DE69233300T2

DE69233300T2 - Kollagenartige Proteinpolymere mit hohen Molikularmassen

Info

Publication number: DE69233300T2
Application number: DE69233300T
Authority: DE
Inventors: Joseph Cappello; A. Franco La Jolla FERRARI
Original assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Current assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-04
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2012-11-05
Also published as: DE69233300D1; EP0670848A1; WO1993010154A1; EP0670848A4; AU675056B2; AU3064692A; JPH07501443A; KR100238715B1; ATE258981T1; EP0670848B1; CA2123316A1

Description

Technisches Gebiet
Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von collagenähnlichen Polymeren unter Verwendung von Rekombinationsverfahren.
Hintergrund
Collagen, ein natürlich vorkommendes Protein, findet in der Industrie breite Anwendung. Chemisch hydrolysiertes natürliches Collagen kann durch Erhitzen und Abkühlen denaturiert und renaturiert werden, um Gelatine herzustellen, was unter anderem bei fotografischen und medizinischen Anwendungen zum Einsatz kommt. Die Ketteneigenschaft von Collagen, die für dieses Phänomen verantwortlich ist, umfasst seine Fähigkeit, spontan Kettenaggregate mit einer Konformation, die als Tripelhelix bezeichnet wird, zu bilden. Die Helices werden durch schwache Wechselwirkungen zwischen Ketten stabilisiert, die aus der großen Nähe des Peptidrückgrats an Stellen, an denen jeder dritte Rest von Glycin besetzt ist, und Knicken, die durch Prolin und Hydroxyprolin an den beiden Positionen zwischen Glycin bereitgestellt werden, herrührt. Die Geometrie der drei geknickten Ketten ermöglicht eine Wasserstoffbrückenbindung innerhalb der Tripelhelix. Die Struktur ist locker und leicht für Wechselwirkung mit Wasser, kleinen organischen und anorganischen Molekülen, anderen Proteinen und Zellen zugänglich. Obwohl Collagen aus vielen verschiedenen Aminosäuresequenzen besteht, existiert eines der strukturell stabileren Segmente am Amino- und Carboxy-terminalen Ende der gereiften Collagenketten vom Typ 1. Diese Enden bestehen zum Großteil aus der Tripeptid-Grundsequenz GPP (das zweite P ist häufig hydroxyliert).
Im Gegensatz zu natürlichen Collagenformen können durch Rekombinationsverfahren hergestellte collagenähnliche Polymere ausschließlich aus einer einzigen Tripep tid-Grundsequenz bestehen, die aus unterschiedlichsten GXY-Sequenzen ausgewählt ist, worin X und Y jede beliebige Aminosäure sein können, die von bekannten natürlichen Sequenzen stammen kann oder auch nicht. Collagenähnliche Polymere können auch aus verschiedenen Tripeptidsequenzen bestehen, die in Form von Blöcken im endgültigen Polymer wiederholt werden. Auch verschiedenartige Blöcke können wiederholt verwendet werden, um Blockcopolymere zu bilden und zusätzliche chemische oder biologische Funktionalität bereitzustellen.
Mit dem Aufkommen der Rekombinationstechnik entstand die Möglichkeit, collagenähnliche Polymere herzustellen, in denen die vorteilhaften Eigenschaften von Collagen selektiv beibehalten werden können, während auch neue Fähigkeiten und Merkmale eingeführt werden konnten. Die Einzigartigkeit von Collagen, das repetitive Tripeptid, stellt angesichts der hohen Regelmäßigkeit der Sequenz und der häufigen Nützlichkeit der Aminosäuren Glycin und Prolin in der Zusammensetzung eine Herausforderung für die Rekombinationstechnik dar. Gene, die für Proteine mit hohem Glycin- und Prolingehalt kodieren, bestehen notwendigerweise aus hohem Gehalt an den Nucleotiden Guanidin und Cytidin in selbstkomplementären Sequenzen. Somit besteht bei der Synthese des Gens im Wesentlichen die Möglichkeit, dass Stränge Schleifen bilden, einsträngige DNA herausgeschnitten wird, Rekombinationsvorgänge stattfinden, die zum Verlust von Segmenten des Gens führen können, und ineffiziente Transkription und/oder Translation vorkommen. Somit besteht großes Interesse daran, Verfahren und Zusammensetzungen zu entwickeln, welche die vorteilhaften Eigenschaften von Collagen bereitstellen und gleichzeitig eine stabile Expression von hochmolekularen collagenähnlichen Proteinen ermöglichen.
Einschlägige Literatur
Die WO 88/05082 und Goldberg et al., Gene (Amst.) 80, 305–314 (1989), beschreiben die Herstellung von zu Collagen analogen Proteinen mit relativ geringem Mole kulargewicht. Siehe auch die PCT/US 87/003360 und PCT/US 89/05016 , die strukturelle Proteinpolymere beschreiben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Hochmolekulare collagenähnliche Polymere, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, werden durch die Synthese von Genen bereitgestellt, die an jeder dritten Position Glycin aufweisen und in denen nicht mehr als etwa 60% der Aminosäuren zwischen den Glycinen Prolin sind. Die Gene werden durch die Synthese von Sequenzen mit vielen Tripeptideinheiten, Ligieren der Sequenzen zur Bereitstellung von Multimeren, Klonieren der Multimere und schließlich Verbinden der Multimere zur Bereitstellung von Genen, die hochmolekulare collagenähnliche Proteine, hauptsächlich in einzelligen Organismen, exprimieren, hergestellt.
Beschreibung spezifischer Ausführungsformen
Es werden Verfahren und Zusammensetzung, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, zur Herstellung von hochmolekularen collagenähnlichen Polymeren bereitgestellt, worin Glycin als erste Aminosäure einer Triadengrundeinheit zurückbehalten wird und die anderen beiden Aminosäuren variiert werden, um den Prolingehalt des Polymers zwischen den Glycinen auf weniger als 60%, üblicherweise auf weniger als 40%, noch häufiger auf weniger als 30%, basierend auf den Aminosäuren im collagenähnlichen Protein, zu reduzieren. Die Polymere können auf verschiedene Arten variiert werden, mit einer einzelnen Grundeinheit, mit alternierenden Grundeinheiten oder mit Blöcken aus verschiedenen Grundeinheiten. Üblicherweise weisen die Polymere an ihren 5'- und 3'-Enden Sequenzen auf, die weniger als etwa 20%, noch häufiger weniger als etwa 10%, der Aminosäuren der Polymere beitragen. Gene werden synthetisiert, um für die collagenähnlichen Polymere zu kodieren, in geeignete Expressionsvektoren insertiert, welche dann in Expressionswirte eingebracht werden. Die resultierenden collagenähnlichen Polymere können dann isoliert, gereinigt und auf verschiedene Arten verwendet werden.
Die Polymere gemäß vorliegender Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Molekulargewicht von zumindest etwa 30 kD (Kilodalton), noch häufiger von zumindest etwa 40 kD und vorzugsweise von zumindest etwa 50 kD und üblicherweise von nicht mehr als 150 kD, noch häufiger von nicht mehr als 125 kD, oft von nicht mehr als 100 kD, aufweisen. Die Polymere sind außerdem dadurch gekennzeichnet, dass sie ähnlich wie Collagen Helices bereitstellen, die zu Denaturierung und Renaturierung, Gelbildung usw. fähig sind. Die Polymere weisen vorzugsweise einen Hauptanteil von Tripeptidtriadensequenzen auf, die in natürlichen Collagenen, insbesondere Säugetiercollagen, vorkommen. Die vorliegenden Polymere können, durch Einführung von verschiedenen funktionellen Einheiten, auf verschiedene Arten modifiziert werden, wobei diese funktionellen Einheiten, je nach Art der funktionellen Einheit, Teil des Designs sein können, um ein gleichmäßig alternierendes Glycin an der dritten Position bereitzustellen oder die Gleichmäßigkeit zu stören, oder am Ende eines Blocks aus Grundeinheiten vorhanden sein können. Jede der 20 Aminosäuren kann vorhanden sein, obwohl geladene Aminosäuren (zahlenmäßig) üblicherweise in weniger als 30%, oft weniger als 15%, repetitiven Sequenzen vorhanden sind.
Die vorliegenden collagenähnlichen Polymere können in Bezug auf ihre Grundeinheiten, das Muster der Grundeinheiten, die Insertion von Unterbrechungssequenzen und dergleichen stark variiert werden. Zumindest 75 Gew.-%, üblicherweise zumindest 80 Gew.-%, noch häufiger zumindest 85 Gew.-%, bestehen aus Triaden (Tripeptiden mit Glycin als erste Aminosäure). Üblicherweise zumindest 50%, noch häufiger zumindest 80%, der Triaden kommen in natürlichem Collagen, insbesondere Säugetiercollagen, vor. Die Anzahl an Triaden beträgt üblicherweise zumindest etwa 100, noch häufiger zumindest etwa 150, aber nicht mehr als etwa 500, üblicherweise nicht mehr als etwa 400.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden durch Formeln beschrieben, worin jeder Großbuchstabe für eine Aminosäure steht, worin die Einbuchstabenkennzeichnung für Aminosäuren jeweils eine bestimmte Aminosäure bezeichnet und Buchstaben, die nicht der Einbuchstabenkennzeichnung angehören, jeweils für eine beliebige Aminosäure oder eine bestimmte Gruppe von Aminosäuren steht. Hochstellungen zeigen an, wenn mehrere Triaden vorhanden sind, das Buchstabensymbol für Aminosäuren kann in den einzelnen Triaden jeweils die gleiche oder unterschiedliche Aminosäuren bezeichnen. Tiefstellungen bezeichnen immer die Anzahl an Wiederholungen des Symbols oder der Formel, auf welche sich die Tiefstellung bezieht.
Größtenteils, aber abhängig von den Anforderungen der Ansprüche, sind die Polymere dadurch gekennzeichnet, dass sie als Motiv, das zumindest zweimalig, entweder zusammenhängend oder nicht zusammenhängend, im collagenähnlichen Polymer vorhanden ist, eine Sequenz der folgenden Formel aufweisen: {(GXO)_nZ}_m worin G Glycin ist; X und O Aminosäuren sind, mit der Maßgabe dass X und O so gewählt sind, dass sie einen Prolingehalt der repetitiven Sequenzen des Polymers, üblicherweise des gesamten Polymers, von weniger als etwa 45%, üblicherweise von weniger als etwa 40%, aber möglicherweise auch weniger als 30%, jedoch mehr als etwa 10%, üblicherweise mehr als etwa 15%, bezogen auf die Anzahl aufweisen;
Z 0 bis 50 Aminosäuren, noch häufiger 0 bis 30 Aminosäuren, oft 0 bis 15 Aminosäuren, aufweist und üblicherweise eine Sequenz mit funktioneller Fähigkeit und keine Wiederholung von GXO ist;
n zumindest 4 und nicht mehr als etwa 100, noch häufiger nicht mehr als etwa 75, oft nicht mehr als etwa 50, ist; und
m zumindest 1, eventuell 2, üblicherweise zumindest etwa 3, und nicht mehr als etwa 20, üblicherweise nicht mehr als etwa 12, ist, wobei m insbesondere kleiner wird, wenn n größer wird.
Die repetitive Sequenz von Triaden beträgt zumindest 60 Gew.-%, üblicherweise zumindest 80 Gew.-%, des Polymers.
Die Gesamtanzahl an unterschiedlichen Triaden im Motiv beträgt zumindest 3, üblicherweise nicht mehr als etwa 24, noch häufiger nicht mehr als etwa 16, oft nicht mehr als etwa 12. Die Gesamtanzahl an unterschiedlichen Aminosäuren im Motiv beträgt üblicherweise nicht mehr als etwa 15, noch häufiger nicht mehr als etwa 10. Die Anzahl an Triaden, die Prolin enthalten, beträgt zumindest 40% der Gesamtanzahl, noch häufiger zumindest 60% der Gesamtanzahl, und nicht mehr als etwa 98 der Gesamtanzahl. Obwohl alle Triaden ein Prolin enthalten können, enthalten vorzugsweise weniger als 85%, üblicherweise weniger als 75%, der Gesamtanzahl Prolin.
Eine Art eines collagenähnlichen Polymers weist größtenteils das folgende Motiv als repetitives Motiv auf: {(GX^XO^O)_n1 Z^Z}_m1 worin GXO wie oben definiert sind; x und o die gleiche Zahl sind und im Bereich von 2 bis 10, üblicherweise 3 bis 8, oft 4 bis 6, liegen und insbesondere 2, 3, 5 oder 10 sind, damit in der Sequenz bis zu so vielen und einschließlich so viele verschiedene Triaden enthalten sind; Z wie oben definiert ist; z = 1 bis m¹, üblicherweise nicht mehr als 3, oft 1 bis 2, vorzugsweise 1 ist, worin z unterschiedliche Z-Gruppen bezeichnet, ähnlich wie bei der Definition von x, und m¹ zumindest 1, eventuell 2, üblicherweise zumindest etwa 3, und nicht mehr als 20, üblicherweise nicht mehr als etwa 12, ist, vor allem wenn n¹ größer wird; und n¹ zumindest 2 und nicht mehr als et wa 100, üblicherweise nicht mehr als etwa 75, noch häufiger nicht mehr als etwa 50, im Allgemeinen nicht mehr als etwa 30, ist.
Wenn beispielsweise x = 3, Z 0 Aminosäuren und m¹ = 1 ist, würde man zu folgender Formel kommen: ((GX¹O¹)(GX²O²)(GX³O³))_n1 worin X¹ eine bestimmte Aminosäure ist, X² die gleiche oder eine andere Aminosäure sein könnte, usw., was gleichermaßen für O gilt; und
n¹ im Allgemeinen zumindest etwa 2, noch häufiger etwa 4, und nicht größer als etwa 33, üblicherweise nicht größer als etwa 25, ist.
Andere Verfahren zur Synthese der vorliegenden Verbindungen eignen sich für ein bestimmtes Motiv der Formel: {(α)_a(β)_e(α)_a1}_g worin:
α 1 bis 9 Triaden, üblicherweise 2 bis 6 Triaden, vorzugsweise 2 bis 4 Triaden, aufweist, wobei üblicherweise zumindest 1 Triade ein Prolin aufweist, noch häufiger zumindest 2 Triaden ein Prolin aufweisen;
β 1 bis 24 Triaden, üblicherweise 2 bis 18 Triaden, noch häufiger 3 bis 9 Triaden, aufweist;
e zumindest 3, üblicherweise zumindest 6, und nicht mehr als etwa 50, üblicherweise nicht mehr als etwa 36, ist;
g zumindest 1 und nicht mehr als 20, üblicherweise nicht mehr als etwa 10, noch häufiger nicht mehr als etwa 8, ist;
a und a¹ gleich oder unterschiedlich sein können; a zumindest 1 und nicht mehr als 6, üblicherweise nicht mehr als etwa 3 ist, mit der Ausnahme, dass a oder a¹ auch 0 sein kann.
Es versteht sich, dass, je größer die Anzahl an vorhandenen Triaden, desto geringer die Anzahl an Wiederholungen ist, die zur Bereitstellung des gewünschten Molekulargewichts erforderlich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen diese verlängerten Motive beispielsweise größtenteils die folgende Formel auf: (GU^uB^b)_p((GX^xO^o)_n1(GU^uB^b)_p1Z^Z}_m1 G, X^X, O^O, Z^Z, m¹ und n¹ sind allesamt wie oben definiert;
U und B sind beliebige Aminosäuren, wobei häufig ein Prolin in zumindest einer der Triaden vorhanden ist (siehe auch die Definitionen für X und O, die hierin enthalten sind);
u und b entsprechen den Bedeutungen von x und o und bezeichnen gleiche oder unterschiedliche Aminosäuren in den unterschiedlichen Triaden- (Tripeptid-) Einheiten; und
p und p¹ sind 1 bis 6, noch häufiger 2 bis 4, wobei die beiden p gleich oder unterschiedlich sein können, üblicherweise jedoch gleich sind, mit der Ausnahme, dass p auch 0 sein kann.
Andere Aminosäuren als Glycin von besonderem Interesse umfassen Alanin (A), Isoleucin (I), Leucin (L), Valin (V), Serin (S), Threonin (T), Asparagin (N), Glutamin (Q), Lysin (K), Arginin (R), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Histidin (H) und Prolin (P), wobei vorzugsweise zumindest eine neutrale polare Aminosäure, z. B. S oder T, oder eine neutrale aliphatische Aminosäure, z. B. A, I, L, oder V, vorhanden ist. Üblicherweise werden die aromatischen hydrophoben Aminosäuren, z. B. F, Y und W, vermieden und, wenn überhaupt, aliphatische hydrophobe Aminosäuren (L, V, I) normalerweise verwendet, wenn ein Prolin vorhanden ist. Vom strukturellen Standpunkt gesehen bilden Triadensequenzen, die Prolin, Alanin, Valin, Serin, Threonin, Glutamin oder Asparagin an den X- oder O-Positionen enthalten, stabilere Tripelhelices. Erhöhte Stabilität wird auch durch Triaden verliehen, die Hydroxyprolin an der O-Position enthalten. Triaden, die Tryptophan und Tyrosin enthalten, werden üblicherweise nicht verwendet. Für einen Anordnung von Tripelhelices höherer Ordnung werden Triaden, die Glutaminsäure oder Asparaginsäure an entweder der X- oder O-Position, insbesondere jedoch an der X-Position, enthalten, sowie Triaden, die Lysin oder Arginin an entweder der X- oder O-Position, insbesondere jedoch an der O-Position, enthalten, bevorzugt.
Von besonderem Interesse sind Strukturen, in denen zumindest eine Triade an einer zweiten Position Prolin aufweist, noch bevorzugter, wenn zwei Triaden Prolin an einer zweiten Position aufweisen oder zumindest eine Triade Prolin an einer dritten Position aufweist, wobei manchmal zwei Triaden Prolin an einer dritten Position aufweisen und häufig zumindest zwei Triaden ein Prolin an der ersten und zweiten Position aufweisen. Meistens weisen zumindest 30%, noch häufiger zumindest 50%, der Triaden in den Motiven ein Prolin an einer zweiten oder dritten Position auf, und es können einige Triaden mit Prolin an beiden Positionen vorkommen, üblicherweise jedoch mit nicht mehr als 35% der Anzahl.
Die Wahl der in einem rekombinanten collagenähnlichen Polymer verwendeten Triaden wird so getroffen, dass Eigenschaften, wie beispielsweise Helixstabilität, Hydratation, Löslichkeit, Gelierungspunkt, biologischer Abbau und Immunogenität beeinflusst werden. Um beispielsweise die Immunogenität zu minimieren, werden Triaden verwendet, die aus Aminosäuren mit einfachen Seitenketten, wie z.B. Glycin, Alanin, Serin, Valin und Prolin, bestehen. Wenn komplexere Aminosäuren erforderlich sind, können sie unter Verwendung von Hexapeptid, Nonapeptid oder längeren Triadensequenzen von natürlichen Collagenketten, die diese Aminosäuren enthalten, eingebaut werden.
Viele der Polymere der vorliegenden Erfindung können in großem Ausmaß durch die folgende Formel dargestellt werden: J_r1((GU^uB^b)_p2((GX^xO^o)_n1(GU^uB^b)_p2)Z₁)_m1)J_r2 worin alle Symbole wie oben definiert sind, mit der folgenden Ausnahme:
J¹ und J², die gleich oder unterschiedlich sein können, sind Aminosäuresequenzen aus etwa 1 bis 40 Aminosäuren, noch häufiger etwa 1 bis 30 Aminosäuren, und können jede beliebige geeignete Sequenz sein;
die beiden r sind gleich oder unterschiedlich und sind 0 oder 1;
die beiden p² sind gleich oder unterschiedlich und sind 0 oder p¹.
Verschiedene repetitive Sequenzen, welche die Motive definieren, können durch die folgenden Sequenzen dargestellt werden:
Triaden von besonderen Interesse umfassen GAP, GPA, GPP, GAS, GPG, GPS, GAQ, GSP, GSQ, GLQ, GPR, GPK, GAK, GAR, GER, GDR, GEP, GDA, GAH und GEA, wobei Kombinationen aus diesen Triaden mit anderen Triaden von besonderem Interesse sind, wobei zumindest etwa 30%, üblicherweise zumindest etwa 50 %, noch häufiger zumindest etwa 60%, oft zumindest 80%, der Anzahl der Triaden innerhalb der genannten Triaden vorkommen. Außerdem beträgt die Anzahl an Tria den, die zwar je nach Einheit stark variieren kann, vorzugsweise 3, 5 oder ein Vielfaches davon.
Sequenzen, welche die GUB-Sequenzen definieren, umfassen:
Die Gene können durch das in der PCT/US 87/02822 beschriebene Verfahren synthetisiert werden. Genauer gesagt werden die Gene laut den folgenden Anleitungen synthetisiert. Relativ kurze Oligonucleotidstränge werden im Allgemeinen so synthetisiert, dass sie für zumindest 12 Aminosäuren, üblicherweise nicht mehr als etwa 60 Aminosäuren, kodieren. Die komplementären Stränge werden anelliert, kloniert und sequenziert, um sicherzustellen, dass die korrekten Sequenzen erhalten wurden. Die Enden können stumpf oder versetzt sein, sind jedoch üblicherweise versetzt. Die Sequenzen werden dann multimeurisiert und ligiert und in einen Klonierungsvektor insertiert. Nach der Transformation in einen geeigneten Wirt werden die Klone auf die Oligomerisierung der Einheiten analysiert, und Einheiten mit geeigneter Größe werden selektiert und für eine Expression verwendet. Wenn flankierende Grundeinheiten von verschiedenen Sequenzen gewünscht sind, kann die für das Motiv kodierende Sequenz an einer geeigneten Restriktionsstelle zwischen den flankierenden Grundeinheiten insertiert werden, so dass das Gen dann mit den geeigneten flankierenden Einheiten herausgeschnitten werden kann. Die resultierende für das Motiv kodierende Sequenz mit den flankierenden Einheiten kann dann herausgeschnitten, oligomerisiert und wie vorher kloniert und als gewünschte Sequenz und Größe aufweisend identifiziert werden.
Die vorliegenden Proteine werden durch Transformation eines geeigneten einzelligen Wirts, wie z. B. E. coli, B. subtilis, Hefe, S. pombe, S. cerevisiae usw., Pilzen, Neurospora, Aspergillus usw. hergestellt. In der Literatur wurden viele Expressions vektoren beschrieben, die darum hierin nicht angeführt werden müssen. Der Expressionsvektor kann einen induzierbaren oder konstitutiven Promotor bereitstellen, wodurch die vorliegenden Proteine kontinuierlich exprimiert oder nur nach einer Induktion exprimiert werden können. Zahlreiche Expressionsvektoren weisen geeignete Promotoren, Terminationssequenzen und Polylinker zwischen den Start- und Terminationssequenzen auf, so dass man das gewünschte Gen leicht in den Polylinker insertieren kann, der unter Transkriptionskontrolle des Promotors stehen soll. Außerdem können die Vektoren einen oder mehrere Marken aufweisen, die eine Selektion im transformierten Wirt ermöglichen. Der Vektor kann auch eine extrachromosale Erhaltung oder Integration in das Genom ermöglichen. Die Marken können Widerstand gegen ein Toxin, z. B. ein Antibiotikum, oder Komplementation eines auxotrophen Wirts zu Prototrophie bereitstellen. Die Wahl des Expressionsvektors hängt von einer Reihe von Faktoren, wie beispielsweise dem Wirt, der Wirtschaftlichkeit, der Einfachheit der Handhabung und dergleichen, ab.
Sobald der Expressionsvektor kloniert wurde, wird er normalerweise analysiert, um sicherzustellen, dass das Gen vorhanden ist und keine Modifikation durchlaufen hat. Der Expressionswirt kann dann in einem Expressionsmedium gezüchtet werden, und nach einer ausreichenden Zeitspanne werden die Zellen lysiert und das Protein wird isoliert. In manchen Fällen ist das Protein relativ unlöslich und kann daher mithilfe verschiedener geeigneter Maßnahmen, beispielsweise Zentrifugation, von Zellbruchstücken getrennt werden. Je nach Reinheitsgrad kann das Protein verwendet werden, wie es ist, oder durch Extraktion unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel, die Verunreinigungen extrahieren und das gewünschte Produkt in unlöslicher Form lassen, weiter gereinigt werden. Falls gewünscht kann eine verdünnte Säurelösung zur Solubilisierung des Proteins verwendet werden, wonach das Protein durch Dialyse ausgefällt wird. Die angewandten Bedingungen variieren je nach bestimmtem produziertem Protein, seiner Löslichkeit, der Art des Wirts, der Art der Verunreinigungen, seinem Endzweck und dergleichen.
Kleine Peptide, welche kleine Segmente der collagenähnlichen Polymere, beispielsweise 15 bis 36 Aminosäuren, enthalten, können hergestellt werden. Diese Segmente können als Haptene verwendet werden, indem das Segment an ein geeignetes Immunogen konjugiert und das resultierende Immunogen zur Herstellung von Antiseren oder monoklonalen Antikörpern verwendet wird, die spezifisch für die Sequenz sind. Somit können Antikörper hergestellt werden, die spezifisch an die collagenähnlichen Polymere der vorliegenden Erfindung binden. Je nach Löslichkeit der vorliegenden Polymere können die Antikörper für Affinitätsreinigung, Identifizierung des Polymers auf Western-Blots oder nichtkovalentes Vernetzen der Polymere zur Herstellung neuer Strukturen und dergleichen verwendet werden.
Die vorliegenden Zusammensetzungen sind für verschiedenste Anwendungen geeignet, etwa für Struktureinheiten, in der Medizin und dergleichen. Die vorliegenden collagenähnlichen Polymere sind zur Bildung von Materialien, wie beispielsweise Fasern, Membranen, Folien, Beschichtungen, Hydrogelen, Kolloidsuspensionen und Formteilen geeignet, wobei sie diesen Materialien und verschiedenen Oberflächen natürlich vorkommender oder synthetischer Quellen einzigartige Merkmale verleihen, wobei diese Merkmale normalerweise mit Wasserabsorption, Biokompatibilität oder Wechselwirkung mit Nichtproteinverbindungen organischer oder anorganischer Natur, z. B. Silberhalogeniden, Farbstoffen usw., zusammenhängen. Beschichtungen mit 1 bis 100 mil können verwendet werden, die an verschiedenen Oberflächen von natürlich vorkommenden und synthetischen Quellen haften. Besondere Eigenschaften dieser Polymere sind ihre thermoreversible Gelierung bei bestimmten Temperaturen, ihre inhärente Biokompatibilität und ihre Bioresorption. Daher können die vorliegenden Polymere bei fotografischen Filmen, als Wundverbände – da sie Neovaskularisierung ermöglichen –, für Augenanwendungen, als Knochenzement, als Matrizen für künstliche Organe, als Membranen, als Beschichtungen zum Züchten von Kulturen, als implantierbares oder injizierbares Arzneimittelverabreichungssystem und dergleichen verwendet werden.
Außerdem kann – da natürliches Collagen vernetzt ist – dieses zum Spinnen, Formen usw. ohne Verdau und Molekulargewichtsreduktion nicht wieder gelöst werden. Somit behalten die collagenähnlichen Polymere die gewünschten Collageneigenschaften bei und können weiterverarbeitet werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung angeführt.
EXPERIMENTELLER TEIL
Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen collagenähnlichen Proteinpolymeren
Beispiel 1
DNA-Herstellungsverfahren
1. Herstellung von Plasmid-DNA aus E. coli A. Labormaßstab
Plasmid-DNA wurde aus 1,5-ml-Kulturen hergestellt, entweder durch das Siedeverfahren oder das alkalische Lyseverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982)).
B. Großtechnisch
Ein Plasmid-tragender Stamm wurde über Nacht in 1 l Luria-Kulturlösung mit dem geeigneten Antibiotikum gezüchtet. Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g entnommen und in 10 ml eiskaltem TE (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert, in 4 ml TES (TE und 25% (Gew./Vol.) Saccharose) resuspendiert und durch Verwirbeln homogenisiert. Die Proben wurden während der folgenden Schritte auf Eis gehalten. Lysozym (1 ml von 10 mg/ml) wurde zu der Zellsuspension zugesetzt und 5 min lang inkubiert, bevor 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 zugesetzt wurden. Nach 10 min Inkubation wurden 50 ml Proteinase K (40 mg/ml) zugesetzt, und wiederum 10 min später wurden 15 ml Lysepuffer (0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8) zugesetzt. Nach 15 bis 20 min wurde das Zelllysat bei 35.000 × g 90 bis 120 min lang zentrifugiert. Der Überstand (19,8 ml) wurde in ein Plastikröhrchen mit 20 mg CsCl und 400 μl Ethidiumbromid (10 mg/ml) transferiert. Nachdem es gelöst worden war, wurde das Gemisch in zwei Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen aufgeteilt, verschweißt und in einem Beckman-Ti-65-Motor bei 60.000 U/min 24 h lang zentrifugiert. Die untere Plasmid-DNA-Bande wurde mit einer hypodermischen Nadel aus dem Röhrchen entfernt. Das Ethidiumbromid wurde drei Mal mit einer gleichen Menge NaCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert. Zwei Volumina H₂O wurden zur DNA-Lösung zugesetzt, und dann wurde die DNA mit Ethanol ausgefällt.
2. Deproteinierung
Eine Phenolextraktion wurde auf einer DNA-Probe mit geeignetem Volumen, typischerweise von 100 μl bis 10 ml, durchgeführt. Die DNA-Probe wurde in 0,01 M Tris-HCl pH 7,5 verdünnt, und 1 mM EDTA und ein gleiches Volumen wassergesättigtes Phenol wurde zugesetzt. Die Probe wurde kurz verwirbelt und 3 min lang auf Eis gestellt. Nach 3-minütiger Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge wurde die wässrige Phase in ein neues Röhrchen gefüllt und ein Mal mit einer gleichen Menge Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert.
3. Ethanolfällung
DNA in einem wässrigen Puffer wurde durch Ethanolfällung konzentriert. Zur DNA-Probe wurden 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 7,5 und 2 bis 3 Volumina kaltes Ethanol zugesetzt. Die DNA wurde 30 Minuten lang bei –70°C oder über Nacht bei –20°C ausgefällt und dann durch 15-minütige Zentrifugation in der Mikrozentrifuge bei 4°C pelletiert. Das Pellet wurde ein Mal mit 200 μl kaltem 80%igem Ethanol gewaschen und wieder 10 Minuten lang bei 4°C ausgefällt. Nach Lufttrocknung oder Gefriertrocknung wurden die Pellets im geeigneten Puffer resuspendiert.
4. Phosphatasebehandlung von DNA

A. Eine Phosphatasebehandlung von DNA wurde durchgeführt, indem 1 μl (25 Einheiten) Kalb-Darmphosphatase (Boehringer Mannheim) direkt zur Restruiktionsenzym-Verdaureaktion zugesetzt und die Inkubation 30 min lang bei 37°C fortgesetzt wurde. Die Phosphatase wurde vor der Deproteinierung durch Phenolextraktion 60 min lang bei 65°C inaktiviert.
B. Eine Phosphatasebehandlung von DNA wurde auch durchgeführt, indem mit Ethanol gefällte DNA von dem Restriktionsenzymverdau in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂ auf eine endgültige DNA-Konzentration von 20 μg/ml resuspendiert wurde. Alkalische Garnelen-Phosphatase wurde in einer Menge von 2 Einheiten/μg DNA zugesetzt, und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert, 20 min lang bei 65°C inaktiviert und dann durch 30-minütiges Mikrozentrifugieren bei 12.000 U/min durch ein Probind-Filter (Millipore) passiert. Die DNA wurde dann mit Ethanol gefällt und in einem geeigneten Puffer resuspendiert.

5. Phosphorylierung von DNA
Vor der Anellierung wurde eine Phosphorylierung durchgeführt, wobei eine 3'-Phosphatase-freie Polynucleotid-Kinase (Boehringer Mannheim) verwendet wurde. Die Umsetzung wurde 30 min lang bei 37°C in einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt, das 12,5 μg DNA, 5 μl 10 × Kinasepuffer (0,5 M Tris pH 7,5, 19 mM Spermidin, 0,1 M MgCl₂, 150 mM DDT, 1 mM EDTA) und 2 μl Polynucleotid-Kinase (10 Einheiten/μl) enthielt. Nach der Phosphorylierung wurden unter Verwendung einer Bio-Spin-6-Säule (BioRad), die in TEAB äquilibriert war, Salze und Glycerin von den DNA-Strängen entfernt.
6. Einfüllreaktion mit DNA-Polymerase 1
DNA wurde in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris HCl pH 7,4, 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂ und je 400 mM der vier Desoxynucleotidtriphosphate enthielt. Zehn Einheiten Klenow-DNA-Polymerase (BRL) wurden zugesetzt, und die Reaktion wurde 15 min lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Dann wurde die DNA mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
7. Verdau mit Restriktionsendonucleasen
DNA wurde mit Restriktionsendonucleasen (REN) in 1 × "AA"-Puffer verdaut [10 × AA-Puffer ist 330 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 660 mM Kaliumacetat, 100 mM Magnesiumacetat, 50 mM Dithiothreit (DTT) und 1 mg/ml Rinder-Serumalbumin (nucleasefrei)]. Wann immer es möglich war, wurde die Konzentration von DNA unter 1 μg/25 μl gehalten. Die Inkubation bei 37°C dauerte bei den meisten Restriktionsendonucleasen 1 bis 4 h, mit Ausnahme der BalI-, BanI- und NeaI-Verdaue, die über Nacht inkubiert wurden.
8. Analytische Agarose elelektrophorese von DNA
Zu DNA-Proben zur Gelanalyse wurden 0,2 Volumina eines Ladungspuffers (5 × Elektrophoresepuffer, 0,01% Bromphenolblau-Farbstoff, 50 mM EDTA und 50 Glycerin). Dann wurden die Proben in Bahnen einer horizontal eingetauchten Elektrophoreseeinheit aufgetragen, die 1,0% (Gew./Vol.) Agarosegel enthielt. Der Elektrophoresepuffer war entweder 1 × TAC oder ½ × TBE. Das 1 × TAC ist 40 mM Tris-Base, 10 mM EDTA, mit Essigsäure auf pH 7,8 eingestellt. Das ½ × TBE ist 0,045 M Tris-Base, 0,045 Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8. Das Gel wurde 18 h lang bei 40 bis 50 Volt laufen gelassen, dann entfernt und 30 min lang mit 0,5 g/ml Ethidiumbromid gefärbt. Die DNA-Banden wurden auf einem UV-Transilluminator mit langer Wellenlänge sichtbar gemacht.
9. Präparative Agarosegelelektrophorese
Die Verfahren und Materialien sind die gleichen wie bei der analytischen Agarosegelelektrophorese. Der einzige Unterschied besteht in der Verwendung von Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt (LMP), mit einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2,5% (Gew./Vol.), je nach Größe des zu reinigenden DNA-Fragments. Nach einer Sichtbarmachung mit Ethidiumbromid wurden DNA-Restriktionsfragmente aus den LMP-Agarosegelen herausgeschnitten. Für eine Agaroseligation war der Puffer 1 × TAE (50 mM Tris-Acetat).
10. NACS-Reinigung
DNA enthaltende Gelfragmente wurden 5 min lang bei 70°C geschmolzen und etwa 5fach mit TEI (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,2 M NaCl) verdünnt. Die Gellösung wurde auf eine NACS-Säule (BRL) aufgetragen. Die Säule wurde mit 5 ml des gleichen Puffers gewaschen. Die gebundene DNA wurde mit 300 μl entweder TE2 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1,0 M NaCl) für DNA-Fragmente, die kleiner als 1000 by sind, oder TE3 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl) für größere Fragmente eluiert. Die eluierte DNA wurde durch Ethanolfällung konzentriert.
11. DNA-Ligation
Reaktionen zur Ligation von kohäsiven Enden enthielten: 1 μg DNA, 1 × AA-Puffer (siehe Schritt 6 oben), 1 mM ATP und 20 Einheiten T4-DNA-Ligase (BRL) in einem Endreaktionsvolumen von 20 μl. Die Ligation wurde 16 bis 18 Stunden lang bei 15°C oder 1 bis 2 Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Für Ligationen stumpfer Enden enthielten die Reaktionen 1 μg DNA, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,25 mM Spermidin, 200 ng BSA, 1 mM Hexamincobaltchlorid (HCC), 0,5 M ATP und 400 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEB) in einem Reaktionsvolumen von 20 μl. Die Ligation wurde 30 min bis 1 h lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen.
12. Agarose-DNA-Ligation
Die Agarose wurde bei 65°C geschmolzen, dann wurde die Temperatur auf 37°C gesenkt, und ein Ligationspuffer (5X = 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM ATP) wurde zugesetzt; das Röhrchen wurde dann bei Raumtemperatur gehalten, und Ligase wurde zugesetzt (1.000 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEB)), das Reaktionsvolumen betrug üblicherweise 50 μl. Die Reaktion wurde bei 15°C 16 bis 18 h lang inkubiert.
mRNA-Verfahren
1. Herstellung von mRNA
mRNA wurde unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens hergestellt, das von W.C. Summers (Anal. Biochem. 33, 459–463 (1970)) beschrieben wurde. Zellen wurden bei 30°C oder 42°C in LB-Medium, das mit Kanamycin (50 μg/ml) ergänzt war, gezüchtet. 10 ml Zellen mit OD600 = 1,0 wurden zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in 10 ml Protoplastenbildungspuffer (15 mM Tris–HCl pH 8,0, 0,45 M Saccharose, 8 mM EDTA) resuspendiert; 80 μl Lysozym bei 50 mg/ml wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde dann 15 min lang auf Eis inkubiert. Die Zellsuspension wurde 5 min lang bei 7.000 U/min in einem SS-34–Rotor unter Verwendung einer RC-5B-Zentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde in 0,5 ml Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 1 mM Na-Citrat, 1,5% (Gew./Vol.) SDS) und 15 μl DEPC resuspendiert. Die Suspension wurde vorsichtig vermischt und dann in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen transferiert, 5 min lang bei 47°C inkubiert und dann auf Eis abgeschreckt. 250 μl gesättigtes NaCl (40% (Gew./Vol.)) wurden zugesetzt, das Ganze wurde vorsichtig vermischt, und die Inkubation auf Eis wurde weitere 10 min fortgesetzt. Die Aufschlämmung wurde 15 min lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in zwei 1,5-ml-Röhrchen gefüllt, und je 1 ml 100% Ethanol wurde zugesetzt. Die RNA wurde in der Kälte ausgefällt und dann bei 4°C 20 min lang zentrifugiert. Die Pellets wurden in 70% Ethanol gespült und getrocknet. Die RNA wurde dann in 0,1 ml H₂O resuspendiert, und OD₂₆₀ und OD₂₈₀ wurden gemessen, um die Abscheidegrad und die Reinheit der RNA zu messen. Der mittlere Abscheidegrad der gesamten RNA (5 mRNA, 95% tRNA + rRNA) aus 10 ml gezüchteten Zellen lag zwischen 0,5 und 1,0 mg.
2. Northern-Blot-Analyse
Die wie oben beschrieben gereinigte RNA wurde auf Agarosegel laufen gelassen und laut dem von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 202–203, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982), beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 10X SSC als Transferpuffer auf Nitrocellulose transferiert.
Das ECL-Gendetektionssystemset (Amersham) wurde für die Markierung der Sonde, die Hybridisierungsbedingungen und die Detektion verwendet. Die Verfahren wurden wie in "ECL gene detection system RPN2101", Version 2, Amersham International plc., beschrieben durchgeführt.
Bakterientransformationsverfahren
1. Herstellung von transformationskompetenten E.-coli-Zellen
Eine Kultur von 200 ml steriler L-Kulturlösung wurde mit einer kleinen Schlaufe voll E.-coli-Zellen inokuliert. Das Ganze wurde unter Rütteln bei 37°C inkubiert, bis die OD₆₀₀ etwa 0,5 betrug. Die Kultur wurde 10 min lang auf Eis gestellt und 10 min lang bei 6.000 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 100 ml eiskaltem 0,1 M MgCl₂ resuspendiert, 30 bis 40 min lang auf Eis gehalten und dann wieder zentrifugiert. Das Pellet wurde in 2 ml eiskaltem 100 mM CaCl₂ resuspendiert, in ein steriles Reagenzglas transferiert und 24 h lang auf Eis inkubiert. Die kompetenten Zellen wurden dann aliquotiert und bei –70°C gelagert.
2. Transformation von E. coli
Ein Aliquot von gefrorenen kompetenten Zellen wurde auf Eis aufgetaut. Zu 50 μl Zellen wurden 0,1 bis 1 μg DNA zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min lang auf Eis inkubiert. Das Röhrchen wurde vom Eis genommen und 2 min lang in ein Bad mit 42°C gestellt. L-Kulturlösung (1 ml) wurde zugesetzt, und das Transformationsgemisch wurde unter Rütteln bei der gewünschten Temperatur (üblicherweise 30°C oder 37°C) 2 h lang inkubiert. Dann wurde 1/10 der Transformation auf L-Kulturlösung-Platten plattiert, die das geeignete Antibiotikum enthielten, und wenn notwendig wurden XGAL und IPTG zugesetzt.
Antikörperherstellung, Proteinchemie und Elektrophorese von Proteinen
1. Herstellung eines Antikörpers für künstlich synthetisierte Peptide
Ein synthetisches Peptid der Sequenz GAHGPAGPKGAHGPAGPKGAPGPAGPPGAPGPAGPP (DCP-C₂A₂) wurde zur Verwendung als Immunogen an Schlüsselloch napfschnecke-Hämocyanin gekoppelt. Das Material wurde zur Herstellung von Antikörpern in Kaninchen an Antibodies, Inc. gesendet. Peptidkonjugate mit einer Konzentration von 1 mg/ml in komplettem Freundschen Adjuvans wurden verwendet, um Kaninchen am Tag 0 zu immunisieren. Den Tieren wurde am Tag 30 ein Antigen in inkomplettem Freundschen Adjuvans reinfiziert, gefolgt von einer Titration am Tag 60. Unter Verwendung eines Mikrotiters RIA wurden unter Einsatz des synthetischen Peptids als Antigen positive Seren detektiert. Kagen und Glick, Methods of Radioimmunoassay, 328, Jafte und Berman (Hrsg.), Academic Press (1979). Es wurden Antiseren erhalten, die mit synthetischen Peptiden der DCP1- und DCP2-Sequenzen reagierten.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurde ein zusätzliches Peptid mit der Sequenz (GAPGPAGPPGSRGDPGPP)₂(DCP-(AB)₂) synthetisiert, das zur Verwendung als Immunogen ebenfalls an Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin gekoppelt wurde. Polyklonale Antiseren wurden dann wie oben beschrieben hergestellt, die an das synthetische Peptid der DCP3-Sequenz banden.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurde ein zusätzliches Peptid mit der Sequenz (GAPGAPGSQGAPGLQ)₂YMK synthetisiert, das zur Verwendung als Immunogen ebenfalls an Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin gekoppelt wurde. Polyklonale Antiseren wurden dann wie oben beschrieben hergestellt, die an das synthetische Peptid der CLP-3.1-Sequenz banden.
2. Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen
Etwa 10⁹ E.coli-Zellen aus Zuchtkulturen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g pelletiert. Die Zellpellets wurden in 100 bis 500 μl 2X Probenpuffer (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 4% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 60% Glycerin oder Saccharose) resuspendiert und 30 s lang unter Verwendung eines Tekmar-Schallzerstörers beschallt. Proben wurden etwa 5 min lang gekocht, und 20 bis 100 μl der Zelllysate wurden auf ein SDS-Polyacrylamidgel (7,5 bis 16% (Gew./Vol.)) übertragen.
Die Gele wurden nach dem Verfahren von Laemmli (Nature 27, 80–685 (1970)) hergestellt. Die Proteine in den Gelen wurden mit 2% Coomassie-Brillantblau in 10% Methanol, 7,5% Essigsäure 1 h lang gefärbt und in 10% Methanol, 7,5% Essigsäure über Nacht entfärbt.
3. Proteinexpressionsanalysen
Eine Kultur, die über Nacht bei 30°C gezüchtet worden war, wurde verwendet, um 50 ml LB-Medien, die in einem 250 ml fassenden Kolben enthalten war, zu inokulieren. Kanamycin wurde auf eine Endkonzentration von 50 μg pro ml zugesetzt, und die Kultur wurde unter Rühren (200 U/min) bei 30°C inkubiert. Als die Kultur eine OD600 von 0,8 erreichte, wurden 40 ml in einen neuen, auf 42°C vorgewärmten Kolben transferiert und bei derselben Temperatur etwa 2 h lang inkubiert. Die Kulturen (30°C und 42°C) wurden auf Eis abgekühlt, und die OD₆₀₀ wurde gemessen. Zellen wurden durch Zentrifugation entnommen und dann in 1,0-OD₆₀₀-Aliquote getrennt und zur Durchführung einer Western-Analyse unter Verwendung der geeigneten Antikörper verwendet.
4. Immun-Blotting von Proteinen in Gelen
Nach einer Proteinelektrophorese wurde eine der flankierenden Glasplatten vom Polyacrylamidgel entfernt. Die Geloberfläche wurde mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 20% Methanol) benetzt. Ein Stück eines Nitrocellulosepapiers (Sartorius, SM11307) wurde mit Transferpuffer gesättigt und auf das Gel gelegt. Luftblasen zwischen dem Filter und dem Gel wurden entfernt. Das Gel und das Nitrocellulosefilter wurden laut den Angaben des Herstellers (Bio-Rad) in die Transfereinheit gefüllt. Der Transfer wurde 3 bis 4 h lang bei 200 mA fortlaufen gelassen. Dann wurde das Nitrocellulosefilter entfernt und mit Amido-Schwarz 3 min lang gefärbt (0,05 Amido-Schwarz, 45% entionisiertes H₂O, 45% Methanol, 10% Essigsäure) und in H₂O entfärbt. Das Filter wurde zumindest 10 min bei Raumtemperatur in "BLOTTO" (5% (Gew./Vol.) fettfreie Trockenmilch, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,9% (Gew./Vol.) NaCl, 0,2% (Gew./Vol.) Natriumazid) inkubiert. Dann wurde das Filter in Serum ein gelegt, das geeigneterweise in 0,5X Blotto (2,5% fettfreie Trockenmilch, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,9% NaCl, 0,2% Natriumazid) verdünnt war, und wurde etwa 16 h lang bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt. Das Filter wurde 1 h lang mit 5 verschiedenen TSA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,9% NaCl, 0,2% Natriumazid) gewaschen. Der Blot wurde in 15 ml 0,5X BLOTTO-Lösung eingelegt, die 1 × 10⁷ cpm ¹²⁵I-Protein A enthielt, und 2 h lang vorsichtig bei Raumtemperatur gerührt. Das Filter wurde 2 h lang mit mindestens 7 verschiedenen TSA gewaschen, ein Mal mit entionisiertem H₂O gespült und luftgetrocknet. Der Blot wurde mit einem Saran-Deckband bedeckt und einer Autoradiographie unterzogen.
5. Aminosäureanalysen
Aminosäurezusammensetzungen wurden durch das PTC-Derivatisierungsverfahren von Henrickson und Meredith (1984) bestimmt. Proteinproben wurden mit 5,7 N konstant siedender HCl bei 108°C 24 h lang im Vakuum hydrolysiert. Nach einer Umsetzung mit PITC wurden bei 254 nm durch HPLC-Umkehrphasenchromatographie unter Einsatz eines Waters-100E-Systems und einer Supelco-C18-Säule (4,6 mm × 25 cm) mit einem Lineargradienten von 0 bis 50% Acetonitril in 0,1 M NH₄OAc pH 6,78 als mobile Base Aminosäurederivate detektiert. R.L. Henrickson und S.C. Meredith, Amino Analysis by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography, Anal. Biochem. 137, 65–74 (1984).
6. Peptidsynthese
Synthetische Peptide wurden durch Festphasensynthese auf einem Peptidsynthesizer Modell 430A von Applied Biosystems unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten symmetrischen Anhydridchemie hergestellt. Die Kopplungsausbeute bei jedem Schritt wurde durch das quantitative Ninhydrinverfahren von Sarin et al. (1981) bestimmt. Das synthetische Peptid wurde vom festen Träger abgespalten, und Aminosäure-Blockiergruppen wurden unter Verwendung von wasserfreiem HF entfernt (Stewart und Young (1984)). Rohe Peptide wurden durch Chromatographie über Sephadex G-50 entsalzt. V.K. Sarin, S.B.H. Kent, J.P. Tam und R.B. Merrifield, Anal. Biochem. 237, 927–936 (1981). J.M. Stewart und J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 85–89, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA (1984).
DNA-Syntheseverfahren
1. In-vitro-DNA-Synthese
Die N,N-Diisopropylphosphoramidite, Glassäulen mit kontrollierter Porengröße (CPG) und alle Synthesereagenzien wurden von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA, bezogen. Synthetische Oligonucleotide wurden durch das Phosphittriesterverfahren mit einem DNA-Synthesizer Modell 381A von Applied Biosystems unter Verwendung eines 10fachen Überschusses von geschützten Phosphoramiditen und 1 μmol eines Nucleotide, das an die Synthese-Hilfssäule gebunden war, hergestellt. Die für die Synthese verwendeten chemischen Abläufe sind die für die Verwendung mit dem Synthesizer empfohlenen Standardvorschriften und wurden von Matteucci et al. (J. Amer. Chem. Soc. 103, 3185–3319 (1981)) beschrieben. Die Entfernung der Schutzgruppen der Oligomere und ihre Abspaltung vom festen Träger wurden laut den Standardvorschriften von McBride et al., Tetrahedron Letters 24, 245–248 (1983), durchgeführt. Die reproduzierbare Ausbeute der Synthese, gemes- sen – wie von Applied Biosystems (1984) empfohlen – durch die optische Dichte der entfernten Schutzgruppe, lag über 97,5%. Das rohe Oligonucleotidgemisch wurde durch präparative Gelelektrophorese gereinigt, wie in der Arbeitsvorschrift vom 9. November 1984 (User Bulletin Nr. 13) von Applied Biosystems beschrieben wurde. Die Acrylamidgelkonzentration variierte je nach der Länge des Oligomers von 10 bis 20%. Das gereinigte Oligomer wurde durch UV-Abschirmung identifiziert, aus dem Gel herausgeschnitten und durch das Crush-and-Soak-Verfahren (Smith, Methods in Enzymology 65, 371–379 (1980)) extrahiert.
2. Sequenzierung von DNA
DNA-Sequenzen wurden durch die in der folgenden Literatur beschriebenen Verfahren bestimmt: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA; Norrander et al., Gene 26, 101–106 (1983); Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977); Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3963–3965 (1983); und Sanger et al., FEBS Letters 87, 107–110 (1978).
Fragmente, welche die Region von Interesse enthielten, wurden in die multiple Klonierungsstelle von M13mp18 oder M13mp19 kloniert (Maniatis et al. (1982) und Norrander et al. (1983)). Einsträngige DNA wurde hergestellt und unter Verwendung von ³⁵S-Desoxyadenosin-5'-(alpha-thio)-triphosphat (New England Nuclear) als Marken durch das Primerverlängerungsverfahren sequenziert (Sanger et al. (1977) und Biggin et al. (1983)). In einigen Fällen wurden Reverse Transkriptase (Molecular Genetics) verwendet, um die Primer zu verlängern, wobei die von Zagursky et al. (Gene Anal. Tech. 2, 89–94 (1985)) verwendeten Didesoxy : Desoxynucleosidtriphosphat-Verhältnisse verwendet wurden. Desoxyadenosintriphosphat, das mit entweder ³²P oder ³⁵S markiert war, wurde in diesen Reaktionen eingesetzt. Verdichtungsartefakte, die in manchen G-C-reichen Sequenzen vorkamen, wurden durch die Eliminierung von Desoxyguanosintriphosphat aus der G-Reaktion und stattdessen der Verwendung von Desoxyinosintriphosphat (P-L Biochemicals) in einer Endkonzentration von 37,5 μM entfernt. In den anderen Gemischen betrug die Konzentration von DidesoxyGTP in der G-Reaktion 0,5 mM. Alle Sequenzen wurden auf 6 oder 8% Polyacrylamidgelen, die 8 M Harnstoff enthielten, laufen gelassen (Sanger et al. (1978)). Primer, die für die Sequenzierung verwendet wurden, wurden von P-L Biochemicals bezogen.
3. Didesoxy-DNA-Sequenzierung von doppelsträngiger Plasmid-DNA
Plasmid-DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt (Herstellung von Plasmid-DNA aus E. coli, Labormaßstab, Maniatis et al.). Primer wurden unter Verwendung eines DNA-Synthesizers wie oben beschrieben synthetisiert und laut dem für die M13-Sequenzierung beschriebenen Verfahren an die Plasmid-DNA anelliert. Die Sequenzierungsreaktionen fanden unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemicals) und unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen statt. Alle Sequenzen wurden auf Polyacrylamidgelen wie oben beschrieben laufen gelassen. Beispiel 2 TABELLE 1 STRUKTUR VON DCP 1, 2 & 3
PLASMID-pPT0134-KONSTRUKTION
Der Akzeptorvektor PPT 0134 wurde spezifisch dafür entworfen und konstruiert, die Konstruktionsanforderungen der DCP-Polymergene zu erfüllen. Dieser Vektor enthält zwei Erkennungsstellen für Fokl-REN in seiner MCS (multiplen Klonierungsstelle).
Zwei Oligonucleotidstränge, die diese Stellen enthielten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und gereinigt.
Nach einer Anellierung wurden die beiden Oligonucleotidstränge mit pSY 937 ligiert (siehe Patentanmeldung Nr. PCT/US87/02822 ), das mit BanI- und EcoRV-RENs verdaut worden war. Das Produkt des Ligationsgemischs wurde in E. coli transformiert und auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde nach Verdau mit ScaI- und StuI-RENs durch eine Agarosegelelektrophorese analysiert. Ein Plasmid pPT 0124 enthielt das erwartete DNA-Fragment.
Die neue MCS wurde dann auf das Plasmid pSY 1367 übertragen. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pSY 1299 (siehe Patentanmeldung Nr. PCT/US87/02822 ). Das Plasmid pSY 1299 wurde mit NciI-REN verdaut, und das große DNA-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese und NACS-Reinigung gereinigt. Das gereinigte DNA-Fragment wurde mit DNA-Polymerase behandelt (Siehe Beispiel 1), ligiert und dann mit FokI verdaut, bevor es in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert wurde. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde gereinigt und durch Restriktionsverdaue analysiert. Ein Plasmid, pSY 1366, erwies sich als korrekt und wies die einzige PokI-Stelle in pSY 1299 nicht auf.
Zwei Oligonucleotidstränge wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und gereinigt.
Die Oligonucleotidstränge 1.A und 1.B wurden anelliert und mit der DNA des Plasmids pSY 1366 ligiert, das mit BanII- und FspI-RENs verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligationsreaktionen wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von transformierten Kolonien wurde gereinigt und mit FokI verdaut. Klone, die mit FokI linearisierten, wurden sequenziert. Das Plasmid pSY 1367 enthielt die gewünschte MCS-Sequenz und wurde für nachfolgende Konstruktionen ausgewählt.
Die Plasmide pPT 0124 und pSY 1367 wurden mit NruI und NcoI verdaut, und die DNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese und NACS-Reinigung gereinigt. Das kleine Fragment (etwa 500 bp) von pPT 0124 wurde mit dem großen Fragment von pSY 1367 ligiert. Das Produkt des Ligationsgemischs wurde in E. coli transformiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde gereinigt und durch Restriktionsverdau und DNA-Sequenzierung analysiert. Ein Plasmid, pPT 0134, enthielt die gewünschte Sequenz und wurde als Akzeptorvektor für die DCP-Konstruktionen verwendet.
SYNTHESE UND ZUSAMMENSTELLUNG DER C-EINHEITEN
Vier Oligonucleotidstränge wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und gereinigt. Jedes Paar von Oligonucleotidsträngen kodiert für eine C₂-Einheit, entweder die 5'- oder die 3'-C₂-Einheit.
Die Oligonucleotidstränge 2.A und 2.B wurden anelliert und mit der DNA des Plasmids pPT 0134 ligiert, das mit FokI-REN verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von transformierten Kolonien wurde gereinigt und mit SfiI verdaut. Klone, die mit SfiI linearisierten, wurden sequenziert. Das Plasmid pPT 0135 enthielt die gewünschte C₂-Sequenz und wurde für nachfolgende Konstruktionen ausgewählt.
Die Stränge 2.C und 2.D wurden wie die Stränge 2.A und 2.B anelliert, ligiert und transformiert. Plasmid-DNA von transformierten Kolonien wurde gereinigt und mit BanII-REN verdaut. Klone, die mit BanII linearisierten, wurden sequenziert. Die Plasmide pPT 0137 und pPT 0138 enthielten die korrekte C₂-DNA-Sequenz.
Die Plasmide pPT 0135 und pPT 0137 wurden mit BanI- und StuI-RENs verdaut. Das große Fragment von pPT 0135, welches das C₂ (Stränge A + B) enthielt, wurde mit dem kleinen Fragment von pPT 0137, welches das C₂-Fragment (Stränge C + D) enthielt, ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von Transformanten wurde gereinigt, und zwei Verdaue wurden durchgeführt, SfiI-StuI- bzw. BanII-StuI-RENs. Klone, welche in beiden Verdaue ein DNA-Fragment mit etwa 800 bp freisetzten, wurden sequenziert. Das Plasmid pPT 0140 enthielt die korrekte C₂C₂-Sequenz, wie in Tabelle 2 dargestellt ist, und wurde für DCP-Genmonomerkonstruktionen verwendet. TABELLE 2
DCP1- UND DCP2-GENMONOMERKONSTRUKTIONEN
Zwei Oligonucleotidstränge wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und gereinigt.
Die beiden Oligonucleotidstränge, die für A₂ (3A & 3B) kodierten, wurden anelliert und mit der Plasmid-DNA pPT 0134 ligiert, die vorher mit FokI-REN verdaut worden war. Die Produkte des Ligationsgemischs wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von Transformanten wurde PstI-REN verdaut, und Klone, die linearisiert waren, wurden sequenziert. Das Plasmid pPT 0142 erwies sich als korrekt und wurde zur Multimerisierung von A₂-Einheiten eingesetzt.
Plasmid-DNA von pPT 0142 wurde mit FokI-REN verdaut, und das Fragment, das die A₂-Einheit enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und unter Verwendung einer NACS-Säule gereinigt (siehe Beispiel 1). Das DNA-Fragment wurde einer Eigenligation unterzogen, und die Produkte der Ligation wurden mit pPT 0134 ligiert, das vorher mit FokI-REN verdaut worden war. Die Produkte des Ligationsgemischs wurden in einen E.-coli-Stamm HG101 transformiert. Plasmid-DNA von Transformanten wurden gereinigt und mit FokI-REN verdaut. Klone, die DNA-Inserts aus 162 by enthielten, die A₆ entsprachen, wurden für eine Sequenzanalyse selektiert. Das Plasmid pPT 0144 wies die erwartete DNA-Sequenz auf und wurde für nachfolgende Konstruktionen selektiert. Plasmid-DNA von pPT 0144 wurde mit FokI-REN verdaut, und die beiden durch Verdau gebildeten DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese getrennt. Das kleinere DNA-Fragment wurde unter Verwendung einer NACS-Säule gereinigt (siehe Beispiel 1). Das DNA-Fragment, das die A₆-Kodierungssequenz trug, wurde mit Plasmid-DNA pPT 0140 ligiert, das vorher mit FokI verdaut worden war. Die Produkte der Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Verdau mit FokI auf Inserts untersucht, die multiple A₆-DNA-Fragmente enthielten. Inserts verschiedener Größe wurden gefunden, von A₆ bis A₂₄. Ein Klon, pPT 0147 (siehe Tabelle 3), enthielt die gewünschte DCP2-Genmonomersequenz C₂A₁₂C₂ und wurde für nachfolgende Konstruktionen verwendet.
Der Klon, der die DCPI-Genmonomersequenz C₂A₂₄C₂ (siehe Tabelle 4) enthielt, die zur Konstruktion des DCP1-Polymergens erforderlich ist, war während der folgenden Schritte sehr instabil. Diese Instabilität wurde auf die hohe Kopienzahl des Akzeptorplasmids zurückgeführt. Aus diesem Grund wurde das Genmonomer von diesem Plasmid in pBR 322 rekloniert (F. Bolivar et al., Gene 2, 95–113 (1977)). Die Plasmid-DNA, die das C₂A₂₄C₂-Genfragment enthielt, wurde durch Verdau mit NruI- und Eco-RV-RENs, Agarosegelelektrophorese aus dem Plasmid isoliert und auf einer NACS-Säule gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde mit Plasmid-pBR322-DNA ligiert, die vorher mit EcoRV- und NruI-RENs verdaut worden war (siehe Agaroseligation in Beispiel 1). Die Produkte dieser Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und auf Bakterienplatten, die 100 μg/ml des Antibiotikums Ampicillin enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Klone, welche die Insertion enthielten, wurden durch Verdau mit mehreren RENs weiter analysiert, und einer, pPT 0153, wurde für die Konstruktion des DCP1-Polymergens ausgewählt. Dieses Plasmid war stabil. TABELLE 3
TABELLE 4
DCP1-POLYMERGENKONSTRUKTION
Plasmid von der DNA pPT 0153 wurde zuerst mit AcyI-REN und dann mit FokI-REN verdaut. Das DNA-Fragment, welches das DCP1-Genmonomer, 783 bp, enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und unter Verwendung einer NACS-Säule gereinigt (siehe Beispiel 1). Das Monomergenfragment wurde mit pSY 1262 ligiert (siehe Patentanmeldung Nr. PCT/US87/02822 ), das mit BanI-REN verdaut worden war. Das Ligationsprodukt wurde in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und zur Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Kanamycin enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Verdau mit BamHI- und PvuII-RENs und Elektrophorese auf Agarosegel auf Inserts analysiert, die multiple DCP1-Monomerfragmente enthielten. Ein Klon, pPT 0164, enthielt das Genmonomer (783 bp); ein weiterer, pPT 0165, ein etwas größeres Fragment (etwa 1200 bp); und ein dritter, pPT 0166, ein Gendimer (1566 bp).
DCP1-PROTEINEXPRESSIONSANALYSE
Ein E.-coli-Stamm HB101, der das Plasmid pPT 0164, pPT 0165 oder pPT 0166 enthielt, wurde bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 gezüchtet und dann 2,0 h lang auf 42°C verlagert. Die durch diese Zellen gebildeten Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse auf neue Proteinbanden untersucht, die mit DCP-C₂A₂-Peptidantiseren reagierten. Eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 45 kD wurde in der Kultur, die das Plasmid pPT 0164 enthielt, beobachtet. Eine Bande mit 68 kD wurde in der Kultur mit pPT 0165 entdeckt, und eine leichte Schliere von Banden wurde in der mit pPT 0166 entdeckt.
Aufgrund des geringen Grades detektierbarer Expression im Stamm, der pPT 0166 enthielt, wurde die mRNA, die durch die DCP1-Klone produziert wurde, analysiert. mRNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. In einer Northern-Blot-Analyse (siehe Beispiel 1) zeigte sich, unter Verwendung der DCP2-Monomersequenz als Sonde, dass die DCP-spezifische mRNA von allen Klonen die volle Länge aufwies und unabhängig von der DCP-Gengröße auf etwa demselben Niveau synthetisiert wurde. DCP 1 pPT 0166 561 Aminosäuren MG: 46.409 Dalton
DCP2-POLYMERGENKONSTRUKTION
Plasmid-DNA von pPT 0147 wurde mit FokI-REN verdaut, und die Verdaufragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Das DCP2-Genfragment mit 483 by wurde herausgeschnitten und mithilfe einer NACS-Säule gereinigt (siehe Beispiel 1). Das gereinigte Fragmente wurde mit pSY 1262 ligiert, das mit BanI-REN verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert, und die Transformanten wurden zur Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Kanamycin enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde gereinigt und auf multiple Insertionen des DCP2-Genmonomerfragments analysiert. Es wurden mehrere Klone mit Größen im Bereich von 500 bis 3.000 bp erhalten. Ergebnisse siehe Tabelle 5.
DCP2-PROTEINEXPRESSIONSANALYSE
Ein E.-coli-Stamm HB101, der die Plasmide pPT 0155 bis 0163 enthielt, wurde bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 gezüchtet und dann 2,0 h lang auf 42°C verlagert. Die durch diese Zellen gebildeten Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse auf eine Proteinbande untersucht, die mit DCP-C₂A₂-Peptid-spezifischen Antiseren reaktiv waren. Ergebnisse siehe Tabelle 5. TABELLE 5
DCP 2 pPT 0159 77 Aminosäuren MG: 64.094 Dalton
DCP3-MONOMERKONSTRUKTION
Vier Oligonucleotidstränge, die für (AB)₂ kodierten, wurden wie beschrieben synthetisiert und gereinigt (siehe Beispiel 1).
Die Oligonucleotidstränge 4.A und 4.B wurden anelliert und mit dem DNA-Plasmid pPT 0134 ligiert (siehe Beispiel 1), das mit Fokl-REN verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von transformierten Kolonien wurde gereinigt und mit PstI und StuI verdaut. Klone, die ein Fragment mit etwa 800 by enthielten, wurden sequenziert. Das Plasmid pPT 0139, das die gewünschte Sequenz der Stränge 4.A und 4.B enthielt, wurde für nachfolgende Konstruktionen ausgewählt.
Die Stränge 4.C und 4.D wurden anelliert und mit dem DNA-Plasmid pPT 0139 ligiert, das vorher mit XbaI- und PstI-RENs verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von transformierten Kolonien wurde gereinigt und mit NcoI- und DraIII-RENs verdaut. Klone, die ein DNA-Fragment enthielten, das der kombinierten Insertion der Stränge 4.A und B und 4.C und D entsprach, wurden sequenziert. Das Plasmid pPT 0143, das die korrekte (AB)₂-DNA-Sequenz enthielt, wie sie in Tabelle 6 enthalten ist, wurde für nachfolgende Konstruktionen ausgewählt. TABELLE 6
Plasmid-DNA von pPT 0143 wurde mit FokI-REN verdaut, und das Fragment, welches das (AB)₂-Genfragment enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und auf einer NACS-Säule gereinigt. Das DNA-Fragment wurde dann mit pPT 0134 ligiert, das mit FokI-REN verdaut worden war. Die Produkte der Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und zur Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Verdau mit FokI-REN auf Inserts untersucht, die multiple (AB)₂-DNA-Fragmente enthielten. Es wurden mehrere Klone erhalten, die von einer Kopie bis zu mehreren Kopien von (AB)₂ reichten. Ein Klon, pPT 0169, der (AB)₆ ent hielt, wurde als Zwischenprodukt für die Konstruktion des DCP3-Genmonomers verwendet.
Das (AB)₆-Genfragment wurde durch Verdau mit FokI-REN, Agarosegelelektrophorese und NACS-Reinigung von pPT 0169 gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde dann mit dem DNA-Plasmid pPT 0140 ligiert, das vorher mit BanI-REN verdaut worden war. Die Produkte der Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert, und Transformanten wurden auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielt, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Verdau mit FokI-REN auf Inserts, die multiple Kopien des (AB)₆-Genfragments enthielten, untersucht. Ein Klon, pPT 0171, der C₂(AB)₁₂C₂ (siehe Tabelle 7) enthielt, wurde als DCP3-Genmonomer für nachfolgende Konstruktionen ausgewählt. TABELLE 7
DCP3-POLYMERGENKONSTRUKTION
Plasmid-DNA von pPT 0171 wurde mit FokI-REN verdaut, und das Fragment, welches das DCP3-Genmonomer enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese und NACS-Reinigung gereinigt. Das DCP3-Monomer wurde dann einer Eigenligation unterzogen und mit dem DNA-Plasmid pSY 1262 ligiert, das mit BanI-REN verdaut worden war. Die Produkte der Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und zur Züchtung in Bakterienplatten, die das Antibiotikum Kanamycin enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde gereinigt und nach Verdau mit XcmI- und PvuII-RENs auf Insertionen untersucht, die multiple Kopien des DCP3-Genmonomerfragments enthielten. Die Klone pPT 0173, pPT 0174, pPT 0175 und pPT 0176, die Monomer-, Dimer-, Trimer- bzw. Tetramerformen von DCP3 enthielten, wurden für eine Expressionsanalysen selektiert.
DCP3-PROTEINEXPRESSIONSANALYSE
Ein E.-coli-Stamm HB101, der DCP3-Plasmide pPT 0173, pPT 0174, pPT 0175 oder pPT 0176 enthielt, wurde bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 gezüchtet und dann 2,0 h lang auf 42°C verlagert. Die durch diese Zellen gebildeten Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse auf neue Proteinbanden untersucht, die mit DCP-(AB)₂-Peptid-spezifischen Antiseren reaktiv waren. Reaktive Banden wurden in jedem Klon entdeckt (Ergebnisse siehe Tabelle 8). Die Expression des Polymers voller Länge nahm jedoch mit zunehmender Größe des Gens ab. Eine Northern-Analyse unter Verwendung des DCP3-Monomers als Sonde zeigte, dass die Synthese von mRNA voller Länge in diesen Klonen äquivalente Werte aufwies. TABELLE 8
DCP 3 pPT 0176 1065 Aminosäuren MG: 91.966 Dalton
Beispiel 3 TABELLE 9
worin:
DCP4- UND DCP5-GENMONOMERKONSTRUKTIONEN
Drei doppelsträngige DNA-Abschnitte, die für (DB)₃ kodierten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, gereinigt und anelliert.
Die drei DNA-Abschnitte wurden separat kloniert. Der erste zweisträngige Abschnitt (5.A & 5.B) wurde an pPT 0138 ligiert, das vorher mit BanI-REN verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und für Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde mit Eco0109I- und StuI-RENs verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Plasmid-DNA, die ein DNA-Fragment geeigneter Größe enthielt, wurde sequenziert, und ein Klon, pPT 0221, wurde in nachfolgenden Konstruktionen verwendet.
Das zweite Paar von Oligonucleotidsträngen (5.C & 5.D) wurde mit pPT 0134 ligiert, das mit FokI-REN verdaut worden war. Nach einer Transformation von E. coli wurde Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien durch Verdau mit BanII- und StuI-RENs analysiert. DNAs, die durch beide Enzyme verdaut wurden, wurden sequenziert. Ein Klon, pPT 0222, wies die erwartete Sequenz auf und wurde für nachfolgende Konstruktionen verwendet.
Plasmid-DNA von pPT 0222 wurde mit FokI-REN verdaut, und das Fragment (54 bp), welches das zweite Paar Oligonucleotidstränge (5C & 5D) enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert, gefolgt von einer NACS-Reinigung. Dieses DNA-Fragment wurde mit pPT 0221 ligiert, das vorher mit BanI-REN verdaut worden war. Die Produkte der Ligation wurden in E. coli transformiert, und Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde nach Verdau mit DraIII- und StuI-RENs durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Ein Klon, pPT 0223, wurde nach einer DNA-Sequenzierung als Akzeptorvektor für das dritte synthetisierte DCP-Genfragment ausgewählt.
Das Plasmid pPT 0223 wurde mit BanI-REN verdaut und mit dem dritten Paar von Oligonucleotiden (5.E & 5.F) ligiert. Das Produkt der Ligationsreaktionen wurde in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und für Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Transformanten wurde gereinigt und mit FokI- und BanI-RENs verdaut. Klone, welche die korrekte Fragmentgröße enthielten, wurden sequenziert. Ein Klon, pPT 0224, der in Tabelle 10 gezeigt wird und die gewünschte Sequenz enthielt, wurde in nachfolgenden Konstruktionen der DCP4- und DCP5-Monomere verwendet. TABELLE 10
Plasmid-DNA von pPT 0224 wurde mit FokI- und BanI-RENs verdaut, und das Verdaufragment, das (DB)₃ trug, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und auf einer NACS-Säule gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde einer Eigenligation unterzogen und dann in pPT 0140 kloniert, das mit BanI-REN verdaut worden war. Die Produkte der Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Verdau mit FokI auf Inserts untersucht, die multiple (DB)₃-DNA-Fragmente enthielten. Es wurden Inserts unterschiedlicher Größen entdeckt, von (DB)₃ bis (DB)₁₂. Ein Klon, pPT 0229, enthielt die gewünschte DCP5-Monomersequenz C₂(DB)₆C₂ und wurde für nachfolgende Konstruktionen verwendet. Der Klon, der die DCP4-Genmonomersequenz C₂(DB)₁₂C₂ enthielt, war während der folgenden Schritte sehr instabil, wie sich während der Konstruktion von DCP1 zeigte. Danach wurde ein neues Plasmid konstruiert, das als Akzeptor für das DCP4-Genmonomerfragment diente.
Das Plasmid pACYC 184 (Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141–1156 (1977)) wurde mit BanI-REN verdaut, durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, und das DNA-Fragment, das etwa 2000 bp entsprach, wurde unter Verwendung einer NACS-Säule weiter gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase gefüllt (siehe Beispiel 1) und dann einer Eigenligation unterzogen. Die Produkte des Ligationsgemischs wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und auf Bakterienplatten selektiert, die 30 μg/ml Chloramphenicol enthielten. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Verdau mit Eco47III linearisiert. Ein Klon, pPT 0235, wurde als Akzeptorvektor für das DCP4-Monomer verwendet.
Die Plasmid-DNA, die das DCP4-Genmonomerfragment enthielt, wurde durch Verdau mit DraI- und PvuII-RENs isoliert, gefolgt von einer Agarosegelelektrophorese. Die Agarosescheibe, die das DCP4-Genmonomerfragment enthielt, wurde mit dem Plasmid pPT 0235 ligiert, das vorher mit Eco47III-REN verdaut worden war, und durch Agarosegelelektrophorese und eine NACS-Säule gereinigt. Die Produkte dieser Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm BH101 transformiert und auf Bakterienplatten, die 30 μg/ml Chloramphenicol enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde durch Verdau mit NruI- und EcoRV-RENs analysiert. Ein Klon, der das DCP4-Genmonomerfragment enthielt, pPT 0237, wurde für die Konstruktion des DCP4-Polymergens ausgewählt. Dieses Plasmid wurde in E. coli stabil aufrechterhalten.
DCP4-POLYMERGENKONSTRUKTION
Plasmid-DNA von pPT 0237 wurde mit Foki-REN verdaut. Das DNA-Fragment, welches das DCP4-Genmonomer enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und unter Verwendung einer NACS-Säule gereinigt (siehe Beispiel 1). Das Monomergenfragment wurde dann mit pSY 1262 ligiert, das vorher mit BanI-REN verdaut worden war, mit Phosphatase behandelt und durch Gelelektrophorese und eine NACS-Säule gereinigt. Die Ligationsprodukte wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert, und die Transformanten wurden zur Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Kanamycin in einer Menge von 50 μg/ml enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde gereinigt und auf eine multiple Insertion des DCP4-Genmonomerfragments untersucht. Mehrere Klone wurden erhalten, die eine, zwei oder vier Kopien des DCP4-Genmonomers enthielten. Die Plasmide pPT 0247, pPT 0248 und pPT 0249, die 1, 2 bzw. 4 Kopien des Genmonomers enthielten, wurden für eine Proteinexpressionsanalyse selektiert.
DCP4-PROTEINEXPRESSIONSANALYSE
Ein E.-coli-Stamm HB101, der die Plasmide pPT 0247, pPT 0248 und pPT 0249 enthielt, wurde bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 gezüchtet und dann 2,0 h lang auf 42°C verlagert. Die durch diese Zellen gebildeten Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse auf neue Proteinbanden untersucht, die mit DCP-C₂(A₂)-Peptid-spezifischen Antiseren reaktiv waren. Eine reaktive Bande, die dem Produkt voller Länge entsprach, wurde in jedem Klon entdeckt. DCP 4 pPT 0249 1065 Aminosäuren MG: 91.533 Dalton
DCP5-POLYMERGENKONSTRUKTION
Plasmid-DNA von pPT 0229, welches das DCP5-Genmonomer enthielt, wurde nach Verdau mit FokI-REN durch Elektrophorese isoliert, gefolgt von einer NACS-Reinigung. Das Genfragment wurde mit pSY 1262 ligiert, das mit BanI-REN verdaut worden war. Die Produkte der Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und für Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Kanamycin in einer Menge von 50 μg/ml enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde gereinigt und auf Inserts untersucht, die multiple Kopien der DCP5-Genmonomer sequenz C₂(DB)₆C₂ enthielten. Die Plasmide pPT 0231 und pPT 0232 enthielten drei bzw. vier Kopien des DCP5-Genmonomers und wurden für Expressionsanalysen verwendet.
DCP5-PROTEINEXPRESSIONANALYSE
Ein E.-coli-Stamm HB101, der die Plasmide pPT 0231 und pPT 0232 enthielt, wurde bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 gezüchtet und dann 2,0 h lang auf 42°C verlagert. Die durch diese Zellen gebildeten Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse auf neue Proteinbanden untersucht, die mit DCP-C₂A₂-Peptid-spezifischen Antiseren reaktiv waren. Eine reaktive Bande, die einem Produkt voller Länge entsprach, wurde in jedem Klon entdeckt. DCP 5 pPT 0232 633 Aminosäuren MG: 55.228 Dalton
DCP6-GENMONOMERKONSTRUKTION
Vier Oligonucleotidstränge, die für D₄ kodierten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, gereinigt und anelliert.
Das erste Oligonucleotidsegment, das aus den Strängen 6.A und 6.B bestand, wurde an pPT 0138 ligiert, das vorher mit BanI-REN verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und zur Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde mit Eco0109I und XmnI-RENs verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Plasmid-DNA, welche das Fragmente mit der korrekten Größe enthielt, wurde sequenziert, und ein Klon, pPT 0219, der die korrekte Sequenz enthielt, wurde für nachfolgende Konstruktionen verwendet.
Das Plasmid pPT 0219 wurde mit BanI- und Eco0109I-RENs verdaut und mit dem zweiten Paar von Oligonucleotiden (6.C und 6.D) ligiert. Die Produkte der Ligation wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert und zur Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von Transformanten wurde gereinigt und mit FokI- und BanI-RENs verdaut. Klone, welche die korrekte Fragmentgröße enthielten, wurden sequenziert. Ein Klon, pPT 0220, der die in Tabelle 11 enthaltene Sequenz enthielt, wurde in nachfolgenden Konstruktionen des DCP6-Genmonomers verwendet. TABELLE 11
Plasmid-DNA, welche die D₄-Sequenz enthielt, wurde mit FokI- und BanI-RENs verdaut, und das Verdaufragment, das D₄ enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert, gefolgt von einer NACS-Reinigung. Das gereinigte Fragment wurde einer Eigenligation unterzogen und dann mit dem DNA-Plasmid pPT 0140 ligiert, das mit BanI-REN verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden in einen E.-coli-Stamm BH101 transformiert und zur Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten, selektiert. Ein Transformant, pPT 0242, der das DCP6-Genmonomer ((D₄)₆, flankiert von C₂–C₂) enthielt, wurde für nachfolgende Konstruktionen verwendet.
DCP6–POLYMERGENKONSTRUKTION
Plasmid-DNA von pPT 0242 wurde mit FokI-REN verdaut. Das DNA-Fragment, welches das DCP6-Genmonomer enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und unter Verwendung einer NACS-Säule gereinigt. Das Monomergenfragment wurde dann mit pSY 1262 ligiert, das vorher mit BanI-REN verdaut worden war, mit Phosphatase behandelt und durch Gelelektrophorese und eine NACS-Säule gerei nigt. Die Ligationsprodukte wurden in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert, und die Transformanten wurden für Züchtung auf Bakterienplatten, die das Antibiotikum Kanamycin in einer Menge von 50 μg/ml enthielten, selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Kolonien wurde gereinigt und auf eine multiple Insertion der DCP6-Genmonomersequenz C₂D₂₄C₂ untersucht. Mehrere Klone wurden erhalten, die von einer bis vier Wiederholungen des DCP6-Genmonomers reichten. Die Plasmide pPT 0243, pPT 0244, pPT 0245 und pPT 0246, die 1, 2, 3 bzw. 4 Wiederholungen des Genmonomers enthielten, wurden für eine Proteinexpressionsanalyse selektiert.
DCP6-PROTEINEXPRESSIONSANALYSE
Ein E.-coli-Stamm HB101, der die Plasmide pPT 0243 bis pPT 0246 enthielt, wurde bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 gezüchtet und dann 2,0 h lang auf 42°C verlagert. Die durch diese Zellen gebildeten Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse auf neue Proteinbanden untersucht, die mit DCP-C₂A₂-Peptid-spezifischen Antiseren reaktiv waren. Ergebnisse siehe Tabelle 11. TABELLE 11
pPT 0246 1.065 Aminosäuren MG: 85.386 Dalton
EIGENSCHAFTEN VON GEREINIGTEM DCP6
Das Proteinpolymer DCP6 wurde in Multigrammmengen gereinigt, die von einem E.coli-Stamm pPT 0246 gebildet wurden, wobei herkömmliche Proteinreinigungs-, Extraktions- und Trennverfahren verwendet wurden. Das gefriergetrocknete Produkt war ein weißes, schwammartiges Material. Durch eine Analyse der Aminosäurezusammensetzung zeigte sich, dass das Material hauptsächlich aus den Aminosäuren Glycin, Alanin, Prolin und Glutamin bestand. Der prozentuelle Molgehalt an Glycin + Alanin + Prolin in den gesamten Aminosäuren betrug 82,8%. Das Molverhältnis zwischen Glycin, Alanin, Prolin und Glutamin betrug 1,95 : 0,89 : 1,00 : 0,89. Das theoretische Verhältnis dieser Aminosäuren für ein DCP6-Polymer ist 1,90 : 1,00 : 1,00 : 0,43.
Das gereinigte Produkt wurde getrocknet und auf seine Elementarzusammensetzung untersucht. Die chemische Analyse zeigte, dass das Produkt 50,5% Kohlenstoff, 6,78% Wasserstoff, 19,5% Stickstoff, 11,3% Wasser und weniger als 0,1% nichtbrennbare Asche enthielt. Die theoretische Elementarzusammensetzung von DCP6 ist 50,9% Kohlenstoff, 6,49% Wasserstoff und 20,2% Stickstoff. Diese Analysen zeigen, dass das getrocknete Produkt aus etwa 85,7% Protein besteht und dass etwa 98,6% dieses Proteins DCP6 ist.
Das getrocknete Produkt ist in Wasser extrem löslich. Lösungen mit 8 Gew.-% oder mehr können leicht hergestellt werden. Bei Raumtemperatur oder darüber sind solche Lösungen viskos, aber fließfähig. Bei Abkühlung auf 0°C bildet die Lösung ein festes Gel, das nicht fließt und halbdurchsichtig ist. Bei Erhitzen auf mehr als 28°C bildet das Gel eine dicke Lösung. Dieser thermoreversible Übergang zwischen den Flüssigkeits- und Gelphasen der Polymerlösung können ohne offensichtliche physikalische Veränderungen der Polymerstruktur wiederholt stattfinden.
PLASMID-pPT0285-KONSTRUKTION
Zwei Oligonucleotidstränge wurden wie in Beispiel 1 beschrieben snythetisiert und gereinigt:
Die beiden Oligonucleotidstränge wurden anelliert und mit der DNA des Plasmids pPT 0235 ligiert, das mit Eco47III- und SnaI-RENs verdaut worden war.
Das Produkt dieser Ligationsreaktion wurde in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von Transformanten wurde gereinigt und mit EcoRI- in Kombination mit Eco47III- oder SnaI- oder NruI-RENs verdaut. Plasmid-DNA von zwei Klonen, welche das korrekte Verdaumuster ergaben, wurde sequenziert. Ein Plasmid, das als pPT 0285 bezeichnet wurde, war korrekt und wurde für weitere Konstruktionen ausgewählt.
CLP-3.1-GENMONOMERKONSTRUKTION
Das synthetische Gen CLP 3.1 wurde aus kleineren Teilen zusammengesetzt. Zuerst wurden vier doppelsträngige Abschnitte einer DNA chemisch synthetisiert.
Die beiden Stränge von Fragment 3 wurden vor einer Anellierung unter Verwendung von 3'-Phosphatase-freier Polynucleotid-Kinase phosphoryliert (siehe Beispiel 1). Alle Fragmente wurden dann unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens individuell anelliert.
Fragment 1 wurde nach einer Anellierung mit PstI-REN verdaut; das Verdaugemisch wurde mit einer BioSpin-Säule behandelt, wie auch die phosphorylierten Fragment-3-Stränge behandelt worden waren. Alle vier Fragmente wurden dann auf ein 12% Polyacrylamidgel in 0,5 X TBE geladen, und die Banden, die doppelsträngiger DNA entsprachen, wurden durch UV-Abschirmung identifiziert, aus dem Gel herausgeschnitten und durch das Crush-and-Soak-Verfahren (Smith, Methods in Enzymology 65, 371–379 (1980)) extrahiert.
Die Fragmente wurden dann in pPT 0285 ligiert, das vorher mit BanI- und EcoRV-RENs verdaut worden war, und mithilfe einer NACS-Säule weiter gereinigt (siehe Beispiel 1). Das Produkt der Ligationsreaktion wurde in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von Transformanten wurden gereinigt und mit PvuII und SacII verdaut; Klone, die Inserts der korrekten Größe enthielten, wurden weiter mit EcoRI in Kombination mit mehreren Restriktionsendonucleasen analysiert, um die Gegenwart von einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen vor der Sequenzierung zu bestimmen. Ein Klon sah vielversprechend aus und wurde sequenziert. Das Plasmid pPT 0291 enthielt die in Tabelle 12 gezeigte Sequenz, die alle vier Fragmente enthielt, wies jedoch eine Deletion von 17 Basen in Fragment 3 auf, einschließlich der DraIII-Restriktionsstelle.
Dieses Plasmid wurde verwendet, um das Monomer CLP 3.1 zu konstruieren. Fragment 3 wurde mit Fragment 4 ligiert, wobei das HCC-Ligationsverfahren verwendet wurde (siehe Beispiel 1). Das Produkt des Ligationsgemischs wurde einer Elektrophorese in 2% niedrigschmelzendem Agarosegel unterzogen, und die Bande, die dem ligierten Produkt entsprach, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und mit pPT-0291-Plasmid-DNA ligiert, die vorher mit BanII- und SnaBI-RENs verdaut worden war, gefolgt von einer Reinigung durch eine Agarosegelelektrophorese und eine NACS-Säule.
Das Produkt der Ligationsreaktion wurde in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA von Transformanten wurde gereinigt und mit BamHI- und EcoRI-RENs verdaut; Klone, welche das korrekte Restriktionsmuster aufwiesen, wurden weiter mit BanII- oder DraIII-RENs analysiert; drei Klone, die Inserts der korrekten Größe enthielten, wurden sequenziert. Das Plasmid pPT 0292 enthielt die gewünschte CLP-3.1-Monomersequenz (siehe Tabelle 13).
CLP-3.1-POLMYERGENKONSTRUKTION
Plasmid-DNA pSY1262 wurde mit BanI-REN verdaut. Das Verdaugemisch wurde in zwei Aliquote geteilt. Eines wurde mit Kalb-Darmphosphatase behandelt, und die andere mit Alkalischer Garnelen-Phosphatase (SAP), wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Plasmid-DNA von pPT 0292 wurde mit BanI-REN verdaut, und die Verdaufragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Das CLP-3.1-Genfragment, 180 bp, wurde herausgeschnitten, mithilfe einer NACS-Säule gereinigt (siehe Beispiel 1) und danach wie oben beschrieben mit dem Plasmid pSY 1262 ligiert.
Das Produkt dieser Ligationsreaktion wurde in einen E.-coli-Stamm HB101 transformiert. Transformanten wurden aufgrund ihres Widerstandes gegenüber Kanamycin selektiert. Plasmid-DNA von einzelnen Transformanten wurde gereinigt und auf eine Größenzunahme aufgrund einer multiplen CLP-3.1-DNA-Insertion untersucht. Mehrere Klone wurden erhalten, die in ihrer Größe von etwa 1,0 kbp bis 3,0 kbp variierten. Fünf Klone pPT 0293 bis pPT 0297, die 6, 9, 11, 13 bzw. 17 Wiederholungen des Genmonomers enthielten, wurden für eine Proteinexpressionsanalyse selektiert.
CLP-3.1-PROTEINEXPRESSIONSANALYSE
Über Nacht gezüchtete Kulturen eines E.-coli-Stamms HB101, welche die bei 30 °C gezüchteten Plasmide pPT 0293 bis pPT 0297 enthielten, wurden separat zur Inokulation von 50 ml eines Mediums verwendet, das sich in einem 250 ml fassenden Kolben befand. Kanamycin wurde in einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt, und die Kulturen wurden unter Rühren (200 U/min) bei 30°C inkubiert. Als die Kulturen eine OD₆₀₀ von 0,8 erreichten, wurden 40 ml jeder Kultur in einen neuen Kolben transferiert, der auf 42°C vorgewärmt worden war, und bei derselben Temperatur etwa 2 h lang inkubiert. Die Kulturen (30°C und 42°C) wurden auf Eis abgekühlt, und die OD₆₀₀ wurde gemessen. Zellen wurden durch Zentrifugation entnommen und in Aliquote mit OD₆₀₀ = 1,0 getrennt, die dann verwendet wurden, um unter Verwen- dung von CLP-3.1-Peptid-spezifischen Antiseren Dot-Blot- und Western-Blot-Analysen durchzuführen (siehe Beispiel 1). Ergebnisse siehe Tabelle 14. Zur Reinigung und Aminosäureanalyse wurden größere Kulturen verwendet. TABELLE 14
Ein E.-coli-Stamm HB101, der die Plasmide pPT 0293 bis pPT 0297 enthielt, wurde wie oben beschrieben gezüchtet. Die durch diese Zellen gebildeten Proteine wurden durch SDS-PAGE analysiert, um die Reaktivität gegenüber CLP-3.1-Peptid-spezifischen Antiseren zu detektieren. Bei jeder Analyse wurde eine stark reaktive Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von jeweils 45 kD bis 130 kD beobachtet. pPT 0297 1077 Aminosäuren MG: 91.266 Dalton
Wie die obigen Ergebnisse zeigen können hochmolekulare collagenähnliche Polymere hergestellt werden. Die Polymere sind dadurch gekennzeichnet, dass sie Triadenwiederholungen aufweisen, wobei die erste Aminosäure jeder Triade Glycin ist. Durch eine Verringerung des prozentuellen Anteils von Prolinen im Vergleich zu natürlichem Collagen werden verschiedene nützliche collagenähnliche Polymere mit ähnlichen Eigenschaften wie Collagen gebildet, die jedoch einzigartige Merkmale aufweisen. Die Produkte werden als Folien, Fasern, Formgegenstände, mit anderen natürlichen oder synthetischen Polymeren vermischt verwendet oder als Beschichtungen auf Fasern, Folien, Laborzubehör oder anderen Oberflächen, z. B. Prothesen und dergleichen, verwendet.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patente sind bezeichnend für die Fachkenntnis von Fachleuten auf dem Gebiet, zu dem die vorliegende Erfindung zählt.
Obwohl die obige Erfindung durch Veranschaulichungen und Beispiele zum Zwecke besseren Verständnisses in gewissem Detail ausgeführt wurde, versteht sich, dass innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Ansprüche bestimmte Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können.

Claims

Collagenähnliches Polymer mit zumindest 30 kD, wie durch SDS-PAGE bestimmt, erhältlich durch Expression in einem einzelligen Organismus aus einem in vitro hergestellten Konstrukt, umfassend zumindest 60 Gew.-% Triaden mit Glycin als erster Aminosäure und zahlenmäßig zumindest 40%, wobei die Triaden zumindest ein Prolin umfassen, worin der zahlenmäßige Gesamt-Prolingehalt zwischen den Glycinen der Triaden weniger als 60% beträgt, das als zumindest zweimalig, entweder zusammenhängend oder nicht zusammenhängend, vorhandenes Motiv eine Sequenz der folgenden Formel aufweist: {(GXO)_nZ}_m worin: X und O so gewählt sind, dass das Motiv einen zahlenmäßigen Prolingehalt von ≤ 40% aufweist; Z 0 bis 50 Aminosäuren aufweist und keine Wiederholung von GXO ist; m zumindest 1 ist; n im Bereich von 4 bis 100 liegt; die Gesamtanzahl unterschiedlicher Triaden im (GXO)_n-Motiv zumindest 3 beträgt; und das Polymer eine collagenähnliche Eigenschaft aufweist, die aus der aus Helixbildung, reversibler Denaturierung und Gelbildung bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Collagenähnliches Polymer nach Anspruch 1, worin das Polymer weiteres dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Aminosäuresequenz Z und repetitive Einheiten (GUB) umfasst, worin die Aminosäuresequenz Z, die repetitiven Einheiten (GUB) und die repetitiven Einheiten (GXO)_n im Polymer verbunden sind, das durch die folgende Formel dargestellt ist: (GU^uB^b)_p{(GX^XO^o)_n(GU^uB^b)_p1Z^Z}_m ¹ worin: Z 0 bis 50 Aminosäuren aufweist und keine Wiederholung von GXO ist; z im Bereich von 1 bis m¹ liegt und anzeigt, dass maximal diese Anzahl an unterschiedlichen Z-Gruppen vorhanden ist; U und B beliebige Aminosäuren sind; u und b anzeigen, dass U und B in jeder Triade gleich oder voneinander verschieden sein können; x und o anzeigen, dass X und O in jeder Triade gleich oder voneinander verschieden sein können; p und p¹ gleich oder voneinander verschieden sein können und im Bereich von 1 bis 6 liegen können, mit der Ausnahme, dass p auch 0 sein kann; m¹ im Bereich von 1 bis 20 liegt; und n nicht über 100 liegt.
Collagenähnliches Polymer nach Anspruch 2, worin das Polymer weiters dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Aminosäuresequenz J umfasst, worin die Aminosäure), die Aminosäuresequenz Z, die repetitiven Einheiten (GUB) und die repetitiven Einheiten (GXO)_n im Polymer verbunden sind, das durch die folgende Formel dargestellt ist: ¹ _r[(GU^uB^b)p{(GX^xO^o)_n(GU^xB^b)_p ¹Z^Z}m¹J² _r worin: J¹ und J² gleich oder voneinander verschieden sind und Aminosäuresequenzen aus etwa 1 bis 50 Aminosäuren sind; und die r gleich oder voneinander verschieden sind und 0 oder 1 sind.
Collagenähnliches Polymer nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Polymer zumindest 75% Triaden mit Glycin als erster Aminosäure umfasst.
Collagenähnliches Polymer nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Polymer zumindest 10% der Aminosäuren an Prolin umfasst und nicht mehr als etwa 150 kD aufweist.
Collagenähnliches Polymer nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin zumindest ein GXO aus GAP, GPA, GPP, GAS, GPS oder GDP besteht, worin G Glycin ist, A Alanin ist, P Prolin ist, S Serin ist und D Asparaginsäure ist.
DNA-Sequenz, die für ein collagenähnliches Polymer nach einem der vorangegangenen Ansprüche kodiert.
DNA-Sequenz, umfassend: ein Gen, das für ein collagenähnliches Polymer nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert; eine Transkriptionsinitiationsregulationsregion, die in einem einzelligen Mikroorganismus am 5'-Ende des Gens funktionell ist; und eine Transkriptionsterminationsregulationsregion, die in einem einzelligen Mikroorganismus am 3'-Ende des Gens funktionell ist; worin das Gen unter der Transkriptionsregulation der Regulationsregionen steht.
Einzelliger Mikroorganismus, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 7 oder 8 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines collagenähnlichen Polymers nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Züchten eines einzelligen Mikroorganismus nach Anspruch 9 für ausreichende Zeit, damit das collagenähnliche Polymer exprimiert wird; und das Isolieren des collagenähnlichen Polymers.
Formgegenstand, der ein collagenähnliches Polymer nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.
Formgegenstand nach Anspruch 11, worin der Formgegenstand ein Gel, eine Folie oder eine Faser ist.