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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Biotechnologie und insbesondere ein neuartiges Plasmid, das das
Gen für
humanes CRP (C-reaktives Protein) trägt, neuartige Mikroorganismen
(z. B. solche, die zu Escherichia coli gehören), die mit dem Plasmid transformiert
sind, sowie ein neuartiges Verfahren zur Herstellung von humanem
CRP durch Züchtung
der vorstehenden Transformante.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur gewerblichen
Herstellung von humanem CRP bereitgestellt. Da die Reinheit des
erhaltenen humanen CRP äußerst hoch
ist, kann es in wirksamer Weise auf dem Gebiet der Diagnose und
klinischen Untersuchung sowie in Form von Arzneimitteln verwendet
werden.
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Stand der Technik
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Humanes CRP wird in der Leber nach
Stimulation durch bisher unidentifizierte stimulierende Substanzen,
die sich aus bakteriellen Infektionen, histologischen ischämischen
Störungen,
malignen Tumoren und dergl. ergeben, gebildet. Nach Erreichen der
Entzündungsstelle
bindet es an Phospholipide der Membranen von Zellen, die einer Nekrose
unterlegen sind, wobei es biologische Veränderungen herbeiführt, wie
eine Komplementaktivierung, die Unterdrückung der Blutplättchenaggregation,
die Beschleunigung verschiedener lymphatischer Funktionen und die
Beschleunigung der Funktionen von Makrophagen, durch die die im
Körper
durch die Entzündung
erzeugten pathologischen Produkte entfernt werden.
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Auf dem Gebiet der klinischen Untersuchungen
werden Tests auf CRP-Konzentrationen im Blut durch Verfahren durchgeführt, bei
denen anti-CRP-Antiserum zum Testserum, das vermutlich CRP enthält, gegeben wird,
z. B. das Einzelimmunodiffusionsverfahren und das Kapillarverfahren.
Jedoch wird das derzeit verwendete, abdominale, von Ascites abgeleitete
Antigen durch Reinigung hergestellt, um Serumkomponenten, einschließlich SAP
(Serum-Amyloid P-Komponente),
deren Aminosäuresequenz
eine hochgradige Homologie zu CRP aufweist, soweit zu entfernen,
dass sie das Antigen nicht mehr stören. Daher sind zahlreiche
Reinigungsstufen erforderlich, was zu einer Erhöhung der Produktionskosten
führt.
Außerdem
ist es bei Durchführung
von Messungen von CRP im Blut unter Verwendung von Antiserum oder
IgG, das durch Tierimmunisierung unter Verwendung des Antigens CRP,
das nur eine unzureichende Reinheit aufweist und mit Serumkomponenten vermischt
ist, erhalten worden ist, schwierig, genaue Tests durchzuführen, da
die Hintergrundantikörper
gegen die Serumkomponenten, wie SAP, durch die Reinigung nicht vollständig entfernt
worden sind.
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Infolgedessen besteht für das Antigen
CRP zur Verwendung auf dem Gebiet von klinischen Untersuchungen
ein starkes Bedürfnis, über hochreines
und wirtschaftlich herstellbares CRP zu verfügen, das keine Serumkomponenten,
wie SAP, enthält.
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Auf der anderen Seite bilden Bakterien
der Gattung Escherichia absolut kein CRP.
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Ferner sind Plasmide bekannt, die
sich für
rekombinante DNA und damit transformierte Mikroorganismen eignen.
Beispielsweise wird in Science, Bd. 198 (1978), S. 1056, die Herstellung
von tierischem Protein in Escherichia coli beschrieben, in das ein
Plasmid mit einem Gehalt an dem Lactose-Promotor unter Verknüpfung an
das Plasmid pBR322 eingeführt
worden ist.
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K. H. ROUX et al., J. Immunol., Bd.
131 (Nr. 5) (1983), S. 2411–2415,
belegen die pentamere Struktur von CRP, einem Produkt mit einem
sehr hohen Molekulargewicht.
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A. Agraval et al., J. Biol. Chem.,
Bd. 267 (1992), S. 25352–25358,
lehren die Expression von CRP aus humanen Zellen.
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EP-A-0 511 393 betrifft die Expression
von Hirudin und hirudinartigen Verbindungen (die ein sehr niedriges
Molekulargewicht aufweisen) in E. coli und weist insbesondere auf
S. 4, Zeilen 56–57
und S. 5, Zeilen ..., darauf hin, dass diese Lehre die Expression
von beliebigen Fremdproteinen umfasst. J EP-A-0 511 393 beschreibt
zwar ein rekombinantes Plasmid mit einem Gehalt an einem Tryptophan-Promotor,
einer DNA-Sequenz, die für
das alkalische Phosphatase-Signalpeptid von E. coli kodiert, und
eine DNA-Sequenz, die für
die Aminosäuresequenz
von Hirudin kodiert, beschreibt aber nicht, wie pentameres CRP zu
exprimieren ist.
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EP-A-0 216 080 beschreibt ein rekombinantes
Plasmid mit einem Gehalt an einem von pMB9-Plasmid abgeleiteten
kil-Gen, wobei die DNA-Region bei Insertion in E. coli zur Induktion
der extrazellulären
Expression von biologisch aktiven Substanzen befähigt ist. Jedoch betrifft die
Druckschrift nicht die Expression von CRP.
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M. L. Tenchini et al., Inflammation,
Bd. 16 (Nr. 2) (1992), S. 93–99,
beschreibt eine Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz
von humanem CRP, isoliert aus einer humanen Leber-cDNA-Bank.
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Die vorstehenden Druckschriften beschreiben
weder das erfindungsgemäße Verfahren
noch legen sie es nahe.
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Bisher finden sich keine Ausführungen über Plasmide,
die das humane CRP-Gen tragen oder über damit transformierte Mikroorganismen.
Es gibt auch keine Veröffentlichungen,
die über
einen Erfolg bei der Schaffung dieser Produkte berichten.
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Erfindungsgemäß zu lösende Aufgabe
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Auf dem Gebiet der klinischen Untersuchungen
beim Test des CRP-Spiegels im Blut führen selbst Spurenmengen von
Serumkomponenten (insbesondere SAP) im CRP-Antigen, das für die Herstellung
von Antikörpern
verwendet wird, dazu, dass das erhaltene Antiserum Antikörper gegen
die restlichen Serumkomponenten enthält, die im Messwert zur Bildung
eines Hintergrunds führen.
Infolgedessen ist es bei Herstellung von CRP-Antigen ausgehend von
vom Menschen abgeleiteten Ausgangsmaterialien schwierig, anti-CRP-Antikörper herzustellen,
die einen genauen Test der CRP-Konzentration im Blut ermöglichen.
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Gegenstand der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein rekombinantes
Plasmid für
die extrazelluläre
Sekretion von biologisch aktivem, humanem CRP (C-reaktives Protein)
aus Escherichia coli-Zellen, die mit dem rekombinanten Plasmid transformiert
sind, wobei das rekombinante Plasmid ein Gen umfasst, das für humanes
CRP mit einem Molekulargewicht von etwa 400 Kilodalton kodiert,
und wobei das humane CRP-Gen funktionell im geeigneten Leseraster
mit einem induzierbaren bakteriellen Promotor und einem Signalpeptid
verknüpft
ist, die für
die Transkription und Sekretion von humanem CRP in Escherichia coli-Wirtszellen,
die mit dem rekombinanten Plasmid transformiert sind, sorgen.
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Ferner betrifft die Erfindung Escherichia
coli, das mit dem rekombinanten Plasmid transformiert ist, sowie
ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem, humanem CRP
aus derartig transformiertem Escherichia coli.
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Kurze Beschreibung der Zeichnung
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1 zeigt
eine Restriktionsenzymkarte des humanen CRP-Expressionsvektors pTRPCRPS-kil.
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2 zeigt
ein Agarosegel-Elektrophoresemuster eines amplifizierten humanen
CRP-Gens.
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3 zeigt
die chemische Synthese des alkalischen Phosphatase-Signalpeptidgens
von Escherichia coli.
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4 zeigt
die Konstruktion des erfindungsgemäßen humanen CRP-Expressionsvektors.
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5 zeigt
einen Vergleich der Reinheit von gereinigtem humanem rekombinantem
CRP und natürlich
vorkommendem humanem CRP.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Erfindungsgemäß ist es als Ergebnis eingehender
Untersuchungen über
die Herstellung von hochreinem CRP-Antigen, das frei von Serumkomponenten
ist, durch gentechnische Herstellung von humanem CRP gelungen, rekombinantes
CRP herzustellen, das in Bezug auf die Proteinchemie und die immunologische
Beschaffenheit mit natürlich
vorkommendem CRP identisch ist, wobei die Herstellung durch extrazelluläre Sekretionsexpression
von CRP durch E. coli erfolgt.
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Mit anderen Worten, erfindungsgemäß wurde
festgestellt, dass das Gen für
humanes CRP aus humaner, von Plazenta abgeleiteter, chromosomaler
DNA unter Anwendung des PCR- Verfahrens
(Polymerase-Kettenreaktion) amplifiziert und in einem Plasmid, das
zu dessen Expression befähigt
ist, kloniert werden kann. Ferner wurde festgestellt, dass mit diesem
Plasmid transformiertes Escherichia coli große Mengen an humanem CRP bildet,
dass dieses rekombinante CRP eine mit der natürlich auftretenden Form absolut
identische Aminosäuresequenz
aufweist und mit Phosphorylcholin in Gegenwart von Calciumionen
auf die gleiche Weise wie die natürlich auftretende Form bindet,
und dass durch Anwendung des Affinitätsreinigungsverfahrens unter Verwendung
einer Phosphorylcholin-immobilisierten Säule das CRP in einer einzigen
Stufe in einem für
ein Antigen geeigneten Ausmaß gereinigt
werden kann.
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Ferner wurden Untersuchungen durchgeführt, um
zu bestätigen,
dass ein anti-CRP-Antikörper,
der keine Kreuzreaktion mit Serumkomponenten, ausgenommen CRP, eingeht,
durch Immunisierung unter Verwendung des vorstehend erhaltenen rekombinanten
CRP als Antigen erhalten werden kann. Diese Befunde führten zur
vorliegenden Erfindung.
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Mit anderen Worten, das Wesen der
vorliegenden Erfindung besteht in der Amplifikation des humanen chromosomalen
CRP-Gens durch das
PCR-Verfahren, in einer Rekombinanten, die ein mit CRP-Gen verknüpftes Vektorplasmid
enthält,
und in Escherichia coli, das unter Verwendung des mit dem CRP-Gen
verknüpften
Vektorplasmids transformiert ist.
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Das erfindungsgemäße Plasmid kann beispielsweise
gemäß dem in
Biochim. Biophys. Acta., Bd. 72 (1963), S. 619–629 beschriebenen Verfahren
erhalten werden. Das Plasmid lässt
sich unter Verwendung von humanem CRP-Gen, das unter Verwendung
eines Restriktionsenzyms verdaut ist, eines Promotors und eines Vektors
gemäß J. Mol.
Biol., Bd. 96 (1974), S. 171–184,
und unter Ligation dieser Bestandteile unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase
herstellen.
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Als vorerwähnte DNA, die als Vektor verwendet
werden kann, kann beispielsweise DNA von pBR322, das von Escherichia
coli abgeleitet ist, und dergl. verwendet werden. Beim Promotor
kann es sich beispielsweise um den Taq-Promotor, den Tryptophan-Promotor,
den λ-pL-Promotor,
den λ-pR-Promotor, den
Lactose-Promotor, den T7-Promotor oder dergl. handeln. Beim Sekretionssignalpeptid
kann es sich um ein Signalpeptid beispielsweise für von Escherichia
coli abgeleitete alkalische Phosphatase, Außenmembran-Protein A, Außenmembran-Protein F, β-Lactamase
oder dergl. handeln. Ferner kann es sich beim Restriktionsenzym
beispielsweise um EcoRI oder PstI und bei der Ligase beispielsweise
um T4-DNA-Ligare handeln.
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Das erfindungsgemäß zu verwendende humane CRP-Gen
kann durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von humaner, von Plazenta
abgeleiteter chromosomaler DNA als Matrize amplifiziert werden.
Der für die
Amplifikation zu verwendende Primer weist eine Basensequenz auf,
die auf der Grundlage der Basensequenz des humanen CRP-Gens konstruiert
ist. Diese Basensequenz wird in den Plasmidvektor pTZ18U eingeführt, um
das Plasmid pTZ-CRP, das das humane CRP-Gen trägt, herzustellen. Ein Gen für das Signalpeptid von
alkalischer Phosphatase aus E. coli wird durch chemische Synthese
hergestellt und stromaufwärts
vom vorerwähnten
Gen ligiert, um pTZ-CRPS herzustellen. Dieses Plasmid wird zur Transformation
von Escherichia coli verwendet, das anschließend mit der Helferphage M13KO7
infiziert wird. Einzelsträngige
DNA wird aus dem Kulturmedium davon hergestellt. Die Basensequenz
dieser DNA wird durch das in "PROTEIN
NUCLEIC ACID AND ENZYME",
Bd. 29 (1986), S. 294–306,
beschriebene Verfahren hergestellt. Das CRP-Gen, dessen Basensequenz
bestätigt
worden ist, wird aus pTZ18U ausgeschnitten und in den extrazellulären Sekretionsexpressionsvektor
pTRP-kil ligiert, der das Plasmid pBR322 mit dem Tryptophan-Promotor,
das vom Plasmid pMB9 abgeleitete kil-Gen und die Shine-Dalgarno-Sequenz
(SD-Sequenz) in
eingeführter
Form enthält.
Auf diese Weise erhält
man das Plasmid pTRPCRPS-kil.
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Die physikochemischen Eigenschaften
des Plasmids pTRPCRPS-kil werden nachstehend dargelegt.
- (1) Das Signalpeptidgen der alkalischen Phosphatase von E. coli
kann stromaufwärts
vom humanen CRP-Gen für
die extrazelluläre
(in das Medium) Sekretionsexpression von humanem CRP unter Einwirkung des
kil-Gens angebracht werden.
- (2) Wie in 1 dargelegt,
ergibt sich eine Spaltbarkeit durch die folgenden Restriktionsenzyme:
| Restriktionsenzym | Spaltungsstellen |
| EcoRI | 1 |
| PstI | 1 |
| HindIII | 1 |
- (3) Das Molekulargewicht beträgt etwa 2,5 Megadalton.
- (4) Für
das humane CRP-Gen mit einem Molekulargewicht von etwa 400 Kilodalton
wird eine Insertion stromabwärts
vom Promotor in der gleichen Richtung festgestellt.
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Beim erfindungsgemäßen Escherichia
coli handelt es sich um Escherichia coli, das mit einem rekombinanten
Plasmid durch Verknüpfung
des vorerwähnten
humanen CRP-Gens mit einem Molekulargewicht von etwa 400 Kilodalton
und einem Promotor stromaufwärts
davon mit einem Vektorplasmid transformiert worden ist. Die Transformation
von Escherichia coli unter Verwendung dieses Plasmids pTRPCRPS-kil
kann beispielsweise gemäß dem in
J. Mol. Biol., Bd. 53 (1970), S. 159–162, beschriebenen Verfahren
durchgeführt
werden, indem man Escherichia coli NM522 mit dem vorerwähnten Plasmid
pTRPCRPSkil, das mit Calciumchlorid bei einer Temperatur von etwa
0°C behandelt
worden ist, in Kontakt bringt.
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Als ein Beispiel für Escherichia
coli, das auf diese Weise transformiert worden ist, lässt sich
Escherichia coli NM522 pTRPCRPS-kil erwähnen, in das das Plasmid pTRPCRPS-kil
eingeführt
worden ist. Bei diesem Stamm handelt es sich um einen neuartigen
Stamm, der aus dem Stand der Technik nicht bekannt ist. Er wurde
beim National Institute of Bioscience and Human Technology unter
der Hinterlegungsnummer FERM BP-4244
(nunmehr als International Patent Organisation Depository National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology bezeichnet)
hinterlegt.
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Dieser Stamm besitzt die gleichen
bakteriologischen Eigenschaften wie der bekannte Stamm Escherichia
coli NM522 (vergl. J. Mol. Biol., Bd. 166 (1983), S. 1–19), ausgenommen
die Fähigkeit
zur Herstellung von humanem CRP und die Resistenz gegenüber Ampicillin.
Dieser Stamm bleibt sicher, da er keine Veränderung von Nichttransmissibilität zu Transmissibilität oder von
Nichtpathogenizität
zu Pathogenizität
hervorruft.
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Bei der Kohlenstoffquelle im Nährmedium,
das für
die Züchtung
des erfindungsgemäßen Escherichia coli
verwendet wird, kann es sich beispielsweise um ein Saccharid, wie
Glucose, Saccharose, Fructose, Stärkehydrolysat, Melassen oder
von einer verbrauchten Sulfitlauge abgeleitetes Saccharid; eine
organische Säure,
wie Essigsäure
oder Milchsäure;
oder einen Alkohol, eine Fettsäure
oder Glycerin und dergl. handeln, die von den einzusetzenden Bakterien
verwertet werden. Bei der einzusetzenden Stickstoffquelle kann es
sich beispielsweise um eine anorganische oder organische Substanz
handeln, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Aminosäuren,
Pepton, Rindfleischextrakt, Hefeextrakt oder dergl. Ferner kann
ein üblicherweise
für Bakterien
verwendetes Kulturmedium eingesetzt werden, das anorganische Salze,
z. B. von Kalium, Natrium, Phosphorsäure, Zink, Eisen, Magnesium,
Mangan, Kupfer, Calcium, Kobalt und dergl., und gegebenenfalls auch
Spurenmengen eines Metallsalzes, Maisquellflüssigkeit, Vitamine, Nucleinsäuren und dergl.,
enthält.
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Das erfindungsgemäße Escherichia coli kann aerob
unter Verwendung derartiger Kulturmedien bei einer Temperatur von
20–45°C, vorzugsweise
von 35–40°C und optimal
bei 37°C
bei einem pH-Wert von 7,0–7,4 und
optimal von 7,2 gezüchtet
werden.
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Das erfindungsgemäße humane CRP wird sodann aus
dem erhaltenen Züchtungsprodukt
gewonnen. Die Gewinnung kann in einem beliebigen Produktstadium
während
des Verfahrens erfolgen, einschließlich das Kulturprodukt, abgetrennte
lebensfähige
Zellen, abgetrennte und behandelte Zellen, rohes Proteinextrakt
oder rohes Protein. Beim Reinigungsverfahren kann es sich um ein
beliebiges herkömmliches
Verfahren der Proteinreinigung handeln.
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Das erfindungsgemäß erhaltene humane CRP besitzt
die folgenden physikochemischen Eigenschaften.
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(1) Bindungsspezifität
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Es bindet an das C-Polysaccharid
von Pneumococcus, Phosphorylcholin, Fibronectin und dergl. in Gegenwart
von Calciumionen.
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(2) Molekulargewicht
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Ein Pentameres mit einem Molekulargewicht
von etwa 115 000, bestehend aus 5 identischen Untereinheiten mit
einem Molekulargewicht von etwa 23 000.
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Eine ausführlichere Erläuterung
der Erfindung findet sich nachstehend unter Bezugnahme auf die Beispiele.
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Beispiel 1
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(a) PCR-Amplifikation
von humanem CRP-Gen
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Unter Verwendung von chromosomaler
DNA, die von humaner Plazenta abgeleitet ist (Produkt der Fa. CLONTECH
Co.), wurde das humane CRP-Gen mit den folgenden beiden Primern
amplifiziert.
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Das Reaktionsgemisch für die Amplifikation
wurde durch Vermischen von jeweils 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert
8,3, 25 °C),
1,5 mM MgCl2, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine
und jeweils 200 μM
dNTPs, jeweils 1 μm
der Primer, 1 μg
humaner chromosomaler DNA und Taq-Polymerase (Produkt der Fa. PERKIN
ELMER CETUS Co.) in einem Gesamtvolumen von 100 μl hergestellt. Die Probe wurde
ferner mit 100 μlMineralöl bedeckt,
um eine Verdampfung zu verhindern.
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Die Reaktionsbedingungen bestanden
in einer 1-minütigen
Denaturierung bei 94°C,
einer 1-minütigen Anlagerung
bei 50°C
und einer 3-minütigen
Polymerisationsreaktion bei 72°C.
Die Inkubation wurde über
30 Zyklen durchgeführt.
Die verunreinigenden Proteine wurden aus der Reaktionslösung durch
Phenolextraktion entfernt. Ferner wurde die Amplifikation des humanen
CRP-Gens mit etwa 0,64 kb durch Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. 2 zeigt die Ergebnisse der
Färbung
mit Ethidiumbromid (M: Molekulargewichtsmarker; 1: rekombinantes
CRP).
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(b) Herstellung des Plasmids
pTZ-CRP
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Jeweils 1 μg der handelsüblichen
Plasmidvektoren pTZ18U und pTZ19U (Produkte der Fa. USB (United
States Biochemicals) Co.) und jeweils 2 Einheiten der Restriktionsenzyme
EcoRI (Produkt der Fa. Takara Shuzo Co.) und PstI (Produkt der Fa.
Takara Shuzo Co.) wurden zu 100 μl
einer Tris-Pufferlösung
mit einem Gehalt an 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl
und 1 mM Dithiothreit gegeben und auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.
Die Umsetzung wurde 16 Stunden bei 37 °C durchgeführt.
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Sodann wurde das Reaktionsgemisch
zur Desaktivierung der Restriktionsenzyme 5 Minuten auf 65 °C erwärmt und
anschließend
mit Ethanol gefällt.
Die verdaute DNA wurde gewonnen.
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Anschließend wurde das humane CRP-Gen,
das nach dem Verfahren von (a) erhalten worden war, 16 Stunden bei
37°C in
der gleichen Pufferlösung
mit einem Gehalt an den Restriktionsenzymen umgesetzt und auf die
vorstehend beschriebene Weise gewonnen. Das erhaltene verdaute CRP-Gen
wurde mit der verdauten Plasmid-DNA vermischt und anschließend 16
Stunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Produkt der Fa. Takara
Shuzo Co.) in 70 mM Tris-Pufferlösung
mit einem Gehalt an 7 mM MgCl2, 20 mM Dithiothreit und 1 mM ATP
(eingestellt auf einen pH-Wert von 7,5) zur Religation der verdauten
DNA 16 Stunden bei 14°C
umgesetzt. Man erhielt das Plasmid pTZ-CRP, das das humane CRP-Gen
trug. Dieses Plasmid pTZ-CRP wurde in E. coli DH5αF'IQ (Produkt der Fa.
BRL Co.) transformiert. Die erhaltene Transformante wurde mit der
Helferphage M13KO7 infiziert und gezüchtet. Aus dem erhaltenen Kulturüberstand
wurde die einzelsträngige
Phage durch Fällung
mit Polyethylenglykol gewonnen. Anschließend wurde die einzelsträngige DNA
aus der Phage durch Phenolextraktion extrahiert und gereinigt. Die
DNA wurde unter Verwendung des DNA-Sequenziergeräts Modell 370A der Fa. ABI
Co. sequenziert. Die erhaltene DNA-Sequenz wurde in die Aminosäuresequenz übersetzt.
Sie stimmte vollständig
mit der bekannten Aminosäuresequenz
von humanem CRP überein.
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(c) Einführung des
Signalpeptidgens von alkalischer Phosphatase von E. coli
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Vier Oligonucleotide (PA + 1, PA – 1, PA
+ 2 und PA – 2),
die für
das Signalpeptid von alkalischer Phosphatase von E. coli kodieren,
und die ersten sieben Aminosäuren
des humanen CRP-Gens
wurden chemisch synthetisiert (3),
wozu ein DNA-Synthesegerät (Modell
8750, Produkt der Fa. Milligene Biosearch Co.) verwendet wurde.
Die Ligation in EcoRI- und HindIII-Stellen des humanen CRP-Gens
an pTZ-CRP (4) wurde
unter den gleichen Bedingungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden,
zur Herstellung von pTZ-CRP durchgeführt.
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(d) Herstellung des Plasmids
pTRPCRPS-kil
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Als Sekretionsexpressionsvektor wurde
pTRP-kil hergestellt, das aus dem Tryptophan-Promotor, Restriktionsstellen
für EcoRI
und PstI an der Klonierungsstelle und dem kil-Gen stromabwärts davon
bestand.
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Bei Induktion des Promotors wurden
das an der Klonierungsstelle inserierte Gen und das stromabwärts davon
inserierte kil-Gen durch den gleichen Tryptophan-Promotor in einen
einzelsträngigen mRNA-Strang
transkribiert und anschließend
zu den entsprechenden Proteinen translatiert. Das CRP-Gen, einschließlich des
vorerwähnten
Signalpeptids, wurde an der Polylinkerstelle des Expressionsvektors
inseriert.
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1 μg
des Expressionsvektors pTRP-kil und 2 Einheiten jeweils der Restriktionsenzyme
EcoRI (Produkt der Fa. Takara Shuzo Co.) und PstI (Produkt der Fa.
Takara Shuzo Co.) wurden zu 100 μl
einer Tris-Pufferlösung
mit einem Gehalt an 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl
und 1 mM Dithiothreit, eingestellt auf den pH-Wert 7,5, gegeben.
Die Umsetzung wurde 16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde
das Reaktionsgemisch zur Desaktivierung der Restriktionsenzyme 5
Minuten auf 65°C
erwärmt
und sodann mit Ethanol gefällt. Die
verdaute DNA wurde gewonnen. Anschließend wurde das Plasmid pTZ-CRPS,
das gemäß dem Verfahren (c)
erhalten worden war, 16 Stunden bei 37°C in der gleichen Pufferlösung, wie
sie vorstehend verwendet wurde, unter Einsatz der Restriktionsenzyme
EcoRI und PstI umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde der Agarose- Gelelektrophorese
unterworfen. Die Bande, die der Größe des CRP-Gens entsprach,
wurde aus dem Gel geschnitten und unter Verwendung eines Gene Clean
Kits (BIO 101, Inc.) gereinigt. Das auf diese Weise erhaltene verdaute
CRP-Gen wurde mit der Plasmid-DNA (die verdaute DNA) vermischt und
sodann 16 Stunden bei 14°C
unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Produkt der Fa. Takara Shuzo
Co.) in 70 mM Tris-Pufferlösung
mit einem Gehalt an 7 mM MgCl2, 20 mM Dithiothreit
und 1 mM ATP, nach Einstellung auf den pH-Wert 7,5, zur Religation
der verdauten DNA umgesetzt. Man erhielt das Plasmid pTRPCRPSkil,
das das humane CRP-Gen trug (4).
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Beispiel 2
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Die Transformation von E. coli NM522
wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pTRPCRPS-kil
durchgeführt.
Die Transformation wurde gemäß dem TSS-Verfahren (TSS =
transformation storage solution), das in Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Bd. 86 (1989), S. 2172–2175
beschrieben ist, durchgeführt.
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Zunächst wurden die Wirtsbakterien
vom Stamm E. coli NM522 in 20 ml LB-Medium gezüchtet. Sodann wurden die Zellen
durch Zentrifugalabscheidung gewonnen und anschließend in
2 ml TSS (LB-Medium vom pH-Wert 6,5 mit einem Gehalt an 10 Polyethylenglykol,
5% Dimethylsulfoxid und 50 mM Mg2+) suspendiert.
100 μl der
erhaltenen Suspension wurden mit 20 μl eines Gemisches, das jeweils
das bei den Verfahren (b) bis (d) erhaltene Plasmid enthielt, versetzt.
Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 0°C behandelt. Sodann wurden 0,9
ml TSS mit einem Gehalt an 20 mM Glucose zugegeben. Eine Züchtung wurde
1 Stunde bei 37°C
durchgeführt.
Nach weiterer Züchtung
bei 37°C
in einem LB-Agarmedium mit einem Gehalt an Ampicillin (50 μg/ml) erhielt
man die Kolonie Escherichia coli NM522-pTRPCRPS-kil, in die sämtliche
Plasmide eingeführt
worden waren.
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Beispiel 3
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Zellen aus der Kolonie der in Beispiel
2 konstruierten Transformanten Escherichia coli NM522-pTRPCRPS-kil
(FERM BP-4244) wurden
5 Stunden bei 32°C
einer Schüttelkultur
in 500 ml LB-Medium mit einem Gehalt an Ampicillin (50 μg/ml) unterzogen.
Nach Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase wurden sie durch
Zugabe von Indolacrylsäure
(IAA) induziert. 3 Stunden nach der Induktion wurden die Zellen
durch Zentrifugalabscheidung gewonnen. Das gewonnene Medium wurde
durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung einer Toyo Pearl-Säule, an der Phosphorylcholin über BSA
immobilisiert war, gereinigt (JP-A-SHO-62-258390, JP-A-SHO-62-258399).
Bei Analyse des gereinigten rekombinanten humanen CRP durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
wanderte es zu der gleichen Molekulargewichtsposition wie natürlich auftretendes
CRP. Wurde ferner das Acrylamidgel, in dem das rekombinante CRP
der Elektrophorese unterzogen war, elektrisch auf eine PVDF-Membran übertragen
und durch das Western-Blotting-Verfahren unter Verwendung der einzelnen
Antikörper,
die durch Immunisierung einzelner Kaninchen mit natürlichem
CRP erhalten worden waren, gefärbt,
so wurde die gefärbte
Bande an der gleichen Position wie natürlich auftretendes CRP beobachtet.
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Sodann wurde bei Sequenzierung von
10 Resten vom N-Terminus
des rekombinanten CRP unter Verwendung eines Protein-Sequenziergeräts eine
vollständige Übereinstimmung
mit dem natürlich
vorkommenden Typ festgestellt.
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Beispiel 4
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Bei Vergleich von Antiserum, das
durch Immunisieren der einzelnen Kaninchen mit einem Gemisch aus
dem gereinigten rekombinanten CRP (hergestellt in Beispiel 3) und
komplettem Freund-Adjuvans erhalten worden war, mit Antiserum, das
durch Immunisieren der einzelnen Kaninchen mit CRP, das aus humaner
abdominaler Aszitesflüssigkeit
erhalten worden war, wurde festgestellt, dass die Becker-Titerwerte
gleich waren (vergl. die nachstehende Tabelle 1).
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Bei Analyse dieser Antikörper durch
Western-Blotting unter Verwendung von CRP-Standardserum CA-7 (Produkt
der Fa. ATAB Co.) von normalem humanem Serum-CA-1 (Produkt der Fa.
ATAB Co.), CRP(-)-Serum und SAP zeigten beide exakt die gleiche
Reaktivität.
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Wie vorstehend erwähnt, beinhaltete
die herkömmliche
Herstellung von vom Menschen abgeleiteten Proteinen durch rekombinante
Gentechnik üblicherweise
die Sekretion in das Periplasma von E. coli, wobei aber im Fall
von CRP eine einfache Sekretion in das Periplasma nicht zur Expression
des aktiven Typs führte.
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Jedoch waren erfindungsgemäß erstmals
die Herstellung großer
Mengen von humanem CRP durch extrazelluläre Sekretion sowie die erfolgreiche
wirksame Herstellung von hochreinem humanem CRP möglich, indem
man ein Plasmid durch Einführung
des Signalpeptidgens von alkalischer Phosphatase aus E. coli unmittelbar
vor dem humanen CRP-Gen und Anordnung des kil-Gens stromabwärts vom humanen CRP-Gen, unter
der Kontrolle des gleichen Promotors, erzeugte. Ferner weist das
erhaltene rekombinante CRP genau die gleiche Aminosäuresequenz
wie die natürlich
auftretende Form auf. Antiserum, das durch Immunisierung damit hergestellt
worden ist, weist nach Reinigung genau die gleiche Reaktivität auf, wie
Antiserum, das durch Immunisierung mit natürlich auftretendem CRP erhalten
worden ist. Daher erweist es sich bei Verwendung als Reagenz bei
klinischen Untersuchungen als wertvolles Antigen zur Herstellung
von Antikörpern
für genaue Tests
von CRP-Konzentrationen
im Blut oder als Kalibrator.
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Erläuterung zur nachstehenden Sequenzliste:
SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 betreffen die beiden vorerwähnten Primer
(Seite 8).
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SEQ ID NO: 3 betrifft die Aminosäuren 1–13 des
Signalpeptids von alkalischer Phosphatase von E. coli gemäß 3.
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SEQ ID NO: 4 betrifft das PA + 1-Oligonucleotid
von 3.
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SEQ ID NO: 5 betrifft das PA + 1-Oligonucleotid
von 3 (gelesen von rechts
nach links).
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SEQ ID NO: 6 betrifft das Peptid,
das die Aminosäuren
14–21
des Signalpeptids von alkalischer Phosphatase von E. coli und die
ersten 7 Aminosäuren
von humanem CRP umfasst.
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SEQ ID NO: 7 betrifft das PA + 2-Oligonucleotid
von 3.
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SEQ ID NO: 8 betrifft das PA – 2-Oligonucleotid
von 3 (gelesen von rechts
nach links).
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