WO1987006613A1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pVN22, CODING FOR BIOSYNTHESIS OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 AND STRAIN PSEUDOMONAS sp. 31 (pVN22) - PRODUCER OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 CONTAINING IT - Google Patents

RECOMBINANT PLASMID DNA pVN22, CODING FOR BIOSYNTHESIS OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 AND STRAIN PSEUDOMONAS sp. 31 (pVN22) - PRODUCER OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 CONTAINING IT Download PDF

Info

Publication number
WO1987006613A1
WO1987006613A1 PCT/SU1987/000052 SU8700052W WO8706613A1 WO 1987006613 A1 WO1987006613 A1 WO 1987006613A1 SU 8700052 W SU8700052 W SU 8700052W WO 8706613 A1 WO8706613 A1 WO 8706613A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
size
pvn22
plasmid
interferon alpha
Prior art date
Application number
PCT/SU1987/000052
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jury Ivanovich Kozlov
Vera Aronovna Naroditskaya
Marina Revazovna Eremashvili
Alexandr Yakovlevich Strongin
Viktor Emilievich Sterkin
Marina Alexeevna Skvortsova
Andrei Jurievich Chistoserdov
Jury Dmitrievich Tsygankov
Ljudmila Vladimirovna Evdonina
Vitaly Lvovich Jurin
Galina Sergeevna Monastyrskaya
Evgeny Davidovich Sverdlov
Grigory Mikhailovich Dolganov
Sergei Anatolievich Tsarev
Original Assignee
Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Geneti
Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni M.M.Shemyak
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Geneti, Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni M.M.Shemyak filed Critical Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Geneti
Priority to GB8729559A priority Critical patent/GB2199830B/en
Publication of WO1987006613A1 publication Critical patent/WO1987006613A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas

Definitions

  • the preceding level of technology is proteins that are produced by slow type of carrots in response to viral infection, and also after the activity is inactive.
  • Interferers have anti-virus action, as well as a whole range of other properties: suppression of the process of cure, influence on their differentiation, and an increase in the in- teraction Introduced by human patients, the name of the patient's internal medicine (internal medicine) is __ 16 G ⁇ m ⁇ l ⁇ giya amin ⁇ isl ⁇ ny ⁇ ⁇ sle- d ⁇ va ⁇ eln ⁇ ey ⁇ azlichnyu ⁇ sh ⁇ e ⁇ e ⁇ n ⁇ v with d ⁇ s ⁇ zhgae ⁇ 8 (# above.
  • ⁇ dna ⁇ e ⁇ is ⁇ chni ⁇ not ⁇ s ⁇ ben • ud ⁇ vle ⁇ v ⁇ i ⁇ ⁇ ebn ⁇ s ⁇ in vys ⁇ chischenny ⁇ in ⁇ e ⁇ e ⁇ na ⁇ 13 ⁇ / 8 ⁇ 7 / 00 5
  • the reclaimed, reclaiming, plasmid-borne species possesses the following genetic markers: the ⁇ n gene, which ensures the stability of ampicillin; gen ⁇ m 5t ⁇ , ⁇ bes ⁇ echivayuschim us ⁇ ychyav ⁇ s ⁇ K s ⁇ e ⁇ mitsinu; contains 5 the following unique sites of recognition of the process:
  • the plasmid vector ⁇ US37 which is conveniently maintained, is 35 in the hostile bacteria, which facilitates the use of natural products and for the sake of good health. 87 /
  • Plasma plasmid detection ⁇ holder92 is illustrated in the attached fig. I.
  • ⁇ ayas ⁇ matsiyu ⁇ - v ⁇ dya ⁇ ⁇ b ⁇ az ⁇ m follows: ⁇ azv ⁇ dya ⁇ zhid ⁇ y s ⁇ ed ⁇ y LB n ⁇ chnuyu ⁇ ul ⁇ u ⁇ u ⁇ .s ⁇ ⁇ m 83 500 ⁇ az and ⁇ as ⁇ ya ⁇ with ae ⁇ atsiey ⁇ i ⁇ em ⁇ e ⁇ a ⁇ u ⁇ e 37 ° C d ⁇ d ⁇ s ⁇ yazheyaiya ⁇ ul ⁇ u ⁇ y ⁇ le ⁇ ⁇ yamaln ⁇ y ⁇ l ⁇ n ⁇ s ⁇ ya ⁇ i 550 nm 0.4-0.6 units,.
  • suspensions are sown on bowls with a selective medium.
  • the mixture obtained by transfusion is introduced into the Soviet Union and the cells are seized on an agarized medium containing 100 ⁇ g / ml of ashchillin. Searching for clones with gene fragments of the gene is carried out by hybridization method. ⁇ ⁇ , for this end, they grow on cellulose filters, with a size of 0.45 ⁇ m. Then, the filters are licked and hybridized with a 32r-labeled probe, which is a waste of the gene for the ⁇ C-..
  • Hybridization ⁇ • • The affected persons are identified by radioactive vehicles. Of the keys, which are hybridized with the probe, they isolate the plasmid DCD and, with the help of the structural analysis, they reveal plasmids that are involved in the participation. We obtain the plasmid ⁇ b ⁇ , then turn on the plasmid ⁇ Brass (Fig.
  • plasmid ⁇ 22 (Fig. 4) 0.2 ⁇ g of the plasmid ⁇ USUS37 and I ⁇ g of the DBP plasmids is safe for the use of the following: ⁇ 2 »6 2-mercury and 50 m ⁇ ⁇ a ⁇ ; Social - 2 units of activity, n_ ⁇ _ ⁇ - 2 units of activity; The volume of the reaction mixture is 30 microliters.
  • the non-plasmid ⁇ US37 is not safe - 13 - When restoring it, give a dance at such a place. Because it does not have the stability of a medicine. There is, with the fact that there is an acute stress-resistant medication, there is no such thing as êt ⁇ US37.
  • conjugants of the accident grow on the minimum agaric salt medium of the following composition: glucose 4 mg / ml, thamingide 5 mg / ml, 50 mg / ml, weight 75 ml / ml 75 mg / ml 75 mg / ml 75 mg / ml 75 mg / ml 75 mg / ml.
  • the conjugate compound was 30 ° C.
  • the transformer also needs a lazyd, which is why this - 14 - Do not grow out of it.
  • a strain was obtained for ⁇ ⁇ and, therefore, ⁇ az. ⁇ ⁇ 22), which contains the plasmid, which secures the synthesis of the SS-11 interface with an activity of 0.7–2.5 –10 9 ⁇ / l. 5
  • Example 3 Example 3
  • the seed crop is introduced in a quantity of 5 samples. in an environment with an indicated medium. It does. pockets to
  • the value of the local pressure of acid is kept at a level of 5-10% of saturation.
  • ⁇ uses ammonia water.
  • the growth of biomass is in turn to change the optical density of the cultural environment. After the end of the activity, the activity on the system is on.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

13 _ __
ΡЖΟΜБИΗΑΗШΑЯ ШГΑЗΜЩЩΑЯ ДΗΚ ρν Ν 22, ΚΟДИΡУВДΑЯ БИΟСИΗΤΕЗ ЧΕДОΒΕЧΕСΚΟГΟ ΛΚ<ЗШΤ__ΡΗΟГΟ ИΗΤΕΡΦΕΡΟΗΑ ø-И, И ШΤΑΜ* 18ΕΙЛЮΜСЖΑЗ ЗΡ. ЗΙ( ρТО 22)- ПΡΟДУЦΕΗΤ ЧΕΙΟΒΕЧΕСΚΟГΟ ЛΕЙΚΟЦИΤΑΡΗΟГΟ ЙΗΤΕΡΦΕΡΟΗΑ СС -Ι£, СΟДΕΡЖΑЩИЙ ΕЁ
Οбласτь τеχниκи Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτи геннοй инженеρии и биοτеχнοлοгии, а τοчнее κ нοвοй, сκοнсτρуи- ροваннοй ϊη ν±-гο , ρеκοмбинанτнοй шιазмиднοй ДΗΚ ρνи 22, κοдиρующей биοсинτез челοвечесκοгο лейκοциτаρнοгο ИΗΤβрφеροна θ - II, и Κ ΗθΒΟму ШΤ Μу Ρзеиά.οтο_ιаз зρ. 31 (ρνττ22) - προдуценτу челοвечесκοгο лейκοци- τаρнοгο инτеρφеροна СС -Ц, еοдеρжащему эτу πлазмиду. Пρедшеοτвущий уροвень τеχниκи Инτеρφеροны - белκи, выρабаτываемые неκοτορыми τиπа- ми κлеτοκ в οτвеτ на виρуснне инφеκции, а τаκже ποсле дей- сτвия неκοτορыχ дρугиχ агенτοв. Инτеρφеροны οбладаюτ анτи- виρусннм дейсτвием, а τаκже целым ρядοм дρугиχ свοйсτв: ποдавление ροсτа κлеτοκ, влияние на иχ диφφеρенциροвκу, аκτивация маκροφагοв, увеличение числа анτиτелοнезависи- мыχ κлеτοκ-κиллеροв и дρугие. Инτеρφеροны, προдуциρуемые лейκοциτами челοвеκа, нοсяτ название лейκοциτаρныχ инτеρ- φеροнοв (инτеρφеροнοв сС ) __ πρедсτавляюτ сοбοй семейсτвο ροдсτвенныχ белκοв, сοдеρκащиχ 166 (в οднοм случае 165) аминοκислοτныχ οсτаτκοв. Гοмοлοгия аминοκислοτныχ ποсле- дοваτельнοοτей ρазличнюπшτеρφеροнοв с дοсτжгаеτ 8(# и выше. Κаяднй вид инτеρφеροна СС κοдиρуеτся сοбсτвен- ным генοм и ποсле индуκции синτеза инτеρφеροнοв еοοτвеτ- сτвующим агенτοм в πлазм κροви ποсτуπаеτ смесь инτеρφе- ροнοв. сС . Биοлοгичесκая аκτивнοсτь ρазличныχ инτеρφеρο- нοв с , οπρеделяемая πο иχ сποсοбнοсτи защищаτь κлеτκи οτ дейсτвия виρусοв, сильнο ваρьиρуеτ, ρазличны τаκже и иχ дρугие биοлοгичесκие и φизиκο-χимичесκие свοйсτва, Цρи πο- лучении инτеρφеροнοв яГдяя леκаρсτвенныχ целей οбычнο ис- ποльзуюτ κροвь дοнοροв. Οднаκο эτοτ исτοчниκ не •ποсοбен удοвлеτвορиτь ποτρебнοсτь в высοκοοчищенныχ инτеρφеροнаχ 13 ΡСГ/8Ш7/00 5
- 2 - ποлнοсτью. Пρименеяие баκτеρиальныχ шτаммοв-προдуценτοв, сοзданныχ меτοдамя мοлеκуляρнοгο κлοниροваяия я геннοй янженеρяя, ποзвοляеτ ποлучаτь янτеρφеροяы ^"πρаκτичесκи в любыχ неοбχοдимыχ κοличесτваχ. Οднаκο κаждый οτдельный προдуценτ лροязвοдиτ τοльκο οддн вид инτеρφеροна сС яз бοльшοгο яχ чясла. Для ποлученяя же леκаρсτвеннοгο πρеπа- ρаτа, свοйсτва κοτοροгο πρяближаюτся κ свοδсτвам πρиροд- нοгο, неοбχοдимο ймеτь набορ πρсщуценτοв, сйнτезиρующиχ ρазличные вяды ияτеρφеροнοв сС . (наπρимеρ, сС -к, СС -ъ, С -С, сС ~ и дρуτие), чτοбы заτем высοκοοчищенные янτеρφеροяы οС мοжнο былο смешиваτь в τеχ προπορция , κаκие οбычнο наблюдаюτся в κροвя челοвеκа. Μеτοдами ген- нοй янженеρяя уже сοзданы дοсτаτοчнο зφφеκτявные баκτе- ρяальные προдуцеяτы неκοτορыχ ποдвядοв янτеρφеροнοв сС . Τаκ, наπρямеρ, сκοнсτρуяροваны ρеκοмбянанτные πлазмнд , οбесπечивающие бяοсянτез в- κлеτκаχ Ε.сοϋ янτеρφеροнοв θС -к. θ -*Ψ , ^С-Κ, я дρугяχ. Οднаκο эτο яедοсτаτοчнο для сοздания πρеπаρаτοв, ποлнοсτью ямиτяρующиχ дейеτвие смеся янτеρφеροнοв сС , ποлученныχ яз дοнορсκοй κροвя. Извесτна ρеκοмбянанτная πлазмидная ДΗΚ ρЬеϊρ-гЬ, сοздая_ая_ιа οснοве веκτορа рвн 322 я κοдяρующая бяοсян- τез янτеρφеροна сС ~~1 , а τаκже язвесτен шτамм ΕзсЬег±- сϊιζа сοϋ 294, сοдеρжащий уκазаняую πлазмиду (ΞΡΑ20072541) . . Ген янτеρφеροна СС - _. ποлучен яз бяблиοτеκя генοв челοвеκа на φаге Χаροн 4Α. Β πлаз- мяде ρЬеϊΡ-гЬ сянτез янτеρφеροна θС -ъ κοнτροлиρуеτся . я_щуцибельным τρяπτοφанοвым προмοτοροм.
Уκазанный шτамм χаρаκτеρязуеτся τем, чτο в προцес- се φеρменτация егο на бοгаτыχ сρедаχ с οτнοсиτельнο вы- сοκям сοдеρжанием τρяπτοφана ( ьΒ-сρеда, бульοн Χοττяя- геρа), οбычнο ясποльзуемыχ для οбесπечения бысτροгο ροс- τа баκτеρяи, наблюдаеτся низκяй уροвень бяοсянτеза це- левοгο προдуκτа. Эτοτ недοсτаτοκ связан с τем, чτο сян- τез янτеρφеροна с - 1 οсущесτвлиеτся ποд κοнτροлем ρегу- ляτορнοй οбласτя τρяπτοφанοвοгο προмοτορа, ρабοτу κοτο- ροгο неοбχοдямο яндуциροваτь. Для οбесπеченяя высοκοгο - 3- уροвня бяοсянτеза янτеρφеροна _^-_. κульτуρальную жид-- κοсτь яеοбχοдимο ρазбавяτь в 20-40 ρаз минимальнοй сο- левοй сρедοй. Значиτельнοе ποяяженяе κοяценτρация τρяπ- τοφана в сρеде πρявοдяτ κ нορмализация τρансκρяπция 5 гена я увелячению сянτеза янτеρφеροна в 20-50 ρаз. Β масшτабаχ προмышленнοгο προязвοдсτва τаκοе ρазбавлеяие ρасτущей κульτуρы πρедсτавляеτся κρайяе слοжным, τем бοлее чτο πρи ρазбавленяя дοлжна сοблюдаτься сτροгая сτеρяльнοсτь вο язбежаяие φагοлизяса κульτуρы Ε. сοϋ 10 Κροме τοгο, Ε. сοϋ - услοвнο πаτοгенный миκροορга- нязм я πρямененяе егο яежелаτельнο для лροизвοдсτва.
; Ρасκρыτяе язοбρеτения
Заявляемая ρеκοмбянанτяая πлазмидная ДΗΚ ρν&22 я шτамм Ρзеи-_οтοηаз зρ. 31 (ρνΝ22 - προдуценτ лей-
15 κοциτаρнοгο яяτеρφеροна сС -II являюτся нοвыми я в ляτеρаτуρе не οπясаны.
. Β οснοву язοбρеτения ποлοжена задача сοзданяя нοвοй ρеκοмбянаяτнοй πлазмяднοй ДΗΚ, κοдяρующей бяο- синτез челοвечесκοгο лейκοвдτаρнοгο янτеρφеροна сС -Ι± ,
20 я нοвοгο шτамма - προдуценτа янτеρφеροяа сС -II, сο- деρжащегο её, я οбесπечявающегο ποлучеяие лейκοциτаρ- яοгο яяτеρφеροна сС -II с высοκям выχοдοм.
Задача ρешена τем, чτο ρеκοмбянаяτная πлазмядная ДΒΚ ρνΝ22 , κοдяρующая бяοсянτез челοвечесκοгο лей-
25 κοциτаρнοгο яяτеρφеροна сС -II , сοгласнο язοбρеτеяя , имееτ ρазмеρ 10,85 τ.π.ο. (τысяч πаρ οснοваяяй) и сοс- τοяτ яз следующиχ элеменτοв:
- ΕсοΕϊ - нϊηά ΙΙΙ - φρагменτ ллазмяды ρΑΥθ 37 ρазмеροм 9,45 τ.π.ο.,
30 - Ηιηα III - Εсοйϊ - φρагменτ ρазмеροм 1,4 τ.π.ο., сοсταящий яз следующиχ элемеяτοв:
- φρагменτ ДΗΚ ρазмеροм 0,25 τ.л.ο. с ρегуляτορнοй οбласτью гена Ώ φага φ χΙ74 я πеρвыми κοдοнамя гена янτеρφеροна сС ,
35 - гея янτеρφеροна сС -!_.. ρазмеροм 0,5 τ.л.ο.,
- учасτοκ генοмнοй ДΗΚ челοвеκа ρазмеροм 0,65 τ.л.ο.; ννθ 87/06613
- 4 - уποмянуτая ρеκοмбяяанτяая πлазмядная ДΗΚ οбладаеτ сле- дующими генеτичесκими маρκеρами: генοм Αρн , οбесπе- чивающим усτοйчивοсτь κ амπициллину; генοм 5тκ, οбесπечивающим усτοйчявοсτь κ сτρеπτοмицину; сοдеρжиτ 5 следующие униκальные учасτκи узнавания ρесτρиκτаз:
Ε±пй. ΙΙΙ-Ο, ΕсοΗΙ -1,4 Τ.П.Ο. , ΒашΗΙ- 10,82 Τ.П.Ο.; деποяиροвана в κοллеκции κульτуρ миκροορгаяизмοв Βсе- сοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο янсτиτуτа аяτибиο- τиκοв и заρегисτρиροвана за нοмеροм 1788 Α .
10 Заявляемая πлазмида сποсοбна ρеπлициροваτься в ρазличныχ гρамοτρицаτельныχ баκτеρияχ, наπρимеρ в Ε.сοϋ, Ρзеиάοπюηаз и дρугиχ, и οбесπечиваеτ бяο- синτез челοвечесκοгο лейκοциτаρнοгο инτеρφеροна сС-Ι1 κοτορый οτлячаеτся οτ язвесτнοгο янτеρφеροна сС -Ι
15 τρемя аминοκяслοτными заменами в ποлοженияχ: 34; 55; 161 Βχοдящий в сοсτав заявляемοй πлазмиды ген инτеρ- φеροнε. сС - Ц , ρазмеροм 0,50 τ.π.ο. ямееτ следующую сτρуκτуρу: Зϊгаχ-Ь
ΜеЪ Суз Αзρ Ьеи Ρгο Οϊη ____? Ηϊз 8ег Ьеи Οϊу 10
ΑΤΟ τοτ ΟΑΤ сτσ σστ σдο Ασσ σдσ ΑΟС στο οοτ
Αзη Αг£ ϊ8 ΑΙа Ьеи Ιϊе Ьеи Ьеи ΑΙа 01η 20
ΑΑΤ ΑΟΟ ΑΟΟ οσσ _._?<_ ΑΤΑ στσ στο ΟСΑ ΟΑΑ
Μе-Ь Οϊу Α £ Ие 5ег Ρгο ΡΙΙΘ 8ег Οуз Ьеи 30
ΑΤΟ ΟΟΑ ΑΟΑ ΑΤΟ τστ σστ ττσ τσσ τοσ στο
Ьуз Αзρ Αгз Ηϊз Αзρ ΡЬе Οϊу Ьеи Ρгο 01η 0 ΑΑΟ ΟΑΟ ΑΟΑ ΟΑΤ 0Α0 ΤΤΤ ΟΟΑ СΤΤ 0000Α0
Οϊи Οϊи Ρϊιе Αзρ Οϊу Αзη Οϊп ΡЬе Οϊη Ьуз 50 ΟΑΟ ΟΑΟ ΤΤΤ ΟΑΤ 000 ΑΑΟ ΟΑΟ ΤΤΟ 0Α0 ΑΔΟ
ΤЬг (____. Δϊа Ιϊе Ρгο νаϊ Ьеи Ηχз Οϊи Μе* бθ
ΑΟΤ ΟΑΑ οσσ ΑΤΟ σστ οτс στσ ΟΑΤ ΟΑΟ ΑΤΟ
ΙΙΘ Οϊη 01η Τϊιг Ρϊιе Αзη Ьеи ΡЬе 8ег <____• 70
ΑΤС ΟΑΟ ΟΑΟ ΑСΟ ττσ ΑДΤ στσ ττσ ΑΟС ΑΟΑ - 5 - Οϊи Αзρ 5ег 5ег Αϊа Αϊа Τгρ Οϊи Οϊη Зег 80
ΟΑΟ ΟΑС τσд τστ οστ οστ τοο ΟΑΑ ΟΑΟ ΑΟΟ
Ьеи Ьеи Οϊи Ьуз ΡЬе 5ег Τϊιг Οϊи Ьеи Τуг 90 στσ ΟΤΑ ΟΑΑ ΑΑΑ ΤΤΤ τσσ ΑΟΤ ΟΑΑ σττ ΤΑΟ
01η 01η Ьеи Αзη Αзп Ьеи 01и Δϊа Οуз νаϊ 100 СΑΟ СΑΑ σΤ ΑΑΤ ΔΑС ΟΤΟ ΟΑΑ ΟΟΑ ΤΟΤ ΟΤΟ
Ιϊе Οϊη 01и Уаϊ 01у Μеϊ 01и 01и ΤЬд» Ρгο 110 ΑΤΑ ΟΑΟ ΟΔΟ ΟΤΤ 000 ΔΤΟ ΟΑΑ ΟΑΟ ΔΟΤ 000
Ьеи Μθ*Ь Αзη 01и Αзρ 5ег Ιϊе Ьеи Αϊа νаϊ 120 СΤΟ ΔΤΟ ΑΑΤ ΟΔΟ ΟΔΟ ΤΟΟ ΔΤС ΟΤΟ- ΟСΤ ΟΤΟ
Αгδ Ьуз Τуг ΡЬе Οϊη Αг§ Ιϊе ΤЬг Ьеи Τуг 130 ΑΟΟ ΑΑΔ ΤΑΟ ΤΤΟ ΟΑΔ ΔΟΑ ΔΤС ΑΟΤ ΟΤΤ ΤΑΤ
Ьеи ΤЬг 01и Ьуз Ьуз Τуг 8ег Ρгο Οуз Αϊа 140 ΟΤΑ ΔΟΑ ΟΑΟ ΑΑΟ ΑΑΑ ΤΑΟ ΑΟΟ ΟΟΤ ΤΟΤ 000
Τгρ 01и νаϊ νаϊ Αгз Αϊа 01и Ιϊе Μе-Ь Δгз 150 - ΤΟΟ ΟΑΟ οττ οτσ ΔΟΔ ΟСΑ ΟΑΔ ΑΤΟ ΑΤΟ ΔΟΑ
5ег Ьеи Зег ΡЗαе Зег ΤЬг Αзη Ьеи Οϊн. Ьуз 1бΟ τσσ στσ τστ τττ ΤΟΔ ΔΟΑ ΔΔΟ ΤΤΟ СΑΔ ΑΔΔ
Figure imgf000007_0001
ΑΟΑ ΤΤΑ ΔΟΟ ΑΟΟ ΑΑΟ ΟΑΤ ΤΟΑ
Изοбρеτеняем τаκже являеτся нοвый шτамм Ρзеи<ϊοтο- ηаз зρ.зΚρνΝ22) - προдуценτ челοвечесκοгο лейκοциτаρ- нοгο янτеρφеροна сС ~ Ц , сοдеρжащий уκазаняую ρеκοм- бинаяτную πлазмидную ДΒΚ ρνΝ22 . Заявляемый шτамм, сοгласяο язοбρеτеняю, ποлученный меτοдами геннοй яяже- неρяя πуτем введения ρеκοмбянанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρνκ22 в баκτеρяя ροда Ρзеиά.οтοηаз , деποяяροвая 02.04.86 - 6 - в κοллеκции κульτуρ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο- исследοваτельсκοгο янсτяτуτа анτибиοτиκοв и заρегисτρи- ροван за нοмеροм Ι788Α.
Б οτличие οτ язвесτнοδ πлазмиды ρЬеΙз?-гЬ , ιде 5 синτез κοнτροлиρуеτся яндувдбельным προмοτοροм, в заяв- ляемοй πлазмиде ρνΝ22 синτез янτеρφеροна сС-Ц наχο- дяτся ποд κοнτροлем κοнсτиτуτивнοгο προмοτορа гена в φага φ χΙ74, чτο уπροщаеτ προцесс φеρменτации. Исποль- зθБаяие в κачесτве веκτορа πлазмиды ρΑУС37(Шзузалкον Υ.Б,
Ю σЫз-Ьοзегάον Δ.Υ. , Ρϊазт±ά. •'14,118-125И98Эс шиροκим сπеκτροм χοзяев ποвышаеτ сτабильнοсτь заявляемοй ρеκοм- бянанτнοй πлазмиды
Figure imgf000008_0001
, ποлученнοй на её οснοве, в οτличие οτ менее сτабильнοгο веκτορа ρΒΗ322 , исποль- зуемοгο для ποлучеяия извесτнοй πлазмиды. Заявляемая
15 πлазмида ρνπ22 дοсτаτοчнο сτабильнο мοжеτ лοддеρжи- ваτься в ρазличныχ шτаммаχ, даже без дοбавления аяτи- биοτиκοв в κульτуρальную сρеду, в το вρемя κаκ извесτ- ная πлазмида ρЬеΧЗ?-гЬ , ποлучеяная на οснοве ρвн 322, в τаκиχ услοвияχ бысτρο элиминиρуеτся. Исποльзοваняе
20 в κачесτве προдуценτа заявляемοгο шτамма Ρзеиάοтοηаз зρ. 31 (ρνгΤ22) ποзвοляеτ увеличиτь аκτивяοсτь инτеρ- φеροна сС ~Н дο 0,7-2,5*10 ΜΕ/л κульτуρальнοй жндκοс- τи. Пρименение заявляемοгο шτамма для синτеза инτеρφе- ροна сС "11 значиτельнο снижаеτ вοзмοжнοсτь φагοлизиса
25 в προцессе φеρменτации. Κροме τοгο, заявляемый шτамм,. в οτличие οτ шτаммοв Ε.сοϊϊ, не являеτся услοвнο πаτο- генным миκροορгаяизмοм. Τаκим οбρазοм, исποльзοваяие πρедлагаемοгο язοбρеτения ποзвοляеτ πο προсτοй τеχнο- лοгии ποлучаτь лейκοциτаρяый челοвечесκий инτеρφеροн
30 ' П ο высοκим выχοдοм.
Лучший ваρиаяτ οсущесτвления изοбρеτения
Слοсοб κοнсτρуиροвания заяв^емοй ρеκοмбянанτнοй πлазмяды ДΗΚ ρν»22 сοсτοиτ в следующем.
Плазмидный веκτορ ρΑУС37, сποсοбный ποддеρжива- 35 τься в гρамοτρицаτельныχ баκτеρяяχ, ρасщеπляюτ ρесτ- ρиκτазами н±ηά щи ΕсοΗϊ И С ποмοιιдаο ДΗΚ-лигазы 87/
- 7 - ввοдяτ Η-лά Иϊ-Εсοβϊ-. φρагмеяτ ρазмеροм 1,4 τ.л.ο., в κοτοροм ρасποлοжен ген инτеρφеροяа сС -11 , наχο- дящийся ποд κοнτροлем προмοτορа. гена Ώ φага _φ χΙ74. Уκазаяный н__αά ш-Εсο κι - φρагменτ ρазмеροм 5 1,4 τ.π.ο. сοсτοиτ из следующиχ элеменτοв:
- φρагмеяτ ДΗΚ ρазмеροм 0,25 τ.π.ο. с ρегуляτορнοй οбласτью гена Б φага ρ < χΙ74 и πеρвыми κοдοнами ге- на янτеρφеροяа СС
- гея янτеρφеροяа сС-Ιά. ρазмеροм 0,5 τ.π.ο.,
Ш - учасτοκ геяοмнοй ДΗΚ челοвеκа ρазмеροм 0,65 τ.π.ο.; уποмяяуτая ρеκοмбяяаяτяая πлазмядная ДΗΚ οбладаеτ ге- неτячесκями маρκеρами: генοм Αρ , οбесπечявающим усτοйчявοсτь κ амπициллину, генοм Зт , 'οбесπечивающям усτοйчявοсτь κ сτρеπτοмицину; οна сοдеρжиτ следующие
15 уняκальяые учасτκя узяаваяяя ρесτρяκτаз:Η±аά Ш-ο, ΕсοΗ - 1,4 Τ.П.Ο., Βат ΗΙ - 10,82 τ.π.θ.
Пοлучаемые ρеκοмбянанτяые πлазмиды τρаясφορмацяей • ввοдяτ в ρазные шτаммы Ε.сοϋ , наπρямеρ Ε сοϊ± Κ802 я С600. Οτбορ τρансφορманτοв προвοдяτ πο ποявлеяяю у
20 яяχ усτοйчявοсτя κ амπяциллину и сτρелτοмяцину, лρячем ген Зтκ τρаясκρябяρуеτся в даяяοм случае с лροмοτορа гена Ώ φага ζρ χΙ74. Τаκяе τρансφορманτы в зяачяτель- яыχ κοличесτваχ сянτезяρуюτ янτеρφеροя сС - ц, οблада- ющяй бяοлοгячесκοй аκτявнοсτью. Τаκ был ποлучен шτамм
25 Ε.сοϋ σбοο,сοдеρжащий ллазмяду, лοлучявшую назяачеяяе. ρνΝ22 .Шτамм Ε.сοϊ± σбοο(ρνυ22) сянτезяρуеτ яяτеρ- φеροя οС -II с аκτявяοсτью дο 1*10 ΜΕ/л. Плазмида ρνΝ22 сποсοбна κ мοбялизациοянοму πеρеяοсу с лοмοщью κοнзю- гаτявныχ ллазмяд. Для мοбялязация ρνн22 в шτамм Ε^сοϋ
30 С600(ρνΝ22) κοнюгацией ввοдяτ πлазмяду Η751, οбесπечявающую усτοйчявοсτь κ τρимеτаπρиму. Заτем προ- вοдяτ межвидοвую κοнъюгацию между Ε.сοϊι σбοο (ρνи22, Η751) и . Ρзёшϊοтοг-аз зρ. 31. Смесь баκτеρий высеваюτ на чашκи с мяяимальяοй сοлевοй сρедοй Αдамса, сοдеρжа-
35 щей амπициллия, сτρеπτοмяцян, τρямеτаπρям и амянοκяс- лοτу τρеοяин, и выρащяваюτ πρя τемπеρаτуρе 30°С. Β
ΤаΚЯΧ уСЛΟΒЯЯΧ ΒЫρаСΤЭЮΤ ΤΟЛЬΚΟ ΚЛеτΚй Ρзеиάοтοηаз зρ. - 8 - 31 (н 75ϊ,рν_Τ22) , τаκ κаκ для ροсτа дοнορнοгο шτамма Ε.сοϊχ сбοο (н 751, ρν_ϊ22) ποмимο τρеοнина неοбχοдим τаκже лейцин. Пρи дальнейшей ρабοτе τρимеτаπρим в сρеду, где ποддеρживаеτся шτамм Ρзеиάοтοηаз зρ. 31 (ρνΝ22), 5 не дοбавляюτ, τаκ κаκ наличие πлазмиды Η751 не явля- еτся οбязаτельным для шτамма-προдуценτа..
Шτамм Ρзеиάοπюηаз зρ. ЗΚρνΝ22) οбесπечиваеτ выеοκий уροвень биοсинτеза инτеρφеροна θС -И , κοτορый дοсτигаеτ 2,5-10 ΜΕ/л κульτуρальнοй жидκοсτи. Ш Заявляемый шτамм Ρзеиάοгаοηаз зρ. 31 (ρνΝ22) , προдувдρующий челοвечесκий леδκοциτаρный инτеρφеροн сС ~- XI χаρаκτеρизуеτся следующими πρизнаκами.
Μορφοлοгичесκие πρизнаκи. Κлеτκи πρямые πалοчκο- видные длияοй 3-5 мκ, гρамοτρицаτельные, несποροнοсные. 15 Κульτуρальные πρизнаκи. Κлеτκи χοροшο ρасτуτ на προсτыχ πиτаτельныχ сρедаχ. Ηа мясο-πеπτοянοм агаρе чеρез 24 часа ροсτа πρи τемπеρаτуρе 25-30°С οбρазуюτ κρуπные κοлοнии с неροвным κρаем (диамеτρ 3-4 мм), ποвеρχнοсτь шеρшавая, цвеτ свеτлο-зеленый. Пρи ροсτе 20 на бульοне Χοττингеρа или жидκοй сρеде Μ9 с дοбавκами κазаминοκислοτ οбρазуеτся ρавнοмеρная нуτь. Чеρез 24 часа ροсτа яа бульοне Χοττингеρа с аэρацией κульτуρа πρиοбρе- τаеτ свеτлο-зеленый цвеτ я слегκа οπалесциρуеτ.
Φизиοлοгο-биοχимичесκие πρизнаκи. Κлеτκи Ρзеиάοтοηаз 25 зρ.зϊ (ρνи22) ρасτуτ πρи τемπеρаτуρе Ι0-35°С с οπτимумοм 30°С, πρи ρΗ 6,7-7,5. Исτοчниκи уτлеροда: глюκοза, аρабинοза. Исτοчниκи азοτа: сοли аммοния, мο- чевина, мοгуτ быτь τаκже амияοκислοτы, πеπτοн, τρиπτοн и дρугие. 30 Усτοйчивοсτь κ анτибиοτиκам. Κлеτκи Ρзеиάοтοηаз зρ. 3 (ρνЫ22) οбладаюτ усτοйчивοсτью κ 400-500 мκг/мл сτρеπτοмицина и 150-200 мκг/мл амπициллина.
Сτабильнοсτь πлазмиды в шτамме Ρзеиάοшοηаз зρ. зΚρνΝ πρя ποддеρжании κлеτοκ Ρзеиάοтοηаз зρ. 31 (ρνΝ22)в τе- 35 чеяяе 6 месяцев на агаρязοваняοй сρеде, сοдеρжащей амπя- циллян я сτρеπτοмицин в сοοτвеτсτвующиχ κοнценτρацияχ, яе наблюдаеτся лοτеρя ялн πеρесτροйκя πлазмиды. - 9 -
Для лучшегο ποнимания насτοящегο язοбρеτеяия лρи- вοдяτся следующие πρямеρы κοнсτρуиροвания заявляемοй ρеκοмбянаяτнοй πлазмиднοй ДБΚ ρνΗ22 и ποлучения шτамма. Пρимеρ I. Для κοнсτρуиροвания заявляемοй ρеκοмбинанτнοй πлаз- миднοδ ДΗΚ ρνΝ22 исποльзуюτ φρагменτы πлазмиды ρΑУС37 я πлазмиды ρνнбοэ πο следующей сχеме.
Пρедваρяτельяο сοздаюτ две яροмедуτοчные πлазмиды ρνΝ 192 и ρνττбϊ , заτем προвοдяτ κοнсτρуиροвание πлаз-
ΜЯДЫ ρν бΟЭ. Κοнсτρуиροвание πлазмиды ρνΝΙ92 лροиллюсτρиροванο на πρилагаемοй φиг. I.
0,1 мκг ДΗΚ πлазмиды ρϋσϊэ и I мκг πлазмиды ρ<_Α4б ρасщеπляюτ ρесτρиκτазаш Ρз-ы и н±ηά Шв следующиχ услοвияχ: 6мΜ Τρис-яσι , ρΗ 7,6, 6мΜ меσι2 , ем 2-меρ- κаπτοэτанοла и 50 Μ Νаθϊ , Ρз-ы - I ед.аκτивнοсτи, нϊηά III— I ед.аκτивяοсτи, οбъем ρеаκциοннοй смеси 20 мκл. Ρеаκцию προвοдяτ.в τечение I часа πρи τемπеρа- τуρе 37°С я οсτанавливаюτ προгρеванием в τечение 20 мия πρя τемπеρаτуρе 65°С. Заτем προвοдяτ лигиροвание ποлу- ченныχ φρагменτοв с ποмοщью ДΗΚ-лигазы φага Τ4 в следу- ющяχ услοвяяχ: 60ιдΜ Τρяс-нσϊ , ρй 7,6, 10 мΜ §σϊ2, 10 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 0,4 мΜ адеяοзияτρиφοсφορяοй κяслοτы, ДΗΚ-лигазы - 2 ед.аκτявнοсτи, οбъем ρеаκциοннοй смеси 25 мκл. Лигиροваяие προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе Ι2°- Ι4°С в τечение 90 мин, ποсле чегο τаκую смесь τρансφορ- мацией ввοдяτ в κлеτκи Ε.сοϋ Л83. Τρаясφορмацию προ- вοдяτ следующим οбρазοм: ρазвοдяτ жидκοй сρедοй ьв нοчную κульτуρу Ε.сοϋ ^м 83 в 500 ρаз и ρасτяτ с аэρацией πρи τемπеρаτуρе 37°С дο дοсτяжеяия κульτуροй κлеτοκ οπτямальнοй πлοτнοсτя πρи 550 нм 0,4-0,6 ед., заτем κлеτκи οχлалςцаюτ в ледяяοй бане и все ποследуκшще οπеρация προвοдяτ πρя τемπеρаτуρе 2 -4°С, 10 мл οχлаж- деннοй κлеτοчнοй сусπензяя ценτρяφугяρуюτ, суπеρнаτаяτ τщаτельяο удаляюτ, а κлеτκя сусπендяρуюτ в 10 мл 0,1 Μ σаσϊ2 с τемπеρаτуροй 2-4°С я выдеρживаюτ 30 мин, ποсле чегο κлеτκя сοбяρаюτ ценτρяφуτяροванием я ρесусπеядиρуюτ в 0,5 мл 0,1 Μ Саσϊ2 , κ 100 мκл πρягοτοвленяыχ τаκим - 10 - οбρазοм κлеτοκ дοбавляюτ 20 мκл ρасτвορа ДΗΚ ποсле лиги- ροвания, сусπензию κлеτοκ в 0,1 Μ σаσι2ζ дοбавленный ρасτвορ ДΗΚ τщаτельнο πеρемешиваюτ и οсτавляюτ πρи τемπе- 5 ρаτуρе 2-4°С на 30 мин, заτем цροгρеваюτ цρи τемπеρаτу- ρе 42°С в τечение 4-5 мин, ποсле чегο снοва на 20 мин πο- мещаюτ в ледяную баню, заτем сусπензию в 10 ρаз ρазвο- дяτ сρедοй ьв и на 30 мин ποмещаюτ в τеρмοсτаτ цρи τем- πеρаτуρе 37°С, ποсле ποдρащивания 50-100 мκл κлеτοчнοй
ΙΟ: сусπензии высеваюτ на чашκи с селеκτивнοй сρедοй. Селеκ- τивная сρеда πρи οτбορе τρансφορмаяτβв, ποлученныχ πρи κлοниροвании φρагменτοв на πлазмиде ρυσιэ , сοдеρжиτ сле- дующие κοмποненτы: Ь -агаρ, амπицшυшн - 100 мκг/мл, изοπροπилτиοгалаκτοзид - 10 мΜ, 5-бροм-4-χлορ-3-индοлшг-
15 ι> -галаκτοзид - 40 мгκ/мл. Οτбиρаюτ неοκρашенные κοлο- нии. Οκρашенные в синий цвеτ κοлοнии несуτ вοссτанοвившийся в ρезульτаτе лигиροвания веκτορ ρυσιэ . йз неοκρашенныχ κο- лοний меτοдοм Биρнбοйма и Дοлли выделяюτ πлазмидную ДΕЖ и προвοдяτ οτбορ τеχ πлазмид, где ποявляеτся учасτοκ узна-
20 вания в§ш. Ρеаκцию ρесτρиκции προвοдяτ, аналοгичнο οπи- саннοму выше, еβ ρезульτаτы анализиρуюτ элеκτροφορезοм ДΗΚ в 1% агаροзнοм геле в τρисбορаτнοм буφеρе (0,1 Μ Τρис- -бορаτа, 0,1 Μ бορнοй κислοτы, 0,002 Μ эτилендиамин-τеτ- ρаацеτаτа Νа с ποследующим προκρашиванием геля бροмис-
25 τым эτидием, чτο ποзвοляеτ увидеτь ДΕЖ в длиннοвοлнοвοм ульτρаφиοлеτе. Βсе προанализиροванные τаκим οбρазοм κο- лοнии сοдеρχали πлазмидную ДΕ2С с учасτκοм узнавания вβϊιι внуτρи. Τаκим οбρазοм была ποлучена веκτορная πлазми- да ρνΝΙ92, сοдеρжащая единичные учасτκи узнавания сле-
30 дующиχ ρееτρиκτаз: н±ηάϊи, вϊаϊι, Ρз-ь ΟΤ ΡЗ-Ы дο ΕсοΕϊ сοдеρжиτ ποлилинκеρную ποследοваτельнοсτь из ρυσ ιэ);
Далее προвοдяτ κοнсτρзгиροвание πлазмиды ρ 61 (φиг.2) 30 мκг ДΕЖ πлазмиды ρ I ϊ 1 ρасщешшюτ ρесτρиκ-
35 τазами н±ηά ш и Εсοй ι в следующиχ услοвияχ: 6 мΜ Τρис-нсι , ρн 7,6, 6 мΜ м§σι2 , 6 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла и 50 мΜ Νаσι , ΕсοН ϊи Η-ϊηά ιιι - 30 ед. аκτивнοсτи, Η20 дο I мл. Ρеаκцию προвοдяτ в τечение 2 часοв πρи мед-
Figure imgf000013_0001
- II - леннοм πеρемешивании πρи τемπеρаτуρе 37°С и οсτанавливаюτ πуτем προгρевания цρи τемπеρаτуρе 65°С в τечение 20 мин. Пοлнοτу ρасщепления ДΕЖ цροвеρяюτ элеκτροφσρезοм ДΪЖ в 1%-κοи агаροзнοм геле, аналοгичнο οπисаннοму выше. Пοсле προвеρκи всю οсτавшуюся ДΕЖ нанοсяτ на 1%-τшΑ агаροзный гель и деляτ φρагменτы элеκτροφορеτичесκи. Заτем цροвοдяτ элеκτροэлщию нужнοгο φρагменτа. Пοлученный φρагменτ ποд- веρгаюτ οгρаниченнοцу πщραлизу ρесτρиκτазοй ЗаиЗД и эτοгο ρазвοдяτ φеρменτ инκубациοнным буφеροм. Дοбавляюτ в κаждую цροбу, сοдеρжашую 0,5 мκг чисτοгο φρагменτа, πο 0,1 ед. аκτивнοсτи 5аи ЗΑ И ποдбиρаюτ вρемя, за κοτσροе φρагменτ ρасщеπляеτся τοльκο часτичнο (инκубацию προвο- дяτ 2 мин, 4 мин, 6 мин и τаκ далее). Ρеаκцаю οсτанавли- ваюτ, ποмещая цροбы в вοдянοй τеρмοсτаτ с τемπеρаτуροй 6δ°С на 20 мин. Пοлнοτу ρасщеπления κοнτροлиρуюτ с ποмσщью элеκτροφορеза в ульτρаτοнκοм геле, чτο ποзвοляеτ нанοсиτъ лишь 1/4 οбъема всей цροбы. Пοлученные φρагменτы всτρаи- ваюτ в οбρабοτанную ρесτρиκτазами Ββϊ ιι и Εсοйϊ длаз- ιду ρνΝϊэг . Дяя эτοгο ДΕЖ ρνϊ92(2 мκг) ρасщешшюτ ρесτρиκτазами вβш и Εсοβϊ в следующ-ϊχ услοвияχ: 100 мΜ Τρис- нσι, ρн 7,5, 6 мΜ мβσι2 , е мΜ 2-меρκаπτο- эτанοла, 50 мΜ Νаσι э ΕсοΗϊ _ 2 ед.аκτивнοсτи, н__αάϊιι - 2 ед.аκτивнοсτи, Η20 дο 30 мκл. Ρеаκцию προвοдяτ в τе- чение I часа цρи τемπеρаτуρе 37°С и οсτанавливаюτ, πο- мещая цροбы в τеρмοсτаτ с τемπеρаτуροй 65°С. Заτем цρο- вοдяτ лигиροвание с ποмοщью ДΕЖ-лигазн φага Τ4, ρас- щешгеннοй πο вβш и Εсοнι д ρνΝϊэг с ρасщеπленнοδ заиЗΑ дщ н±ηάϊи-Εсοκϊ- φρагменτа из Ρ I τ * .Ρеаκцию προвοдяτ аналοгичнο οπисаннοму выше, сοдеρжание ДΗΚ: 0,1 мκг ρνΝϊ92 , 0,4 мκг ДΕЖ φρагменτа, κοнечный οбъем 20 мκг. Пοлученную смесь τρансφορмацией ввοдяτ в Ε.сοϊ люз и κлеτκи выееваюτ на агаρизοванную сρеду, сοдеρжащую 100 мκг/мл ашшциллина. Пοисκ κлοнοв с φρагменτами гена инτеρφеροна προвοдяτ меτοдοм гибρидизации ϊл. βϊ-ь , Ддя эτοгο κοлοнш выρа- щиваюτ на ниτροцеллюлοзныχ φильτρаχ, ρазмеρ πορ 0,45 мκм. Заτем κοлοнии на φильτρаχ лизиρуюτ и цροвοдяτ гибρиди- зацию с меченым 32ρ зοндοм, πρедсτавляющим сοбοй учасτοκ гена инτеρφеροна οС -к. Эτο вοзмοжнο, τаκ κаκ ДΕЖ гена - 12 - инτеρφеροна сС -Α имееτ сχοдную с генοм инτеρφеροна сС'- П нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь. Гибρидизу^ • • ющиеся κοлοнии выявляюτ ρадиοавτοгρаφией. Из κлοнοв, κοτορые гибρидизуюτся с зοндοм, выделяюτ πлазмидную ДΗΕС и с ποмοщью ρесτρиκциοннοгο анализа выявляюτ τе πлазми- ды, κοτορые сοдеρжаτ учасτοκ узнавания ΒβШ . Τаκим οбρазοм ποлучаюτ πлазмиду ρνΝбι , заτем лροвοдяτ κοн- сτρуиροвание πлазмиды ρνηбοэ (φиг. 3).0,1 мκг н±ηάШ- ЗаиЗΑ - φρагменτа ДΗΚ ρазмеροм 0,25 τ.π.ο. , τде ρасπο- . лοжея προмοτορ гена в φага ρ χΙ74, з-в - ποследοваτель- нοсτь гена в , а τаκже ΑΤΟ и ιсга - κοдοны зρелοгο гена инτеρφеροна θС -Α φеρменτаτивяο сшиваюτ с 0,5 мκг ДΗΚ ρνΝбϊ , πρедваρиτельнο ρасщеπленнοй ρесτρиκτазами ΗϊηάϊИ и Ββϊи , в услοвияχ, аналοгичныχ вышеуκазанным. Заτем ποлученнуюπеβлг лиг__ροван_ιя смеοь ввοдяτ τρансφορмацией в Ε.сοϋ «Ш83 и οπρеделяюτ в τρансφορ- манτаχ биοлοгичесκую аκτивнοсτь инτеρφеροна θС " II Τаκим οбρазοм иденτиφищρуюτ κлοн, сοдеρжащий πлазмиду ρνΝб09, κοτορая οбеслечиваеτ синτез зρелοгο инτеρφеροна θ - II в κлеτκаχΕ.сοϋ ποд κοнτροлем προмοτορа гена в φага φ χΙ74.
Далее προвοдяτ κοнсτρуиροвание πлазмиды ρνΝ22 (φиг.4) 0,2 мκг ДΗΚ πлазмиды ρΑУС37 и I мκг ДБΚ πлаз- миды ρνΝбοэ ρасщеπляюτ ρесτρиκτазами Ξсοйϊ.. и Η-лάϊιι в следующиχ услοвиях: 6 мΜ Τρис-ΗСΙ , ρΗ 7,6, бιиΜ ΜβСϊ2» 6 2-меρκаπτοэτанοла и 50 мΜ Νаθϊ; ΕсοΕΙ - 2 единицы аκτивяοсτи,н_ϊ_ιιάϊΙΙ- 2 едияицы аκτивнοсτи; οбъем ρеаκциοн- нοй смеси 30 мκл. Ρеаκцию προвοдяτ 40 мин πρи τемπеρа- τуρе 37°С и οсτанавливаюτ προгρеванием в τечение'15 мин πρи τемπеρаτуρе 65°С. Заτем προвοдяτ сπшвание ποлученныχ φρагменτοв с ποмοщью ДБΚ-лигазы φага Τ4. Ιигиροвание προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе Ι2-Ι4°С в τечеше 120 мин, ποсле чегο τаκую смесь τρансφορмацией ввοдяτ в Ε.сοϋ σбοο Τρансφορмиροванные κлеτκи ποсле длиτельнοгο ποдρащивания -' ' (2,5 часа) высеваюτ на агаρизοванную ь сρеду, сοдеρ- жащую в κачесτве селеκτивныχ маρκеροв сτρеπτοмицин (100 жг/мл). Беκτορная πлазмида ρΑУС37 не сποсοбна - 13 - πρи вοссτанοвлении даτь τρансφορманτοв на τаκοй сρеде,. τаκ κаκ не οбладаеτ усτοйчивοсτью κ сτρеπτοмицину. Пρο- мοτορ, с κοτοροгο προисχοдиτ эκсπρессяя сτρеπτοмицин- усτοйчивοсτи, у ρΑУС37 οτсуτсτвуеτ. Пρи κлοниροвании προмοτορ-сοдеρжащегο φρагменτа с инτеρφеροнοм сС~ ΪΙ из ρνΝбθЭ в ρΑУС37 προисχοдиτ вοссτанοвление усτοйчи- вοсτи κ сτρеπτοмицину, чτο ποзвοляеτ легκο οτбиρаτь κлοны, сοдеρжащие исκοмые πлазмиды. Из τаκиχ κлοнοв выделяюτ πлазмидную ДΕΚ и προвеρяюτ сτρуκτуρу πлазмид с ποмοщы) ρасτρиκτаз ц±аάϊιϊи ΕсοΗϊ в услοвияχ,аналο- гичныχ οπисаяным выше. Αнализ ποлучаемыχ φρагменτοв προвοдяτ с ποмοщью элеκτροφορеза в 1% агаροзнοм геле в.. сτандаρτнοм Τρис-бορаτнοм буφеρе, с ποследующим προκρа- πшванием геля бροмисτым эτидием. Τаκим οбρазοм иденτи- φициροвана πлазмида ρνΝ22. Пρимеρ 2. Пοдучение шτамма Ρзеиάοтοηаώ зρ.31 (ρνΝ22), προдуциρующегο инτеρφеροн σС-Ц , προвοдяτ следутацим θбρазοм. Для введения πлазмиды ρνΝ22 в Ρаβиάοтοηаа аρ.31 πρимеκяюτ две ποследοваτельные κοнъюгации. Сначала в шτамм Ε.сοϊι σбοο (ρνΝ22) κοнъюгацией ввοдяτ πлаз- миду Η751 Л751 οбесπечиваеτ усτοйчивοсτь κ τρимеτаπρиму. Бысев κοнъюганτοв προизвοдяτ на минималъную агаρи- зοванную сοлевую сρеду Αдамса, сοдеρжащую следующие κοмποненτы: глюκοзу 4 мг/мл, τиамингидροχлορид 5 мκг/мл, τρеοнин 50 мκг/мл, лейвдн 50 мκг/мл, амπивдллин 75 мκзмя сτρеπτοмицин 75 мκг/мл, τρимеτаπρим (75 мκг/мл). Β эτиχ услοвияχ выρасτаюτ τοльκο κοнъюганτы Ε.сοϊι сбοο (н 751, ρνΝ22) • Заτем προвοдяτ κοнъюгацию между Β.сοϋ σбθθ (Η 751, ρνΝ22) И Ρааиάοтοηаа зρ.31 с деφеκτным генοм -ыιг Δ . Κοнъюганτы выρасτаюτ на мини- мальнοй агаρизοваннοй сοлевοй сρеде следующегο сοсτава: глюκοза 4 мг./мл, τиамингйдροχлορйд 5 жг/мл, τρеοнин 50 жг/мл, амπивдллин 75 жг/мл, сτρеπτοмицин 200 жг/мл,- τρимеτалρим 75 жг/мл. Τемπеρаτуρа ροсτа κοнъюганτοв 30°С. Шτамм-дοнορΕ.сοϊ± σбοο(κ 751, ρνΝ22) ποмшлο τρеοнина нуждаеτся еще и в лейπдне, ποэτοму на τаκοй - 14 - сρеде не выρасτаеτ. Б ρезульτаτе ποлучен шτамм Ρзβиάοтοηаз зρ. зι ρνΝ22), сοдеρжащий πлазмиду, κοτορая οбес- πечиваеτ синτез инτеρφеροна сС - 11 с аκτивнοсτью 0,7-2,5-Ю9 ΜΞ/л. 5 Пρимеρ 3.
Κульτивиροвание шτамма Ρзβиάοтοηаз зρ. 31 (ρνΝ22) οсущесτвляюτ πуτем выρащивания егο πρи τемπеρаτуρе 28°С в τечение 14 часοв на сκοшеннοй агаρизοваннοй сτандаρτ- нαϊ сρеде Χοττингеρа, сοдеρжащей анτибиοτиκи амπициллин
Ш (75 жг/мя), сτρеπτοмицин (150 жг/мл)» Τρимеτалρим в сρеду не дοбавляеτся, τаκ κаκ наличие πлазмиды й 75ϊна προдуκцию инτеρφеροна не влияеτ. Βыροсшую на κοсяκаχ биοмассу исποльзуюτ для πρигοτοвления ποсевнοгο маτеρиа- ла. Для эτοгο κлеτκи πеρенοсяτ в κοлбы Эρяенмейеρа οбъе-
15 мοм 750 мл сο 100 мл уκазаннοй выше сρеды, нο без агаρа и выρащиваюτ на κачаже πρи 'πеρемепшвании (240 οб/мин) в τечение несκοльκиχ часοв лρи τемπеρаτуρе 28°С. Οπτи- чесκая πлοτнοсτь ποсевнοδ κульτуρы дοлжна быτь ρавна πρиблизиτельнο 1-2,5 ед. πρи 550 нм. Φеρменτацию προ-
20 вοдяτ в φеρменτеρе, οснащеннοм сисτемами для ρегулиρο- вания τемπеρаτуρы, ρΗ, сκοροсτи πеρемешивания и аэρавди, даτчиκοм для измеρения πаρвдальнοгο давления ρасτвορен- нοгο κислοροда. Пοсевную κульτуρу внοсяτ в κοличесτве 5 οб. в φеρменτеρ с уκазаннοй сρедοй. Ρасτяτ. κлеτκи дο
25 οπτичесκοй πлοτнοсτи в сτандаρτяыχ услοвияχ 2-4 ед. πρи ρΗ 6,7-6,9 и τемπеρаτуρе 28±0,5°С. Пροвοдяτ инτенсивную аэρацию и πеρемеπшвание. Ρежим аэρации и леρемешивания. лοдбиρаюτ τаκим οбρазοм, чτοбы ροсτ κульτуρы не лимиτи- ροвался κοнценτρацией ρасτвορеннοгο κислοροда, для чегο
30 значение лаρвдальнοгο давления κислοροда лοддеρживаюτ на уροвне 5-10% οτ насыщения. Для сτабилизации ρΗ исποль- зуюτ аммиачную вοду. Ροсτ биοмассы κοнτροлиρуюτ πο изме- нению οπτичесκοй πлοτнοсτи κульτуρальнοй сρеды. Пοсле οκοнчания φеρменτавди аκτивнοсτь инτеρφеροна сοсτавляеτ
35 Ι,2χΙ09ΜΕ/л. - 15 - Пροмышленная πρименимοсτь
Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρνΝ22, κοдиρующая биοсинτез челοвечесκοгο лейκοвдτаρнοгο инτеρ- φеροна сС-Ι1 , наχοдиτ πρименение для ποлучения шτаммοв- лροдуценτοв челοвечесκοгο лейκοциτаρнοгο инτеρφеροна сС-Ц с высοκοй аκτивнοсτью.
Заявляемый шτамм Ρзеиάοтοηаз зρ.31 (ρνΝ22)- сС -Ц лροдуцеяτ челοвечесκοгο лейκοциτаρнοгο инτеρφеροна наχοдиτ πρимеяение в миκροбиοлοгйчесκοё и медивдясκοй лροмышленнοсτи для ποлучения инτеρφеροна сС -Ι1 , κοτορыδ мοжеτ πρименяτься в медицинсκοй πρаκτиκе κаκ в сοчеτании с дρугими извесτными лейκοциτаρными инτеρφеροяами, τаκ и самοсτοяτелшο.

Claims

- 16 -
ΦΟБШΙΑ ИЗΟБΡΕΤΕБЙЯ
I. Ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚρνΝ22 , κοдиρующая биοсинτез челοвечесκοгο лейκοциτаρнοгο инτеρφеροна сС - П, 5 χаρаκτеρизующаяся τем, чτο οна имееτ ρазмеρ 10,85 τ.π.ο. и сοсτοиτ из следующиχ элеменτοв: -ΕсοΗΙ - н_лάΙΙΙ - φρагменτ πлазмиды ρΑУС37 ρазмеροм 9,45 τ.π.ο.,
- нϊηάϊИ-ΕοοΕϊ - φρагменτ ρазмеροм 1,4 τ'.π.ο., Ю сοсτοящий из следующиχ элеменτοв:
- φρагменτ ДΗΚ ρазмеροм 0,25 τ.л.ο» с ρегуляτορнοй οбласτью гена ϋ φага _φ χΙ74 и леρвыми κοдοнами гена инτеρφеροна сС ,
- ген инτеρφеροна сС-ΤΙ ρазмеροм 0,5 τ.π.ο.,
15 - учасτοκ генοмнοй ДΗΚ челοвеκа ρазмеροм 0,65 τ.л.ο.;.- уποмянуτая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ οбладаеτ сле.- дущими генеτичесκими маρκеρами: генοмΔρ οбесπечи-- вающим усτοйчивοсτь κ амπивдллину; генοм 5π 9 οб.есπе-- чиваιοщим усτοйчивοсτь κ сτρелτοмицину; сοдеρжиτ следу-
20 ющяе униκальные учасτκи узнавания ρесτρиκτаз: н±ηάϊϊϊ-0; ΕсοйΙ - 1,4 τ.л.ο.;Βат ΗΕ - 10,82 τ.л.ο. делοниροвана Β κοллеκции κульτуρ миκροορганизмοв Бсесοюзнοгο научнο-. исследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτибиοτиκοв и заρегисτρи- ροвана за нοмеροм Ι788Α .
25 2. Шτамм Ρзеиάοтοηаз зρ. 31 (рνΝ22) - лροдуценτ челοвечесκοгο лейκοвдτаρнοгο инτеρφеροна сС - ΪΙ, сοдеρ- жащий ρеκοмбинанτную ллазмидную ДΗΚ ρνΝ22 лο π. I, лοлученный меτοдοм геянοё инженеρии луτем введения ρе- κοмбинанτнοй πлазмиднοи ДΗΚ ρνΝ22 в баκτеρии ροда
30 Ρзеиάοтοηаз , деποшροванный 02.04.86 в κοллеκции κульτуρ миκροόρганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτель- сκοгο инсτиτуτа анτибиοτиκοв и заρегисτρиροванный за нοмеροм Ι788Α.
PCT/SU1987/000052 1986-04-30 1987-04-29 RECOMBINANT PLASMID DNA pVN22, CODING FOR BIOSYNTHESIS OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 AND STRAIN PSEUDOMONAS sp. 31 (pVN22) - PRODUCER OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 CONTAINING IT WO1987006613A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8729559A GB2199830B (en) 1986-04-30 1987-04-29 Recombinant plasmid dna pvn22, coding for biosynthesis of human leukocyte interferon -i1 and strain pseudomonas sp. 31 (pvn22)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU4065414/31 1986-04-30
SU864065414A SU1703690A1 (ru) 1986-04-30 1986-04-30 Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1987006613A1 true WO1987006613A1 (en) 1987-11-05

Family

ID=21236928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/SU1987/000052 WO1987006613A1 (en) 1986-04-30 1987-04-29 RECOMBINANT PLASMID DNA pVN22, CODING FOR BIOSYNTHESIS OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 AND STRAIN PSEUDOMONAS sp. 31 (pVN22) - PRODUCER OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 CONTAINING IT

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4988622A (ru)
JP (1) JPH01500960A (ru)
CH (1) CH673469A5 (ru)
DE (1) DE3790221T1 (ru)
GB (1) GB2199830B (ru)
SU (1) SU1703690A1 (ru)
WO (1) WO1987006613A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7399464B2 (en) 2001-06-11 2008-07-15 Genodyssee Sa Polypeptides of the IFNα-7 gene

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6089741A (en) * 1996-08-19 2000-07-18 Cogent Light Technologies, Inc. Apparatus and method for coupling high intensity light into low temperature optical fiber

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0072541A2 (en) * 1981-08-14 1983-02-23 F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft Human leukocyte interferons, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4748233A (en) * 1982-03-23 1988-05-31 Bristol-Myers Company Alpha-interferon Gx-1
SU1364343A1 (ru) * 1984-07-13 1988-01-07 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0072541A2 (en) * 1981-08-14 1983-02-23 F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft Human leukocyte interferons, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NATURE, Vol. 287, Nr. 5781, 02 October 1980, (MacMillan Journals Ltd), DAVID V. GOEDDEL et al., "Human Leukocyte Interferon Produced by E. Coli is Biologically Active", pp. 411-415. *
ZHURNAL VSESOJUZNOGO KHIMICHESKOGO OBSCHESTVA, Vol. XXIX, Nr. 2, 1984, (Khimia, Moscow), E.D. SVERDLOV, "Interferony i Geneticheskaya Inzheneria", pages 85-89. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7399464B2 (en) 2001-06-11 2008-07-15 Genodyssee Sa Polypeptides of the IFNα-7 gene

Also Published As

Publication number Publication date
GB8729559D0 (en) 1988-02-03
GB2199830B (en) 1990-07-04
SU1703690A1 (ru) 1992-01-07
CH673469A5 (ru) 1990-03-15
GB2199830A (en) 1988-07-20
US4988622A (en) 1991-01-29
DE3790221T1 (ru) 1988-06-23
JPH01500960A (ja) 1989-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110785489A (zh) 使用CRISPR/Cpf1在T细胞中进行基因编辑的组合物和方法
CN107074967A (zh) 白介素‑2/白介素‑2受体α融合蛋白和使用方法
JPH05509093A (ja) インターロイキン―７を用いた選定免疫療法
WO2001042443A1 (fr) Procede de modification des proprietes genetiques d&#39;un organisme
CN109641064A (zh) 非整合病毒递送系统及其相关方法
JPS631296B2 (ru)
CN101484461B (zh) Cd83在联合治疗中的用途
Sam et al. Early IL-12 p70, but not p40, production by splenic macrophages correlates with host resistance to blood-stage Plasmodium chabaudi AS malaria
Graves Studies on the use of a membrane feeding technique for infecting Anopheles gambiae with Plasmodium falciparum
CN108431228A (zh) Tlr抑制性寡核苷酸及其用途
Fu et al. Effect of mild intermittent cold stimulation on thymus immune function in broilers
WO1987006613A1 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pVN22, CODING FOR BIOSYNTHESIS OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 AND STRAIN PSEUDOMONAS sp. 31 (pVN22) - PRODUCER OF HUMAN LEUCOCYTE INTERFERON alpha-I1 CONTAINING IT
AU3420689A (en) Method and means for immuno-stimulating blood treatment with a mitogen
JP2016011272A (ja) 免疫応答制御剤
Smith et al. Exogenous interleukin-12 (IL-12) exacerbates Cryptosporidium parvum infection in gamma interferon knockout mice
WO2021160124A1 (zh) 嵌合抗原受体的优化
CN107557366A (zh) 一种斜带石斑鱼天然免疫受体tlr13基因及其真核表达载体与应用
Hammar et al. Induction of tubuloreticular structures in cultured human endothelial cells by recombinant interferon alfa and beta
CN109609553B (zh) 提高nk细胞靶向作用力的方法及ccr5基因的应用
CN111000839A (zh) 二甲基精氨酸及其衍生物用于抑制t、b细胞增殖
JP2003325188A (ja) サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法
JPS5823793A (ja) ヒトｔ細胞増殖因子の製造方法
JP2003063991A (ja) 経口用サイトカイン誘導剤
CN114181907B (zh) 一种基于CRISPR/CasRx RNA编辑系统靶向炎症因子的细胞微囊泡
CN109136190A (zh) 一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的btla-/-t淋巴细胞的制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CH DE GB JP US

RET De translation (de og part 6b)

Ref document number: 3790221

Country of ref document: DE

Date of ref document: 19880623

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3790221

Country of ref document: DE