CH673469A5

CH673469A5 -

Info

Publication number: CH673469A5
Application number: CH11/88A
Authority: CH
Inventors: Jury Ivanovich Kozlov; Vera Aronovna Naroditskaya; Marina Revazovna Eremashvili; Alexandr Yakovlevich Strongin; Viktor Emilievich Sterkin; Marina Alexeevna Skvortsova; Andrei Jurievich Chistoserdov; Jury Dmitrievich Tsygankov; Ljudmila Vladimirovna Evdonina; Vitaly Lvovich Jurin; Galina Sergeevna Monastyrskaya; Evgeny Davidovich Sverdlov; Grigory Mikhailovich Dolganov; Sergei Anatolievich Tsarev
Original assignee: Vnii Genetiki Selek; Inst Bioorg Chimii
Priority date: 1986-04-30
Filing date: 1987-04-29
Publication date: 1990-03-15
Also published as: GB8729559D0; GB2199830B; SU1703690A1; WO1987006613A1; GB2199830A; US4988622A; DE3790221T1; JPH01500960A

Description

BESCHREIBUNG

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue in vitro konstruierte rekombinante Plasmid-DNS pVN22, VNIIA Nr. 1788A', welche die Biosynthese von menschlichem leuko2ytärem Interferon a-Il kodiert, und auf einen neuen Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) VNIIA Nr. 1788A, welcher dieses Plasmid enthält, als Produzent von menschlichem leukozytärem Interferon cc-11.

Stand der Technik

Interferone sind Eiweisse, welche durch einige Zelltypen in Beantwortung der Virusinfektionen sowie nach der Einwirkung einiger anderer Agenzien gebildet werden. Interferone weisen eine antivirale Wirkung sowie eine ganze Reihe anderer Eigenschaften auf: Wachstumshemmung von Zellen, Einfluss auf ihre Differenzierung, Aktivierung von Makrophagen, Erhöhung der Anzahl von antikörperunabhängigen Killerzellen und andere. Interferone, produziert durch Leukozyten des Menschen, werden als leukozytäre Interferone (a-Interferone) genannt und stellen eine Familie von verwandten Eiweissen dar, die 166 (in einem Fall 165) Aminosäurereste enthalten. Die Homologie der Amino-säuresequenzen verschiedener a-Interferone erreicht 80% und darüber. Jede Spezies von a-Interferon wird durch ihr eigenes Gen kodiert, und nach der Syntheseinduktion von Interferonen mit dem betreffenden Agens tritt in das Blutplasma ein Gemisch von a-Interferonen ein. Die biologische Aktivität verschiedener a-Interferone, die durch ihre Fähigkeit, Zellen gegen Virusaggression zu schützen, definiert wird, variiert stark, unterschiedlich sind auch ihre anderen biologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften. Bei der Herstellung von a-Interferonen als Arzneimittel wird das Spenderblut gewöhnlich verwendet. Diese Quelle kann jedoch den Bedarf an hochgereinigten Interferonen völlig nicht sichern. Die Verwendung von bakteriellen Produzentenstämmen, hergestellt nach Verfahren zum molekularen Klonieren und zur Gentechnik, ermöglicht es, a-Interferone praktisch in beliebigen erforderlichen Mengen zu gewinnen. Aber jeder einzelner Produzent erzeugt nur 1 Spezies des a-Interferons von einer grossen Anzahl derselben. Zur Herstellung eines Arzneipräparates, dessen Eigenschaften denen des natürlichen Präparats nahekommen, muss man doch über einen Satz von Produzenten verfügen, welche verschiedene Spezies von a-Interferonen (beispielsweise a-A, a-B, a-C, a-I u. a.) synthetisieren, damit hochgereinigte a-Interferone dann in jenen Proportionen vermischt werden können, welche für das Blut beim Menschen üblich sind. Mittels Verfahren der Gentechnik sind ausreichend wirksame bakterielle Produzenten für einige Unterarten von a-Interferonen schon hergestellt werden. So sind beispielsweise rekombinante Plasmide konstruiert, welche die Biosynthese in E.coli-Zellen von Interferonen a-A, a-F, a-K und anderen bewirken. Aber dies reicht nicht aus, um Präparate herzustellen, die die Wirkung des Gemisches von aus dem Spenderblut gewonnenen a-Interferonen völlig imitieren.

Bekannt ist eine rekombinante auf der Basis des Vektors pBR 322 hergestellte Plasmid-DNS pLeIF-rL, welche die Biosynthese von Interferon a-L kodiert, sowie bekannt ist der Stamm Escherichia coli 294, der das angegebene Plasmid (EPA2 0072541) ent-5 hält. Das Gen des Interferons a-L ist aus der Bibliothek von menschlichen Genen auf dem X-Phagen Charon 4A gewonnen. In dem Plasmid pLeIF-rL wird die Synthese des Interferons a-L durch induzierbaren Tiyptophanpromotor kontrolliert.

Der angegebene Stamm wird dadurch charakterisiert, dass bei io der Fermentation desselben auf reichen Nährmedien mit einem relativ hohen Tiyptophangehalt (LB-Medium, Hottinger-Nähr-bouillon), welche zwecks Erzielung des schnellen Wachstums von Bakterien gewöhnlich verwendet werden, eine niveaulose Biosynthese des Endprodukts nachgewiesen wird. Dieser Nachteil ist 15 damit verbunden, dass die Synthese des Interferons a-L unter Kontrolle eines Regulatorbereichs des Tiyptophanpromotors, dessen Funktion zu induzieren ist, erfolgt. Um das hohe Niveau der Biosynthese des Interferons a-L sicherzustellen, ist die Kulturflüssigkeit mit einem minimalen Salzmedium auf das 20- bis 20 40fache zu verdünnen. Die bedeutende Senkung der Tryptophan-konzentration des Mediums fuhrt zur Normalisation der Gentranskription und zu einer 20- bis 50fachen Steigerung der Synthese. Im Industrieproduktionsmassstab scheint eine solche Verdünnung der wachsenden Kultur sehr schwierig, zumal bei der 25 Verdünnung eine strenge Sterilität zwecks Vermeidung der Phago-lyse der Kultur E. coli einzuschalten ist. E. coli ist ausserdem ein bedingt pathogener Mikroorganismus, und die Verwendung desselben im Industriebetrieb ist unerwünscht.

30 Darstellung der Erfindung

Die rekombinante Plasmid-DNS pVN22 und der Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) als Produzent von leukozytärem Interferon a-Il sind neu entwickelt und in der Fachliteratur nicht beschrieben.

35 Der Erfindung liegt eine Aufgabe zugrunde, eine neue rekombinante Plasmid-DNS, welche die Biosynthese von menschlichem leukozytärem Interferon a-Il kodiert, und einen neuen sie enthaltenden Stamm als Produzent für Interferon a-H, der die Herstellung von leukozytärem Interferon a-Il in hoher Ausbeute sichert, 40 zu entwickeln.

Die Aufgabe wurde durch die neue rekombinante Plasmid-DNS pVN22, welche die Biosynthese von menschlichem leukozytärem Interferon a-Il kodiert, gelöst, die erfindungsgemäss eine « Grösse von 10,85 kb (Kilobases) hat und aus folgenden Elementen besteht:

- 9,45 kb grosses EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasmids pAYC 37

- 1,4 kb grosses Hindlll-EcoRI- Fragment, bestehend aus so folgenden Elementen:

- 0,25 kb grosses DNS-Fragment mit dem Regulatorbereich des D-Gens des Phagen (pX174 und den ersten Genkodonen von a-Interferon I

- 0,5 kb grosses Gen von Interferon a-Il mit der weiter unten 55 angegebenen Nucleotidsequenz

- 0,65 kb grosser Abschnitt der Genom-DNS beim Menschen,

dass die erwähnte rekombinante Plasmid-DNS folgende genetische Marker, und zwar ApR-Gen für Ampizillin-Resistenz, so SmR-Gen für Streptomyzin-Resistenz besitzt, folgende einzigartige Teilabschnitte zur Erkennung von Restriktionsendonucleasen Hindlll für den Ausgangspunkt, Eco RI mit einer Grösse von 1,4 kb, BamHI mit einer Grösse von 10,82 kb enthält. Dieses Plasmid ist in The Collection of Cultures of Microorganisms of the 65 All-Union Research Institute of Antibiotics, Moscow, Nagatins-kaja 3a am 2. April 1986 unter der Registrier-Nr. 1788A' deponiert worden.

Das erfindungsgemässe Plasmid kann in verschiedenen gram-

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negativen Bakterien, zum Beispiel in E. coli, Pseudomonas und Stellungen 34, 55, 161 unterscheidet.

anderen, repliziert werden und bewirkt die Biosynthese von Das 0,50 kb grosse Gen des Interferons a-Il im Bestand des menschlichem leukozytärem Interferon a-Il, welches sich vom erfindungsgemässen Plasmids ist wie folgt aufgebaut:

bekannten Interferon a-1 durch 3 Aminosäuresubstitutionen in

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Start

Met

Cys

Asp

Leu

Pro

Gin

Thr

His

Ser

Leu

Gly

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GAT

CTG

CCT

CAG

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Leu

Ala

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Gly

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Ile

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70

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100

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120

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ATG

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GAC

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CTG

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GTG

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Lys

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Arg

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ACT

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Leu

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Lys Lys

Tyr

Ser

Pro

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140

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TAC

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CCT

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Trp

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Arg

150

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GTC

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GAA

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ATG

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Ser

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CTC

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Arg

Leu

Arg

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Asp

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TTA

AGG

AAG

CAT

TGA

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Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein neuer Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22), der die angegebene rekombinante Plasmid-DNS pVN22 enthält und als Produzent von menschlichem leukozytärem Interferon a-Il dient. Der erfmdungsgemässe Stamm, hergestellt gemäss der Erfindung nach Verfahren der Gentechnik durch Einfuhrung der rekombinanten Plasmid-DNS pVN22 in Bakterien der Gattung Pseudomonas, ist in der Mikro-benkulturensammlung des Allunions-Forschungsinstituts für Antibiotikas (Ihe Collection of Cultures of Microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics, Moscow, Nagatins-kaja 3a) am 2. April 1986 deponiert worden und hat die Registriernummer 1788A.

Im Unterschied zum bekannten Plasmid pLeIF-rL, bei welchem die Synthese durch induzierbaren Promotor kontrolliert wird, steht die Synthese von Interferon a-H im erfmdungsgemäs-sen Plasmid pVN22 unter Kontrolle des konstitutiven Promotors des D-Gens von Phagen <pX174, was den Fermentationsprozess vereinfacht. Die Verwendung des Plasmids pAYC37 mit dem breiten Wirtskreis (Tsygankov Y.D., Chistoserdov A.Y., Plasmid I.Y., 118-125, 1985) als Vektor ergibt eine höhere Stabilität des erfindungsgemässen auf seiner Basis hergestellten rekombinanten Plasmids pVN22 gegenüber dem weniger stabilen Vektor pBR322, der zur Herstellung des bekannten Plasmids dient. Das erfmdungsgemässe Plasmid pVN22 kann in verschiedenen Stämmen genügend stabil auch ohne Zusetzen von Antibiotika ins Kulturmedium gehalten werden, während das bekannte, auf der Basis von pBR322 gewonnene Plasmid unter gleichen Bedingungen schnell eliminiert wird. Durch Verwendung des erfindungsgemässen Stammes Pseudomonas sp. 31 (pVN22) als Produzent lässt sich die Aktivität des Interferons a-Il auf 0,7 bis 2,5 • 109 Aktivitätseinheiten je 1 Liter Kulturflüssigkeit steigern. Der erfmdungsgemässe Stamm, der zur Synthese des Interferons a-Il dient, setzt die Möglichkeit der Phagolyse im Laufe der Fermentation bedeutend herab. Zum Unterschied von Stämmen E. coli ist ausserdem der erfmdungsgemässe Stamm kein bedingt patho-gener Mikroorganismus. Die Verwendung der vorgeschlagenen Erfindung ermöglicht es also, das menschliche leukozytäre Interferon a-H in einer hohen Ausbeute nach einer einfachen Technologie herzustellen.

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung.

Das Verfahren zum Konstruieren des erfindungsgemässen rekombinanten DNS-Plasmids pVN22 besteht in folgendem.

Der Plasmid-Vektor pAYC37, der in gramnegativen Bakterien gehalten werden kann, wird mittels Restriktasen Hindlll und EcoRI gespalten, und mit Hilfe der DNS-Ligase wird das 1,4 kb grosse Hindlll-EcoR I-Fragment eingeführt, in dem das Gen des Interferons a-Il vorliegt, welches unter Kontrolle des Promotors des D-Gens von Phagen cpX174 steht.

Das 1,4 kb grosse Hindlll-EcoRI-Fragment besteht aus folgenden Elementen:

- 0,25 kb grosses DNS-Fragment mit dem Regulatorbereich des D-Gens des Phagen (pX174 und den ersten Genkodonen von a-Interferon

- 0,5 kb grosses Gen von Interferon a-Il

- 0,65 kb grosser Abschnitt der Genom-DNS beim Menschen;

die erwähnte rekombinante Plasmid-DNS besitzt genetische Marken, und zwar ApR-Gen für Ampizillin-Resistenz, SmR-Gen für Streptomyzin-Resistenz; sie enthält folgende einzigartige Teilabschnitte zur Erkennung von Restriktasen Hindlll-O, EcoRI mit einer Grösse von 1,4 kb und Bam HI mit einer Grösse von 10,82 kb.

Die herstellbaren rekombinanten Plasmide werden durch Transformation in verschiedene Stämme E.coli, beispielsweise E.coli K802 und C600, eingeführt. Die Entnahme von Transformanten erfolgt dann, wenn sie die Resistenz gegen Ampizillin und Streptomyzin aufweisen, wobei das SmR-Gen in diesem Falle vom Promotor des D-Gens des Phagen (pX174 transkribiert wird.

Diese Transformanten synthetisieren grosse Mengen von Interferon a-Il, das biologische Wirksamkeit aufweist. So wurde der Stamm E.coli C600 mit dem als PVN22 bezeichneten Plasmid gewonnen. Der Stamm E.coli C600 (pVN22) synthetisiert das 5 Interferon a-Il mit einer Wirksamkeit von höchstens 1 ■ 108 Aktivitätseinheiten je 1 Liter. Das Plasmid pVN22 besitzt eine Fähigkeit, mit Hilfe von konjugativen Plasmiden mobilgemacht übertragen zu werden. Zur Mobilisation von pVN22 führt man in den Stamm E.coli C600 (pVN22) durch Konjugation das Plasmid io R751, welches für die Trimetaprim-Resistenz sorgt, ein. Dann erfolgt die zwischenartliche Konjugation zwischen E.coli C600 (pVN22, R751) und Pseudomonas sp. 31. Das Bakteriengemisch wird auf Schalen mit dem minimalen Salzmedium nach Adams, welches Ampizillin, Streptomyzin, Trimetaprim und Aminosäure i5 Threonin enhält, eingeimpft und bei einer Temperatur von 30 0 C gezüchtet. Unter solchen Bedingungen wachsen nur Zellen von Pseudomonas sp. 31 (R751, pVN22), weil zum Wachstum des Donorstammes E.coli C600 (R751, pVN22) neben Threonin auch Leuzin notwendig ist. Bei weiteren Arbeiten wird Trimetaprim ins 20 Medium, wo der Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) gehalten wird, nicht hinzugeben, weil das Vorliegen des Plasmids 751 für den Produzentenstamm nicht unbedingt ist.

Der Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) sichert ein hohes Niveau der Biosynthese von Interferon a-Il, welches 2,5 • 109 Akti-25 vitätseinheitenje 1 Liter Kulturflüssigkeit erreicht.

Der erfmdungsgemässe Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22, welcher das menschliche leukozytäre Interferon a-Il produziert, wird durch folgende Merkmale gekennzeichnet:

Morphologische Merkmale. Zellen sind gerade, stabformig, 3o 3 bis 5 Mikrometer lang, gramnegativ, sporenlos.

Kulturmerkmale. Zellen wachsen gut auf einfachen Nährmedien. Auf Fleisch-Pepton-Agar entstehen nach 24 Stunden Wachstum bei einer zwischen 25 und 30 °C liegenden Temperatur grosse Kolonien mit unebenem Rand (von 3 bis 4 mm gros-35 sem Durchmesser), die Oberfläche ist rauh und von hellgrüner Farbe. Beim Wachstum auf der Hottinger-Nährbouillon oder der Nährflüssigkeit M9 mit Kasaminosäurezusätzen tritt eine gleich-mässige Trübung auf. Nach 24 Stunden Wachstum auf der Hottinger-Nährbouillon unter Belüftung wird die Kultur hellgrün und 40 opalesziert etwas.

Physiologisch-biochemische Merkmale. Zellen von Pseudomonas sp. 31 (pVN22) wachsen bei einer Temperatur von 10 bis 35 ° C als Optimum bei einem pH-Wert von 6,7 bis 7,5. Kohlenstoffquellen sind Glukose, Arabinose. Stickstoffquellen sind 45 Ammoniumsalze, Harnstoff sowie Aminosäuren, Pepton, Tripton u. a.

Resistenz gegen Antibiotika. Zellen von Pseudomonas sp. 31 (pVN22) sind gegen 400 bis 500 (xg/ml Streptomyzin und 150 bis 200 [xg/ml Ampizillin beständig.

50 Stabilität des Plasmids im Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22): Beim Halten der Zellen von Pseudomonas sp. 31 (pVN22) innerhalb von 6 Monaten auf einem agarisierten Nährboden, enthaltend Ampizillin und Streptomyzin in entsprechenden Konzentrationen, kommt es zu Plasmid-Verlust oder Umbau 55 desselben nicht.

Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden folgende Beispiele zum Konstruieren der erfindungsgemässen rekombinanten Plasmid-DNS pVN22 und zur Herstellung des Stammes angeführt.

60 Beispiel 1

Zum Konstruieren der erfindungsgemässen rekombinanten Plasmid-DNS pVN22 werden Fragmente von Plasmiden pAYC37 und pVN609 nach folgendem Schema verwendet.

Es werden zwei Zwischenplasmide pVN192 und pVN61 im 65 voraus geschaffen, und dann wird das Plasmid pVN609 konstruiert.

Das Konstruieren des Plasmids pVN192 wird anhand der beiliegenden Fig. 1 näher erläutert.

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0,1 ug DNS des Plasmids pUC19 und 1 ug DNKdes Plasmids pGA46 werden mit Restriktasen Pstl und Hindlll unter folgenden Bedingungen gespalten: 6 mMol Tris-HCl, pH 7,6,6 mMol MgCh, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 50 mMol NaCI, Pstl und Hindlll besitzen je 1 Aktivitätseinheit, das Volumen des Reaktionsgutes beträgt 20 (il. Die Reaktion wird innerhalb von 1 Stunde bei Temperatur von 37 ° C durchgeführt und durch Durchwärmen innerhalb von 20 Minuten bei einer Temperatur von 65 °C gestoppt. Dann werden die gewonnenen Fragmente mit Hilfe der DNS-Ligase des Phagen T4 unter folgenden Bedingungen legiert: 60 mMol Tris-HCl, pH 7,6, 10 mMol MgCI2,10 mMol 2-Merkaptoäthanol, 0,4 mMol Adenosintriphosphorsäure, DNS-Ligase besitzt 2 Aktivitätseinheiten, das Volumen des Reaktionsgutes beträgt 25 jil. Das Legieren erfolgt bei einer zwischen 12 und 14 ° C liegenden Temperatur innerhalb von 90 Minuten, wonach dieses Gemisch in Zellen von E.coli JM83 durch Transformation eingeführt wird. Die Transformation wird wie folgt durchgeführt: Die Nachtkultur E.coli JM83 verdünnt man mit der Nährflüssigkeit LB 500fach und lässt sie unter Belüftung bei einer Temperatur von 37 ° C wachsen, bis die Zellen der Kultur bei 550 nm eine optimale Dichte von 0,4 bis 0,6 Einheiten erreichen. Man kühlt danach die Zellen im Eisbad ab und verwirklicht alle darauffolgenden Operationen bei einer zwischen 2 und 4 °C liegenden Temperatur, zentrifugiert 10 ml abgekühlter Zellsuspension, entfernt die supernatante Flüssigkeit sorgfältig, supsendiert die Zellen in 10 ml 0,1 molarem CaCh, dessen Temperatur zwischen 2 und 4 ° C liegt, lässt für 30 Minuten stehen, sammelt danach die Zellen durch Zentrifugieren und resuspendiert sie in 0,5 ml 0,1 molarem CaCh, setzt 25 |il DNS-Lösung nach dem Legieren zu 100 |il auf solche Weise vorbereiteten Zellen hinzu, rührt die Zellsuspension in 0,1 molarem CaCI2 und die nichtzuge-gebene DNS-Lösung sorgfältig um und lässt bei einer zwischen 2 und 4 °C liegenden Temperatur 30 Minuten lang stehen, durchwärmt dann bei einer Temperatur von 42 ° C 4 bis 5 Minuten lang, unterbringt danach für 20 Minuten wieder ins Eisbad, verdünnt nachher die Suspension mit LB-Medium lOfach und bringt in einen Thermostat für 30 Minuten bei 37 °C ein, impft 50 bis 100 jil herangewachsene Zellsupension in Schalen mit selektivem Nährmedium ein. Das selektive Nährmedium bei der Entnahme von Transformanten, hergestellt durch Klonieren von Ragmenten auf dem Plasmid pUC19, enthält folgende Komponenten: L-Agar, 100 (-ig/ml Ampizillin, 10 mMol Isopropylthiogalaktosid, 40 p.g/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-ß-galaktosid. Es werden nicht gefärbte Kolonien entnommen. Blaugefarbte Kolonien tragen den durch Legieren wiederhergestellten Vektor pUC19. Von nicht gefärbten Kolonien isoliert man die Plasmid-DNS nach Birnbeum und Dolli (Birnboimi und Dolly) und entnimmt jene Plasmide, bei denen sich ein Erkennungsabschnitt Bglll findet. Die Restriktionsreaktion verläuft analog zum oben beschriebenen, ihre Ergebnisse werden durch DNS-Elektrophorese in l%igem Agarosegel mit Tris-Borat-Puffer (0,1 Mol Tris-Borat, 0,1 Mol Borsäure, 0,002 Mol Natriumäthylendiaminotetraazetat) unter anschliessendem Durchfarben von Gel mit Ethidiumbromid analysiert, was die DNS im langwelligen Ultraviolett nachzuweisen ermöglicht. Alle dadurch analysierten Kolonien enthielten die Plasmid-DNS mit dem darin befindlichen Erkennungsabschnitt von Bglll. So wurde das vektorielle Plasmid pVN192, gewonnen, welches einzelne Erkennungsabschnitte folgender Restriktasen Hindlll, Bglll, Pst enthält, in einem Bereich von Pstl bis EcoRI eine polylinkere Sequenz aus pUC19 enthält.

Ferner wird das Plasmid pVN 61 (Fig. 2) konstruiert. 30 [ig DNS des Plasmids p IT1 werden mit restriktasen Hindlll und EcoRI unter folgenden Verhältnissen gespalten: 6 mMol Tris-HCl, pH 7,6, 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 50 mMol NaCI, EcoRI und Hindlll besitzen je 30 Aktivitätseinheiten, die H20-Menge beträgt höchstens 1 ml. Die Reaktion dauert 2 Stunden lang unter langsamem Umrühren bei einer Temperatur von 37 ° C und wird durch Durchwärmen bei einer Temperatur von 65 °C innerhalb von 20 Minuten gestoppt. Die vollständige Spaltung von DNS wird durch DNS-Elektrophorese in l%igem Agarosegel analog zum oben Beschriebenen geprüft. Nach der Prüfung bringt man die ganze gebliebene DNS auf l%iges Agarosegel auf und teilt die Fragmente elektrophoretisch auf. Dann erfolgt die Elektroelution des erforderlichen Fragments. Das hergestellte Fragment wird einer beschränkten Hydrolyse mit Restriktase mit Sau3 A unterworfen. Man verdünnt dazu das Enzym mit dem Inkubationspuffer, setzt jeder 0,5 (ig reines Fragment enthaltenden Probe je 0,1 Aktivitätseinheit Sau3A hinzu und wählt die Zeit aus, wo das Fragment nur teilweise gespalten wird (die Inkubation dauert 2, 4, 6 Minuten usw.). Die Reaktion wird gestoppt, wenn die Proben in einen Wasserthermostat bei 68 ° C für 20 Minuten eingebracht werden. Die vollständige Spaltung wird durch Elektrophorese in ultrafeinem Gel geprüft, wodurch nur Vi Volumen der ganzen Probe aufgebracht werden kann. Die gewonnenen Fragmente werden in das mit Restriktasen Bglll und EcoRI behandelte Plasmid pVN192 eingebaut. DNS pVNI92 (2 p.g) wird dazu mit Restriktasen Bglll und RcoRI bei folgenden Verhältnissen gespalten: 100 mMol Tris-HCl, pH 7,5,6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol, 50 mMol NaCI, EcoRI und Hindlll besitzen je 2 Aktivitätseinheiten, die H20-Menge beträgt höchstens 30 pJ. Die Reaktion dauert 1 Stunde lang bei 37 °C und wird durch Einbringung der Proben in den Thermostat bei einer Temperatur von 65 ° C gestoppt. Dann führt man das Legieren der durch Bglll und EcoRI gespaltenen DNS von pVN192 mit der durch Sau3A gespaltenen DNS von Hindlll-EcoRI-Fragment aus p IT1 mit Hilfe der DNS-Ligase des Phagen T4 durch. Die Reaktion verläuft analog zum oben Beschriebenen. DNS enthält 0,1 jxg pVN193,0,4 [ig DNS des Fragments, das Endvolumen beträgt 20 [ig. Das erhaltene Gemisch führt man durch Transformation in E.coli JM83 ein und impft die Zellen auf ein agarisiertes Nährmedium ein, das 100 (ig/1 Ampizillin enthält.

Klone mit Genfragmenten von Interferon werden nach einem Verfahren zur Hybridisierung in situ gesucht. Kolonien werden zu diesem Zweck an Zellulosenitratfiltern mit einem Porendurchmesser von 0,45 jxm gezüchtet. Die an Filtern befindlichen Kolonien werden dann lysiert und mittels 32P-markierter Sonde, die einen Genabschnitt des Interferons a-A darstellt, hybridisiert. Dies ist der Fall, weil die Gen-DNS von Interferon a-II ähnliche Nuldeo-tidsequenz aufweist. Hybridisierende Kolonien weiden radiografisch nachgewiesen. Von Klonen, welche durch Sonde hybridisiert werden, wird die Plasmid-DNS herausgeschnitten, und durch Restriktionsanalyse werden jene Plasmide erkannt, die einen Erkennungsabschnitt von Bglll enthalten. Dadurch wird das Plasmid pVN61 gewonnen. Dann wird das Plasmid pVN609 (Fig. 3) konstruiert, 0,1 jig HindIII-Sau3A-Fragment der DNS mit einer Grösse von 0,25 kb, wo sich der Promotor des D-Gens von Phagen cpX174, die S-D-Sequenz des D-Gens sowie ATG und IGT als Kodone des reifen Genf von Interferon a-A befinden, wird mit 0,5 iig DNs von pVN61, vorgespalten mit Restriktasen Hindlll und Bglll, durch Fermentation unter den oben angegebenen ähnlichen Bedingungen vernetzt.

Man führt dann das nach dem Legieren hergestellte Gemisch in E.coli JM83 durch Transformation ein und bestimmt die biologische Wirksamkeit von Interferon a-Il in Transformanten. Somit wird der das Plasmid pVN609 enthaltende Klon identifiziert, welches die Synthese des reifen Interferons a-Il in Zellen von E.coli unter Kontrolle des Promotors des D-Gens von Phagen <pX1774 bewirkt.

Dann wird das Plasmid pVN22 (Fig. 4) konstruiert. 0,2 [ig DNS des Plasmids pAYC37 und 1 (ig DNS des Plasmids pVN609 werden mit Restriktasen EcoRI und Hindlll bei folgenden Verhältnissen gespalten: 6 mMol Tris-HCl, pH 7,6, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 50 mMol NaCI, EcoRI und Hindlll besitzen je 2 Aktivitätseinheiten. Das Volumen des Reaktionsguts beträgt 30 ul. Die Reaktion dauert 40 Minuten bei einer Tempera-

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tur von 37 °C und wird durch Durchwärmen innerhalb von 15 Minuten bei einer Temperatur von 65 ° C gestoppt. Die hergestellten Fragmente werden danach mit Hilfe der DNS-Ligase des Phagen T4 vernetzt. Das Legieren wird innerhalb von 120 Minuten bei einer zwischen 12 und 14 ° C liegenden Temperatur durchgeführt, wonach dieses Gemisch in E.coli C600 durch Transformation eingeführt wird. Nach langwierigem (2,5 Stunden) Heranwachsen werden die transformierten Zellen auf agarisiertes Nährmedium LB eingeimpft, welches Streptomyzin als selektive Marken (100 |ig/ml) enthält. Das vektorielle Plasmid pAYC37 ist nicht fähig, bei der Wiederherstellung Transformanten auf diesem Medium zu erzeugen, weil es keine Streptomyzin-Resistenz aufweist. Der Promotor, von welchem die Expression der Streptomy-zin-Resistenz ausgeht, fehlt bei diesem Plasmid pAYC37. Beim Klonieren des promotorhaltigen Fragments mit dem Interferon a-Il aus pVN609 in pAYC37 kommt es zur Wiederherstellung der Streptomyzin-Resistenz, was es ermöglicht, Klone mit gesuchten Plasmiden leicht zu entnehmen. Von diesen Klonen isoliert man die Plasmid-DNS und prüft die Struktur von Plasmiden mit Hilfe von Restriktasen Hindlll und EcoRI unter den oben beschriebenen ähnlichen Bedingungen. Die Analyse der herstellbaren Fragmente wird durch Elektrophorese in l%igem Agarosegel mit dem genormten Tris-Borat-Puffer unter anschliessendem Durchfarben mit Ethidiumbromid durchgeführt. Somit ist das Plasmid pVN22 identifiziert.

Beispiel 2

Der Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22), der das Interferon a-Il produziert, wird wie folgt hergestellt: Zwecks Einfuhrung des Plasmids pVN22 in Pseudomonas sp. 31 benutzt man zwei aufeinanderfolgende Konjugationen. In den Stamm E.coli C600 (pVN22) wird das Plasmid R751, welches die Trimetaprim-Resi-stenz sichert, durch Konjugation zunächst eingeführt.

Die Beimpfung von Konjuganten erfolgt auf das minimale agarisierte Salzmedium nach Adams, welches folgende Komponenten enthält: 4 mg/ml Glukose, 5 ug/ml Thiaminhydrochlorid, 50 ug/ml Threonin, 50 (ig/ml Leuzin, 75 jig/ml Ampizillin, 75 [ig/ml Streptomyzin, Trimetaprim (75 ug/ml). Unter solchen Verhältnissen wachsen nur Konjuganten E.coli C600 (R 751, pVN22). Dann nimmt man die Konjugation zwischen E.coli C600 (R 751, pVN22) und Pseudomonas sp. 31 mit dem Defektgen thr A vor. Die Konjuganten wachsen auf dem minimalen aga-risierten Salzmedium folgender Zusammensetzung: 4 mg/ml Glukose, 5 jig/ml Thiaminhydrochlorid, 50 jig/ml Threonin, 75 Ug/ml Ampizillin, 200 [ig/ml Streptomyzin, 75 ug/ml Trimetaprim. Die Wachstumstemperatur von Konjuganten ist 30 °C gleich. Der Donorstamm E.coli C600 (R 751, pVN22) bedarf neben Threonin auch Leuzin und wächst deshalb auf solchem Medium nicht. Im Ergebnis erhält man einen Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) mit einem Plasmid, das die Synthese von Interferon a-Il mit einer Wirksamkeit von 0,7 bis 2,5 • 109 Aktivi-

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tätseinheitenje 1 Liter bewirkt.

Beispiel 3

Der Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) wird durch Züchtung desselben bei einer Temperatur von 28 ° C innerhalb von 14 Stunden auf dem schrägen agarisierten genormten Hottinger-Medium, enthaltend Antibiotika Ampizillin (75 ug/ml) und Streptomyzin (150 ug/ml) kultiviert. Trimetaprim wird dem Nährmedium nicht hinzugegeben, weil das Vorliegen des Plasmids R 751 die Herstellung von Interferon nicht beeinflusst. Die auf schrägen Oberflächen gezüchtete Biomasse dient zur Zubereitung von Inokulum. Die Zellen werden dazu in Erlenmeyer-Kolben mit 750 ml Fassungsvermögen von 100 ml des oben angegebenen Nährmediums aber ohne Agar übertragen und auf einem Schütteltisch unter Umrühren (240 U/min) innerhalb von mehreren Stunden bei einer Temperatur von 28 ° C gezüchtet. Die optische Dichte des Inokulums muss angenährt zwischen 1 und 2,5 Einheiten bei 550 nm liegen. Die Fermentation erfolgt in einem Fermenter, der mit Systemen zur Regelung der Temperatur, des pH-Wertes, der Umrührgeschwindigkeit und der Belüftungsgeschwindigkeit, mit einem Geber zur Messung des Partialdruckes von gelöstem Sauerstoff ausgestattet ist. Das Inokulum wird in einer Menge von 5 Vol.% in den Fermenter mit dem angegebenen Nährmedium eingetragen. Die Zellen werden bis zum Erzielen einer zwischen 2 und 4 Einheiten liegenden optischen Dichte bei einem pH-Wert von 6,7 bis 6,9 und einer Temperatur von 27,5 bis 28,5 °C unter genormten Bedingungen gezüchtet. Man fuhrt die intensive Belüftung und das Umrühren durch. Die Belüftungs-und Umrührbedingungen werden so gewählt, dass das Wachstum des Inokulums durch die Konzentration von aufgelöstem Sauer-stofF nicht limitiert wird, wozu der Partialdruck von Sauerstoff in einem Bereich von 5 bis 10% des Sättigungswerts konstant gehalten wird. Zur Stabilisation des pH-Werts verwendet man das Ammoniakwasser. Das Wachstum der Biomasse wird durch Änderung der optischen Dichte des Kulturmediums geprüft.

Nach der vollendeten Fermentation beträgt die Wirksamkeit von Interferon 1,2-109Aktivitätseinheiten je 1 Liter.

Gewerbliche Verwertbarkeit

Die erfmdungsgemässe rekombinante Plasmid-DNS pVN22, welche die Biosynthese von menschlichem leukozytärem Interferon a-H kodiert, wird zur Herstellung von Produzentenstämmen für menschliches leukozytäres Interferon a-Il mit einer hohen Wirksamkeit verwendet.

Der erfmdungsgemässe Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) als Produzent von menschlichem leukozytärem Interferon a-Il findet in der mikrobiologischen Industrie und Medizintechnik zur Herstellung von Interferon a-Il Verwendung, welches in der praktischen Medizin sowohl in Kombination mit den anderen bekannten leukozytären Interferonen als auch getrennt zum Einsatz kommen kann.

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2 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE 1. Rekombinante Plasmid-DNS pVN22, welche die Biosynthese von menschlichem Ieukozytärem Interferon a-II kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Grösse von 10,85 kb hat und aus folgenden Elementen besteht:

- Eco EU- Hindlll- Fragment des Plasmids pAYC37 mit einer Grösse von 9,45 kb

- Hindlll-EcoRI-Fragment mit einer Grösse von 1,4 kb, bestehend aus folgenden Elementen:

- DNS-Fragment mit einer Grösse von 0,25 kb mit dem Regulatorbereich des D-Gens des Phagen <pX174 und den ersten s Genkodonen von a-Interferon I

- Gen von Interferon a-Il mit einer Grösse von 0,5 kb mit folgender Nucleotidsequenz

Start

Met Cys Asp Leu Pro Gin Tür His der Leu Gly 10 ATG IGT GAT CTG CCT CAG ACC CAC AGC CTG GGT

Asa Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gin 20 AAT AGG AGG GCC TTG ATA CTC CTG GCA CAA

Met Gly Arg Ile der pro Phe Ser Cys Leu 30 ATG GGA AGA ATC TCT CCT TTC TCC TGC CTG

Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gin 40 AAG GAC AGA ÇAT GAC TTT GGA CTT CCC CAG

Glu Glu Ptie Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys 50 GAG GAG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG

Tür Gin Ala Ile Pro Val Leu His Glu Met 60 ACT CAA GCC ATC ÇÇT GTC CTC CAT GAG ATG

Ile Gin Gin Tür Phe Asn Leu Phe der Thr 70 ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA

Glu Asp der der Ala Ala Trp Glu Gin der 00 GAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAA CAG AGC

Leu Leu Glu Lys Pne Ser Thr Glu Leu Tyr 90 CTC CTA GAA AAA TTT TCC ACT GAA CTT TAC

Gin Gin Leu Asn Asn Leu Glu Ala Cys Val 100 CAG CAA CTG AAT AAC CTG GAA GCA TGT GTG

Ile Gin Glu Val Gly Met Glu Glu Thr Pro 110 ATA GAG GAG GTT GGG ATG GAA GAG ACT CCC

Leu Met Asn Glu Asp der Ile Leu Ala Val 120 CTG ATG AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT G'TG

Arg Lys Tyr Ptie Gin Arg Ile Thr Leu Tyr 130 AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTT TAT

Leu Tnr Glu Lys Lys Tyr der Pro Cys Ala IAO CTA ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC

Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile üet Arg 150 TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA

Ser Leu der Pae der Thr Asn Leu Gin Lys 160 TCC CTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA Arg Leu Arg Arg Lys Asp AGA TTA AGG AGG AAG CAT TGA

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- Abschnitt der Genom-DNS mit einer Grösse von 0,65 kb beim Menschen,

dass die erwähnte rekombinante Plasmid-DNS folgende genetische Marker, und zwar ApR-Gen für Ampizillin-Resistenz, SmR-Gen für Streptomyzin-Resistenz besitzt, folgende einzigartige Teilabschnitte zur Erkennung von Restriktionsendonucleasen Hindlll für den Ausgangspunkt, Eco RI mit einer Grösse von 1,4 kb, Bam HI mit einer Grösse von 10,82 kb enthält.
2. Stamm Pseudomonas sp. 31 (pVN22) VNIIA Nr.-1788A als Produzent von menschlichem leukozytärem Interferon a-Il, der die rekombinante Plasmid-DNS pVN22 nach Anspruch 1 enthält.