FI75185C - Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en foer insulin kodande nukleotidsekvens. - Google Patents

Description

! 75185

Insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä DNA-siirtovektori

Jakamalla erotettu hakemuksesta 781675 5 Tämä keksintö koskee insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävää DNA-siirtovektoria, jota voidaan käyttää mikro-organismia transformoitaessa. Keksinnön mukaiselle DNA-siirtovektorille on tunnusomaista, että mai-10 nittu siirtovektori sisältää deoksinukleotidialisekvens- sin, joka koodaa a) ihmisen insuliinin A-ketjua, nimittäin seuraa- vaa s 5' GGL1ATM2GTL3GAJ4CAJ5TGK6TGK7ACLgQRgS9ATM1QTGK11QR^2 S12X1 3TY1 3TÄK1 4GAJ1 5X1 6TY16GAJ17AAK1 8TÄK1 9^20^21 3' ' b) ihmisen insuliinin B-ketjua, nimittäin seuraa- vaa: 5 ----TTK.GTL.AAK.GAJ.CAK-X^TY^TGK-GGL-QR.S.CAK.-X,,TY,, 2q i ^ j 4 sob / ö y y luiiii GTL12GAJ13Gcli4X15TY15TÄK16X17TY17GTL18TGK19GGL20GAJ21 W22GZ22GGL23Y"rK24TTK25^AK26ACL27CCL28AAJ29ACL30 3'' joissa alisekvensseissä A on deoksiadenyyli, 25 G on deoksiguanyyli, C on deoksisytosyyli: T on tymidyyli, J on A tai G, K on T tai C, L on A, T, C tai G, M on A, C tai T,

Xn on T tai C, jos Yn on A tai G, ja C, jos Y^ on C tai T,

Y on A, G, C tai T, jos X on C, ja A tai G, jos n n J J

Xn on T, on C tai A, jos on G tai A, ja C, jos on C tai T, 2 75185

Zn on A, G, C tai T, jos Wn on C, ja A tai G, jos W on A, n QRn on TC, jos Sn on A, G, C tai T, ja AG, jos Sn on T tai C, 5 on A, G, C tai T, jos QR^ on TC, ja T tai C, jos QR on AG, n.

jossa alanumero n tarkoittaa ihmisen insuliinin sen aminohapon asemaa, jota nukleotidisekvenssi vastaa geneettisen koodin mukaisesti, ja aminohapot on numeroitu 10 aminopäästä lukien.

Tässä selityksessä käytetään seuraavia symboleja ja lyhenteitä:

DNA - deoksiribonukleiinihappo RNA - ribonukleiinihappo 15 cDNA - komplementaarinen DNA

(syntetisoitu entsymaattisesti mRNA-sekvenssistä) mRNA - lähetti-RNA tRNA - siirtäjä-RNA dATP - deoksiadenosiinitrifosfaatti 20 dTTP - deoksitymidiinitrifosfaatti dGTP - deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP - deoksisytidiinitrifosfaatti A - adeniini T - tyrniini 25 G - guaniini C - sytosiini

Tris - 2-amino-2-hydroksietyyli-1,3-propaanidioli EDTA - etyleenidiamiinitetraetikkahappo ATP - adenosiinitrifosfaatti 30 TTP - tymidiinitrifosfaatti

Hind ΙΙΙ-tunnistuskohta - sekvenssi A>IaGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hind III-endonukleaa-sin avulla,

Hsu I-tunnistuskohta - sekvenssi A ΊAGCTT spesifi-35 sesti lohkaistu nuolen kohdalla Hsu I-endonukleaasin avul la,

II

3 75185

Hae ΙΙΙ-tunnistuskohta - sekvenssi GG Ice, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae III-endonukleaasin avulla.

Col El - kolisiini El:ää muodostava plasmidi 5 poly d A - polydeoksiadenylaatti oligo d ~ oligodeoksitymidylaatti (12-18 emästä)

Alu I-tunnistuskohta - sekvenssi AG ^CT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Alu I-endonukleaasin avulla.

10 BAm HI-tunnistuskohta - sekvenssi G |GATCC, spesifisesti lohkaistu nuolen Bam HI - endonukleaasin avulla.

Bgl I-tunnistuskohta - sekvenssi GCCNNNN ^NGGC, spesifisesti . lohkaistu nuolen kohdalla Bgl I-endonukleaasin avulla (Huom: N tarkoittaa nukleotidia).

15 Eco Rl-tunnistuskohta - sekvenssi G ^AATTC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Eco RI-endonukleaasin avulla.

Eco RII-tunnistuskohta - sekvenssi IcCAGG tai AcCTGG, spesifisesti . lohkaistu nuolen kohdalla Eco RII-endonukle-aasin avulla.

20 Hae II-tunnistuskohta - sekvenssi AGCGcIt, AGCGCilc, GGCGC tai GGCGCiC, spesif isesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae II-endonukleaasin avulla.

Hinc II-tunnistuskohta - sekvenssi GTTAAC, GTTGAC, GTCAAG tai GTCGAC, spesifisesti lohkaistu Hinc II-25 endonukleaasin avulla.

Pst I-tunnistuskohta - sekvenssi CTGCA *G, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Pst I-endonukleaasin avulla.

Sai I-tunnistuskohta - sekvenssi G ^TCGAC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sai I-endonukleaasin avulla.

Sst I - tunnistuskohta - sekvenssi GAGCT^C, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sst I-endonukleaasin avulla.

DNA:n emässekvenssin biologinen merkitys on siinä, että se on geneettisen informaation säilytyspaikka. On tunnettua, että DNA:n emässekvenssi on koodi, jonka mukai-^ sesti kaikkien solun valmistamien proteiinien aminohappo jen järjestys määräytyy. Lisäksi sekvenssin osilla saattaa olla tehtävänä säädellä proteiinin valmistusajankohtaa ja 4 75185 määrää.. Säätely-yksiköiden luonne tunnetaan vaillinaisesti. Kunkin säikeen emässekvenssiä käytetään templaattina, kun DNA replikoituu solunjakaantumisessa.

Tapa, jolla DNA:n emässekvenssi-informaatiota käyte-g tään proteiinien aminohappojärjestyksen määräämiseen, on pääpiirteiltään sama kaikilla elävillä organismeilla.

On osoitettu, että jokainen proteiineissa tavallisesti esiintyvä aminohappo määräytyy yhden tai useamman trinukleo-tidin eli triplettisekvenssin mukaan. Näin ollen jokaista .jQ proteiinia varten on olemassa vastaava DNA-segmentti, joka sisältää proteiinin aminohappojärjestystä vastaavan triplettisekvenssin. Geneettinen koodi on esitetty seu-raavassa taulukossa.

Geneettinen koodi 15

Fenyylialaniini (Phe) TTK Histidiini (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJ

Isoleusiini (Ile) ATM Asparagiini (Asn) AAK

Metioniini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJ

20 Väliini (Vai) GTL Asparagiini-

Seriini (Ser) QRS happo (Asp) GAK

Proliini (Pro) CCL Glutamiini-.

Treoniini (Thr) ACL happo (Glu) GAJ

Alaniini (Ala) GCL _ Kysteiini (Cys) TGK

25 Tyrosiini (Tyr) TAK Tryptofaani (Try) TGG

Päätesignaali TAJ Arginiini (Arg) WGZ

Päätesignaali TGA Glysiini (Gly) GGL

Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti tarkoittaa DNA:n'rrinukleotidia, jossa on 5'-pää vasemmalla ja 3’-pää ^ oikealla. Kirjaimet edustavat puriini- ja pyrimidiiniemäk- siä, joista nukleotidisekvenssi muodostuu.

A = adeniini G = guaniini C = sytosiini 35 m .. .

T = tyrniini 5 75185

X = T tai C, jos Y on A tai G, ja X = G, jos Y on C tai T

Y : A, G, C tai T, jos X on C, ja

Y = A tai G, jos X on T

5 W = C tai A, jos Z on A tai G

W : C, jos Z on C tai T Z = A, G, C tai T, jos W on C, ja Z = A tai G, jos W on A QR = TC, jos S on A, G, C tai T 10 QR = AG, jos S on T tai C

S = A, G, C tai T, jos QR on TC S = T tai C, jos QR on AG J = A tai G K = T tai C

15 L = A, T, C tai G

M = A, C tai T

Transskriptioksi nimitetään ensimmäistä vaihetta . siinä biologisessa prosessissa, jolla nukleotidisekvenssi-informaatio muunnetaan aminohapposekvenssiksi. Tässä vai-20 heessa kopioidaan ensin RNA:11a se DNA-segmentti, jonka sekvenssi määrittelee valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksi-riboosi on korvattu riboosilla ja tymiinin tilalla käytetään urasiilia. RNA:n emäkset voivat asettua samanlaisiksi 25 emäspareiksi kuin DNA:n emäkset. Näin ollen DNA-nukleo- tidisekvenssin RNA-transskriptio on komplementaarinen kopioitavan sekvenssin kanssa. Tällainen RNA on nimeltään lähetti-RNA (mRNA), koska sen tehtävänä on toimia välittäjänä solun geneettisen järjestelmän ja proteiineja syntetisoi-30 van järjestelmän välillä.

Solun sisällä käytetään mRNA:ta templaattina siinä monimutkaisessa prosessissa, johon sisältyy lukuisia entsyymejä ja solujärjestelmiä, ja joka johtaa tietyn aminohapposekvenssin syntymiseen. Tätä prosessia nimitetään mRNA:n 35 translaatioksi.

6 75185

Usein esiintyy myös lisävaiheita, joissa translaatio-prosessissa syntetisoitu aminohapposekvenssi muunnetaan funktionaaliseksi proteiiniksi. Insuliini on esimerkki tästä.

5 Insuliinin välitön prekursori on yksittäinen poly- peptidi, nimeltään proinsuliini, joka sisältää kaksi insuliiniketjua, A ja B, joita yhdistää peptidi C, ks. Steiner, D.F., Cunningham, D., Spigelman, L. ja Aten, B. Science 157, 697 (1967). Viimeaikaisen tiedon mukaan 10 insuliinin mRNA:n alkuperäinen translaatiotuote ei ole pro insuliini vaan preproinsuliini, joka sisältää 20 lisäami-nohappoa proinsuliinin aminopäässä, ks. Cahn., S.J.,

Keim, P. ja Steiner D.F., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73, 1964 (1976) ja Lomedico, P.T. ja Saunders, G.F., Nucl.

15 Acids. Res. 3, 381 (1976). Preproinsuliinin rakenne voidaan esittää seuraavasti: NHg (pre-peptidi)-ketju B-(ketju O-ketju A-C00H.

Monet lääketieteen tai tutkimuksen kannalta merkittävät proteiinit sijaitsevat korkeampien organismien, kuten 20 selkärankaisten, soluissa tai ovat näiden solujen valmis tamia. Näitä ovat mm. insuliinihormoni, muut peptidihor-monit, kuten kasvuhormoni, verenpainetta säätelevät hormonit ja monet teollisesti, lääketieteellisesti tai tutkimuksellisesti merkittävät hormonit. Näitä proteiineja on 25 usein vaikea uuttaa organismista käyttökelpoisia määriä, ja tämä ongelma on varsin vaikea ihmisistä peräisin olevien proteiinien kohdalla. Näin ollen tarvitaan menetelmiä, joilla tällaisia proteiineja voidaan valmistaa riittäviä määriä soluissa organismin ulkopuolella. Tietyissä tapauk-30 sissa on mahdollista saada aikaan sopivia solu- linjoja, joita voidaan pitää elossa kudosviljelyteknii-kalla. Kudosviljely on kuitenkin hidasta, elatusaine kallista, olosuhteiden säätely tarkkaa ja saanto pieni. Lisäksi on usein vaikeata säilyttää solulinja vakiona siten, et-35 tä halutut erityisominaisuudet säilyvät.

7 75185

Sitä vastoin mikro-organismeja, kuten bakteereja, on suhteellisen helppo viljellä kemiallisesti määritellyissä elatusaineissa. Fermentointitekniikka on pitkälle kehittynyttä. Organismien viljeleminen nopeasti ja suurilla 5 saannoilla on mahdollista. Lisäksi eräät mikro-organismit ovat geeniensä ja ominaisuuksiensa puolesta perusteellisesti tutkittuja ja tunnettuja.

Näin ollen on erittäin toivottavaa pystyä siirtämään lääketieteellisesti merkittävän proteiinin geneettinen 10 koodi organismista, joka tavallisesti tekee proteiinin sopivaan mikro-organismiin. Tällä tavalla mikro-organismi voi syntetisoida proteiinia säädellyissä kasvuolosuhteissa ja proteiinia voidaan saada haluttu määrä. Valmistuskustannuksia voidaan ehkä myös oleellisesti pienentää, jos 15 proteiinia syntetisoidaan tällaisella menetelmällä. Lisäksi mahdollisuus eristää ja siirtää tietyn proteiinin valmistuksen määrittelevä geneettinen sekvenssi mikro-organismiin, jonka geneettinen tausta tunnetaan hyvin, tarjoaa suuriarvoisen tutkimuskeinon, kun halutaan tietää, kuinka 20 tämän proteiinin synteesi on säädelty ja kuinka proteiinia muokataan synteesin jälkeen. Geneettisiä sekvenssejä voidaan myös muuntaa niin, että saadaan terapeuttisilta tai funktionaalisilta ominaisuuksiltaan muuttuneita proteiineja.

25 Menetelmä, johon keksintö liittyy, on monivaiheinen menetelmä, joka sisältää entsyymien katalysoimia reaktioita. Näiden entsyymireaktioiden luonnetta selostetaan tähän mennessä tiedossa olevien seikkojen perusteella.

Käänteistransskriptaasi (DNA-polymeraasi) katalysoi 30 RNA-templaattisäikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesiä RNA-templaatin, DNA-templaatin ja neljän deoksi-nukleosiditrifosfaatin, dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, läsnäollessa. Reaktio lähtee käyntiin DNA-templaatin ei-kova-lenttisella sitoutumisella mRNA:n 3'-päähän ja sen jälkeen 35 seuraa tarvittavien deoksinukleotidien asteittainen liittäminen kasvavan ketjun 3'-päähän mRNA-nukleotidisekvenssin määritteleminä emäspareina. Saatua molekyyliä voidaan pi- 8 75185 tää hiusneularakenteena, joka sisältää alkuperäisen RNA:n liittyneenä yksittäisellä DNA-säikeellä komplementaariseen DNA-säikeeseen. Käänteistransskriptaasi kykenee myös katalysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä 5 DNA-templaattia, jolloin saatu tuote on kaksisäikeinen DNA-hiusneula, jonka toisessa päässä säikeitä yhdistää yk-sisäikeinen DNA/ ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc.Natl.

Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972) ja Efstratiadis, A., Kafa-tos, F.C., Maxam, A.F. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976). 10 Restriktioendonukleaasit ovat entsyymejä, jotka pystyvät hydrolysoimaan fosfodiesterisidoksia kaksisäi-keisessä DNA:ssa niin, että DNA-säikeeseen muodostuu katkoskohta. Jos DNA on suljetun silmukan muotoinen, silmukan rakenne muuttuu lineaariseksi. Tämän tyyppisen entsyymin 15 pääasiallinen ominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tätä sekvenssiä nimitetään restrik-tioendonukleaasin tunnistuskohdaksi. Restriktioendonukle-aaseja on eristetty useista eri lähteistä ja karakterisoi-20 tu tunnistuskohtiensa nukleotidisekvenssien perusteella.

Jotkut restriktioendonukleaasit hydrolysoivat fosfodieste-risidokset samasta kohdasta kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää. Eräät katalysoivat sellaisten sidosten hydrolyysiä, joita erottaa toisistaan muutama nuk-25 leotidi, ja molekyylin kumpaankin päähän syntyy vapaa yk- sisäikeinen alue. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itse-komplementaarisia ja siten kohesiivisia, ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenliittämiseen. Koska tietyn entsyymin voidaan ennustaa pilkkovan saman tunnis-30 tuskohdan omaavia DNA-molekyylejä, syntyy samat kohesiivi- set päät, ja näin ollen on mahdollista yhdistää restriktio-endonukleaasilla käsiteltyjä heterologisia DNA-sekvenssejä muihin samalla tavalla käsiteltyihin sekvensseihin, ks. Roberts, R.J. Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Restrik-35 tiokohdat ovat kuitenkin melko harvinaisia, mutta restrik- tioendonukleaasien käyttökelpoisuutta on voitu parantaa syntetisoimalla sellaisia kaksisäikeisiä oligonukleotide- 11 9 75185 ja, joissa on tunnistuskohtasekvenssi. Näin ollen voidaan melkeinpä mikä tahansa DNA-segmentti liittää mihin tahansa toiseen segmenttiin siten, että molekyylin päihin liitetään tarvittava restriktio-oligonukleotidi, tuote asete-5 taan tarvittavan restriktioendonukleaasin vaikutukselle alttiiksi niin, että syntyy tarvittavat kohesiiviset päät, ks. Heyneker, H.L., Shine, J., Goodman, H.M., Boyer, H.W., Rosenberg, J., Dickerson, R.E., Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. ja Riggs, A.D., Nature 263, 748 (1976) ja Scheller, 10 R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

S1-endonukleaasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan yksisäikeisen DNA:n fosfodiesterisidoksia tai kaksisäikeisessä DNArssa olevia yksisäikeisiä liitos-15 kohtia, ks. Vogt, V.M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).

DNA-ligaasi on entsyymi, joka kykenee katalysoimaan fosfodiesterisidoksen syntymisen kahden sellaisen DNA-segmentin välille, joissa on 5'-fosfaatti ja 3'-hyd-roksyyli, vastaavasti, ja jollainen saattaa muodostua 20 kahdesta DNA-fragmentista, joita kohesiiviset päät pitävät yhdessä. Entsyymin normaalina toimintatapana pidetään sitä, että se yhdistää toisen säikeen rinnalle syntyvät useat tytär-DNA-fragmentit toisiinsa. DNA-ligaasi voi kuitenkin sopivissa olosuhteissa katalysoida sellaisten 25 tylppien päiden yhtymisen, joissa kaksi tylppäpäistä molekyyliä yhtyy kovalenttisesti, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 67, 1468 (1970).

Alkalinen fosfataasi on yleisentsyymi, joka kykenee 30 hydrolysoimaan fosfaattiestereitä, DNA:n 5'-päätefosfaatit mukaanluettuina.

Mainitun monivaiheisen menetelmän osavaiheessa sijoitetaan tietty DNA-fragmentti DNA-vektoriin, kuten plas-midiin. Plasmidi on nimitys, jota käytetään mistä tahansa 35 itsenäisesti replikoituvasta DNA-yksiköstä, joka on mikro-bisolussa eikä kuulu isäntäsolun omaan genomiin. Plasmidi ei ole geneettisesti sitoutunut isäntäsolun kromosomiin.

10 75185

Plasmidi-DNA esiintyy rengasmaisina kaksisäikeisinä molekyyleinä, joiden molekyylipaino tavallisesti on muutama

Q

miljoona, joidenkin jopa yli 10 , ja ne edustavat tavallisesti vain pientä prosenttimäärää solun kokonais-DNA: 5 sta. Plasmidi-DNA voidaan tavallisesti suuren kokoeronsa vuoksi erottaa isäntäsolun DNA:sta. Plasmidit voivat replikoitua isäntäsolun jakaantumisnopeudesta riippumatta ja joskus niiden jakaantumisnopeutta voidaan säädellä kasvuolosuhteita muuttamalla. Vaikka plasmidi esiintyykin sul-10 jettuna renkaana, siihen voidaan keinotekoisesti liittää DNA-segmentti niin, että syntyy molekyylipainoltaan suurempi rekombinoitu plasmidi, jonka replikoitumiskyky ja geenien ekspressioitumiskyky eivät ole oleellisesti muuttuneet. Näin ollen plasmidi toimii hyödyllisenä vektori-15 na, joka siirtää DNA-segmentin uuteen isäntäsoluun. Re- kombinoitua DNA:ta käyttävään teknologiaan soveltuvia plasmideja ovat varsinkin sellaiset, jotka sisältävät va-lintatarkoituksiin sopivia geenejä, kuten geenejä, jotka aiheuttavat lääkeaineiden vastustuskykyä.

20 Tämän keksinnön käytännöllisen toteutustavan valai semiseksi selostetaan rotan insuliinigeenin eristäminen ja siirto yksityiskohtaisesti. Kohteeksi valittiin insuliini, koska sillä on keskeinen merkitys kliinisessä lääketieteessä ja perustutkimuksessa. Alaan perehtyneet pystyvät selos-25 tetun menetelmän avulla eristämään insuliinigeenin orga nismista, ihminen mukaanluettuna.

Insuliini eristettiin ensimmäisen kerran vuonna 1922. Nykyisin tämän hormonin käyttö sokeritaudin hoidossa tunnetaan hyvin. Vaikka teurastamoilta tulevat naudan 30 ja sian haimat ovat insuliinilähteitä, tästä hormonista tulee olemaan pulaa, koska diabeetikkojen määrä maailmassa kasvaa. Lisäksi joillakin diabeetikoilla kehittyy haitallinen allergia naudan ja sian insuliinille. Siksi on erittäin toivottavaa pystyä tuottamaan riittävästi ihmi-35 sen insuliinia maailmanlaajuista tarvetta tyydyttämään.

ii 11 75185

Jos ihmisen insuliinia voitaisiin tuottaa bakteerien avulla, tämä päämäärä olisi saavutettavissa. Tämän keksinnön tekemiseen asti on päämäärän saavuttamista kuitenkin vaikeuttanut se, että ei ole ollut olemassa menetelmää, jol-5 la insuliinigeeni voitaisiin siirtää bakteereihin. Tämä keksintö sisältää kyseisen menetelmän.

Kun kyetään saamaan aikaan tietyn sekvenssin omaava DNA, jonka geneettinen koodi vastaa tiettyä proteiinia, on mahdollista kemiallisin tai biologisin keinoin muuntaa 10 nukleotidisekvenssiä niin, että lopuksi saatu spesifinen proteiini on myös modifioitu. Tämä antaisi esimerkiksi mahdollisuuden valmistaa modifioitua insuliinia, joka sopisi tiettyyn lääketieteelliseen tarkoitukseen. Näin ollen mikro-organismille voidaan antaa sellainen geneettinen 15 kapasiteetti, että se kykenee valmistamaan insuliinityyp- pisen aminohapposekvenssin, jolla on insuliinin oleelliset ominaisuudet.

Kyky siirtää tietyn korkeamman organismin normaalille aineenvaihdunnalle välttämättömän proteiinin geneet-20 tinen koodi mikro-organismiin, kuten bakteeriin, avaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien tuottamiselle viljelemällä. Tämä taas tarjoaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien määrän lisäämiselle tai korvaamiselle sellaisilla proteiineilla, jotka on valmis-25 tettu transformoiduilla mikro-organismeilla, kun korkeam man organismin kyky tuottaa tällaisia proteiineja on puutteellinen ja voidaan ajatella esimerkiksi mahdollisuutta saada aikaan symbioottinen suhde tämän keksinnön avulla syntetisoidun mikro-organismin ja kroonista tai äkillistä 30 puutostautia sairastavan ihmisen välille, jolloin tässä selostetulla tavalla geneettisesti transformoitu mikro-organismi siirrostettaisiin tai muulla tavalla liitettäisiin ihmiseen kompensoimaan ihmisen aineenvaihdunnassa ilmenevää patologista puutteellisuutta.

35 Esimerkkeinä tähän keksintöön kuuluvista spesifi sistä DNA-sekvensseistä siirretään rotan preproinsuliinin 12 751 85 rakennegeeni bakteeriin. Näin ollen voidaan ajatella, että menetelmää voidaan hyvin soveltaa minkä tahansa korkeammalta organismilta, kuten selkärankaiselta, otetun DNA-sekvenssin siirtämiseen mihin tahansa mikro-organismiin.

5 Tässä yhteydessä korkeampi organismi määritellään miksi tahansa erilaistuneita kudoksia sisältäväksi eukaryootti-seksi organismiksi, joihin kuuluvat mm. hyönteiset, nilviäiset, kasvit ja selkärankaiset, nisäkkäät mukaanluettuina, joihin puolestaan kuuluvat nautaeläimet, siat, 10 kädelliset ja ihminen. Mikro-organismilla ymmärretään mi tä tahansa mikroskooppisen pientä elävää organismia, jonka yleisnimitys on alkueliö, ja joka voi olla prokaryoot-tinen tai eukaryoottinen, kuten bakteeri, alkueläin, levä tai sieni, joihin luetaan myös hiivat. Kyseisessä proses-15 sissa haluttu solukko eristetään ensin parannetulla mene telmällä. mRNA eristetään soluista muuttumattomana uudella menetelmällä, jossa RNA-aasiaktiivisuus on käytännöllisesti katsoen kokonaan hävitetty. Vahingoittumaton mRNA puhdistetaan uutteesta pylväskromatografisesti ja se saa-20 tetaan käänteistransskriptaasientsyymin vaikutukselle alttiiksi komplementaarisen säikeen (cDNA) syntetisoimi-sessa tarvittavien neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Tässä ensimmäisessä vaiheessa käänteistrans-skriptaasin avulla saatuun tuotteeseen kohdistetaan menet-25 tely, jolla ribonukleotidisekvenssi poistetaan selektiivi sesti. Jäljelle jäänyttä deoksinukleotidisekvenssiä, joka on komplementaarinen alkuperäisen mRNA:n kanssa, inkuboi-daan toisessa reaktiossa käänteistransskriptaasin eli DNA-polymeraasin kanssa neljän deoksinukleosiditrifosfaatin 30 läsnäollessa. Saatu tuote on kaksinkertainen cDNA, jonka komplementaariset säikeet ovat liittyneet toisiinsa yksinkertaisella säikeellä toisesta päästä. Siten tämä tuote käsitellään yksinkertaiselle säikeelle spesifisellä nukleaasilla, joka katkaisee yksinkertaisen yhdistävän 35 säikeen. Saatua kaksisäikeistä cDNArta pidennetään lisää mällä kumpaankin päähän tietty DNA, joka sisältää restrik-tioentsyymin tunnistuskohtasekvenssin. Lisäys katalysoidaan DNA-ligaasi-entsyymillä. Tämän jälkeen pidennetty 13 751 85 cDNA käsitellään restriktioendonukleaasilla, joka tuottaa itsekomplementoituvat yksisäikeiset päät kaksoissäikeen kummankin säikeen 5'-päähän.

Plasmidi-DNA, jossa on saman restriktioendonukleaa-5 sin tunnistuskohta, käsitellään entsyymillä siten, että polynukleotidisäie katkeaa ja muodostuu itsekomplementoituvat yksisäikeiset nukleotidisekvenssit 5'-päihin. Yksisäi-keisten päiden 5'-päätefosfaattiryhmät poistetaan, jotta plasmidi ei pystyisi muodostamaan isäntäsolua transfor-10 moivaa rengasrakennetta. Valmistettua cDNA:ta ja plasmidi- DNA:ta inkuboidaan yhdessä DNA-ligaasin läsnäollessa. Kuvatuissa reaktio-olosuhteissa voi elinkelpoinen suljettu rengasplasmidi-DNA syntyä vain, jos siihen sisältyy cDNA-segmentti. cDNA-sekvenssin sisältävä plasmidi siirre-15 tään tämän jälkeen sopivaan isäntäsoluun. Sellaiset solut, jotka ovat saaneet elinkelpoisen plasmidin, tunnistetaan kasvatuksessa pesäkkeistä, joilla on plasmidille kuuluva geneettinen ominaisuus, kuten lääkkeenvastustuskyky. Tämän jälkeen viljellään niitä puhtaita bakteerikantoja, 20 joissa on cDNA-sekvenssin sisältävä rekombinoitu plasmidi, ja rekombinoitu plasmidi eristetään uudelleen. Tällä tavalla voidaan valmistaa suuria määriä rekombinoitua plas-midi-DNA:ta ja spesifinen cDNA-sekvenssi voidaan eristää tästä endonukleolyyttisellä lohkaisulla sopivan restriktio-25 entsyymin avulla.

Tämän keksinnön sisältämää perusmenetelmää voidaan soveltaa minkä tahansa korkeamman organismin, ihminen mukaanluettuna, sisältämän halutun nukleotidisekvenssin eristämiseen ja siirtämiseen isäntämikro-organismiin. Menetel-30 mää voidaan käyttää tietyn lääketieteellisesti tai teolli sesti arvokkaan proteiinin geneettisen koodin siirtämiseen ja tällaisen proteiinin mikrobiologiseen syntetisointiin. Tämän keksinnön sisältämän menetelmän käytännöllistä puolta valotetaan selostamalla rotan insuliinin nukleotidisek-35 venssin eristäminen, siirto bakteereihin ja replikoitumi- nen niissä. Menetelmä soveltuu myös ihmisestä eristetyn nukleotidisekvenssin, kuten ihmisen insuliinin, siirtämiseen.

14 75185 Tämä keksintö liittyy menetelmään, jolla tietyn nuk-leotidisekvenssin omaava DNA-molekyyli voidaan eristää ja siirtää mikro-organismiin ja alkuperäinen DNA:n nukleoti-disekvenssi löytää replikoitumisen jälkeen organismista.

5 Menetelmän eri vaiheet voidaan jakaa neljään ryh mään.

1. Halutun solukon eristäminen korkeammasta organismista

Tietyn proteiinin geneettiselle koodille on olemas-10 sa kaksi mahdollista lähdettä, nimittäin lähdeorganismin DNA tai DNA:n RNA-transskriptio. Yhdysvaltain kansallisten terveysinstituuttien (National Institutes of Health) tämänhetkisten turvallisuusvaatimusten mukaan ihmisen geenejä, olivatpa ne millaisia tahansa, voidaan sijoittaa 15 rekombinoituun DNA:han ja sen jälkeen bakteereihin vain silloin, kun geenit ovat perusteellisesti puhdistettuja, tai kun käytössä on erityisen suuria riskejä sisältävälle työskentelylle tarkoitetut tilat (P4), ks. Federal Register, Voi. 41, No. 131, 1967-07-07, s. 27902-27943. Näin ollen 20 missä tahansa ihmisen proteiinin valmistukseen tähtääväs sä menetelmässä, kuten tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä, on lähdettävä sellaisen spesifisen mRNA:n eristämisestä, joka sisältää halutun proteiinin koodin. Tässä toimintatavassa on lisäksi se etu, että solusta uutettu 25 mRNA voidaan puhdistaa helpommin kuin solusta uutettu DNA.

Varsinkin on mahdollista käyttää hyväksi sitä seikkaa, että pitkälle erikoistuneissa organismeissa, kuten selkärankaisissa, on tietyissä paikoissa tiettyjä solukkoja, joiden tehtävänä on tuottaa jotakin kyseeseen tulevaa 30 proteiinia. Vaihtoehtoisesti tällainen solukko voi esiin tyä jossakin organismin kehitysvaiheessa. Suurin osa tällaisen solukon soluista eristetystä mRNA:sta sisältää halutun nukleotidisekvenssin. Näin ollen eristettävän solukon ja eristysmenetelmän valinnassa voidaan ottaa huo-35 mioon ne edut, joita eristettävän mRNA:n alkuperäinen puhtausaste tarjoaa.

Il 15 751 85

Useimmissa kudoksissa, rauhasissa ja elimissä soluja yhdistää kuituinen sidekudos, joka on koostunut pääasiassa kollageenista, mutta voi kudoksesta riippuen sisältää myös muita rakenneproteiineja, polysakkarideja ja kiven-5 näisainevarastoja. Solujen eristäminen tietystä kudoksesta edellyttää menetelmiä, joilla solut voidaan irrottaa sidekudoksesta. Tietyn erikoistuneen solutyypin eristäminen ja puhdistaminen sisältää näin ollen kaksi päävaihetta, jotka ovat solujen erottaminen sidekudoksesta ja halu-10 tun solutyypin erottaminen muuntyyppisistä kudoksen so luista. Esimerkkinä selostetaan menetelmä, jolla voidaan eristää haiman Langerhansin saarekkeet, jotka sopivat insuliinin mRNA-koodin eristämiseen.

Insuliinia tuottavia soluja voidaan johtaa muista-15 kin lähteistä, kuten sikiöasteella olevan vasikan haimas ta tai viljellyistä saarekekasvainsoluista. Puhtaiden saa-rekesolujen eristäminen on tällöin paljon yksinkertaisempaa, varsinkin jos käytetään puhtaita soluviljelmiä. Edellä selostettua saarekesolujen eristämismenetelmää ei täl-20 löin tarvita, mutta se on kuitenkin edullinen yleisen käyt tökelpoisuutensa vuoksi.

Usein on todettu, että halutun mRNA:n osuutta voidaan lisätä, jos käytetään hyväksi solun kykyä reagoida ulkoisiin ärsykkeisiin. Esimerkiksi hormonikäsittely saat-25 taa aiheuttaa halutun mRNA:n tuotannon lisääntymisen. Mui ta menetelmiä ovat kasvatus tietyssä lämpötilassa ja/tai tietyssä ravinteessa tai muussa kemiallisessa aineessa. Eristettäessä rotan kasvuhormonin mRNA:ta viljeltyjen rotan aivolisäkesolujen käsittely kilpirauhashormonilla ja 30 glukokortikoideilla lisäsi synergistisesti kasvuhormonin mRNA:n määrää merkittävästi.

2. mRNA:n uuttaminen Tärkeä piirre tässä keksinnössä on se, että solu-uutteesta poistetaan RN-aasiaktiivisuus käytännöllisesti 35 katsoen kokonaan. Uutettava mRNA on yksisäikeinen poly- nukleotidi, jossa ei ole mitään komplementaarista säiettä.

16 751 8 5 Näin ollen yhdenkin fosfodiesterisidoksen hydrolyyttinen katkeaminen sekvenssissä tekisi koko molekyylin kykenemättömäksi siirtämään vahingoittumatonta geneettistä sekvenssiä mikro-organismiin. Kuten edellä mainittiin, RN-aasi 5 on laajalle levinnyt ja se on hyvin aktiivinen ja poik keuksellisen pysyvä. Sitä on iholla, se kestää tavalliset lasitavaroiden pesumenetelmät ja joskus se kontaminoi orgaaniset kemikaalit.

Haimasolu-uutteita käsiteltäessä vaikeudet ovat 10 erittäin suuret, sillä haima tuottaa ruoansulatusentsyy mejä ja on siten hyvin RN-aasipitoinen. RN-aasiepäpuh-taus koskee kuitenkin kaikkia kudoksia ja tässä selostettua RN-aasiaktiivisuuden tuhoamismenetelmää voidaan soveltaa kaikkiin soluihin. Menetelmän poikkeuksellinen tehok-15 kuus esitetään muuttumattoman mRNA:n eristämisessä haiman saarekesoluista.

Tässä keksinnössä käytetään kaotrooppisen anionin, kaotrooppisen kationin ja disulfidisidoksia pilkkovan rea-genssin yhdistelmää solujen rikkomisen aikana ja kaikkien 20 niiden operaatioiden aikana, jotka tarvitaan käytännölli sesti katsoen proteiinittoman RNA:n aikaansaamiseksi. Edellä mainittujen reagenssien yhteisvaikutuksen tehokkuus on todettu käytännössä eristämällä käytännöllisesti katsoen vahingoittumaton mRNA hyvällä saannolla rotan haimasta 25 eristetyistä Langerhansin saarekkeista.

Sopivien kaotrooppisten ionien valinta riippuu niiden vesiliukoisuudesta ja saatavuudesta. Sopivia kaotroop-pisia kationeja ovat mm. guanidinium, karbamoyyliguanidium, guanyyliguanidinium, litium tms. Sopivia kaotrooppisia 30 anioneja ovat mm. jodidi, perkloraatti, tiosyanaatti, dijodisalisylaatti tms. Tällaisten anionien ja kationien muodostamien suolojen suhteellinen tehokkuus määräytyy niiden liukoisuuden mukaan. Esimerkiksi litiumdijodisalisylaatti on voimakkaampi denaturantti kuin guanidiniumtio-35 syanaatti, mutta sen liukenevuus on vain noin 0,1 mol/1 ja se on myös suhteellisen kallista. Guanidiniumtiosya-

II

17 75185 naatti on etusijalle asetettava kationi-anioniyhdistelmä, koska sitä on helposti saatavissa ja sen liukenevuus vesiliuoksiin on hyvä, jopa noin 5 mol/1.

Tioliyhdisteiden, kuten β-merkaptoetanolin, tiedetä tään rikkovan tioli-disulfidivaihtoreaktiolla proteiinien molekyylinsisäisiä disulfidisidoksia. β-merkaptoetanolin lisäksi tunnetaan useita sopivia tioliyhdisteitä, kuten ditiotreitoli, kysteiini, propanolidimerkaptaani tms. Vesiliukoisuus on tarpeellinen vaatimus, sillä tioliyhdis-1 q tettä pitää olla läsnä suuri ylimäärä molekyylinsisäisiin disulfideihin verrattuna, jotta vaihtoreaktio tapahtuisi käytännöllisesti katsoen täydellisesti, β-merkaptoetano-li on asetettava etusijalle, koska sitä on helposti saatavissa kohtuulliseen hintaan.

1 g Tietyn kaotrooppisen suolan tehokkuus on suoraan verrannollinen sen väkevyyteen, kun halutaan inhiboida RN-aasi uutettaessa RNA:ta soluista tai kudoksista. Edullinen väkevyys on sen vuoksi suurin käytännössä toteutettavissa oleva väkevyys. Sen, että tässä keksinnössä onnis-2Q tutaan säilyttämään mRNA vahingoittumattomana uuton aika na, arvellaan johtuvan siitä nopeudesta, jolla RN-aasi denaturoituu, ja denaturoituraisasteesta. Näin ilmeisesti selittyy guanidiniumtiosyanaatin paremmuus hydrokloridiin nähden, vaikka hydrokloridi on denaturointiaineena vain 25 hieman heikompi. Denaturointiaineen tehokkuus määritellään siksi kynnysväkevyydeksi, joka tarvitaan proteiinin täydelliseen denaturoimiseen. Toisaalta proteiinien denaturoitu-misnopeus riippuu usein denaturantin väkevyyden suhteesta kynnysarvoon 5-10 potenssiin korotettuna, ks. Tanford, 30 C.A., Adv. Prot. Chem. 23, 121 (1968). Kvalitatiivisesti tämä suhde merkitsee sitä, että guanidiniumhydrokloridia vain hieman tehokkaampi denaturantti pystyy denaturoimaan proteiinin monta kertaa nopeammin samana konsentraationa. RN-aasidenaturaation kinetiikan ja mRNA:n säilymisen vä-33 listä suhdetta soluista tapahtuvan uuton aikana ei nähtävästi ole havaittu eikä tutkittu ennen tätä keksintöä.

,8 751 85

Jos edellä oleva analyysi on oikea, pitäisi edullisen de-naturantin olla sellainen, jolla on matala kynnysväkevyys denaturoinnissa ja suuri vesiliukoisuus. Tämän vuoksi gua-nidiniumtiosyanaatti on edullisempi kuin litiumdijodisali-5 sylaatti, vaikka viimeksimainittu on voimakkaampi denatu- rantti, sillä guanidiniumtiosyanaatti on liukoisempi, ja näin ollen sitä voidaan käyttää sellaisena väkevyytenä, että RN-aasi inaktivoituu nopeammin. Edellä oleva analyysi selittää myös, miksi guanidiniumtiosyanaatti, joka on hieman 10 voimakkaampi denaturantti, on edullisempi kuin lähes yhtä liukoinen hydrokloridi.

Disulfidisidoksia katkaisevan reagenssin käyttö yhdessä denaturantin kanssa tekee mahdolliseksi jälkimmäisen vaikutuksen ja tehostaa sitä, koska RN-aasimolekyyli muut-15 tuu kokonaan avautuneeksi. Tioliyhdisteen ajatellaan aut tavan denaturointiprosessin etenemistä, koska se estää nopean denaturoinnin, joka voi tapahtua, jos molekyylin-sisäiset disulfidisidokset jätetään koskemattomiksi. Lisäksi mRNA-valmisteen sisältämä RN-aasiepäpuhtaus säilyy 20 käytännöllisesti katsoen inaktiivisena, vaikka denaturant- tia ja tiolia ei olisikaan läsnä. Disulfidisidoksia katkaisevat reagenssit, joissa on tioliryhmiä, ovat jossain määrin tehokkaita minä tahansa konsentraationa, mutta on edullista käyttää suurta tioliryhmien ylimäärää molekyy-25 linsisäisiin disulfidisidoksiin verrattuna, jolloin vaihtoreaktio saadaan ajetuksi molekyylinsisäisten disulf idisidosten katkeamisen suuntaan. Toisaalta, koska monet tioliyhdisteet ovat pahanhajuisia ja suurten väkevyyksien kanssa on epämiellyttävä työskennellä, on käy-30 tännön syistä olemassa väkevyyden yläraja. Kun β-merkap- toetanolia käytetään vahingoittumattoman RNA:n erottamiseen, on alueella 0,05-1,0 mol/1 olevat väkevyydet havaittu tehokkaiksi, ja optimaalisen väkevyyden katsotaan olevan 0,2 mol/1.

35 Väliaineen pH voi olla missä tahansa välillä 5,0- 8,0, kun mRNA uutetaan soluista.

Il 19 75185

Solujen rikkomisen jälkeen RNA erotetaan solun proteiineista ja DNA:sta. Tähän tarkoitukseen on kehitetty useita menetelmiä. Tavallinen menetelmä on etanoli-saostus, jolla RNA saostetaan selektiivisesti. Tämän kek-5 sinnön sisältämässä menetelmässä on edullisempaa jättää saostusvaihe pois ja kerrostaa homogenaatti suoraan 5,7 mol/1 cesiumkloridiliuokseen sentrifugiputkessa ja sen jälkeen suorittaa sentrifugointi julkaisussa Glisin, V., Crkvenjakov, R. ja Buys, C., Biochemistry 12, 2633 (1974) 1 q kuvatulla tavalla. Tämä menetelmä on edullinen, koska RN- aasille vahingollinen ympäristö voidaan säilyttää koko ajan ja saadaan hyvällä saannolla RNA:ta, joka ei sisällä DNA:ta eikä proteiinia.

Edellä kuvatulla menetelmällä saadaan soluhomoge-15 naatin koko RNA puhdistetuksi. Tästä RNA:sta on kuiten kin haluttua mRNA:ta vain osa. Puhdistusta jatkettaessa käytetään hyväksi sitä seikkaa, että korkeampien organismien soluissa mRNA:ta prosessoidaan transskription jälkeen siten, että siihen liitetään polyadenyylihappoa.

2o Tällainen poly-A-sekvenssejä sisältävä mRNA voidaan erot taa selektiivisesti kromatografiapylväässä, jossa on täytteenä selluloosaa, johon on liitetty oligotymidylaat-tia, ks. Avis, H. ja Leder, P., edellä. Edellä kuvattu menetelmä on sopiva silloin, kun tarvitaan käytännöllises-25 ti katsoen puhdasta, vahingoittumatonta ja translaatio- kelpoista mRNA:ta RN-aasia runsaasti sisältävistä lähteistä. mRNA:n puhdistus ja sen jälkeiset in vitro-toi-menpiteet voidaan suorittaa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla mille tahansa mRNA:lie huolimatta lähde-or-30 ganismista.

Tietyissä tapauksissa, kuten käytettäessä kudos- viljelmäsoluja mRNA-lähteenä, RN-aasiepäpuhtaus voi olla niin vähäinen, ettei edellä kuvattua RN-aasin inhibointia tarvita. Tällöin ennestään tunnetut RN-aasiaktiivisuuden 35 poistomenetelmät riittävät.

20 7 5 1 85 3. cDNA:n muodostaminen Tässä yhteydessä viitataan kuvioon 1, jossa on kaavioesitys menetelmän jäljellä olevista vaiheista. Ensimmäisenä vaiheena on puhdistetun mRNA:n kanssa komple-5 mentaarisen DNA-sekvenssin muodostaminen. Tämän reaktion entsyymiksi valitaan käänteistransskriptaasi, vaikka periaatteessa voitaisiin käyttää mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka kykenee muodostamaan komplementaarisen DNA-säikeen käyttämällä mRNA:ta templaattina. Reaktio voidaan 10 suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa siten, että mRNA:ta käytetään templaattina ja neljän deoksinukleosidi-trifosfaatin seosta DNA-säikeen prekursorina. On edullista, jos yksi deoksinukleosiditrifosfaateista on merkitty 32 α-asemassa P-atomilla, sillä sen avulla voidaan seurata Ί5 reaktiota, se toimii merkkinä erotusmenetelmissä, kuten kromatografiässä ja elektroforeesissa, ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia päätelmiä, ks. Efstratiadis, A., et ai., edellä.

Kuten kuviosta ilmenee, käänteistransskriptaasin 20 reaktiotulos on kaksisäikeinen hiusneularakenne, jossa RNA-säiettä ja DNA-säiettä yhdistää toisiinsa ei-kovalent-tinen sidos.

Käänteistransskriptaasireaktion tuote poistetaan reaktioseoksesta tunnetuilla menetelmillä. On havaittu 25 hyödylliseksi käyttää fenoliuuton, kromatografiän ("Sepha- dex^G-100", Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi) ja etanoli-uuton yhdistelmää.

Kun cDNA on syntetisoitu entsymaattisesti, RNA-temp-laatti voidaan poistaa. Ennestään tunnetaan useita menetel-30 miä, joilla RNA voidaan hajottaa selektiivisesti DNA:n läsnäollessa. Alkalinen hydrolyysi on edullinen menetelmä, koska se on hyvin selektiivinen ja sitä voidaan helposti säädellä pH:n avulla.

Alkalisen hydrolyysin ja neutraloinnin jälkeen 32 35 P:llä merkitty cDNA voidaan haluttaessa väkevöidä etano- lisaostuksella.

21 75185 Tällaisen kaksisäikeisen hiusneula-cDNA:n syntetisointi tapahtuu sopivan entsyymin, kuten DNA-polymeraasin tai käänteistransskriptaasin avulla. Reaktio-olosuhteet 32 ovat aikaisemmin kuvatun kaltaiset, a- P:llä merkitty 5 nukleosiditrifosfaatti mukaanluettuna. Käänteistransskrip- taasia saadaan useista lähteistä. Linnun Myeloblastosis-virus on edullinen lähde. Virusta valmistaa tohtori D.J. Beard, Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, National Institutes of Health’in kanssa tekemällään sopi--j q muksella.

Kun cDNA-hiusneula on muodostettu, saattaa olla edullista puhdistaa se reaktioseoksesta. Kuten aikaisemmin mainittiin, on edullista käyttää fenoliuuttoa, kroma-tografiaa ("SephadeiP^G-1 00") ja etanolisaostusta, kun DNA 15 halutaan saada puhdistetuksi proteiiniepäpuhtauksista.

Hiusneularakenne voidaan muuntaa tavalliseksi kak-sisäikeiseksi DNA-rakenteeksi siten, että komplementaarisia säikeitä yhdistävä yksittäinen säie poistetaan. On olemassa useita entsyymejä, jotka kykenevät spesifisesti 2o hydrolysoimaan DNA:n yksisäikeisiä osia. Tähän tarkoituk seen hyvin sopiva entsyymi on Aspergillus oryzaesta eristetty S1-nukleaasi (valmistaja Miles Research Products, Elkhart, Indiana). Kun DNA-hiusneularakenne käsitellään Sl-nukleaasilla, saadaan hyvällä saannolla sellaisia mo-25 lekyylejä, joissa on emäsparipäät. Tämän jälkeen suorite taan uutto, kromatografia ja etanolisaostus, kuten edellä on kuvattu. Efstratiadis et ai. ovat edellä mainitussa julkaisussa selostaneet mRNA:n kaksisäikeisten cDNA-transskrip-tioiden syntetisointia käänteistransskriptaasin ja S1-nuk-30 leaasin avulla.

Tylppäpäisten cDNA-molekyylien osuutta voidaan mahdollisesti lisätä, jos suoritetaan käsittely E. colin DNA-polymeraasi I:llä neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Entsyymin eksonukleaasiaktiivisuuden ja po-35 lymeraasiaktiivisuuden yhteisvaikutus toimii siten, että 22 7 5 1 85 ulkoneva 31-pää poistuu ja ulkoneva 5'-pää täyttyy. Näin voidaan varmistaa, että mahdollisimman suuri määrä cDNA-molekyylejä osallistuu seuraavan vaiheen liittämisreaktioi-hin.

^ Keksinnön mukaisen menetelmän seuraavassa vaihees sa käsitellään cDNA-tuotteen päät niin, että kuhunkin päähän saadaan restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan sekvenssi. Käytännön syyt määräävät päihin liitettävän DNA-fragmentin valinnan. Päihin lisättävä sekvenssi vali-taan restriktioendonukleaasin perusteella ja tämä puolestaan valitaan sen DNA-vektorin perusteella, johon cDNA liitetään. Valittavassa plasmidissa pitäisi olla vähintään yksi kohta, johon restriktioendonukleaasin katkaisu-vaikutus voi kohdistua. Esimerkiksi plasmidi pMB9 sisäl-tää yhden tunnistuskohdan entsyymille Hind III. Hind III eristetään Haemophilus influenzaesta ja puhdistetaan seu-raavalla menetelmällä: Smith, H.O. ja Wilcox, K.W., J.

Mol.Biol. 51, 379 (1970). Haemophilus aegyptious-orga-nismin entsyymi Hae III puhdistetaan seuraavalla menetel-mällä: Middleton, J.H., Edgell, M.H. ja Hutchinson III, C.A., J. Virol. 10, 42 (1972). Haemophilus suis-organis-min entsyymi, Hsu I, katalysoi saman paikkaspesifisen hydrolyysin samassa tunnistuskohdassa kuin Hind III. Näin ollen näitä kahta entsyymiä voidaan pitää funktionaali- sesti vaihtoehtoisina.

25

Kaksois-cDNA:n päihin liittämistä varten on edullista käyttää kemiallisesti syntetisoitua kaksisäikeistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind IIl:n tunnistuskohdan. Kaksisäikeisen dekanukleotidin sekvenssi on esitetty ku- 30 viossa 1, ks. Heyneker, H.L., et ai. ja Scheller, R.H., et ai. edellä. Alalla työskenteleville on tarjolla useita tällaisia tunnistuskohtasekvenssejä, ja tästä syystä on mahdollista valita kaksois-DNA:n päät, kussakin tapauksessa tarvittavalle restriktioendonukleaasille sopiviksi.

35 Restriktiokohtasekvenssien liittäminen cDNA:n päi hin voidaan toteuttaa menetelmällä, jota nimitetään tylppään päähän liittämiseksi, ja jolloin katalysoidaan DNA-

II

23 751 85 ligaasilla, joka on puhdistettu seuraavalla menetelmällä: Panet, A., et ai.. Biochemistry 12, 5045 (1973). Edellä mainitut Sgaramella, V., et ai. ovat selostaneet tylppään päähän liittämisreaktiota. Tylppään päähän liittämisessä, 5 jossa reaktio tapahtuu tylppäpäisen cDNA:n ja suuren mo- laarisen ylimäärän kanssa kaksisäikeistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind III endonukleaasin tunnistuskohdan, saadaan tuotteeksi cDNA, jonka kummassakin päässä on Hind III:n restriktiokohtasekvenssi. Kun reaktiotuote käsitel-10 lään Hind ΙΙΙ-endonukleaasilla, tapahtuu katkeaminen re- striktiokohdassa ja muodostuu yksisäikeiset itsekomplemen-toituvat 5'-päät, kuten kuviosta 1 ilmenee.

4. Yhdistelmä-DNA:n siirtovektorin muodostaminen Periaatteessa voitaisiin käyttää monenlaisia virus-15 ja plasmidi-DNA-molekyylejä muodostettaessa rekombinaatte- ja juuri kuvatulla tavalla valmistetun cDNA:n kanssa. Pää-vaatimuksia ovat, että DNA:n siirtovektori kykenee menemään isäntäsoluun ja replikoitumaan siellä, ja vektorilla pitäisi olla sellainen geneettinen ominaisuus, jonka avul-20 la voidaan erottaa ne isäntäsolut, jotka ovat saaneet vektorin. Yleisistä turvallisuussyistä pitäisi valinta kuitenkin rajoittaa koetyyppiin soveltuviin siirtovektorila-jeihin NIH:n ohjeita noudattaen, ks. edellä. Tällä hetkellä käyttöön hyväksyttyjä sopivia siirtovektoreita ovat mm. 25 useat bakteriofagilambdajohdannaiset (ks. esim. Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E., Denniston-Thompson, K., Faber, H.E., Furlong, L.A., Grunwald, D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schumm, J.W., Sheldon, E.L. ja Smithies, O., Science 196, 161 (1977) ja col E1-plasmidijohdannaiset 30 (ks. esim. Rodriquez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M.,

Boyer, H.W. ja Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms In the Control of Gene Expression, D.P. Nierlich, W.J. Rutter, C.F. Fox, Eds. (Academic Press, NY, 1976) ss. 471-477). Col E1:stä johdetuille plasmideil-35 le on ominaista suhteellisen pieni koko, sillä niiden mo-lekyylipaino on muutaman miljoonan luokkaa, ja se, että 24 751 85 normaaliolosuhteissa plasmidi-DNA:n kopioiden luku isän-täsolua kohti on 20-40, mutta se saadaan nostetuksi tuhanteen tai sitäkin suuremmaksi, kun isäntäsolut käsitellään kloramfenikolilla. Isäntäsolun kyky suurentaa sisältämään-5 sä geenimäärää tekee tietyissä olosuhteissa tutkijan sää- dellessä mahdolliseksi sen, että isäntäsolu tuottaa pääasiassa plasmidigeenien koodaamia proteiineja. Näin ollen tällaiset col E1-johdannaiset ovat edullisia siirto-vektoreita tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä. So-10 pivia col E1-johdannaisia ovat mm. plasmidit pMB-9, jonka sisältämä geeni aiheuttaa vastustuskyvyn tetrasykliinille, ja pBR313, pBR315, pBR316, pBR317 ja pBR322, jotka sisältävät tetrasykliiniresistenssin geenin ja ampisilliini-resistenssin geenin. Resistenssiä aiheuttavan geenin läs-15 näolo tarjoaa sopivan keinon, jolla voidaan valita solut, jotka ovat infektoituneet plasmidilla, sillä tällaiset pesäkkeet kasvavat lääkkeen läsnäollessa, mutta jos plas-midia ei ole,- solut eivät kasva. Tämän selityksen sisäl-tämissä esimerkeissä käytettiin col Elsstä johdettua plas-20 midia, joka sisälsi em. resistenssigeenin ja yhden Hind III-tunnistuskohdan.

Plasmidi pBR322 on pitkälle karakterisoitu.

Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 95) on kuvannut tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin. Plasmidin 25 pBR322 molekyylipaino on 2,7 x 106 daltonia (Bolivar, F.,

Gene 4 (1978) 121), ja se sisältää ampisilliiniresistens-

R R

sin (Ap :n) ja tetrasykliiniresistenssin (Te :n) aiheut- p tavat geenit. Edellä mainitussa Ap -geenissä on yksi p endonukleaasin Pst 1 tunnistuskohta. Te -geenissä on yksi 30 tunnistuskohta kullekin seuraavista endonukleaaseista:

Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi pBR322 sisältää yhden Eco Rl:n tunnistuskohdan, kaksi Hind II:n tunnistuskohtaa, viisi Eco RII:n tunnistuskohtaa, kolme Bgl I:n tunnistus-kohtaa, 12 Alu I:n tunnistuskohtaa, 12 Hae II:n tunnistus-35 kohtaa ja 17 Hae III:n tunnistuskohtaa. Tunnistuskohdat on merkitty renkaan muotoiseen pBR322-plasmidiin sivul-

II

25 75185

D

la 103 Bolivarin et ai. julkaisussa. Ap -geeni häviää lohkaistaessa plasmidi Pst I:n tunnistuskohdasta ja liitet- £ täessä vierasta DNA:ta siihen. Samoin Te häviää lohkaistaessa pBR322 endonukleaaseilla Hind III, Vai I tai Bam I 5 ja liitettäessä vierasta DNA:ta niiden tunnistuskohtaan.

Liitettäessä DNA Pst I:n tunnistuskohtaan muodostuu rekom-binaatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka s ovat sekä ampisilliinisensitiivisiä (Ap ) että tetrasyk- p liiniresistenttejä (Te ) samoin liittämällä DNA Hind III:n 10 Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi- naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliini-sensitiivisiä. Siirtovektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun neljään tunnistuskohtaan liitettyä vierasta 15 DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtovektorin lääkeaine- resistenssiominaisuuksien perusteella eli siitä, onko se ampisilliinisensitiivinen ja tetrasykliiniresistentti tai ampisilliiniresistentti ja tetrasykliinisensitiivinen. Siirtovektori voidaan edelleen karakterisoida poistamalla 2o siihen liitetty vieras DNA, määrittämällä muodostuneiden kahden tuotteen molekyylipaino ja vertaamalla näitä lähtöaineiden molekyylipainoihin. Lisäksi karakterisointia voidaan täydentää merkitsemällä siirtovektoriin eri endo-nukleaasien tunnistuskohdat. Siirretyn DNA-molekyylin sek-25 venssi voidaan myös määrittää. Mainitun plasmidin pBR322 koko nukleotidisekvenssi on esitetty J. Sutcliffen väitöskirjassa "Nucleotide Sequence of pBR322", Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA, 1978.

Samoin plasmidia pBR313 on pitkälle karakterisoitu. 30 Tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin ovat kuvanneet Bolivar, F. et ai. (Gene 2, (1977) 75). Plasmi din pBR313 molekyylipaino on 5,8 x 106 daltonia, ja se p sisältää ampisilliiniresistenssin (Ap ) ja tetrasykliini- p resistenssin (Te ) aiheuttavat geenit. Plasmidin pBR313 p 35 Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista nukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI. Plasmidin pBR313 26 75185 tunnistuskohdat eri endonukleaaseille on määritetty täydellisesti, ja tästä tuloksena saatu tunnistuskohtakartta on esitetty sivulla 84 Bolivarin et ai. julkaisussa. Liitettäessä vierasta DNArta Hind III:n, Sai I:n tai Bam HI:n 5 tunnistuskohtaan tetrasykliiniresistenssi häviää. Täten yhdistelmä-DNA-molekyylejä löydetään kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliinisensitii-visiä. Siirtovektori voidaan karakterisoida lääkeainere-sistenssiominaisuuksien, siirretyn DNA-sekvenssin, restrik-10 tioentsyymien tunnistuskohtakartan ja edellä mainittujen molekyylipainojen perusteella.

Kolmas plasmidi, jota on pitkälle karakterisoitu, on pMB9. Tämän plasmidin valmistusmenetelmän ovat esittäneet Rodriguez, R.L. et ai. (edellä) ja Bolivar, F. et ai. 15 (Gene 2 (1977) 75). Plasmidin pBM9 molekyylipaino on 3,5 x 10^ daltonia, ja se sisältää tetrasykliiniresistenssin p (Te ) aiheuttavan geenin. Tämä plasmidi sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seuraavista endonukleaaseista:

Eco Rl, Hind III, Sal I ja Bam HI. Näistä kolmen jälkim- p 20 mäisen tunnistuskohdat sijaitsevat Te -geeneissä. Liitet täessä vierasta DNArta Hind Hirn, Sai I:n tai Bam Hirn tunnistuskohtaan tetrasykliiniresistenssi häviää. Siirto-vektori, joka sisältää vierasta DNArta joissakin näistä kohdista, voidaan karakterisoida tämän ominaisuuden perus-25 teella. Tämä siirtovektori voidaan edelleen karakterisoi da määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi, vertaamalla molekyylipainoja ja tunnistuskohta-analyysillä, kuten edellä on kuvattu.

Plasmidia pSC101 on pitkälle karakterisoitu. Cohen, 30 S.H. et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293) ovat kuvanneet tämän plasmidin syntetisoinnin ja alustavan karakterisoinnin. Karakterisointia ovat täydentäneet Cohen, S.N. et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70 (1973) 3240, Boyer, H.W. et ai. (Recombinant Molecules), Beers, R.F.

35 ja Basset, E.G., Raven Press, New York, s. 12 (1977) ja

Cohen, S.N. et ai. (Recombinat Molecules, s. 91). Plasmi- I! 27 75185 din pSCIOI molekyylipaino on 5,8 x 10^ daltonia, ja se si-sältää tetrasykliiniresistenssin (Tc ) aiheuttavan geenin.

p

Tc -geeni sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seuraa-vista endonukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI. Li-5 säksi plasmici pSC101 sisältää yhden Eco RI:n tunnistus kohdan, yhden Hpa I:n tunnistuskohdan, yhden Sma I:n tunnistuskohdan ja neljä Hinc II:n tunnistuskohtaa. Tetra-sykliiniresistenssi häviää halkaistaessa pSC101 endonuk-leaaseilla Hind III, Sal I tai Bam HI ja liitettäessä 10 vierasta DNA:ta näiden tunnistuskohtaan. Liitettäessä DNA Hind III:n, Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan re-kombinaatiomolekyylejä löydetään viljelmistä, jotka ovat tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtovektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun kolmeen kohtaan liitettyä vie-15 rasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtovektorin re- sistenssiominaisuuksien perusteella. Siirtovektori voidaan edelleen karakterisoida (a) poistamalla siirretty vieras DNA-sekvenssi, määrittämällä molekyylipainot ja vertaamalla niitä keskenään, (b) laatimalla tunnistuskohtakartta 20 ja (c) määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi.

28 7 51 8 5

Sopivan isännän valinnassa on monia mahdollisuuksia samoin kuin plasmidin valinnassa. Tässä selostuksessa kuvattuihin menetelmiin on kehitetty E. colikanta X-1776, jonka NIH on hyväksynyt, kun käytetään P2-työsken-5 telytiloja, ks. Curtiss III, R., Ann. Rev. Microbiol. 30, 507 (1976). E. coli RR-1 on sopiva, kun P3-työskentely-tilat ovat käytettävissä.

Rekombinoidut plasmidit muodostetaan siten, että sekoitetaan keskenään restriktioendonukleaaseilla käsitel-10 tyä plasmidi-DNA:ta ja cDNArta, jonka pääteryhmät ovat vastaavasti käsitellyt. Plasmidi-DNA:ta käytetään suuri molaarinen ylimäärä cDNArhan verrattuna, jotta cDNA-seg-mentit muodostaisivat mahdollisimman vähän kombinaatteja toistensa kanssa. Aikaisemmissa menetelmissä tämä on joh-15 tanut siihen, että suurin osa kierrossa olevista plasmi- deista on sellaisia, jotka eivät sisällä cDNA-fragment-tia. Näin ollen valintaprosessista on tullut vaivalloinen ja aikaavievä. Aikaisemmin tämä ongelma on ratkaistu siten, että on yritetty rakentaa sellaisia DNA-vektoreita, 20 joissa on restriktioendonukleaasin tunnistuskohta sopivan merkkigeenin keskellä siten, että rekombinantin liittäminen jakaa geenin ja samalla geenin koodaama toiminta häviää.

On edullista käyttää sellaista menetelmää, jolla 25 niiden pesäkkeiden lukumäärä saadaan mahdollisimman pieneksi, joista rekombinoitua plasmidia etsitään. Menetelmässä toimitaan siten, että restriktioendonukleaasil-la katkaistu plasmidi-DNA käsitellään alkalisella fosfa-taasilla (valmistaja Worthington Biochemical Corporation, 30 Freehold, New Jersey). Alkalinen fosfataasi poistaa 5'- päiden fosfaatit endonukleaasin synnyttämistä plasmidin päistä ja estää plasmidi-DNA:n itseligaation. Näin ollen renkaanmuodostus ja samalla transformaatio riippuu siitä, että tapahtuu 5'-fosforyloidut päät sisältävän DNA-frag-35 mentin liittyminen. Kuvattu menetelmä vähentää ilman re- kombinaatiota tapahtuvan transformaation suhteellista 4 esiintymistä määrään, joka on alle 1-10 .

29 7 5 1 85 Tämä keksintö perustuu siihen, että DNA-ligaasin katalysoima reaktio tapahtuu DNA:n 5'-fosfaattipääteryh-män ja DNA:n 3'-hydroksyylipääteryhmän välillä. Jos 5'-fosfaatti puuttuu, ei liittymisreaktiota tapahdu. Kun 5 kaksisäikeiset DNA:t pitää yhdistää, on olemassa kolme tilannetta, kuten taulukosta 1 ilmenee.

Taulukko 1

Tapaus Reagoivat yhdisteet Ligaasituote_ 10 I 3' 5' 3' 5' --OH Η,Ο,ΡΟ- -O-P-O- + ^ ^ + Ou Π -0p03H2 H0---O-P-O - 2 5' 3' 5' 3' 15 II 3' 5' 3' 5' - OH H203P-0- -O-P-O- -OH + OH---OH HO- +K2° 5' 3' 5' 3' i i 20 HI | 3' 5' i-OH HO--ei reaktiota I OH + HO-- ; 5' 3' 25 Taulukossa 1 on kaksisäikeinen DNA esitetty kaaviol- lisesti yhtenäisinä yhdensuuntaisina viivoina ja niiden vastaavat 5'- ja 3'-pääteryhmät on merkitty hydroksyyleiksi (OH) tai fosfaateiksi (0P03H2). Tapauksessa I on kummassakin reagoivassa molekyylissä päissä 5'-fosfaatti, ja 30 näin ollen molemmat säikeet yhtyvät toisiinsa kovalentti- sesti. Tapauksessa II on liitettävistä päistä vain toisessa 5'-fosfaatti ja näin ollen vain toinen liitettävistä säikeistä liittyy toiseen kovalenttisesti ja toiseen säi-keeseen jää epäjatkuvuuskohta. Kovalenttisesti liittymä-35 tön säie pysyy assosioituneena liittyneeseen säikeeseen vetysiltojen avulla, jotka esiintyvät vastakkaisten säi- 30 7 5 1 85 keiden komplementaaristen emäsparien välillä. Tapauksessa III ei kummassakaan reagoivassa päässä ole 5'-fosfaattia eikä yhdistymisreaktiota tapahdu.

Näin ollen pitää poistaa 5'-fosfaattiryhmä sellai-5 sesta päästä, jonka liittyminen toiseen halutaan estää.

Käytettäväksi sopii mikä tahansa 5'-fosfaattiryhmän poistomenetelmä, joka ei muuten vahingoita DNA-rakennetta. Mieluiten käytetään alkalisen fosfataasin katalysoimaa • hydrolyysiä.

10 Edellä kuvattu menetelmä on hyödyllinen myös siinä tapauksessa, että lineaarinen DNA-molekyyli halutaan katkaista kahteen alafragmenttiin, tavallisesti restriktio-endonukleaasia käyttämällä, ja sen jälkeen rekonstruoida alkuperäiseksi sekvenssiksi. Alafragmentit voidaan puhdis-15 taa erikseen ja haluttu sekvenssi voidaan rekonstruoida yhdistämällä alafragmentit. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää DNA-ligaasia, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 20 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E. colista saatua ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehmann, I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointia restriktio-25 endonukleaasikäsittelyllä saaduista alafragmenteista pa rantaa suuresti, jos voidaan käyttää menetelmää, jossa sopimattomien sekvenssien rekonstruoinnilta vältytään. Sopimaton tulos voidaan välttää, jos halutun sekvenssin omaava homogeenisen pituinen cDNA-fragmentti käsitellään 30 reagenssilla, joka kykenee poistamaan 5'-päätefosfaattiryhmä t cDNArsta ennen kuin homogeeninen cDNA lohkeaa re-striktioendonukleaasin vaikutuksesta. Tässä alkalinen fosfataasi on edullinen entsyymi. 51-päätefosfaatit ovat rakenteellinen edellytys DNA-ligaasin alafragmentteja yh-35 distävälle vaikutukselle. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää kovalenttisesti, joissa ei ole 5'-pääte-

II

31 75185 fosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan yhdistää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 5'-päätefosfaatin, joka on muodostunut restriktioendonukleaasin eristettyyn DNA: hän kohdistaman katkaisevan vaikutuksen tuloksena.

5 Edellä selostettu menettely estää sopimattomimman

liittymisreaktion, nimittäin se, että kaksi fragmenttia liittyisi käänteisessä järjestyksessä eli takaosa etuosaan eikä etuosa takaosaan. Muita mahdollisia sivureaktioita, kuten dimeroitumista tai renkaanmuodostumista ei 10 saada estetyiksi, koska nämä tapahtuvat reaktiotyypin II

mukaisesti, vrt. taulukkoa 1 edellä. Tällaiset sivureaktiot ovat kuitenkin vähemmän haitallisia, koska ne johtavat fysikaalisesti identifioitaviin ja erotettaviin tuotteisiin, kun taas käänteinen rekombinaatio ei sitä tee.

15 Edellä kuvattujen menetelmien valaisemiseksi rotan insuliinin cDNA-koodi eristettiin ja rekombinoitiin plas-midin kanssa. DNA-molekyyleillä transformoituva bakteerikanta oli E. coli X-1776. Transformoidut bakteerit erotettiin suorittamalla viljely tetrasykliinipitoisessa kasvu-20 alustassa. Erään transformoitujen solujen sisältämän re- kombinoidun plasmidin DNA:n havaittiin sisältävän liittyneen DNA-fragmentin, jonka pituus oli noin 410 nukleotidia. Samalla menetelmällä eristettiin ja analysoitiin myös muita rekombinantteja. Liitetyt fragmentit irrotet-25 tiin plasmidista Hind III- tai Hsu I-endonukleaasikäsit- telyllä ja niiden DNA-sekvenssi analysoitiin seuraavalla menetelmällä: Maxam, A.M. ja Bilbert, W., Proc. Natl. Adac. Sei. USA 74, 560 (1977). Liitettyjen DNA-fragmenttien nuk-leotidisekvenssi havaittiin ylipitkäksi ja se sisälsi koo-30 din rotan koko proinsuliini I:lle ja prepeptidisekvenssin kolmelletoista aminohapolle kaikkiaan 23 aminohaposta. Jäljempänä on esitetty, millainen tämä nukleotidisekvens-si on.

Juuri kuvatulla menetelmällä voidaan eristää ja 35 puhdistaa korkeamman organismin geeni, myös ihmisen gee ni, ja siirtää se mikro-organismiin, jossa se replikoi- 32 7 5 1 8 5 tuu. Selostuksessa kuvataan uusia rekombinoituja plas-mideja, jotka sisältävät eristetyn geenin kokonaan tai osia siitä. Selostuksessa kuvataan uusia mikro-organismeja, joita ei tähän mennessä ole löydetty luonnosta, 5 ja joiden geneettinen rakenne sisältää korkeamman orga nismin geenin. Seuraavissa esimerkeissä kuvataan rekom-binoituja plasmideja, jotka sisältävät osia rotan insu-liinigeenistä ja ihmisen insuliinigeenistä sekä uusia mikro-organismeja, jotka sisältävät mainittuja geenejä.

10 Esimerkki 1 Tässä esimerkissä kuvataan rotan insuliinin mRNA:n uutto ja eristys sekä sille komplementaarisen DNA:n syntetisointi ja karakterisointi. Rotan haiman saarekesolu-jen valmistamiseksi nukutetun rotan haima infusoitiin 15 Hank'in suolaliuoksella infusoimalla takakautta haimatie-hyeeseen. Hank'in suolaliuos on alalla tunnettu standardi-liuos (valmistaja Grand Island Biological Supply Company, Grand Island, New York). Haima poistettiin, jauhettiin Hank'in liuoksessa 0°C:ssa ja kollagenaasin ja soijapavun 20 trypsiini-inhibiittorin annettiin vaikuttaa. Kaikki toi menpiteet suoritettiin 0-4°C:ssa, ellei toisin ole ilmoitettu. Viimeksimainitun toimenpiteen olosuhteet olivat erittäin kriittiset. 30 ml:n lasiputkeen laitettiin kaksi jauhettua rotan haimaa Hank'in liuoksessa niin, että ko-25 konaistilavuudeksi tuli 8 ml. Kaikki lasiputket oli esi- käsitelty silikonilla ("Siliclad", Clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey). Inku-bointiseos sisälsi 12 mg kollagenaasia, joka on Clostridium histolyticumista valmistettu entsyymi (valmistusme-30 netelmä: Mandi, I., Mackennan, J.D. ja Howes, E.L., J. Clin. Invest. 32, 1323 (1943), tyyppi CLS IV (valmistaja Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey), ja 1 mg soijapavun trypsiini-inhibiittoria (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri). Putkea 35 ravisteltiin nopeudella 90 ravistusta minuutissa 37°C:ssa 25 minuutin ajan. Kollagenaasin vaikutuksen optimaalista edistymistä oli tarkkailtava jatkuvasti. Jos inkubointi

II

33 7 5 1 85 oli liian lyhyt, saarekesolujen irtaantuminen jäi epätäydelliseksi, ja jos inkubointiaika oli liian pitkä, saa-rekesolut alkoivat liueta. Inkuboinnin jälkeen putkea sentrifugoitiin 1 minuutti nopeudella 200 r/min. Emä-5 liuos dekantoitiin ja hiukkaset pestiin Hank'in liuoksella, ja sentrifugointi ja pesu toistettiin yhteensä viisi kertaa. Lopullisen sentrifugoinnin jälkeen hiukkaset suspendoitiin 15 ml:aan "Ficoll'^liuosta (Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Ruotsi), jonka tiheys oli 1,085. Sen 10 jälkeen lisättiin 8 ml "Ficoll"-liuosta, jonka tiheys oli 1,080, 5 ml "Ficoll"-liuosta, jonka tiheys oli 1,060, ja putkea sentrifugoitiin heiluvassa kuppiroottorissa ensin 5 minuuttia nopeudella 500 r/min ja sen jälkeen 5 minuuttia nopeudella 2000 r/min. Tämän menettelyn seurauk-15 sena rakkulasolut jäivät putken pohjalle ja saarekesolut nousivat gradienttiin ja muodostivat rintaman kahden ylimmän kerroksen väliin. Saarekesolukerros sisälsi epäpuhtauksina hermosoluja, imusolmukkeita ja sidekudosta. Suuret epäpuhtaushiukkaset poistettiin materiaalista kerrok-20 sessa. Materiaalin loppuosa sijoitettiin leikkelymikro- skooppiin, ja näkyvät epäpuhtaudet poistettiin käsin mikro-pipetillä. Tämän jälkeen soluvalmiste sekoitettiin Hank' in liuokseen ja sentrifugoitiin. Emäliuos dekantoitiin ja solumateriaali varastoitiin nestemäiseen typpeen.

25 200 rotasta kootut saarekesolut homogenisoitiin 4°C:ssa 4M guanidiniumtiosyanaatissa ("Tridom", Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, Sveitsi), joka sisälsi 1 M 8-merkaptoetanolia, ja joka oli puskuroitu pH-arvoon 5,0. Homogenaatti kerrostettiin 1,2 ml:n kanssa 5,7 M CsCl, 30 joka sisälsi 100 mM EDTA, ja sentrifugoitiin 15°C:ssa 18 tuntia nopeudella 37 000 r/m Beckman-ultrasentrifugin roottorissa SW 50,1 (Beckman Instrument Company, Fullerton, California). RNA kulkeutui putken pohjalle.

Polyadenyloitu RNA eristettiin koko RNA-valmis-35 teestä kromatografisesti oligo(dT)selluloosan avulla me netelmällä, jonka ovat esittäneet Aviv, H. ja Leder, P., vrt. edellä.

34 751 85

Rotan Lagerhansin saarekkeiden koko polyadenyloitu RNA transskriboitiin cDNAtksi linnun Myeloblastosis-vi-ruksen käänteistransskriptaasin avulla (valmistaja tohtori D.J. Beard, Life Science Inc., St. Petersburg,

5 Florida). Reaktio tapahtui seoksessa, jossa oli 50 mM

Tris-HCl, pH 8,3, 9 mM MgCl2, 30 mM NaCl, 20 mM B-mer-kaptoetanolia, 1 mM kutakin kolmea deoksiribonukleosidi-trifosfaattia, joissa ei ollut radioaktiivisuutta, 250 μΜ neljättä deoksinukleosiditrifosfaattia, joka oli mer-32 10 kitty a- P:llä, jonka spesifinen aktiivisuus oli 50-200

Ci/mol, 20 yg/ml oligo-dT^ 2_-|q (Collaborative Research,

Waltham, Massachusetts), 100 ug/ml polyadenyloitua RNA: ta ja 200 yksikköä/ml käänteistransskriptaasia. Seosta inkuboitiin 45°C:ssa 15 minuuttia. Tämän jälkeen lisät- 15 tiin EDTA-Na2 niin, että väkevyydeksi tuli 25 mM, liuos uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenolia, joka oli kyllästetty vedellä ja sen jälkeen vesifaasi kromatogra- fioitiin Sephadex G-100-pylväässä (halkaisija 0,3 cm,

korkeus 10 cm) käyttämällä eluenttia, jossa oli 10 mM

20 Tris-HCl, pH 9,0, 100 mM NaCl ja 2 mM EDTA. Välisijati- lavuudella eluoituneeseen nukleiinihappoon lisättiin am- moniumasetaattia, pH 6,0 niin, että väkevyydeksi tuli 0,25 M, ja saostettiin etanolilla. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla, liuotettiin 50 plsaan juuri valmistet- 25 tua 0,1 M NaOH ja inkuboitiin 20 minuuttia 70°C:ssa niin, että RNA hydrolysoitui. Seos neutraloitiin lisäämällä 32 1M natriumasetaattia, pH 4,5, ja P-cDNA-tuote saostettiin etanolilla ja liuotettiin veteen. Osa yksisäikeistä cDNA:ta analysoitiin natiivilla polyakryyliamidigeelillä 30 seuraavalla menetelmällä: Dingman, C.W. ja Peacock, A.C., 32

Biochemistry 7, 659, (1968). Geelit kuivattiin ja P-DNA tutkittiin autoradiografiällä käyttäen "Kodak No-Screen NS-2T"-filmiä (Eastman Kodak Corporation, Rochester, New York). Elektroforeesikuvion mukaan cDNA oli hetero-35 disperssi. Tunnettujen standardien mukaan se sisälsi ainakin yhtä cDNA-lajia, jossa oli noin 450 nukleotidia.

Il 35 751 85

Esimerkki la

Toistettiin esimerkki 1, käyttäen kuitenkin eri 8-merkaptoetanolipitoisuuksia saarekesolujen homogenisoin-tivaiheessa, nimittäin 0,05 M, 0,2 M, 0,6 M ja 0,8 M.

5 Kaikilla näillä pitoisuuksilla saatiin sama lopputulos, eli mRNA:n hajoamista RNraasin vaikutuksesta ei tapahtunut.

Esimerkki 1b

Toistettiin esimerkit 1 ja 1a, käyttäen kuitenkin 10 eri pH-arvoja saarekesolujen homogenisointivaiheessa, ni mittäin pH-arvoja 6,0, 7,0 ja 8,0. Kaikilla näillä pH-ar-voilla saatiin sama lopputulos, eli mRNA:n hajoamista RN: aasin vaikutuksesta ei tapahtunut.

Esimerkki 2 15 Tässä esimerkissä kuvataan rotan insuliinin kaksi- säikeisen cDNA:n syntetisointi ja karakterisointi. Komplementaarisen säikeen syntetisoimiseksi esimerkissä 1 tuotteeksi saatu yksisäikeinen cDNA käsiteltiin käänteistrans-skriptaasilla. Reaktioseos sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 20 9 mM MgC^r 10 mM ditiotreitolia, 50 mM kutakin kolmea deoksiribonukleosiditrifosfaattia, jotka eivät olleet ra- 32 dioaktiivisesti merkittyjä, 1 mM a- P:llä merkittyä nuk-leosiditrifosfaattia, jonka spesifinen aktiivisuus oli 1-10 Ci/mmol, 50 yg/ml cDNA ja 220 yksikköä/ml käänteis-25 transskriptaasia. Reaktioseosta inkuboitiin 120 minuuttia 45°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTA-Na2 niin, että väkevyydeksi tuli 25 mM, uutettiin fenolilla, kroma-tografoitiin Sephadex 00:11a ja saostettiin etano lilla. Erä reaktiotuotetta, jonka aktiivisuus oli 500-30 1000 sykäystä minuutissa, analysoitiin geelielektroforeet- tisesti esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Standardinäyt-teisiin vertaamalla löydettiin heterodisperssi kaista, jonka pituus oli noin 450 nukleotidia. Erä esimerkin 1 ja esimerkin 2 DNA-reaktiotuotetta käsiteltiin erikseen 35 Hae III-restriktioendonukleaasilla ja suoritettiin samanlainen geelielektroforeesi. Endonukleaasi katkaisi kummankin tuotteen ja geelielektroforeesissa havaittiin kak- 36 7 5 1 85 si radioaktiivista kaistaa. Kaksisäikeisen cDNA:n katkaisussa syntyneet kaistat edustivat käytännöllisesti katsoen samanpituisia tuotteita kuin yksisäikeiden cDNA:n katkaisussa syntyneet.

5 Esimerkki 3 Tässä esimerkissä selostetaan kuinka esimerkissä 2 valmistettuun kaksisäikeiseen rotan haiman saarekesolu- cDNArhan kytketään Hind III:n dekanukleotiditunnistuskoh- ta tylppään päähän tapahtuvana liittämisenä. Esimerkin 2 10 kaksisäikeistä reaktiotuotetta, jonka väkevyys oli 2-5 yg/ml, käsiteltiin ensin 30 minuuttia 22°C:ssa ja sitten 15 minuuttia 10°C:ssa 30 yksiköllä S1-nukleaasia, jonka aktiivisuus oli 1200 yksikköä/ml (Miles Laboratories,

Elkhart, Indiana), liuoksessa, jossa oli 0,03 M natrium- 15 asetaattia, pH 4,6, 0,3 M natriumkloridia ja 4,5 mM ZnC^.

Reaktio lopetettiin lisäämällä Tris-emästä (loppuväkevyys 0,1 M), EDTArta (loppuväkevyys 25 mM) ja E. colin tRNA:ta (valmistettu seuraavalla menetelmällä: von Ehrenstein, G.,

Methods of Enzymology, S.P. Colowick ja N.O. Kaplan, Eds., 20 Voi. 12A, s. 588 (1967) 40 yg/ml. Reaktioseos uutettiin fenolilla, kromatografoitiin Sephadex ^3-1 00 :11a ja väli- 32 sijatilavuudella eluoitu P-cDNA saostettiin etanolilla. Tällä käsittelyllä saatiin hyvällä saannolla cDNA-molekyy-lejä, joissa oli emäsparipäät, jotka tarvitaan kemiallises-25 ti syntetisoitujen dekanukleotidien liittämiseksi tylppään päähän. Hind ΙΙΙ-dekameerit valmistettiin seuraavalla menetelmällä: Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

Hind ΙΙΙ-dekameerien liittäminen cDNA:hän suoritettiin in-30 kuboimalla 1 tunti 14°C:ssa liuoksessa, jossa oli 66 mM

Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mMMgC^, 1 mM ATP, 10 mM ditiotrei-tolia, 3 mM Hind III dekameeria, jonka aktiivisuus oli 5 10 sykäystä minuutissa pikomoolia kohti, ja noin 500 yksikköä/ml T4 DNA-ligaasia. Tämän jälkeen reaktioseosta 35 kuumennettiin 65°C:ssa 5 minuuttia ligaasin inaktivoimi- seksi. Sitten käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 150 yksiköllä/ li 37 751 85 ml Hsu I- tai Hind III-endonukleaasia ja tämän jälkeen lisättiin kaliumkloridia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 50 mM, β-merkaptoetanolia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 1 mM, ja EDTAtta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 5 0,1 mM (New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts, myy

Hind III- ja Hae III-endonukleaasia). Reaktiotuote analysoitiin geelielektroforeesilla samoin kuin esimerkissä 1 ja havaittiin piikki, joka vastasi noin 450 nukleotidin sekvenssiä, ja lisäksi Hind ΙΙΙ-dekameerien katkenneita 10 fragmentteja.

Esimerkki 3a

Eco-RI-dekanukleotiditunnistuskohdat kytkettiin esimerkin 2 mukaiseen cDNArhan, kuten on selitetty esimerkissä 3. (Eco-RI-dekameerit oli valmistettu Scheller 15 et al:n edellä mainitun artikkelin mukaisesti, ja niillä oli sekvenssi 5'-CCGAATTCGG-31). Tämän jälkeen tuote di-gestoitiin Eco RI:llä, jolloin käytettiin samoja reaktio-olosuhteita kuin edellä (ks. digestointi Hsu I:llä ja Hind III:lla). Eco Rl saatiin New England Prolabs1 ilta.

20 Reaktiotuote analysoitiin geelielektroforeettisesti kuten esimerkissä 1 on selitetty, ja todettiin noin 450 nukleotidin sekvenssiä vastaava piikki, sekä Eco-RI-dekameerien fragmentteja.

Esimerkki 4 25 Tässä esimerkissä muodostetaan rekombinoitu plasmi- di ja karakterisoidaan se replikoitumisen tapahduttua. Plas-midi pMB-9 DNA (valmistusmenetelmä: Rodriguez, R.L., Bolivar, F., Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M., ICN-UCLA symposium on Molecular and Cellular Biology, D.P.

30 Wierlich, W.J. Rutter ja C.F. Fox, Eds., (Academic Press,

New York, 1976), ss. 471-477) katkaistiin Hind III-restrik-tiokohdasta Hsu I-endonukleaasilla, ja sen jälkeen käsiteltiin alkalisella fosfataasilla BAPF (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey). Reaktioseoksessa oli 35 entsyymiä 0,1 yksikköä 1 yg DNA:ta kohti ja inkubointi tapahtui 25 mM Tris-HCl-liuoksessa, pH 8, 65°C:ssa 30 minuutin ajan, ja sen jälkeen fosfataasi poistettiin fenoliuutol- 38 75185 la. Etanolisaostuksen jälkeen lisättiin fosfataasilla käsitelty plasmidi-DNA cDNA:han, jossa oli Hind III-kohesii-viset päät niin, että suhteeksi tuli 3 moolia plasmidia 1 cDNA-moolia kohti. Seosta inkuboitiin 1 tunti 14°C:ssa 5 liuoksessa, jossa oli 66 mM Tris, pH 7,6, 6,6 mM MgC^, 10 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP ja 50 yksikköä/ml T4 DNA-ligaasia.

Seos lisättiin suoraan E. coli X-1776-solususpen-sioon, jonka solut oli valmistettu transformaatioon seu-10 raavasti: soluja kasvatettiin 37°C:ssa solutiheyteen noin

O

2 x 10 solua/ml 50 mlrssa ravinneliuosta, joka sisälsi 10 g/1 tryptonia, 5 g/1 hiivauutetta, 10 g/1 natriumklo-ridia, 2 mM natriumhydroksidia, 100 yg/ml diaminopimelii-nihappoa ja 40 yg/ml tymiiniä. Solut otettiin talteen sent- 15 rifugoimalla 5 minuuttia nopeudella 5000 r/min 5°C, suspen- doitiin 20 ml:an kylmää 10 mM natriumkloridiliuosta, sentri-fugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin jälleen transfor-mointipuskuriin, jossa oli 75 mM CaC^» 140 mM NaCl ja 10 mM Tris, pH 7,5, ja pidettiin 5 minuuttia jäässä. Tämän 20 jälkeen solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin jälleen 0,5 ml:an transformaatiopuskuria. Transformaatio suoritettiin sekoittamalla keskenään 100 μ 1 solususpensiota ja 50 μΐ rekombinoitua DNA:ta (1 yg/ml). Seosta inkuboitiin ensin 15 minuuttia 0°C:ssa, sitten 4 minuuttia 25°C:ssa ja 25 lopuksi 30 minuuttia 0°C:ssa. Sitten solut siirrettiin agarmaljoihin valituissa olosuhteissa kasvatettaviksi.

Rekombinoitujen plasmidien seulonta tapahtui siten, että läsnä oli 5 yg/ml tetrasykliiniä Hind III-kohdan transformaatiota varten. Tietty rekombinantti, nimeltään 30 pAU-1, eristettiin. Epäpuhtaita plasmidivalmisteita, jois sa oli 2-5 yg pAU-1:stä eristettyä DNA:ta, käsiteltiin Hsu I-endonukleaasiylimäärällä. Lisättiin EDTA-Na2:ta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 10 mM, ja sakkaroosia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 10 % (paino/tilav) ja 35 seos erotettiin polyakryyliamidigeelillä (8 %). DNA löy dettiin kohdasta, joka vastasi noin 410 emäsparin pituutta.

Il 39 751 8 5

Esimerkki 4a (i) Esimerkki 4 toistettiin paitsi, että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR-322 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla tavalla 5 (Gene 2 (1977) 95). Käytetyt olosuhteet olivat muuten sa mat paitsi, että yhdistelmäkloonien lopullinen selektio suoritettiin viljelemällä niitä väliaineessa, joka sisälsi 20 yg/ml tetrasykliiniä. Yhdistelmäklooniin siirretty DNA-sekvenssi erotettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla, 10 jolloin saatiin noin 410 emäsparin pituinen DNA-fragment- ti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1.

(ii) Esimerkki 4 toistettiin paitsi, että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla menetel- 15 mällä (Gene 2 (1977) 75). Käytetyt olosuhteet olivat muu ten samat paitsi, että yhdistelmäkloonien lopullinen selektio suoritettiin kohdassa (i) kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 410 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1.

20 (iii) Esimerkki 4 toistettiin paitsi, että plasmi din pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSC101 DNA: ta, joka oli valmistettu Cohenin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293) . Käytetyt olosuhteet (yhdistelmäkloonien selektiomenetelmä 25 mukaanlukien) olivat esimerkin 4 mukaiset. Yhdistelmäklooniin siirretty DNA-sekvenssi erotettiin, jolloin saatiin noin 410 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1.

Esimerkki 4b 30 Esimerkit 4 ja 4a toistettiin paitsi, että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E. colia RRI tai E. colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat samat kuin esimerkissä 4 ja 4a, ja saatiin samat tulokset.

Esimerkki 5 35 Esimerkin 4 mukaista plasmidin pAU-1 DNA:ta puhdis tettiin edelleen elektroforeesilla 6 % polyakryyliamidi-geelillä. Tämän jälkeen DNA eluoitiin geelistä ja merkit- 32 40 7 51 8 5 tiin inkuboimalla γ- P-ATP:n ja polynukleotidikinaasin kanssa Maxam'in ja Gilbert'in kuvaamissa olosuhteissa (ks. Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74 (1977) sivut 560-).

Entsyymi katalysoi radioaktiivisen fosfaattiryhmän siir-32 5 tymisen γ- P-ATP:stä DNA:n 5'-päihin. Entsyymi saatiin E. colista seuraavalla menetelmällä: Panet, A., et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Näin merkitty DNA katkaistiin Hae III-endonukleaasilla esimerkissä 2 kuvatulla tavalla ja molemmat fragmentit, joista toisessa oli noin 10 265 ja toisessa noin 135 emäsparia, erotettiin polyakryy- liamidigeelillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Eristetyt fragmentit saatettiin alttiiksi spesifisille katkaisu-reaktioille ja suoritettiin sekvenssianalyysi edellä mainitulla Maxam'in ja Gilbert'in menetelmällä. Taulukossa 2 15 on esitetty yhdistelmä tämän koesarjan tuloksista ja saman laisten koesarjojen tuloksista, joissa tutkittiin cDNA:ta käyttämällä Col E1:stä johdettuja plasmidivektoreita, kuten pMB-9 ja pBR-322. Sekvenssin 5'-päässä on määrittelemätön noin 50-120 nukleotidia sisältävä sekvenssi ja 3'-20 päässä olevan poly-dA:n pituus vaihtelee. Sekvenssi on aikaansaatu parhaan tämänhetkisen tiedon perusteella. Katkoviivalla merkitty sekvenssi on vielä hieman epävarma .

Il 41 75185

Η C O

u u e υ ου

H OU

HU UH

U U HU

H

U O C

Hau o a <

H H H < 00 U

u u o u o e e e

< C UH

u

U HO

U O H H

CU U U < 0 C H U >> CU C U 1-i

CC OHO

C ου out

U C O U O

H H O H U

u c u u u u

H H O U H H

—· H H m o C c H C · O o u u m

H H C O H

UH O C H ·£Γ*

U H O

H O U U 6

U U O U U G

CU O C U 2 U C ™ H U U C > HU o υ e :<ö U U U H H Oi U C ni C cue φ HC U U U ,

(M U U O H H

^ u e tn O H O C Λί

O uau uoc u "S

M 5 ™ U or-u U M

C H ,

a HUHU

3 U O H e H <Ö H UH U O U Jj 3 u U rn (rt u o u u “1 H U H C H U T?

^ e o u u e O

U U 4->

Ο o H U

UH H H H ji U U U C C t, E- ^ U [0 O C U U >

U C C U U O

H H U U U

u O e H Hl ^ U H O U O Cl 0) H U CO U Cl Φ U UI 3 H U U Hl Zi

U U H C Cl M

HO U C ci 10 u ai

O C U Hl -H

U C CC Hl C

HO U U UI

o u u e £ UH U U U >

U U U U H -H

U -H

1 o u u o k, I H e U VO e rn I U U U 00 e ^

I I-H

I O UHO r-H

O C C OH U e ^ —e U U O O H ^

Sh u u u •Q U H e e

+} U U U H

£ H C O U

® O e H C

^ o u u e 4-1 4-1

-H

« 75185

Esimerkki 6

Seuraavassa on kuvattu ihmisen insuliinia koodaa-van nukleotidisekvenssin sisältävän DNA:n eristys- ja puhdistusmenetelmä, sekä mainitun DNA:n sisältävän siirtovek-5 torin valmistus, sekä sellaisen mikro-organismikannan val mistus, joka sisältää mainitun DNA:n geneettisessä koostumuksessaan.

Haiman saarekesolut eristettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Useasta haimanäytteestä eristetyt saareke-10 solut yhdistettiin ja homogenoitiin esimerkissä 1 kuvatul la tavalla 4-m guanidiinitiosyanaattiliuoksessa, joka sisälsi 0,2-m β-merkaptoetanolia ja jonka pH oli 5,0. Poly-adenyloitu RNA eristettiin affiniteettikromatografisesti Avivin ja Lederin kuvaamalla tavalla (edellä). Yksijuos-15 teinen cDNA valmistettiin käänteistransskriptaasin avulla, ja mRNA hydrolysoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Kaksijuosteinen cDNA valmistettiin käänteistransskriptaa-sia käyttäen esimerkissä 2 kuvatulla tavalla ja hajotettiin S1-nukleaasilla esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

20 Hind ΙΙΙ-linkkerit liitettiin ihmisen insuliinia koodaa- vaan kaksisäikeiseen cDNA:han esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Tuote hajotettiin Hind III- ja Hsu I-restriktioent-syymeillä ja analysoitiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Tällöin havaittiin lohjenneiden Hind ΙΙΙ-dekameerifragment-25 tien lisäksi vyöhyke, joka vastasi noin 450 nukleotidin pituista DNA-sekvenssiä. Ihmisen insuliinia koodaava cDNA, joka sisälsi kohesiiviset Hind ΙΙΙ-päät, liitettiin plasmi-diin pMB-9 esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. E. coli X-1776 transformoitiin tällä plasmidilla ja yhdistelmäplasmidien 30 selektio suoritettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Yh- distelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin Hsu I-restriktioentsyymin avulla ja analysoitiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Noin 450 nukleotidia sisältävä DNA otettiin talteen. Täten kloonatun ihmisen insuliinin ha-35 varttiin sisältävän ihmisen insuliinin koko aminohapposekvenssiä koodaavat nukleotidit. A-ketjun aminohapposekvenssi on seuraava:

II

43 751 85 1 10

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu- 20

Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn.

B-ketjun aminohapposekvenssi on seuraava: 1 10

Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- 20 5 Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro- 30

Lys-Thr.

Aminohapposekvenssi on numeroitu siitä päästä alkaen, joka sisältää vapaan aminoryhmän.

Esimerkki 6a 10 (i) Esimerkki 6 toistettiin paitsi, että plasmidin pMB-9 tilalla käytettiin plasmidia pBR322. Kaikki reaktio-olosuhteet ja yhdistelmäplasmidien selektioraenetelmä olivat samat kuin esimerkissä 4a(i). Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla taval-15 la, jolloin saatiin noin 450 nukleotidia sisältävä DNA- fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 6.

(ii) Esimerkki 6 toistettiin paitsi, että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA: 20 ta. Kaikki reaktio-olosuhteet ja yhdistelmäplasmidien selektiomenetelmä olivat samat kuin esimerkissä 4a(ii). Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 450 nukleotidia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisek-25 venssi on esitetty esimerkissä 6.

(iii) Esimerkki 6 toistettiin paitsi, että plasmidin pMA-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSC101 DNA:ta. Kaikki reaktio-olosuhteet ja yhdistelmäplasmidien selektiomenetelmä olivat samat kuin esimerkissä 4a 30 (iii). Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti ero tettiin, jolloin saatiin noin 450 nukleotidia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 6.

Esimerkki 6b 35 Esimerkit 6 ja 6a toistettiin paitsi, että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E. colia RR1 tai E. colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat samanlaiset ja saatiin samat tulokset.

Claims (6)

44 751 85

1. Insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä DNA-siirtovektori, jota voidaan käyttää mikro-or-5 ganismia transformoitaessa, tunnettu siitä, että siirtovektori sisältää deoksinukleotidialisekvenssin, joka koodaa a) ihmisen insuliinin A-ketjua, nimittäin seuraa- vaa: 10 5'—ggl1atm2gtl3gaj4caj5tgk6tgk7acl8qr9s9atm1()tgk1 1qr1 2 S1 2X1 3TY1 3TAK1 4GAJ1 5X1 6TY1 6GAJ1 7^1 8TAK1 S^O^r"3' ' b) ihmisen insuliinin B-ketjua, nimittäin seuraa- vaa: 5.---TTK1GTL2AAK3GAJ4CAK5X6TY6TGK7GGL8QRgSgCAK1QX^.,ΤΥ11

15 GTL, 2GAJ, 3gcl, 4X, ..ty, 5tak, ,,χ, ,τυ, ,οτι,, 8tgk,, 9ggl2()gaj21 W22GZ22GGL23TTK24TTK25TAK26ACL27CCL2eAAJ29ACL30—3’' joissa alisekvensseissä A on deoksiadenyyli, G on deoksiguanyyli, 20. on deoksisytosyyli, T on tymidyyli, J on A tai G, K on T tai C, L on A, T, C tai G, 25. on A, C tai T, X on T tai C, jos Y on A tai G, ja C, jos Y^ on n J n J n C tai T, Y^ on A, G, C tai T, jos Xn on C, ja A tai G, jos X on T, n

30 V?n on C tai A, jos Z on G tai A, ja C, jos on C tai T, Z on A, G, C tai T, jos W on C, ja A tai G, jos n J n W on A, n QR on TC, jos S on A, G, C tai T, ja AG, jos S n n n 35 on T tai C, Sn on A, G, C tai T, jos QRn on TC, ja T tai C, jos QR on AG, J n II 45 751 85 jossa alanumero n tarkoittaa ihmisen insuliinin sen aminohapon asemaa, jota nukleotidisekvenssi vastaa geneettisen koodin mukaisesti, ja aminohapot on numeroitu amino-päästä lukien.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-siirtovekto ri, siirrettynä mikro-organismiin Escherichia coli, kanta X-1776 tai RR-1, ja replikoituna mainitussa mikro-organismissa . 46 7 5 1 85