JPH0612995B2 - ルシフェラ−ゼ遺伝子 - Google Patents

ルシフェラ−ゼ遺伝子

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JPH0612995B2
JPH0612995B2 JP20519487A JP20519487A JPH0612995B2 JP H0612995 B2 JPH0612995 B2 JP H0612995B2 JP 20519487 A JP20519487 A JP 20519487A JP 20519487 A JP20519487 A JP 20519487A JP H0612995 B2 JPH0612995 B2 JP H0612995B2
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    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata、
ゲンジボタル）由来のルシフェラーゼ遺伝子に関する。
〔従来の技術〕
ルシオラ（Luciola）属ホタルのルシフェラーゼは、収
集されたルシオラ属ホタルより分離、精製されて得られ
ているに過ぎない〔プロク・ナトル・アカド・サイ・
（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第74巻、第７号、第2799〜2
802頁（1977）〕。
上記ルシフェラーゼは、例えば、ＡＴＰの定量用酵素と
して極めて有用な酵素である。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかしながら、上記ルシフェラーゼは、昆虫由来である
ため、その製造には、ルシオラ属ホタルを自然界より採
取するか、あるいは、該ホタルを養殖し、得られた該ホ
タルよりルシフェラーゼを分離、精製しなければなら
ず、その製造には、多大な時間と労力を要するものであ
った。
〔問題点を解決するための手段〕
そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを得、この組み換え体ＤＮＡをエッシェリシア（Es
cherichia）属に属する微生物に含ませたルシフェラー
ゼ生産能を有する微生物を培地に培養することにより、
短期間のうちに効率よくルシフェラーゼが生産されるこ
とを知り特許出願を行なった（昭和62７月29日付特許出
願明細書（1）及び（2））。
その後、本発明者等は、ルシオラ・クルシアタ由来のル
シフェラーゼ遺伝子について更に検討した結果、ルシオ
ラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ遺伝子を初めて単
離及び構造決定することに成功し、本発明を完成した。
即ち本発明は、第４図に示されるアミノ酸配列をコード
するルシフェラーゼ遺伝子である。
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）のル
シフェラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを検
索する際、プローブとしてホタルの１種であるフォティ
ナス・ピラリス（Photinus pyralis）由来のルシフェラ
ーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを使用するた
めにその調製法について述べる。
ホタルの１種であるフォティナス・ピラリスの尾部より
ｍ−ＲＡＮを調製するには、例えば、モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）、第196頁、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）（1982）及び分子遺伝学実験法、
小関治男、志村令郎、第66〜67頁（1983）記載の方法等
により得ることができる。
得られたｍ−ＲＮＡよりルシフェラーゼをコードするｍ
−ＲＮＡを濃縮するには、例えば、バイオメディカル・
リサーチ（Biomedical Research）、第３巻、第534〜54
0頁（1982）記載の方法により行なうことができる。
なお、この際、ルシフェラーゼに対する抗ルシフェラー
ゼ血清を使用するのであるが、該血清は、例えば、免疫
化学、山村雄一、第43〜50頁（1973）記載の方法により
得ることができる。
ルシフェラーゼをコードするｍ−ＲＮＡよりｃ−ＤＮＡ
を合成するには、例えば、モル・セル・バイオル（Mol.
Cell Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及びジーン（G
ene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法により行な
うことができる。
次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＭＣＥ10ＤＮＡ［プラス
ミドｐＫＮ305〔アグル・バイオル・ケム（Agr.Biol.Ch
em.）、第50巻、第271頁（1986）記載の大腸菌トリプト
ファンオペロンのプロモーターを有するプラスミド〕及
びプラスミドｐＭＣ1843〔メソズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）、第100巻、第293〜308
頁（1983）記載の大腸菌β−ガラクトシダーゼ構造遺伝
子を有するプラスミド〕を用いて作製したプラスミド〕
等に組み込み、種々の組み換え体プラスミドＤＮＡを
得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌（E.coli）ＤＨ１
（ＡＴＣＣ33849）、大腸菌（E.coli）ＨＢ101（ＡＴＣ
Ｃ33694）等をハナハン（Hanahan）の方法〔ディーエヌ
エイ・クローニング（ＤＮＡ Cloning）、第１巻、第1
09〜135頁（1985）〕により形質転換し、種々の形質転
換株を得る。
なお、このようにして得られた形質転換株の有する組み
換え体プラスミドＤＮＡは、大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ構造遺伝子の途中にｃ−ＤＮＡが組み込まれたプラス
ミドであって、ｃ−ＤＮＡによりコードされているペプ
チドは、β−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として
発現するものである。
上記の種々な形質転換株よりルシフェラーゼをコードす
るｃ−ＤＮＡを検出するには、形質転換株を培養するこ
とにより、菌体蛋白質を発現させ、抗ルシフェラーゼ血
清と交差する蛋白質が存在するか否かにより検出するこ
とができ、例えば、アグリック・バイオル・ケム（Agri
c.Biol.Cem.）、第50巻、第271頁（1986）及びアナル・
バイオケム（Anal.Biochem.）、第112巻、第195頁（198
1）記載の方法等により行なうことができる。
次いで、不完全なルシフェラーゼのｃ−ＤＮＡを32Ｐを
用いニックトランスレーション法〔モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Habor Laboratory）、（1982）及びジェイ・モル・
バイオル（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237〜251頁（19
77）〕により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプローブと
してコロニーハイブリダイゼイション法〔蛋白質、核
酸、酵素、第26巻、第575〜579頁（1981）〕によりプラ
スミドｐＵＣ19ＤＮＡをベクターとして作成したｃ−Ｄ
ＮＡのジーンバンクのライブラリーより1.8kbのルシフ
ェラーゼをコードするｃ−ＤＮＡを含有するプラスミド
ＤＮＡを得ることができる。
そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりフォティナス・ピラリス由来のルシフェラー
ゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、該
プラスミドＤＮＡに、制限酵素、例えばEcoRI及びClaI
を温度30〜40℃、好ましくは37℃で１〜24時間、好まし
くは２時間作用させて反応終了液を、アガロースゲル電
気泳動法〔モレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning）、第150頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリース（Cold Spring Harbor Laboratory）（1
982）記載〕によりフィティナス・ピラリス由来のルシ
フェラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを得る
ことができる。
次に、本発明のルシフェラーゼ遺伝子の調製法等につい
て述べる 先ず、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の由来は、如
何なるものでよく、例えば、ルシオラ・クルシアタ（Lu
ciola cruciata、ゲンジボタル）等が挙げられ、殊に該
ホタルの尾部が好ましい。
そして、上記ホタルの尾部からのｍ−ＲＮＡの調製及び
ｍ−ＲＮＡからのｃ−ＤＮＡの合成は、例えば、上述し
たフィティナス・ピラリスのｍ−ＲＮＡの調製法及びｃ
−ＤＮＡの合成法と全く同様にして行なうことができ
る。
次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵＣ19ＤＮＡ（室酒造・
社・製）等に組み込み、種々の組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌（E.coli）
ＤＨ１（ＡＴＣＣ33849）、大腸菌（E.coli）ＨＢ101
（ＡＴＣＣ33694）等をハナハン（Hanahan）の方法〔デ
ィーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡCloning）、第１
巻、第109〜135頁（1985）〕により形質転換し、種々の
形質転換株を得る。
次いで、フォティナス・ピラリス由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを32Ｐを用いニッ
クトランスレーション法〔モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Habo
r Laboratory）（1982）及びジェイ・モル・バイオル
（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237〜251頁（1977）〕に
より標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプローブとしたコロ
ニーハイブリダイゼイション法〔蛋白質・核酸・酵素、
第26巻、第575〜579頁（1981）〕により、プラスミドｐ
ＵＣ19ＤＮＡをベクターとして作成したルシオラ・クル
シアタ由来のｃ−ＤＮＡをジーンバンクのライブラリー
より２．０ｋｂのルシフェラーゼをコードするｃ−ＤＮ
Ａを含有するプラスミドＤＮＡを得ることができる。
次いで、該プラスミドＤＮＡに制限酵素、例えば、SspI
〔ニューイングランドバイオラボ・社・製〕を常法によ
り作用させて、ルシフェラーゼをコードするｃ−ＤＮＡ
を含有するＤＮＡを得、該ＤＮＡを、ベクターＤＮＡに
組み込み、新規な組み換え体ＤＮＡを得る。
上記ベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、
例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファー
ジベクターＤＮＡ等が挙げられるが、具体的には、例え
ば、ｐＵＣ18（宝酒造・社・製）、ｐＵＣ19（宝酒造・
社・製）、λｃＩ857h80attλｓＲＩλ▲0 3▼sRIλ▲0 2
▼ｓＲＩλ▲0 1▼（特公昭61-37917号公報記載）等が挙
げられる。
そして、このようにして得られた新規な組み換え体ＤＮ
Ａを用いて、エッシェリシア（Escherichia）属の微生
物、例えば、大腸菌ＪＭ101（ＡＴＣＣ33876）等を、コ
ーエン（Cohen）等の方法〔ジェイ・バク（J.Bac.）、
第119巻、第1072〜1074頁（1974）〕により、形質転換
するか、あるいは、モレキュラー・クローニング（Mole
cular Cloning）、第256〜268頁、コールド、スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Lab
oratory)(1982）記載の方法により形質導入してルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクタ
ーＤＮＡに挿入した新規な組み換え体ＤＮＡを含みルシ
フェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微
生物を得る。
このようにして得られた微生物より純化された新規な組
み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、プロク・ナトル・
アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第62巻、第115
9〜1166頁（1969）記載の方法などにより得ることがで
きる。
そして、上記の純化された新規な組み換え体ＤＮＡに、
例えば、制限酵素ＰstI（宝酒造・社・製）を温度30℃
以上、好ましくは37℃、酵素濃度200〜400ユニット／ml
で１〜４時間、好ましくは４時間作用させて消化し、Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。
上記ＤＮＡ断片混合物よりルシオラ・クルシアタ由来の
ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを
単離するには、フォティナス・ピラリス由来のルシフェ
ラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡの単離法と
全く同様にして得ることができる。
次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物よりルシフ
ェラーゼを採取するのである。
培地としては、例えば、エッシェシリア属に属する微生
物の培養に用いられるものであれば、如何なるものでも
よく、例えば、トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5
％（W/V）、NaCl0.5％（W/V）及び1mMのイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド等が挙げられる。
また、培養温度は、例えば、30〜40℃、好ましくは37℃
程度で、培養時間は、例えば、４〜８時間、好ましくは
４時間程度である。
そして、培養物より菌体を例えば、8,000r.p.m.で10分
間程度の遠心分離処理により集菌し、得られた菌体を、
例えば、メソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）第133巻、第3〜14頁（1986）記載の方法
により破砕し、粗酵素液を得る。
そして、粗酵素液は、そのままでも使用可能であるが、
必要により硫安分画，疎水クロマトグラフ法、例えば、
ブチル−トヨパール650 C等，ゲル濾過法、例えば、ウ
ルトロゲルＡｃＡ34等により精製して、純化されたルシ
フェラーゼを得る。
このようにして得られたルシフェラーゼの理化学的性質
は、フォトケム・フォトバイオル（Photochem.Photobio
l.）、第42巻、第609〜611頁（1985）に記載されたもの
と全く同様である。
〔発明の効果〕
上述したことから明らかな如く、本発明によれば、本発
明ルシフェラーゼ遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａを含むエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養
することにより、極めて短期間のうちに、ルシフェラー
ゼを効率よく得ることができるので、本発明は産業上極
めて有用なものである。
以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。
実施例 なお、以下にのべる項目１〜10には、ホタルの１種であ
るフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼをコードす
る遺伝子を含有するＤＮＡ（該ＤＮＡは、ルシオラ・ク
ルシアタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有す
るＤＮＡを検索する際、プローブとして使用されるもの
である。）の調製についてのべる。
１．ｍ−ＲＮＡの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス（photinus
pyralis）の乾燥尾部（シグマ・社・製）１ｇを乳鉢及
び乳棒を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液５ml
〔20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）／10mM NaCl／３mM
酢酸マグネシウム／５％（W/V）ショ糖／１．２％（V/
V）トリトンＸ−100／10mMバナジルヌクレオシド錯体
（ニューイングランド バイオラボ・社・製）〕を添加
し、更に、上記と同様に破砕してフォティナス・ピラリ
ス尾部破砕物含有溶液を得た。
このようにして得た溶液５mlを、カップ型ブレンダー
（日本精製製作所・社・製）に入れ、5,000r.p.m.で５
分間処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシアネ
ート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシアネート／37.5mM
クエン酸ナトリウム（pH7.0）／0.75％（W/V）Ｎ−ラウ
ロイルザルコシンナトリウム／0.15Mβ−メルカプトエ
タノール）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い3,00
0r.p.m.で10分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを
用いて濾過し、瀘液を得、超遠心分離機用チューブ（日
立工機・社・製）４本に、予め１．２mlの５．７Ｍの塩
化セシウム溶液を夫々重層し、その上に、上記瀘液を重
層するように夫々分注し、超遠心分離機（日立工機・社
・製、ＳＣＰ55Ｈ）を用いて温度15℃、30,000r.p.m.で
16時間遠心分離して沈澱物を得た。
得られた沈澱物を、冷70％（V/V）エタノールを用いて
洗浄したものを、10mMトリス緩衝液〔10mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.4）／5mMＥＤＴＡ／１％ドデシル硫酸ナト
リウム〕４mlに懸濁したものに、同量のｎ−ブタノール
及びクロロフォルムを４対１（容量比）となる如く混合
したものを添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.で1
0分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この
有機溶媒層に上記10mMトリス緩衝液４mlを添加し、上記
抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得られ
た水層に、1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.2）及び
２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−20℃で２
時間放置したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間遠
心分離し、ＲＮＡを沈澱させ、得られたＲＮＡを４mlの
水に溶解し、上記エタノール沈澱操作を行なったのち、
得られたＲＮＡを１mlの水に溶解し、3.75mgのＲＮＡを
得た。
そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計７mg
のＲＮＡを調製し、このＲＮＡ中よりｍ−ＲＮＡを選択
するために、７mgのＲＮＡを、オリゴ（dT）−セルロー
ス（ニューイングランドバイオラボ・社・製）カラムク
ロマトグラムにかけた。
カラムとして２．５mlテルモシリンジ（テルモ・社・
製）を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液〔10mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.6）／１mMＤＥＴＡ／０．１％（W/
V）ドデシル硫酸ナトリウム〕で膨潤させたのち、カラ
ムに充填し、結合緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH7.6）
／１mMＥＤＴＡ／０．４M Nacl／０．１％ドデシル硫酸
ナトリウム〕で平衡化したものである。
７mgのＲＮＡに、同量の緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH
7.6）／１mMＥＤＴＡ／０．８M NaCl／０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処
理し、氷中で急冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラム
にかけたのち、結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ
−ＲＮＡ及びｔ−ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩
衝液でｍ−ＲＮＡを溶出し、40μｇのｍ−ＲＮＡを得
た。
２．ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
ｍ−ＲＮＡを濃縮した。
10〜25％（W/V）のショ糖密度勾配は、ベックアン・社
・製のローターＳＷ41用ポリアロマチューブに40％（W/
V）ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）／20mM
NaCl／１mMＥＤＴＡ／40％（W/V）ショ糖〕０．５mlを
入れ、その上に２．４mlずつ25％（W/V）、20％（W/
V）、15％（W/V）及び10％（W/V）のショ糖液を重層
し、温度４℃で24時間放置することにより作製した。こ
のショ糖密度勾配に、ｍ−ＲＡＮ30μｇを重層し、ベッ
クマン・社・製のＳＷ41ローターを用い、常法により3
0,000r.p.m.、温度18℃で18時間遠心分離を行なった。遠
心分離操作ののち、０．５mlずつ分画し、エタノール沈
澱法によりｍ−ＲＮＡを回収し、10μｌの水に溶解し
た。
次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、ルシフェラーゼのｍ−ＲＮＡが濃縮されてい
る画分の同定を行なった。分画したＲＮＡ１μｌ、ウサ
ギ網状赤血球ライセート（アマシャム・社・製）９μｌ
及び〔35Ｓ〕メチオニン１μｌ（アマシャム・社・製）
を混合し、温度30℃で30分間反応させたものに、150μ
ｌのＮＥＴ緩衝液〔150mM NaCl／５mMＥＤＴＡ／0.02％
（W/V）NaN3／20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）／0.05
％（W/V）ノニデットＰ−40（ベセスダリサーチラボラ
トリー・社・製、界面活性剤）〕を添加し、更に、１μ
ｌの抗ルシフェラーゼ血清（後述のようにして調製した
もの。）を添加し、温度４℃で18時間放置したものに、
10mgのプロティンＡセファロース（ファルマシア・社・
製）を添加し、温度20℃で30分間放置したものを、常法
により12,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、樹脂を回
収した。
回収した樹脂を、200μｌのＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、40μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル
緩衝液〔62.5mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）／10％（V
/V）グリセロール／２％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウ
ム／５％（V/V）メルカプトエタノール／0.02％（W/V）
プロムフェノールブルエー〕を添加し、温度100℃で３
分間煮沸し、常法により12,000r.p.m.で１分間遠心分離
処理し、上清を回収し、全量を７．５％（W/V）ドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルに乗せた。
ゲル電気泳動は、ラエムリ（Laemmli）の方法〔ネーチ
ュアー（Nature）、第227頁、第680頁（1970）〕で行な
い、泳動したのちのゲルは、10％（V/V）の酢酸に30分
間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水に30分間浸漬し、
更に、１Ｍサリチル酸ナトリウム溶液に30分間浸漬し、
乾燥して乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フィル
ム・社・製、ＲＸ）を用いてフルオログラフィーを行な
った。
以上の操作により、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの存在す
る画分のＲＮＡを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋
白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラ
ーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている画分が同定できた。
３．抗血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。
３．２mg／ml濃度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ・社・
製ルシフェラーゼを０．５Ｍグリシルグリシン溶液（pH
7.8）に溶解したもの〕０．７mlを、等量のフレンド（F
reund）完全アジェバントで懸濁したもの2.24mgを、抗
原として体重２kgの日本白色種ウサギの指掌部に投与
し、飼育２週間経過したのち、初回と同量の抗原を背部
皮内へ投与し、更に、飼育１週間経過したのち、同様の
操作を行ない、また更に、飼育１週間後全採血を行なっ
た。
そして、得られた血液を、温度４℃で18時間放置したも
のを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、上
清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。
４．ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡの合成は、アマシャム・社・製キットを用い
て行なったものである。
上述の如く得られたｍ−ＲＮＡ２μｇを用いてアマシャ
ム社の指示するモル・セル・バイオル・（Mol.Cell Bio
l.）、第２巻、第161頁（1982）及びジーン（Gene）、
第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行なった結
果、300ngの２本鎖ｃ−ＤＮＡが得られた。
このｃ−ＤＮＡ150ngを、７μｌのＴＥ緩衝液〔10mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.5）／１mMＥＤＴＡ〕に溶解し
たものに、11μｌの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム
（pH６．８）／60mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）／2mM
塩化コバルト〕及び３．８μｌのティリング混液〔10mM
ジチオスレイトール７．５μｌ／10ng／mlポリ（poly）
Ａ１μｌ／５mMｄＣＴＰ２μｌ／水110μｌ〕を夫々添
加し、更に、29ユニットのターミナルトランスフェラー
ゼ（ベーリンガー・マンハイム・社・製）を添加し、温
度30℃で10分間反応させたのち、２．４μｌの0.25MＥ
ＤＴＡ及び２．４μｌの10％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウムを夫々添加して反応を停止させた。
反応停止液に25μｌの水飽和フェノールを用いて除蛋白
処理を行なったのち、回収した水層に、25μｌの４Ｍ酢
酸アンモニウム及び100μｌの冷エタノールを夫々添加
し、温度−70℃で15分間放置し、12,000r.p.m.で10分間
遠心分離してｃ−ＤＮＡを回収し、10μｌのＴＥ緩衝液
に溶解し、ｃ−ＤＮＡ溶解液を得た。
以上の如くしてデオキシシチジンのテイルの付いたｃ−
ＤＮＡ100ngを得た。
５．ベクターに使用する組み換え体プラスミドｐＭＣＥ
10ＤＮＡの調製 大腸菌W3110株（ＡＴＣＣ27325）、プラスミドｐＢＲ32
5（ＢＲＬ・社・製）及びプラスミドｐＢＲ322ＤＮＡ
（宝酒造・社・製）を用いてティー・マスダ等（T.Masu
da et.al.）アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Agricultural Biological Chemistry）、
第50巻、第271〜279頁（1986）記載の方法により作製し
たプラスミドｐＫＮ305ＤＮＡ並びにプラスミドｐＭＣ1
403-3ＤＮＡ（特開昭61-274683号公報記載）夫々１μｇ
を、10μｌの混液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
／10mM MgCl2／100mM NaCl／1mMジチオスレイトール〕
に添加し、更に、これに、Hind III及びＳａｌｌ（いず
れも宝酒造・社・製）を夫々２ユニットずつ添加し、温
度37℃で１時間反応させて切断処理し、常法によるフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得
た。この沈澱物を、10μｌのライゲーション緩衝液〔20
mM MgCl2／６６mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）／1mMＡ
ＴＰ／15mMジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を得、
更に、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造・社・
製）を添加し、温度20℃で４時間連結反応を行なった。
次いで、この反応液を用い、ジェイ・バクテリオロジー
（J.Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁（197
4年）〕記載の形質転換法により、大腸菌ＪＭ101（ＡＴ
ＣＣ33876）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリン
耐性及びテトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有す
る組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＭＣＥ10と命名し
た。この組み換え体プラスミドｐＭＣＥ10ＤＮＡを含有
する大腸菌ＪＭ101株を、トリプトン１％（W/V）、酵母
エキス０．５％（W/V）、及びNaCl 0.5％（W/V）からな
る培地１ｌに、該培地を用い温度37℃で16〜24時間前培
養して得た大腸菌ＪＭ101（ｐＭＣＥ10）の培養液20ml
を接種し、温度37℃で３時間振盪培養したのち、0.2gの
クロラムフェニコールを添加し、更に同一温度で20時間
同培養を行ない、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により6,000r.p.m.で10分
間遠心分離して湿潤菌体２ｇを得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25MＥＤＴＡ溶液（pH8.0）８ml及び20％（W/V）ド
デシル硫酸ナトリウム溶液８mlを夫々添加し、温度60℃
で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃で1
6時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したもの
を、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液６
ml（pH7.5）に溶解し、更に、これに、塩化セシウム６
ｇ及びエチジウムブロマイド溶液（10mg/ml）０．２ml
を添加したものを、常法により39,000r.p.m.で42時間超
遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行な
い、組み換え体プラスミドｐＭＣＥ10ＤＮＡを単離し、
また更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマ
イドを除去したのち、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透析を行ない純化さ
れた組み換え体プラスミドｐＭＣＥ10ＤＮＡ500μｇを
得た。
６．ベクターＤＮＡの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミドｐＭＣＥ
10ＤＮＡ15μｇを、90μｌの項目４記載のＴＥ緩衝液に
溶解し310μｌのMed緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5）／100mM MgCl2／10mMジチオスレイトール／50
0mM Nacl〕を添加したのち30ユニットの制限酵素ＡccI
（宝酒造・社・製）を更に加え、温度37℃で１時間切断
処理を行ない切断処理物を得た。この切断処理物に、10
0μｌの水飽和フェノールを加え除蛋白操作を行なった
のち、水層を回収し、これに、1/10量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（pH7.5）及び２倍量の冷エタノールを加え、温度
−70℃で15分間放置したのち、12,000r.p.m.で10分間遠
心分離し、ＤＮＡを回収した。
このＤＮＡを、10μｌのＴ緩衝液に溶かし、15μｌの混
液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）／60mMトリス
−塩酸緩衝液（pH6.8）／２mM塩化コバルト〕を加えた
のち、更に、５μｌのティリング混液（項目４記載）
（５mMd ＧＴＰを用いた）を加え、また更に、５ユニッ
トのターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造・社・製）
を添加し、温度37℃で15分間反応させた。項目４記載の
ｃ−ＤＮＡティリング反応と同様の後処理を行なうこと
により組み換え体プラスミドｐＭＣＥ10ＤＮＡのＡccＩ
サイトにデオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡを
調製した。
一方、プラスミドｐＵＣ19ＤＮＡのＰstＩサイトにデオ
キシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡの調製も同時に
行なった。
プラスミドｐＵＣ19ＤＮＡ（宝酒造・社・製）30μｇ
を、350μｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、40μｌのM
ed緩衝液及び制限酵素ＰstＩ（宝酒造・社・製）120ユ
ニットを夫々添加し、温度37℃で１時間切断処理したの
ち、常法によりフェノールによる除蛋白処理及びエタノ
ール沈澱処理によりＤＮＡを回収した。
得られたＤＮＡを、35μｌのＴＥ緩衝液に溶解したもの
に、50μｌの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.
8）／60mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）／１mM塩化コバ
ルト〕、19μｌの項目４記載のティリング混液（ｄＧＴ
Ｐ含有）並びに60ユニットのターミナルトランスフェラ
ーゼ（宝酒造・社・製）を夫々添加し、温度37℃で10分
間反応させたのち、常法によりフェノール処理及びエタ
ノール沈澱を行なうことによりＤＮＡを回収した。
７．アニーリング及び形質転換 合成したｃ−ＤＮＡ15ng及びベクタ−ＤＮＡ200ngを、3
5μｌのアニール緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）／100mM NaCl／１mMＥＤＴＡ〕に溶解し、温度65
℃で２分間、温度46℃で２時間、温度37℃で１時間及び
温度20℃で18時間放置する操作によりｃ−ＤＮＡとベク
ターＤＮＡをアニールした。
アニールしたＤＮＡを用いて、ハナハン（Hana-han）の
方法〔ディーエヌエイ クローニング（ＤＮＡ Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌Ｄ
ＨＩ株 （ＡＴＣＣ33849）を形質転換し、プラスミド
ｐＵＣ19ＤＮＡ及び組み換え体プラスミドｐＭＣＥ10
ＤＮＡをベクターとしたｃ−ＤＮＡバンクを夫々作製し
た。
８．ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索 組み換え体プラスミドｐＭＣＥ10ＤＮＡのＡccＩ部位
は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部
位にあるので、この部位は組み込まれたｃ−ＤＮＡはβ
−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み換
え体プラスミドｐＭＣＥ10のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子のプロモーターは前述した様に大腸菌トリプトファン
遺伝子のプロモーターに変換してある。
組み換え体プラスミドｐＭＣＥ10ＤＮＡを、ベクターと
するｃ−ＤＮＡバンクのコロニー96個を10mlのＭ９カザ
ミノ酸培地〔モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）、第440〜441頁、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー（Colod Spring Harbor Laborato
ry）（1982）〕にチアミン（10μｇ／ml）を加えた培地
を用い温度37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌し
たのち、200μｌの項目２記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サ
ンプル緩衝液に懸濁し、温度100℃で５分間煮沸した。
この懸濁液40μｌを、７．５％（W/V）ポリアクリルア
ミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった。泳
動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエスタンブロッ
ト法〔アナル・バイオケム・（Anal.Biochm.）、第112
巻、第195頁（1981）〕によりニトロセルロースのフィ
ルターに転写し、このニトロセルロースフィルターをイ
ミューンブロットアッセイキット（バイオラッド・社・
製）を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。方法
は、バイオラッド社の操作法に従った。
即ちニトロセルロースのフィルターを、100mlのブロッ
キング溶液［ＴＢＳ緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝液／
500mM NaCl(pH7.5）〕に３％（W/V）のゼラチンを溶か
した溶液］中温度25℃で、30分間振盪した。次に、この
ニトロセルロースフィルターを25mlの一次抗体溶液〔ル
シフェラーゼ抗血清を１％（W/V）のゼラチンをＴＢＳ
緩衝液に溶かした溶液で25培（V/V）に希釈した溶液〕
に移し、温度25℃で90分間振盪したもの、100mlのツィ
ーン（Tween）−20洗液〔ＴＢＳ緩衝液に0.05％（W/V）
のツィーン（Tween）−20を溶かした溶液〕中に移し、
温度25℃で10分間振盪する操作を２回行なった。次い
で、このようにして得たニトロセルロースフィルターを
60mlの二次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識した抗ウサギ抗体（バイオ・ラッド社製）を１％（W/
V）のゼラチンをＴＢＳ緩衝液に溶かした溶液で3000倍
（V/V）に希釈した溶液〕中に移し、温度25℃で60分間
振盪したのち、100mlのツィーン（Tween）−20洗液でニ
トロセルロースフィルターを洗う上記操作を２回繰り返
し、このようにして得たニトロセルロースフィルター
を、120mlの発色液〔60mgの４−クロロ−１−ナフトー
ルを20mlの冷メタノールに溶解した溶液及び60μｌの30
％（V/V）過酸化水素水を100mlのＴＢＳ緩衝液に添加し
た溶液を混合した溶液〕中に移し、温度25℃で10分間発
色させた。
この様にして96個のコロニーを１グループとして４グル
ープについて同様の方法を行なったところ、２つのグル
ープでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが認
められた。次に、この２つのグループに属する96個のコ
ロニーを12個のコロニーずつ８グループに分け同様の操
作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェラーゼ
血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、このグル
ープに含まれる１２個のコロニーを、１個のコロニーず
つ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反応する
蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作によりル
シフェラーゼｃ−ＤＮＡをもつ２個のコロニーが得られ
た。この２個のコロリーより項目５記載の方法でプラス
ミドＤＮＡを調製した。得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡは、ｐＡＬｆ２Ｂ８及びｐＡＬｆ３Ａ６と夫々命
名した。
９．大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−ＤＮＡの
プローブの作製 組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３Ａ６ＤＮＡ100μｇ
を、330μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、これに40μｌのＬo
w緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）／100mM M
gCl2／10mMジチオスレイトール〕、130ユニットのＰst
Ｉ（宝酒造・社・製）及び120ユニットのＳacＩ（ベー
リンガー・マンハイム・社・製）を添加し、温度37℃で
１．５時間切断した。
このＤＮＡ全量を０．７％（W/V）アガロースゲルを用
い電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動はティ
ー・マニアテス（T.Maniatis）等の方法〔モレキュラー
・クローニング（Molecular Clo-ning）、第156〜161
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Habor Laboratory）（1984）〕に従って
行なった。ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを含むＤＮＡバン
ドを切り出し、透析チューブに入れ、２mlのＴＥ緩衝液
を加えたのち、透析チューブをシールとし、電気泳動に
より、ゲル中より緩衝液中にＤＮＡを溶出した。この溶
液に等容量の水飽和フェノールを加え、撹拌したのち、
水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収した。
得られたＤＮＡフラグメント10μｇを、126μｌのＴＥ
緩衝液に溶かし、16μのMed緩衝液及び64ユニットのSau
３ＡＩ（宝酒造・社・製）を加え、温度37℃で２時間反
応させたのち、全量を５％（W/V）ポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動により、ＤＮＡ断片の分離を行な
った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、エイ・マク
サム（A.Maxam）の方法〔メンズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）、第65巻、第506頁（19
80）〕に従って行なった。190bpのＤＮＡフラグメント
を前述と同様の方法で単離し、１μｇのSau３ＡＩルシ
フェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントが得られた。
この１μｇのルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを、〔α−
32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマシャム・社・製）を用いてニック
トランスレーション法により標識した。ニックトランス
レーションは宝酒造社製のキットを用い、宝酒造の指示
するジェイ・モル・バイオル・（J.Mol.Biol.）、第113
巻、第237〜251頁（1977）及びモレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コールド
・スプリング・バーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Habor Laboratory）（1982）記載の方法に従って行なっ
た。
10．大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−コロニー
ハイブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Ｐで標識したルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡ断片を、プローブとして用い、組み換え体プラ
スミドｐＵＣ19ＤＮＡをベクターとするフォティナス・
ピラリス尾部ｃ−ＤＮＡバンクを、コロニーハイブリダ
イゼーション法（蛋白質・核酸・酵素、第26巻、第575
〜579頁（1981）で検索し、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ
を有するコロニーを得た。そのうちの１個のコロニーの
有する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＡＬｆ３と命名
し、項目５記載の方法でプラスミドＤＮＡを調製した。
該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌ＤＨ１（ｐＡＬｆ３）と命名した。なお、該形質転換
株はＡＴＣＣ67462として寄託されている。
そして、上記組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡ
を、ＸbaＩ、Ｈind III、ＢamＨＩ、ＥcoＲＩ及びＰst
Ｉ（いずれも宝酒造・社・製）を用い、単一消化及び２
重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動法により移動度パターンを分析し、得られた移動度パ
ターンとλＤＮＡ（宝酒造・社・製）をＨind IIIによ
り消化して得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンと
対比することにより得られた分子量は、1,700bpであ
り、上記プラスミドの制限酵素地図は、第１図に示すと
おりであった。
11．ルシオラ・クルシアタ（Luciola Cruciata）のｍ−
ＲＡＮの調製 生きたルシオラ・クルシアタ（ゲンジボタル・株式会社
・西部百貨店より購入）10ｇを超低温冷蔵庫に入れ、凍
結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部２
ｇに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、項目１記載の方法に従って１．１mgのＲＮＡを調製
した。このＲＮＡ１．１mgを項目１記載の方法に従って
オリゴ（dT）−セルロースのカラムクロマトグラフィー
を行ない30μｇのルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−ＲＮＡ
を調製した。
12．ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクの作製 ｃ−ＤＮＡの合成はアマシャム社より購入したキットを
用い、アマシャム社の指示するモル・セル・バイオル
（Mol.Cell Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及びシ
ーン（Gene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に
従って合成した。
２μｇのルシオラ・クルシアタ尾部ＲＮＡより０．９μ
ｇの二本鎖ｃ−ＤＮＡが合成された。このｃ−ＤＮＡ
０．３μｇに項目４記載の方法を用いてポリデオキシシ
チジンのテイルを付加した。
このｃ−ＤＮＡ20ng及び項目６で調製したポリグアノシ
ンのテイルをそのＰstＩ部位に付加したｐＵＣ19プラス
ミドＤＮＡ500ngを、項目７記載の方法でアニールし、
ハナハン（Hanahan）の方法〔ディエヌエイ・クローニ
ング（ＤＮＡ Cloning）、第１巻、第109〜135頁（198
5）〕に従ってアニールしたＤＮＡにより大腸菌ＤＨ１
株（ＡＴＣＣ33849）を形質転換しルシオラ・クルシア
タ尾部ｃ−ＤＮＡバンクを作製した。
13．ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡの検索 項目10で得られた組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＡ
Ｎ10μｇを、90μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、10μｌのMe
d緩衝液、25ユニットの制限酵素ＥcoＲＩ及び25ユニッ
トの制限酵素のＣlaＩ（いずれも宝酒造・社・製）を添
加し、温度37℃で２時間反応を行ないＤＮＡを切断し
た。切断した組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡよ
りフォテナス・ピラリス（アメリカホタル）由来のルシ
フェラーゼｃ−ＤＮＡ部分を含む800bpのＥcoIR／Ｃla
ＩＤＮＡフラグメントを、項目９記載のアガロースゲル
電気泳動法を用いる方法に従って単離し、１μｇのＥco
ＲＩ／ＣlaＩＤＮＡフラグメントを得た。この１μｇの
ＤＮＡを、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ三燐酸（アマシャム・
社・製）を用いて項目９記載のニックトランスレーショ
ン法により32Ｐで標識した。32Ｐで標識したＥcoＲＩ／
ＣlaＩＤＮＡフラグメントをプローブとして、ルシオラ
・クルシアタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクを項目10記載のコロ
ニーハイブリダイゼーション法で検索することによりル
シオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを
有する大腸菌を選択した。
プローブとハイブリダイズする大腸菌コロニーを数個得
た。この中の１コロニーの有する組み換え体プラスミド
ＤＮＡをｐＧＬｆ１と命名し、項目５記載の方法に従い
組み換え体プラスミドＤＮＡを単離した。該組み換え体
プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸菌ＤＨ１（ｐ
ＧＬｆ１）と命名した。なお、該形質転換株はＡＴＣＣ
67482として寄託されている。
組み換え体プラスミドｐＧＬｆ１ＤＮＡをＨpaＩ，Ｈin
d III，ＥcoＲＶ，ＤraＩ，Ａfl II，Ｈinc II，ＰstＩ
（いずれも宝酒造・社・製）及ＳspＩ（ニューイングラ
ンドバイオラボ・社・製）を用い、単一消化及び二重消
化して得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法
により、移動度パターンを分析し、得られた移動度パタ
ーンとλファージＤＮＡ（宝酒造・社・製）をＨind II
Iにより消化して得られたＤＮＡ断片の標準移動度パタ
ーンとを対比することにより得られた分子量は、2,000b
pであり、上記プラスミドの制限酵素地図は、第２図に
示す通りである。
14．ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡの塩基配列の解析 組み換え体プラスミドｐＧＬｆ１ＤＮＡ10μｇを制限酵
素ＰstＩ（宝酒造・社・製）で切断し、ルシフェラーゼ
ｃ−ＤＮＡを含む２．０kbＤＮＡ断片を２．５μｇを
得、このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ119ＤＮＡ
（宝酒造・社・製）のｐstＩ部位にクローニングし、ｃ
−ＤＮＡの挿入方向の違いにより得られたプラスミドＤ
ＮＡを夫々ｐＧＬｆ２及びｐＧＬｆ３と命名した。組み
換え体プラスミドｐＧＬｆ１ＤＮＡ及びプラスミドｐＵ
Ｃ119ＤＮＡのＰstＩによる切断処理（項目６記載の方
法）、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ断片のアガロースゲル
電気泳動法を用いた単離（項目９記載の方法）、プラス
ミドｈＵＣ119ＤＮＡ及びルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ断
片の連結反応（項目５記載の方法）、連結反応液を用い
た大腸菌ＪＭ101株（ＡＴＣＣ33876）の形質転換（項目
５記載の方法）、並びに組み換え体プラスミドｐＧＬｆ
２及びｐＧＬｆ３ＤＮＡの調製（項目５記載の方法）
は、カッコ内記載の方法に従った。
次いで、組み換え体プラスミドｐＧＬｆ２及びｐＧＬｆ
３ＤＮＡを用いてキロシークエンス用欠失キット（宝酒
造・社・製）を用い、ヘニコフ（Henikoff）の方法〔ジ
ーン（Gene）、第28巻、第351〜359頁（1984）〕に従い
ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡに種々の欠失が導入されたプ
ラスミドＤＮＡを作製し、項目５記載の方法で大腸菌Ｊ
Ｍ101株（ＡＴＣＣ33876）に導入した。このようにして
得られた大腸菌にペルパーファージＭ13Ｋ０７（宝酒造
・社・製）を感染させることによりメッシング（Messin
g）の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enzymology）、第101巻、第20〜78頁（1983）〕に
従って１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡ
によるシークエンシングは、Ｍ13シークエンシングキッ
ト（宝酒造・社・製）を用いて上記メッシング（Messin
g）の方法に従い行なった。塩基配列の解析のためのゲ
ル電気泳動は８％（W/V）ポリアクリルアミドゲル（富
士写真フィルム・社・製）を用いて行なった。
得られたルシオクラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
ｃ−ＤＮＡのみの全塩基配列を第３図に、また、該ｃ−
ＤＮＡから翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を第
４図に夫々示した。
15．組み換え体プラスミドｐＧＬｆ15ＤＮＡの構築 組み換え体プラスミドｐＧＬｆ１ＤＮＡ５μｇを、90μ
ｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、10μｌのMed緩衝液
及び25ユニットのＳspＩを添加し、温度37℃で２時間消
化したのち、更に、これに等容量の水飽和フェノールを
添加し、常法に従い除蛋白操作を行なった。消化した組
み換え体プラスミドｐＧＬｆ１ＤＮＡよりルシオラ・ク
ルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡをコードする
1.7KbＤＮＡフラグメントを項目９記載のアガロースゲ
ル電気泳動を用いる方法を利用して単離し、１μｇの
１．７Ｋｂ ＳspＩフラグメントを得た。
一方、プラスミドｐＵＣ18ＤＮＡ（宝酒造・社・製）１
μｇを、18μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、２μｌのＳmaＩ
緩衝液（100mMトリス−塩酸緩衝液液（pH8.0）／70mM塩
化マグネシウム／200mM塩化カリウム／70mM２−メルカ
プトエタノール／０．１％ウシ血清アルブミン〕及び５
ユニットのＳmaＩ（宝酒造・社・製）を添加し、温度37
℃で１時間消化したのち、常法によりフェノール抽出及
びエタノール沈澱を行ない、沈澱物を得た。
０．５μｇのＳmaＩで消化したプラスミドｐＵＣ18ＤＮ
Ａ及び０．５μｇの１．７Ｋｂルシオラ・クルシアタ由
来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントを、７μｌ
の水に溶解し、13μｌの混液〔77mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.4）／15mM塩化マグネシウム／15mMジチオスレイ
トール／0.15mMアデノシン三燐酸〕及び１ユニットのＴ
４リガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・社・製）を添
加し、温度８℃で18時間連結反応を行った。この反応液
を用い、項目７記載の如くして大腸菌ＪＭ101株（ＡＴ
ＣＣ33876）を形質転換し、得られた形質転換株より、
項目５の如くしてプラスミドＤＮＡを単離した。単離し
たプラスミドＤＮＡを、Ｈind III（宝酒造・社・製）
で単一消化し１．５Kb及び２．９KbのＤＮＡ断片を生じ
るプラスミドＤＮＡを選択し、この組み換え体プラスミ
ドＤＮＡをｐＧＬｆ15、このプラスミドＤＮＡを有する
大腸菌を大腸菌ＪＭ101（ｐＧＬｆ15）と命名した。な
お、大腸菌ＪＭ101（ｐＧＬｆ15）はＡＴＣＣ67461とし
て寄託されている。
大腸菌ＪＭ101（ｐＧＬｆ15）を項目５記載の方法で培
養し、組み換え体プラスミドＤＮＡを単離することによ
り１の培養液より１．２mgの純化された組み換え体ｐ
ＧＬｆ15ＤＮＡが得られた。
16．大腸菌ＪＭ101（ｐＧＬｆ15）（ＡＴＣＣ67461）の
培養及び粗酵素液の調製 大腸菌ＪＭ101（ｐＧＬｆ15）（ＡＴＣＣ67461）を、Ｌ
Ｂ−amp培地〔バクトトリプトン１％（W/V），酵母エキ
ス0.5％（W/V），NaCl０．５％（W/V），及びアンピシ
リン（50μｇ／ml）〕３mlにて温度37℃で18時間振盪培
養を行なった。この培養液０．５mlを10mlの上記ＬＢ−
amp培地に接種し、更に、これに、１mMのイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシドを添加し、温度37℃で４時
間振盪培養したのち、8,000r.p.m.で10分間の遠心分離
操作により湿潤菌体20mgを得た。
回収した菌体を、０．１M KH2PO4(pH7.8）、２mMＥＤＴ
Ａ、１mMジチオスレイトール及び０．２mg／mlプロタミ
ン硫酸からなる緩衝液０．９mlに懸濁し、更に、これ
に、100μｌの10mg／mlのリゾチーム溶液を添加し、氷
中に15分間放置した。次に、この懸濁液を、メタノール
・ドライアイス浴中で凍結し、続いて温度25℃に放置
し、完全に解凍した。更に、12,000r.p.m.で５分間遠心
分離操作を行なうことにより上清として粗酵素液１mlを
得た。
このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活
性の測定は、下記記載方法により行ない、その結果を下
表に示した。
得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活性の測定は、ク
リッカ（Kricka）等の方法〔アチーブス・オブ・バイオ
ケミストリー・アンド・バイオフィズィクス（Archives
of Biochemistry and Bioph-ysics）、第217巻、第674
頁（1984）〕に従って生成するフォトン数を計測するこ
とにより行なった。
すなわち、260μｌの25mMグリシルグリシン緩衝液（pH
7.8）、16μｌの０．１Ｍ硫酸マグネシウム24μｌの１m
Mルシフェリン（シグマ・社・製）及び10μｌの粗酵素
液を混合したのち、100μｌの20mMＡＴＰを添加し、発
生するフォトン数を20秒間積算した値を下表に示した。
また、比較のため、プラスミドｐＵＣ18ＤＮＡを有する
大腸菌ＪＭ101株〔大腸菌ＪＭ101（ｐＵＣ18）〕につい
ても同様にルシフェラーゼ活性を測定し、その結果を下
表に示した。
上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し、フォト
ン数が増加しているため、本発明に用いた大腸菌菌体中
にルシフェラーゼが生産されていることが判明した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡの制
限酵素による切断地図を示す図であり、第２図は、組み
換え体プラスミドｐＧＬｆ１ＤＮＡの制限酵素による切
断地図を示す図であり、第３図は、本発明ルシフェラー
ゼ遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第４図は、
本発明ルシフェラーゼ遺伝子から翻訳されるポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す図である。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
    ルシフェラーゼ遺伝子。
  2. 【請求項２】下記に示される塩基配列で表わされる特許
    請求の範囲第１項記載のルシフェラーゼ遺伝子。
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