JPS63267292A - 新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は第１表のアミノ酸配列を有するヒト顆粒球コロ
ニー」］戟因子（以下ｈＧ−ＣＳＦと略記する）ポリペ
プチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換される
か、および／または一部のアミノ酸が欠失したアミノ酸
配列を有する新規ポリペプチド（以下ｈＧ−ＣＳＦポリ
ペプチド誘導体とも称する）、該ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆポリ
ペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ組
換え体プラスミド、該プラスミドを含む微生物および該
微生物を用いるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆポリペプチド誘導体の
製造法に関する。

産業上の利用分野 ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ）は、
造血幹細胞を増殖・分化させ種々の血球を形成させる際
に必須なポリペプチドの１種で、主として顆粒球、なか
でも好中球の増加を促進する効果をもつ。好中球は生体
の感染防御において重要な役割を担っているが寿命が短
く、前駆細胞の恒常的な増殖・分化によって常に補給さ
れていなければならない。近年広く行われている増殖性
腫瘍に対する治療は、同時に好中球前駆細胞の増殖を阻
止するため、担癌患者の感染防御機能を低下させるとい
う重篤副作用をもつ。ｈＧ−ＣＳＦは、好中球の増加を
促進することにより、この副作用を軽減し、他方、感染
症を予防・治療する効果をもつものと期待される。さら
に、ｈＧ−ＣＳＦには、白血病細胞株をｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏにおいて分化させる活性があり、白血病に対する治療
薬となる可能性もあるものとみられる。本発明のｈ　Ｇ
−ＣＳ　Ｆポリペプチド誘導体は、既知のｈＧ−ＣＳＦ
よりすぐれたｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ活性を有しており、医薬
品としての利用が期待される。

従来の技術 近年急速に発展してきた組換えＤＮＡ技術により、血球
の増殖・分化に係わるタンパク質性の因子の遺伝子が次
々と単離されてきた。それらの因子は、微生物や動物細
胞を利用して遺伝子工学の手法で生産されている。

ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆは、長田らがヒト扁平上皮癌細胞株Ｃ
ＨＵ−ｎよりｃＤＮＡを単離してその塩基配列を決定し
、ＣＯ８細胞での発現を報告している〔長田ら：ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１９．４１５（１９８６））。

また、スープ（Ｓｏｕｚａ）　　らはヒト膀胱癌細胞株
５６３７よりｃＤＮＡを単離してその塩基配列を決定し
、大腸菌での発現を報告している〔スープら：サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３２．　６１　（１９８６）
〕。

上記２つのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の
アミノ酸配列と本発明者が正常人末梢血マクロファージ
より単離したｃＤＮＡによってコードされるタンパク質
のアミノ酸配列（第１表）とは一致している。

第　　　　　　１　　　　　　表 ＴｈｒＰｒｏＬｅｕＧｌ　ｙＰｒｏＡｌａＳｅｒｓｅｒ
ＬｅｕＰｒｏＧ］　ｎ５ｅｒＰｈｅＬｅｕＬｅｕＬｙｓ
ＣｙｓＬｅｕＧｌ　ｕＧ　１ｎＶａ　ｌＡｒｇＬｙｓｌ
　］ｅＧ　ｌｎＧ　１ｙＡｓｐＧ　１ｙＡＩａＡ　Ｉａ
ＬｅｕＧ］ｎＧ　Ｉ　ｕＬｙｓＬｅｕＣｙｓＡ　１ａＴ
ｈｒＴｙｒＬｙｓＬｅｕＣｙｓＨｉ　５ＰｒｏＧｌｕＧ
ｌ　ｕＬｅｕＶａ］　ＬｅｕＬｅｕＧＩ　ｙＨｉ　５Ｓ
ｅｒＬｅｕＧ］　ｙｌ　Ｉ　ｅＰｒ。

Ｔｒｐ＾１ａＰｒｏＬｅｕＳｅｒＳｅｒＣｙｓＰｒｏＳ
ｅｒＧＩｎ＾１ａＬｅｕＧｌｎＬｅｕＡｌａＧｌｙＣｙ
ｓＬｅｕＳｅｒＧ　］　ｎＬｅｕＨ１ｓＳｅｒＧ　ｌ　
ｙＬｅｕＰｈｅＬｅｕＴｙｒＧ　ｌｎＧ　ｌ　ｙＬｅｕ
ＬｅｕＧ　Ｉ　ｎＡ　Ｉ　ａＬｅｕＧ　ｌｕＧ　Ｉ　ｙ
ＰｈｅＡ］　ａＴｈｒＴｈｒＩ　］ｅＴｒｐＧＩｎＧ］
　ｎＭｅｔＧｌｕＧｌ　ｕＬｅｕＧＩ　ｙＭｅｔＡｌ　
ａＰｒｏ八ｌ　へＬｅｕＧＩ　ｎＶａＩＬｅｕＶａＩＡ
ｌ　ａＳｅｒＨｉｓＬｅｕＧ］　ｎＳｅｒＰｈｅＬｅｕ
ＧｌｕＶａｌＳｅｒＴｙｒＡｒｇＶａ］　ＬｅｕＡｒｇ
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、比活性が高く、血中での安定性の高い
ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体を安価に大量に製造す
る手段を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、第１表に示されたｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆのｃ
ＤＮＡを改変し、改変したｃＤＮＡを組み込んだプラス
ミドを担う大腸菌を培養することにより、またプロテア
ーゼを用いるポリペプチドの限定分解により比活性の高
いｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆポリペプチド誘導体を製造できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

発明の詳細な説明 本発明によれば、新規なｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ”ポリペプチ
ド誘導体、該ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを
組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含む微
生物および該微生物を用いる新規なｈＧ−ＣＳＦポリペ
プチド誘導体の製造法が提供される。

本発明のｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体は、。

第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦポリペプチ
ドの一部のアミノ酸が他種アミノ酸で置換されるか、お
よび／または一部のアミノ酸゛が欠失したものである。

置換されるアミノ酸はＮ末端近傍のアミノ酸であり、Ｎ
末端から１〜１７番目のアミノ酸のうち少なくとも１個
であることが望ましい。欠失するアミノ酸はＮ末端近傍
のアミノ酸であり、Ｎ末端から１−１１番目のアミノ酸
のうち少なくとも１個であることが望ましい。

本発明の組換え体プラスミドは、上記ｈ　ｃ−ｃＳＦポ
リペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片がＤＮＡの発
現機能を持つ適当なプラスミドに組み込まれたものであ
る。

本発明のｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆポリペプチド誘導体をコード
するＤＮＡ断片としては、第１表に示されるｈ　Ｇ−Ｃ
Ｓ　ＦをコードするＤＮＡの塩基配列の第１〜５１番目
の塩基のうち少なくとも１個が置換した配列を有するも
のが好ましい。

第１表に示されるｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡとし
ては、ｈＧ−ＣＳＦをコードするメンセンジャーＲＮ△
から組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａ　（ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ）または染色体ＤＮＡか
ら得られるｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦをコードするＤＮＡなどが
利用できる。

ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡとしては、ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆをコ
ードしているものであればいかなるものも用いることが
できるが、具体的にはｐｃｓＦｌ−２を用いることがで
きる。ｐｃｓＦｌ−２は、本発明者によって製造された
ものであり、その製造法は参考例１に記載されている。

ｐｃｓＦｌ−２中のｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡは、Ｍ１３フ
ァージを用いたディデオキシ・シーフェンス（ｄｉｄｅ
ｏｘｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）法〔ジェイ・メシング（Ｊ
、　Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９．
２６９　（１９ｇ２＞〕により決定された第１表に示す
塩基配列を有している。

ｐｃｓＦ　１−２は第１図に示した制限酵素地図を有す
るプラスミドで、それを含む大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　［１ＣＳＦ　　１−２　　（Ｆ
ＩＥＭＲ０Ｐ−１２２０）　　　として昭和６１年１１
月２７日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研
）に寄託されている。

ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを
組み込むプラスミドとしては、大腸菌で該ＤＮＡが発現
できるものならいかなるプラスミドでも使うことができ
る。

好ましくは、適当なプロモーター、例えば、ｔｒｐ系、
ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入する
ことができ、しかもシャイン−ダルガノ配列（以下ＳＤ
配列と略記する）と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適当な
距離、例えば６〜１８塩基対に調節したプラスミドを用
いることができる。

具体的に好適なプラスミドとしては、ｐ　ＫＹＰｌｏ（
特開昭５８−１１０６００）　、ｐＬｓＡｌ　　（参考
例３）、ｐＧＥＬｌ　［開板ら：プロシーディング・オ
プ・ヂ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、ＵＳ
Ａ　　８２．４３（１６（１９８５）　）　、ｐ　ＫＹ
Ｐ　２６　（特開昭６２−４８６９９）、ｐＢＲ３２２
Ｃポリバー（９ｏ１ｉｖａｒ）　　ら：ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）　２．９５（１９７７）　）などがあげられる。

ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆポリペプチドおよびその誘導体をコー
ドするＤＮＡとベクターＤ　Ｎ　Ａとの組換えは、制限
酵素を用いて両Ｄ　Ｎ　Ａを消化後、Ｔ４ＤＮＡリガー
セを用いて結合する一般的組換えＤ　Ｎ　’Ａ技法を用
いて行うことができる。結合に際しては、制限酵素を用
いて消化したＤＮＡ断片の末端を、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ・クレノー断片を用いる埋め込み反応、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いる埋め込み反応または削り込み反応を
利用して加工する方法やＤＮＡ！Ｊンカーを用いる方法
によっても行うことができる。

ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡとしてｐｃｓＦｌ−２を、該ＤＮ
Ａを組み込むためのプラスミドとしてｐＧＥＬＩ、ｐＫ
ＹＰｌｏ、ｐＫＹＰ２６．ｐＢＲ３２２゜ｐＬｓＡｌを
用い、また必要な場合には、化学合成したＤＮＡＩＪン
カーや部位特異的変異を用いて、ｈＧ−ＣＳＦポリペプ
チド誘導体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体プ
ラスミドを造成する例を以下に述べる。

第１図に示したようにしてｐｃｓＦｌ−２Ｃ約４．５キ
ロベース（以下ｋｂと略記する）〕を＾ｐａｌと３ａｍ
ＨＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧ
Ｔ法）〔エル・ライスラング−（Ｌ。

Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ）　：アナリティカル・パイオゲ
ミストリイ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）　９８．３０５　（１９７９））にて約１．
５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製する。

次いで、ｐＬｓＡｌをＢａｎ１とｆ３ａｍＨＩで切断し
た後、ＬＧＴ法にて約２．８　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精
製する。このようにして得られた両ＤＮＡ断片と、第１
図に示した合成りＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
しｐｃｆＴＡｌを得る。

次いで、第２図に示したようにして、ｐＣｆＴ＾１をＢ
ａｍＨＩで切断後、クレノー断片で処理することにより
突出末端を平滑末端に変換し、さらにＥｃｏＲＩで切断
後、約２．５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精
製する。別にｐｃｆＴＡｌをＥｃ　ｏＲＩとＤｒａＩで
切断後、約１．ＯｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精
製する。このようにして得たＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより結合し、ｐｃｆＴＢ２０を得る。

さらに、第３図のように、ｐｃｓＦｌ−２をＡｐａｌと
ＢａｍＨＩで切断後、約１．５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を
ＬＧＴ法により精製する。また、ｐＧＥＬｌを）（ｉｎ
ｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌで切断後、約１．
７　ｋ　ｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により、精製する。

一方、ｐＫＹＰ　１０をＰｓｔＩとＢａ　ｎＩＩＩで切
断後、約１．１　ｋ　ｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により
精製する。これら３つのＤＮＡ断片と第３図に示した合
成りＮＡをＴ　４　ＤＮＡ　！Ｉガーゼにより結合し、
ｐＣｆＴＬ２３　、　ｐＣｆＴＬ３８．　ｐＣｆＴＬ３
５゜ｐｃｆＴＬ４１を得、また、これら３−”）のＤＮ
Ａ断片と第４図に示した合成りＮＡをＴ４ＤＮＡリガー
ゼにより結合し、ｐｃｆＴＭ１４．　　ｐｃｆＴＭ１７
．　ｐｃｆＴＭ１１３を得る。

さらに、第５図に示すように、ｐｃｆＴＡｌをＢａｎＩ
ＩＩと５ｔｕＩで切断後、ｈＧ−ＣＳ　Ｆ　ｃ　ＤＮＡ
を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製
する。また、ｐＫＹＰ２６をＢａｍＨＩで切断後、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ・クレノー断片で処理することにより
突出末端を平滑末端に変換し、さらにＰｓｔｌで切断後
、ＬＧＴ法にて約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。

一方、ｐＧＥＩ、１をＢａｎＩＩ［とＰｓｔＩで切断後
、約１．ＯｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する
。こうして得られた３つのＤＮＡ断片をＴ　４　ＤＮＡ
　リガーゼで結合することにより、ｐｃｆＷＤｌを得る
。

さらに、第６図に示すように、ｐＣｆＴＬ３８をＨｉｎ
ｄｌｌとＢｇｌＩＩで切断後約２，６ｋｂのＤＮＡ断片
をＬＧＴ法により精製する。また、ｐＣｆＴＬ３８をＨ
ｉｎｄｌｌＩとＤｐｎ　Ｔで切断後、約３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。一方、ｐｃｆＴＢ
２０をＡｖａｌで切断後、クレノー断片で処理すること
により突出末端を削り、さらにＢｇｌｌＩで切断後、約
４８０ｂｐのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こ
うして得た３つのＤＮＡ断片をＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガ
ーゼで結合することによりｐ　Ｃｆ　Ｔｅ３に１９を得
る。さらに、同じく第６図に示すようにして、ｐ　Ｃｆ
　Ｔｅ３に１９をＢａｎＩＩ［とＢｇｌＩで切断後約１
．ＱｋｂのＤＮＡ断片を、またＢｇｌＩのみで切断後約
１．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ＬＧＴ法により精製する。

一方、ｐｃｆ７９５に１９をＢｇｌＩと５ａｕ３Ａで切
断後、約３５ＱｂｐのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製
する。こうして得られる３つのＤＮＡ断片と、第６図中
段に示した合成りＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、
ｐｃ　ｆ　ＡＡ　１を得る。さらに、同じく第６図に示
すようにして、ｐｃ　ｆ　ＡＡ　１をＸｈｏＩとＢｇｌ
　Ｉで切断後、約３．ＱｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法に
より精製する。このＤＮＡ断片と上記ｐＣｆＴ９５．Ｋ
　１９のＢｇ　Ｉ　ｌ−３ａｕ３Ａ断片（約３５０　ｂ
ｐ）および第６図下段に示す合成りＮＡを７４ＤＮＡＩ
Ｊガーゼで結合し、ｐＣｆＡＢ５およびｐｃｆＡＢ１４
を得る。さらに、第７図に示すよう、に、ｐｃｆＡＢ５
をＡｖａ　ＩとＢｇｌＩＩで切断後、約２，３ｋｂのＤ
ＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。また、ｐｃｆＷＤ
ｌををＢｇｌｌＩとＡｖａ　Ｉで切断後、約１，３ｋｂ
のＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして得ら
れた両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで結合し、ｐ
ＣｆＢＡ８を得る。また、ｐｃｆＡＢ１４をＡｖａｌと
ＢｇｌＩＩで切断後ＬＧＴ法により精製される約２．８
ｋｂのＤＮＡ断片と、前記ｐｃｆｌｌｌ口１の。

Ｂｇｌｎ、ＡｖａＩ断片約１．３ｋｂとをＴ　４　ＤＮ
Ａリガーゼで結合し、ｐＣｆＢＡ３２を得る。さらに、
同じく第７図に示すように、ｐＣｆＢＡ８をＢａｎ１ｌ
Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ｘｈＯＩで切断後、約１．４ｋｂと約
２．７ｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こ
うして得られる２つのＤＮＡ断片と第７図に示した合成
りＮＡ’ＪンカーをＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼで結合
させ、ｐｃｆＢＢｌｏｌ、ｐＣｆＢＣ５２、ｐＣｆＢＣ
５９、ｐＣｆＢＤ２８、ｐＣｆＢＤ５６、ｐｃ　ｆＢＣ
４２Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣｆＢ
Ｃ７７、ｐＣｆＢＣ９３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆＢＣ
９７、ｐＣｆＢＤ８２を得る。第８図に示すように、ｐ
ＢＲ３２２をｐｓｔｒで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼで突出末端を削り、Ｔ４ＤＮΔリガーゼを用いてＢｇ
　Ｉ　Ｉｆ　！Ｊンカーを挿入し、さらにＥｃｏＲＩと
ＢｇｌＩ［で切断後、約３．６ｋｂのＤＮＡ断片をＬＧ
Ｔ法により精製する。

一方、上記で得られるｐｃｆＢＢｌｏｌ、ｐＣｆＢＣ５
２、ｐＣｆＢＣ５９、ｐｃｆＢＤ２８　、ｐＣｆＢＤ５
６をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断後、約１，３ｋｂの
ＤＮＡ断片を各々ＬＧＴ法により精製する。こうして得
られる約３．６ｋｂと約１，３ｋｂのＤＮＡ断片を各々
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合することにより、各々、ｐｃ
ｆｃＢｌｏｌ、ｐｃｆｆｌ、ｃ５２、ｐＣｆＣＣ５９、
ｐＣｆＣＤ２８　、ｐＣｆＣＤ５６を得る。

他方、ｐｃ　ｆ　ＢＡ　８を１３ａｎｌｌＪ、ＢｇｌＩ
［、ＸｈｏＩで切断後、約１．４ｋｂと約２．７ｋｂの
ＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして得られ
る２つの断片と第１４図に示した合成りＮＡ！Ｉンカー
をＴ４ＤＮ、Ａリガーゼで結合させ、ｐＣｆＴＮＳ７お
よびｐＣｆ　ＴＡＡ　ｒ　ｇ　４　Ｓを得る。加えて、
第１５図に示すようにｐＣｆＴＮＳ７をＰｖｕｌ。

ＸｈｏＩで切断後、約１ｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法に
より精製する。またｐＣｆＢＡ３２をｐｖｕｌ。

Ｘｈｏｌで切断後、１約３ｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。こうして得られる２つの断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合させ、ｐ　Ｃｆ　ＴＮ２０５を得る
。同様に、ｐｃｆＴＡＡｒｇ４ｓをｐｖｕ　Ｉ　％Ｘｈ
ｏＩで切断後、ＬＧＴ法で精製して得られる約１ｋｂの
断片と、前記ｐＣｆＢＡ３２をＰｖｕ　Ｉ。

Ｘｈｏｌで切断して得られる約３ｋｂのＤＮＡ断片とを
Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼで結合させｐＣｆＴＡＡｒｇ４を
得る。また、ｐＣｆＢＡ８をＢａｎＩＩ［、Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、約１．４ｋｂと約２．７
ｋｂのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により［１する。こうして
得られる２つの断片と第１６図に示した合成りＮＡ　リ
ンカ−をＴ４ＤＮＡ　リガーゼで結合させ、ｐＣｆＴＮ
Ｓ３０１　、ｐ　Ｃｆ　ＴＮ　５４０１を得る。さらに
第１２図に示すようにｐＣｆＢＡ８をＸｈｏＩで切断後
、クレノー断片で処理することにより突出末端を平滑末
端に変換し、さらにＰｖｕ　Ｉで切断後、約３ｋｂのＤ
ＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。別に、ＡＴＧベク
ターｐＴｒｓ２０（参考例４）をＳａｃ　１で切断後、
クレノー断片で処理して突出末端を平滑末端に変換し、
さらにＰｖｕ　Ｉで切断後、ＬＧＴ法により約１ｋｂの
ＤＮＡ断片を精製する。こうして得られる２つの断片を
Ｔ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼで結合させ、ｐＣｆＴＮＳ
５０１を得る。

部位特異的変異を用いる例としては、第１７図に示すよ
うに、ｐＣｆＢＤ２８をＢａｎ１ｌＪとｐｓｔｒで切断
後、約２１０ｂｐのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製す
る。また、Ｍ１３ファージベクターのＭ１３ｍｐ１９Ｒ
ＦＤＮＡをＡｃｃＩとＰｓｔｌで切断後、約１２４ｋｂ
のＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして得ら
れる２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ　リガーゼにより結
合し、ｐｔ１９Ｂ［１２８Ｎを得る。ついで、このｐｔ
１９ＢＤ２８Ｎを大腸菌ＪＭ１０５にトランスフェクシ
ョンし、得られたファージより一本鎖ｐｔ１９ＢＤ２８
Ｎを得る。同じく第１７図に示すようにして、Ｍ１３ｍ
ｐ１９ＲＦＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥＣ０ＲＩで切断
後、約７．２　ｋ　ｂのＤＮＡ切断をＬＧＴ法により精
製する。この約７．２　ｋ　ｂのＤＮＡ断片と上記で得
られた一本鎖ｐｔ１９ＢＤ２８Ｎを混合し、変性処理の
後再びアニールさせることによりギャップト・デュプレ
ックスＤＮＡを生成させ、ＬＧＴ法によりこれを精製す
る。ついでこのギャップト・デュプレックスＤＮＡに第
１７図に示した合成りＮＡをアニールさせた後、クレノ
ー断片とＴ４ＤＮＡＩＪガーゼにより環状化する。この
環状化ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０５株にトランスフェクシ
ョンし、部位特異的変異が導入されたｐｔ１９ＢＤ２８
ＮＡ１７．ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＴ１７を得る。

さらに同しく第１７図に示すようにしてｐｔｌ’９ＢＤ
２８ＮＡ１７．ｐｔ１９ＢＤ２７ＮＴ１７をＡｖａＩと
ｘｈＯＩで切断後、約１１０　ｂ　ｐノＤＮＡ断片を各
々ＬＧＴ法により精製する。一方、ｐＣｆＢＤ２８をＸ
ｈｏｌとＢｇｌＩ［で切断後、約２．７４ｋｂのＤＮＡ
断片をＬＧＴ法により精製する。また、ｐＣｆＢＤ２８
をＢｇｌＩ［とＡｖａＩで切断後、約１．２９ｋｂのＤ
ＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして得られる
約１１０ｂｐ　、約２，７４ｋｂ。

約１．２９　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を各々Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合することにより、各々ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７
．ｐｃｆＢＤ２８Ｔ１７を得る。

上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常０．１〜２０■
のＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍＭ
）のＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ’（ｐＨ６，０〜９．５好ま
しくはｐＨ７，０〜８．０）　、Ｏ〜２００ｍＭのＮａ
Ｃｊ！、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ
ｇＣβ２を含む反応液中で、制限酵素０．１〜１００単
位（好ましくはＩＮのＤＮＡに対して１〜３単位）を用
い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異
なる）にふいて、１５分間〜２４時間行う。反応の停止
は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱することに
よるが、フェノールまたはジエチルピロカーボネートな
どの試薬により制限酵素を失活させる方法も用いること
ができる。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片あるいはギャッ
プト・デュプレックスＤＮＡの精製は、ＬＧＴ法やポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法〔エイ・エム・マキサム
（Ａ、　Ｍ、　Ｍａｘａｍ）　　ら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）。

ＵＳＡ　７４．、５６０　（１９７７）Ｅなどによって
行う。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ６，１〜
９．５、好ましくはｐＨ７゜０〜８．０）、２〜２０ｍ
Ｍ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ　ｇ　Ｃ４２２，
０，１〜１０ｍＭ（好ましくは０．５〜２．０　ｍＭ）
のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ　（好ましくは５〜１°ＯｍＭ
）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好まし
くは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２
〜２０時間）行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ・コー
エン（Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）　　ら：プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
）　ＵＳＡ６９、２１１０（１９７２））によって、大
腸菌に導入する。

結合反応によって生じた組み換え体Ｍ１３ファージＲＦ
ＤＮＡは、必要により公知のトランスフェクション法〔
口野嘉幸ら：蛋白質・核酸・酵素２９、２９４　（１９
８４））によって、大腸菌ＪＭ１０５株〔ジェイ・メシ
ング（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ）　　ら：ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）　３３．１０３　（１９８５）：ｌに導入する。

組換え体プラスミドＤＮＡおよび組み換え体Ｍ１３ファ
ージＲＦＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの単離は、バ
ーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｈ
，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）　　ら：ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、）ユ、　１５１３　（１９７９）　）などを用いて行
う。

組み換え体Ｍ１３ファージからの一本鎖ＤＮＡの単離は
公知の方法〔口野嘉幸ら；蛋白質・核酸・酵素　２９．
２９４　（１９８４）］に従って行う。

プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。

さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要があるときはＭ
１３ファージを用いたディデオキシ・シーフェンス（ｄ
ｉｄｅｏｘｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）法〔ジエイ・メシン
グ（ＪｏＭｅｓｓｉｎｇ）　　ら：　ジーン（Ｇｅｎｅ
）１９．２６９（１９８２）　）によって決定する。

以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。

本発明のｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆポリペプチド誘導体は以下の
とおりに製造できる。

すなわち、プラスミド（例えばｐＣｆＢＤ２８）を用い
て大腸菌に一１２ＨＢ１０１を形質転換させ、アンピシ
リン耐性（Ａｐ’以下同じ）のコロニーの中からプラス
ミド（例えばｐＣｆＢＤ２８＞を有する大腸菌を選びだ
す。プラスミド（例えばｐｃｆＢＤ２８）を有する大腸
菌を培地に培養することにより培養物中にｈ　Ｇ−ＣＳ
　Ｆポリペプチド誘導体を生成させることができる。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにｈ　Ｇ
−ＣＳ　Ｆポリペプチド誘導体の生産に好適なものなら
ば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、クリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ４Ｃｊ！、（ＮＨ，）２ＳＯ，
、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、
バタトトリプトン、コーン・ステイープ・リカーなどが
、その他の栄養源としてはに、ＨＦＯ２、ＫＨ，ＰＯ２
、ＮａＣβ、ＭｇＳＯ３、ビタミンＢ＋　、ＭｇＣβ２
などが使用できる。

培養はｐ　Ｈ５，５〜８，５、温度１８〜４０℃で通気
撹拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培養菌体
中にｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体が蓄積するので、
培養物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕
し、遠心して菌体残渣を得る。この菌体残渣からマース
トンらの方法ＣＦ、　Ａ、　０゜！、１ａｒＳｔＯｎ　
　ら　：　ＢＩＤ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　　　二２．
　８００　　　（１９８４）　　）によりｈＧ−ＣＳＦ
ポリペプチド誘導体を抽出・精製・可溶化・再生し、該
誘導体でマウス骨髄細胞を処理し、軟寒天中に形成され
るコロニー数を指標としたアッセイ法によりｈ　Ｇ−Ｃ
Ｓ　Ｆポリペプチド誘導体の定量を行う。

本発明におけるＧ−Ｃ８Ｆ活性の測定は以下のように行
う。８〜１２週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（静岡実験動
物協同組合）の大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出し
、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したａ　−Ｍｉｎ
ｉｍｕｎ＋　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｐｌ
ｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、以下ａ　−Ｍ　Ｅ　
Ｍ培地と略す）に懸濁する。この細胞（約５　Ｘ　１０
’個）懸濁液１．５ｍｌを、ナイロン・ウール（Ｎｙｌ
ｏｎ　ｗｏｏｌ）　　（和光純薬、Ｎｙｌｏｎ　Ｆｉｂ
ｅｒ　１４６−０４２３１）をつめたカラム（０，３ｇ
）に浸漬し、５％ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃
９０分間反応させる。次いで予め３７℃に加温したα−
ＭＥＭ培地をカラムに流し、溶出してくるナイロン・ウ
ール非吸着性の骨髄細胞を得る。この細胞をα−ＭＥＭ
培地で一回洗浄し、所定の濃度に調製する。

次いで、開部らの方法（Ｏｋａｂｅ　Ｔ、　ｅｔ　ａｔ
、、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　　４４．４５０
３−４５０６（１９８６）　）に準じて骨髄造血幹細胞
コロニー形成能を測定する。すなわち、ａ−ＭＥＭ　　
０．２ｍ１ＳＦＢＳ　　０．４ｍｌおよび２段階稀釈し
た各サンプルＱ、２ｍｌの混液に、上記の方法で調製し
た骨髄細胞（２Ｘ１０’個／ｍ　ｌ　）の０，２ｍｌを
混和する。これに４２℃に保温した０、６％寒天（Ｉｌ
ｉｆｃｏ、　Ａｇａｒ　ｐｕｒｉｆｌｅｄ　＃　０５６
０−０１）溶液を等量（１，０ｍ１）混和し、その０．
５ｍｌを２４穴？／ｌ／チディッシ：Ｌ（Ｎｕｎｃ社製
、＃　１４３９８２）に播種する（５　Ｘ　１０’個／
ｄ＋ｓｈ、　　ｎ　＝　３’）　ｏ　５％ＣＯ，インキ
ニベーター中で３７℃７日間培養し、４０個以上の細胞
からなるコロニーの数を顕微鏡（Ｏ１ｙｍｐｕｓ１重、
Ｋ４０）で計数する。コロニー計数後、注意深くスライ
ドグラス上にとり出し、アセトン・ホルマリン混液で３
０秒間固定後、Ｋｕｂｏｔａらの方法ＣＫｕｂｏｔａ　
Ｋ１．　ｅｔ　ａｌ、、　ＩＥｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌｏ
ｇｙ、　　８．３３９−３４４　（１９８０））でニス
テラー１２電果色を施し、各コロニーの同定を行う。

各サンプルの力価は、コロニー形成試験の２段階稀釈に
於ける計数結果から以下の様に算出する。

スタンダードとして用いたインタクトＧ−ＣＳＦのコロ
ニー形成の最大値のＡ値を与える活性を５０単位と定義
し、これに各サンプルの稀釈率および単位ｍ１当りの活
性に換算するため、２０を乗じて力価（単位）とする。

比活性は、単位蛋白質（ａ＋ｇ）当りの力価（単位／ｍ
ｇ）で表示する。

ｈ（、−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側のアミノ酸が欠
失したｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆポリペプチド誘導体は酵素的分
解方法により製造することもできる。

該誘導体は天然のｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆを原料物質として用
い酵素分解により製造することもできるが、天然のｈＧ
−ＣＳＦは酵素（プロテアーゼ）に対する反応性が低い
ので、プロテアーゼに対して反応性の高められた改変ｈ
Ｇ−ＣＳＦを用いた方が高活性を有する誘導体を収率よ
く製造することができる。

原料物質としては、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端
側アミノ酸が第２表のように置換した改変ｈＧ−ＣＳＦ
（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）および（社）が好適に用いられ
る。（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）および（ｄ）は、対応する
塩基配列を有するプラスミドｐｃ　ｆ　ＢＣ５９（ＮＣ
５９）、ｐＣｆ　ＢＤ２８　（ＮＤ２８）、ｐ　Ｃｆ　
ＢＣ９５（ＮＣ９５）およびｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ　（
Ａｒｇ４Ｓ）をそれぞれ保有する菌株を培養し公知の方
法で精製単離することにより得ることができる。

酸素としては、セリンプロテアーゼ、チオールプロテア
ーゼなどのエンドプロテアーゼが好適に用いられる。具
体的には、例えば、ズブチリシンＡ１ズブチリシンＢＰ
Ｎ’　、ズブチリシンカールスバーグ、ズブチリシンノ
ボ、プロテア−ゼに１ナガーゼ、サーモライシン、エン
ドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ，）リブシン、α−キモト
リプシンなどがあげられる。酵素は、原料物質の１ｍｇ
に対して３．４Ｘ１０−’〜８．５　Ｘ　］、　０−’
単位の割合で用いる。

第２表　Ｎ束端部プロテアーゼ感受性ｈＧ−ＣＳＦ誘導
体の例酵素反応は、原料物質をトリス塩酸緩衝液あるい
はリン酸緩衝液などの水性溶液に溶かし、酵素を加えて
、１０〜３７℃で３０分間〜３日間行う。

本発明における総蛋白質量、蛋白質量は以下に記載する
方法によって測定する。

総蛋白質量の測定はエム・エム・ブラッドフォードの方
法（ＭｌＭ、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　：アナリティ力ルー
バイオケミストリイ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）
　７２．２４８（１，９７６）　）により行う。

蛋白質量はレムリの方法（Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ
　：ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７．６８０　
（１９７０）　〕により〕ＳＯ３−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳を行った後、クロマトスキャナー（Ｃ３−９
３０高車製作所）で測定する。

酵素切断後に得られるペプチドのＮ末端アミノ酸配列は
自動アミノ酸配列測定機“ガス−フェーズ・プロティン
・シークエンサー・モデル４７０Ａ″　（アプライド・
バイオシステムズ社製）とスペクトラ・フィジクス（Ｓ
ｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）社製高速液体クロマト
グラフィーの組み合せによって測定する。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ発現プラスミドｐｃｆＴＡ１の造成（
第１図参照）： 参考例１により得られたｐｃｓＦｌ−２ＤＮＡ２■を１
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（＋）８７．５）、７
　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．６　ｍＭ　２−メルカプ
トエタノールおよび１００ｍＭ　　ＮａＣ１を含む全量
２０ｇの溶液（以下“Ｙ−１００緩衝液”と略す）に溶
かし、制限酵素Ａｐａｌ［：ベーリンガー・マンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製〕と
Ｂａｎ＋ＨＩ（全酒造社製、以下制限酵素については特
記しない限りすべて全酒造社製）それぞれ１０単位を加
え、３７℃で４時間反応を行った。この反応液からＬＧ
Ｔ法によりｌ、　５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片０．４塊をｆ
ｉｔ製、回収した。

別に参考例３の方法で調製したプラスミドｐＬＳＡ１２
■をＹ−１００１衝液２０ＩｔＩｌに溶かし、制限酵素
３ａｎＩＩ［（東洋紡績社製）とＢａｍＨＩそれぞれ１
０単位を加え、３７℃で４時間反応を行った。この反応
液からＬＧＴ法により２．８　ｋ　ｂのＤＮＡ断片０．
８■を精製、回収した。

一方、成熟ｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦポリペプチドのＮ末端１番
目から５番目までのアミノ酸〔スレオニン１（ＡＣＡま
たはＡＣＴ）、プロリン”　　（ＣＣＡまたはＣＣＴ）
、ロイシン３（ＣＴＡ）　、グリシン４（ＧＧＣ）、プ
ロリン５（ＣＣＣ）〕をコードするコドンと発現に必要
な開始コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、ま
た、トリプトファンプロモーター（Ｐ　ｔ　ｒ　ｐ）の
下流のＳＤ−配列とＡＴＧとの距離を、６〜１８ｂ１７
）間の適当な長さにする必要があることなどの理由から
、下記のＤＮＡリンカ−を合成した。

５′ ３′ まず−零細Ｄ　Ｎ　Ａ　、　２５ｍｅｒと２０ｍａｒを
通常のトリエステル法〔アール・フレア（ＲｌＣｒｅａ
）　　ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ７５．５７６５　（１９
７８）　：］により合成した。２６ｍａｒ、２０ｍａｒ
のそれぞれ２■を５ＱｍＭ　　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣ１
（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジ
チオスレイトーノペ０．１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍ　Ｍ
　Ａ　Ｔ　Ｐを含む緩衝液（以下この緩衝液を“Ｔ４キ
ナーゼ緩衝液″と略記する）４０誠に溶かし、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ３０単位（宝酒造社製二以下同じ
）を加えて、３７℃６０分間リン酸化反応を行った。

上記で得たｐｃｓＦｌ−２由来のＡｐａｌ−ＢａｍＨＩ
断片（１，５ｋ　ｂ）　　０．４部ｇとｐＬｓＡ１由来
のＢａｎｌｌＪ−ＢａｍＨＩ断片（２，８ｋｂ）　　０
．２■とを２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７
，６）、１０　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．１０ｍＭジ
チオスレイトールおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む緩衝液
（以下この緩衝液を“Ｔ４リガーゼ緩衡液”と略記する
）２５ρに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡ！Ｊンカー
を０．１■加えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（全酒造社製：以下同じ）６単位を加え、４℃１
８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１０１株〔ポリバー（Ｂｏｌ　１ｖａｒ）　　らニジ
ーン（Ｇｅｎｅ）　　２．７５　（１９７７）　）をコ
ーエンらの方法〔ニス・エヌ−コ−ｘ　ン（Ｓ、Ｎ、Ｃ
ｏｈｅｎ）　　ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ−サイエ７ス（Ｐｒｏｃ、　
　〜ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、並、　２１１０　（１９７２＞　）
　　（以下大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる）に
より形質転換し、Ａｐｒのコロニーを得た。このコロニ
ーの培養菌体から公知の方法〔エイチ・シー・バーンボ
イム（ｆｌ、　Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）　　ら：　ヌク
レイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　７．１５１３（１９７９））　　
（以下プラスミドＤＮＡの分離はこの方法を用いる）に
従ってプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミ
ドの構造は、ＢａｎＩＩ［、Ｒｓａｌ、Ｐｓｔｌ、Ｈｉ
ｎｃｌＩ［ｌ、ＢｇｌＩＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動により確認した。

このプラスミドをｐｃｆＴＡｌとよぶ。ｐＣｆＴＡｌの
ＢａｎＩＩ［、ＨｉｎｄＩＩＩ付近の塩基配列は下記の
とおりであることを、Ｍ１３ファージを用いたディデオ
キシ・シーフェンス法で確認した。

実施例２゜ ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮΔの３′−非翻訳領域の１部を欠失
したプラスミドｐｃｆＴＢ２０の造成（第２図参照）： 実施例１で得られたｈＧ−Ｃ２Ｆ発現ブラスミミドｐｃ
ｆＴＡ１　　（４，３ｋｂ）２■をＹ−１００緩衝液２
０ｍに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ　　４単位を加えて
３７℃４時間消化反応を行った。フェノール−クロロホ
ルム等量混合液による抽出（以下フェノール−クロロホ
ルム抽出と略記する）の後、エタノール沈澱により、Ｄ
ＮＡ断片１．８■を回収した。このＤＮＡ断片を５０ｍ
Ｍ　　ＴｒｉｓＨＣＩ　（ｐＨ７，８）　、７ｍＭ　　
ＭｇＣＩ２および６ｍＭメルカプトエタノールを含む緩
衝液（以下この緩衝液を“クレノー緩衝液”と略記する
）２０μｇに溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰをそれぞれ１ｍＭになるように加え、さらに４
単位のＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片（宝酒造社
製二以下同じ）を加えて、室温で１時間反応させ、突出
末端を平滑末端に変換した。

フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱によ
り、ＤＮＡ断片１．６■を回収した。該ＤＮＡ断片をＹ
−１００緩衝液２０ρに溶かし、１０単位のＥｃ　ｏＲ
Ｉを加え、３７℃４時間切断反応を行った。この反応液
からＬＧＴ法により２．５ｋｂのＤＮＡ断片（ＢａｍＨ
Ｉ（Ｂｌｕｎｔ）−ＥｃｏＲＩ断片）　１■を得た。

別に、ｐｃｆＴＡ１２■を２０ＩＩＪ！のＹ−１００緩
衝液に溶かし、１０単位のＥ　ｃ’　ｏ　ＲＩを加え、
３７℃４時間切断反応を行った後、ＮａＣ１１度が１５
０ｍＭとなるようにＮａＣＩを添加し、１０単位のＤｒ
ａＩを加え、３７℃４時間切断反応を行った。アガロー
スゲル電気泳動にて完全な分解を確認した後、ｈ　Ｇ−
ＣＳ　Ｆ　ｃ’ＤＮＡを含む１．ＯｋｂのＤＮＡ断片（
ＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ断片）０．２■を、ＬＧＴ法によ
り精製、回収した。

上記で得たＢａｍＨＩ（Ｂｌｕｎｔ）　−Ｅｃ　ｏＲＩ
断片（２，５ｋｂ）　０．２　ｔｔｇとＥｃ　ｏＲＩ−
Ｄｒ　ａ　ＩＩｒ片（１，０ｋｂ）　　０．２■をＴ４
リガーゼ緩衡液２５４に溶かし、この混合液にＴ　４　
ＤＮＡ　’Ｊガーゼ６１位を加え、４℃１８時間結合反
応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１０１株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回収した
。得られたプラスミドの構造は、ＨｉｎｄｌｌｌＪ、Ｐ
ＳｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。このプラスミドをｐｃｆＴＢ２０と呼ぶ。

実施例３゜ ｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦのＮ末端アミノ酸を置換したポリペプ
チドをコードするプラスミドｐＣｆＴＬ２３゜ｐＣｆＴ
Ｌ３８．ｐＣｆＴＬ３５．ｐｃｆＴＬ４１の造成（第３
図参照）： 参考例１の方法によって得たｐｃｓＦｌ−２（４，５ｋ
ｂ）３眉を６０ｄＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素
ＡｐａＩ　　（ベーリンガー・マンハイム社製）と制限
酵素ＢａｍＨＩそれぞれ８単位ずつを加え、３７℃で３
時間切断反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の大
部分を含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｐａＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片）約０．４Ｊｉｇを得た。

一方、ｐＧＥＬＩ　Ｃ間板ら：プロシーディング・オブ
・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　　
８２．４３０６（１９８５）　）（Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｉ
ＧＥＬＩ　　ＦＥＲＭ　　ＢＰ＝６２９の培養物から常
法により採取’）　（３，４ｋｂ）２■をＹ−１００緩
衝液４０ＩＪ！ｌに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌそれぞれ４単位ずつを加え３
７℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ
法により、リボプロティン由来ターミネークーを含む約
１．７　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨ
Ｉ断片）約０．５眉を得た。

別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　３Ｊ１ｇをＹ−１００緩衝液６
０誠に溶かし、制限酵素　ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績社
製）と制限酵素ｐｓｔｒをそれぞれ６単位ずつ加え３７
℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法
によりトリプトファンプロモーター（Ｐ　ｔ　ｒ　ｐ）
を含む約１．１　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（ＢａｎＩＩＩ−
Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片）約０．５Ｊ１ｇを得た。

一方、成熟ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸であるＴｈ
ｒをＳｅｒ、Ｃｙｓ、ＡｒｇまたはＧＩｙのうちのいず
れかに置換し、発現に必要な開始コドン（ＡＴＧ）を付
与する必要があること、またＰｔｒｐの下流のＳＤ配列
とＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐの間の適当な長さに
する必要があることなどの理由から、下記のＤＮＡリン
カ−を合成した。

（ＮはＧ、　Ａ、、　ＴまたはＣのいずれかの塩基であ
る）まず、−末鎖ＤＮＡ、　２５−ｍａｒ　と２　Ｑ　
−ｍａｒを通常のトリエステル法により合成した。２６
−ｍａｒおよび２　Ｑ−ｍａｒの各々２０ピコモルを４
０４のＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（全酒造社製）６単位を加えて、３７℃で
６０分間リン酸化反応を行った。

次ニ上記で得たｐｃｓＦｌ−２由来のＡｐａＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（約１．５ｋｂ）　０．３ｘｒとｐＧＥＬ１由
来のＰ　ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約１．７°ｋｂ
）０．２■および発現ベクターｐＫＹＰ１０のＢａｎ１
ＩＩ−ＰｓｔＩ断片（約１．１ｋｂ）０．２河を全量３
０薦のＴ４１Ｊガーゼ緩衝液に溶かし、この混合液に上
記ＤＮＡ’Ｊンカーを約１ピコモル加えた。この混合液
にさらに６単位のＴ　４　ＤＮＡ　’Ｊガーゼを加えて
４℃、１８時間結合反応を行った。

組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０７０）〔カメ
ロン（Ｃａｍｅｒｏｎ）ら：プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、　　Ｕ
ＳＡ　　７２．３４１６（１９７５）　］を形質転換し
、Ａ　ｐ　ｒのコロニーを得た。この形質転換株よりプ
ラスミドＤＮＡを公知の方法に従って分離・精製した。

該プラスミドＤＮＡの構造はＰｓｔｒ、ＥｃｏＲｒ、Ｂ
ａｎＩＩＩで　　　−切断後、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により確認した。これらのプラスミドを第３図
に示したとおりｐＣｆＴＬ２３．ｐＣｆＴＬ３８．ｐＣ
ｆＴＬ３５゜ｐｃｆＴＬ４１とよぶ。上記プラスミド中
のｈＧ−ＣＳＦ誘導体遺伝子のＮ末端付近の配列はそれ
ぞれ、 であることをＭ１３ファージを用いたディデオキシ・シ
ーフェンス法により確認した。

ｐＣｆＴＬ２３によりコードされるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘
導体く本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ　ＣＧＩｙ’　）とよぶ
）は、成熟ｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦのＮ末端のＴｈｒがＧｌｙ
に置換していることが確認された。同様に、ｐＣｆＴＬ
３８によりコードされるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体く本誘
導体をｈＧ−ＣＳＦ　［Ｓｅｒ’　〕とよぶ）はＳｅｒ
に、ｐＣｆＴＬ３５によりコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘
導体（本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ（Ｃｙｓ’）とよぶ）は
Ｃｙｓに、ｐｃｆＴＬ４１によりコードされるｈ　Ｇ−
ＣＳ　Ｆ誘導体く本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ　ＣＡｒｇ’
　）とよぶ）はＡｒｇにそれぞれＮ末端のアミノ酸が置
換していることが確認された。

実施例４゜ ｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦのＮ末端および３番目のアミノ酸を置
換したポリペプチドをコードするプラスミドｐ　Ｃｆ　
ＴＭ１４．　　ｐＣｆ　ＴＭ１７およびｐ　Ｃｆ　ＴＭ
１１３の造成〈第４図参照）： 参考例１の方法によって得たｐｃｓＦｌ−２（４，５ｋ
ｂ）３■をＹ−１００緩衝液６０ｍに溶かし、ＡｐａＩ
とＢａｍＨＩをそれぞれ８単位ずつ加え、３７℃で３時
間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりｈ
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の大部分を含む約１，５ｋｂのＤＮＡ
断片（ＡｐａＩ−１３ａｍＨＩ断片）約０．４■を得た
。

一方、ｐＧＥＬｌ　　（３，４ｋｂ）２■をＹ−１００
ｖ１衝液４０パに溶かし、制限酵素）（ｉｎｄＩ［ｒ。

ＢａｍＨＩおよびＰＳｔＩそれぞれ４単位ずつを加え３
７℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ
法により、リポプロティン由来ターミネータ−を含む約
１，７ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐｓｔｌ−ＢａｍＨＩ断片）
約０．５■を得た。

別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　３■をＹ−１００緩衝液６０ρ
に溶かし、制限酵素ＢａｎＩ［とＰｓｔｌそれぞれ６単
位ずつを加え３７℃で３時間切断反応を行った。この反
応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約１．１ｋｂの
ＤＮＡ断片（Ｂ　ａ　ｎ　ｍ−Ｐｓｔ　Ｉ断片）約０．
５鱈を得た。

一方、成熟ｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦのＮ末端のアミノ酸である
ＴｈｒをＳｅｔに、３番目のアミノ酸であるＬｅｕをＧ
ａｙ、Ｓｅｒ、ＣｙｓまたはＡｒｇのうちいずれかに置
換し、発現に必要な開始コドン（ＡＴＧ）を付与する必
要があること、またＰｔｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧ
との距離は、６〜１８ｂｐの間の適当な長さにする必要
があることなどの理由から、下記のＤＮＡ　！７ンカー
を合成した。

（ＮはＧ、　Ａ、　ＴまたはＣのいずれかの塩基である
）まず、−不備ＤＮＡ、　２６−ｍｅｒと２Ｑ　−ｍａ
ｒを通常のトリエステル法により合成した。２６−ｍａ
ｒおよび２０−ｍａｒの各々２０ピコモルを４０城のＴ
４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ６単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を
行った。

次に上記で得たｐｃｓＦｌ−２由来のＡｐａｌ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（約１．５ｋｂ）０．３ｑとｐＧＥＬ１由来の
Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約１．７ｋｂ）０．
２〜および発現ベクターｐＫＹＰ１０のＢａｎ■−Ｐｓ
ｔＩ断片（約１．１ｋｂ）０．２■を３０４のＴ４リガ
ーゼＭ衝液に溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカ−
を約１ピコモル加えた。この混合液にさらに６単位のＴ
　４　ＤＮＡ　リガーゼを加えて４℃、１８時間結合反
応を行った。

組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００Ｓ　Ｆ　８　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０７０）株を
コーエンらの方法により形質転換し、Ａｐｒのコロニー
を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを公知の
方法に従って分離・精製した。該プラスミドＤＮＡの構
造はＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂａｎｍで切断後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により確認した。これらの
プラスミドを第４図に示したとおり、ｐｃｆＴＭｌ４．
ｐｃｆＴＭｌ７゜ｐｃｆＴＭｌ１３とよぶ。上記プラス
ミド中のｈＧ−Ｃ８Ｆ誘導体遺伝子のＮ末端付近の配列
はそれぞれ、 であることをＭ１３ファージを用いたディデオキシ・シ
ーフェンス法により確認した。

ｐｃｆＴＭｌ４によりコードされる誘導体（本誘導体を
ｈＧ−ＣＳＦ　Ｃ３ｅｒ’、Ｃｙｓ’ｌとよぶ）は、成
熟ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のＴｈｒ’がＳｅｒに、３番目
のアミノ酸であるＬｅｕがＣｙｓに置換していることが
確認された。同様にｐＣｆＴＭ１７によりコードされる
誘導体く本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ　［Ｓｅｒ’、Ａｒｇ
３）とよフ）ハ、Ｎ末端のＴｈｒがＳｅｒに、３番目の
ＬｅｕがＡｒｇに、ｐｃｆＴＭｌ　１３によりコードさ
れる誘導体く本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ　（Ｓｅｒ’、Ｓ
ｅｒ’　）とよぶ）は、Ｎ末端のＴｈｒがＳｅｒに、３
番目のＬｅｕがＳｅｔに置換していることがｍｉｏされ
た。

実施例５゜ （１）組換え体プラスミドｐｃｆＷＤ１の造成（第５図
参照）　： 実施例１の方法で得たｐｃｆＴＡｌ　　５ｇを５０４の
ｙ−ｔｏｏ緩衝液に溶かし、制限酵素Ｓｔｕ　１１０単
位と、制限酵素ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績社製）１０単
位を加えて、３７℃で１時間消化反応を行った。反応液
からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約１．
３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ　ａ　ＴＩ　ｌｌｌ−３ｔｕＩ
断片）約０．５１℃ｇを得た。別に、参考例２の方法で
製造したｐＫＹＰ２６　３■を５０４のＹ−１００緩衝
液に溶かし、ＢａｍＨＩ６単位を加えて、３０℃で１時
間消化反応を行った。

これに１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！（Ｉ）Ｈ７，
５）。

１ｍＭＥＤＴＡで飽和したフェノールを等量論え、激し
く撹拌した後、低速遠心分離法（３，３００ｒｐｍ、１
０分間、以下同条件）により水層を集めた。等量のクロ
ロホルムを加え、激しく撹拌した後低速遠心分離法によ
り水層を集めた。１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加
え、２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃、１時間
静置した。冷却遠心分離法（４℃、　　１１．００　Ｏ
ｒｐｍ１０分間）で沈殿を集めた。この沈殿を３０ｍの
クレノー緩衝液に溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。

ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰをそれぞれ１００μＭになるように
加え、ＤＮＡポリメラーゼ■・タレノー断片を２単位加
え１７℃で１５分間反応を行った。６８℃で１０分間処
理してＤＮＡポリメラーゼエ・クレノー断片を失活させ
た後、ＮａＣｊ！を１００ｍＭとなるように加え、制限
酵素ＰｓｔＩを５単位加え３７℃で１時間消化反応を行
った。

反応液からＬＧＴ法によりｆｌ）Ｉ）ターミネータ−を
含む約１．３　ｋ　ｂのＤＮＡ断片［ＢａｍＨＩ（Ｂｌ
ｕｎｔ）　−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ断片〕約０．６■を得た。

これとは別に、ｐＧＥＬｌ　　’４■を４０ρのＹ−１
００緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡
績社製）１０単位とＰｓｔｌ　　１０単位を加え３７℃
で１時間消化反応を行い、反応液から、ＬＧＴ法でトリ
プトファン系プロモーターを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片
（ＢａｎＩ［Ｉ−Ｐｓｔｒ断片）を０．４■得た。

上記で得たｐｃｆＴＡ１由来のＢａｎｌｌｌ−３ｔｕｌ
断片（約１．３ｋｂ）約０．２．、、ｐＫＹＰ２６由来
のＢ　ａｍＨＩ（Ｂｌｕｎｔ）　−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　　
断片（約１．８ｋｂ）約０．１■、ｐＧＥＬ１由来のＢ
ａｎＴＩＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片（約１ｋｂ）約０．１■
を３０ＪｌｆｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、
４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃、１８時間結
合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第５図に
示したｐｃｆＷＤｌを得た。

（２）　　ｐ　Ｃｆ　Ｔ　９５　Ｋ　１９の造成（第６
図参照）：実施例３の方法で得たｐＣｆＴＬ３８　５鴻
を５０４のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｎとＢｇｆ＃を１０単位ずつ加え、３７℃で１時間
消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法によりトリプト
ファン・プロモーターを含む約２．６　ｋ　ｂのＤＮＡ
断片（ＨｉｎｄＩＩ［−Ｂｇｊ！ＩＩ断片）約０．７眉
を得た。別にｐｃ　ｆ　ＴＬ３８．１００ｇを１．５ｍ
ｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩＩ
ｌ！：ＨｉｎｄＩＩ［を８０単位ずつ加え、３７℃で６
時間消化反応を行った。

反応液からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む
ＤＮＡ断片を回収し、ＥＬＵＴＩＰＴ″−ｄ　（Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ１１社製）で精製した
。

このＤＮＡ断片をｌＱｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７，５）、７ｍＭ　　ＭｇＣβｚ、１５０ｍＭＮａＣ１
，６ｍＭ　　２−メルカプトエタノール（以下、“Ｙ−
１５０緩衝液”と略記する）を含む全量９ｈｊｌの溶液
に溶かし、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　
　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）３単位を加え３７℃で１５分
間消化反応を行った。反応液からポリアクリルアミド電
気泳動法で、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約３００ｂｐ
のＤＮＡ断片（Ｈｉ　ｎ　ｄｍ−ＤｐｎＩ断片）約１ｊ
ｔｇを得た。

別に実施例２の方法で得たｐｃｆＴＢ２０１０■を１０
０４のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ａｖａ■１
０単位を加え、３７℃で１時間消化反応を行った。フェ
ノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿でＤＮ
Ａを回収し、３０ｍのクレノー緩衝液に溶かし、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ・クレノー断片を２単位加え、１７℃で
３０分間反応を行った。６８℃で１０分間処理しＤＮＡ
ポリメラーゼＩ・クレノー断片を失活させ、ＮａＣｊ！
を１００ｍＭになるように加え制限酵素ＢｇｆＩ１１０
単位を加え３７℃で１時間消化反応を行った。反応液か
らＬＧＴ法でβｐｐターミネータ一部分を含む約４８０
ｂｐのＤＮＡ断片（Ａｖａ　Ｉ（Ｂｌｕｎｔ）　−Ｂｇ
ｆｌｌ）約０．３Ａｇを得た。

上記で得た、ｐＣｆＴＬ３８由来のＨｉｎｄｍ−Ｂｇβ
■断片（約２．６ｋｂ）約０．１■。

ｐＣｆＴＬ３８由来のＨ１ｎｄＩＩＩ−ＤｐＴｌ　１断
片（約３００ｂｐ）約０．２■、ｐｃｆＴＢ２０由来の
Ａｖａ　Ｉ（Ｂｌｕｎｔ）−ＢｇｌＩＩ断片（約４８０
ｂｐ）約０．１５■を３０４のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝
液に溶かし、４単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第６図に
示したｐＣｆ７９５に１９を得た。

（３）　　ｐ　Ｃｆ　Ａ　Ａ　１の造成（第６図参照）
：前項で得たｐｃｆＴ９５に１９　５ＪＬｇを５０誠の
Ｙ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂａｎ■（東洋紡
績社製）７単位とＢｇｊ！Ｉ（日本ジーン社製）２単位
を加え、３７℃で１時間消化反応を行った。反応液から
ＬＧＴ法によりトリプトファン・プロモータ一部分を含
む約１ｋｂのＤＮＡ断片（１３ａｎｌｌ−Ｂｇｊ！　Ｉ
断片）約０．６■と、βｐｐターミネータ一部分を含む
約１．８ｋｂのＤＮＡ断片（ＢｇβＩ−Ｂｇｊ！　Ｉ断
片）約１■を得た。

これとは別に１５■のｐｃｆＴ９５に１９を１５０、ｄ
のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂｇｊ！Ｉ（日
本ジーン社製）６単位と５ａｕ３Ａ　１０単位を加え３
７℃で１時間消化反応を行った。反応液からポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ部
分を含む約３５０　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂｇｉ’ｌ−３
ａｕ）Ａ断片）約０．３■を得た。

これとは別に、下記のＤＮＡ　リンカ−を合成した。

まず、−木調Ｄ　Ｎ　Ａ、３９−ｍａｒと４１−ｍａｒ
を通常のトリエステル法により合成した。３９−ｍｅｒ
および４１−ｍｅｒの各々２０ピコモルを全量４０ｍの
Ｔ４キナーゼ！ｉｌｌ液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（全酒造社製〉６単位を加えて、３７℃で６
０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐｃｆＴ９５に１９由来のＢａｎＩＩＩ
−Ｂｇｊ！　Ｉ断片（約１ｋｂ）０．１．ｑ。

Ｂｇｊ７　Ｉ−Ｂｇ（ｌ　Ｉ断片（約１．８ｋｂ）０．
０５ｊｉｇ、ＢｇｌｌＩ−５ａｕ３Ａ断片（約３５０ｂ
ｐ）０．１■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衡液２５ｍに溶か
し、この混合液に上記ＤＮＡＩＪンカーを約２ピコモル
加えた。さらにＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼ６単位を加
え、４℃で１８時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第６図に
示したｐｃ　ｆ　ＡＡ　１を得た。前記ディデオキシ・
シーフェンス法でｐｃ　ｆ　ＡＡ　１のＤＮＡ！Ｊンカ
一部分の塩基配列を決定したところ、４番目のアミノ酸
であるＬｅｕをコードするコドンの３番目の塩基は八で
あることが判明した。このｐｃｆＡＡｌでは）Ｉ　Ｇ−
ＣＳ　Ｆの１０番目のＰｒｏから２３番目のＬｙｓまで
の１４アミノ酸をコードするＤＮＡ部分が欠失している
。また、ｈＧ−ＣＳＦの６番目のＡｌａがＡｓｎに変化
する変異が導入されており、新たにＸｈｏｌサイトが生
じる。

（→　ｐＣｆＡＢ５の造成（第６図参照）：前項で得た
ｐｃｆＡＡｌ　　３．ｉｉｇを３０薦のＹ−１００緩衝
液に溶かし、制限酵素ＸｈｏＩを５単位加え、３７℃で
１時間消化反応を行った。

アガロースゲル電気泳動法でＸｈｏｒ切断が完全に行わ
れていることを確認したのち、制限酵素Ｂｇｊ！Ｉ（日
本ジーン社製）を１単位加え、３７℃で２５分間部分消
化反応を行った。反応液からＬＧＴ法によりトリプトフ
ァン・プロモータ一部分およびｌ１ｐｐターミネータ一
部分を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｘｈｏｌ−Ｂｇｌｌ
ｌ断片）約１ｇを得た。これとは別に、下記のＤＮＡ　
！Ｊンカーを合成した。

（ＮはＧ、　Ａ、　ＴまたはＣ） このリンカ−ＤＮＡはｐｃ　ｆ　ＡＡ　１のｈＧ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡで欠失していたｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆの１０番目
のＰｒｏから２３番目のＬｙｓまでの１４アミノ酸をコ
ードするＤＮＡ部分を含んでいる。

まず、−木調ＤＮＡ、　２７−ｍｅ；と２５−ｍａｒ（
２種）と２３−ｍａｒを通常のトリエステル法により合
成した。たがいに相補的な２７−ｍｅｒと２５−ｍｅｒ
および２５−ｍｅｒと２３−ｍａｒのＤ’ＮＡ２０ピコ
モルずつを各々全量４０薦のＴ４キナーゼ緩衝液に溶か
し、Ｔ４ポリヌグレオチドキナーゼ（全酒造社製）６単
位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐｃｆＡＡ１由来のＸｈｏＩ−Ｂｇｌｌ
Ｉ断片（約３ｋｂ）０．１■、前項で得たｐ（：ｆＴ９
５に１９由来のＢｇｊｌ！　ｒ−３ａｕ３Ａ断片（約３
５０ｂｐ）　０．１■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液３０
威に溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカ−を２ピコ
モルずつ加えた。さらにＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ６単位を
加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第６図に
示したｐＣｆＡＢ５とｐｃｆＡＢ１４を得た。前記ディ
デオキシ・シーフェンス法でｐＣｆＡＢ５とｐＣｆ　Ａ
Ｂ１４のＤＮＡＩＪンカ一部分の塩基配列を決定したと
ころ、１７７番目アミノ酸をコードするコドンの１番目
の塩基はｐＣｆＡＢ５ではＡであり、ｐｃｆＡＢ１４で
はＴであって各々Ｓｅｒのコドン（ＡＧＣ）およびＣｙ
ｓのコドン（ＴＧＣ）であり成熟型ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆの
１７７番目Ｃｙｓが、ｐＣｆＡＢ５ではＳｅｒに置換し
、ｐｃｆＡＢ１４では置換していないことが判明した。

実施例６゜ （１）　　ｐＣｆＢＡ８右よびｐＣｆＢＡ３２の造成（
第７図参照）： 前項で得たｐＣｆＡＢ５．３■を４０４のＹ−１００緩
衝液に溶かし、制限酵素ＡｖａＩ５単位とＢｇｊＭ［５
単位を加え３７℃で１時間消化反応を行った。反応液か
らＬＧＴ法により、トリプトファンプロモータ一部分と
ｌｐｐターミネータ一部分を含む約２．３　ｋ　ｂのＤ
ＮＡ断片（ＡｖａＩ−ＢｇＲＵ断片）を約１■得た。

これとは別に、第１項で得たｐｃｆＷＤ１６眉を５０４
のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂｇｉ’ｎを５
単位加え、３７℃で１時間消化反応を行った。アガロー
スゲル電気泳動法で８ｇｌ切断が完全に行われているこ
とを確認した後に、制限酵素ＡｖａＴを３単位加え、３
７℃で２０分間部分切断反応を行った。反応液からＬＧ
Ｔ法により、ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ　ｃ　ＤＮＡの大部分を
含む約１．３　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｂｇβ■−Ａｖａ
Ｉ断片）を０．４Ｎ得た。

次に上記で得たｐＣｆＡＢ５由来のＡｖａＩ−Ｂｇβ■
断片（約２．８ｋｂ）の０．１ｇとｐＣｆＷＤＩ由来の
Ｂｇｆ！’ｆｌ−ＡｖａＩ断片（約１．３ｋｂ）０．３
■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衡液２５Ｊ１１に溶かし、３
単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃１８時間結時
間形を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第７図に
示したｐｃ　ｆ　ＢＡ８を得た。

ｐＣｆＢＡ８のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ
酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの６番目のＡｈａがＡｓ
ｎに、１７７番目ＣｙｓがＳｅｒに置換している。以後
、本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ　ＣＮＡ３：］と呼ぶ。

他方前項で得たｐｃｆＡＢ１４．３■を４０ＡＩ２のＹ
−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ａｖａ１５単位とＢ
ｇβ■５単位を加え３７℃で１時間消化反応を行った。

反応液からＬＧＴ法により、トリプトファンプロモータ
一部分とｊ２ｐｐターミネータ一部分を含む約２．３　
ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ａｖａｌ−Ｂｇｊ２■断片）を約
１■得た。

これとは別に、第１項で得たｐｃｆＷＤ１６■を５０Ａ
ｌ！のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂｇβ■を
５単位加え、３７℃で１時間消化反応を行った。アガロ
ースゲル電気泳動法でＢｇｉ’ＩＩ切断が完全に行われ
ていることを確認した後に、制限酵！Ａｖａｌを３単位
加え、３７℃で２０分間部分切断反応を行った。反応液
からＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの大部分を
含む約１．３　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｂｇβ■−Ａｖａ
■断片）を０．４■得た。

次に上記で得たｐｃｆＡ８１４由来のＡｖａＩ−Ｂｇｊ
！ＩＩ断片（約２．８ｋｂ）の０．１■とｐＣｆＷＤＩ
由来のＢｇｊ！ＩＩ−ＡｖａＩ断片（約１．３ｋｂ）０
．３１℃ｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５４に溶かし
、３単位の７４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃１８時間
結時間形を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーヲ得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第７図に
示したｐＣｆＢＡ３２を得た。

ｐＣｆＢＡ３２のコードするｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体の
アミノ酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの６番目のＡｌａ
がＡｓｎに置換している。

（２）　　ｐｃｆＢＢｌｏｌの造成： 前項で得たｐＣｆＢＡ８．６Ｊ１ｇを５０４のＹ−１０
０緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂ　ａ　ｎ、　ｍ（東洋紡
績社！ＩＩ）１０単位、Ｂｇβ■８単位、ｘｈＯ■８単
位を加え、３７℃１時間消化反応を行った。反応液から
ＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約１．４ｋ
ｂ（７）ＤＮＡ断片（Ｘｈｏｌ−Ｂｇβ■断片）約０．
６尾とトリプトファンプロモータ一部分を含む約２．７
　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｂａ　ｎＩＩＩ−Ｂｇ　ＲＩ［
断片）約０．８肩を得た。

これとは別に、下記のＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪンカーを合成し
た。

まず−重鎮ＤＮＡ、３１−ｍａ　ｒと３３−ｍａｒを通
常のトリエステル法により合成した。３１−ｍａｒおよ
び３３−ｍａｒの各々２■を全量４０ρのＴ４キナーゼ
緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単
位（全酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化
反応を行った。

次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎＩＩＩ−Ｂｇ
β■断片（約２．７　ｋ　ｂ断片）０．１ｇ、同じ（ｐ
ＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＩ−ＢｇｌＵ断片（約１．４　
ｋ　ｂ断片）０．１ｊＬ１をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衡液
２５ｍに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡ！Ｊンカーを
約２ピコモル加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位
を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
第７図に示したｐｃｆＢＢｌｏｌを得た。ｐｃｆＢＢｌ
ｏｌのコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ酸配列は
、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの１番目のＴｈｒがＡｌａに、３
番目のＬｅｕがＴｈｒに、４番目のＧｌｙがＡｒｇに、
５番目のＰｒｏがＳｅｒに、１７７番目ＣｙｓがＳｅｒ
に置換されている。以後、本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ　（
ＮＢＩ　０１）と呼ぶ。

（３）　　ｐｃｆＢｃ４２Ｂ１．　ｐＣｆＢＣ４５、ｐ
ＣｆＢＣ５２、ｐＣｆＢＣ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣ
ｆＢＣ７７、ｐＣｆＢＣ９３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆ
ＢＣ９７の造成（第８図参照）　：まず、下記のＤＮＡ
！Ｊンカーを合成した。

この合成りＮＡ’Ｊンカーは、３ケ所の塩基がＧ。

Ａ、、Ｔ、Ｃのうちのいずれかであり、１ケ所の塩基が
ＧかＡ（３１−ｍａｒの場合）、あるいはＣかＴ（３３
−ｍａｒの場合）のいずれかであり、合計１２８種類の
ＤＮＡ！Ｊンカーの混合物として得られる。その結果、
このＤＮＡリンカ−のコードするｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦのＮ
末端のアミノ酸配列としてはＭｅｔの次のアミノ酸とし
ては１６６種類Ｐｒｏの次のアミノ酸としては８種類の
可能性があり全体として１２８種類のアミノ酸配列が可
能であるようにデザインされている。

まず−木調ＤＮＡ、３１−ｍａ　ｒと３３−ｍａｒを通
常のトリエステル法により合成した。３１−ｍｅｒおよ
び３３−ｍｅｒの各々２■を全量４０４のＴ４キナーゼ
緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒
造社製）３０単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化
反応を行った。

次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎｍ−Ｂｇ
ｊ！ｎ断片（約２．７　ｋ　ｂ断片）０．１■、同じ（
ｐＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＩ−Ｂｇβ■断片（約１．４
　ｋ　ｂ断片）０．１■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２
５薦に溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカ−を約２
ピコモル加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼｆａ１１位
を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ株を形質転換し、Ａｐｒのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
ｐｃ　ｆＢＣ４２Ｂ　１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐＣｆＢＣ
５２、ｐＣｆＢＣ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣｆＢＣ７
７、ｐＣｆＢＣ９３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆＢＣ９７
を得た。前記ディデオキシ・シーフェンス法でＤＮＡリ
ンカ一部分の塩基配列を決定したところ、ｈＧ−ＣＳＦ
誘導体のＮ末端側の塩基配列は下記の通りであることが
判明した。

ＡＴＧ　　ＡＧＴ　　ＣＣＡ　　ＡＣＡ　　ＡＧＡ　　
Ａ［ｉ［：　　ＧＬ：Ｌ：これらのプラスミドがコード
するｈｃ−ｃｓＦ誘導体は、それぞれ成熟型ｈ　Ｇ−Ｃ
Ｓ　Ｆに比べて次のようにアミノ酸残基が置換きれてい
る。

ｐｃｆＢｃ４２Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐＣｆＢＣ５２
、ｐＣｆＢＣ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣｆＢＣ７７、
ｐＣｆＢＣ９３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆＢＣ９７にコ
ードされるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体を以後、それぞれｈ
Ｇ−ＣＳ　Ｆ　ＣＮＣ４２Ｂ　Ｉ’ｌ、ｈＧ−ＣＳＦ　
（ＮＣ４５］　、ｈＧ−ＣＳＦ　ＣＮＣ５２：］　、ｈ
Ｇ−ＣＳＦ　［：ＮＣ５９）　、ｈＧ−ＣＳＦ［ＮＣ７
６）　、ｈＧ−ＣＳＦ　ＣＮＣ７７）　、ｈＧ−ＣＳＦ
　［：ＮＣ９３］　、ｈＧ−ＣＳＦ　［：ＮＣ９５）お
よびｈＧ−ＣＳＦ　［ＮＣ９７）と呼ぶ。

（４）　　ｐＣｆＢＤ２８、ｐＣｆＢＤ５６、ｐＣｆＢ
Ｄ８２の造成： まず、下記のＤＮＡ’Ｊンカーを合成した。

このＤＮＡリンカ−は、４ケ所の塩基がＧ、Ａ。

Ｔ、　　Ｃのうちのいづれかであり、合計２５６種類の
ＤＮＡ　リンカ−の混合物として得られる。

その結果、このＤＮＡＩＪンカーのコードするｈＧ−Ｃ
ＳＦのＮ末端のアミノ酸配列とじては４ケ所に４種類の
アミノ酸の可能性があり、全体として２５６種類のアミ
ノ酸配列が可能であるようにデザインされている。

まず一本鎮ＤＮＡ、３１−ｍｅ　ｒと３３−ｍａｒを通
常のトリエステル法により合成した。３１−ｍａｒおよ
び３３−ｍａｒの各々２■を全量４０４０Ｔ４キナーゼ
緩衝液にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単
位（宝酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化
反応を行った。

次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎＩＩＩ−
Ｂｇ　ＲＩ［断片（約２．７　ｋ　ｂ断片）０．１■、
同じ＜ｐＣｆＢＡ８由来（ＤＸｈｏｒ−Ｂｇｌ！Ｕ断片
（約１．４　ｋ　ｂ断片）０．ＩＪｔｇをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液２５ｍに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡ
ＩＪンカーを約２ピコモル加えた。さらにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った
。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１０１株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドを回収し、ｐｃｆ
ＢＤ２８．ｐＣｆＢＤ５６．ｐＣｆＢＤ８２を得た。前
記ディデオキシ・シーフェンス法でＤＮＡリンカ一部分
の塩基配列を決定したところ、ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体
のＮ末端側の塩基配列は下記の通りであることが判明し
た。

＾ＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＧＣＧＣ
にれらのプラスミドがコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体は
、それぞれ成熟型ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆに比べて次のように
アミノ酸残基が置換されている。

※置換されていないアミノ酸 ｐＣｆ　ＢＤ２８．　　ｐＣｆ　ＢＤ５６．　　ｐＣｆ
　ＢＤ８２にコードされるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体を以
後、それぞれｈ　Ｇ−ＣＳ、Ｆ　（ＮＤ　２８）　、ｈ
Ｇ−ＣＳＦ［：ＮＤ５６）およびｈＧ−ＣＳＦ　（ＮＤ
８２）と呼ぶ。ｐｃ　ｆ　ＢＤ５６を含む大腸菌菌株は
６ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＥＣｆＢＤ５６　
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１２２１）として、ｐＣｆＢＤ２８
を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＥＣｆ　ＢＤ　２８　（Ｆ　ＥＲＭＢＰ−１４７９）
として微工研にそれぞれ寄託しである。

（５）　　ｐ　Ｃｆ　Ｔ　Ｎ　Ｓ　７の造成（第１４図
）：下記のＤＮＡ’Ｊンカーを合成した。

０ｍａｒ このＤＮＡリンカ−のコードするｈＧ−ＣＳＦのＮ末端
のアミノ酸配列としては、１番目のＴｈｒから４番目の
Ｇｌｙまでの４アミノ酸が欠失したアミノ酸配列となる
ようにデザインされている。

まず−重鎮ＤＮＡ、　１３−ｍｅｒと２０−ｍａｒを通
常のトリエステル法により合成した。１８−ｍｅｒおよ
び２０−ｍａｒの各々２■を全量４０ｄのＴ４キナーゼ
緩衝液にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単
位（宝酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化
反応を行った。

次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎｌｌ−Ｂ
ｇβ■断片（約２．７　ｋ　ｂ断片）０．１■、同じ（
ｐＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＩ−Ｂｇβ■断片（約１．４
ｋｂ）０．１■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５ｍに溶
かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカ−を約２ピコモル
加えた。さらにＴ４ＤＮ／Ｍｌガーゼ６単位を加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、Ａｐｒのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドを回収し、ｐＣｆ
ＴＮＳ７を得た。

ｐＣｆＴＮＳ７にコードされるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体
を以後、ｈＧ−ＣＳＦ　（△１−４ＳＥと呼ぶ。

（６）　　ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓの造成（第１４図）：
下記のＤＮＡ！ｊンカーを合成した。

３３ｍｅｒ　（４ｍｉｘ） このＤＮＡＩＪンカーは、２ケ所の塩基がＡかＧのいづ
れかであり、合計４種類のＤＮＡＩＪンカーの混合物と
して得られる。その結果、このＤＮＡリンカ−のコード
するｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦのＮ末端のアミノ酸配列としては
、４番目のアミノ酸が４種類可能であるようにデザイン
されている。

まず−重鎮ＤＮＡ、　３１−ｍｅｒと３３−ｍｅｒを通
常のトリエステル法により合成した。３１−ｍｅｒおよ
び３３−ｍｅｒの各々２肩を全量４０ρのＴ４キナーゼ
緩衝液にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単
位（宝酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化
反応を行った。

次に第（１）項で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎｌＩＩ
−ＢｇｌＴｌ断片（約２．７　ｋ　ｂ断片）０．１■、
同じ（ｐＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＩ−Ｂｇｉ！ＩＩ断片
（約１．４　ｋ　ｂ断片）０．１■をＴ４ＤＮＡリガー
ゼ緩衝液２５４に溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリン
カ−を約２ピコモル加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ
６単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドを回収し、ｐＣｆ
ＴＡＡｒｇ４Ｓを得た。前記ディデオキシ・シーフェン
ス法でＤＮＡリンカ一部分の塩基配列を決定したところ
、ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体のＮ末端側の塩基配列は下記
の通りであることが判明した。

ｐＣｆＴＡＡｒｇ４ＳによりコードされるｈＧ−ＣＳＦ
誘導体を以後ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ　ｌｌ’Ａｒｇ’。

Ｓｅｔ”　）と呼ぶ。

（７）　　ｐｃｆＴＮ２０５の造成（第１５図）：第５
項で得たｐＣｆＴＮＳ７．３■を４０℃のに一１５０緩
衝液（Ｙ−１００緩衝液の１００ｍＭ　　ＮａＣｌ２を
１５０ｍＭ　　ＫＣＩにおきかえたもの）に溶し、制限
酵素Ｐｖｕｌ　　５単位とＸｈｏＩ　　５単位を加え３
７℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法に
より、トリプトファンプロモータ一部分を含む約１．Ｏ
ｋｂのＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ−Ｘｈｏｌ断片）を約０．
５■得た。

これとは別に、第１項で得たｐＣｆＢＡ３２３■を４０
４のに一１５０緩衝液に溶かし、制限酵素ｐｖｕＩ　　
５単位とＸｈｏｌ　　５単位を加え、３７℃で１時間消
化反応を行った。反応液からＬＧＴ法により、ｈＧ−Ｃ
ＳＦｃＤＮＡの大部分を含む約３．ＱｋｂのＤＮＡ断片
（Ｘｈｏｌ−ＰｖｕＩ断片）を２■得た。

次に上記で得たｐＣｆＴＮＳ７由来のＰｖｕｉ−Ｘｈｏ
Ｉ断片（約１．　ｏｋｂ）　（７）ｏ、　１ｘトｐ　Ｃ
ｆＢ　Ａ３２由来のＸｈｏＩ−Ｐｖｕｌ断片（約３．０
ｋｂ）０．３■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衡液２５ｇに溶
かし、３単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃１８
時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第１５図
に示したｐＣｆＴＮ２０５を得た。

ｐｃｆＴＮ２０５のコードするｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体
のアミノ酸配列は、成熟型ｈＧ二ＣＳＦの１〜４番目の
アミノ酸が欠失している。以後本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ
　（△１−４〕と呼ぶ。

（８）　　ｐＣｆＴＡＡｒｇ４の造成（第１５図）：第
６項で得たｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ、３Ｎを４０４のに−
１５０緩衝液に溶かし、制限酵素Ｐｖｕｌ　　５単位と
Ｘｈｏｌ　　５単位を加え３７℃で１時間消化反応を行
った。反応液からＬＧＴ法により、トリプトファンプロ
モータ一部分を含む約ＬＯｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ　ｖ　
ｕ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片）を約０．５■得た。

これとは別に、第１項で得たｐＣｆＢＡ３２３■を４０
ｄのに一１５０緩衝液に溶かし、制限酵素ｐｖｕ１　５
単位とＸｈｏｌ　　５単位を加え、３７℃で１時間消化
反応を行った。反応液からＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡの大部分を含む約３．　Ｑ　ｋ　ｂのＤＮＡ
断片（ＸｈｏＩ−Ｐｖｕｌ断片）を２埒得た。

次に上記で得たｐｃｆＴＡＡｒｇ４ｓ由来のＰｖｕｌ−
Ｘｈｏｌ断片（約１．０ｋｂ）の０．１尾とｐＣｆＢＡ
３２由来のＸｈｏＩ−ＰｖｕＩ断片（約３．　Ｏｋｂ）
　０．３■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衡液２５ＪＬＩｌに
溶かし、３単位の７４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃、１
８時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｒのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第１５図
に示したｐｃｒ’ｒＡＡｒｇ４を得た。

ｐＣｆＴＡＡｒｇ４のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体の
アミノ酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの４番目のＧＩｙ
がＡｒｇに置換している。以後本誘導体をＧ−ＣＳＦ　
ＣＡｒｇ４：］と呼ぶ。

（９）　　ｐＣｆＴＮＳ　３０１の造成（第１６図）：
第１項で得たｐＣｆＢＡ８．６■を５０４のＹ−１００
緩衝液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＪ１０単位、Ｂ
ｇｊ！ＩＩ８単位を加え、３７℃１時間消化反応を行っ
た。反応液からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを
含む約１．４　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−
Ｂｇｌ■断片）約０．６肩を得た。

次に下記のＤＮＡ！Ｊンカーを合成した。

３′ ５′ このＤＮＡリンカ−のコードするｈＧ−ＣＳＦのＮ末端
のアミノ酸配列としては、１番目のＴｈｒから１１番目
のＧｉｎまでの１１アミノ酸が欠失したアミノ酸配列と
なるようにデザインされている。まず−零細ＤＮＡ、　
２７−ｍｅｒ　と２９−ｍａｒを通常のトリエステル法
により合成した。

２７−ｍｅｒおよび２９−ｍａｒの各々２眉を全量４０
ρのＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌタレオチ
ドキナーゼ３０単位（宝酒造社製）を加えて、３７℃で
６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎ■−Ｂｇβ■
断片（約２．７　ｋ　ｂ断片）０．１■、同じ＜ｐＣｆ
ＢＡ８由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇｊ！ＩＩ断片〈約１
．４　ｋ　ｂ断片）０．１■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衡
液２５１ｉ！ｌに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡ’）
ンカーを約２ピコモル加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガー
ゼ６単位を加え、４℃で１８一時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１０１株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
ｐＣｆＴＮＳ３０１を得た。ｐＣｆＴＮＳ３０１にコー
ドされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ　（
△１−１１Ｓ〕と呼ぶ。

σｌ　　ｐＣｆＴＮＳ４０１の造成（第１６図）：下記
のＤＮＡ！Ｊンカーを合成した。

３９ｍｅｒ ４１ｍｅｒ このＤＮＡリンカ−のコードするｈＧ−ＣＳＦのＮ末端
のアミノ酸配列としては、１番目のＴｈｒから７番目の
Ｓｅｒまでの７アミノ酸が欠失したアミノ酸配列となる
ようにデザインされている。

まず−末鎖ＤＮＡ、　３９−ｍａｒと４１−ｍａｒを通
常のトリエステル法により合成した。３９−ｍｅｒおよ
び４１−ｍｅｒの各々２埒を全量４０城のＴ４キナーゼ
緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単
位（宝酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化
反応を行った。

次に上記で得たｐｃｆＢＡ８由来のＢａｎＩＩ［−Ｂｇ
β■断片（約２．７　ｋ　ｂ断片）０．１尾、同じ＜ｐ
ＣｆＢＡ８由来のＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＢｇＩｍ断片（約１
．４　ｋ　ｂ断片）０．１ＪＬｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液２５城に溶かし、この混合液に上記ＯＮ＾リンカ
ー約２ピコモルを加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６
単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１０１株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
ｐＣｆＴＮＳ４０１を得た。ｐＣｆＴＮＳ４０１にコー
ドされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ　Ｃ
△１−７Ｓ）と呼ぶ。

（社）　ｐＣｆＴＮＳ５０１の造成（第１２図）：第１
項で得られたｐＣｆＢＡ８．６■を４０４のｙ−ｉｏｏ
緩衡液に溶かし、制限酵素Ｘｈｏ１１０単位を加え、３
７℃１時間消化反応を行った。フェノール−クロロホル
ム抽出およびエタノール沈澱でＤＮＡを回収し、３０ｇ
のクレノー緩衝液に溶かし、ＤＮＡポリメラーゼＩ・ク
レノー断片を２単位加え、１７℃で３０分間反応を行っ
た。６８℃で１０分間処理しＤＮＡポリメラーゼ■・ク
レノー断片を失活させ、ＫＣｌを１５０ｍＭになるよう
に加え制限酵素ｐｖｕ　ｌを８単位加え３７℃で１時間
消化反応を行った。

反応液からＬＧＴ法でｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約３
ｋｂのＤＮＡ断片ＣＸｈｏｌ　　（Ｂｌｕｎｔ）−ｐｖ
ｕｌ〕約２■を得た。

別に、参考例４の方法によって得たＡＴＧベクターｐＴ
ｒｓ２０　　（３，８ｋｂ）５Ｍを５０４のＹ−０緩衝
液（Ｙ−１００緩衝液より１０ｆ）ｍＭＮａＣβを除い
たもの）に溶かし、１６単位の制限酵素Ｓａｃ　ｌを加
え、３７℃で３時間切断反応を行った。フェノール−ク
ロロホルム抽出の後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回
収し、３０ｍのクレノー緩衝液に溶かし、ＤＮＡポリメ
ラーゼ■・クレノー断片を２単位加え、１７℃で３０分
間反応を行った。６８℃で１０分間処理しＤＮＡポリメ
ラーゼ■・クレノー断片を失活させ、Ｋ（ｌを１５０ｍ
Ｍになるように加え、制限酵素Ｐ’ｖｕ　Ｉを８単位加
え３７℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ
法でＰ　ｔｒｐを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片［：Ｓ　ａ
　ｃ　Ｉ　　（Ｂｌｕｎｔ）−ＰｖｕＩ］約０．５■を
得た。

次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＴ（Ｂｌｕｎ
ｔ）　−Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ断片（約３ｋｂ）０．１Ａｇと
ｐＴｒｓ２０由来のＳ　ａ　ｃ　Ｉ（Ｂｌｕｎｔ）　−
Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ断片（約１ｋｂ）０．２ＡｇをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ緩衡液２５ρに溶かし、３単位の７４　ＤＮ
Ａ　’Ｊガーゼを加え、４℃１８時間結合反応を行った
。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐ’のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第１２図
に示したｐＣｆＴＮＳ５０１を得た。

ｐＣｆＴＮＳ５０１のコードするｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導
体は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端６番目までのアミノ
酸が欠失し、１７７番目ＣｙｓがＳｅｔに置換している
。ｐＣｆＴＮＳ５０１にコードされるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ
誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ　（△１−６Ｓ）と呼ぶ。

実施例７゜ （１）　　ｐｃｆｃＢｌｏｌ　、ｐＣｆＣＣ５２，ｐＣ
ｆＣＣ５９゜Ｃｆ　ＣＤ２８．　　ｐＣｆ　ＣＤ５６の
造成（第８図）；まず、ｐＢＲ３２２［ポリバー（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）　２．９５　（１
９７７））　３Ａｇを４０ｗ１のＹ−１００ａ！Ｉ液に
溶かし、制限酵素ＰｓｔＩを５単位加え、３７℃１時間
消化反応を行った。

フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で
ＤＮＡを回収し、３３ｍＭ）’Ｊスス−酸（ｐＨ７，９
）　、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、５ｍＭジチオスレイトール、および０．４ｍＭＬｆ
）ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰＳｄＴＴＰを含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ緩衝液と略記する）２０誠に溶かし、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ（宝酒造社！り１１単を加え、３７℃、
３０分反応を行った。

フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で
ＤＮＡを回収し、２０〃のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に
溶かした。これにＢｇβ■リンカ−ＤＮＡ　（宝酒造社
製：ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ）を約８ピ
コモル加え、さらにＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを６単位加え
、４℃１８時間結時間部を行った。フェノール−クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈殿でＤＮＡを回収し、４
０４のＹ−１００暖衡液に溶かし、制限酵素ＥｃｏＲＩ
を１０単位、Ｂｇｌｍを８単位加え、３７℃で１時間消
化反応を行った。

反応液からＬＧＴ法でテトラサイタリン耐性遺伝子部分
を含む約３．５ｋｌｊのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−Ｂｇ
ｊｌ’Ｉ［断片）約０．９■を得た。

これとは別に、実施例６−（２）で得たｐＣｆＢＢｌｏ
ｌ、実施例６−（３）で得たｐＣｆＢＣ５２あるいはｐ
ＣｆＢＣ５９、実施例６−（４）で得たｐＣｆＢＤ２８
あるいはｐＣｆＢＤ５６をそれぞれ３■別々に１０倍濃
度のＹ−１００緩衝液にとかし、制限酵素ＥｃｏＲＩを
５単位、Ｂｇｊ’ｌＩを６単位加え、３７℃で１時間消
化反応を行った。反応液からＬＧＴ法で、ｈＧ−ＣＳ　
Ｆ　ｃ　ＤＮＡ部分を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片（
ＥｃｏＲＩ−ＢｇＡ■断片）をそれぞれ約０．４■得た
。

上記で得た、ｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ−Ｂｇβ■
断片（約３．６ｋｂ）約０．０５■を２０４のＴ　４　
ＤＮＡ　！Ｊガーゼ緩衝液にとかしたものを５本調製し
た。これに上記で得たｐＣｆＢＢｌｏｌあるいはｐＣｆ
ＢＣ５２あるいはｐＣｆＢＣ５９あるいはｐＣｆＢＤ２
８あるいはｐｃｆＢＤ５６由来のＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｍ
）！ｆｒ片（約１，８ｋｂ断片）約０．１■ずつを別々
に加え、さらにＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼを４単位加
え、４℃１８時間結時間部を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１０１株を形質転換し、Ｔｃ”のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し第
８図に示したｐＣｆ　ＣＢＩＯＩ　、　　ｐＣｆ　ＣＣ
５２，ｐＣｆ　ＣＣ５９゜ｐＣｆＣＤ５２．ｐＣｆＣＤ
５６を得た。これらのプラスミドにコードされるｈ　Ｇ
−ＣＳ　Ｆｉ厚導体アミノ酸配列はそれぞれｐｃｆＢＢ
ｌｏｌ・。

ｐＣｆＢＣ５２，ｐＣｆＢＣ５９，ｐＣｆＢＤ２８゜ｐ
ＣｆＢＤ５６にコードされるｈＧ−ＣＳＦ透導体のアミ
ノ酸配列と同じである。

実施例８．　　ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の生産および精製：
実施例３．４．６および７で得た組換え体プラスミドｐ
ＣｆＴＬ２３．ｐＣｆＴＬ３５．ｐＣｆＴＬ３８．　　
ｐｃｆＴＬ４１．ｐｃｆＴＭ１４゜ｐｃｆＴＭ１７．　
ｐｃｆＴＭ１１３．　ｐｃｆＢＢｌｏｌ、　ｐｆｌ：ｆ
Ｂｃ４２Ｂ１．　ｐＣｆＢＣ４５゜ｐｃｆＢｃ５２．　
ｐｃｆＢｃ５９．　ｐＣｆＢＣ７６、ｐｃｆＢｃ７７、
　ｐＣｆＢＣ９３゜ｐＣｆＢＣ９５，ｐＣｆＢＣ９７，
ｐｃｆＢＤ２Ｂ、　ｐＣｆＢＤ５６．　ｐｃｆＢＤ８２
゜ｐＣｆＴＮＳ７．　ｐＣｆＡＡｒｇ４Ｓ、ｐＣｆＴＮ
Ｓ３０１．　ｐＣｆＴＮＳ４０１゜ｐＣｆＴＮＳ５０１
．　ｐＣｆｔ＋Ｄ２８＾１７．　ｐｃｆＢＤ２８Ｔ１７
をもつ大腸菌Ｗ３１１０典株（それぞれ巳ＣｆＴＬ２３
．　　ＥＣｆ丁し３５゜ＥＣｆＴＬ３８．ＢＣｆＴＬ４
１．　　ＥＣｆＴＭ１４．　　ＢＣｆＴＭ１７．　　Ｉ
ＥＣｆＴＭ１１３　。

ＥＣｆＢＢｌｏｌ、　　［：ＣｆＢＣ４２Ｂｌ、　　Ｅ
ＣｆＢＣ４５，ＢＣｆＢＣ５２，１ＥｃｆＢｃ５９゜Ｅ
ＣｆＢＣ７６、ＢＣｆＢＣ７７、ＥＣｆＢＣ９３，Ｉｌ
：［：ｆＢｃ９５．　　ＥＣｆＢＣ９７゜εＣｆＢＤ２
８．　　εＣｆＢＤ５６．　　ＥＣｆＢＤ８２．　　Ｂ
ＣｆＴＮＳ７．　　εＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ。

ＥＣｆＴＮＳ３０１．ＥＣｆＴＮＳ４０１．　ＥＣｆＴ
ＮＳ５０１．　ＥＣｆＢＤ２８Ａ１７゜ＥＣｆＢＤ２８
Ｔ１７と呼ぶ）をＬＧ培地〔バットトリプト２１０ｇ１
酵母エキス５ｇ、ＮａＣ１５ｇ、グルコース１ｇを水１
１に溶かし、ＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３
７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５■／　
ｍ　ｌのトリプトファンと５０Ｍ／ｍｌのアンピシリン
を含むＭＣＧ培地〔Ｎａ２ＨＰＯ。

０．６％、ＫＨ２ＰＯ４０，３％、ＮａＣｌ　０．５％
、カザミノ酸０．５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　１　ｍ　Ｍ
　、ビタミンＢ＋　　４．ｉｃｇ／ｍ１ＳｐＨ７，２）
　　１００ｍｌに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、
トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアク
リル酸（３β−１ｎｄｏｌｅａｃｒｙｌ　１ｃａｃｉｄ
、以下ＩＡＡと略す）をｌＯｇ／ｍｌ加え、さらに２〜
１２時間培養を続けた。培養液を８．０００ｒｐｉ　、
１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ　　ＮａＣｊ！、３
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）緩衝液で洗
浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍ１に懸濁し、０℃
で超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮＳＯＮＩＣＰＯＩＩＩＥ
ＲＣＯＭＰＡＮＹ　　社　５ＯＩＩＩＦＩＢＲＣｌ１ｉ
ＬＬ　　ＤＩＳＲＩＩＰＴＯＲ２００，０ＵＴＰＩＪＴ
　Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ２．１０分間処理）した。これを９，
０００ｒｐｍ　、　３０分間遠心して菌体残渣を得た。

この菌体残渣からマーストンらの方法ＣＦ。

＾、Ｑ、　　１ａｒｓｔｏｎら：　８１０／ＴＥＣＨＮ
ＯＬＯＧＹ　２　、　８００（１９８４）　）によりｈ
　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した
。蛋白量の測定は、日本バイオ・ラッド・ラボラトリー
ズ社プロティン・アッセイキット　くスタンダードアッ
セイ法）〔Ｍ、　Ｍ。

Ｂｒａｄｆｏｒｃｌ　：Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、　７２．２４８　（１９７６））により行った。Ｇ−
ＣＳ　Ｆ活性の測定は以下のように行った。８〜１２週
令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（静岡実験動物協同組合）の
大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出し、牛胎児血清（
ＦＢＳ）を１０％添加したａ　−Ｍｉｎｉｍｕｍ　　［
１ｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＦｌｏｗＬａｂ
ｏｒａｔｏｒ　ｉｅｓ、　以下α−ＭＥＭ培地と略す）
に懸濁した。この細胞（約５　Ｘ　１０７個）ｇ濁液１
．５ｍｌを、ナイロン・ウー／ｌ／　（Ｎｙｌｏｎ　ｗ
ｏｏり　　（和光純薬、Ｎｙｌｏｎ　Ｆｉｂｅｒ　１４
６−０４２３１）をつめたカラム（０，３ｇ）に浸漬し
、５％ｃｏ２インキュベーター内ニて３７℃９０分間反
応させた。次いで予め３７℃に加温したα−ＭＥＭ培地
をカラムに流し、溶出してくるナイロン・ウール非吸着
性の骨髄細胞を得た。この細胞をα−ＭＵＭ培地で一回
洗浄し、所定の濃度に調整した。

次いで、両部らの方法（Ｏｋａｂｅ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、
、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　　４４．４５０３
−４５０６　（１９８６））に準じて骨髄造血幹細胞コ
ロニー形成能を測定した。すなわち、ａ−ＭＥＭ　　０
．２ｍｌ、ＦＢＳ　　Ｑ、４ｍｌおよび２段階稀釈した
各サンプルＱＪｍｌの混液に、上記の方法で調製した骨
髄細胞（２Ｘ　１０重個／＋ｎｌ）’の０．２ｍｌを混
和した。これに４２℃に保温した０、６％寒天（Ｄｉｆ
ｃＯ，Ａｇａｒ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　＃　０５６０−０
１）溶液を等量（１，０ｍ１）混和し、そのＱ、５ｍｌ
を２４穴マルチデイツシｘ　（Ｎｕｎｃ社製、＃　１４
３９８２）　に播種した（５Ｘ１０’個／ｄｉｓｈ　、
　ｎ＝　３）　。５％ＣＯ２インキュベーター中で３７
℃７日間培養し、４０個以上の細胞からなるコロニーの
数を顕微鏡（Ｏ１ｙｍｐｕｓ１重、Ｘ４０）で計数した
。コロニー計数後、注意深くスライドグラス上にとり出
し、アセトン・ホルマリン混液で３０秒間固定後、Ｋｕ
ｂｏｔａらの方法１：Ｋｕｂｏｔａ　Ｋ、、ｅｔ　ａｌ
ｌ、　Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、　　８．３３９
−３４４　（１９８０）：ｌでエステラーゼ２型染色を
施し、各コロニーの同定を行った。

各サンプルの力価は、コロニー形成試験の２段階稀釈に
於ける計数結果から以下の様に算出した。

スタンダードとして用いたインタクトＧ−ＣＳ　Ｆのコ
ロニー形成の最大値の各位を与える活性を５０単位と定
義し、これに各サンプルの稀釈率および単位ｆｆ１１当
りの活性に換算するため、２０を乗じて力価（単位）と
した。比活性は、単位蛋白質（＋ｎｇ）当りの力価（単
位／■）で表示した。

インタクトのＧ−ＣＳ　ＦおよびＧ−ＣＳ　Ｆ誘導体の
力価を第３表に示す。

第　　　　　３　　　　　表 実施例９．　ヒト骨髄細胞に対するｈＧ−ＣＳＦＩ導体
の活性測定 ２０〜３０才の健常人の腸骨より骨髄液をとりだし、こ
れに等量のα−ＭＥＭ培地を加え混和した。フィコール
−パーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）液（ファルマシ
ア・ファイン・ケミカル社、比重１．０７７）３ｍｌの
上に上記骨髄液４ｍｌを重層し、４００ｘｇ、３０分間
遠心分離し、中間層に（る細胞を分離した。

細胞をＰＢＳ　＜ＮａＣ１８ｇ、ＫＣｊ２０．２ｇ。

Ｎ　ａａＨＰ　０４１．１５　ｇおよびＫＨ２Ｐ０，０
．２ｇを水に溶かして１ｊ２としたもの）で２回洗浄後
、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＭ
培地に懸濁し、２　Ｘ　Ｉ　Ｑ６７ｍ１以下の細胞濃度
に調整した。プラスチック・ディツシュ〔ファルコン（
Ｆａｌｃｏｎ）３００３）にｌＱｍｌ播種し、５％Ｃ○
２インキュベーターにて３７℃９０分間培養し、プラス
チック・ディツシュに非付着性の細胞を回収した。細胞
をα−ＭＥＭ培地で一回洗浄し、所定の濃度に調整して
以下のヒト骨髄幹細胞増殖促進活性およびコロニー形成
試験に供した。すなわち、９６大平型マイクロプレート
（ＮＵＮＣ，１６７００８）の各ウェルに１０％ＦＢＳ
添加α−ＭＥＭ培地を１００ＪｔＩｌ注入し、次いで実
施例８の方法で得たｈＧ−’ＣＳＦおよびｈＧ−ＣＳＦ
誘導体の各サンプル１００ｍを第一列に添加した。よく
混和した液１００ｍを第二列目に移し２倍稀釈とし、以
下１２列まで同様に２段階稀釈した（ｎ＝３）。陰性対
照として、α−ＭＥＭ培地だけの群を設けた。

次に、各ウェルに上述のごとく調製した骨髄細胞懸濁液
１００ｊｌＪＩ（有核細胞数、５Ｘ１０’個）を播種し
、５％ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃、３日間培
養した。最後の１８〜２０時間に６３Ｈ−チミジン〔ア
マ−ジャム日本（ＡｍｅｒｓｈａｍＪａｐａｎ）、　Ｃ
ｏｄｅＴＲＫ６１．１０７ｍｃｉ／ｍｇ）　１０ｍを添
加して培養した。セル・ハーベスタ−（［：ｅｌｌ　ｈ
ａｒｖｅｓｔｅｒ）（ラボサイエンス社）にて各細胞を
ガラスフィルター上に回収し乾燥後、細胞にとり込まれ
た放射能を液体シンチレーションカウンター〔バラカー
ド社（Ｐａｃｋａｒｄ）、　Ｔｒｉｃａｒｂ　３３２０
））で計測した。

一方、ヒト骨髄造血幹細胞コロニー形成試験および各コ
ロニーの同定は実施例８の方法に従って行った０ 各サンプルの力価は、コロニー形成試験において、１個
のコロニーを形成しうる活性を１単位と定義した。すな
わち、２段階稀釈に於ける計数結果の直線性を与える投
与量応答直線（ＤＯ３ｅ−ｒｅＳｐＯｎＳｅ−ｖｃｕｒ
ｖｅ）よりＨａｌｆ　Ｍａｘ値（最大数り込み値の’Ａ
の値）を求め、各サンプルの力価を算出した。

比活性は単位蛋白質（ｍｇ）当りの力価（ｕｎｉｔ／ｍ
ｇ）で表示した。

インタクトのｈＧ−ＣＳＦおよびｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導
体の力価を第４表に示す。

第　　　　４　　　　表 実施例１０．　Ｎ末端第１〜７番目欠失、１７番セリン
ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体く以後Ｍ−７Ｓと略す）の製造
： 実施例６で得た組換え体プラスミドｐＣｆＢＣ５９をも
つ大腸菌（ＥＣｆＢＣ５９）を実施例８に記したように
培養、精製して得た第２表の誘導体（ａ）　（１３２Ｎ
／ｍｌ　＞を含む１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ−１０
０ｍＭ　　ＮａＣＡ溶液（ｐＨ８，０）５０ｍｌに対し
て、ズブチリンＢＰＮ’　　（８，５単位／ｍｇ蛋白質
）（シグマ社製）を０，７■添加し、２５ｔ４０時間イ
ンキュベートした。１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ２
　（ｐＨ８，０）で３倍稀釈ののち、ｌＱｍＭＴｒ　ｉ
　５−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）で充たされたＤＩｌｉＡＢ
−トヨバール６５０Ｍ（東洋曹達工業社製）（１，７ｃ
ｍ　Ｘ　４．４　ａｍ）に１０ｍ１／時の流速で通塔し
た。

次いで１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ８
，０）２０ｍｌを５ｍｌ／時の流速で通塔後、ｌＯｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）の緩衝液系に直線勾配
でＮａＣ１をＯＭから０．４Ｍｔで総容量５０ｍ１かけ
て加え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−７３誘導体１；
！　Ｎ　ａ　Ｃｊ！　６度１００〜１５０ｍＭで溶出さ
れた（収量０．７　ｍｇ、収率ｌＯ％）。純度は９０％
以上であった。

実施例１１゜ Ｍ−７５の製造： 実施例６で得た組換え体プラスミドｐＣｆＢＣ５９をも
つ大腸菌（ＥＣｆ　ＢＣ５９）を実施例８に記したよう
に培養、精製して得た第２表の誘導体（ｂ）　（１３２
，ｑ／ｍｌ）を含む１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１
００ｍＭ　　ＮａＣｊ！溶液（ｐＨ８，０＞５　Ｑｍｌ
に対して、ズブチリンＢＰＮ’　　（８，５単位／■蛋
白質）（シグマ社製）を０．７ｇ添加し、２５ｔ１４時
間インキコベートした。ｌＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８，０）で３倍稀釈したのち、１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ
　５−ＨＣＩｌ　（ｐＨ８，０）で充たされたＤＥＡＥ
−トヨパール６５０Ｍ（東洋曹達工業社製）（１，７ｃ
ｎ＋Ｘ　４．４　ｃｍ）にＩ　Ｑｍｌ／時の流速で通塔
した。次いで１０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　　（
ｐＨ８，０）２０ｍｌを５ｍ１／時の流速で通塔後、ｌ
ＱｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）の緩衝液
系に直線勾配でＮａＣｆ１をＯＭから０，４Ｍまで総容
量５０ｍ１かけて加え、同流速で溶出を行った。Ｍ−Ｔ
Ｓ誘導体はＮａＣｌ１濃度１００〜１５０ｍＭで溶出さ
れたく収量４．２　ｍｇ、収率６３％）。純度は９０％
以上であった。

実施例１２゜ Ｍ−７３の製造： 実施例６で得た組換え体プラスミドｐＣｆＴＡＡ　ｒ’
ｇ　４　Ｓを持つ大腸菌（ＥＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ）を実
施例８に記したように培養、精製して得た第２表の透導
体（ｄ）　（１３２ａ／ｍｌ）を含むｌＯｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ−１００ｍＭ　　ＮａＣ１溶液（ｐＨ８，０）
５　Ｑｍｌに対してズブチリシフ８ＰＮ’（８，５単位
／ｍｇ−蛋白質）（シグマ社製）を０．７■添加し、２
５℃４０時間インキュベートした。

Ｎ　ａ　ＣＲ濃度を０．５Ｍにした後、ｌＯｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）−０，５Ｍ　　ＮａＣｌで充
されたＺｎキレート　セファロース（ファルマシア・フ
ァインケミカル社製）　　（１，７Ｃ１１１Ｘ２，６Ｃ
Ｉｌ＋）に６ｍ１／時の流速で通塔した。次いで、ｌＱ
ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＮＣＲ（ｐＨ８，０）−０，５Ｍ　
　ＮａＣ１１２ｍ１を３ｍｌ／時の流速で通塔後、１［
１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＲ−０，５Ｍ　　ＮａＣ１の緩衝
液を直線勾配でｐＨ８，０からｐＨ６゜０まで総容量３
０ｍ１かけて、同流速で溶出を行った。Ｍ−７３誘導体
はｐＨ７，０付近で溶出された（収量ｏ、　６　ｔｕｇ
、収率９％）。

純度は９０％であった。

実施例１３゜ Ｎ末端第１〜６番目欠失、１７番セリンｈＧ−ＣＳＦＩ
導体（以後Ｍ−６５と略す）の製造：第２表の誘導体（
ａ）　（１３２ｇ／ｍｌ　）を含む１０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！−１００ｍＭ　　ＮａＣｊ！溶液（ｐＨ８
，０）５０ｍｌに対して、ズブチリシンＢＰＮ’　　（
８，５単位／　ｍｇ蛋白質）　　（シグマ２１りを０．
７Ｉｉｇ添加し、２５℃　２時間インキュベートした。

１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！　（ｐＨ８，０）で３
倍稀釈したのち、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８，０）で充たされたＤＥＡＥ−）ヨバール６５０Ｍ（
東洋曹達工業社製）　　（１，７ｃｍＸ４．４ｃｍ）に
Ｉ　Ｑｍｌ／時の流速で通塔した。次いでｌＯｍＭＴｒ
　ｉ　５−ＨＣｆ　（ｐＨ８，０）２　Ｑｍｌを５ｍｌ
／時の流速で通塔後、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ
！（ｐＨ８，０）の緩衝液系に直線勾配でＮａＣｌをＯ
Ｍから０．４Ｍまで総容量５Ｑｍｌかけて加え、同流速
で溶出を行った。Ｍ−６３誘導体はＮａＣｊ２ａ度１０
０〜１５０ｍＭで溶出された（収ｉｉ２．６ｍｇ。

収率４０％）。純度は９０％以上であった。

実施例１４、 Ｍ−６３製造： 第２表の誘導体（ａ）　（１３２ｘ／ｍｌ＞を含む１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ−］０００ｍＭ　ＮａＣ１
溶液（ｐＨ８，０＞５　Ｑｍｌに対して、エポルザイム
（４１２０単位／■蛋白質）（協和発酵工業社製）を０
．７■添加し、２５℃２０時間インキュベートした。Ｎ
ａＣ１濃度を０．５Ｍにした後、ｌＱｍＭＴｒ　ｉ　５
−ＨＣＩｌ　（ｐＨ８，０）　−０，５Ｍ　　ＮａＣｊ
！で充たされたＺｎキレート　セファロース（ファルマ
シア・ファイン・ケミカル社製）　（１，７ｃｍ　Ｘ２
．６ｃｍ）に６ｍ１／時の流速で通塔した。次いで、１
０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）−０
，５ＭＮａＣｊ！　　１２ｍ１を３ｍ１／時の流速で通
塔後、１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｆｌ−０，５Ｍ
　　ＮａＣｆ１の１１％液を直線勾配でｐＨ８，０から
ｐ　Ｈ６，０まで総容量３０ｍ１かけて同流速で溶出を
行った。Ｍ−６３誘導体はｐ　Ｈ７，０付近で溶出され
た（収量２．５　ｍｇ、収率３８％）。純度は９０％以
上であった。

実施例１５゜ Ｍ−６５の製造： 第２表の誘導体（ｂ）　（１３２ＪＬｇ／ｍｌ）を含む
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１！１００ｍＭ　　ＮａＣ
ｊ！溶液（ｐＨ８，０）５　Ｑｍｌに対してズブチリシ
ンアミロサッカリティカスを０．７■添加し、２５℃、
２０時間インキュベートした。ＮａＣβ濃度を０．５　
Ｍにした後、ｌＤｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（
ｐＨ８，０）　−０，５Ｍ　　ＮａＣｌで充たされたＺ
ｎキレート　セファロース（ファルマシア・ファイン・
ケミカル社製）（１，７ｃｍｘ２．６ｃｍ）に６ｍ１／
時の流速で通塔した。次いで、１０ｍＭ　　Ｔ　ｒ　ｉ
　５−Ｈ（１！　　（ｐＨ８，０）−０，５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｊ！　　１２ｍｌを３ｍｌ／時の流速で通塔後、１０
ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ（ｐＨ８，０）−０，
５Ｍ　　ＮａＣｌの緩衝液系に直線勾配でｐＨ８，０か
らｐ　Ｈ６，０まで総容量３０ｉ１かけて同流速で溶出
を行なった。Ｍ−６３誘導体はｐＨ７，０付近で溶出さ
れた（収量２．５■、収率３８％）。

純度は９０％以上であった。

実施例１６゜ Ｍ−６３の製造： 第２表の誘導体（ｄ）　（１３２Ａｇ／ｍｌ　）を含む
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ−１００ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ１溶液（ｐＨ８，０）５０ｍｌに対してズブチリシン
・カールスバーグ（０，０３４単位／ＩＩＩｇ蛋白質）
（ＮＯＶＯ社）を０．７■添加し、２５℃、２０時間イ
ンキュベートした。ＮａＣｌ濃度を０．５Ｍにした後、
１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（ｐＨ８，０）
−０，５ＭＮａＣβで充たされたＺｎキレート　セファ
ロース（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）（１
，７ｃｍＸ　２．６　ｃｍ）に５ｍｌ／時の流速で通塔
した。

次いで、１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（ｐＨ
８，０）−０，５Ｍ　　ＮａＣｌ　１２ｍ１を３ｍ１／
時の流速で通塔後、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ−
０，５ＭＮａＣｊ！の緩衝液系に直線勾配でｐＨ８，０
からｐＨ６，０まで総容１３０ｍ＋かけて同流速で溶出
を行なった。Ｍ−６３誘導体はｐ　Ｈ７，０付近で溶出
された（収量３ｍｇ、収＄４５％）。純度は９０％以上
であった。

実施例１７゜ Ｍ−６３の製造： 第２表の誘導体（ａ）　（１３２ｑ／ｍｌ）を含む１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ−１００ｍＭ　　ＮａＣｌ溶
液（ｐＨ８，０）　５　Ｑｍｌに対して、プロテイナー
ゼＫ　（０，０２７単位／ｍｇ−蛋白質）（シグマ社製
）ヲ０．７■添加し、２５℃４０時間インキュベートし
た。１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（ｐＨ８、
Ｏ）で３倍稀釈ののち、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
ｌ（ｐＨ８，０）で充たされたＤＥＡＥ−）ヨパール６
５０Ｍ（東洋曹達工業社製＞　　（１，７ｃｍＸ４．４
ｃｓ）に１０ｆｆｌｌ／時の流速で通塔した。次いで１
０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　５−ＨＣＲ（ｐＨ８，０）　　２　
Ｑｍｌを５ｍ１／時の流速で通塔後、１０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｎ（ｐＨ８，０）の緩衝液系に直線勾配でＯ
Ｍ　　ＮａＣβから０．４Ｍ　　ＮａＣβまで総容量５
０ｍ１かけて加え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−６３
誘導体はＮａ（１！濃度１００〜１５０ｍＭで溶出され
た（収量２．６　ｍｇ、収率３９％）。純度は９０％以
上であった。

実施例１８゜ Ｎ末端第１〜５番欠失、１７番セリンｈＧ−ＣＳＦ誘導
体（以後Ｍ−５３と略す）の製造：第２表の誘導体（ｂ
）　（１３２ｇ／ｍｌ　＞を含む１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｊ！−１００ｍＭ　　ＮａＣｊ２溶液（ｐ　Ｈ８
，０）　　５０ｍｌに対して、トリプシン（２６７単位
／　ｍｇ−蛋白質）（シグマ社製）を０．５■添加し、
２５℃、１０時間インキュベートした。

ＮａＣｊｉｆｉ度を０．５Ｍにした後、１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）−０，５Ｍ　　ＮａＣｌ
２で充たされたＺｎキレート　セファロース（ファルマ
シア・ファイン・ケミカル社製）　　（１，７ｃｍＸ２
．６ｃｍ）に６ｍ１／時の流速で通塔した。次いで、１
０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ！　（ｐＨ８，０＞−０，
５Ｍ　　ＮａＣβ１２ｒｒ１１を３ｍ１／時の流速で通
塔後、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ，ｆ！　　（＋）８
８．０）−０，５Ｍ　　ＮａＣｌ２の緩衝液系に直線勾
配でＯＭから０．３Ｍまでのイミダゾールを総容１３０
ｍ１かけて加え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−５３誘
導体は０．１Ｍイミダゾールで溶出された（収量２．７
ｍｇ、収率４１％）。純度は９０％以上であった。

実施例１９゜ Ｍ−４３の製造： 第２表の誘導体（ｄ）　（１３２ｇ／ｍｌ）を含む１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！−１００ｍＭ　　ＮａＣ１
溶液（ｐ　Ｈ８，０）　　５０ｍｌに対して、トリプト
シン２６７単位／■−蛋白質（シグマ社製）を５鴻添加
し、２５℃２０時間インキュベートした。ＮａＣ１濃度
を０．５Ｍにした後、ｌＱｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８，０）−０，５Ｍ　　Ｎａ（１！で充たされ
たｌｎキレート　セファロース（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカル社製）（Ｌ７ｃｍＸ２．６ｃｍ）に５＋ｎ
ｌ／時の流速で通塔した。次いで、１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ２　（ｐＨ８，０）−０，５Ｍ　　ＮａＣｊ！　
　１２ｍ１を３ｍｌ／時の流速で通塔後、１０ｍＭ　Ｔ
　ｒ　ｉ　５−ＨＣ１ｐＨ８，０）−０，５ＭＮａＣＪ
ｉ！の緩衝液系に直線勾配でＯＭから０．３Ｍまでのイ
ミダゾールを総容量３Ｑｍｌかけて加え、同流速で溶出
を行なった。Ｍ−４３誘導体は０．１Ｍイミダゾールで
溶出された（収量２．７　ｍｇ、収率４１％）。純度は
９０％以上であった。

実施例２０６ Ｍ−４３の製造： 第２表の誘導体（ｄ）　（１３２、ｑ／ｍｌ　）を含む
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ−１００ｍＭ　　ＮａＣ
ｊ！溶液（ｐＨ８，０）　　５０ｍ１に対してα−キモ
トリプシン２６７単位／　ｍｇ−蛋白質（シグマ社製）
を５■添加し、２５℃、２０時間インキュベートした。

ＮａＣｊ！濃度を０．５Ｍにした後、１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）　　０．５　Ｍ　　Ｎ　ａ
　Ｃｆ！、で充たされたＺｎキレート　セファロース（
ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）　　（１，７
ｃｍｘ２．５ｃｍ）に６ｍｌ／時の流速で通塔した。次
いで、ｌＱｍＭＴＴｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）
−０，５Ｍ　　ＮａＣＡ１２ｍ１を３ｍ１／時の流速で
通塔後、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）　−
０，５Ｍ　　Ｎａ（ｌの緩衝液系に直線勾配でＯＭから
０．３Ｍまでのイミダゾールを総容１３０ｍ１かけて加
え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−４Ｓ誘導体は０．１
Ｍイミダゾールで溶出された（収量２．３ｍｇ、収率３
５％）。純度は９０％以上であった。

実施例２１゜ 実施例１０−２０に認められたように、１７番目がセリ
ンに置換し、しかもＮ末端アミノ酸が、４個欠失（Ｍ−
４３）、５個欠失（Ｍ−５３）、６個欠失（Ｍ−６３）
、そして７個欠失（Ｍ−７８）されたｈＧ−ＣＳＦｍ導
体が得られる。一般に組換えＤＮＡ技術を用いる場合、
Ｎ末端にメチオニンが付加される。これが、組換え型産
物の１つの欠点である。しかし、本発明の酵素切断法を
用いれば、Ｎ末端にメチオニンが付加されずに製造でき
るので有利である。

このように取得された誘導体のＧ−ＣＳ　Ｆ活性を測定
し比較した。結果を第５表に示す。

第５表　Ｍ−ｎ　Ｓ　（ｎ＝　４．５．６．７）誘導第
５表の結果より、Ｎ末端側アミノ酸４〜７欠失体につい
ては、すべて、インタフ）ｈＧ−ＣＳＦに比べ、ｉｎ　
ｖｉｔｒｏの評価において２〜４倍の高活性が見い出さ
れた。

したがって、本発明より製造できるＮ末端側アミノ酸欠
失体はＮ末端側にメチオニンが付加されず、しかもイン
タクトより２倍〜４倍高活性を有するものである。

Ｎ末端部の変異による加水分解酵素に対する切断反応性
（感受性）の獲得について以下の例で示す。

実験例１゜ インタクトのｈＧ−ＣＳＦとＮ末端変異ｈＧ−ＣＳＦと
のズブチリシン・カールスバーグに対する反応性の比較 実施例１６と同様にして、第２表の誘導体とインタクト
のｈＧ−ＣＳＦをズブチリシン・カールスバーグＣＮ０
ＶＯ社）　３．６　Ｘｌ０−’単位／ｍｇ−ｃ　−ＣＳ
Ｆ存在下に１４時間、２５℃でインキュベートしたとこ
ろ、第２表の誘導体からはＭ−６５誘導体が得られたが
、インタフ）ｈＧ−ＣＳＦは未反応であった。さらに、
酵素量１００倍（３，６Ｘ　１０−２単位／ｍｇ−Ｇ−
ＣＳＦ）にしても、インタクトでは、Ｍ−６３の生成は
なく全体的な分解反応が優先した。

実験例２゜ インタクトのｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦとＮ末端変異ｈＧ−ＣＳ
Ｆとのトリプシンに対する反応性の比較実施例１９と同
様にして、第２表の誘導体（ａ）とインタクトｈ　Ｇ−
ＣＳ　Ｆをトリプシン（シグマ社）０．２２単位／ｍｇ
−Ｇ−ＣＳＦの存在下に２０時間。

２５℃でインキュベートしたところ、第２表の誘導体（
ａ）からはＭ−４３誘導体が得られたが、インタクトｈ
Ｇ−ＣＳＦは未反応であった。さらに、酵素量１００倍
（２２単位／■−〇−ＣＳ　Ｆ）にしても、インタクト
ｈ　Ｇ−ＣＳ　ＦではＭ−４３の生成はなく全体的な分
解反応が優先した。

実験例３゜ ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体の熱安定性： 第６表に示した本発明の各種誘導体２０■をリン酸緩衝
液−生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７，２）または１０％
牛脂児血清（ＦＢＳ）添加α−ＭＥＭ培地１ｍｌに溶解
させた。５６℃でインキュベートし、経時的にサンプル
採取を行い、そのＣＳＦ活性を、マウス骨髄細胞を用い
たコロニー形成試験（前記開部らの方法）で測定した。

各サンプルは４０ｎｇ／ｍｌより２段階稀釈法で１０段
階の稀釈を行い、各段階の測定を行い、良好な用量反応
（Ｄｏｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を与える任意の濃度で
の活性を加熱前（０分）と比較することにより残存活性
を求めた。

ＰＢＳ中または１０％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭ培地中での
残存活性（熱安定性に対応する）をそれぞれ第６表（Ａ
）および（Ｂ）に示す。

（Ｂ） 実施例２２゜ 部位特異的変異を用いたｐｃｆＢＤ２８Ａ１７゜ｐｃｆ
ＢＤ２８Ｔ１７の造成（第１７図参照）：（ａ）　　鋳
型−末鎖ＤＮＡ　（−重鎮ｐｔ１９ＢＤ２８Ｎ）の造成
： 実施例６（４）の方法で得たｐＣｆＢＤ２８　３■を５
０ＪｌｆｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂａ
ｎ１ｍ　（東洋紡績社製）とＰｓｔＩをそれぞれ１０単
位ずつ加え、３７℃で２時間切断反応を行った。この反
応液からＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（ＮＤ２
’８）のＮ末部分をコードする約２１０ｂｐのＤＮＡ断
片（ＢａｎＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片）約０．１■を得た。

一方、Ｍ１３ファージベクターであるＭ１３ｍｐ１９Ｒ
ＦＤＮＡ　（全酒造社製）Ｉｇを全量５０〃のＹ−５０
緩衝液に溶かし、制限酵素Ａｃｃｌ（東洋紡績社製）を
１０！ｉ位加え、３７℃、２時間切断反応を行った。そ
の後、ＮａＣβ濃度が１００ｍＭになるようにＮａＣβ
を添加し、制限酵素Ｐｓｔｌを１０単位加え３７℃、２
時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
約７．２４　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（ＡＣＣＩ−Ｐｓｔｌ
断片）約０．８■を得た。

上記で得たＢａｎＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（約２１０ｂｐ
）０．２ｔＬｇと、Ａｃ　ｃ　ｒ−Ｐｓ　ｔ　１１１片
（約７．２４ｋｂ）０．０５■をＴ４リガーゼ緩衝液５
０薦に溶かし、この混合液にＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガー
ゼ１０単位を加え１２℃、１６時間結合反応を行った。

次に、公知の方法に従い、上記反応液を用いて大腸菌Ｊ
ＭＩ　０５株をトランスフェクションし、組換え体ファ
ージを得た。この組換え体ファージの感染した大腸菌Ｊ
ＭＩ　Ｏ５株の培養菌体より、プラスミドＤＮＡ回収法
に準じて、組換え体Ｍ１３ファージＲＦＤＮＡを回収し
た。

このＲＦＤＮＡ　（これをｐ　ｔ　１９ＢＤ２８Ｎと呼
））ノ構造は、ＰｓｔＪ、ＥｃｏＲＩ、ＡｖａＩ。

ＸｈｏＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より確認した。そこでこの組換え体ファージより、公知
の方法に従って一本鎖ｐｔ１９ＢＤ２８Ｎを回収し鋳型
とした。

（社）ギャップト・デュプレックスＤＮＡ　（Ｇａｐｐ
ｅｄＤｕｐｌｅｘ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）の造成：Ｍｌ　３ｍ
ｐ　１９ＲＦＤＮＡ　（全酒造社製）３■を３０４のＹ
−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄＩ［をそれぞれ１０単位ずつ加え、３７℃で２時間切
断反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法により約７．２　ｋ　ｂのＤＮ
Ａ断片（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩｒ断片）約２．５■
を得た。

このｍｐ１９ＲＦＤＮＡ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ
Ｉｌｒ断片（約７．２ｋｂ）と前項で得た鋳型−重鎮Ｄ
ＮＡ、ｐｔ１９ＢＤ２８Ｎ　　１■をクレノー緩衝液２
７誠に溶かし、１００℃で６Ｄ−１その後、６５℃で１
０分間、３７℃で４０分間。

クスＤＮＡを生成させた。生成したギャップト・デュプ
レックスＤＮＡはＬＧＴ法により回収した。

（Ｃ）　　突然変異誘発（ｐｔ　１９ＢＤ２８ＮＡ１７
゜ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＴ１７の造成）： 実施例６で得たｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体〔ＮＤ２８）の
Ｎ末端から１７番目のアミノ酸であるＳｅｔをＡｌａに
置換するために必要な一本鎖ＤＮＡ（これをＤ−１と呼
ぶ）および同ＳｅｔをＴｈｒに置換するために必要な一
本鎖ＤＮＡ　（これをＤ−２と呼ぶ）を通常のトリエス
テル法により合成した。Ｄ　−１（３３−ｍａｒ）およ
びＤ−２（３３−ｍａｒ）の塩基配列を下に示す。

Ａｌａ ↑ Ｔｈｒ ↑ Ｄ−１を用いた突然変異誘発により５ｔｕｌサイトが、
Ｄ−２を用いた突然変異誘発によりＸｂａ　Ｉサイトが
新たに生じるようにデザインされているため、突然変異
が導入されたものをこれらの制限酵素による切断で確認
することができる。

Ｄ−１，Ｄ−２それぞれ１眉を別個に５０ｄのＴ４キナ
ーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３
０単位を加えて３７℃で６０分間リン酸化反応を行った
。

次に、このリン酸化したＤ−１あるいはＤ−２の０．２
■と前項で得たギャップト・デュプレックスＤＮＡ０．
ＩＪｔｇを６．５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！　（＋
）８７．５）、８ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１ｍＭ２−メル
カプトエタノールおよび１００ｍＭＮａＣｌ！を含む緩
衝液３４４に溶かし、６５℃で６０分間、室温で３０分
間放置し、Ｄ−１あるいはＤ−２をギャップト・デュプ
レックスＤＮＡにアニールさせた。

この溶液にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰをそれぞれ　０．５ｍＭになるように加えた後
、１．５単位のＤＮＡポリメラーゼ■・クレノー断片と
１０単位のＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼを加え、４℃、
１６時間の伸長反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０５をトランスフェクシ
ョンし、変異導入ファージを得た。

変異導入ファージの感染した大腸菌ＪＭ１０５よりＲＦ
ＤＮＡを回収し、Ａｖａ　ｌ、Ｘｈｏ　Ｉ。

５ｔｕｌ（Ｄ−１を用いた場合）あるいはＸｂａＩ（Ｄ
−２を用いた場合）で切断後、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により確認した。Ｄ−１により変異を導入した
ＲＦＤＮＡをＩ）ｔ１９ＢＤ２８ＮＡ１７．Ｄ−２によ
り変異を導入したＲＦＤＮＡをｐｔ　１９ＢＤ２８ＮＴ
１７と呼ぶ。

ｐ　ｔ　１９ＢＤ２８ＮＡ１７の５ｔｕｒサイト付近お
よびｐ　ｔ　１９ＢＤ２８ＮＴ１７のＸｂａ　Ｉサイト
付近の塩基配列は下記のとおりであることを、Ｍ１３フ
ァージを用いたディデオキシ・シーフェンス法で確認し
た。

（ｄ）　　ｐｃｆＢＤ２８Ａ１７およびｐＣｆＢＤ２８
Ｔ１７の造成： 前項で得たｐ　ｔ　１９ＢＤ２８ＮＡ１７°あるいはＩ
）ｔ１９ＢＤ２８ＮＴ１７３■を５０４のＹ−１００緩
衝液に溶かし、制限酵素ＡｖａＩおよびＸｈｏＩをそれ
ぞれ１０単位加え３７℃で２時間切断反応を行った。反
応液からＬＧＴ法により、前項で導入した変異　部位を
含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ａｖ　ａ　Ｉ−Ｘｈ　
ｏ　１断片）を０．０５尾得た。

一方、実施例６の（４）で得たｐＣｆＢＤ２８２Ｊｔｇ
を５０１ＪｉのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｘ
ｈｏｌとＢｇβ■をそれぞれ１０単位ずつ加え３７℃で
２時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によ
り、トリプトファンプロモータ一部分を含む約２．７４
ｋｂのＤＮＡ断片（Ｘｈｏｌ−ＢｇＲＵ断片）を約ｌ１
１ｇ得た。

また、ｐｃ　ｆ　ＢＤ２８２■を５０ＩＩＪ！のＹ−１
００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂｇβ■を１０単位加え
３７℃で２時間切断反応を行った。アガロースゲル電気
泳動でＢｇ、ｉ！ｎ切断が完全に行われていることを確
認した後に、制限酵素Ａｖａｌを５単位加え３７℃で１
０分間部分切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法
により、成熟型ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの大部分とＲｐｐ
ターミネータ一部分を含む約１．２９　ｋ　ｂのＤＮＡ
断片（Ｂｇ　ｊ！　ＩＩ−Ａｖ　ａ　Ｉ断片）を０．４
Ａｇ得た。

次に上記で得たｐＣｆＢＤ２８由来のｘｈ○■−Ｂｇ　
ｆ　Ｉ［断片（約２．７４ｋｂ＞　０．１■および８ｇ
β１ｌ−Ａｖａｌ断片（約１．２９ｋｂ）とｐｔ１９Ｂ
Ｄ２８ＮＡ１７あるいはｐ　ｔ　１９ＢＤ２８ＮＴ１７
のＡｖａｌ−ＸｈｏＩ断片（約１１０ｂｐ）　０．０２
埒をＴ４リガーゼ緩衝液６０ｓｔに溶かし、１０単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、１２℃で１６時間結合反応
を行った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐ’のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプ
ラスミドＤＮＡを回収した。

ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＡ１７を用いて造成したプラスミド
をｐｃｆＢＤ２８ＡＩ７．ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＴ１７を
用いて造成したプラスミドをｐｃ　ｆ　ＢＤ２８Ｔ　１
７と呼ぶ。ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７の構造は、Ａｖａｒ、
ＸｈｏＩ、Ｂｇ’β■。

５ｔｕｌで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認
した。また、ｐｃｆＢＤ２８ＴＩ　７の構造はＡｖａＩ
、ＸｈｏＩ、Ｂｇｊ７ＩＩ、ＸｂａＩで切断後、アガロ
ースゲル電気泳動により確認した。

これら２つのプラスミドがコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導
体は、それぞれ成熟型ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆに比べて以下の
ようにアミノ酸残基が置換されている。

ｐｃｆＢＤ２８Ａ１７およびｐＣｆＢＤ２８Ｔ１７にコ
ードされるｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆ誘導体を以後、それぞれｈ
Ｇ−ＣＳＦ　ＣＮＤ２８Ａ１７）。

ｈＧ−ＣＳＦ　（ＮＤ２８Ｔ１７）と呼ぶ。

参考例１゜ ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐｃｓＦ１−２
の単離 （１）　　正常人末梢血マクロファージからのポリ　（
Ａ）ＲＮＡの調製： 正常人の末梢血より遠心分離して得た白血球をプラスチ
ックボトルで培養し、非接着性の細胞を洗浄・除去する
ことにより、接着性の細胞であるマクロファージを単離
した。このマクロファージより、チオシアン酸グアニジ
ン−塩化リチウム法〔カサラ（Ｃａｔｈａｌａ）　　ら
：ディーエヌエイ　（ＤＮＡ）　２．３２９　（１９８
３）　）に従い、ポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下記のご
とく調製した。

正常人の末梢血４０　ＱｍｌをＨｉｔａｃｈｉ　ＲＰＲ
ＩＯ。

−ターにて１８０Ｏｒｐｍ、２０分間遠心して血球を沈
殿させ、これを５　Ｑｍｌ　’Ｊン酸緩衝食塩水〔Ｎａ
ＣＲ８ｇ／Ｊ、ＫＣｊ！　　０．２ｇ／Ｌ無水Ｎ　ａｚ
ＨＰ　Ｏｌｌ、　１５　ｇ／　ｊ！、Ｋ　Ｈ，Ｐ　０゜
０．２ｇ／ｆ！　（ｐＨ７，２）；以下ＰＢＳと略記す
る〕に懸濁した。この懸濁液２５ｍ１をリンパ球分離液
〔ピオネティクス（ＢＩＯＮ巳ＴｌＣ３）社製〕２５ｍ
１ニ重層し、旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯ（ｊ−ターにて
１８００ｒｐｍ　、　３０分間遠心した。中間層の白血
球を分取し、等量のＰＢＳで洗浄（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｒ
ＰＲＩＯローターにて１５０Ｏｒｐｍ、１０分間）した
後、５％の仔牛脂児血清を含む２　ＱｍｌのＲＰＭ１１
６４０培地（田水製薬社製）に、懸濁し培養した。

培養には組織培養用フラスコ〈コーニング社製）を用い
た。３７℃で１．５時間培養した後、培養上清を非接着
性の細胞とともに除去した。新たに２（１ｍｌの同培地
と大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）を０．３　ｍｇ／ｍｌとな
るように加え、さらに３７℃で４時間培養した。次いで
、培養液より１．］、００Ｘｇ、　４℃、１０分間の遠
心によって細胞を集め、８０ｍ１のＰＢＳで洗浄した後
、５Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ
、５０ｍ１イ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７）およ
び８％（Ｖ／Ｖ）　２−メルカプトエタノールからなる
溶液１０ｍ１中でポルテックス・ミキサーを用い可溶化
した。この可溶化物を遠心管に移し４ＭＬｉＣ！！溶液
３Ｑｎ＋１をりえて撹拌した後、４℃、２０時間静置し
た。

ｔ（ｉｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＱ　ｏ−クーにて９．００
　Ｏｒｐｍ　、　９０分間遠心後、ＲＮＡを沈殿として
回収した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチ
ウムからなる溶液５　Ｑｍｌに懸濁し、旧ｔａｃｈｉ　
ＲＰＲＩＯローターにて９．００　Ｑｒｐｍ、　６０分
間遠心後、再びＲＮＡを沈殿として回収した。

ＲＮＡの沈殿を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、Ｉｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ！（
ｐＨ７，５）からなる溶液Ｉ　Ｑｍｌに溶解し、フェノ
ール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回
収した。得られたＲＮＡ約０、８　ｍｇを１０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−Ｈ（１（Ｊ）Ｈ８，０）および１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡからなる溶液１ｍｌに溶かした。６５℃、５分間
インキコベートし、０．１ｍ１の５ＭＮａＣ１を加えた
。混合物をオリゴ（ｄ　Ｔ）セルロース・カラム〔ピー
・エル・バイオケミカル（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積０．５
ｍｌ＞にかけた。吸着したポ’Ｊ　　（Ａ）を有するｍ
ＲＮＡを１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊｌ！　（ｐ
Ｈ７，５）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液で溶
出し、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約３０鴻を得た。

（２）　　ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入
：オカヤマーバーグ（Ｄｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　）の
方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ
（Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、）、　　２．１６１　
（１９８２））に従い、ＣＤＮＡの合成とそれを組み込
んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概
略を第９図に示す。

ｐｃＤＶｌ　（オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａ−ｙ
ａｍａ　＆　Ｂｅｒｇ）　：モレキュラー畢アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、
）、　３．２８０（１９８３））　４００ｔｔｇを１０
ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、６ｍ
Ｍ　　ＭｇＣＲ，および１０ｍＭＮａＣｊ！からなる溶
液３００誠に加え、さらに５００単位のＫｐｎ　Ｉを加
えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫｐｎ
ＩｔＢ位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出後
、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。Ｋｐｎ　Ｉ
切断した該ＤＮＡ約２００眉を４０ｍＭカコジル酸ナト
リウム、３０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６，８）
、　　１　ｍＭ　　Ｃａ　Ｃｌ　２および０．１ｍＭジ
チオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる緩
衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを０．
２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００ＪＩＩｌに加え、
さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）（Ｐ−Ｌ　
Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃、
１１分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶｌのＫｐｎ　Ｉ
切断部位の３′末端にポＩＪ（ｄＴ）鎖が約６７個付加
された。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エ
タノール沈殿により、ポＩＪ（ｄＴ）ｔｍの付加したｐ
ＣＤＶＩＤＮＡ約１００■を回収した。該ＤＮＡを１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、６ｍＭ　
　ＭｇＣＣ，１００ｍＭＮａＣｊ！からなる緩衝液１５
０ｍに加え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩを加え、３
７℃２時間反応させた。該反応物をＬＧＴ法で処理後、
約３．１　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を回収し、約６０Ｊｔｇ
のポリ　（ｄＴ）鎮付加ｐｃＤＶ１を得た。該ＤＮＡを
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！　（ｐＨ８，０）お
よび１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液５００頭に溶解し
、６５℃５分間インキュベート後、氷冷して５０４の５
Ｍ　　Ｎａ、ＣＩを加えた。混合物をオリゴ（ｄＡ）セ
ルロースカラム（コラボラティブリサーチ社製）クロマ
トグラフィーにかけた。ポＩＪ（ｄＴ）鎖長が充分なも
のはカラムに吸着し、これを１０ｍＭ　　Ｔｒｊｓ−Ｈ
Ｃｊ！（ｐＨ８，０）および１　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａか
らなる溶液で溶出し、ポ＋）　　（ｄＴ）鎖の付加した
ｐｃＤｌ（以下ベクターブライマーと略記する）２７Ｊ
ｔｇを得た。

次にリンカ−ＤＮＡの調製を行った。

ｐＬＩ　Ｃオカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆　　Ｂｅｒｇ）　　：モレキユラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジイ（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、
）、　３．２８０（１９８３）　）　　約１４ＩＩｇを
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｆ＋７．５）、　　
６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ　　ＮａＣβから
なる緩衝液２００誠に加え、さらに５０単位のＰｓｔＩ
を加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰｓ
ｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、ＰＳｔＩで切断
したｐ　Ｌ　Ｉ　ＤＮＡ約１３Ｊｉｇを回収した。

該ＤＮＡ約１３ｘｒをＴｄＴ緩衝液に越濃度０．２５ｍ
ＭのｄＧＴＰを含む溶液５０薦に加え、さらにＴ　ｄ　
Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）５４単
位を加えて３７℃１３分間インキニベートし、ｐＬｌの
ＰｓｔＩ切断部位３′末端に（ｄ　Ｇ）鎖を約１４個付
加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈
殿にてＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを］　ＯｍＭ　　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）　。

５　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｊ！　２および６０ｍＭ　　
Ｎａ（１からなる緩衝液１００薦に加え、さらに８０ｆ
ｉ位のＨｉｎｄｎｌを加えて３７℃３時間インキコベー
トシ、ｐ　Ｌ　Ｉ　ＤＮＡのＨｉｎｄ［部位で切断した
。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約Ｑ
、　５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ド
レツエン（口ｒｅｔｚｅｎ）　　ら：アナリティカル・
バイオケミストリイ（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）。

１１２、　２９５　（１９８１）　〕にて回収し、オリ
ゴ（ｄＧ）鎖付きのリンカ−ＤＮＡ　（以下単にリンカ
−ＤＮＡと略記する）を得た。

上記で調製したポ’Ｊ　（Ａ）ＲＮＡ約３■、ベクター
プライマー約１．４ｇを５０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５−Ｈ
Ｃｊ！（ｐＨ８，３）、８ｍＭ　ＭｇＣｊ！２゜３０ｍ
Ｍ　　ＫＣｌ、０．３ｍＭ　　ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ
　（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）お
よび１０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ−Ｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２．
３ｍに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工業社製
）を加え、４１℃９０分間インキュベートし、ｍＲＮＡ
に相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡ−
ＤＮＡ二重二重材加したベクタープライマーＤＮＡを回
収した。該ＤＮＡを６６ｐＭ　　ｄＣＴＰおよび０．２
Ｎポリ　（Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液２０４に溶かし、１
４単位のＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社製）を加えて３７℃２分間インキニベートし、
ｃＤＮＡ３’末端に２０個の（ｄＣ）鎮を付加した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿により（ｄＣ）鎖の付加したｃＤＮＡ−ベクタープ
ライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　６ｍＭ　ＭｇＣＬ
および６０ｍＭ　　ＮａＣｊ！からなる液４００ｍに溶
かし、２０単位のＨｉｎｄｌ［を加え、３７℃２時間イ
ンキュベートし、）ｉｉｎｄＩ［Ｉ部位で切断した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿して０．５ピコモルの（ｄＣ）鎮付加ｃＤＮＡ−ベク
ターブライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．２ピコモル
および前記のリンカ−ＤＮＡ０．４ピコモルを１０ｍＭ
　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＯ２（＋）Ｈ７，５）、０．１Ｍ　
　ＮａＣ１’および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液１
００ｍに溶かし、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０
分。

２５分、３０分間インキニベートした。２０ｍＭＴｒ　
ｉ　５−ＨＣｊｉ！　（ｐ）１７．５）　、　　４ｍＭ
　　ＭｇＣＬ。

１０ｍＭ　（ＮＨ，）２ｓｏ、、０．１Ｍ　　ＫＣＩお
よび０．１ｍＭ　　β−ＮＡＤの組成で、全量１０００
ｍとなるよう反応液を調製した。該反応液に２５単位の
大腸菌ＤＮＡ！Ｊガーゼにューイングランド・バイオラ
ブズ社製）を加え、１１ｔ１８時間インキュベートした
。該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ、０．１５ｍＭ　β
−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製し、１０単位の大腸
菌ＤＮＡリガーゼ、２０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩ　　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）お
よび１０単位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅ−ｍｉｃａｌｓ社製）を加え、１２℃、２５
℃で順次１時間ずつインキュベートした。上記反応で、
ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−ＤＮ
Ａ二重二重材ＮＡ部分がＤＮＡに置換され、完全な二重
鎖Ｄ　Ｎ　Ａの組換え体プラスミドが生成した。

（３）　　ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの
選択： （２）で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８株をスコツト（Ｓｃｏｔｔ）　　らの方法
〔重定勝哉：細胞工学２．６１６（１９８３））に従い
形質転換した。得られた約９２００個のコロニーをニト
ロセルロース・フィルター上に固定シた。長田ら〔長田
（Ｎａｇａｔａ）ら：ネイチ＋　−（ｌｉａｔｕｒｅ）
３１９　、４１５（１９８６））が単離したｈ　Ｇ−Ｃ
Ｓ　Ｆの成熟タンパク質のＮ末端９アミノ酸に相当する
２７塩基の合成りＮＡ ５’−ＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴ
ＣＣＣＴＧ　−３’を３２ｐで標識したプローブに６０
℃で強く会合した１菌株を選んだ〔グルンステイン・ホ
グネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−）１ｇｇｎｅｓｓ）の方
法、プロシーディング・オブ・ヂ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、）　ＩＳＡ　７２゜３９６１（１９７５）
　）。この菌株がもつプラスミドｐＣＳＦ１２が有する
ｃＤＮＡの全塩基配列を、Ｍ１３ファージを用いたディ
デオキシ・シーフェンス法により決定したく第１表）。

そめ結果、ｐＣＳＦ　１−２が有するｃＤＮＡは、ｈ　
Ｇ−ＣＳＦをコードしていることが判明した。

この菌株は、前記のようにε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉＥＣＳＦＩ−２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２２０）
として、微工研に寄託されている。

参考例２゜ プラスミドｐＫＹＰ２６の分離精製 ｐＫＹＰ２６を含む大腸菌〔巳５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉＩＫＹＰ２６　（ＦＢＩＩＭ　ＢＦ−８６３）
）を５０ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むし培地（１％バ
タトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％Ｎ　ａ　Ｃ
Ｒ、ｐ　Ｈ７，５）ｌ　Ｑ＋ｎｌで３７℃、１８時間培
養した。この培養液全量を５０ｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むし培地１１に植菌し、３７℃で培養した。４時間
後に、クロラムフェニコールを１７０■／ｍｌとなるよ
うに加え、さらに３７℃、１６時間培養した。遠心分離
法（５，００Ｏｒｐｍ　１０分間）により集菌を行い、
０．８％ＮａＣｌ２で菌体を洗浄した後、５０ｍＭＴｒ
　ｉ　５−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８，０）２０ｍｌに懸濁
し、氷冷した。１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを３ｍｌ加
え水中に１０分間静置した後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを９
．６ｍｌ加え、水中に１０分間静置し、２％トリトンＸ
−１００（和光純薬工業社製）を２．３ｍｌ加え水中に
さらに１時間静置した。５０，０００ｘｇで４℃、１時
間超遠心分離を行い、上滑的４０ｍ１を得た。次にこの
上清に３ＭＮａＯＨを加えｐＨを１２．５として、室温
で１０分間静かに撹拌した。

２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）を加え、ｐＨを
８．５にもどし、さらに３分間撹拌した。この時点で液
の容量は約５５＋ｎｌであった。１／９容の５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１を加えた後、フェノール抽出をを行った。Ｉ／２
５０容の５ｔｎｇ／ｍＩＲＮａｓｅ　　Ａ（シグマ社製
）を加え、３７℃、１時間ＲＮＡ分解反応を行った後、
１１５容の５Ｍ　　ＮａＣβを加え、１／３容の３０％
ＰＥＧ６０００　（半井化学薬品社製）を加え一２０℃
に２時間静置した。

遠心分離法で沈殿を集め、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ！　（ｐＨ７，５）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからな
る液２ｍｌに溶かし、ンジウム・ドデシル・サルフェイ
ト　（ＳＤＳ）を０．５％となるよ°うに加え、プロテ
ィナーゼＫ（シグマ社製）を５０■／ｍｌとなるように
加えて、３７℃、１時間蛋白質分解反応を行った。フェ
ノール抽出を３回繰り返し行った後、クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱でＤＮＡを回収し、１０ｍＭＴ　
ｒ　ｉ　５−ＨＣＲ（ｐ）１７．５）ふよび１ｍＭ　　
ＥＤＴＡからなる液１ｍｌに溶かした。このようにして
ｐＫＹＰ２６を８００ｇ得ることができた。ｐＫＹＰ２
６の構造は、ＥｃｏＲＩ。

Ｋｐｎ　Ｉ、ＢａｍＨｌ、Ｂｇｊ２ＩＩ、、、Ｐｓ　ｔ
　Ｉで切断してアガロースゲル電気泳動で′ｆＩｉ認し
た。

参考例３゜ １）ヒトＬＴｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＬＴ１の単ａ
： （１）ＬｕｋＩＩ細胞よりのポリ　（Ａ）ＲＮＡの調製
： ヒトリンパ芽球様細胞株ＬｕｋＩＩより、チオシアン酸
グアニジン−塩化リチウム法〔力サラ（Ｃａｔｈａｌａ
）ら：ディーエヌエイ　（ＤＮＡ）ヱ、　３２９　（１
９８３＞）に従い、ポリ（Ａ＞を有するＲＮＡを下記の
ごとく調製した。

ヒトリンパ芽球様細胞株１．ｕｋＩＩｃベリッシュ・ワ
イ・ルビ７　（Ｂｅｒｉｓｈ　Ｙ、Ｒｕｂｉｎ）　　ら
：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　［ＩＳＡ　８２．６６３７　
（１９８５）　）を、５％の仔牛脂児血清と１ｍＭＮ−
２−とドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンス
ルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む１１のＲＰＭ１１６４
０培地（日永製薬社製）に、８　Ｘ　１０５／ｍｌとな
るように接種し、増殖させた。培養にはスピンナー・カ
ルチャー・ボトルを用いた。３７℃で４８時間培養した
後、遠心によって細胞を集め、１０ｎｇ／＋ｎｌのフォ
ルボール・ミリステート・アセテ−）　（ＰＭＡ　；Ｐ
ｈｏｒｂｏｌｍｙｒｉｓｔａｔｅ　ａｃｅｔａｔｅ）と
５％の仔牛脂児血清と１ｍＭ　　ＨＥＰＥＳを含む、新
しい１βのＲＰＭ１１６４０培地に移し、さらに３７℃
で４８時間培養した。続いて、この細胞懸濁液の一部（
２５０ｍ１）から１．１１０Ｏｘ、４℃。

１０分間の遠心によって細胞を集め’、３Ｑｍｌのリン
酸塩バッファーで洗浄した後、５Ｍチオシアン酸グアニ
ジン、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ７）およ
び８％（Ｖ／Ｖ）　　２−メルカプトエタノールからな
る溶液１０ｍ１中でポルテックス・ミキサーを用い可溶
化した。この可溶化物を遠心管に移し、４Ｍ　　ＬｉＣ
！溶液８０ｍ１を加えて撹拌した後、４℃、２０時間静
置した。旧ｔａｃｈｉＲＰＲＩＯＤ−ターにて９．ＯＯ
Ｏｒｐｍ。

９０分間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡ
の沈殿を４Ｍ尿素ふよび２Ｍ塩化リチウムからなる溶液
５０１Ｔｌｌに懸濁し、旧ｔａｃｈｉＲＰＲ１００−タ
ーにて９．００　Ｏｒｐｍ、　６０分間遠心後、再びＲ
ＮＡを沈殿として回収した。

ＲＮＡの沈殿を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−Ｈｃｉ　（ｐＨ
７，５）からなる溶液Ｉ　Ｑｍｌに溶解し、フェノール
−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収し
た。得られたＲＮＡ約２．５■を１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｊ！（ｐＨ８，０）＃よび１ｍＭ　　ＥＤＴＡか
らなる溶液１ｍｌに溶かした。６５℃、５分間インキニ
ベートし、０，１ｍｌの５Ｍ　　Ｎａ（１！を加えた。

混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース・カラム〔ビー・エ
ル・バイオケミカル（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ＋
）社製〕りＤ？トゲラフイー（カラム体積０．５ｍ１）
にかけた。吸着したポリ（Ａ＞を有するｍＲＮＡを１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）および１ｍＭ
　ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ！Ｊ　（Ａ）を有
するｍＲＮＡ約１００ｇを得た。

（２）　　ＣＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入
： オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方法
〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（Ｍ
ｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、　　２．１６１　（１
９８２）　）に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込ん
だ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概略
を第９図に示す。

ｐｃＤＶＩ　Ｃオカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａ
ｍａ　＆　Ｂｅｒｇ）　：　％　Ｌ／キュラー◆アンド
・セルラー・バイオロジ４　（Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉ
ｏｌ、）。

３、　　２８０　　　（１９８３ン　）４００ｘｒを１
０ｍＭ　　　Ｔ　　ｒ　　ｉ　　　５ＨＣｊ！　（ｐＨ
７，５）　、６ｍＭ　ＭｇＣＬおよび１０ｍＭ　ＮａＣ
ｊ！からなる溶液３００４に加え、さらに５００単位の
ＫｐｎＩを加えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミ
ド中のＫｐｎ　Ｉ部位で切断した。フェノール−クロロ
ホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した
。Ｋｐｎ　Ｉ切断した該ＤＮＡ約２００■をＴｄＴ緩衝
液にｄＴＴＰを０，２５ｍＭとなるよう加えた溶液２０
０ｍに加え、さらに８１単位のＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃、１
１分間反応させた。

ここで、ｐｃＤＶｌのＫｐｎ　Ｉ切断部位の３′末端に
ポ’Ｊ　　（ｄＴ）鎖が約６７個付加された。

該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈殿により、ポリ　（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶ　Ｉ
　ＤＮＡ約１００尾を回収した。

該ＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！（ｐＨ７
，５）、６ｍＭ　　ＭｇＣＬ、１００ｍＭＮａＣｊ！か
らなる緩衝液１５０ｇに加え、さらに３６０単位のＥｃ
ｏＲＩを加え、３７℃２時間反応させた。該反応物をＬ
ＧＴ法で処理後、約３．ｌ　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を回収
し、約６０■のポリ　（ｄＴ）！Ｊ付加ｐＣＤＶｌを得
た。該ＤＮＡをｌＱｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ
８，０）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液５００
ｍに溶解し、６５℃５分間インキニベート後、氷冷して
５０誠の５Ｍ　　ＮａＣｊ！を加えた。混合物をオリゴ
（ｄＡ）セルロースカラム（コラボラティブリサーチ社
製）クロマトグラフィーにかけた。ポリ　（ｄＴ）鎖長
が充分なものはカラムに吸着し、これを１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ＜ｐＨ８，０）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
からなる溶液で溶出し、ポリ　（ｄＴ）鎖の付加したｐ
ｃＤＶｌ　　（以下ベクターブライマーと略記する）２
７眉を得た。

次にリンカ−ＤＮＡの調製を行った。

ｐＬＩ　Ｃオカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆Ｂｅｒｇ）：モレキユラー・アンド・セルラー・ハイ
オロジ４　　（Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、）、　
　３゜２８０　（１９８３））約１４■を１０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　（ｐＨ７，５＞、６ｍＭ　　Ｍｇ
ＣＪ！。

および５０ｍＭ　　ＮａＣｊ！からなる緩衝液２００μ
ｓに加え、さらに５０単位のＰｓｔｌを加え、３７℃４
時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰＳｔＩ部位で切断さ
せた。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿を行い、ＰｓｔＩで切断したｐＬ　Ｉ　Ｄ
ＮＡ約１３■を回収した。該ＤＮＡ約１３■をＴｄＴ緩
衝液に終濃度０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０ｄ
に加え、さらにＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ−ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製）５４単位を加えて３７℃１３分間イ
ンキコベートし、ｐＬｌのＰｓｔｌ切断部位３′末端に
（ｄ　Ｇ）鎮を約１４個付加した。フェノール−クロロ
ホルム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該
ＤＮＡを１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ７
，５＞、６ｍＭＭ　ｇ　Ｃｊ！　２および６０ｍＭ　　
ＮａＣβからなる緩衝液１００ρに加え、さらに８０単
位のＨｉｎｄｌＩ［を加えて３７℃３時間インキュベー
トし、ｐ　Ｌ　Ｉ　ＤＮＡの）（ｉｎｄ■部位で切断し
た。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約
Ｑ、５ｋｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツ
ェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ）ら：アナリティカル・バイオケ
ミストリイ　（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１１２．２９５　（１９８１）　
）にて回収し、オリゴ〈ｄＧ）ｕＡ付きのリンカ−ＤＮ
Ａ（以下単にリンカ−ＤＮＡと略記する）を得た。

上記で調製したポ’Ｊ　　（Ａ）ＲＮＡ約２■。

ベクターブライマー約１．４■を５０ｍＭＴｒ　１ｓ−
ＨＣＩＩ　（ｐＨ８，３）、８ｍＭＭｇＣ１２，３０ｍ
Ｍ　　ＫＣｊ！、０．３ｍＭＤＴＴ、２ｍＭ　　ｄＮＴ
Ｐ　（ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄｃＴＰ）および１０単位の
りボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２．３４に溶解し、
１０単位の逆転写酵素（生化学工業社製）を加え、４１
℃９０分間インキュベートし、ｍＲＮＡに相補的なりＮ
Ａを合成させた。該反応物をフェノール−クロロホルム
抽出、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮の
付加したベクターブライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮ
Ａを６６μＭ　　ｄＣＴＰおよび０．２■ポリ　（Ａ）
を含むＴｄＴ緩衡液２０ρに溶かし、１４単位のＴｄＴ
（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３，
７℃２分間インキュベートし、ｃＤＮＡ３’末端に２０
個の（ｄＣ）鎖を付加した。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出し、エタノール沈殿により（ｄＣ）ｔＪ
の付加したｃＤＮＡ−ベクターブライマーＤＮＡを回収
した。該ＤＮ、Ａを１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ
Ｉ　（ｐＨ７，５）。

６ｍＭ　　ＭｇＣＬおよび６０ｍＭＮａＣｇからなる液
４００ＩＪＪ！に溶かし、２０単位の。

ＨｉｎｄＩ［Ｉを加え、３７℃２時間インキュベートし
、ＨｉｎｄＩＩ［部位で切断した。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して０．５ピコ
モルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤ
ＮＡを得た。

該ＤＮＡ０．’２ピコモルおよび前記のリンカ−ＤＮＡ
０．４ピコモルを１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩＩ
（ｐＨ７，５）、０．１Ｍ　　ＮａＣ１および１ｍＭＥ
ＤＴＡからなる溶液１００度に溶かし、６５℃、４２℃
、０℃でそれぞれ１０分、２５分。

３０分間インキュベートした。２０ｍＭＴｒ　ｉ　５−
ＨＣＲ（ｐＨ７，５）、４ｍＭＭ’ｇＣＬ、１０ｍＭ　
（ＮＨ４）２３０４゜０．１Ｍ　　Ｋ（ｌおよび（１，
１ｍＭ　　β−ＮＡＤの組成で、全量１００　ｍとなる
よう反応液を調製した。該反応液に２５単位の大腸菌Ｄ
ＮＡリガーゼにニーイングランド・バイオラブズ社製）
を加え、１１℃１８時間インキュベートした。該反応液
を各４０μＭのｄＮＴＰ。

０．１５ｍＭ　　β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製
し、１０単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｊガーゼ。

２０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｐ−Ｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および１０単位の大腸
菌リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ　　ａｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社製）を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつ
インキュベートした。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換
えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮のＲＮＡ部
分がＤＮＡに置換され、完全な二重１ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａの
組換え体プラスミドが生成した。

（３）　　ヒトＬＴｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの選択
： （２）で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６０
０ＳＦ８株〔カメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ）　：プロシー
ディング・オプ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＬＩＳＡ７２．３４１６　（１
９７５）　〕を５ＣＯｔｔらの方法〔重定勝哉：細胞工
学ユ、　６１６　（１９８３））に従い形質転換した。

得られた約３０．０００個のコロニーをニトロセルロー
ス・フィルター上に固定した。ジエネンテク（Ｇｅｎｅ
ｎｔｅｃｈ　）社が単離したヒトＬＴｃＤＮＡ　（バト
リック・ダブりニー・グレイ（Ｐａｔｒｉｃｋ　Ｗ、Ｇ
ｒａｙ）らニネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　３２２．
　７２１０９８４）　　）の５′非翻訳領域の一部の塩
基配列と一致するＩ’ｌ基の合成りＮＡ５’−ＧＡＴＣ
ＣＣＣＧＧ　ＣＣＴ　Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ　−３’を３２ｐ
で標識したプローブに５２℃で強く会合した１菌株を選
んり〔クルンスティン・ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
　−）１ｏｇｎｅｓｓ　）の方法、プロシーディング・
オブ・デ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ
　　７２゜３９６１　（１９７５）　）。この菌株が持
つプラスミドｐｔ、”ｒｌのｃＤＮＡの全塩基配列を、
Ｍ１３ファージを用いたディデオキシ・シーフェンス法
により決定した。その結果、ｐＬＴｌのＣＤＮＡはヒト
ＬＴをコードしていることが判明した。

２）組換え体プラスミドｐＬＡｌの造成：前項の方法に
よって得たｐＬＴ’ｌ（４，７ｋｂ）５■を１０ｍＭ　
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）。

７ｍＭ　　ＭｇＣＩｈ、６ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルを含む全量５０ＩｉＪＩの溶液（以下“Ｙ−〇緩衝液
”と略記する）に溶かし、制限酵素ＸｈｏＩ［（ベーリ
ンガーマンハイム社１ｌ）１０単位を加えて、３７℃で
２時間切断反応を行った。次いで、ＮａＣ１を終濃度１
５０ｍＭとなるように加え、制限酵素Ｎ５ｉＩにニーイ
ングランド・バイオラブズ社製）１０単位を加え、３７
℃でさらに３時間切断反応を行った。反応液からＬＧＴ
法によりヒトＬＴＤＮＡの大部分を含む約７５０ｂｐの
ＤＮＡ断片（ＸｈｏＩＩ−ＮｓｉＩ断片）約０，３■を
得た。

別に、ｐＬＴｌ　　２０爬を２００４のＹ−５０緩衝液
に溶かし、制限酵素ＨａｅＩＩＩ４０単位を加えて、３
７℃で２時間切断反応を行った。

次いで、ＮａＣ１を終濃度１５０ｍＭとなるように加え
、Ｎ５ｉｒ４０単位を加え、３７℃でさらに３時間切断
反応を行った。反応液からポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により、ヒ）ＬＴのＮ末端部分を含む約５０ｂｐ
のＤＮＡ断片（Ｈａ　ｅｍ−Ｎｓ　ｉ　Ｉ断片）約４０
ｎｇを得た。

一方、ｐＧＥＬｌ　　（３，４ｋｂ）３■を全量３０４
のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素５ｔｕｌと制限
酵素Ｂｇ（＃それぞれ６単位ずつを加え３７℃で３時間
切断反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法によりＡｐ’遺伝子を含む約２
．’３　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｓ　ｔ　ｕ　Ｉ−Ｂｇβ
■断片）約１．０〜を得た。

次に上記で得たｐＬＴ１由来のＸｈｏｌＩ−ＮｓｉＩ断
片（約７５０Ｍ）０．２■およびＨａｅ［１Ｉ−Ｎｓ　
ｉ　Ｉ断片（約５０ｂｐ）２０ｎｇとｐＧＥＬ１由来の
Ｓｔｕｌ−Ｂｇｊ！ＩＩ断片（約２．３ｋｂ）０．６■
を全量２０４のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、この混合
溶液にさらに２単位のＴ　４　ＤＮＡ　！Ｉガーゼ（宝
酒造社製）を加え４℃１８時間反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＭ４３０株をコ
ーエンらの方法により形質転換し、Ａｐｒのコロニーを
得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方
法に従って分離精製し、該プラスミドＤＮＡを５ｔｕＩ
等の制限酵素で切断することによりプラスミドの構造解
析を行った。その結果、目的のプラスミドが得られたこ
とを確認した。この組換え体プラスミドをｐＬＡｌと呼
ぶ。

３）ＬＴ発現プラスミドｐＬｓＡ１の造成：前項により
得られたｐＬＡｌ　　（３，１ｋｂ）をもつ大腸菌ＫＭ
４３０株を培養し、培養菌体から常法によりｐＬＡＩＤ
ＮＡを調製した。得られたｐＬＡＩＤＮＡ　　３■をＹ
−１００緩衝液３０４に溶かし、５ｔｕｌとＢｇｆｎそ
れぞれ３単位ずつを加え３７℃で３時間切断反応を行っ
た。この反応液からＬＣ，Ｔ法によりヒトＬＴ遺伝子の
大部分を含む約７９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳｔｕＩ−Ｂ
ｇｊ！ＩＩ断片）約０．５■を得た。

別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　３■をＹ−１００！１衝液３０
ｇに溶かし、制限酵素ＢａｎＩＩ［と制限酵素ＰｓｔＩ
をそれぞれ６単位ずつを加え３７℃で３時間切断反応を
行った。この反応液からＬＧＴ法によりトリプトファン
プロモーター（Ｐｔｒｐ）を含む約１．１　ｋｂのＤＮ
Ａ断片（ＢａｎＩ［［−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片）約０．６Ｊ
Ｌｇを得た。

また、ｐＧＥＬｌ　　（３，４ｋｂ）２■をＹ−１００
緩衝液２０ρに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ。

ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩそれぞれ４単位ずつを加え３
７℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ
法によりリボプロティン由来ターミネータ−を含む約Ｌ
　７　ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ
断片）約０．７眉を得た。

一方、成熟ヒ）ＬＴポリペプチドのＮ末端であるＬｅｕ
　（ＣＴＡ）から、５番目のアミノ酸であるＧｌｙ（Ｇ
ＧＣ）の２番目の塩基（ＧＧ）までと、発現に必要な開
始コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またＰ
ｔｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８
ｂｐの間の適当な長さにする必要があることなどの理由
から、下記のＤＮＡ’）ンカーを合成した。

まず、一本＃ＪＤ　Ｎ　Ａ　、　２７−ｔｎｅｒと２５
−ｔｎｅｒを通常のトリエステル法により合成した。２
７−ｍｅｒおよび２５−ｍａｒの各々２０ピコモルを全
量４０薦のＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造社製）６単位を加えて、３７
℃で６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＬＡ１由来のＳｔｕｌ−ＢｇｉＵ断片
（約７９０ｂｐ）０．３ｇと発現ベクターｐＫＹＰ　１
０のＢａｎｍ−ＰｓｔＩ断片（約１．１ｋｂ）０．４■
およびｐＧＥＬ１由来のＰ　ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断
片（約１．７ｋｂ）０．６■をＴ４’Ｊガーゼ緩衝液２
５１ｉＩｌに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡＩＪンカ
ーを約１ピコモル加えた。この混合溶液にさらにＴ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間結合反応
を行った。

組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｋ
Ｍ４３０株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収した
。得られたプ、ラスミドの構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ、
ＢａｎｎＩ。

ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂｇｊ２ＩＩで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動により確認した。このプラスミド
をｐＬｓＡｌとよぶ。ｐＬｓＡｌの１３ａｎＩ［Ｉ、Ｈ
ｉｎｄＩＩ［付近の塩基配列は下記のとおりであること
をマキサム・ギルバートの方法〔エイ・エム・マキサム
（Ａ１Ｍ９Ｍａｘａｍ）ら：プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　ＵＳＡ　　７４．５６０（
１９７７）　〕で確Ｓ忍した。

参考例４゜ ＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０の造成； 第１３図に示した手順に従い、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コ
ドンの間の距離が１４塩基で、かつＡＴＧコドンの直後
に５ａｃＩサイトを有するＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０
を造成した。

まず、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　３■をＹ−１００緩衝液３０ρ
に溶かし、制限酵素ＢａｎＩＩ［と制限酵素Ｎｒｕｌ　
　にューイングランド・バイオラブズ社製）をそれぞれ
６単位ずつ加え、３７℃で３時間切断反応を行った。こ
の反応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約３．３　
ｋ　ｂのＤＮＡ断片（ＢａｎｌｌＩ−ＮｒｕＩ断片）約
０．５■を得た。

一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コドンを付与するた
めに下記のＤＮＡリンカ−をトリエステル法により合成
した。

１９−ｍａｒと１７−ｍａｒの合成りＮＡ　（各々１０
ピコモルずつ）を５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！
　（ｐＨ７，５）。

１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ！、、５ｍＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ　　ΔＴＰを含
む全量２０ｍの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ３単位（全酒造社製）を加えて、３７℃で６０分
間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＫＹＰ　１０由来のＢａｎＩ［−Ｎｒ
ｕ　Ｉ断片（約３．８ｋｂ）０．１Ａｇと上記のＤＮＡ
リンカ−約０．５ピコモルをＴ４’Ｊガーゼ緩衝液２０
誠に溶かし、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、
４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ株〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖｅｒ）　　ら；ジー
ン（Ｇｅｎｅ）ム７５　（１９７７））を形質転換し、
Ａｐ’のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体から
プラスミドＤＮＡを回収した。得られたブ）スミドの構
造は制限酵素ＥｃｏＲＩ、　ＢａｎＩＩ［、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ。

５ａｃ１．ＮｒｕＩで切断後、アガロースゲル電気泳動
により確認した。このプラスミドをｐＴｒｓ２０と名付
けたく第１３図）ｏ　ｐＴｒｓ２０のＢａｎＩ［Ｉ。

ＨｉｎｄＩＩＩサイト付近の塩基配列は下記のとおりで
あることをＭ１３ファージを用いたディデオキシ・シー
フェンス法を用い確認した。

発明の効果 本発明によればＣＳＦ活性の高いポリペプチドを大量に
安価に供給することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｃｆＴＡ１の造成工程を示す。 第２図はプラスミドｐｃｆＴＢ２０の造成工程を示す。 第３図はプラスミドｐＣｆＴＬ２３，３８゜３５．４１
の造成工程を示す。 第４図はプラスミドｐｃｆＴＭ１４，１７゜１１３の造
成工程を示す。 第５図はプラスミドｐｃｆＷＤ１の造成工程を示す。 第６図はプラスミドｐｃｆＴ９５に１９゜ｐｃｆＡＡｌ
およびｐｃ　ｆ　ＡＢ　５の造成工程を示す。 第７図はプラスミドｐＣｆＢＡ８．ｐＣｆＢＢ１０１、
ｐＣｆＢＣ５２，５９，４２Ｂ１，４５゜７６．７７．
９３，９５．９７およびｐｃ　ｆ　ＢＤ２８．５６．８
２の造成工程を示す。 第８図はプラスミドｐｃｆｃＢ１０１．ｐＣｆＣＣ５２
，５９，ｐＣｆＣＤ２８，５６の造成工程を示す。 第９図（１）および（２）は、オカヤマ・バーブ法によ
るｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの
造成過程の概略を示す。 第１０図はプラスミドｐＬＡ１の造成工程を示す。 第１１図はプラスミドｐＬＳＡ　１の造成工程を示す。 第１２図はプラスミドｐＣｆＴＮＳ５０１の造成工程を
示す。 第１３図はプラスミドｐＴｒｓ２０の造成工程を示す。 第１４図はプラスミドｐＣｆＴＮＳ？およびｐＣｆＴＡ
Ａｒｇ４Ｓの造成工程を示す。 第１５図はプラスミドｐｃｆＴＮ２０５およびｐＣｆＴ
ＡＡｒｇ４の造成工程を示す。 第１６図はプラスミドｐＣｆＴＮＳ３０１およびｐＣｆ
ＴＮＳ４０１の造成工程を示す。 第１７図（１）および（２）はプラスミドｐｃ　ｆ　Ｂ
Ｄ２８Ａ１？、ｐｃｆＢＤ２．８Ｔ１７の造成工程を示
す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 １１ｐｐ図ｍ＋−１１ 第２図 第３図 第８図 ｓｇｔｚ 第９図（１） 第９図（２） ｃｃｃ　　　　　　　　　ＴＴＴＴ　−−−ＣＣＣＡＡ
Ａ ＤＮＡすが−ビ 第１０図 第１１図 第１３囚 ＥｃｏＲＩ 第１４図 第１５図 ｎ卯

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１表のアミノ酸配列を有するヒト顆粒球コロニ
   ー刺戟因子（以下ｈＧ−ＣＳＦと略記する）ポリペプチ
   ドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換されたアミ
   ノ酸配列を有する新規ポリペプチド。
2. （２）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側のアミノ酸
   が他種のアミノ酸で置換された特許請求の範囲第１項の
   新規ポリペプチド。
3. （３）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側第１〜１７
   番目のアミノ酸のうち少なくとも１個のアミノ酸が他種
   のアミノ酸で置換された特許請求の範囲第１項記載の新
   規ポリペプチド。
4. （４）Ｎ末端の１〜６番目のアミノ酸のうち少なくとも
   １個と１７番目のアミノ酸とがｈＧ−ＣＳＦポリペプチ
   ドの相当する位置のアミノ酸とは異なることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の新規ポリペプチド。
5. （５）第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦポリ
   ペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換され
   たアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａ。
6. （６）第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦポリ
   ペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換され
   たアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａ断片がプラスミドＤＮＡに組み込まれた組換え体プラ
   スミド。
7. （７）プラスミドＤＮＡとしてトリプトファンプロモー
   ターを有するプラスミドＤＮＡを用い、該ＤＮＡ断片が
   プラスミドＤＮＡのトリプトファンプロモーターの下流
   に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第６項
   記載の組換え体プラスミド。
8. （８）該ＤＮＡ断片が第１表の塩基配列の第１〜５１番
   目の塩基のうち少なくとも１個が他の塩基で置換された
   配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第６また
   は７項記載の組換え体プラスミド。
9. （９）ｐＣｆＴＬ３８、ｐＣｆＴＬ４１、ｐＣｆＴＬ２
   ３、ｐＣｆＴＬ３５、ｐＣｆＢＢ１０１、ｐＣｆＢＣ４
   ２Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐＣｆＢＣ５２、ｐＣｆＢＣ
   ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣｆＢＣ７７、ｐＣｆＢＣ９
   ３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆＢＣ９７、ｐＣｆＢＤ２８
   、ｐＣｆＢＤ５６、ｐＣｆＢＤ８２、ｐＣｆＴＭ１４、
   ｐＣｆＴＭ１７、ｐＣｆＴＭ１１３、ｐＣｆＴＡＡｒｇ
   ４Ｓ、ｐＣｆＴＡＡｒｇ４、ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７およ
   びｐＣｆＢＤ２８Ｔ１７から選ばれる特許請求の範囲第
   ６、７または８項記載の組換え体プラスミド。
10. （１０）第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦポ
    リペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換さ
    れたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤ
    ＮＡ断片がプラスミドＤＮＡに組み込まれた組換え体プ
    ラスミドを含む微生物。
11. （１１）該微生物が大腸菌に属する特許請求の範囲第１
    ０項の微生物。
12. （１２）該組換え体プラスミドがｐＣｆＴＬ３８、ｐＣ
    ｆＴＬ４１、ｐＣｆＴＬ２３、ｐＣｆＴＬ３５、ｐＣｆ
    ＢＢ１０１、ｐＣｆＢＣ４２Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐ
    ＣｆＢＣ５２、ｐＣｆＢＣ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣ
    ｆＢＣ７７、ｐＣｆＢＣ９３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆ
    ＢＣ９７、ｐＣｆＢＤ２８、ｐＣｆＢＤ５６、ｐＣｆＢ
    Ｄ８２、ｐＣｆＴＭ１４、ｐＣｆＴＭ１７、ｐＣｆＴＭ
    １１３、ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ、ｐＣｆＴＡＡｒｇ４、
    ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７およびｐＣｆＢＤ２８Ｔ１７から
    選ばれる特許請求の範囲第１０項の微生物。
13. （１３）第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦポ
    リペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換さ
    れたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤ
    ＮＡ断片がプラスミドＤＮＡに組み込まれた組換え体プ
    ラスミドを含む微生物を培地に培養し、培養物中に該ポ
    リペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチ
    ドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造法。
14. （１４）該微生物が大腸菌に属する特許請求の範囲第１
    ３項の方法。
15. （１５）該組換え体プラスミドがｐＣｆＴＬ３８、ｐＣ
    ｆＴＬ４１、ｐＣｆＴＬ２３、ｐＣｆＴＬ３５、ｐＣｆ
    ＢＢ１０１、ｐＣｆＢＣ４２Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐ
    ＣｆＢＣ５２、ｐＣｆＢＣ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣ
    ｆＢＣ７７、ｐＣｆＢＣ９３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆ
    ＢＣ９７、ｐＣｆＢＤ２８、ｐＣｆＢＤ５６、ｐＣｆＢ
    Ｄ８２、ｐＣｆＴＭ１４、ｐＣｆＴＭ１７、ｐＣｆＴＭ
    １１３、ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ、ｐＣｆＴＡＡｒｇ４、
    ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７およびｐＣｆＢＤ２８Ｔ１７から
    選ばれる特許請求の範囲第１３項の方法。
16. （１６）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの一部のアミノ酸が
    欠失したポリペプチド。
17. （１７）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側第〜１１
    番目のアミノ酸のうちの少なくとも１個のアミノ酸が欠
    失した特許請求の範囲第１６項のポリペプチド。
18. （１８）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側、第１−
    ４、１−５、１−６、１−７および１−１１のペプチド
    から選ばれるペプチドが欠失した特許請求の範囲第１７
    項目のポリペプチド。
19. （１９）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの一部のアミノ酸が
    欠失したポリペプチドをコードするＤＮＡ。
20. （２０）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側第１−１
    １番目のアミノ酸のうち少なくとも１個のアミノ酸が欠
    失したポリペプチドをコードするＤＮＡ。
21. （２１）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側、第１−
    ４、１−５、１−６、１−７および１−１１のペプチド
    から選ばれるペプチドが欠失したポリペプチドをコード
    するＤＮＡであることを特徴とする特許請求の範囲第２
    ０項のＤＮＡ。
22. （２２）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの一部のアミノ酸が
    欠失したポリペプチドをコードするＤＮＡ断片がプラス
    ミドＤＮＡに組み込まれた組換え体プラスミド。
23. （２３）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側第１−１
    １番目のアミノ酸のうち少なくとも１個のアミノ酸が欠
    失したポリペプチドをコードするＤＮＡ断片がプラスミ
    ドＤＮＡに組み込まれたことを特徴とする特許請求の範
    囲第２２項の組換え体プラスミド。
24. （２４）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側第１−４
    、１−５、１−６、１−７および１−１１のペプチドか
    ら選ばれるペプチドが欠失したポリペプチドをコードす
    るＤＮＡ断片がプラスミドＤＮＡに組み込まれたことを
    特徴とする特許請求の範囲第２３項の組換え体プラスミ
    ド。
25. （２５）プラスミドＤＮＡとしてトリプトファンプロモ
    ーターを有するプラスミドＤＮＡを用い、該ＤＮＡ断片
    がプラスミドＤＮＡのトリプトファンプロモーターの下
    流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第２
    ４項の組換え体プラスミド。
26. （２６）ｐＣｆＴＮＳ７、ｐＣｆＴＮＳ３０１、ｐＣｆ
    ＴＮＳ４０１およびｐＣｆＴＮＳ５０１からなる群から
    選ばれる特許請求の範囲第２５項の組換え体プラスミド
    。
27. （２７）アミノ酸の欠失に加え、ｈＧ−ＣＳＦポリペプ
    チドの第１７番目のアミノ酸システイン（Ｃｙｓ）がセ
    リン（Ｓｅｒ）に置換されたことを特徴とする特許請求
    の範囲第１６項のポリペプチド。
28. （２８）ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの一部のアミノ酸が
    欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
    るＤＮＡ断片がプラスミドＤＮＡに組み込まれた組換え
    体プラスミドを含む微生物を培地に培養し、培養物中に
    該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペ
    プチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造
    法。
29. （２９）第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦポ
    リペプチドの１７番目のアミノ酸（システイン）がセリ
    ンに置換され、かつＮ末端側１〜６番目のアミノ酸のう
    ち少なくとも１個が他種アミノ酸に置換されたポリペプ
    チドに水性媒体中プロテアーゼを作用させ、反応溶液中
    に第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦポリペプ
    チドの１７番目のアミノ酸（システイン）がセリンに置
    換され、かつＮ末端側のアミノ酸が４〜７個欠失したア
    ミノ酸配列を有する新規ポリペプチドを生成させ、該反
    応溶液から該ポリペプチドを採取することからなる新規
    ポリペプチドの製造法。