia kaksisäikeises-sä DNArssa niin, että DNA-säikeeseen muodostuu katkoskohta. Jos DNA on suljetun silmukan muotoinen, silmukan rakenne 15 muuttuu lineaariseksi. Tämän tyyppisen entsyymin pääasiallinen ominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tätä sekvenssiä nimitetään restriktio-endonukleaasin tunnistuskohdaksi. Restriktioendonukle 20 aaseja on eristetty useista eri lähteistä ja karakterisoitu tunnistuskohtiefJTSa nukleotidisekvenssin perusteella. Eräät restriktioendonukleaasit hydrolysoivat fosfodiesteri-sidokset samasta kohdasta kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää. Eräät katalysoivat sellaisten sidosten 25 hydrolyysiä, joita erottaa toisistaan muutama nukleotidi, ja molekyylin kumpaankin päähän syntyy vapaa yksisäikeinen alue. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itsekomplementaa-risia ja siten kohesiivisia, ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenliittämiseen. Koska tietyn 30 entsyymin voidaan ennustaa pilkkovan saman tunnistuskoh-dan omaavia DNA-molekyylejä, syntyy samat kohesiiviset päät, ja näin ollen on mahdollista yhdistää restriktio-endonukleaasilla käsiteltyjä heterologisia DNA-sekvensseja muihin samalla tavalla käsiteltyihin sekvensseihin, ks.

35 Roberts, R.J. Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Restrik- tiokohdat ovat kuitenkin melko harvinaisia, mutta restriktio- 9 65446 endonukleaasien käyttökelpoisuutta on voitu parantaa syntetisoimalla sellaisia kaksisäikeisiä oligonukleotideja, joissa on tunnistuskohtasekvenssi. . Näin ollen voidaan melkeinpä mikä tahansa DNA-segmentti liittää mihin tahansa 5 toiseen segmenttiin siten, että molekyylin päihin liitetään tarvittava restriktio-oligonukleotidi, tuote asetetaan tarvittavan restriktioendonukleaasin vaikutukselle alttiiksi,niin että syntyy tarvittavat kohesiiviset päät (ks. Heyneker, H.L., Shine, J., Goodman, H.H., Boyer, H.W., 10 Rosenberg, J., Dickerson, R.E., Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. ja Riggs, A.D., Nature 263, 748 (1976) ja Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H. W., Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 ( 1977)).

Sl-endonukleaasi on yleisentsyymi, joka kykenee 15 hydrolysoimaan yksisäikeisen DNA:n fosfodiesterisidoksia tai kaksisäikeisessä DNA:ssa olevia yksisäikeisiä liitoskohtia, ks. Vogt, V.M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).

DNA-ligaasi on entsyymi, joka kykenee katalysoimaan fosfodiesterisidoksen syntymisen kahden sellaisen DNA-seg-20 mentin välille, joissa on 5'-fosfaatti ja 31-hydroksyyli, vastaavasti, ja jollainen saattaa muodostua kahdesta DNA-fragmentista, joita kohesiiviset päät pitävät yhdessä. Entsyymin normaalina toimintatapana pidetään sitä, että se yhdistää toisen säikeen rinnalle syntyvät useat tytär-DNA-25 fragmentit toisiinsa. DNA-ligaasi voi kuitenkin sopivissa olosuhteissa katalysoida sellaisten tylppien päiden yhtymisen, joissa kaksi tylppäpäistä molekyyliä yhtyy kovalent-tisesti( ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Nat 1. Acad. Sei. USA 67 , 1468 (1970)).

30 Alkalinen fosfataasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan fosfaattiestereitä, DNA:n 5'-päätefosfaatit mukaanluettuina.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän osavaiheessa sijoitetaan tietty DNA-fragmentti DNA-vektoriin, kuten 35 plasmidiin. Plasmidi on nimitys, jota käytetään mistä tahansa itsenäisesti replikoituvasta DNA-yksiköstä, joka on 10 65446 mikrobisolussa eikä kuulu isäntäsolun omaan genomiin. Plas-midi ei ole geneettisesti sitoutunut isäntäsolun kromosomiin. Plasmidi-DNA esiintyy rengasmaisina kaksisäikeisinä molekyyleinä, joiden molekyylipaino tavallisesti on muutama g 5 miljoona, joidenkin jopa yli 10 , ja ne edustavat tavallisesti vain pientä prosenttimäärää solun kokonais-DNA:sta. Plasmidi-DNA voidaan tavallisesti suuren kokoeronsa vuoksi erottaa isäntäsolun DNA:sta. Plasmidit voivat replikoitua isäntäsolun jakaantumisnopeudesta riippumatta ja joskus nii-10 den jakaantumisnopeutta voidaan säädellä kasvuolosuhteita muuttamalla. Vaikka plasmidi esiintyykin suljettuna renkaana, siihen voidaan keinotekoisesti liittää DNA-segmentti niin, että syntyy molekyylipainoltaan suurempi rekombinoitu plasmidi, jonka replikoitumiskyky ja geenien ekspressiokyky 15 eivät ole oleellisesti muuttuneet. Näin ollen plasmidi toimii hyödyllisenä vektorina, joka siirtää DNA-segraentin uuteen isäntäsoluun. Rekombinoitua DNA:ta käyttävään teknologiaan soveltuvia plasmideja ovat varsinkin sellaiset, jotka sisältävät valintatarkoituksiin sopivia geenejä, kuten geenejä, 20 jotka aiheuttavat lääkeaineiden vastustuskykyä.

Tämän keksinnön käytännöllisen toteutustavan valaisemiseksi selostetaan rotan insuliinigeenin eristäminen ja siirto yksityiskohtaisesti. Alaan perehtyneet pystyvät selostetun menetelmän avulla eristämään insuliinigeenin 25 organismista, ihminen mukaanluettuna.

Insuliini eristettiin ensimmäisen kerran vuonna 1922. 30 Nykyisin tämän hormonin käyttö sokeritaudin hoidossa tunnetaan hyvin. Vaikka teurastamoilta tulevat naudan ja sian haimat ovat insuliinilähteitä, tästä hormonista tulee 30 olemaan pulaa, koska diabeetikkojen määrä maailmassa kasvaa.

Lisäksi joillakin diabeetikoilla kehittyy haitallinen aller-35 gia naudan ja sian insuliinille. Siksi on erittäin toivottavaa pystyä tuottamaan riittävästi ihmisen insu- 11 65446 liinia maailmanlaajuista tarvetta tyydyttämään. Jos ihmisen insuliinia voitaisiin tuottaa bakteerien avulla, tämä päämäärä olisi saavutettavissa. Tämän keksinnön tekemiseen asti on päämäärän saavuttamista kuitenkin vaikeuttanut 5 se, että ei ole ollut olemassa menetelmää, jolla insuliini-geeni voitaisiin siirtää bakteereihin. Tämä keksintö sisältää kyseisen menetelmän.

Kun kyetään saamaan aikaan tietyn sekvenssin omaava DNA, jonka geneettinen koodi vastaa tiettyä proteiinia, 10 on mahdollista kemiallisin tai biologisin keinoin muuntaa nukleotidisekvenssiä niin, että lopuksi saatu spesifinen proteiini on myös modifioitu. Tämä antaisi esimerkiksi mahdollisuuden valmistaa modifioitua insuliinia, joka sopisi tiettyyn lääketieteelliseen tarkoitukseen. Näin ollen 15 mikro-organismille voidaan antaa sellainen geneettinen kapasiteetti, että se kykenee valmistamaan insuliinityyp-pisen aminohapposekvenssin, jolla on insuliinin oleelliset ominaisuudet. Samaa voidaan ajatella kasvuhormoneista.

Kyky siirtää tietyn korkeamman organismin normaa-20 lille aineenvaihdunnalle välttämättömän proteiinin geneettinen koodi mikro-organismiin, kuten bakteeriin, avaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien tuottamiselle viljelemällä. Tämä taas tarjoaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien määrän lisäämiselle tai 25 korvaamiselle sellaisilla proteiineilla, jotka on valmistettu transformoiduilla mikro-organismeilla, kun korkeamman organismin kyky tuottaa tällaisia proteiineja on puutteellinen ja voidaan ajatella esimerkiksi mahdollisuutta saada aikaan symbioottinen suhde tämän keksinnön avulla valmistetun 30 mikro-organismin ja kroonista tai äkillistä puutostautia sairastavan ihmisen välille, jolloin tässä selostetulla tavalla geneettisesti muunnettu mikro-organismi siirros-tettaisiin tai muulla tavalla liitettäisiin ihmiseen kompensoimaan ihmisen aineenvaihdunnassa ilmenevää patologista 35 puutteellisuutta.

12 65446

Esimerkkeinä tähän keksintöön kuuluvista spesifisistä DNA-sekvensseistä siirretään rotan preproinsuliinin raken-negeeni bakteeriin. Näin ollen voidaan ajatella, että menetelmää voidaan hyvin soveltaa minkä tahansa korkeammalta 5 organismilta, kuten selkärankaiselta, otetun DNA-sekvenssin siirtämiseen bakteeri-isäntään. Tässä yhteydessä korkeampi organismi määritellään miksi tahansa erilaistuneita kudoksia sisältäväksi eukaryoottiseksi organismiksi, joihin kuuluvat mm. hyönteiset, nilviäiset, kasvit ja selkärankaiset, 10 nisäkkäät mukaanluettuina, joihin puolestaa kuuluvat nautaeläimet, siat, kädelliset ja ihminen.

Kyseisessä prosessissa haluttu solukko eristetään ensin parannetulla menetelmällä. mRNA eristetään soluista muuttumattomana uudella menetelmällä, jossa RNA-aasi-15 aktiivisuus on käytännöllisesti katsoen kokonaan hävitetty. Vahingoittumaton mRNA puhdistetaan uutteesta pylväs-kromatografisesti ja se saatetaan käänteistransskriptaasi-entsyymin vaikutukselle alttiiksi komplementaarisen säikeen (cDNA) syntetisoimisessa tarvittavien neljän 20 deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Tässä ensim mäisessä vaiheessa käänteistransskriptaasin avulla saatuun tuotteeseen kohdistetaan menettely, jolla ribonukleotidi-sekvenssi poistetaan selektiivisesti. Jäljelle jäänyttä deoksinukleotidisekvenssiä, joka on komplementaarinen al-25 kuperäisen mRNA:n kanssa, inkuboidaan toisessa reaktiossa käänteistransskriptaasin eli DNA-polymeraasin kanssa neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Saatu tuote on kaksinkertainen cDNA, jonka komplementaariset säikeet ovat liittyneet toisiinsa yksinkertaisella säikeellä toi-30 sesta päästä. Siten tämä tuote käsitellään yksinkertaiselle 13 65446 säikeelle spesifisellä nukleaasilla, joka katkaisee yksinkertaisen yhdistävän säikeen. Saatua kaksisäikeistä cDNA:ta pidennetään lisäämällä kumpaankin päähän tietty DNA, joka sisältää restriktioentsvvmin tunnistuskohtasekvenssin.

5 Lisäys katalysoidaan DNA-ligaasi-entsyymillä. Tämän jälkeen pidennetty cDNA käsitellään restriktioendonukleaasilla, joka tuottaa itsekomplementoituvat yksisäikeiset päät kaksois-säikeen kummankin säikeen 5'-päähän.

Plasmidi-DNA, jossa on saman restriktioendonukleaasin 10 tunnistuskohta, käsitellään entsyymillä siten, että polynukleotidisäie katkeaa ja muodostuu itsekomplementoituvat yksisäikeiset nukleotidisekvenssit 5'-päihin. Yksisäi-keisten päiden 51-päätefosfaattiryhmät poistetaan, jotta plasmidi ei pystyisi muodostamaan isäntäsolua transformoi-15 vaa rengasrakennetta. Valmistettua cDNA:ta ja plasmidi-DNA:ta inkuboidaan yhdessä DNA-ligaasin läsnäollessa. Kuvatuissa reaktio-olosuhteissa voi elinkelpoinen suljettu rengasplasmidi-DNA syntyä vain, jos siihen sisältyy cDNA-seg-mentti. cDNA-sekvenssin sisältävä plasmidi siirretään tä-20 män jälkeen sopivaan isäntäsoluun. Sellaiset solut, jotka ovat saaneet elinkelpoisen plasmidin, tunnistetaan kasvatuksessa pesäkkeistä, joilla on plasmidille kuuluva geneettinen ominaisuus, kuten lääkkeenvastustuskyky. Tämän jälkeen viljellään niitä puhtaita bakteerikantoja, joissa on cDNA-25 sekvenssin sisältävä rekombinoitu plasmidi, ja rekombinoitu plasmidi eristetään uudelleen. Tällä tavalla voidaan valmistaa suuria määriä rekombinoitua plasmidi-DNA:ta ja spesifinen cDNA-sekvenssi voidaan eristää tästä endonukleolyyt- tisellä lohkaisulla sopivan restriktioentsyymin· avulla.

14 65446 Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla tietyn nukleo-tidisekvenssin omaava DNA-molekyyli voidaan eristää ja siirtää mikro-organismiin ja alkuperäinen DNA:n nukleotidisek-venssi löytää replikoitumisen jälkeen organismista, ja jon-5 kan menetelmän eri vaiheet voidaan jakaa neljään ryhmään: 1. Halutun solukon eristäminen korkeammasta organismista

Tietyn proteiinin geneettiselle koodille on olemassa kaksi mahdollista lähdettä, nimittäin lähdeorganismin DNA 10 tai DNA:n RNA-transskriptio. Yhdysvaltain kansallisten ter-veysinstituuttien (National Intitutes of Health) tämänhetkisten turvallisuusvaatimusten mukaan ihmisen geenejä, olivatpa ne millaisia tahansa, voidaan sijoittaa rekombinoituun DNA:han ja sen jälkeen bakteereihin vain silloin, kun geenit 15 ovat perusteellisesti puhdistettuja, tai kun käytössä on erityisen suuria riskejä sisältävälle työskentelylle tarkoitetut tilat (P4), ks. Federal Register, Voi. 41, No. 131, 1967-07-07, ss. 27902 - 27943. Näin ollen millä tahansa ihmisen proteiinin valmistukseen tähtäävällä menetelmällä, 20 kuten tämän keksinnön sisältämällä menetelmällä, on lähdettävä sellaisen spesifisen mRNA:n eristämisestä, joka sisältää halutun proteiinin koodin. Tässä toimintatavassa on lisäksi se etu, että solusta uutettu mRNA voidaan puhdistaa helpommin kuin solusta uutettu DNA. Varsinkin on mahdollista 25 käyttää hyväkseen sitä seikkaa, että pitkälle erikoistuneissa organismeissa, kuten selkärankaisissa, on tietyissä paikoissa tiettyjä solukkoja, joiden tehtävänä on tuottaa jotakin kyseeseen tulevaa proteiinia. Vaihtoehtoisesti tällainen solukko voi esiintyä jossakin organismin kehitysvaiheessa.

30 Suurin osa tällaisen solukon soluista eristetystä mRNA:sta sisältää halutun nukleotidisekvenssin. Näin ollen eristettävän solukon ja eristysmenetelmän valinnassa voidaan ottaa huomioon ne edut, joita eristettävän mRNA:n alkuperäinen puhtausaste tarjoaa.

15 65446

Useimmissa kudoksissa, rauhasissa ja elimissä soluja yhdistää kuituinen sidekudos, joka on koostunut pääasiassa kollageenista, mutta voi kudoksesta riippuen sisältää myös muita rakenneproteiineja, polysakkarideja ja kivennäisaine-5 varastoja. Solujen eristäminen tietystä kudoksesta edellyttää menetelmiä, joilla solut voidaan irrottaa sidekudoksesta. Tietyn erikoistuneen solutyypin eristäminen ja puhdistaminen sisältää näin ollen kaksi päävaihetta, jotka ovat solujen erottaminen sidekudoksesta ja halutun solutyypin erottaminen 10 muun tyyppisistä kudoksen soluista. Esimerkkinä selostetaan menetelmä, jolla voidaan eristää haiman Lagerhansin saarekkeet, jotka sopivat insuliinin mRNA-koodin eristämiseen.

Insuliinia tuottavia soluja voidaan johtaa muistakin lähteistä, kuten sikiöasteella olevan vasikan haimasta tai 15 viljellyistä saarekekasvainsoluista. Puhtaiden saarekesolujen eristäminen on tällöin paljon yksinkertaisempaa, varsinkin jos käytetään puhtaita soluviljelmiä. Edellä selostettua saarekesolujen eristämismenetelmää ei tällöin tarvittaisi, mutta se on kuitenkin edullinen menetelmä yleisen käyttökelpoi-20 suutensa vuoksi.

Usein on todettu, että halutun mRNA:n osuutta voidaan lisätä käyttämällä hyväksi solun kykyä reagoida ulkoisiin ärsykkeisiin. Esimerkiksi hormonikäsittely saattaa aiheuttaa halutun mRNA:n tuotannon lisääntymisen. Muita menetelmiä 25 ovat kasvatus tietyssä lämpötilassa ja/tai tietyssä ravinteessa tai muussa kemiallisessa aineessa.

2. mRNA:n uuttaminen Tärkeä piirre tässä keksinnössä on se, että solu-uutteesta poistetaan RN-aasiaktiivisuus käytännöllisesti katsoen 30 kokonaan. Uutettava mRNA on yksisäikeinen polynukleotidi, jossa ei ole mitään komplementaarista säiettä. Näin ollen yhdenkin fosfodiesterisidoksen hydrolyyttinen katkeaminen sekvenssissä tekisi koko molekyylin kykenemättömäksi siirtämään vahingoittumatonta geneettistä sekvenssiä mikro-organismiin.

16 6544 6

Kuten edellä mainittiin, RN-aasi on laajalle levinnyt, ja se on hyvin aktiivinen ja poikkeuksellisen pysyvä. Sitä on iholla, se kestää tavalliset lasitavaroiden pesumenetelmät ja joskus se kontaminoi orgaaniset kemikaalit. Haimasolu-uuttei-5 ta käsiteltäessä vaikeudet ovat erittäin suuret, sillä haima tuottaa ruuansulatusentsyymejä ja on siten hyvin RN-aasipi-toinen. RN-aasiepäpuhtaus koskee kuitenkin kaikkia kudoksia ja tässä selostettua RN-aasiaktiivisuuden tuhoamismenetelmää voidaan soveltaa kaikkiin soluihin. Menetelmän poikkeukselle» linen tehokkuus esitetään muuttumattoman mRNArn eristämisessä haiman saarekesoluista.

Tässä keksinnössä käytetään kaotrooppisen anionin, kaotrooppisen kationin ja disulfidisidoksia pilkkovan reagens-sin yhdistelmää solujen rikkomisen aikana ja kaikkien niiden 15 operaatioiden aikana, jotka tarvitaan käytännöllisesti katsoen proteiinittoman mRNA:n aikaansaamiseksi. Edellä mainittujen reagenssien yhteisvaikutuksen tehokkuus on todettu käytännössä eristämällä käytännöllisesti katsoen vahingoittumaton mRNA hyvällä saannolla rotan haimasta eristetyistä Langerhansin 20 saarekkeista.

Sopivien kaotrooppisten ionien valinta riippuu niiden vesiliukoisuudesta ja saatavuudesta. Sopivia kaotrooppi-sia kationeja ovat mm. guanidinium, karbamoyyliguanidinium, guanyyliguanidinium, litium tms. Sopivia kaotrooppisia an-25 ioneja ovat mm. jodidi, perkloraatti, tiosyanaatti, dijodi-salisylaatti tms. Tällaisten anionien ja kationien muodostamien suolojen suhteellinen tehokkuus määräytyy niiden liukoisuuden mukaan. Esimerkiksi litiumdijodisalisylaatti on voimakkaampi denaturantti kuin guanidiniumtiosyanaatti, mutta 30 sen liukenevuus on vain noin 0,1 M ja se on myös suhteellisen kallista. Guanidiniumtiosyanaatti on etusijalle asetettava kationi-anioniyhdistelmä, koska sitä on helposti saatavissa ja sen liukenevuus vesiliuoksiin on hyvä, jopa noin 5 mol/1.

Tioliyhdisteiden, kuten /S-merkaptoetanolin, tiede-35 tään rikkovan tioli-disulfidivaihtoreaktiolla proteiinien molekyylinsisäisiä disulfidisidoksia. /S-merkaptoetanolin 17 65446 lisäksi tunnetaan useita sopivia tioliyhdisteitä, kuten di-tiotreitoli, kysteiini, propanolidimerkaptaani tms. Vesiliukoisuus on tarpeellinen vaatimus, sillä tioliyhdistettä pitää olla läsnä suuri ylimäärä molekyylinsisäisiin disul-5 fideihin verrattuna, jotta vaihtoreaktio tapahtuisi käytännöllisesti katsoen täydellisesti ,/$-merkaptoetanoli on asetettava etusijalle, koska sitä on helposti saatavissa kohtuulliseen hintaan.

Tietyn kaotrooppisen suolan tehokkuus on suoraan ver-10 rannollinen sen väkevyyteen, kun halutaan inhiboida RN-aasi uutettaessa RNA:ta soluista tai kudoksista. Edullinen väkevyys on sen vuoksi suurin käytännössä toteutettavissa oleva väkevyys. Sen, että tässä keksinnössä onnistutaan säilyttämään mRNA vahingoittumattomana uuton aikana, arvellaan joh-15 tuvan siitä nopeudesta, jolla RN-aasi denaturoituu, ja denatu-roitumisasteestä. Näin ilmeisesti selittyy guanidiniumtiosya-naatin paremmuus hydrokloridiin nähden, vaikka hydrokloridi on denaturointiaineena vain hieman heikompi. Denaturointiai-neen tehokkuus määritellään siksi kynnysväkevyydeksi, joka 2o tarvitaan proteiinin täydelliseen denaturoimiseen. Toisaalta proteiinin denaturoitumisnopeus riippuu usein denaturantin väkevyyden suhteesta kynnysarvoon 5-10 potenssiin korotettuna, ks. Tanford, C. A., Adv. Prot. Chem. 23, 121 (1968). Kvalitatiivisesti tämä suhde merkitsee sitä, että guanidinium-25 hydrokloridia vain hieman tehokkaampi denaturantti pystyy denaturoimaan proteiinin monta kertaa nopeammin samana konsent-raationa. RN-aasidenaturaation kinetiikan ja mRNA:n säilymisen välistä suhdetta soluista tapahtuvan uuton aikana ei nähtävästi ole havaittu eikä tutkittu ennen tätä keksintöä.

30 Jos edellä oleva analyysi on oikea, pitäisi edullisen denaturantin olla sellainen, jolla on matala kynnysväkevyys denatu-roinnissa ja suuri vesiliukoisuus. Tämän vuoksi guanidinium-tiosyanaatti on edullisempi kuin litiumdijodisalisylaatti, vaikka viimeksimainittu on voimakkaampi denaturantti, sillä 35 guanidiniumtiosyanaatti on liukoisempi, ja näin ollen sitä voidaan käyttää sellaisena väkevyytenä, että RN-aasi inakti- 18 65446 voituu nopeammin. Edellä oleva analyysi selittää myös, miksi guanidiniumtiosyanaatti on edullisempi kuin lähes yhtä liukoinen hydrokloridi (syanaatti on hieman voimakkaampi denatu-rantti kuin hydrokloridi).

5 Disulfidisidoksia katkaisevan reagenssin käyttö yh dessä denaturantin kanssa tekee mahdolliseksi jälkimmäisen vaikutuksen ja tehostaa sitä, koska RN-aasimolekyyli muuttuu kokonaan avautuneeksi. Tioliyhdisteen ajatellaan auttavan denaturointiprosessin etenemistä, koska se estää nopean de-10 naturoinnin, joka voi tapahtua, jos molekyylinsisäiset di-dulfidisidokset jätetään koskemattomiksi. Lisäksi mRNA-val-misteen sisältämä RN-aasiepäpuhtaus säilyy käytännöllisesti katsoen inaktiivisena, vaikka denaturanttia ja tiolia ei olisikaan läsnä. Disulfidisidoksia katkaisevat reagenssit, 15 joissa on tioliryhmiä, ovat jossain määrin tehokkaita minä tahansa konsentraationa, mutta on edullista käyttää suurta tioliryhmien ylimäärää molekyylinsisäisiin disulfidisidoksiin verrattuna, jolloin vaihtoreaktio saadaan ajetuksi molekyylin-sisäisten disulfidisidosten katkeamisen suuntaan. Toisaalta, 20 koska monet tioliyhdisteet ovat pahanhajuisia ja suurten väkevyyksien kanssa on epämiellyttävä työskennellä, on käytännön syistä olemassa väkevyyden yläraja. Kun /3-merkaptoeta-nolia käytetään vahingoittumattoman RNA:n erottamiseen, on alueella 0,05 - 1,0 M olevat väkevyydet havaittu tehokkaiksi, 25 3a optimaalisen väkevyyden katsotaan olevan 0,2 M.

Väliaineen.pH voi olla välillä 5,0 - 8,0, kun mRNA uutetaan soluista.

Solujen rikkomisen jälkeen RNA erotetaan solun proteiineista ja DNAssta. Tähän tarkoitukseen on kehitetty useita 30 menetelmiä.

Tavallinen käytetty menetelmä on etanolisaostus, jolla RNA saostetaan selektiivisesti. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on edullisempaa jättää saostusvaihe pois ja kerrostaa homogenaatti suoraan 5,7 M cesiumkloridiliuokseen sent-35 rifugiputkessa ja sen jälkeen suorittaa sentrifugointi julkai- 19 65446 sussa Glisin, V. , Crvenjakov, R. ja Byus, C., Biochemistry 13, 2633 (1974) kuvatulla tavalla. Tämä menetelmä on edullinen, koska RN-aasille vahingollinen ympäristö voidaan säilyttää koko ajan ja saadaan hyvällä saannolla RNA:ta, joka ei sisäl-5 lä DNA:ta eikä proteiinia.

Edellä kuvatulla menetelmällä saadaan soluhomogenaa-tin koko RNA puhdistetuksi. Tästä RNA:sta on kuitenkin haluttua mRNA:ta vain osa. Puhdistusta jatkettaessa käytetään hyväksi sitä seikkaa, että korkeampien organismien soluissa 10 mRNA:ta prosessoidaan transskription jälkeen siten, että siihen liitetään polyadenyylihappoa. Tällainen poly-A-sekvenssejä sisältävä mRNA voidaan erottaa selektiivisesti kromato-grafiapylväässä, jossa on täytteenä selluloosaa, johon on liitetty oligotymidylaattia, ks. Avis, H. ja Leder, P. edel-lä. Edellä kuvattu menetelmä on sopiva silloin, kun tarvitaan käytännöllisesti katsoen puhdasta, vahingoittumatonta ja translaatiokelpoista mRNA:ta RN-aasia runsaasti sisältävistä lähteistä. mRNA:n puhdistus ja sen jälkeiset in varotoimenpiteet voidaan suorittaa käytännöllisesti katsoen sa-20 Titalla tavalla mille tahansa mRNA: lie huolimatta lähde-organismista.

Tietyissä tapauksissa, kuten käytettäessä kudosvil-jelmäsoluja mRNA-lähteenä, RN-aasiepäpuhtaus voi olla niin vähäinen, ettei edellä kuvattua RN-aasin inhibointia tarvita. 25 Tällöin ennestään tunnetut RN-aasiaktiivisuuden poistomenetelmät riittävät.

3. cDNA:n muodostaminen Tässä yhteydessä viitataan kuvioon 1, jossa on kaavioesitys menetelmän jäljellä olevista vaiheista. Ensimmäi-30 senä vaiheena on puhdistetun mRNA:n kanssa komplementaarisen DNA-sekvenssin muodostaminen. Tämän reaktion entsyymiksi valitaan käänteistransskriptaasi, vaikka periaatteessa voidaan käyttää mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka kykenee muodostamaan komplementaarisen DNA-säikeen käyttämällä mRNA:ta 35 templaattina. Reaktio voidaan suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa siten, että mRNA:ta käytetään templaattina ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin seosta DNA-säikeen prekursorina. On edullista, jos yksi deoksinukleosiditrifos- 20 6 5 4 4 6 32 faateista on merkitty Q,-asemassa P-atomilla, sillä sen avulla voidaan seurata reaktiota, se toimii merkkinä erotusmenetelmissä, kuten kromatografiässä ja elektroforeesissa, ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia päätelmiä, ks. Efstratiadis, A., et ai., edellä.

5 Kuten kuvasta ilmenee, käänteistransskriptaasin reaktiotulos on kaksisäikeinen hiusneularakenne, jossa RNA-säiettä ja DNA-säiettä yhdistää toisiinsa ei-kovalenttinen sidos.

Käänteistransskriptaasireaktion tuote poistetaan 1q reaktioseoksesta tunnetuilla menetelmillä. On havaittu hyödylliseksi käyttää fenoliuuton, kromatografiän ("Sephadex G-100", Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi) ja etanoliuuton yhdistelmää.

Kun CDNA on syntetisoitu entsymaattisesti, RNA-15 templaatti voidaan poistaa. Ennestään tunnetaan useita menetelmiä, joilla RNA voidaan hajottaa selektiivisesti DNA:n läsnäollessa. Alkalinen hydrolyysi on edullinen menetelmä, koska se on hyvin selektiivinen ja sitä voidaan hyvin helposti säädellä pH:n avulla.

20 Alkalisen hydrolyysin ja neutraloinnin jälkeen 32 P:llä merkitty cDNA voidaan haluttaessa väkevöidä etanoli-saostuksella.

Tällaisen kaksisäikeisen hiusneula-cDNA:n syntetisointi tapahtuu sopivan entsyymin, kuten DNA-polymeraasin 25 tai käänteistransskriptaasin avulla. Reaktio-olosuhteet ovat 32 aikaisemmin kuvatun kaltaiset, Ot- P:llä merkitty nukleosi-ditrifosfaatti mukaanluettuna. Käänteistransskriptaasia saadaan useista lähteistä. Linnun myeloblastosis-virus on edullinen lähde. Virusta valmistaa tri D. J. Beard, Life Sciences 30 Incorporated, St. Petersburg, Florida, National Institutes of Health'in kanssa tekemällään sopimuksella.

Kun cDNA-hiusneula on muodostettu, saattaa olla edullista puhdistaa se reaktioseoksesta. Kuten aikaisemmin mainittiin, on havaittu edulliseksi käyttää fenoliuuttoa, 35 kromatografiaa ("Sephadex G-100") ja etanolisaostusta, kun DNA halutaan saada puhdistetuksi proteiiniepäpuhtauksista.

Hiusneularakenne voidaan muuntaa tavalliseksi kak-sisäikeiseksi DNA-rakenteeksi siten, että komplementaarisia säikeitä yhdistävä yksittäinen säie poistetaan. On olemassa 40 useita entsyymejä, jotka kykenevät spesifisesti hydrolysoi- 65446 21 maan DNA:n yksisäikeisiä osia. Tähän tarkoitukseen hyvin sopiva entsyymi on Aspergillus oryzaesta eristetty S1-nukle-aasi (valmistaja Miles Research Products, Elkhart, Indiana).

Kun DNA-hiusneularakenne käsitellään S1-nukleaasilla, saa-5 daan hyvällä saannolla sellaisia molekyylejä, joissa on emäs-paripäät. Tämän jälkeen suoritetaan uutto, kromatografia ja etanolisaostus, kuten edellä on kuvattu. Efstratiadis et ai. ovat edellä mainitussa julkaisussa selostaneet mRAN:n kaksi-säikeisten cDNA-transskriptioiden syntetisointia käänteis-10 transskriptaasin ja S1-nukleaasin avulla.

Tylppäpäisten cDNA-molekyylien osuutta voidaan mahdollisesti lisätä, jos suoritetaan käsittely E. colin DNA-polymeraasi I:llä neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Entsyymin eksonukleaasiaktiivisuuden ja polymeraasi-15 aktiivisuuden yhteisvaikutus toimii siten, että ulkoneva 3'-pää poistuu ja ulkoneva 5'-pää täyttyy. Näin voidaan varmistaa, että mahdollisimman suuri määrä cDNA-molekyylejä osallistuu seuraavan vaiheen liittämisreaktioihin.

Keksinnön mukaisen menetelmän seuraavassa vaiheessa 20 käsitellään cDNA-tuotteen päät niin, että kuhunkin päähän saadaan restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan sekvenssi. Käytännön syyt määräävät päihin liitettävän DNA-fragmentin valinnan. Päihin lisättävä sekvenssi valitaan restriktioendonukleaasin perusteella ja tämä puolestaan valitaan sen DNA-25 vektorin perusteella, johon cDNA liitetään. Valittavassa plas-midissa pitäisi olla vähintään yksi kohta, johon restriktioendonukleaasin katkaisuvaikutus voi kohdistua. Esimerkiksi plasmidi pMB9 sisältää yhden tunnistuskohdan entsyymille Hind III. Hind III eristetään Haemophilus influenzaesta ja 30 puhdistetaan seuraavalla menetelmällä: Smith, H. 0. ja Wilcox, K. W., J. Mol. Biol. 51, 379 (1970). Haemophilus aegyptious-organismin entsyymi Hae III puhdistetaan seuraavalla menetelmällä: Middleton, J. H., Edgell, M. H. ja Hutchison III, C. A., J. Virol. 10, 42 (1972). Haemophilus suis-organismin entsyymi, 35 Hsu I, katalysoi saman paikkaspesifisen hydrolyysin samassa tunnistuskohdassa kuin Hind III. Näin ollen näitä kahta entsyymiä voidaan pitää funktionaalisesta vaihtoehtoisina.

Kaksois-cDNA:n päihin liittämistä varten on edullista käyttää kemiallisesti syntetisoitua kaksisäikeistä dekanuk-40 leotidia, joka sisältää Hind III:n tunnistuskohdan. Kaksisäi- 22 65446 keisen dekanukleotidin sekvenssi on esitetty kuvassa 1, ks. Heyneker, H. L. et ai., ja Scheller, R.H. et al., edellä. Alalla työskenteleville on tarjolla useita tällaisia tunnis-tuskohtasekvenssejä, ja tästä syystä on mahdollista valita 5 kaksois-cDNA:n päät kussakin tapauksessa tarvittavalle restriktioendonukleaasille sopiviksi.

Restriktiokohtasekvenssien liittäminen cDNA:n päihin voidaan toteuttaa menetelmällä, jota kutsutaan tylppään päähän liittämiseksi, ja jolloin katalysoidaan DNA-ligaasilla, 10 joka on puhdistettu seuraavalla menetelmällä: Panet, A. et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Edellä mainitut Sgaramel-la, V. et ai. ovat selostaneet tylppään päähän liittämisreak-tiota. Tylppään päähän liittämisessä, jossa reaktio tapahtuu tylppäpäisen cDNA:n ja suuren molaarisen ylimäärän kanssa 15 kaksisäikeistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind III endo-nukleaasin tunnistuskohdan, saadaan tuotteeksi cDNA, jonka kummassakin päässä on Hind III:n restriktiokohtasekvenssi.

Kun reaktiotuote käsitellään Hind ΙΙΙ-endonukleaasilla, tapahtuu katkeaminen restriktiokohdassa ja muodostuu yksisäikei-20 set itsekomplementoituvat 5’-päät, kuten kuviosta ilmenee.

4. Yhdistelmä-DNA:n siirtovektorin muodostaminen Periaatteessa voitaisiin käyttää monenlaisia virus-ja plasmidi-DNA-molekyylejä muodostettaessa rekombinantteja juuri kuvatulla tavalla valmistetun cDNA:n kanssa. Pääehtoi-25 na ovat, että DNA:n siirtovektori kykenee pääsemään isäntä-soluun ja replikoituinaan siellä, ja vektorilla pitäisi olla sellainen geneettinen ominaisuus, jonka avulla voidaan erottaa ne isäntäsolut, jotka ovat saaneet vektorin. Yleisistä turvallisuussyistä pitäisi valinta kuitenkin rajoittaa koe-30 tyyppiin soveltuviin siirtovektorilajeihin NIH:n ohjeita noudattaen, ks. edellä. Hyväksyttyjen DNA:n siirtovektorien luettelo kasvaa jatkuvasti, kun kehitetään uusia vektoreita ja NIH Recombinant DNA Safety Committee hyväksyy ne.

65446 Tällä hetkellä käyttöön hyväksyttyjä sopivia siirto-vektoreita ovat mm. useat bakteriofagilambdajohdannaiset (ks. esim. Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E. , Denniston-Thomson, K., Faber. H.E., Furlong, L.A., Grunwald, 5 D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schumm, J.W., Sheldon, E.L.

ja Smithies, 0., Science 196, 161 (1977)) ja col E1-plasmidi-johdannaiset (ks. esim. Rodriquez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M.N., INC-UCLA Symposium 10 on Molecular Mechanism in the Control of Gene Expression, D.P. Nierlich, W.J. Rutter, C.F. Fox, Eds. (Academic Press, NY, 1976) ss. 471 - 477). Col E1:stä johdetuille plasmideil-le on ominaista suhteellisen pieni koko, sillä niiden mole-kyylipaino on muutaman miljoonan luokkaa, ja se että normaa-15 liolosuhteissa plasmidi-DNA:n kopioiden luku isäntäsolua kohti on 20 - 40, mutta se saadaan nostetuksi tuhanteen tai sitäkin suuremmaksi, kun isäntäsolut käsitellään kloramfeni-kolilla. Isäntäsolun kyky suurentaa sisältämäänsä geenimää-rää tekee tietyissä olosuhteissa mahdolliseksi sen, että 20 isäntäsolu tuottaa pääasiassa plasmidigeenien koodaamia proteiineja. Näin ollen tällaiset col E1-johdannaiset ovat edullisia siirtovektoreita tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä. Sopivia col E1-johdannaisia ovat mm. plasmidit pMB-9, jonka sisältämä geeni aiheuttaa vastustuskyvyn tetra-25 sykliinille, ja pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 ja pBR-322, jotka sisältävät tetrasykliiniresistenssigeenin ja ampisil-liiniresistenssigeenin Resistenssiä aiheuttavan geenin läsnäolo tarjoaa sopivan keinon, jolla voidaan valita solut, jotka ovat infektoituneet plasmidilla, sillä tällai-30 set pesäkkeet kasvavat lääkkeen i 24 65446 läsnäollessa, mutta jos plasmidia ei ole, solut eivät kasva. Tämän selityksen sisältämissä esimerkeissä käytettiin col El:stä johdettua plasmidia, joka sisälsi e.m, resistenssigeenin ja yhden Hind-III-tunnistuskohdan.

5

Plasmidia pBR-322 on pitkälle karakterisoitu.

Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 95) on kuvannut tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin. Plasmidin

C

pBR322 molekyylipaino on 2,7 x 10 daltonia (Bolivar F., 10 Gene 4 (1978) 121), ja se sisältää ampisilliiniresistens-

R R

sin (Ap :n) ja tetrasykliiniresistenssin (Te :n) aiheutta-

* R

vat geenit. Edellä mainitussa Ap -geenissä on yksi β endonukleaasin Pst 1 tunnistuskohta. Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista endonukleaaseista: 15 Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi pBR322 sisältää yhden Eco RI:n tunnistuskohdan, kaksi Hind II:n tunnistuskohtaa, viisi Eco RII:n tunnistuskohtaa, kolme Bgl I:n tunnistuskohtaa, 12 Alu I:n tunnistuskohtaa, 12 Hae II:n tunnistuskohtaa ja 17 Hae III:n tunnistuskohtaa. Tunnistuskohdat on 20 merkitty renkaan muotoiseen pBR322-plasmidiin sivulla 103 Bolivarin et ai. julkaisussa. Ap -geeni häviää lohkaistaessa plasmidi Pst I:n tunnistuskohdasta ja liitettäessä

R

vierasta DNA:ta siihen. Samoin Te häviää lohkaistaessa pBR 322 endonukleaaseilla Hind III, Vai I tai Bam I ja 25 liitettäessä vierasta DNA:ta niiden tunnistuskohtaan.

Liitettäessä DNA Pst I:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi-

naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka . S

ovat sekä ampisilliinisensitiivisiä (Ap ) että tetrasyklii-

' D

niresistenttejä (Te ) samoin liittämällä DNA Hind III:n 30 Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi-naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliini-sensitiivisiä. Siirtäjävektori, joka sisältää johonkin edel- 25 6 5 4 4 6 lä mainittuun neljään tunnistuskohtaan liitettyä vierasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtäjävektorin lääke-aineresistenssiominaisuuksien perusteella eli siitä, onko se ampisilliinisensitiivinen ja tetrasykliiniresis-5 tentti tai ampisilliiniresistentti ja tetrasykliini- sensitiivinen. Siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida poistamalla siihen liitetty vieras DNA, määrittämällä muodostuneiden kahden tuotteen molekyylipaino ja vertaamalla näitä lähtöaineiden molekyylipainoihin. Li-10 säksi karakterisointia voidaan täydentää merkitsemällä siirtäjävektoriin eri endonukleaasien tunnistuskohdat. Siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi voidaan myös määrittää. Mainitun plasmidin pBR322 koko nukleotidisekvenssi on esitetty J. Sutcliffen väitöskirjassa "Nucleotide 15 Sequence of pBR322", Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA.

Samoin plasmidia pBR313 on pitkälle karakterisoitu. Tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin ovat kuvanneet Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 75).

g 20 Plasmidin pBR313 molekyylipaino on 5,8 x 10 daltonia,

O

ja se sisältää ampisilliiniresistenssin (Ap ) ja tetrasyk-

R

liiniresistenssin (Te ) aiheuttavat geenit. Plasmidin pBR313 Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista nukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI.

25 Plasmidin pBR313 tunnistuskohdat eri endonukleaaseille on määritetty täydellisesti, ja tästä tuloksena saatu tunnis-tuskohtakartta on esitetty sivulla 8>4 Bolivarin et ai. julkaisussa. Liitettäessä vierasta DNArta Hind III:n.

Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan tetrasykliiniresis-30 tenssi häviää. Täten yhdistelmä-DNA-molekyylejä löydetään kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtäjävektori voidaan karakterisoida lääkeaineresistenssiominaisuuksien, siirretyn DNA-sekvenssin, restriktioentsyymin tunnistuskohtakartan 35 ja edellä mainittujen molekyylipainojen perusteella.

26 6 5 4 4 6

Kolmas plasmidi, jota on pitkälle karakterisoitu, on pMB 9. Tämän plasmidin valmistusmenetelmän ovat esittäneet Rodriguez, R.L. et ai. (edellä) ja Bolivar, F.

et ai. (Gene 2 (1977) 75). Plasmidin pMB 9 0 5 molekyylipaino on 3,5 x 10 daltonia, ja se sisältää

O

tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan geenin. Tämä plasmidi sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seu-raavista endonukleaaseista: Eco Rl, Hind III, Sal I ja

Bam HI; Näistä kolmen jälkimmäisen tunnistuskohdat si-10 jaitsevat Te -geenissä. Liitettäessä vierasta DNArta

Hind III:n, sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan tetra-sykliiniresistenssi häviää. Siirtäjävektori, joka sisältää vierasta DNA:ta joissakin näistä kohdista, voidaan karakterisoida tämän ominaisuuden perusteella. Tämä siir-15 täjävektori voidaan edelleen karakterisoida määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi, vertaamalla molekyyli-painoja ja tunnistuskohta-analyysillä, kuten edellä on kuvattu.

Plasmidia pSCIOI on pitkälle karakterisoitu. Cohen, 20 S.H et ai. (Proc. Natl.Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293) ovat kuvanneet tämän plasmidin syntetisoinnin ja alustavan karakterisoinnin. Karakterisointia ovat’ täydentäneet Cohen, S.N. et ai. (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 70 (197 3) 3240 Boyer, H.W. et ai (Recombinant Molecules), Beers, R.F. ja 25 Basset, E.G. toim. , Raven Press, New York, s. 13 (1977) ja Cohen, S.N. et ai (Recombinant Molecules, s. 91). Plasmidin pSCIOI molekyylipaino on 5,8 x 10 daltonia,

O

ja se sisältää tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan n geenin. Te -geeni sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin 30 seuraavista endonukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi plasmidi pSCIOI sisältää yhden Eco RI:n tunnistuskohdan, yhden Hpa I:n tunnistuskohdan, yhden Sma I:n tunnistuskohdan ja neljä Hinc II:n tunnistuskohtaa. Tetrasykliiniresistenssi häviää halkaistaessa pSCIOI endo-35 nukleaaseilla Hind III, Sal I tai Bam HI ja liitettäessä vierasta DNA:ta näiden tunnistuskohtaan. Liitettä- 27 65446 essä DNA Hind III:n, Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan rekombinaatiomolekyylejä löydetään viljelmistä, jotka ovat tetrasykliinisensitiivisiä* Siirtäjävektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun kolmeen kohtaan lii-5 tettyä vierasta DNAtta, voidaan karakterisoida siirtä-jävektorin resistenssiominaisuuksien perusteella. Siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida (a) poistamalla siirretty vieras DNA-sekvenssi, määrittämällä molekyylipainot ja vertaamalla niitä keskenään, (b) laati-10 maila tunnistuskohtakartta ja (c) määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi.

Sopivan isännän valinnassa on monia mahdollisuuksia samoin kuin plasmidin valinnassa. Tässä selostuksessa kuvattuihin menetelmiin on kehitetty E. coli-kanta X-1776, 15 jonka NIH on hyväksynyt, kun käytetään P2-ty6skentelytilo-ja (ks. Curtiss III, R., Ann. Rev. Microbiol. 30, 507 (1976)). E. coli RR-1 on sopiva, kun P3-työskentelytilat ovat käytettävissä.

Rekombinoidut plasmidit muodostetaan siten, että 20 sekoitetaan keskenään restriktioendonukleaasilla käsiteltyä plasmidi-DNA:ta ja cDNA:ta, jonka pääteryhmät ovat vastaavasti käsitellyt. Plasmidi-DNA:ta käytetään suuri molaa-rinen ylimäärä cDNA:han verrattuna, jotta cDNA-segmentit muodostaisivat mahdollisimman vähän kombinaatteja toistensa 25 kanssa. Aikaisemmissa menetelmissä tämä on johtanut siihen, että suurin osa prosessin plasmideista on sellaisia, jotka eivät sisällä cDNA-fragmenttia. Näin ollen valintaprosessista on tullut vaivalloinen ja aikaavievä. Aikaisemmin tämä ongelma on ratkaistu siten, että on yritetty rakentaa sellai-30 siä DNA-vektoreita, joissa on restriktioendonukleaasin tunnis-tuskohta sopivan merkkigeenin keskellä siten, että rekombi-nantin liittäminen jakaa geenin ja samalla geenin koodaama toiminta häviää.

28 6 5 4 4 6

On edullista käyttää sellaista menetelmää, jolla niiden pesäkkeiden lukumäärä saadaan mahdollisimman pieneksi, joista rekombinoitua plasmidia etsitään. Menetelmässä toimitaan siten, että restriktioendonukleaasilla katkaistu 5 plasmidi-DNA käsitellään alkalisella fosfataasilla (valmistaja Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey). Alkalinen fosfataasi poistaa 5'-päiden fosfaatit endonukleaasin synnyttämistä plasmidin päistä ja estää plasmidi-DNA:n itseligaation. Näin ollen renkaanmuodostus 10 ja samalla transformaatio riippuu siitä, että tapahtuu 5'-fosforyloidut päät sisältävän DNA-fragmentin liittyminen. Kuvattu menetelmä vähentää ilman rekombinaatiota tapahtuvan transformaation suhteellista esiintymistä määrään, joka on alle 1/10^.

15 Tämä keksintö perustuu siihen, että DNA-ligaasin katalysoima reaktio tapahtuu DNA:n 5'-fosfaattipääteryhmän ja DNA:n 3'-hydroksyylipääteryhmän välillä. Jos 5'-fosfaatti puuttuu, ei liittymisreaktiota tapahdu. Kun kaksisäikei-set DNA:t pitää yhdistää, on olemassa kolme tilannetta, 20 kuten taulukosta 1 ilmenee: 29 65446

Taulukko 1

Tapaus Reagoivat yhdisteet Ligaasituote I 3· 51 3' 5.

--OH H O PO- -O-P-0-- -— 0?0,u + 2 3H0- -o-p-o--±2H2o 5' 1 3’ 5' 3' II 3· 5* 3' 5.

*-011 + !I2°3?-°---°"p-°-+H o

---Oli + OH---OH HO-- 7U

5' · 3’ 5' 3' III 3' 5’ _{l0_ ei reaktiota -OH + KO- 5’ 3’

Taulukossa 1 on kaksisäikeinen DNA esitetty kaavallisesti yhtenäisinä yhdensuuntaisina viivoina ja niiden vastaavat 5'- ja 3'-pääteryhmät on merkitty hydroksyy-leiksi (OH) tai fosfaateiksi (OPOgH^). Tapauksessa I on kummassakin reagoivassa molekyylissä päissä 5'-fosfaatti, ja näin ollen molemmat säikeet yhtyvät toisiinsa kovalent-tisesti. Tapauksessa II on liitettävistä päistä vain toisessa 5’-fosfaatti ja näin ollen vain toinen liitettävistä säikeistä liittyy toiseen kovalenttisesti ja toiseen säikeeseen jää epäjatkuvuuskohta. Kovalenttisesti liittymätön säie pysyy assosioituneena liittyneeseen säikeeseen vetysiltojen avulla, jotka esiintyvät vastakkaisten säikeiden komplementaaristen emäsparien välillä. Tapauksessa III ei kummassakaan reagoivassa päässä ole 5'-fosfaattia eikä yhdistymisreaktiota tapahdu.

Näin ollen pitää poistaa 5’-fosfaattiryhmä sellaisesta päästä, jonka liittyminen toiseen halutaan estää.

30 65446 Käytettäväksi sopii mikä tahansa 5'-fosfaattiryhmän poistomenetelmä, joka ei muuten vahingoita DNA-rakennetta. Mieluiten käytetään alkalisen fosfataasin katalysoimaa hydrolyysiä.

5 Edellä kuvattu menetelmä on hyödyllinen myös siinä tapauksessa, että lineaarinen DNA-molekyyli halutaan katkaista kahteen alafragmenttiin, tavallisesti restriktio-endonukleaasia käyttämällä, ja sen jälkeen rekonstruoida alkuperäiseksi sekvenssiksi. Alafragmentit voidaan puhdis-10 taa erikseen ja haluttu sekvenssi voidaan rekonstruoida yhdistämällä alafragmentit. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää DNA-ligaasia, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei.

15 USA 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E. colista saatua ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehman, I.R., J. Biol. Chem 245, 3626 (1970).

Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointia restriktio-20 endcnukleaasikäsittelyllä saaduista alafragmenteista parantaa suuresti, jos voidaan käyttää menetelmää, jossa sopimattomien sekvenssien rekonstruoinnilta vältytään. Sopimaton tulos voidaan välttää, jos halutun sekvenssin omaava homogeenisen pituinen cDNA fragmentti käsitellään 25 reagenssilla, joka kykenee poistamaan 5'-päätefosfaatti-ryhmät cDNA:sta ennen kuin homogeeninen cDNA lohkeaa res-triktioendonukleaasin vaikutuksesta. Tässä alkalinen fosfataasi on edullinen entsyymi. 51-päätefosfaatit ovat rakenteellinen edellytys DNA-ligaasin alafragmentteja yhdistävälle 30 vaikutukselle. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää kovalenttisesti, joissa ei ole 5'-päätefosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan yhdistää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 51-päätefosfaatin, joka on muodostunut restriktioendonukleaasin eristettyyn DNA:hän kohdistaman 35 katkaisevan vaikutuksen tuloksena.

3i 654 4 6

Edellä selostettu menettely estää sopimattomimman liittymisreaktion, nimittäin» että kaksi fragmenttia liittyisi käänteisessä järjestyksessä eli takaosa etuosaan eikä etuosa takaosaan. Muita mahdollisia sivureaktioita, 5 kuten dimeroitumista tai renkaanmuodostusta ei saada estetyksi,, koska nämä tapahtuvat reaktiotyypin II mukaisesti, vrt. taulukkoa 1 edellä. Tällaiset sivureaktiot ovat kuitenkin vähemmän haitallisia, koska ne johtavat fysikaalisesti indentifioitaviin ja erotettaviin tuottei-10 siin, kun taas käänteinen rekombinaatio ei sitä tee.

Edellä kuvattujen menetelmien valaisemiseksi rotan insuliinin cDNA-koodi on eristetty ja rekombinoitu plasmi-din kanssa. DNA-molekyyleillä transformoituva bakteerikanta oli E. coli X-1776. Transformoidut bakteerit erotettiin 15 suorittamalla viljely tetrasykliinipitoisessa kasvualustassa. Erään transformoitujen solujen sisältämän rekombinoidun plasmidin DNA:n havaittiin sisältävän liittyneen DNA-fragmentin, jonka pituus oli noin 410 nukleotidia. Samalla menetelmällä eristettiin ja analysoitiin myös mui-20 ta rekombinantteja. Liitetyt fragmentit irroitettiin plasmi-dista Hind III- tai Hsu I-endonukleaasikäsittelyllä ja niiden DNA-sekvenssi analysoitiin seuraavalla menetelmällä: Maxam, A.M. ja Bilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 74, 560 (1977). Liitettyjen DNA-fragmenttien nukleo-25 tidisekvenssi havaittiin ylipitkäksi ja se sisälsi koodin rotan koko proinsuliini I:lle ja prepeptidisekvenssin kolmelletoista aminohapolle, kaikkiaan 23 aminohaposta. Jäljempänä on esitetty, millainen tämä nukleotidisekvenssi on.

32 65446

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä kuvataan rotan insuliinin mRNA:n uutto ja eristys, sille komplementaarisen DNA:n syntetisointi ja karakterisointi. Rotan saarekesolujen valmista-5 miseksi nukutetun rotan haima infusoitiin Hank'in suolaliuoksella infusoimalla takakautta haimatiehyeeseen'. Hank ’ in suolaliuos on alaan perehtyneiden tuntema standardiliuos, jota myy mm. Grand Island Biological Supply Company,

Grand Island, New York. Haima poistettiin, jauhettiin 10 Hank*in liuoksessa 0°C:ssa ja kollagenaasin ja soijapavun trypsiini“inhibiittorin annettiin vaikuttaa. Kaikki toimenpiteet suoritettiin 0-U°C:ssa, ellei toisin ilmoiteta. Viimeksimainitun toimenpiteen olosuhteet olivat erittäin kriittiset. 30 millilitran lasiputkeen laitettiin 15 kaksi jauhettua rotan haimaa Hank'in liuoksessa niin, että kokonaistilavuudeksi tuli 8 ml. Kaikki lasiputket oli esi-käsitelty silikonilla ("Siliclad", Clay-Adams Divison, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey). Inkuboin-tiseos sisälsi 12 mg kollagenaasia, joka on Clostridium 20 histolyticumista valmistettu entsyymi (valmistusmenetelmä: Mandi, I., Mackennan, J.D. ja Howes, E.L., J. Clin. Invest. 32, 1323 (1943)), tyyppi CLS IV, valmistaa Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, ja 1 mg soijapavun trypsiini-inhibiittoria, valmistaja Sigma 25 Chemical Coproration, St. Louis, Missouri. Putkea ravisteltiin nopeudella 90 heilahdusta/min.

37°C:ssa 25 minuutin ajan. Kollagenaasin vaikutuksen optimaalista edistymistä oli tarkkailtava jatkuvasti.

Jos inkubointi oli liian lyhyt, saarekesolujen irtaan-30 tuminen jäi epätäydelliseksi, ja jos inkubointiaika oli liian pitkä, saarekesolut alkoivat liueta. Inkuboinnin jälkeen putkea sentrifugoitiin 1 minuutti nopeudella 200 r/min. Emäliuos dekantoitiin ja hiukkaset pestiin Hank'in liuoksella, ja sentrifugointi ja pesu toistettiin yhteensä 35 viisi kertaa. Lopullisen sentrifugoinnin jälkeen hiukkaset suspendoitiin 15 ml saan "FicollM-liuosta (Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Ruotsi), jonka tiheys oli 1,085.

33 65446

Sen jälkeen lisättiin 8 ml "Ficoll"-liuosta, jonka tiheys oli 1,080, 5 ml "Ficoll"-liuosta, jonka tiheys oli 1,060, ja putkea sentrifugoitiin heiluvassa kuppiroottorissa ensin 5 minuuttia nopeudella 500 r/min ja sen jälkeen 5 mi-5 nuuttia nopeudella 2000 r/min. Tämän menettelyn seurauksena rakkulasolut jäivät putken pohjalle ja saarekesolut nousivat gradienttiin ja muodostivat rintaman kahden ylimmän kerroksen väliin. Saarekesolukerros sisälsi epäpuhtauksina hermosoluja, imusolmukkeita ja sidekudosta. Suuret 10 epäpuhtaushiukkaset poistettiin materiaalista kerroksessa. Materiaalin loppuosa sijoitettiin leikkelymikroskooppiin, ja näkyvät epäpuhtaudet poistettiin käsin mikropipetillä. Tämän jälkeen soluvalmiste sekoitettiin Hank*in liuokseen ja sentrifugoitiin. Emäliuos dekantoitiin ja solumateri-15 aali varastoitiin nestemäiseen typpeen.

200 rotasta kootut saarekesolut homogenisoitiin U°C:ssa UM guanidiniumtiosyanaatissa ("Tridom”,

Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, Sveitsi), joka sisälsi 1 My>-merkaptoetanolia, ja joka oli puskuroitu pH-ar-20 voon 5,0. Homogenaatti kerrostettiin 1,2 ml:n kanssa 5,7 M CsCl, joka sisälsi 100 mM EDTA, ja sentrifugoitiin 15°C:ssa 18 tuntia nopeudella 37 000 r/m Beckman-ultra-sentrifugin roottorissa SW 50,1 (Beckman Instrument Company, Fullerton, California). RNA kulkeutui putken pohjalle.

25 Polyadenyloitu RNA eristettiin koko RNA-valmis- teesta kromatografisesti oligo(dT)selluloosan avulla menetelmällä, jonka ovat esittäneet Aviv, H. ja Leder, P., vrt. edellä.

30 Rotan Langerhansin saarekkeiden koko polyadenyloitu RNA transskriboitiin cDNA:ksi linnun Myeloblastosis-viruk-sen käänteistransskriptaasin avulla, jota toimittaa tohtori D.J. Beard (Life Science Inc., St. Petersburg,

Florida). Reaktio tapahtui seoksessa, jossa oli 50 mM 35 Tris-HCl, pH 8,3, 9 mM MgCl2, 30 mM NaCl, 20 mM /6-merkapto-etanolia, 1 mM kutakin kolmea deoksiribonukleosiditrifos- 34 65446

faattia, joissa ei ollut radioaktiivisuutta, 250 ^uM

neljättä deoksinukleosiditrifosfaattia, joka oli merkit-32 ty ci- P:llä, jonka spesifinen aktiivisuus oli 50-200 Ci/mol, 20 ^ug/ml oligo-dT^2-18 Collaborative Research, 5 Waltham, Massachusetts), 100 ^ug/ml polyadenyloitua RNA:ta ja 200 yksikköä/ml käänteistransskriptaasia. seosta inkuboi- tiin 45°C:ssa 15 minuuttia. Tämän jälkeen lisättiin EDTA-Na^ niin, että väkevyydeksi tuli 25 mM, liuos uutettiin tilavuudellaan fenolia, joka oli kyllästetty vedellä, 10 ja sen jälkeen vesifaasi kromatografoitiin Sephadex G-100 pylväässä (halkaisija 0,3 cm, korkeus 10 cm) käyttämällä eluenttia, jossa oli 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 100 mM NaCl ja 2 mM EDTA. Välisijatilavuudella eluoitunee-seen nukleiinihappoon lisättiin ammoniumasetaattia, 15 pH 6,0, niin, että väkevyydeksi tuli 0,25 M, ja saostettiin etanolilla. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla, liuotettiin 50 ^ulraan juuri valmistettua 0,1 M NaOH ja inku-boitiin 20 minuuttia 70°C:ssa niin, että RNA hydrolysoitui.

Seos neutraloitiin lisäämällä IM natriumasetaattia, pH 4,5, . 32 20 ja p-cDNA-tuote saostettiin etanolilla 3a liuotettiin veteen. Osa yksisäikeistä cDNA:ta analysoitiin natiivilla polyakryyliamidigeelillä seuraavalla menetelmällä: Dingman, C.W, ja Peacock, A.C., Biochemistry 7, 659, (1968).

3 2

Geelit kuivattiin ja P-DNA tutkittiin autoradiograflal-25 la käyttäen "Kodak No-Screen NS-2T"-filmiä (Eastman

Kodak Corporation, Rochester, New York). Elektroforeesi-kuvion' mukaan arvioituna cDNA oli heterodisperssi. Tunnettujen standardien mukaan arvioituna se sisälsi ainakin yhtä cDNA-lajia, jossa oli noin 450 nukleotidia.

30 Esimerkki la

Toistettiin esimerkki 1, käyttäen kuitenkin eri /9-merkaptoetanolipitoisuuksia saarekesolujen homogeni-sointivaiheessa, nimittäin 0,05 M, 0,2 M, 0,6 M ja 0,8 M. Kaikilla näillä pitoisuuksilla saatiin sama lopputulos, 35 eli mRNA:n hajoamista RN:aasin vaikutuksesta ei tapahtunut.

35 65446

Esimerkki lb

Toistettiin esimerkit 1 ja la, käyttäen kuitenkin eri pH:ta saarekesolujen homogenisointivaiheessa, nimittäin pH 6,0, 7,0 ja 8,0. Kaikilla näillä pH-arvoilla 5 saatiin sama lopputulos, eli mRNA:n hajoamista RN:aasin vaikutuksesta ei tapahtunut.

Esimerkki 2 ' Tässä esimerkissä kuvataan rotan insuliinin kaksi- säikeisen cDNA:n syntetisointi ja karakterisointi. Komple- 10 mentaarisen säikeen syntetisoimiseksi esimerkissä 1 tuotteeksi saatu yksisäikeinen cDNA käsiteltiin käänteis- transskriptaasilla. Reaktioseos sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 9 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolia, 50 mM kutakin kolmea deoksiribonukleosiditrifosfaattia, jotka eivät 3 2 15 olleet radioaktiivisesti merkittyjä, 1 mM P:llä merkittyä nukleosiditrifosfaattia, jonka spesifinen aktiivisuus oli 1-10 Ci/mmol, 50 ^ug/ml cDNA ja 220 yksik-köä/ml käänteistransskriptaasia. Reaktioseosta inkuboi-tiin 120 minuuttia 45°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisää-20 mällä EDTA-Na2 niin, että väkevyydeksi tuli 25 mM, uutettiin fenolilla, kromatografoitiin Sephadex G-100:lla ja saostettiin etanolilla. Erä reaktiotuotetta, jonka aktiivisuus oli 500-1000 sykäystä minuutissa, analysoitiin geelielektroforeesilla esimerkissä 1 kuvatulla taval-25 la. Standardinäytteisiin vertaamalla löydettiin hetero-disperssi kaista, jonka pituus oli noin 450 nukleotidia.

Erä esimerkin 1 ja esimerkin 2 DNA-reaktiotuotetta käsiteltiin erikseen restriktioendonukleaasilla Hae III ja suoritettiin samanlainen geelielektroforeesi. Endonukleaasi 30 katkaisi kummankin tuotteen ja geelielektroforeesissa havaittiin kaksi radioaktiivista kaistaa. Kaksisäikeisen cDNA:n katkaisussa syntyneet kaistat edustivat käytännöllisesti katsoen samanpituisia tuotteita kuin yksisäi-keisen cDNA:n katkaisussa syntyneet.

36 65446

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä selostetaan, kuinka esimerkissä 2 valmistettuun kaksisäikeiseen rotan saareke-cDNArhan kytketään Hind III:n dekanukleotiditunnistuskohta tylpin pään päähän tapahtuvana liittämisenä. Esimerkin 2 kaksi-säikeistä reaktiotuotetta, jonka väkevyys oli 2-5 ^ug/ml, käsiteltiin ensin 3 0 minuuttia 22°C:ssa ja sitten 1-5 minuuttia 10°C:ssa 30 yksiköllä Sl-nukleaasia, jonka aktiivisuus oli 1200 yksikköä/ml (Miles Laboratories, Elkhart,

10 Indiana), liuoksessa, jossa oli 0,03 M natriumasetaattia,pH

4,6, 0,3 M natriumkloridia ja 4,5 mM ZnCl^. Reaktio lopetettiin lisäämällä Tris-emästä niin, että loppuväkevyy-deksi tuli 0,1 M, EDTA:ta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 25 mM, ja E. colin tRNA:ta (valmistettu seuraavalla 15 menetelmällä: von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, S.P. Colowick ja N.O. Kaplan, Eds., Voi. 12A, s. 588 (1967)) 40 ^ug/ml. Reaktioseos uutettiin fenolilla, kroma-tografoitiin Sephadex G-100:lla ja välisijatilavuudella eluoitu ^P-cDNA saostettiin etanolilla. Tällä käsitte-20 lyllä saatiin hyvällä saannolla cDNA-molekyylejä, joissa oli emäsparipäät, jotka tarvitaan kemiallisesti syntetisoitujen dekanukleotidien liittämiseksi tylppään päähän. Hind ΙΙΙ-dekameerit valmistettiin seuraavalla menetelmällä: Scheller, R.H. Dickerson, R.E., Boyer, H.W., 25 Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

Hind III-dekameerien liittäminen cDNA:han suoritettiin inkuboimalla 1 tunti 14°C:ssa liuoksessa, jossa oli 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgC^ > 1 mM ATP, 10 mM ditio-treitolia, 3 mM Hind III dekameeria, jonka aktiivisuus 30 oli 10^ sykäystä minuutissa pikomoolia kohti, ja noin 500 yksikköä/ml T4 DNA-ligaasia. Tämän jälkeen reaktioseosta kuumennettiin 65°C:ssa 5 minuuttia ligaasin inaktivoimi-seksi. Sitten käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 150 yksiköl-lä/ml Hsu I- tai Hind ΙΙΙ-endonukleaasia ja tämän jälkeen 35 lisättiin kaliumkloridia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 50 mM, yi-merkaptoetanolia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 1 mM, ja EDTA:ta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 0,1 mM.CNew England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts, 37 65446 myy Hind III- ja Hae ΙΙΙ-endonukleaasia). Reaktiotuote analysoitiin geelielektroforeesilla samoin kuin esimerkissä 1 ja havaittiin piikki, joka vastasi noin 450 nukleotidin sekvenssiä, ja lisäksi Hind III-dekameerien 5 katkenneita fragmentteja.

Esimerkki 3a

Eco-RI-dekanukleotiditunnistuskohdat kytkettiin esimerkin 2 mukaiseen cDNA:han, kuten on selitetty esimerkissä 3. (Eco-RI-dekameerit oli valmistettu Scheller 10 et ai:n edellä mainitun artikkelin mukaisesti, ja niillä oli sekvenssi 5'-CCGAATTCGG-3'). Tämän jälkeen tuote digestoitiin Eco Ritilä (valmistaja New England Prolabs), jolloin käytettiin samoja reaktio-olosuhteita kuin edellä (ks. digestointi Hsu I:llä ja Hind 111:11a). Reaktio-15 tuote analysoitiin geelielektroforeettisesti (kuten Esimerkissä 1 on selitetty), ja todettiin noin 450 nukleotidin sekvenssiä vastaava piikki, sekä Eco-RI-dekameerien fragmentteja.

Esimerkki 4 20 Tässä esimerkissä muodostetaan rekombinoitu plasmidi ja karakterisoidaan se replikoitumisen tapahduttua.

Plasmidi pMB-9 DNA (valmistusmenetelmä: Rodriguez, R.L., Boliver, F., Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M., ICN-UCtiA symposium on Molecular and Cellular Biology,

25 D.P. Wierlich, W.J. Rutter ja C.F. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976), ss. 471-477) katkaistiin Hind III-restriktiokohdasta Hsu I-endonukleaasilla, ja sen jälkeen käsiteltiin alkalisella fosfataasilla BAPF (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey). Reaktio-30 seoksessa oli entsyymiä 0,1 yksikköä 1 ^ug DNA:ta kohti ja inkubointi tapahtui 25 mM Tris-HCl-liuoksessa, pH 8, 65°C:ssa 30 minuutin ajan, ja sen jälkeen fosfataasi poistettiin fenoliuutolla. Etanolisaostuksen jälkeen lisättiin fosfataasilla käsitelty plasmidi-DNA cDNA:han, jossa 35 oli Hind ΙΙΙ-kohesiiviset päät, niin, että suhteeksi tuli 3 moolia plasmidia 1 cDNA-moolia kohti. Seosta inkuboitiin 1 tunti 14°C:ssa liuoksessa, jossa oli 66 mM

38 65446

Tris, pH 7,6, 6,6 mM MgCl^ , 10 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP ja 50 yksikköä/ml T4 DNA-ligaasia.

Seos lisättiin suoraan E.coli X-1776-solususpen-sioon, jonka solut oli valmistettu transformaatioon 5 seuraavasti. Soluja kasvatettiin 37°C:ssa solutiheyteen

O

noin 2 x 10 solua/ml 50 ml:ssa ravinneliuosta, joka sisälsi 10 g/1 tryptonia, 5 g/1 hiivauutetta, 10 g/,1 nat-riumkloridia, 2 mM natriumhydroksidia, 100 ^,ug/ml diaminopimeliinihappoa ja 40 ^ug/ml tymiiniä. Solut 10 otettiin talteen sentrifugoimalla 5 minuuttia nopeudella 5 000 r/min 5°C, suspendoitiin 20 ml:aan kylmää 10 mM natriumkloridiliuosta, sentrifugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin jälleen transformointipuskuriin, jossa oli 75 mM CaClj» 140 mM NaCl ja 10 mM Tris, pH 7,5, ja pi-15 dettiin 5 minuuttia jäässä. Tämän jälkeen solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin jälleen 0,5 ml:aan transformaatiopus-kuria. Transformaatio suoritettiin sekoittamalla keskenään 100 yUl solususpensiota ja 50 ^ul rekombinoitua DNArta (1 ^ug/ml). Seosta inkuboitiin ensin 15 minuut-20 tia 0°C:ssa, sitten 4 minuuttia 25°C:ssa ja lopuksi 30 minuuttia 0°C:ssa. Sitten solut siirrettiin agarmaljoi-hin valituissa olosuhteissa /viljeltäviksi.

Rekombinantti-plasmidien seulonta tapahtui siten,' että läsnä oli 5 ^ug/ml tetrasykliiniä Hind III-25 kohdan transformaatiota varten. Valittu rekombinantti, nimeltään pAU-1, eristettiin. Epäpuhtaita plasmidivalmisteita, joissa oli 2-5 ^ug pAU-l:stä eristettyä DNA:ta, käsiteltiin Hsu I-endonukleaasiylimäärällä. Lisättiin EDTA-Na^tta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 10 mM, 30 ja sakkaroosia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 10 % (paino/tilav) ja seos erotettiin polyakryyliamidi-geelillä (8 %). DNA löydettiin kohdasta, joka vastasi noin 410 emäsparin pituutta.

Esimerkki 4a. (i) Esimerkki 4 toistettiin, paitsi että 35 plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR322 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla tavalla (Gene 2 (1977) 95). Käytetyt olosuhteet olivat muuten samat, paitsi että yhdistelmäkloonien 39 6 544 6 lopullinen selektio suoritettiin viljelemällä niitä väliaineessa, joka sisälsi 20 ^ug/ml tetrasykliiniä. Yhdistelmäklooniin siirretty DNA-sekvenssi erotettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin HIO 5 emäsparin pituinen DNA-fragmentti, jonka nukleotidi-sekvenssi on esitetty taulukossa 1.

(ii) Esimerkki 4 toistettiin, paitsi että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai.

10 kuvaamalla menetelmällä (Gene 2 (1977) 75). Käytetyt olosuhteet olivat muuten samat paitsi että yhdistelmä-kloonien lopullinen selektio suoritettiin kohdassa (i) kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 410 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi 15 on esitetty taulukossa 1.

(iii) Esimerkki 4 toistettiin, paitsi että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSCIOI DNA:ta, joka oli valmistettu Cohenin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Proc. Nat. Acad. Sei.

20 USA 70 (1973) 1293). Käytetyt olosuhteet (yhdistelmä-kloonien selektiomenetelmä mukaanlukien) olivat esimerkin 4 mukaiset. Yhdistelmäklooniin siirretty DNA-sekvenssi erotettiin, jolloin saatiin noin 410 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi 25 on esitetty taulukossa 1.

Esimerkki 4b. Esimerkit 4 ja 4a toistettiin, paitsi että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E.colia RRI tai E. colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat samat kuin esimerkissä 4 ja 4a, ja saatiin samat tulokset.

40 65446

Esimerkki 5

Esimerkin H mukaista plamidin pAU-1 DNA:ta puhdistettiin edelleen elektroforeesilla 6 % polyakryyli- amidigeelillä. Tämän jälkeen DNA eluoitiin geelistä ja jl o 2 5 merkittiin inkuboimalla «- p-ATP:n ja polynukleotidi-kinaasin kanssa Maxam'in ja Gilbert1in kuvaamissa olosuhteissa ks.Proc. Natl. Acad. Sei.,USA, 74 (1977) sivut 560-. Entsyymi katalysoi radioaktiivisen fosfaatti- 3 2 ryhmän siirtymisen p-ATP:stä DNA:n 5’ -päihin.

10 Entsyymi saatiin E. colista seuraavalla menetelmällä:

Panet, A., et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Näin merkitty DNA katkaistiin Hae III-endonukleaasilla esimerkissä 2 kuvatulla tavalla ja molemmat fragmentit, joista toisessa oli noin 265 ja toisessa noin 135 emäs-15 paria, erotettiin polyakryyliamidigeelillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Eristetyt fragmentit saatettiin alttiiksi spesifisille katkaisureaktioille ja suoritettiin sekvenssianalyysi edellä mainitulla Maxam'in ja Gilbert’in menetelmällä. Taulukossa 1 on 20 esitetty yhdistelmä tämän koesarjan tuloksista ja samanlaisten koesarjojen tuloksista, joissa tutkittiin cDNA:ta käyttämällä Col EL:stä johdettuja plasmidivekto-reita, kuten pMB-9 ja pBR-322. Sekvenssin 5'-päässä on määrittelemätön noin 50-120 nukleotidia sisältävä sekvens-25 si ja 3'-päässä olevan poly-dA:n pituus vaihtelee. Sekvenssi on aikaansaatu parhaan tämänhetkisen tiedon perusteella. Vastaava rotan proinsuliini I:n aminohapposekvenssi alkaa numerolla 1 merkitystä triplettikohdasta ja loppuu numerolla 86 merkittyyn triplettikohtaan. Katko-30 viivalla merkitty sekvenssi on vielä hieman epävarma.

r 41 <

E-ι U U

O O < s r- . .

g ° u » 65446

Eh Eh O O

O B Eh

Eh U U

Eh U

U U U <.

O U < O <

U n Eh oo O

< O

u u < u < U I< O < Eh < Eh < u ο υ u U U Eh >,

< U U rH

rt Eh o < < < U 04

υ ο υ I

U < EH u

Eh O O

O U U U < <c υ o o

Eh Eh Eh Eh h- Eh O CJ <·

Eh U m U U < (0

Eh C Eh O -n O Eh < Eh 0

< U S

U U < U Eh P

Eh CJ U Eh «5

Eh Eh < U >

U O U »O

0 Eh O O O Oh

O U O < <D

Eh O <

U U ft -H

U Eh U U *3 U)

a U O EH M

U U j Eh rf Φ <C < < w

< *c u o U -H

< O U eh nJ

U U Eh rf -P

U Eh < 0)

U O U Ο Ο Ο -H

«“ <N U O r-· <« O 0

<3 U U Ο -P

0 < O Eh

J4 ϋ Eh Eh Eh U -P

.¾ O U < Eh (β 3 O Eh O U > rj n U 0

3 H U U U U

<β Eh ·< Eh U -P

Eh U O U U < ¢)

Eh O 0> U U U eh O 3

Eh E-* Eh Eh iH

U U U < Λ! (0

Eh O

U U < U U -P

rt! < O U 3

O Eh O U U 4J

Eh Eh <0 U O O rii Eh Eh| >

Eh nr Ο Ο κίΙ -H

U U U U <3l -H

Eh Ul > U Eh O CJ EhJ (3

U Eh < .<1 .H

υ u o .3 <1 rH

U Ul *< U U ««5 O Ehi « «< < < EH| 1 a o u oi I o u o <

I EH U O U

C3 U U EH

r- O U O id U

.S eh λ; y oo 3 5 u o o 3 fo U U O Eh <

r- C < in Eh O

U U O Eh

5 Eh O U U

iH U Eh < < M U U U Eh

® Eh < U U

5. O < EH Ä U U U << 42 65446

Esimerkki 6

Seuraavassa on kuvattu ihmisen insuliinia koo-daavan nukleotidisekvenssin sisältävän DNA:n eristyspä puhdistusmenetelmä, sekä mainitun DNA:n sisältävän 5 siirtovektorin valmistus, sekä sellaisen mikro-orga-nismikannan valmistus, joka sisältää mainitun DNA:n geneettisessä koostumuksessaan.

Ihmisen saarekesolut eristettiin ihmisen haimaku-doksesta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Haimakudos oli 10 saatu sopivasta kohteesta, se voi olla peräisin esim.

lahjoitetusta haimasta, äskettäin kuolleen henkilön ruumiista tai ihmisen insulinoomasta. Useasta haimasta eristetyt saarekesolut yhdistettiin ja homogenoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla 4-m guanidiinitiosyanaat-15 tiliuoksessa, joka sisälsi 0,2-m /^-merkaptoetanolia ja jonka pH oli 5,0. Polyadenyloitu RNA eristettiin affiniteettikromatografisesti Avivin ja Lederin kuvaamalla tavalla (edellä). Yksijuosteinen cDNA valmistettiin käänteistransskriptaasin avulla, ja mRNA 20 hydrolysoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Kaksi-juosteinen cDNA valmistettiin käänteistransskriptaasia käyttäen esimerkissä 2 kuvatulla tavalla ja hajoitet-tiin Sl-nukleaasilla esimerkissä ,3 kuvatulla tavalla. Hindlll-linkkerit liitettiin ihmisen insuliinia koodaa-25 vaan kaksijuosteiseen cDNArhan esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Tuote hajoitettiin Hindlll- ja Hsu-restriktio-entsyymeillä ja analysoitiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Tällöin havaittiin lohjenneiden Hindlll-dekameerifragmenttien lisäksi vyöhyke, joka vastasi 30 noin 450 nukleotidin pituista DNA-sekvenssiä. Ihmisen Insuliinia koodaava cDNA, joka sisälsi kohesiiviset Hindlll -päät, liitettiin plasmidiin pMB-9 esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. E. coli X-1776 transformoitiin tällä plasmidilla, ja yhdistelmäplasmidien selektio 35 suoritettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Yhdis-telmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin 43 6 5 4 4 6

Hsul -restriktioentsyymin avulla ja analysoitiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Noin 450 nukleotidia sisältävä DNA otettiin talteen. Täten kloonatun ihmisen insuliinin havaittiin sisältävän ihmisen insuliinin 5 koko aminohapposekvenssiä koodaavat nukleotidit. A-ket-jun aminohapposekvenssi on seuraava: 1 10

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu- 20 •j^q Tyr-Flu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn.

B-ketjun aminohapposekvenssi on seuraava: 1 10

Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- 20

Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys- 15 30

Thr.

Aminohapposekvenssi on numeroitu siitä päästä alkaen, joka sisältää vapaan aminoryhmän.

Esimerkki 6a. (i) Esimerkki 6 toistettiin, paitsi että 20 plasmidin pMB-9 tilalla käytettiin plasmidia pBR322.

Kaikki reaktio-olosuhteet ja yhdistelmäplasmidien selek-tiomenetelmä olivat samat kuin esimerkissä 4a(i). Yh-distelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 450 25 nukleotidia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleoti-disekvenssi on esitetty esimerkissä 6.

(ii) Esimerkki 6 toistettiin, paitsi että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA:ta. Kaikki reaktio-olosuhteet ja yhdistelmäplasmi-30 dien selektiomenetelmä olivat samat kuin esimerkissä 4a(ii). Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 450 nukleotidia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 6.

35 (iii) Esimerkki 6 toistettiin, paitsi että plasmi

din pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSCIOI

44 65446 DNA:ta. Kaikki reaktio-olosuhteet ja yhdistelmäplasmi-dien selektiomenetelmä olivat samat kuin esimerkissä Ha(iii). Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 450 nukleotidia 5 sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 6.

Esimerkki 6b. Esimerkit 6 ja 6a toistettiin, paitsi että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E. colia RR1 tai E. colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat saman-10 laiset, ja saatiin samat tulokset.

Claims (1)

1. 45 65446 Patenttivaatimus Menetelmä insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän bakteerin valmistamiseksi, tunnettu sii-5 tä, että a) mRNA eristetään haimakudoksen saarekesoluista homogenoimalla ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi noin 4 mol/1 guanidiniumtiosyanaattia ja 0,05...1,0 mol/1 p>- 10 merkaptoetanolia sisältävää liuosta pH:ssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNA:n ribonukleaasihajoamista ei tapahdu, b) valmistetaan saadusta mRNA:sta sinänsä tunnetulla tavalla käänteistransskriptaasientsyymin avulla sellainen cDNA, jolla on insuliinia koodaava nukleotidisekvens- 15 si, ja mainittu cDNA muutetaan kaksisäikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistus-kohtasekvenssit saadun kaksisäikeisen cDNA:n päihin sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin restriktioendonukleaasina on sama entsyymi kuin seuraävassa kohdassa d), jonka jäl- 20 keen cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, d) avataan bakteerin plasmidivektori restriktioendonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind III:n, Hsu I:n tai Eco Rl:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla esimerkik- 25 si inkuboimalla pH:ssa 7,6 37°C:ssa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jolla on kohesiiviset päät, e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivek-torin 51-fosfaattipääteryhmät käsittelemällä esimerkiksi alkalisella fosfataasilla pH:ssa 8,0 65°C:ssa 30 minuutin 30 ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset päät eivät voi liittyä toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plasmidivektori ja kohdassa c) saatu cDNA sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa, 35 esimerkiksi pH:ssa 7,6 14°C:ssa tunnin ajan, käyttäen plas- 46 65446 midivektorin moolista ylimäärää, ja g) sekoitetaan bakteeri, kuten E. coli-bakteeri, esimerkiksi E. coli X-1776, ja kohdassa f) saatu reaktio-tuote, jotta saadaan insuliinia koodaavan nukleotidisek-5 venssin sisältävä bakteeri. v 65446 Förfarande för framställning av en bakterie som in-nehäller en för insulin kodande nukleotidsekvens, k ä n -5 netecknat därav, att a) mRNA isoleras ur öceller av bukspottkörtelväv-nad genom att homogenisera dessa i närvaro av ett ribonuk-leas inhiberande ämne, vilket kan utgöras t.ex. av en lös-ning innehällande 4 mol/1 guanidiumtiocyanat och 0,05...1,0 10 mol/1 /&-merkaptoetanol, vid ett pH av 5,0...8,0, varvid säledes nägot ribonukleassönderfall av mRNA ej sker, b) ur den erhällna mRNA framställes pä i och för sig känt sätt med tillhjälp av ett reverstransskriptasenzym en s£dan cDNA, vilken har en för insulin kodande nukleotid- 15 sekvens, och den nämnda cDNA:n omvandlas tili tväträdig, c) tili den erhällna tväträdiga cDNAsns ändar fo-gas restriktionsendonukleasens igenkänningsställesekvenser pä i och för sig känt sätt, varvid säsom restriktionsendo-nukleas användes sarana enzym som i följande steg d), var- 20 efter cDNA:n kapas med tillhjälp av nämnda restriktionsendo-nukleas sä, att kohesiva ändar uppstär, d) en bakterieplasmidvektor öppnas med tillhjälp av en renstriktionsendonukleas, t.ex. med Hind III, Hsu I eller Eco Rl, pä i och för sig känt sätt t.ex. genom att 25 inkubera vid ett pH av 7,6 och en temperatur av 37°C i 2 timmar, för erhällande av en öppnad plasmidvektor med kohesiva ändar, e) den i punkt d) erhällna plasmidvektorns 5'-fosfatändgrupper hydrolyseras genom behandling med t.ex. al- 30 kalisk fosfatas vid ett pH av 8,0 och en temperatur av 65°C i 30 minuter, varvid de i punkt d) nämnda kohesiva ändarna ej kan förenas med varandra, f) den enligt punkt e) behandlade plasmidvektorn och den i punkt c) erhällna cDNAsn kopplas tili varandra 35 pä i och för sig känt sätt, genom att inkubera i närvaro av