DE3887223T2 - Luciferase-Gen und neue rekombinante DNA sowie ein Verfahren zur Herstellung von Luciferase. - Google Patents
Luciferase-Gen und neue rekombinante DNA sowie ein Verfahren zur Herstellung von Luciferase.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Luciferase-Gen, das von Luciola cruciata gewonnen wird, eine neue rekombinante DNA, die das Luciferase-Gen darin eingefügt enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Luciferase.
- Luciferase wird aus Glühwürmchen, die zur Gattung Luciola gehören, in einfacher Weise erhalten, indem sie aus den gesammelten Glühwürmchen der Gattung Luciola [Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (7), 2799-2802 (1977)] isoliert und dann gereinigt wird.
- Luciferase ist ein äußerst nützliches Enzym, z.B. zur ATP- Analyse. Die oben beschriebene Luciferase wird aus Insekten gewonnen; zur Herstellung von Luciferase müssen allerdings Glühwürmchen, die zur Gattung Luciola gehören, aus der Natur gesammelt werden oder müssen Glühwürmchen gezüchtet werden; Luciferase soll dann aus den Glühwürmchen isoliert und gereinigt werden, so daß viel Zeit und viele Labore für die Produktion erforderlich sind.
- Als Ergebnis verschiedener Untersuchungen zur Lösung der vorstehenden Probleme haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, daß Luciferase durch Darstellung einer rekombinanten DNA, die DNA, die ein Gen, das Luciferase codiert in einer Vektor-DNA eingebaut enthält, und Züchten eines Luciferase-produzierenden Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und der die rekombinante DNA enthält, in einem Medium, in kurzer Zeit, und dergleichen, effektiv hergestellt werden kann. Bei weiteren Untersuchungen über das Luciferase-Gen, das aus Luciola cruciata gewonnen wird, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung auch einen Erfolg bei der Isolierung eines Luciferase-Gens, das aus Luciola cruciata gewonnen wird, und erstmals bei der Bestimmung seiner Struktur erzielt, und so die vorliegende Erfindung vollendet.
- Die W0-A-8703304 offenbart DNA-Zusammensetzungen, Verfahren zum Aufbau und Verwendung derselben, wobei sie aus DNA-Sequenzen, die Luciferase-Aktivität codieren, oder aus DNA-Sequenzen, die Hybridmoleküle codieren, die Luciferase-Aktivität und eine zweite biologische Aktivität aufweisen, bestehen, die für die Durchführung biologischer Versuche nützlich sind.
- Y. Kishi et al., Tetrahedrom Lett. 1968 (24), 2847-2850 beschreibt die Isolierung von Luciferin und Luciopterin aus dem japanischen Glühwürmchen Luciola cruciata.
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Luciferase- Gen, das eine Aminosäure-Sequenz gemäß Anspruch 1 und Anspruch 2 codiert.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue rekombinante DNA gemäß den Ansprüchen 3 bis 6.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Luciferase gemäß den Ansprüchen 7 bis 10.
- Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einem Luciferase-Gen, das eine Aminosäure-Sequenz codiert, die in Figur 4 dargestellt ist.
- Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einer neuen rekombinanten DNA, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gen, das Luciferase codiert, in eine Vektor-DNA eingebaut ist.
- Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht in einem Verfahren zur Herstellung von Luciferase, welches das Züchten eines Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA enthält, die ein Gen, das Luciferase codiert, in einer Vektor-DNA eingesetzt umfaßt, und der zu der Gattung Escherichia gehört, die fähig ist Luciferase zu produzieren, in einem Medium sowie Sammeln von Luciferase aus der Kultur umfaßt.
- Figur 1 zeigt eine Spaltungskarte rekombinanter Plasmid- pALf3-DNA mit Restriktionsenzymen.
- Figur 2 zeigt eine Spaltungskarte für rekombinante Plasmid-pALf1-DNA mit Restriktionsenzymen.
- Figur 3 zeigt eine Basensequenz des Luciferase-Gen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
- Figur 4 zeigt eine Aminosäure-Sequenz von Polypeptid, das aus dem Luciferase-Gen der vorliegenden Erfindung übersetzt wurde.
- Es ist bisher versucht worden, Luciferase aus Luciola cruciata zu isolieren; allerdings ist das Enzym an sich instabil und verursacht somit das Problem, daß es zum praktischen Gebrauch nur mit Schwierigkeiten bereitgestellt werden kann. Luciferase, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, hat den Vorteil, daß sie stabil ist und auch eine hohe Aktivität hat.
- Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
- Bei der Untersuchung von DNA, die ein Gen, das Luciferase von Luciola cruciata codiert, enthält, wird DNA, die ein Gen, das Luciferase, die von Photinus pyralis abgeleitet ist, codiert enthält als Probe verwendet. Daher wird die Herstellung der DNA unten beschrieben.
- Die Herstellung von m-RNA aus dem Schwanz von Photinus pyralis, welches ein Glühwürmchen ist, kann nach Verfahren durchgeführt werden, die beispielsweise in Molecular Cloning, Seite 196, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Haruo Ozeki und Reiro Shimura, BUNSHI IDENGAKU JIKKENHO (Experimental Molecular Genetics), Seiten 66-67 (1983), usw. beschrieben sind.
- Eine Konzentrierung von m-RNA, die Luciferase codiert, aus der gewonnenen m-RNA kann nach einem Verfahren erfolgen, das z.B. in Biomedical Research, 3 , 534-540 (1982), beschrieben ist, oder dgl.
- In diesem Fall wird ein Anti-Luciferase-Serum auf Luciferase verwendet. Dieses Serum kann beispielsweise nach Yuichi Yamamura, MEN-EKI KAGAKU (Immunochemistry), Seiten 43-50 (1973) usw. erhalten werden.
- Eine Synthese von c-DNA aus m-RNA, die Luciferase codiert, kann nach Verfahren durchgeführt werden, die beispielsweise in Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982) und Gene, 25, 263 (1983) beschrieben sind.
- Dann wird die so erhaltene c-DNA z.B. in Plasmid pMCE10- DNA [Plasmid, das unter Verwendung von Plasmid pKN 305 (Plasmid, das einen Promotor aus Escherichia coli- Tryptophan-Operator, beschrieben in Agr. Biol. Chem., 50, 271 (1986), hat) und Plasmid pMC 1843 [Plasmid, das Escherichia coli-β-galactosidase-Strukturgen, beschrieben in Methods in Enzymology, 100, 293-308 (1983) enthält) hergestellt wird] eingefügt, um verschiedene rekombinante Plasmid-DNAs zu erhalten. Unter Verwendung dieser DNAs wird die Transformation von Escherichia coli (E. coli) DHl (ATCC 33849), Escherichia coli (E. coli) HB 101 (ATCC 33694) nach dem Verfahren von Hanahan [DNA Cloning, 1, 109-135 (1985)] unter Erhalt verschiedener Transformanten durchgeführt.
- Die rekombinanten Plasmid-DNAs, die durch die so gewonnenen Transformanten erhalten werden sind Plasmide, in denen c-DNA in der Mitte des Escherichia coli-β- Galactosidase-Strukturgens eingebaut worden ist. Ein Peptid, das durch c-DNA codiert ist, wird als Protein, das mit β-Galactosidase verbunden ist, exprimiert.
- Um c-DNA, die Luciferase codiert, unter den verschiedenen oben beschriebenen Transformanten nachzuweisen, werden die Transformanten gezüchtet, wodurch Zellprotein exprimiert wird. Der Nachweis kann durchgeführt werden, indem bestimmt wird, ob irgendein Crossing-over-Anti-Luciferase- Serumprotein vorliegt. Verfahren, die beispielsweise in Agric. Biol. Chem., 50, 271 (1986) und Anal. Biochem., 112, 195 (1981) usw. beschrieben sind, können zum Nachweis verwendet werden.
- Nach Markierung der c-DNA von unvollständiger Luciferase mit ³²P kann als nächstes nach dem Nick- Translationsverfahren [Molecular Cloning, Seiten 109-112, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) und J. Mol. Biol., 113, 237-251 (1977)] unter Verwendung des Kolonie- Hybridisierungsverfahrens [Protein, Nucleic Acid & Enzyme, 26, 575-579 (1981)] ein Escherichia coli-Stamm erhalten werden, der Plasmid-DNA hat, die Photinus pyralis- Luciferase-c-DNA von 1,8 Kb enthält, aus einer von Photinus pyralis gewonnenen c-DNA-Library, die unter Verwendung von Plasmid pUC19 DNA (hergestellt durch Takara Shuzu Co., Ltd.) als Vektor hergestellt wird, erhalten.
- Um die gereinigte Plasmid-DNA zu erhalten wird beispielsweise ein Verfahren verwendet, das in Proc. Natl. Acad. Sci., 62, 1159-1166 (1966), beschrieben ist, verwendet.
- Um DNA, die das Gen, das von Photinus pyralis abgeleitete Luciferase codiert, enthält, aus der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA zu erhalten, werden Restriktionsenzyme wie z.B. EcoR I und Cla I auf die Plasmid-DNA bei Temperaturen von 30 bis 40ºC, vorzugsweise bei 37ºC 1-24 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden einwirken gelassen; die nach Beendigung der Reaktion erhaltene Lösung wird einer Elektrophorese auf Agarose-Gel unterworfen, [welche in Molecular Cloning, Seite 150, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben ist], um DNA zu erhalten, die das Gen enthält, das von Photinus pyralis abgeleitete Luciferase codiert.
- Als nächstes wird die Herstellung des Luciferase-Gen und dergleichen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung beschrieben.
- Zunächst einmal kann eine Quelle, aus der das Gen, das Luciferase codiert, gewonnen wird irgendeine Quelle sein, erwähnt werden kann beispielsweise Luciola cruciata, usw. Besonders bevorzugt ist der Schwanzteil dieses Glühwürmchens. Die Herstellung von m-RNA aus dem Schwanz des Glühwürmchens und die Synthese von c-DNA aus in-RNA kann beispielsweise in der ganz gleichen Weise wie bei der Herstellung von m-RNA von Photinus pyralis und der Synthese von c-DNA, die oben beschrieben wurde, durchgeführt werden.
- Dann wird die so erhaltene c-DNA in eine Vektor-DNA z.B. Plasmid pUC19-DNA (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.) eingebaut, um verschiedene rekombinante Plasmid-DNAs zu erhalten. Unter Verwendung dieser DNAs wird eine Transformation von Escherichia coli (E. coli) DHl (ATCC 33849), Escherichia coli (E. coli) HB 101 (ATCC 33694) nach dem Verfahren von Hanahan [DNA Cloning, 1, 109-135 (1985)] unter Erhalt verschiedener Transformanten durchgeführt.
- Nach der Markierung der DNA, die das Gen enthält, welches die aus Photinus pyralis isolierte Luciferase codiert, mit ³²P kann durch das Nick-Translations-Verfahren [Molecular Cloning, Seiten 109-112, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) und J. Mol. Biol., 113, 237-251 (1977)] unter Verwendung des Kolonien-Hybridisierungsverfahrens [Protein Nucleic Acid & Enzyme, 26, 575-579 (1981)] ein Escherichia coli-Stamm aus der Gen-Library aus Luciola cruciata abgeleiteter c-DNA erhalten werden, der eine Plasmid-DNA hat, die eine Luciola cruciata-Luciferase-c-DNA von 2,0 Kb enthält.
- Um die gereinigte Plasmid-DNA zu erhalten, wird beispielsweise ein Verfahren, das in Proc. Natl. Acad. Sci., 62, 1159-1166 (1969), usw. beschrieben wird, verwendet.
- Bei Einwirkung von z.B. Restriktionsenzym Pst I (hergestellt durch Takara Shuzu Co., Ltd.) auf gereinigte Plasmid-DNA bei einer Temperatur von 30ºC oder höher, vorzugsweise bei 37ºC, bei einer Enzymkonzentration von 200 bis 400 Einheiten pro ml 1-4 Stunden, vorzugsweise 4 Stunden lang, um einen Aufschluß zu bewirken, wird ein DNA-Bruchstücke-Gemisch erhalten.
- Die Isolierung von DNA, die das Gen, das aus Luciola cruciata gewonnene Luciferase codiert, enthält, aus dem oben beschriebenen DNA-Fragment-Gemisch kann in gleicher Weise durchgeführt werden wie die Isolierung von DNA, die das Gen enthält, das die von Photinus pyralis gewonnene Luciferase codiert.
- Als nächstes wird durch Einwirkung eines Restriktionsenzyms z.B. Ssp I (hergestellt von New England Biolab Co., Ltd.) auf die Plasmid-DNA, die c-DNA enthält, die Luciola cruciata-Luciferase von 2,0 Kb codiert, in üblicher Weise eine DNA erhalten, die c-DNA, die Luciferase von 1,6 Kb codiert enthält. Die DNA wird in eine Vektor-DNA eingebaut, um so eine neue rekombinante DNA zu ergeben.
- Als die oben genannte Vektor-DNA kann irgendeine Vektor- DNA verwendet werden. Erwähnt werden kann beispielsweise Plasmid-Vektor-DNA, Bacteriophagen-Vektor-DNA. Spezifische Beispiele sind pUC 18 (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.), pUC 19 (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.), λcI857h80attλsRiλ&sup0;&sub3;sRIλ&sup0;&sub2;sRIλ&sup0;&sub1; (beschrieben in der japanischen Patentanmeldung 61-37917).
- Unter Verwendung der so erhaltenen neuen rekombinanten DNA wird ein Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia, z.B. Escherichia coli JM 101 (ATCC 33876) oder dergleichen, gehört, nach dem Verfahren von Cohen et al. [J. Bac., 119, 1072-1074 (1974)] transformiert oder nach dem in Molecular Cloning, S. 256-268, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschriebenen Verfahren einer Transfection unterzogen, um einen Luciferase- produzierenden Organismus zu erhalten, der zur Gattung Escherichia gehört und der die neue rekombinante DNA enthält, die das Luciferase-codierende Gen in eine Vektor- DNA eingebaut enthält.
- Um eine gereinigte neue rekombinante DNA aus dem auf diese Weise erhaltenen Mikroorganismus zu gewinnen, wird beispielsweise ein Verfahren benutzt, das in Proc. Natl. Acad. Sci., 62, 1159-1166 (1969) beschrieben ist, usw.
- Bei Einwirkung z.B. eines Restriktionsenzyms Pst I (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.) auf die gereinigte neue rekombinante DNA, die oben beschrieben ist, bei einer Temperatur von 30ºC oder höher, vorzugsweise bei 37ºC bei einer Enzymkonzentration von 200 bis 400 Einheiten pro ml für 1 bis 4 Stunden, vorzugsweise 4 Stunden, um einen Aufschluß zu bewirken, wird ein DNA- Fragment-Gemisch erhalten.
- Die Isolierung von DNA, die das Gen enthält, das von Luciola cruciata abgeleitete Luciferase codiert, aus dem DNA-Fragment-Gemisch kann in genau der gleichen Weise durchgeführt werden wie die Isolierung von DNA, die das Gen enthält, das von Photinus pyralis gewonnene Luciferase codiert.
- Als nächstes wird der oben beschriebene Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet und Luciferase aus der Kultur gesammelt.
- Es kann irgendein Medium verwendet werden, sofern es zur Kultur von Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia gehören, verwendet wird. Erwähnt werden kann beispielsweise 1% (Gewicht/Volumen) Tripton, 0,5% (Gewicht/Volumen) Hefeextrakt, 0,5% (Gewicht/Volumen) NaCl und 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid.
- Die Temperatur für die Züchtung liegt zwischen 30 und 40ºC, vorzugsweise bei etwa 37ºC, ein Züchtungszeitraum ist beispielsweise 4 bis 8 Stunden, vorzugsweise etwa 4 Stunden.
- Die Zellen aus der Kultur werden durch Zentrifugieren bei 8000 Upm für etwa 10 Minuten gesammelt. Die erhaltenen Zellen werden nach dem in beispielsweise Methods in Enzymology, 133, 3-14 (1986) beschriebenen Verfahren homogenisiert, um eine Rohenzym-Lösung zu erhalten.
- Die Rohenzym-Lösung kann verwendbar sein so wie sie ist; wenn notwendig und erwünscht, kann die Rohenzym-Lösung durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, hydrophober Chromatographie, z.B. unter Verwendung von Butyl-Toyo- Pearl 650 C usw., durch Gelfiltration unter Verwendung z.B. von Ultrogel AcA 34 gereinigt werden, wodurch gereinigte Luciferase erhalten wird.
- Die physikochemischen Eigenschaften der so erhaltenen Luciferase waren die gleichen, wie die, die in Photochem. Photobiol., 42, 609-611 (1985) beschrieben sind.
- Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht, kann Luciferase erfindungsgemäß in äußerst kurzer Zeit hergestellt werden, indem der Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört, welche die rekombinante DNA enthält, die das Luciferase-Gen der vorliegenden Erfindung eingebaut enthält. Daher ist die vorliegende Erfindung vom industriellen Standpunkt aus äußerst nützlich.
- Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
- In den folgenden Punkten 1 bis 10 wird die Herstellung von DNA, die ein Gen enthält, das Luciferase von Photinus pyralis als einem der Glühwürmchen codiert, (diese DNA wird als Probe bei der Untersuchung von DNA, die ein Gen enthält, das Luciferase von Luciola cruciata codieft, verwendet) beschrieben.
- Unter Verwendung von Mörser und Pistill wurden 1 g trockene Schwänze (hergestellt von Sigma Co., Ltd.) von Photinus pyralis als einer Glühwürmchen-Art kräftig homogenisiert, zur Auflösung wurden 5 ml Puffer zugesetzt [20 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,4)/10 mM NaCl/3 mM Magnesiumacetat/5% (Gewicht/Volumen) Saccharose/1,2% (Volumen/Volumen) Triton X-100/10 mM Vanadyl-Nucleosid Komplex (hergestellt von New England Biolap. Co., Ltd.)]. Das Gemisch wurde in der oben beschriebenen Weise weiter homogenisiert, wobei eine Lösung, die den homogenisierten Schwanz von Photinus pyralis enthielt, erhalten wurde.
- In einen Tiegelmischer (hergestellt von Nippon Seiki Seisakusho) wurden 5 ml der so erhaltenen Lösung gefüllt. Nach 5-minütiger Behandlung bei 5000 Upm wurden 12 ml Guanidinisothiocyanatlösung (6 M Guanidinisothiocyanat/37,5 mM Natriumcitrat (pH 7,0)/0,75% (Gewicht/Volumen) Natrium-N-Lauroyl-Sarkosin/0,15 M β- Mercaptoethanol) dem System zugesetzt. Das Gemisch wurde mit dem oben beschriebenen Mischer 10 Minuten bei 3000 Upm behandelt. Die resultierende Lösung wurde unter Verwendung eines 3-fachen Gaze unter Erhalt des Filtrates filtriert. Das Filtrat wurde sorgsam in Schichten auf 4 Rohre für die Ultrazentrifuge (hergestellt von Hitachi Koki Co., Ltd.), in welche jeweils 1,2 ml 5,7 M Caesiumchlorid-Lösung vorher in Schichten gegeben wurde, gegossen. Unter Verwendung der Ultrazentrifuge (hergestellt von Hitachi Koki Co., Ltd, SCP55H) wurde eine Zentrifugierung bei 30000 Upm für 16 Stunden vorgenommen, um so Präzipitate zu erhalten.
- Die erhaltenen Präzipitate wurden mit gekühltem 70%-igem (V/V) Ethanol gewaschen und in 4 ml 10 mM Tris-Puffer [10 mM Trishydrochlorid (pH 7,4)/5 nM EDTA/1% Natrium- Dodecylsulfat] suspendiert. Es wurde die gleiche Menge eines Gemisches aus n-Butanol und Chloroform (1:4, Volumenverhältnis) dem Gemisch zugesetzt, um eine Extraktion durchzuführen. Der Extrakt wurde 10 Minuten lang bei 3000 Upm in üblicher Weise zentrifugiert, um eine Trennung in wässrige Phase und organische Lösungsmittelphase durchzuführen. Zu der organischen Lösungsmittelphase wurden 4 ml 10 mM Trispuffer, der oben beschrieben ist, gegeben. Die Extraktions und Separations-Arbeitsschritte, die oben beschrieben sind, wurden zweimal wiederholt. Zu der erhaltenen wässrigen Phase wurde 1/10 der Menge 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und eine zweifache Menge kaltes Ethanol gegeben. Nach zweistündigem Stehenlassen bei einer Temperatur von -20ºC wurde das Gemisch 20 Minuten lang bei 8000 Upm in üblicher Weise zentrifugiert, um RNA auszufällen. Die erhaltene RNA wurde in 4 ml Wasser gelöst. Nach dem oben beschriebenen Arbeitsgang zur Ausfällung mit Ethanol wurde die erhaltene RNA in 1 ml Wasser gelöst, wobei 3,75 mg RNA erhalten wurden.
- Durch Wiederholung der vorstehenden Arbeitsgänge wurden insgesamt 7 mg RNA hergestellt. Um m-RNA aus der RNA zu selektieren, wurden 7 mg RNA der Säulenchromatographie mit Oligo-(dT)-Cellulose (hergestellt von New England Biolab Co., Ltd.) unterworfen.
- Als Säule wurde eine 2,5 ml Terumo-Spritze (hergestellt von Terumo Co., Ltd.) verwendet. Nachdem 0,5 g Harz mit Elutionspuffer [10 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,6)/1 mM DETA/0,1% (Gew./V) Natriumdodecylsulfat] gequollen war, wurde das Harz in die Säule gepackt und mit Bindungspuffer [10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,6)/1 mM DETA/0,4 M NaCl/0,1% (Gew./V) Natriumdodecylsulfat] äquilibriert.
- Zu 7 mg RNA wurde die gleiche Menge Puffer [10 mM Tris- Hydrochlorid (pH 7,6)/1 mM DETA/0,8 M NaCl/0,1% (Gew./V) Natriumdodecylsulfat] gegeben. Das Gemisch wurde bei einer Temperatur von 65ºC 10 Minuten lang hitzebehandelt und dann in Eiswasser abgeschreckt. Nachdem es der Oligo(dT)- Cellulose-Säule unterworfen worden war, wurde das Harz mit Bindungspuffer gewaschen, um ungebundene r-RNA und t-RNA auszuwaschen. Außerdem wurde m-RNA mit Elutionspuffer eluiert, wobei 40 um m-RNA erhalten wurden.
- Es wurde ein Saccharose-Dichte-Gradient von 10 bis 25% (Gew./V) hergestellt, indem 0,5 ml 40%-iger (Gew./V) Saccharoselösung [50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5)/20 mM NaCl/1 mM EDTA/40% (Gew./V) Saccharose] in ein Polyaroma-Rohr für einen Rotar SW 41, hergestellt von Beckmann Co., Ltd., gefüllt wurden, wobei jeweils 2,4 ml 25%-ige (Gew./V), 20%-ige (Gew./V), 15%-ige (Gew./V) und 10%-ige (Gew./V) Saccharoselösung in Schichten aufgebracht wurden und das System bei einer Temperatur von 4ºC 24 Stunden lang stehengelassen wurde. Auf den Saccharose- Dichtegradienten wurden 30 ug m-RNA unter Bildung einer Schicht aufgebracht. Unter Verwendung eines SW 41 Rotars, hergestellt von Beckmann Co., Ltd., wurde eine Zentrifugation bei 30000 Upm bei einer Temperatur von 18ºC 18 Stunden lang in üblicher Weise durchgeführt. Nach dem Arbeitsgang des Zentrifugierens wurden jeweils 0,5 ml fraktioniert und nach dem Ethanol-Präzipitationsverfahren wurde m-RNA isoliert und in 10 ul Wasser gelöst.
- Als nächstes wurde das Protein, das durch m-RNA codiert ist, untersucht, wodurch die auf m-RNA von Luciferase konzentrierte Fraktion identifiziert wurde. 1 ul fraktionierte RNA, 9 ul Hasen-Reticular-Erythrocyten-Lysat (hergestellt von Amersham Co., Ltd.) und 1 ul [³&sup5;S] Methionin (hergestellt von Amersham Co., Ltd.) wurden gemischt und bei einer Temperatur von 30ºC 30 Minuten lang umgesetzt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 150 ul NET- Puffer [150 mM NaCl/5 mM EDTA/0,02% (Gew./V) NaN&sub3;/20 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,4)/0,05% (Gew./V) Nonidet P-40 (hergestellt von Besesda Research Laboratories Co., Ltd., oberflächenaktives Mittel)] und 1 ul Anti- Luciferase-Serum (Herstellung wird später beschrieben) gegeben. Nach 30-stündigem Stehenlassen bei einer Temperatur von 20ºC wurden 10 mg Protein-A-Sepharose (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals Inc.) dem Gemisch zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde dann 1 Minute lang bei 12000 Upm in üblicher Weise zentrifugiert, um das Harz zu isolieren.
- Das isolierte Harz wurde dreimal mit 200 ul NET-Puffer gewaschen. Dem Harz wurden 40 ul Probenpuffer für SDS-PAGE [62,5 mM Tris-Hydrochlorid-puffer (pH 6,8)/10% (V/V) Glycerin/2% (Gew./V) Natriumdodecylsulfat/5% (V/V) Mercaptoethanol/0,02% (Gew./V) Bromphenol-Blau] zugesetzt. Das Gemisch wurde bei einer Temperatur von 100ºC 3 Minuten lang gekockt und 1 Minute bei 12000 Upm in üblicher Weise zentrifugiert, um den Uberstand zu isolieren. Die gesamte Menge wurde auf 7,5% (Gew./V) Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
- Es wurde ein Gelelektrophorese nach dem Verfahren von Laemmli [Nature, 227, 680 (1970)] durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel für 30 Minuten in 10% (V/V) Essigsäure getaucht, um Protein zu imobilisieren. Dann wurde das Gel für 30 Minuten in Wasser getaucht und außerdem 30 Minuten lang in eine 1 M Natriumsalicylat- Lösung getaucht; dann wurde es unter Erhalt eines trockenen Gels getrocknet. Das trockene Gel wurde der Fluorographie unterworfen, wobei ein Röntgenfilm (hergestellt durch Fuji Photo Film Co., Ltd., RX) verwendet wurde.
- Aus den vorhergehenden Arbeitsschritten wurde die Bande von Luciferaseprotein nur in dem Fall auf dem Röntgenfilm erkannt, wo RNA in der Fraktion, in welcher Luciferase-m-RNA vorlag verwendet wurde; die Fraktion, in der die Luciferase-m-RNA konzentriert war, konnte identifiziert werden.
- Hasen-Anti-Luciferase-Serum auf gereinigte Luciferase wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- 0,7 ml Luciferase-Lösung, die eine Konzentration von 3,2 mg/ml hatte [Lösung wurde erhalten durch Lösen von Luciferase, hergestellt durch Sigma Co., Ltd. in 0,5 M Glycylglycin-Lösung (pH 7,8)], wurden in einer äquivalenten Menge von Freund's vollständigem Adjuvans suspendiert. 2,24 mg der Suspension wurden in die Pfote eines japanischen weißen Hasen mit einem Gewicht von 2 kg als Antigen verabreicht. Nach zweiwöchigem Füttern wurde die gleiche Menge Antigen wie am Anfang intrakutan in den Rücken verabreicht. Nach weiterem einwöchigem Füttern wurde ein ähnlicher Vorgang wiederholt. Nach einer weiteren Woche Füttern wurde das gesamte Blut gesammelt.
- Das erhaltene Blut wurde 18 Stunden lang bei einer Temperatur von 4ºC stehengelassen und bei 3000 Upm 15 Minuten lang in herkömmlicher Weise zentrifugiert, wobei Anti-Luciferase-Serum als Überstand erhalten wurde.
- Die Synthese von c-DNA wurde unter Verwendung eines Kits, die von Amersham Co., Ltd. hergestellt wurde, durchgeführt.
- Unter Verwendung von 2 ug m-RNA, die wie oben beschrieben erhalten worden war, wurde die Synthese von c-DNA in Übereinstiminung mit den Verfahren, die in Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982) und Gene, 25, 263 (1983) beschrieben sind, durchgeführt. Als Ergebnis wurden 300 ng Doppelstrang-c-DNA erhalten.
- Diese c-DNA, 150 ng, wurden in 7 ul TE-Puffer [10 mM Tris- Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5)/1 mM EDTA] gelöst. Der Lösung wurden 11 ul einer Mischung [280 mM Natriumcacodylat (pH 6,8)/60 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 6,8)/2 mM Kobaltchlorid] und 3,8 ul Tailing-Mischung [7,5 ul 10 mM Dithiothreitol/ 1 ul 10 ng/ml Poly(A)/2 ul 5 mM dCTP/110 ul Wasser] zugesetzt. Außerdem wurden 29 Einheiten terminale Transferase (hergestellt von Boehringer Mannheim AG) dem Gemisch zugesetzt. Nach 10-minütiger Reaktion bei einer Temperatur von 30ºC wurden dem Gemisch zur Unterbrechung der Reaktion 2,4 ul 0,25 M EDTA und 2,4 ul 10%-iges (Gew./V.) Natriumdodecylsulfat zugesetzt.
- Die Lösung, deren Reaktion unterbrochen worden war, wurde einer Behandlung zur Entfernung von Protein unter Verwendung von 25 ul Wasser gesättigtem Phenol unterworfen. Dann wurden 25 ul 4 M Ammoniumacetat und 100 ul kaltes Ethanol zu der abgetrennten wässrigen Lösung gegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei einer Temperatur von -70ºC stehengelassen und 10 Minuten bei 12000 Upm zentrifugiert, um c-DNA zu isolieren. c-DNA wurde in 10 ul TE-Puffer unter Erhalt einer c-DNA-Lösung gelöst.
- Wie oben beschrieben, wurden 100 ng c-DNA mit dem Deoxycytidin-Ende erhalten.
- Plasmid pKN305 DNA, hergestellt nach dem Verfahren, das von T. Masuda et al., Agricultural Biological Chemistry, 50, 271-279 (1986) beschrieben ist, unter Verwendung von Escherichia coli W3110 Stamm (ATCC 27325) und Plasmid pBR 325 (hergestellt von BRL Co.) und Plasmid pBR 322-DNA (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.), wie auch pMC 1403-3 DNA (beschrieben in der japanischen Patent- Offenlegungsschrift 61-274683) wurden zu je ug zu 10 ul einer Mischung [50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5)/10 mM MgCl&sub2;/100 mM NaCl/1 mM Dithiothreitol] gegeben. Darüberhinaus wurden je 2 Einheiten Hind III und Sal I (beide von Takara Shuzu Co., Ltd. hergestellt) dem Gemisch zugesetzt. Durch einstündige Reaktion bei einer Temperatur von 37ºC wurde eine Spaltungsbehandlung durchgeführt. Eine Extraktion mit Phenol und Präzipitation mit Ethanol wurden in üblicher Weise durchgeführt, um Präzipitate zu erhalten. Die Präzipitate wurden in 10 ul Ligationspuffer gelöst [20 mM MgCl&sub2;/66 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,6)/1 mM ATP/15 mM Dithiothreitol], wobei eine Lösung erhalten wurde. Außerdem wurde eine Einheit T4DNA-Ligase (hergestellt durch Takare Shuzo Co., Ltd.) zugesetzt, um bei einer Temperatur von 20ºC für 4 Stunden eine Ligation durchzuführen. Unter Verwendung dieser Reaktionslösung wurde dann Escherichia coli JM 101 (ATCC 33876) nach dem Transformationsverfahren, das in [J. Bacteriology, 119, 1072-1074 (1974)] beschrieben ist, transformiert. Nach Prüfung der chemischen Resistenz (Ampicillin-Resistenz und Tetracyclin-Resistenz) sowie der β-Galactosidase-Aktivität wurde ein Transformant erhalten. Die rekombinante Plasmid- DNA, die in dem Stamm enthalten war, wurde pMCE 10 genannt. Escherichia coli, Stamm JM 101, der diese rekombinante Plasmid-DNA, pMCE 10-DNA enthielt, wurde in einem Medium, das aus 1% (Gew./V) Tripton, 0,5% (Gew./V) Hefeextrakt und 0,5% (Gew./V) NaCl bestand, bei einer Temperatur von 37ºC 16 bis 24 Stunden lang kultiviert. 20 ml der so erhaltenen Kulturlösung von Escherichia coli JM 101 (pMCE 10) wurde zum Beimpfen von 1 l des Mediums verwendet, anschließend erfolgte eine Schüttelkultur bei einer Temperatur von 37ºC 3 Stunden lang. Nach Zusatz von 0,2 g Chloramphenicol wurde die Kultivierung bei der gleichen Temperatur für weitere 20 Stunden fortgesetzt, um so eine Kulturlösung zu erhalten.
- Danach wurde die Kulturlösung bei 6000 Upm 10 Minuten lang in herkömmlicher Weise zentrifugiert, wobei 2 g nasse Zellen erhalten wurden. Nachdem die Zellen in 20 ml 350 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 8,0), der 25% (Gew./V) Saccharose enthielt, wurden 10 mg Lysozym, 8 mg 0,25 M EDTA-Lösung (pH 8) und 8 ml 20%-iges (Gew./V) Natriumdodecylsulfat zu der Suspension gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei einer Temperatur von 60ºC gehalten, um so eine Lysatlösung zu ergeben.
- Der Lysatlösung wurden 13 ml 5 M NaCl-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde bei einer Temperatur von 4ºC 16 Stunden lang behandelt und dann bei 15000 Upm in üblicher Weise zentrifugiert, um einen Extrakt zu erhalten. Der Extrakt wurde in üblicher Weise einer Extraktionsbehandlung mit Phenol und einer Präzipitationsbehandlung mit Ethanol unterworfen, wobei Präzipitate entstanden.
- Dann wurden die Präzipitate unter reduziertem Druck in herkömmlicher Weise getrocknet und in 10 mM Tris- Hydrochloridpuffer (pH 7,5) der 1 mM EDTA enthielt, gelöst. Außerdem wurden der Lösung 6 g Caesiumchlorid und 0,2 ml Ethydiumbromid-Lösung (10 mg/ml) zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde einer Zentrifugationsbehandlung mit äquilibriertem Dichtegradienten unterzogen, und zwar unter Verwendung einer Ultrazentrifuge bei 39000 Upm 42 Stunden lang in herkömmlicher Weise, um rekombinante Plasmid-pMCE10-10-DNA zu isolieren. Nach der Entfernung von Ethydiumbromid unter Verwendung von n-Butanol wurde eine Dialyse mit 10 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA pro 500 ug gereinigte rekombinante Plasmid pMCE 10-DNA enthielt.
- 15 ug der so erhaltenen rekombinanten Plasmid pMCE 10-DNA wurden in 90 ul TE-Puffer, der unter Punkt 4 beschrieben wurde, gelöst. Nach Zusattz von 10 ul Med-Puffer [100 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5)/10 mM MgCl&sub2;/10 mM Dithiothreitol/500 mM NaCl] wurden 30 Einheiten Restriktionsenzym Acc I (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.) dem Gemisch zugesetzt. Bei einer Temperatur von 37ºC wurde eine Spaltungsbehandlung 1 Stunde lang durchgeführt, um das Spaltprodukt zu erhalten. Dem Spaltprodukt wurden 100 ul Wasser-gesättigtes Phenol zugesetzt, wodurch Protein entfernt wurde. Dann wurde die wässrige Phase isoliert und eine 1/10 ihrer Menge 3 M Natriumacetat (pH 7,5) und die 2-fache Menge kaltes Ethanol zu der wässrigen Phase gegeben. Nach 15-minütigem Stehenlassen bei einer Temperatur von -70ºC wurde das Gemisch bei 12000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert, um DNA zu gewinnen.
- Diese DNA wurde in 10 ul TE-Puffer gelöst; 15 ml eines Gemisches [280 mM Natriumcacodylat (pH 6,8)/60 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 6,8)/2 mM Kobaltchlorid] wurden der Lösung zugesetzt. Ferner wurde 5 ul einer Tailing- Lösung (in Punkt 4 beschrieben) (5 mM dGTP wurden anstatt 5 mM dCTP verwendet) dem Gemisch zugesetzt. Darüberhinaus wurden 5 Einheiten terminale Transferase (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.) zugegeben, um das Ganze dann 15 Minuten bei einer Temperatur von 37ºC reagieren zu lassen. Durch eine Nachbehandlung in ähnlicher Weise wie bei der DNA-Tailing's-Reaktion, die in Punkt 4 beschrieben ist, wurde DNA mit dem Deoxyguanosin-Ende an der Acc I-Stelle der rekombinanten Plasmid pMCE 10-DNA hergestellt.
- Außerdem wurde zur gleichen Zeit die Herstellung von DNA mit einem Deoxyguanosin-Ende an der Pst I-Stelle von Plasmid pUC 19 DNA durchgeführt.
- Zu einer Lösung von 30 ug Plasmid pUC 19-DNA (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.) in 350 ul TE-Puffer wurden 40 ul Med-Puffer und 120 Einheiten Restrictionsenzym Pst I (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.) gegeben. Nach einer 1-stündigen Spaltungsbehandlung bei einer Temperatur von 37ºC wurde DNA durch eine Behandlung der Proteinentfernung mit Phenol und einer Präzipitationsbehandlung mit Ethanol in üblicher Weise gewonnen.
- Die erhaltene DNA wurde in 35 ul TE-Puffer gelöst. Der Lösung wurden 50 ;jl eines Gemisches [280 mM Natriumcacodylat (pH 6,8)/60 mM Tris-Hydrochlorid-Puf fer (pH 6,8)/2 mM Kobaltchlorid], 19 ul der Tailing Mischung (enthaltend dGTP anstatt dCTP), die in Punkt 4 beschrieben wurde, sowie 60 Einheiten terminaler Transferase (hergestellt von Takara Shuzu Co., Ltd.) zugesetzt. Nach 10-minütiger Reaktion bei 37ºC wurde die DNA durch eine Behandlung mit Phenol zur Proteinentfernung und eine in herkömmlicher Weise durchgeführte Behandlung zur Präcipitation mit Ethanol isoliert.
- 15 ng synthetisierte c-DNA und 200 ng Vektor-DNA wurden in 35 ul Ringschlußpuffer [10 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5)/100 mM NaCl/1 mM EDTA] gelöst. Die Lösung wurde bei einer Temperatur von 65ºC 2 Minuten, bei einer Temperatur von 46ºC 2 Stunden, bei einer Temperatur von 37ºC 1 Stunde und bei einer Temperatur von 20ºC 18 Stunden stehengelassen, um dadurch c-DNA und Vektor-DNA zu einem Ring zu schließen. Unter Verwendung der ringförmigen DNA wurde Escherichia coli, Stamm DHl (ATCC 33849) nach dem Verfahren von Hanahan [DNA Cloning, 1, 109-135 [1985] transformiert, um eine c-DNA-Bank herzustellen, die Plasmid pUC 19-DNA und rekombinante Plasmid pMCE 10-DNA als Vektoren enthält, herzustellen.
- Die Acc I-Stelle der rekombinanten Plasmid-pMCE 10 DNA liegt an einer Stelle, welche das Escherichia coli-β- Galactosidase-Gen codiert. Daher bildet c-DNA, die an dieser Stelle eingebaut ist, ein mit β-Galactosidase verbundenes Protein. Darüberhinaus wurde ein Promotor des β-Galactosidase-Gens der rekombinanten Plasmid pMCE 10-DNA in einen Promotor des Tryptophangens von Escherichia coli umgewandelt, wie es oben beschrieben wurde.
- 96 Kolonien von c-DNA mit rekombinanter Plasmid pMCE 10- DNA als Vektor wurden in Schüttelkultur in 10 ml M9 Casaminosäure-Medium [Molekular Cloning, 440-441, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)], das mit Thiamin (10 ug/ml) ergänzt war, bei einer Temperatur von 37ºC 10 Stunden lang kultiviert. Nach dem Sammeln der Zellen in üblicher Weise wurden die Zellen in 200 ul Probenpuffer für SDS-PAGE, der in Punkt 2 beschrieben ist, suspendiert. Die Suspension wurde bei einer Temperatur von 100ºC 5 Minuten lang gekocht.
- 40 ul dieser Suspension wurden in gängiger Weise der Elektrophorese unter Verwendung von 7,5%-igem (Gew./V) Polyacrylamid-Gel unterworfen. Nach Beendigung der
- Elektrophorese wurde das Protein, das sich auf dem Gel entwickelt hatte, mittels Western-Blotting-Verfahren auf Nitrocellulose-Filter transferiert [Anal. Biochem., 112, 195 (1981)]. Dieses Nitrocellulose-Filter wurde mit Anti-Luciferase-Serum unter Verwendung des Immuno-Blotting- Analysen-Kits (hergestellt von Biorad Co.) gefärbt. Das Verfahren wurde in Übereinstimmung mit dem Arbeitsverfahren von Biorad Co. durchgeführt.
- D.h., der Nitrocellulosefilter wurde in 100 ml Blockierungslösung [TBS-Puffer [20 mM Tris-Hydrochlorid- Puffer/500 mM NaCl (pH 7,5)], die 3% (Gew./V) Gelatine enthielt, bei einer Temperatur von 25ºC 30 Minuten geschüttelt. Anschließend wurde dieser Nitrocellulosefilter in 25 ml primäre Antikörperlösung [Lösung, die durch Lösen von 1% (Gew./V) Gelatine in TBS- Puffer und Verdünnen von Luciferase-Antiserum mit der resultierenden Lösung erhalten wurde] übergeführt und bei einer Temperatur von 25ºC 90 Minuten lang geschüttelt, anschließend wurde es in 100 ml Tween-20 Waschlösung [Lösung, die durch Lösen von 0,05% (Gew./V) Tween-20 in TBS-Puffer erhalten wurde] übergeführt und bei einer Temperatur von 25ºC 10 Minuten lang geschüttelt. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Dann wurde das so erhaltene Nitrocellulosefilter in 60 ml sekundäre Antikörperlösung [Lösung, die erhalten wurde durch Lösung von Antihasen-Antikörper, markiert mit Meerrettich- Peroxidase (hergestellt von Biorad Co.), in einer Lösung von 1% (Gew./V) Gelatine in TBS-Puffer in der 3000-fachen Menge (V/V)] übergeführt. Nach 60-minütigem Schütteln bei einer Temperatur von 25ºC wurde das Nitrocellulosefilter mit 100 ml Tween-20 Waschlösung gewaschen. Der oben beschriebene Arbeitsvorgang wurde zweimal wiederholt. Das so erhaltene Nitrocellulosefilter wurde in 120 ml farbbildende Lösung [Lösung hergestellt durch Vermischen einer Lösung von 60 mg 4-Chlor-1-naphthol in 20 ml kaltem Methanol und einer Lösung von 60 ul 30%-iger wässriger Wasserstoffperoxidlösung in 100 ml TBS-Puffer] zur Farbbildung für 10 Minuten bei einer Temperatur von 25ºC übergeführt.
- Ähnliche Arbeitsvorgänge wurden mit 4 Gruppen, jede aus 96 Kolonien bestehend, durchgeführt. Bei zwei Gruppen wurde eine Proteinbande, die mit Luciferase-Antiserum gefärbt war, erkannt. Anschließend wurden 96 Kolonien, die zu den zwei Gruppen gehörten, in 8 Gruppen aus je 12 Kolonien geteilt und ähnliche Arbeitsvorgänge durchgeführt. In einer Gruppe wurde ein Protein, das mit Anti- Luciferaseserum reagiert hatte, festgestellt. Von den 12 Kolonien, die in dieser Gruppe enthalten waren, wurde jede Kolonie in ähnlicher Weise behandelt, wodurch eine Protein-produzierende Kolonie, welche mit Luciferase- Antiserum reagiert hatte, identifiziert wurde. Durch die vorstehenden Arbeitsvorgänge wurden zwei Kolonien mit Luciferase-c-DNA erhalten. Aus den zwei Kolonien wurde Plasmid-DNA durch das in Punkt 5 beschriebene Verfahren hergestellt. Die erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNAs wurden pALf2B8 bzw. pALf3A6 bezeichnet.
- In 330 ul TE-Puffer wurden 100 ug rekombinante Plasmid pALf3A6-DNA gelöst. Der Lösung wurden 40 ul Low-Puffer [100 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5)/100 mM MgCl&sub2;/10 mM Dithiothreithol], 130 Einheiten Pst I (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und 120 Einheiten Sac I (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) zugesetzt, um bei einer Temperatur von 37ºC für 1,5 Stunden eine Spaltung zu bewirken.
- Die gesamte Menge der DNA wurde durch Elektrophorese unter Verwendung von 0,7% (Gew./V) Agarosegel getrennt. Die Agarosegel-Elektrophorese wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Seiten 156-161, Cold Spring Harbor Laboratory (1984)] durchgeführt. Eine DNA-Bande, die Luciferase-c-DNA enthielt wurde ausgeschnitten und in ein Dialyserohr gelegt. Nachdem 2 ml TE-Puffer eingefüllt worden waren, wurde das Dialyserohr verschlossen und DNA durch Dialyse vom Gel in den Puffer eluiert. Zu dieser Lösung wurde ein äquivalentes Volumen wassergesättigtes Phenol gegeben. Nach Rühren wurde die wässrige Phase isoliert und DNA durch Ausfällen mit Et0H in herkömmlicher Weise gewonnen.
- 10 ug des erhaltenen DNA-Fragments wurden in TE-Puffer gelöst; 16 ul Med-Puffer und 64 Einheiten Sau 3 AI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu der Lösung gegeben. Nach 2-stündiger Reaktion bei 37ºC wurde die gesamte Menge zur Isolierung von DNA-Bruchstücken der Elektrophorese unter Verwendung von 5% (Gew./V) Polyacrylamidgel unterworfen. Die Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von A. Maxam [Methods in Enzymology, 65, 506 (1980)] durchgeführt. Ein DNA-Bruchstück mit 190 bp wurde nach dem beschriebenen Verfahren isoliert, wobei 1 ug Sau 3 AI-Luciferase-c-DNA-Bruchstück isoliert wurde.
- Unter Verwendung von [α-³²P] dCTP (hergestellt von Amersham Co.) wurde 1 ug dieser Luciferase-c-DNA nach dem Nick-Translations-Verfahren markiert. Das Nick- Translations-Verfahren wurde unter Verwendung eines Kits, der von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt worden war, gemäß dem in J. Mol. Biol., 113, 237-251 (1977) und Molecular Cloning, S. 109-112, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) durchgeführt.
- Unter Verwendung des mit 32P markierten Luciferase-c-DNA- Bruchstücks, das nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, als Probe wurde die c-DNA-Bank des Schwanzes von Photinus ovralis untersucht, wobei das rekombinante Plasmid pUC 19-DNA ein Vektor war, und Kolonienhybridisierung [(Protein, Nucleic Acid and Enzym, 26, 575-579 (1981)] angewendet wurde. Es entstanden Kolonien mit Luciferase-c-DNA. Rekombinante Plasmid-DNA, die durch eine der Kolonien erhalten worden war, wurde pALf3 bezeichnet; Plasmid-DNA wurde nach dem in Punkt 5 beschriebenen Verfahren hergestellt. Escherichia coli, der die rekombinante Plasmid-DNA enthielt, wurde Escherichia coli DH 1 (pAlf3) genannt. Der Transformant ist als ATCC 67462 hinterlegt worden.
- Die rekombinante Plasmid pALf3-DNA, die oben beschrieben wurde, wurde einem Einzelaufschluß und einem doppelten Aufschluß unter Verwendung von XbaI, Hind III, BamH I, Ec0R I und Pst I (alle hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unterworfen. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese am Wanderungsmuster analysiert. Durch Vergleich der erhaltenen Wanderungsmuster mit einem Standard-Wanderungsmuster eines DNA-Fragmentes, das durch Verdauung von λDNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Hind III erhalten worden war, stellte sich heraus, daß die Größe der in pALf3 eingefügten c-DNA 1700 bp war. Eine Restriktionsenzym-Karte des oben beschriebenen Plasmids ist in Fig. 1 dargestellt.
- 10 g lebende Luciola cruciata (gekauft von Seibu Department Store) wurden in eine Ultratieftemperatur-Box gegeben und gefroren. Alle Schwänze wurden mit einer Schere abgeschnitten. Zu 2 g der erhaltenen Schwänze wurden 18 ml Guanidinisothiocyanat-Lösung gegeben. Nach dem in Punkt 1 beschriebenen Verfahren wurden 1,1 mg RNA hergestellt. In Übereinstimmung mit dem in Punkt 1 beschriebenen Verfahren wurden 1,1 mg dieser RNA der Säulenchromatographie mit Oligo (dT)-Celiulose unterworfen, um 30 ug Schwanz-m-RNA von Luciola cruciata herzustellen.
- Die Synthese von c-DNA wurde unter Verwendung eines Kits, der von Amersham Co. gekauft worden war, gemäß dein von Amersham Co. angegebenen Verfahren, welches in Mol. Cell Biol., 2, 161 (182) und Gene, 25, 263 (1983) beschrieben wurde, durchgeführt.
- Aus 2 ug der Luciola cruciata-Schwanz-RNA wurden 0,9 ug doppelsträngige c-DNA synthetisiert. Unter Verwendung des in Punkt 4 beschriebenen Verfahrens wurde an 0,3 ug dieser c-DNA ein Ende aus Polydeoxycytidin angefügt.
- 20 ng dieser c-DNA und 500 ng pUC 19-Plasmid, das in Punkt 6 hergestellt worden war und bei dem ein Polyguanosin-Ende an die Pst 1-Stelle angefügt worden war, wurden nach dem in Punkt 7 beschriebenen Verfahren zu einem Ring geschlossen. Escherichia coli, Stamm DH 1 (ATCC 33849) wurde durch die zu einem Ring geschlossene DNA nach dem Verfahren von Hanahan [DNA Cloning, 1, 109-135 (1985)] transformiert, um so eine c-DNA-Bank vom Luciola cruciata-Schwanz herzustellen.
- In 90 ul TE-Puffer wurden 10 ug rekombinante Plasmid pALf3-DNA gelöst; der Lösung wurden 10 ul Med-Puffer, 25 Einheiten Restriktionsenzym EcoR I und 25 Einheiten Restriktionsenzym Cla I (beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) zugesetzt. Zur Spaltung der DNA wurde die Reaktion bei einer Temperatur von 37ºC 2 Stunden lang durchgeführt. Aus der gespaltenen rekombinanten Plasmid pALf 3-DNA wurde ein 800 bP EcoR I/Cla I-DNA-Fragment, das von Photinus Dvralis (amerikanisches Glühwürmchen) abgeleitete Luciferase-c-DNA enthielt, nach dem in Punkt 9 beschriebenen Verfahren isoliert, wobei Agarose-Gel- Elektrophorese verwendet wurde. Auf diese Weise wurde 1 ug EcoR I/Cla I-DNA-Fragment erhalten. Unter Verwendung von [α-³²P] dCTP-Triphosphat (hergestellt von Amersham Co.) wurde 1 ug dieser DNA mit ³²P nach der in Punkt 9 beschriebenen Nick-Trans lations-Methode markiert. Unter Verwendung des mit ³²P markierten EcoR I/Cla I-DNA- Fragmentes als Probe wurde die c-DNA-Bank des Schwanzes von Luciola cruciata durch Kolonien-Hybridisierung, die in Punkt 10 beschrieben ist, untersucht, um so Escherichia coli mit von Luciola cruciata abgeleiteter Luciferase-c- DNA zu selektieren. Es wurden verschiedene Stämme von Escherichia coli erhalten, die fähig sind mit der Probe zu hybridisieren. Eine rekombinante Plasmid-DNA, die durch eine dieser Kolonien erhalten wurde, wurde pGLfl genannt. Die rekombinante Plasmid-DNA wurde gemäß dem in Punkt 5 beschriebenen Verfahren isoliert. Escherichia coli, das die rekombinante Plasmid-DNA enthielt, wurde Escherichia coli DH 1 (pGLfl) genannt. Der Transformant wurde als ATCC 67482 hinterlegt.
- Die rekombinante Plasmid pGLfl-DNA, die oben beschrieben wurde, wurde einer einzelnen Verdauung und einer doppelten Verdauung unter Verwendung von Hpa I, Hind III, EcoR V, Dra I, Afl II, Hinc II, Pst I (alle von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) und Ssp I (hergestellt von New England Biolab Co.) unterworfen. Die erhaltenen DNA-Bruchstücke wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese am Bewegungsmuster untersucht. Durch Vergleich des erhaltenen Bewegungsmusters mit einem Standard-Bewegungsmuster eines DNA-Fragmentes, das durch Verdauung von λDNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Hind III erhalten worden war, wurde festgestellt, daß die Größe der in pGLfl eingefügten c-DNA 2000 bp war. In Figur 2 ist eine Restriktionsenzym-Karte des oben beschriebenen Plasmids dargestellt.
- Rekombinante Plasmid PGLf 1-DNA, 10 ug, wurde Restriktionsenzym Pst I (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten, wobei 2,5 ug 2,0 Kb-DNA-Fragment, das Luciferase-c-DNA enthielt, erhalten wurden. Dieses DNA- Fragment wurde an der Pst I-Stelle von Plasmid pUC 119-DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) cloniert. Die erhaltenen Plasmid-DNAs wurden pGLf2 bzw. pGLf3 in Abhängigkeit vom Unterschied in der Richtung der eingefügten c-DNA genannt. Es wurden eine Spaltungsbehandlung von rekombinanter Plasmid pGLf1-DNA und Plasmid pUC 119-DNA mit Pst I (Verfahren in Punkt 6 beschrieben), Isolierung der Luciferase-c-DNA-Fragmente unter Verwendung der Agarose-Gel-Elektrophorese (in Punkt 9 beschrieben), Verknüpfung von Plasmid-pUC 119-DNA und Luciferase-c-DNA-Fragment (in Punkt 5 beschrieben) Transformation von Escherichia coli-Stamm JM 101 (ATCC 33876) unter Verwendung der Verknüpfungs-Reaktions-Lösung (in Punkt 5 beschrieben) sowie Herstellung von rekombinanten Plasmid-pGLf2 und pGlf3-DNAs (in Punkt 5 beschrieben) nach den in den Klammern angegebenen Verfahren durchgeführt.
- Als nächstes wurden unter Verwendung von rekombinanten Plasmid pGLf2- und pGlf3-DNAs Plasmid-DNAs, in die verschiedene Deletionen in die Luciferase-c-DNA eingeführt waren, hergestellt, und zwar unter Verwendung eines Deletionskits zur Killosequenz (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem Verfahren von Henikoff [Gene, 28, 351-359 (1984)], gefolgt von der Einführung in Escherichia coli, Stamm JM 101 (ATCC 33876) wie es in Punkt 5 beschrieben ist. Durch Infizieren des so erhaltenen Escherichia coli mit Helferphage M13k07 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde eine einzelsträngige DNA nach der Methode von Messing [Methods in Enzymologie, 101, 20-78 (1983)] hergestellt. Die Bestimmung der Sequenz der erhaltenen einsträngigen DNA wurde nach der oben beschriebenen Methode von Messing unter Verwendung einer M13 Sequenzer-Apparatur (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. Eine Gelelektrophorese zur Analyse der Basensequenz wurde unter Verwendung von 8% (Gew./V) Polyacrylamidgel (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) durchgeführt.
- Die Basensequenz des Luciferase-codierenden Bereichs der von Luciola cruciata abgeleiteten Luciferase-c-DNA ist in Figur 3 dargestellt. In Figur 4 ist eine Aminosäuresequenz des Proteins, das von der c-DNA translatiert wurde, dargestellt.
- Zu einer Lösung von 5 ug rekombinanter Plasmid pGLf1-DNA in 90 ul TE-Puffer wurden 10 ul Med-Puffer und 25 Einheiten Ssp I (hergestellt von New England Biolap. Co., Ltd.) gegeben. Nach 2-stündigem Aufschluß bei einer Temperatur von 37ºC wurde ein äquivalentes Volumen Wasser gesättigtes Phenol zugesetzt, wodurch der Vorgang der Proteinentfernung in üblicher Weise durchgeführt wurde. Aus der verdauten rekombinanten Plasmid pGLf15-DNA wurden 1,6 Kb DNA-Fragment, das von Luciola cruciata abgeleitete Luciferase-c-DNA codiert, isoliert, und zwar unter Verwendung des in Punkt 9 beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese. Auf diese Weise wurde 1 ug 1,6 Kb Ssp I-Fragment erhalten.
- Außerdem wurde 1 ug Plasmid pUC 18-DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) in 18 ul TE-Puffer gelöst; und 2 ul Sma I-Puffer [100 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8,0)/70 mM Magnesiumchlorid/200 mM Kaliumchlorid/70 mM 2- Mercaptoethanol/0,1% Rinderserum Albumin] und 5 Einheiten Sma I (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden der Lösung zugesetzt. Nach Verdauen bei einer Temperatur von 37ºC für 1 Stunde wurde ein Extraktion mit Phenol und eine Präcipitation mit Ethanol in üblicher Weise unter Erhalt von Präcipitaten dürchgeführt.
- In 7 ul Wasser wurden 0,5 ug Sma 1-aufgeschlossene Plasmid pUC 18-DNA und 0,5 ug 1,6 Kb von Luciola cruciata abgeleitetes Luciferase-c-DNA-Fragment gelöst. Der Lösung wurden 13 ul einer Mischung [77 mM Tris-Hydrochlorid- Puffer (pH 7,4)/15 mM Magnesiumchlorid/15 mM Dithiothreitol/0,15 mM Adenosintriphosphat] und eine Einheit T4 Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim AG) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 18 Stunden bei einer Temperatur von 8ºC einer Verknüpfung unterworfen. Unter Verwendung der Reaktionslösung wurde Escherichia coli Stamm JM 101 (ATCC 33876) wie in Punkt 7 beschrieben transformiert. Von den erhaltenen Transformanten wurde Plasmid-DNA wie in Punkt 5 beschrieben isoliert. Die isolierte Plasmid-DNA wurde einer einzelnen Verdauung mit Hind III (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unterworfen, und es wurde eine Plasmid-DNA die 1,5 Kb und 2,9 Kb DNA-Fragmente bildete, selektiert. Diese rekombinante Plasmid-DNA wurde pGLf15 genannt; Escherichia coli, das diese Plasmid-DNA trug, wurde Escherichia coli JM 101 (pGLf15) genannt. Escherichia coli JM 101 (pGLf15) ist als ATTC 67461 hinterlegt worden.
- Escherichia coli JM 101 (pGLf15) wurde nach dem in Punkt 5 beschriebenen Verfahren gezüchtet. Durch Isolierung der rekombinanten Plasmid-DNA wurden 1,2 mg gereinigte rekombinante pGLf15-DNA aus einem 1 l Kulturlösung erhalten.
- Escherichia coli JM 101 (pGLf15) (ATCC 67461) wurde in 3 ml LB-amp-Medium [1% (Gew./V) Baktotripton, 0,5% (Gew./V) Hefeextrakt, 0,5% (Gew./V) NaCl und Ampicillin (50 ug/ml)] bei einer Temperatur von 37ºC 18 Stunden lang in Schüttelkultur gezüchtet. 0,5 ml dieser Kulturlösung wurden in 10 ml des oben genannten LB-amp-Mediums geimpft und 1 nM Isopropyl-β-D-thiogalactosid wurde zugesetzt. Nach 4-stündiger Schüttelkultur bei einer Temperatur von 37ºC wurde die Kultur dem Zentrifugieren bei 8000 Upm 10 Minuten lang unterworfen, wobei 20 mg nasse Zellen erhalten wurden.
- Die gewonnenen Zellen wurden in 0,9 ml Puffer suspendiert, welcher aus 0,1 M KH&sub2;P0&sub4; (pH 7,8), 2 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol und 0,2 mg/ml Protaminsulfat bestand. Ferner wurden 100 ul einer Lösung von 10 mg Lysozym pro ml der Suspension zugegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang in Eis stehen gelassen. Als nächstes wurde die Suspension in eine Methanol-Trockeneis-Bad gefroren und dann bei einer Temperatur von -25ºC stehengelassen, um vollständig zu gefrieren. Durch Ausführung eines Zentrifugierschrittes bei 12000 Upm für 5 Minuten wurde 1 mal Rohenzym-Lösung als Überstand erhalten.
- Die Luciferase-Aktivität der so erhaltenen Rohenzym-Lösung wurde nach dem unten beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle angegeben.
- Die Messung der Luciferase-Aktivität in der erhaltenen Rohenzym-Lösung wurde durch Zählen der Anzahl der gebildeten Photonen nach dem Verfahren von Kricka durchgeführt [Archives of Biochemistry and Biophysics, 217, 674 (1982)].
- D.h. 260 ul 25 mM Glycylglycin-Puffer (pH 7,8), 16 ul 0,1 M Magnesiumsulfat und 24 ul 1 mM Luciferin (hergestellt von Sigma Co.) und 10 ul Rohenzym-Lösung wurden vermischt. Dann wurden 100 ul 20 mM ATP dem Gemisch zugesetzt. Die Zahl der gebildeten Photonen wurde über 1 Minute integriert. Die integrierten Werte sind in der untenstehenden Tabelle angegeben.
- Zum Vergleich wurde auch die Luciferase-Aktivität bei Escherichia coli, Stamm JM 101, der Plasmid pUC 18-DNA trägt [Escherichia coli JN 101 (pUC 18)] gemessen. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle angegeben. Tabelle Werte Anzahl der Fotonen/ml Probe Kulturlösung Escherichia coli JM 101 (pGLf15) (Erfindung) Escherichia coli JM 101 (pUC 18) (Kontrolle)
- Wie aus der obigen Tabelle klar hervorgeht, ist die Zahl der Photonen bei der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Vergleich erhöht und daher wird Luciferase in den Zellen von Escherichia coli, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, produziert.
- Obgleich die Erfindung im Detail und unter Anführung von speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, daß der Fachmann auf diesem Gebiet verschiedene Änderungen und Modifikationen vornehmen kann, ohne den Geist und den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Claims (10)
1.
Luciferase-Gen, das eine unten angegebene
Aminosäure-Sequenz codiert:
2. Luciferase-Gen nach Anspruch 1, das durch eine unten
angegebene Basen-Sequenz dargestellt wird:
3. Neue rekombinante DNA (Luciferase-Gen) nach Anspruch
1, die eine isolierte Luciferase-DNA aus Luciola
cruciata enthält.
4. Neue rekombinante DNA nach Anspruch 3, wobei das
Gen, das Luciferase codiert, ein Luciferase-Gen ist,
das eine unten angegebene Aminosäure-Sequenz
codiert.
5. Neue rekombinante DNA nach Anspruch 3, wobei das
Gen, das Luciferase codiert, durch eine unten
angegebene Basensequenz dargestellt wird.
6. Neue rekombinante DNA nach Anspruch 3, wobei die aus
Luciola cruciata isolierte Luciferase-DNA in
Escherichia coli IM 101 (pUC18) eingesetzt ist.
7. Verfahren zur Herstellung von Luciferase, welches
das Züchten eines Mikroorganismus, der zur Gattung
Escherichia, die fähig ist, Luciferase zu
produzieren, gehört, wobei der Mikroorganismus, der
eine rekombinante DNA (Luciferase-Gen) nach Anspruch
1 enthält, in die ein aus Luciola cruciata
isoliertes Luciferase-Gen eingesetzt ist, in einem
Medium; sowie Sammeln der Luciferase aus der Kultur
umfaßt.
8. Verfahren zur Herstellung von Luciferase nach
Anspruch 7, wobei das Gen, das Luciferase codiert,
ein Luciferase-Gen ist, das eine unten angegebene
Aminosäure-Sequenz codiert.
9. Verfahren zur Herstellung von Luciferase nach
Anspruch 7, wobei das Gen, das Luciferase codiert,
durch eine unten angegebene Basensequenz dargestellt
wird.
10. Verfahren zur Herstellung von Luciferase nach
Anspruch 7, wobei die rekombinante DNA eine DNA ist,
die durch Einsetzen eines aus Luciola cruciata
isolierten Luciferase-Gens in Escherichia coli JM
101 (pUC18) hergestellt wird.
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