JPH04225998A - 顆粒細胞を刺激するファクター、組換えｄｎａ、組換えベクター、原核細胞、組換えｄｎａの製造法、ｇ−ｃｓｆ活性を有する蛋白質の取得法、およびｇ−ｃｓｆ突然変異蛋白質を含有する医薬製剤 - Google Patents
顆粒細胞を刺激するファクター、組換えｄｎａ、組換えベクター、原核細胞、組換えｄｎａの製造法、ｇ−ｃｓｆ活性を有する蛋白質の取得法、およびｇ−ｃｓｆ突然変異蛋白質を含有する医薬製剤Info
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B23—MACHINE TOOLS; METAL-WORKING NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- B23K—SOLDERING OR UNSOLDERING; WELDING; CLADDING OR PLATING BY SOLDERING OR WELDING; CUTTING BY APPLYING HEAT LOCALLY, e.g. FLAME CUTTING; WORKING BY LASER BEAM
- B23K26/00—Working by laser beam, e.g. welding, cutting or boring
- B23K26/351—Working by laser beam, e.g. welding, cutting or boring for trimming or tuning of electrical components
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、配列
５０ ５１ ５２ ５３ ５
４ ５５ ５６Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅの１個またはそれ以上
のアミノ酸が、１７４のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳ
Ｆの５０〜５６の位置で突然変異誘発されているかない
しは１７７のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５３〜
５９の位置で突然変異誘発されているか、または／およ
び４のＨｉｓ−基の少なくとも１個が、１７４のアミノ
酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４３、７９、１５６および
１７０の位置で突然変異誘発されているかないしは１７
７のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４６、８２、１
５９もしくは１７３の位置で突然変異誘発されているよ
うな、顆粒細胞を刺激するファクターＧ−ＣＳＦの突然
変異蛋白質に関する。
４ ５５ ５６Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅの１個またはそれ以上
のアミノ酸が、１７４のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳ
Ｆの５０〜５６の位置で突然変異誘発されているかない
しは１７７のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５３〜
５９の位置で突然変異誘発されているか、または／およ
び４のＨｉｓ−基の少なくとも１個が、１７４のアミノ
酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４３、７９、１５６および
１７０の位置で突然変異誘発されているかないしは１７
７のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４６、８２、１
５９もしくは１７３の位置で突然変異誘発されているよ
うな、顆粒細胞を刺激するファクターＧ−ＣＳＦの突然
変異蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】リンフォカインは、血液細胞が成熟した
場合に包含されている。このリンフォカインは、骨髄の
原基細胞の成熟化を刺激し、分化性分裂した細胞を生じ
る。Ｇ−ＣＳＦは、活性化された単核細胞、マクロファ
ージおよび一連の別の細胞系統によって合成される。
場合に包含されている。このリンフォカインは、骨髄の
原基細胞の成熟化を刺激し、分化性分裂した細胞を生じ
る。Ｇ−ＣＳＦは、活性化された単核細胞、マクロファ
ージおよび一連の別の細胞系統によって合成される。
【０００３】Ｇ−ＣＳＦは、ヒトの疱状癌の細胞系統５
６３７の細胞培養上澄み液から均質になるまで清浄化さ
れた（Ｗｅｌｔ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ８２（１９８５）、１５２６）。天然の
Ｇ−ＣＳＦに対してコード化するｃＤＮＡの配列は、ス
ンザ（Ｓｕｎｚａ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２（１９
８６）、６１の記載から公知である。第２の介在配列を
選択的に切り継ぎすることに応じて、２０４もしくは２
０７のアミノ酸を有するＧ−ＣＳＦの２個の天然に由来
する形が存在し、この中、最初の３０個はシグナルペプ
チドである（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ， ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．，Ｄ． ＭａｌｅおよびＣ． Ｒｉｃｋｗｏｏｄ
編）。成熟蛋白質は、約１９．６ｋＤの分子量を有し、
かつ分子間もしくは分子内のジスルフィド橋を形成する
ことができる５個のシステイン基を有する。結合に関す
る研究により、Ｇ−ＣＳＦが好中球の顆粒細胞に結合す
ることが判明した。赤芽球、リンパ球、好酸球の細胞系
統の場合ならびにマクロファージの場合には、結合は全
く観察されないかまたは僅かな結合しか観察されない。 Ｇ−ＣＳＦ受容体は、１５０ｋＤの分子量を有する唯１
つのペプチド鎖からなる（Ｎｉｃｏｌａ， Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． Ｔｏｄａｙ ８（１９８７）、１３４）。細胞
１個当たりの受容体の数は、一般に細胞が成熟するにつ
れて増大し、かつ細胞１個当たり数百個であることがで
きる。リンフォカイン受容体が、配位子を結合する細胞
外領域、疎水性トランスメンブラン領域および細胞内領
域からなることから出発する。受容体へのリンフォカイ
ンの結合は、環式ヌクレオチドの合成、ホスファティジ
ルイノシトール ４，５−ビスホスフェートの加水分
解、ならびにプロテインキナーゼＣの活性化および細胞
内カルシウム濃度の上昇を惹起させることができる。こ
の方法により細胞の物質交換が如何にして生じるのかは
極めて重要なことであるが、しかし現在のところ殆ど解
明されていない。更に、受容体への配位子の結合の結果
として、細胞内部への受容体−配位子複合物の移動は、
受容体依存性エンドサイトーシスによって可能である。 この種のインターナリゼーションは、明らかにリンフォ
カイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）の場合にも規定されてい
るが、しかし細胞の物質交換に対する結果は未だ解明さ
れていない。
６３７の細胞培養上澄み液から均質になるまで清浄化さ
れた（Ｗｅｌｔ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ８２（１９８５）、１５２６）。天然の
Ｇ−ＣＳＦに対してコード化するｃＤＮＡの配列は、ス
ンザ（Ｓｕｎｚａ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２（１９
８６）、６１の記載から公知である。第２の介在配列を
選択的に切り継ぎすることに応じて、２０４もしくは２
０７のアミノ酸を有するＧ−ＣＳＦの２個の天然に由来
する形が存在し、この中、最初の３０個はシグナルペプ
チドである（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ， ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．，Ｄ． ＭａｌｅおよびＣ． Ｒｉｃｋｗｏｏｄ
編）。成熟蛋白質は、約１９．６ｋＤの分子量を有し、
かつ分子間もしくは分子内のジスルフィド橋を形成する
ことができる５個のシステイン基を有する。結合に関す
る研究により、Ｇ−ＣＳＦが好中球の顆粒細胞に結合す
ることが判明した。赤芽球、リンパ球、好酸球の細胞系
統の場合ならびにマクロファージの場合には、結合は全
く観察されないかまたは僅かな結合しか観察されない。 Ｇ−ＣＳＦ受容体は、１５０ｋＤの分子量を有する唯１
つのペプチド鎖からなる（Ｎｉｃｏｌａ， Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． Ｔｏｄａｙ ８（１９８７）、１３４）。細胞
１個当たりの受容体の数は、一般に細胞が成熟するにつ
れて増大し、かつ細胞１個当たり数百個であることがで
きる。リンフォカイン受容体が、配位子を結合する細胞
外領域、疎水性トランスメンブラン領域および細胞内領
域からなることから出発する。受容体へのリンフォカイ
ンの結合は、環式ヌクレオチドの合成、ホスファティジ
ルイノシトール ４，５−ビスホスフェートの加水分
解、ならびにプロテインキナーゼＣの活性化および細胞
内カルシウム濃度の上昇を惹起させることができる。こ
の方法により細胞の物質交換が如何にして生じるのかは
極めて重要なことであるが、しかし現在のところ殆ど解
明されていない。更に、受容体への配位子の結合の結果
として、細胞内部への受容体−配位子複合物の移動は、
受容体依存性エンドサイトーシスによって可能である。 この種のインターナリゼーションは、明らかにリンフォ
カイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）の場合にも規定されてい
るが、しかし細胞の物質交換に対する結果は未だ解明さ
れていない。
【０００４】Ｇ−ＣＳＦは、好中球の顆粒細胞の集団が
短時間の内に著しく増大する状態にあるので、Ｇ−ＣＳ
Ｆにとって重要な治療上の使用分野が判明する。すなわ
ち、例えば免疫系の細胞を破壊するような癌の場合に化
学療法によりＧ−ＣＳＦを使用することができる。更に
、Ｇ−ＣＳＦは、骨髄移植の場合、重い壊疽創傷の場合
、免疫の弱さに応じての条件的感染の場合および白血病
の場合に使用することができた。種々の治療形のために
は、Ｇ−ＣＳＦのより活性の形を開発することが望まし
いが、しかしＧ−ＣＳＦの殆ど活性でない形を開発する
ことも望ましい。
短時間の内に著しく増大する状態にあるので、Ｇ−ＣＳ
Ｆにとって重要な治療上の使用分野が判明する。すなわ
ち、例えば免疫系の細胞を破壊するような癌の場合に化
学療法によりＧ−ＣＳＦを使用することができる。更に
、Ｇ−ＣＳＦは、骨髄移植の場合、重い壊疽創傷の場合
、免疫の弱さに応じての条件的感染の場合および白血病
の場合に使用することができた。種々の治療形のために
は、Ｇ−ＣＳＦのより活性の形を開発することが望まし
いが、しかしＧ−ＣＳＦの殆ど活性でない形を開発する
ことも望ましい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、点突然変異を意図的に導入することによって幅広の
活性スペクトルを有するＧ−ＣＳＦ分子を開発すること
であった。この場合、この活性の変化は、アミノ酸配列
のできるだけ僅かな変化によって達成されるはずである
。
は、点突然変異を意図的に導入することによって幅広の
活性スペクトルを有するＧ−ＣＳＦ分子を開発すること
であった。この場合、この活性の変化は、アミノ酸配列
のできるだけ僅かな変化によって達成されるはずである
。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明による課題は、配
列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｉｌｅの１個またはそれ以上のアミノ酸が、１７４のア
ミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５０〜５６の位置で突
然変異誘発されているかないしは１７７のアミノ酸を有
する成熟Ｇ−ＣＳＦの５３〜５９の位置で突然変異誘発
されているか、または／および４のＨｉｓ−基の少なく
とも１個が、１７４のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦ
の４３、７９、１５６もしくは１７０の位置で突然変異
誘発されているかないしは１７７のアミノ酸を有する成
熟Ｇ−ＣＳＦの４６、８２、１５９もしくは１７３の位
置で突然変異誘発されているような顆粒細胞を刺激する
ファクター（Ｇ−ＣＳＦ）またはＧ−ＣＳＦ変種によっ
て解決される。
列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｉｌｅの１個またはそれ以上のアミノ酸が、１７４のア
ミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５０〜５６の位置で突
然変異誘発されているかないしは１７７のアミノ酸を有
する成熟Ｇ−ＣＳＦの５３〜５９の位置で突然変異誘発
されているか、または／および４のＨｉｓ−基の少なく
とも１個が、１７４のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦ
の４３、７９、１５６もしくは１７０の位置で突然変異
誘発されているかないしは１７７のアミノ酸を有する成
熟Ｇ−ＣＳＦの４６、８２、１５９もしくは１７３の位
置で突然変異誘発されているような顆粒細胞を刺激する
ファクター（Ｇ−ＣＳＦ）またはＧ−ＣＳＦ変種によっ
て解決される。
【０００７】
【作用】意外なことに、新規のアミノ酸の導入により、
幅広の活性スペクトルを有するＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白
質が生じる。活性の測定は、例えばＢｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ． ２５３（１９８８）２１３〜２１８；Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ． １７（１９８９）１１６〜１１９；
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ８３（１９８６）５０１０の記載により行なうこと
ができる。
幅広の活性スペクトルを有するＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白
質が生じる。活性の測定は、例えばＢｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ． ２５３（１９８８）２１３〜２１８；Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ． １７（１９８９）１１６〜１１９；
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ８３（１９８６）５０１０の記載により行なうこと
ができる。
【０００８】本発明によるＧ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ
変種の概念は、リーダー配列を有するかまたはリーダー
配列を有しない全部の天然に由来する変種、ならびにこ
の変種から誘導された、組換えＤＮＡ技術によって修飾
されたＧ−ＣＳＦ蛋白質、殊にＧ−ＣＳＦ含量とともに
なお他のポリペプチド配列を有する融合蛋白質を包含す
る。特に好ましいのは、この意味において、原核細胞の
場合に表現するのに適当な位置−１でＮ−末端Ｍｅｔ基
を有するＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質である。同様に、好
ましいのは、組換えメチオニン不含Ｇ−ＣＳＦ変種であ
り、この変種は、ＰＣＴ／ＥＰ９１／００１９２の記載
により得ることができる。“突然変異誘発された”の概
念は、当該アミノ酸が欠失されているかまたは特に別の
アミノ酸によって置換されていることを意味する。
変種の概念は、リーダー配列を有するかまたはリーダー
配列を有しない全部の天然に由来する変種、ならびにこ
の変種から誘導された、組換えＤＮＡ技術によって修飾
されたＧ−ＣＳＦ蛋白質、殊にＧ−ＣＳＦ含量とともに
なお他のポリペプチド配列を有する融合蛋白質を包含す
る。特に好ましいのは、この意味において、原核細胞の
場合に表現するのに適当な位置−１でＮ−末端Ｍｅｔ基
を有するＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質である。同様に、好
ましいのは、組換えメチオニン不含Ｇ−ＣＳＦ変種であ
り、この変種は、ＰＣＴ／ＥＰ９１／００１９２の記載
により得ることができる。“突然変異誘発された”の概
念は、当該アミノ酸が欠失されているかまたは特に別の
アミノ酸によって置換されていることを意味する。
【０００９】この意味において、好ましいのは、配列Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌ
ｅからなる７個のアミノ酸の１個が別のアミノ酸によっ
て置換されているようなＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質であ
る。しかし、１個を上廻る、殊に２個のアミノ酸を交換
することもできる。
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌ
ｅからなる７個のアミノ酸の１個が別のアミノ酸によっ
て置換されているようなＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質であ
る。しかし、１個を上廻る、殊に２個のアミノ酸を交換
することもできる。
【００１０】特に好ましいのは、Ｓｅｒ基が１７４のア
ミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５３もしくは１７
７のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５６で１９
個の別のアミノ酸の中の１個、殊にＴｈｒによって交換
されているようなＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質である。
ミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５３もしくは１７
７のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５６で１９
個の別のアミノ酸の中の１個、殊にＴｈｒによって交換
されているようなＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質である。
【００１１】更に、Ｌｅｕ基を、１７４のアミノ基を有
する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５４でかもしくは１７７のア
ミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５７で１９個の別
のアミノ酸の中の１個、殊にＴｈｒによって置換するこ
とは、好ましい。この場合には、Ｇ−ＣＳＦ活性の幅広
の変化を有するＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質が得られる。
する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５４でかもしくは１７７のア
ミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置５７で１９個の別
のアミノ酸の中の１個、殊にＴｈｒによって置換するこ
とは、好ましい。この場合には、Ｇ−ＣＳＦ活性の幅広
の変化を有するＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質が得られる。
【００１２】更に、４個のＨｉｓ基の中の１個が１７４
のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置４３、７９、
１５６もしくは１７０でかまたは１７７のアミノ酸を有
する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置４６、８２、１５９もしくは
１７３で別のアミノ酸、殊にＧｌｎによって交換されて
いるようなＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質は、好ましい。
のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置４３、７９、
１５６もしくは１７０でかまたは１７７のアミノ酸を有
する成熟Ｇ−ＣＳＦの位置４６、８２、１５９もしくは
１７３で別のアミノ酸、殊にＧｌｎによって交換されて
いるようなＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質は、好ましい。
【００１３】更に、本発明の対象は、本発明によるＧ−
ＣＳＦ突然変異蛋白質に対してコード化する組換えＤＮ
Ａである。また、本発明の１つの対象は、本発明による
組換えＤＮＡの少なくとも１つのコピーを有する組換え
ベクターである。この場合、有利なのは、原核細胞の場
合に表現するのに適当な組換えベクターである。この種
のベクターは、当業者に知られているものである。
ＣＳＦ突然変異蛋白質に対してコード化する組換えＤＮ
Ａである。また、本発明の１つの対象は、本発明による
組換えＤＮＡの少なくとも１つのコピーを有する組換え
ベクターである。この場合、有利なのは、原核細胞の場
合に表現するのに適当な組換えベクターである。この種
のベクターは、当業者に知られているものである。
【００１４】更に、本発明の１つの対象は、本発明によ
る組換えＤＮＡまたは／および本発明による組換えベク
ターで形質転換されている１つの細胞である。有利に、
この細胞は原核細胞であり、特に有利には、大腸菌細胞
である。
る組換えＤＮＡまたは／および本発明による組換えベク
ターで形質転換されている１つの細胞である。有利に、
この細胞は原核細胞であり、特に有利には、大腸菌細胞
である。
【００１５】また、本発明の対象は、本発明による組換
えＤＮＡの製造法であり、この場合にはＧ−ＣＳＦまた
はＧ−ＣＳＦ変種に対してコード化しているＤＮＡ配列
を位置特異的に突然変異誘発する。位置特異的に突然変
異誘発する分子生物学的常法は、当業者に知られている
。特に、突然変異誘発は、突然変異誘発性プライマーと
しての合成オリゴヌクレオチドの使用下で基質としての
一本鎖ＤＮＡを用いて実施される。常法は、例えばＡｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｎｏ．１５２３“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）第１５４巻、Ｐａｒｔ Ｅ、３
６７〜３８２（１９８７）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７９（１９８９）３０９〜
３１１に記載されている。
えＤＮＡの製造法であり、この場合にはＧ−ＣＳＦまた
はＧ−ＣＳＦ変種に対してコード化しているＤＮＡ配列
を位置特異的に突然変異誘発する。位置特異的に突然変
異誘発する分子生物学的常法は、当業者に知られている
。特に、突然変異誘発は、突然変異誘発性プライマーと
しての合成オリゴヌクレオチドの使用下で基質としての
一本鎖ＤＮＡを用いて実施される。常法は、例えばＡｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｎｏ．１５２３“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）第１５４巻、Ｐａｒｔ Ｅ、３
６７〜３８２（１９８７）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７９（１９８９）３０９〜
３１１に記載されている。
【００１６】更に、本発明の対象は、本発明によるＧ−
ＣＳＦ突然変異蛋白質の取得法出あり、この場合には、
１つの細胞を本発明による組換えＤＮＡまたは／および
本発明による組換えベクターにより形質転換し、この形
質転換した細胞を適当な媒体中で培養し、かつ細胞また
は媒体からの蛋白質を取得する。真核細胞または原核細
胞からの組換え蛋白質を取得するための通常分子生物学
的に使用される方法は、公知であり、かつ詳細に説明す
ることは不必要である。
ＣＳＦ突然変異蛋白質の取得法出あり、この場合には、
１つの細胞を本発明による組換えＤＮＡまたは／および
本発明による組換えベクターにより形質転換し、この形
質転換した細胞を適当な媒体中で培養し、かつ細胞また
は媒体からの蛋白質を取得する。真核細胞または原核細
胞からの組換え蛋白質を取得するための通常分子生物学
的に使用される方法は、公知であり、かつ詳細に説明す
ることは不必要である。
【００１７】また、最後に、本発明の対象は、作用物質
としての本発明によるＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質をベー
スとし、場合によっては常用の製薬学的担持剤、充填剤
および助剤を一緒に含有する医薬製剤である。このよう
な医薬製剤は、殊に上記の治療的使用分野に適当である
が、しかし好中球の顆粒細胞の形成を励起するような他
の治療的方法にも適当である。
としての本発明によるＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質をベー
スとし、場合によっては常用の製薬学的担持剤、充填剤
および助剤を一緒に含有する医薬製剤である。このよう
な医薬製剤は、殊に上記の治療的使用分野に適当である
が、しかし好中球の顆粒細胞の形成を励起するような他
の治療的方法にも適当である。
【００１８】
【実施例】例１
ベクター ｍｇｌ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇの製造ベクター
ｐＫＫ １７７−３ Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（ＤＳＭ５
８６７）から、シャイン・ダルガルノ配列、ＡＴＧコド
ンおよびＧ−ＣＳＦ遺伝子のコード化配列を有する長さ
５５４ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを平
滑断端でのリゲイトによりベクターｐＰｚ ０７−ｍ
ｇｌ ｌａｃのＮｃｏＩ−切断個所（ＷＯ８８／０９
３７３、第１０図）にクローン化する。ＮｃｏＩの消化
後に上に懸吊されている一本鎖中に存在する前記ベクタ
ーのｌａｃ Ｚ遺伝子のＡＴＧ開始コドンは、ムング
・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ Ｎｕｋ
ｌｅａｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と一緒にインキュ
ベートすることにより、先に消化される。生じるベクタ
ーは、ｍｇｌ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇと呼ばれる。
ｐＫＫ １７７−３ Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（ＤＳＭ５
８６７）から、シャイン・ダルガルノ配列、ＡＴＧコド
ンおよびＧ−ＣＳＦ遺伝子のコード化配列を有する長さ
５５４ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを平
滑断端でのリゲイトによりベクターｐＰｚ ０７−ｍ
ｇｌ ｌａｃのＮｃｏＩ−切断個所（ＷＯ８８／０９
３７３、第１０図）にクローン化する。ＮｃｏＩの消化
後に上に懸吊されている一本鎖中に存在する前記ベクタ
ーのｌａｃ Ｚ遺伝子のＡＴＧ開始コドンは、ムング
・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ Ｎｕｋ
ｌｅａｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と一緒にインキュ
ベートすることにより、先に消化される。生じるベクタ
ーは、ｍｇｌ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇと呼ばれる。
【００１９】例２
配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
の場合のアミノ酸Ｌｅｕ（Ｘ）の突然変異誘発突然変異
誘発を公知の技術によりＭ１３鋳型を用いて実施する（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｎｏ．１５２３“Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ”）．切断部
位ＢｓｔＸＩ／ＡａｔＩＩ上で、長さ２５１ｂｐのＧ−
ＣＳＦ−ｃＤＮＡフラグメントを単離する。上に懸吊さ
れている一本鎖をムング・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕ
ｎｇ ｂｅａｎ Ｎｕｋｌｅａｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）によって分解し、このフラグメントを、ＥｃｏＲ
Ｉ／ＳｍａＩで切断したベクターＭ１３ｍｐ１９中にク
ローン化する。上に懸吊されているＥｃｏＲＩ末端を平
滑断端でのクローン化のために充填する。一本鎖ＤＮＡ
の調製後、オリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡにつきハ
イブリッド形成し、オリゴヌクレオチド上から外へ５´
→３´の方向への延長をクレノウポリメラーゼ、リガー
ゼおよび４個のヌクレオチドトリホスフェート（ＧＴＰ
、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＡＴＰ）の使用下で実施する。今や
二本鎖ＤＮＡを、Ｆ´エピソームを有する大腸菌細胞中
で形質転換し、したがって糸状Ｍ１３ファージによる感
染が可能となる（例えば、ＪＭ１０１、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニア、から入手）
。１個のプラークを突つき、このプラーク中に含有され
ている突然変異誘発されたＭ１３ファージを一本鎖ＤＮ
Ａの調製のために使用する。公知の技術（例えば、サン
ガーによるデオキシ法）により、ＤＮＡ配列化を実施し
、こうして望ましい突然変異固定のための正確な交換を
検査する。 次に、二本鎖ＤＮＡの調製後に、Ｇ−ＣＳＦの突然変異
されたＡｖａＩ−フラグメントを単離し、かつ表現ベク
ターｍｇｌ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（ＡｖａＩで切断した）
中にクローン化する。
の場合のアミノ酸Ｌｅｕ（Ｘ）の突然変異誘発突然変異
誘発を公知の技術によりＭ１３鋳型を用いて実施する（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｎｏ．１５２３“Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ”）．切断部
位ＢｓｔＸＩ／ＡａｔＩＩ上で、長さ２５１ｂｐのＧ−
ＣＳＦ−ｃＤＮＡフラグメントを単離する。上に懸吊さ
れている一本鎖をムング・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕ
ｎｇ ｂｅａｎ Ｎｕｋｌｅａｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）によって分解し、このフラグメントを、ＥｃｏＲ
Ｉ／ＳｍａＩで切断したベクターＭ１３ｍｐ１９中にク
ローン化する。上に懸吊されているＥｃｏＲＩ末端を平
滑断端でのクローン化のために充填する。一本鎖ＤＮＡ
の調製後、オリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡにつきハ
イブリッド形成し、オリゴヌクレオチド上から外へ５´
→３´の方向への延長をクレノウポリメラーゼ、リガー
ゼおよび４個のヌクレオチドトリホスフェート（ＧＴＰ
、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＡＴＰ）の使用下で実施する。今や
二本鎖ＤＮＡを、Ｆ´エピソームを有する大腸菌細胞中
で形質転換し、したがって糸状Ｍ１３ファージによる感
染が可能となる（例えば、ＪＭ１０１、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニア、から入手）
。１個のプラークを突つき、このプラーク中に含有され
ている突然変異誘発されたＭ１３ファージを一本鎖ＤＮ
Ａの調製のために使用する。公知の技術（例えば、サン
ガーによるデオキシ法）により、ＤＮＡ配列化を実施し
、こうして望ましい突然変異固定のための正確な交換を
検査する。 次に、二本鎖ＤＮＡの調製後に、Ｇ−ＣＳＦの突然変異
されたＡｖａＩ−フラグメントを単離し、かつ表現ベク
ターｍｇｌ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（ＡｖａＩで切断した）
中にクローン化する。
【００２０】完全なＧ−ＣＳＦ遺伝子を再構成するため
に、引続きＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上に懸吊
されている末端をクレノウポリメラーゼで充填し、その
後にＡｖａＩと一緒に部分的に消化し、したがってＧ−
ＣＳＦ遺伝子（約１３０ｂｐで）中の５´ＡｖａＩ部位
は分解されない。このＤＮＡを開始ベクターｍｇｌ−Ｇ
−ＣＳＦ−Ｂｇからの大きさ約２４０ｂｐのＧ−ＣＳＦ
フラグメントＡｖａＩ／ＢａｍＨＩ（充填されたクレノ
ウポリメラーゼを有するＢａｍＨＩ部位）とリガートす
る。大腸菌ＪＭ８３中での形質転換後、ＷＯ８８／０９
３７３に記載の方法でＧ−ＣＳＦを表現する。
に、引続きＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上に懸吊
されている末端をクレノウポリメラーゼで充填し、その
後にＡｖａＩと一緒に部分的に消化し、したがってＧ−
ＣＳＦ遺伝子（約１３０ｂｐで）中の５´ＡｖａＩ部位
は分解されない。このＤＮＡを開始ベクターｍｇｌ−Ｇ
−ＣＳＦ−Ｂｇからの大きさ約２４０ｂｐのＧ−ＣＳＦ
フラグメントＡｖａＩ／ＢａｍＨＩ（充填されたクレノ
ウポリメラーゼを有するＢａｍＨＩ部位）とリガートす
る。大腸菌ＪＭ８３中での形質転換後、ＷＯ８８／０９
３７３に記載の方法でＧ−ＣＳＦを表現する。
【００２１】使用したｃＤＮＡは、１７５のアミノ酸を
有するＧ−ＣＳＦに対してコード化する１つの配列を有
し（信号配列なしではあるが、位置−１でＭｅｔ基を有
する）、したがって好ましい突然変異は、Ｌｅｕの場合
にＧ−ＣＳＦアミノ酸配列の５４の位置（この場合、Ｎ
末端Ｍｅｔ基は算入されない）で開始される。
有するＧ−ＣＳＦに対してコード化する１つの配列を有
し（信号配列なしではあるが、位置−１でＭｅｔ基を有
する）、したがって好ましい突然変異は、Ｌｅｕの場合
にＧ−ＣＳＦアミノ酸配列の５４の位置（この場合、Ｎ
末端Ｍｅｔ基は算入されない）で開始される。
【００２２】アミノ酸５０〜５６（１７４のアミノ酸を
有するＧ−ＣＳＦに対して）をコード化する、Ｇ−ＣＳ
Ｆをコード化するｃＤＮＡの配列は、次の通りである：
（Ｘ）
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｉｌｅ ５´−ＣＴＣ ＧＧＡ ＣＡＣ
ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＴＣ−３´相応する
突然変異誘発すべき相補的逆鎖は、次の通りである： ５´−ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ−３´この逆鎖に相応す
る次の１９のオリゴヌクレオチドは、方向付けされる突
然変異誘発のために使用される：野生型：５´→３
ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＡＧＡ Ｇ
ＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｍｅｔ１． ５´ ＧＡＴ
ＧＣＣ ＣＡＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ
ＧＡＧ ３´
Ｐｈｅ２．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡ
Ａ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｇｌｎ３． ５
´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＴＧ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｇｌｕ４． ５´ ＧＡＴ
ＧＣＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ
ＧＡＧ ３´
Ａｓｐ５．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ Ｇ
ＴＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｃｙｓ６．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ａｌａ７． ５´ ＧＡ
Ｔ ＧＣＣ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣ
Ｃ ＧＡＧ ３´
Ｇｌｙ８．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ
ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｈｉｓ９．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＴＧ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｉｌｅ１０． ５´ ＧＡ
Ｔ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣ
Ｃ ＧＡＧ ３´
Ｌｙｓ１１．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ Ｃ
ＴＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｔｙｒ１２． ５
´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＴＡ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ａｓｎ１３． ５´ ＧＡＴ
ＧＣＣ ＧＴＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ
ＧＡＧ ３´
Ｐｒｏ１４．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＧＧ
ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３
´
Ａｒｇ１５． ５´
ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＣＧ ＡＧＡ ＧＴ
Ｇ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｓ
ｅｒ１６． ５´ ＧＡＴ Ｇ
ＣＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ Ｇ
ＡＧ ３´
Ｔｈｒ１７．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＧＴ
ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｖａｌ１８． ５´
ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＴＧ
ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｔｒｐ
１９． ５´ ＧＡＴ ＧＣＣ
ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´例３ 変化された活性を有するＧ−ＣＳＦの製造野生型と比較
して酵素的により活性のＧ−ＣＳＦは、位置５３のセリ
ンを、１７４のアミノ酸（配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ中のセリン）を有するＧ−ＣＳＦの位
置５３のトレオニン中に交換することによって得ること
ができる。突然変異誘発のために、次の二本鎖オリゴヌ
クレオチドが使用された：Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｙ Ｉｌｅ５’ ＣＣＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＧＧＡ ＣＡＣ ＡＣＣ Ｃ
ＴＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＣＴ ＣＣ
ＣＣＴＧ ＡＧＣ ３´３´ Ｃ ＣＴＣ Ｇ
ＡＣ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＴＧ ＴＧ
Ｇ ＧＡＣ ＣＣＧ ＴＡＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＣＧＡ
ＧＧＧＧＡＣ ５´クローン化のためには、ベクター
ｐＫＫ １７７−３ Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（ＤＳＭ５
８６７）からのＧ−ＣＳＦ−ｃＤＮＡフラグメント（約
３００ｂｐ、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ）をベクターｐＵ
Ｃ１９（Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他（１９８５
）、Ｇｅｎｅ３３，１０３）のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ切
断部位中にリゲイトする。
有するＧ−ＣＳＦに対して）をコード化する、Ｇ−ＣＳ
Ｆをコード化するｃＤＮＡの配列は、次の通りである：
（Ｘ）
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｉｌｅ ５´−ＣＴＣ ＧＧＡ ＣＡＣ
ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＴＣ−３´相応する
突然変異誘発すべき相補的逆鎖は、次の通りである： ５´−ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ−３´この逆鎖に相応す
る次の１９のオリゴヌクレオチドは、方向付けされる突
然変異誘発のために使用される：野生型：５´→３
ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＡＧＡ Ｇ
ＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｍｅｔ１． ５´ ＧＡＴ
ＧＣＣ ＣＡＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ
ＧＡＧ ３´
Ｐｈｅ２．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡ
Ａ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｇｌｎ３． ５
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ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｇｌｕ４． ５´ ＧＡＴ
ＧＣＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ
ＧＡＧ ３´
Ａｓｐ５．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ Ｇ
ＴＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｃｙｓ６．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ａｌａ７． ５´ ＧＡ
Ｔ ＧＣＣ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣ
Ｃ ＧＡＧ ３´
Ｇｌｙ８．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ
ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｈｉｓ９．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＴＧ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｉｌｅ１０． ５´ ＧＡ
Ｔ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣ
Ｃ ＧＡＧ ３´
Ｌｙｓ１１．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ Ｃ
ＴＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´
Ｔｙｒ１２． ５
´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＴＡ ＡＧＡ
ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ａｓｎ１３． ５´ ＧＡＴ
ＧＣＣ ＧＴＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ
ＧＡＧ ３´
Ｐｒｏ１４．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＧＧ
ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３
´
Ａｒｇ１５． ５´
ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＣＧ ＡＧＡ ＧＴ
Ｇ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｓ
ｅｒ１６． ５´ ＧＡＴ Ｇ
ＣＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ Ｇ
ＡＧ ３´
Ｔｈｒ１７．
５´ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＧＴ
ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｖａｌ１８． ５´
ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＴＧ
ＴＣＣ ＧＡＧ ３´
Ｔｒｐ
１９． ５´ ＧＡＴ ＧＣＣ
ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ
３´例３ 変化された活性を有するＧ−ＣＳＦの製造野生型と比較
して酵素的により活性のＧ−ＣＳＦは、位置５３のセリ
ンを、１７４のアミノ酸（配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ中のセリン）を有するＧ−ＣＳＦの位
置５３のトレオニン中に交換することによって得ること
ができる。突然変異誘発のために、次の二本鎖オリゴヌ
クレオチドが使用された：Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｙ Ｉｌｅ５’ ＣＣＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＧＧＡ ＣＡＣ ＡＣＣ Ｃ
ＴＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＣＴ ＣＣ
ＣＣＴＧ ＡＧＣ ３´３´ Ｃ ＣＴＣ Ｇ
ＡＣ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＴＧ ＴＧ
Ｇ ＧＡＣ ＣＣＧ ＴＡＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＣＧＡ
ＧＧＧＧＡＣ ５´クローン化のためには、ベクター
ｐＫＫ １７７−３ Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（ＤＳＭ５
８６７）からのＧ−ＣＳＦ−ｃＤＮＡフラグメント（約
３００ｂｐ、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ）をベクターｐＵ
Ｃ１９（Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他（１９８５
）、Ｇｅｎｅ３３，１０３）のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ切
断部位中にリゲイトする。
【００２３】このＤＮＡをＡｖａＩ／ＳａｃＩで分解し
、かつ直接的に上記のプライマー対と、常用の技術によ
りリゲイトする。次に、構造体から突然変異されたＢｓ
ｔＩＸ／ＳａｃＩフラグメントを単離することができ、
かつベクターｐＫＫ１７７−３ Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（
ＤＳＭ５８６７）（ＢｓｔＸＩ／ＳａｃＩ）中にクロー
ン化することができる。この表現クローンの最終的な調
製はは、例１と同様にして行なわれる。活性の測定は、
例５の記載と同様にして行なわれる。
、かつ直接的に上記のプライマー対と、常用の技術によ
りリゲイトする。次に、構造体から突然変異されたＢｓ
ｔＩＸ／ＳａｃＩフラグメントを単離することができ、
かつベクターｐＫＫ１７７−３ Ｇ−ＣＳＦ−Ｂｇ（
ＤＳＭ５８６７）（ＢｓｔＸＩ／ＳａｃＩ）中にクロー
ン化することができる。この表現クローンの最終的な調
製はは、例１と同様にして行なわれる。活性の測定は、
例５の記載と同様にして行なわれる。
【００２４】例４
活性中心に存在しないアミノ酸の突然変異によるＧ−Ｃ
ＳＦの酵素的性質の変化 公知のセリンエステラーゼと同様にして、ヒスチジンを
有する活性中心のセリンが酵素的活性を構成するための
相互活性を生じることが認められる。Ｇ−ＣＳＦの配列
の場合に、実際に４３、７９、１５６および１７０の位
置（信号ペプチドなしの１７４Ａ．Ｓ．配列から数えて
）４個のヒスチジンが存在する。位置５２（もしくは１
７７のアミノ酸の長い形の場合の位置５５）でのヒスチ
ジン基は、この突然変異誘発の場合には考慮されないま
まである。この場合、Ｈｉｓ（ＣＣＡ、ＣＴＡ）は、Ｇ
ｌｎ（ＣＡＧ）によって交換される。逆鎖上でＧｌｎに
対してコード化するコドンは、配列ＣＴＧに相当する。
ＳＦの酵素的性質の変化 公知のセリンエステラーゼと同様にして、ヒスチジンを
有する活性中心のセリンが酵素的活性を構成するための
相互活性を生じることが認められる。Ｇ−ＣＳＦの配列
の場合に、実際に４３、７９、１５６および１７０の位
置（信号ペプチドなしの１７４Ａ．Ｓ．配列から数えて
）４個のヒスチジンが存在する。位置５２（もしくは１
７７のアミノ酸の長い形の場合の位置５５）でのヒスチ
ジン基は、この突然変異誘発の場合には考慮されないま
まである。この場合、Ｈｉｓ（ＣＣＡ、ＣＴＡ）は、Ｇ
ｌｎ（ＣＡＧ）によって交換される。逆鎖上でＧｌｎに
対してコード化するコドンは、配列ＣＴＧに相当する。
【００２５】例１の記載と同様に、Ｇ−ＣＳＦフラグメ
ントは、Ｍ１３ｍｐ１９中でサブクローン化される。
ントは、Ｍ１３ｍｐ１９中でサブクローン化される。
【００２６】逆鎖に相応する次のオリゴヌクレオチドは
、突然変異誘発のために使用される：１．５´ＧＣＴ
ＣＣＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＡＧ Ｃ ３´
グルタミン４３に対してヒスチジン４３２．５´ＧＡＡ
ＡＡＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＴＧ
ＧＣＴ Ｃ ３´グルタミン７９に対してヒスチジン
７９３．５´ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＣＣ
ＴＡＧ ＣＡＡ ＣＣ ３´グルタミン１５６に対
してヒスチジン１５６４．５´ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＧＣ
ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＣＧ ＴＡＧ ＡＡＣ Ｇ ３
´グルタミン７９に対してヒスチジン７９表現ベクター
の場合の分析および再クローン化は、例１と同様にして
行なわれる。
、突然変異誘発のために使用される：１．５´ＧＣＴ
ＣＣＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＡＧ Ｃ ３´
グルタミン４３に対してヒスチジン４３２．５´ＧＡＡ
ＡＡＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＴＧ
ＧＣＴ Ｃ ３´グルタミン７９に対してヒスチジン
７９３．５´ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＣＣ
ＴＡＧ ＣＡＡ ＣＣ ３´グルタミン１５６に対
してヒスチジン１５６４．５´ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＧＣ
ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＣＧ ＴＡＧ ＡＡＣ Ｇ ３
´グルタミン７９に対してヒスチジン７９表現ベクター
の場合の分析および再クローン化は、例１と同様にして
行なわれる。
【００２７】例５
Ｇ−ＣＳＦの活性の測定
Ｇ−ＣＳＦの活性を、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５３
（１９８８）２１３〜２１８、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ
． １７（１９８９）１１６〜１１９、Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３（１９
８６）５０１０に記載されているように完全にＧ−ＣＳ
Ｆに依存するマウスの白血病系統を用いて試験する。細
胞のファクター依存性をそのまま保持するようにするた
めに、維持される培養の培地（ＲＰＭＩ培地、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、商品番号
Ｎｏ．２０９９４４５，胎児の牛血清１０％を用いて）
は、不変にＧ−ＣＳＦ １０００Ｕ／ｍｌを含有する
。
（１９８８）２１３〜２１８、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ
． １７（１９８９）１１６〜１１９、Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３（１９
８６）５０１０に記載されているように完全にＧ−ＣＳ
Ｆに依存するマウスの白血病系統を用いて試験する。細
胞のファクター依存性をそのまま保持するようにするた
めに、維持される培養の培地（ＲＰＭＩ培地、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、商品番号
Ｎｏ．２０９９４４５，胎児の牛血清１０％を用いて）
は、不変にＧ−ＣＳＦ １０００Ｕ／ｍｌを含有する
。
【００２８】この試験の場合には、直接にＮＳＦ６０細
胞のＧ−ＣＳＦ刺激増殖が ３Ｈ−チミジンの導入によ
って測定される。この試験の実施は、次のようにして行
なわれる：指数増殖期にある（細胞密度 細胞最大１
×１０５／ｍｌ）ＮＳＦ６０細胞を微量適定板中に入れ
（細胞１×１０４／孔）、かつＧ−ＣＳＦ濃度を減少さ
せながら培養する。孔１中の最大用量のＧ−ＣＳＦは、
維持される培養の場合の濃度に相応する（１０００Ｕ／
ｍｌ、特異的活性蛋白質１×１０８Ｕ／ｍｇ）。希釈は
、１０の数の工程で行なわれる。
胞のＧ−ＣＳＦ刺激増殖が ３Ｈ−チミジンの導入によ
って測定される。この試験の実施は、次のようにして行
なわれる：指数増殖期にある（細胞密度 細胞最大１
×１０５／ｍｌ）ＮＳＦ６０細胞を微量適定板中に入れ
（細胞１×１０４／孔）、かつＧ−ＣＳＦ濃度を減少さ
せながら培養する。孔１中の最大用量のＧ−ＣＳＦは、
維持される培養の場合の濃度に相応する（１０００Ｕ／
ｍｌ、特異的活性蛋白質１×１０８Ｕ／ｍｇ）。希釈は
、１０の数の工程で行なわれる。
【００２９】約２４時間のインキュベートの後、３Ｈ−
チミジン（０．１μＣｉ／孔）を添加する。その上、細
胞をなおさらに１６時間インキュベートする。
チミジン（０．１μＣｉ／孔）を添加する。その上、細
胞をなおさらに１６時間インキュベートする。
【００３０】試験を評価するためには、細胞を微量適定
板中に入れて凍結させ、したがってこの細胞は溶解する
。この細胞溶菌液をガラス繊維フィルター上に吸引し、
洗浄し、乾燥し、かつシンチレーションカウンター中で
測定する。３Ｈ−チミジンの導入は、ＮＳＦ６０細胞の
Ｇ−ＣＳＦ誘発増殖に対して比例関係にある。
板中に入れて凍結させ、したがってこの細胞は溶解する
。この細胞溶菌液をガラス繊維フィルター上に吸引し、
洗浄し、乾燥し、かつシンチレーションカウンター中で
測定する。３Ｈ−チミジンの導入は、ＮＳＦ６０細胞の
Ｇ−ＣＳＦ誘発増殖に対して比例関係にある。
【００３１】例６
活性中心でのアミノ酸交換によるＧ−ＣＳＦの活性の変
化 アミノ酸位置５４で修飾されたＧ−ＣＳＦは、特に位置
５４のロイシンを位置５４のトレオニン中に交換する（
配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ中のＬｅ
ｕ）ことによって例３に記載の方法に相応して適当な二
本鎖オリゴヌクレオチドの使用下で得ることができ、こ
れは、相応する位置でアミノ酸に対してＴｈｒをコード
化する核酸トリプレット（例えば、ＡＣＣ）を含有する
。この場合、Ｇ−ＣＳＦの長い形の１７４のアミノ酸の
場合の位置５４は、長い形の１７７のアミノ酸の場合の
位置５７に相当する。
化 アミノ酸位置５４で修飾されたＧ−ＣＳＦは、特に位置
５４のロイシンを位置５４のトレオニン中に交換する（
配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ中のＬｅ
ｕ）ことによって例３に記載の方法に相応して適当な二
本鎖オリゴヌクレオチドの使用下で得ることができ、こ
れは、相応する位置でアミノ酸に対してＴｈｒをコード
化する核酸トリプレット（例えば、ＡＣＣ）を含有する
。この場合、Ｇ−ＣＳＦの長い形の１７４のアミノ酸の
場合の位置５４は、長い形の１７７のアミノ酸の場合の
位置５７に相当する。
【００３２】位置５４にＴｈｒを有する１７４のアミノ
酸を有する突然変異体の活性は、ＮＳＦ６０の細胞試験
（例５参照）の場合に１７４のアミノ酸を有する野生型
Ｇ−ＣＳＦと比較して減少されている。更に、このＧ−
ＣＳＦ突然変異体の活性は、トレオニンへのセリンの位
置５３でのアミノ酸交換（例３の記載）によりＧ−ＣＳ
Ｆ突然変異体と比較して減少されている。
酸を有する突然変異体の活性は、ＮＳＦ６０の細胞試験
（例５参照）の場合に１７４のアミノ酸を有する野生型
Ｇ−ＣＳＦと比較して減少されている。更に、このＧ−
ＣＳＦ突然変異体の活性は、トレオニンへのセリンの位
置５３でのアミノ酸交換（例３の記載）によりＧ−ＣＳ
Ｆ突然変異体と比較して減少されている。
Claims (16)
- 【請求項１】 顆粒細胞を刺激するファクター（Ｇ−
ＣＳＦ）またはＧ−ＣＳＦ変種において、配列５０
５１ ５２ ５３ ５４
５５ ５６Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅの１個またはそれ以上のアミノ
酸は、１７４のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５０
〜５６の位置で突然変異誘発されているかないしは１７
７のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５３〜５９の位
置で突然変異誘発されているか、または／および４のＨ
ｉｓ−基の少なくとも１個は１７４のアミノ酸を有する
成熟Ｇ−ＣＳＦの４３、７９、１５６もしくは１７０の
位置で突然変異誘発されているかないしは１７７のアミ
ノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４６、８２、１５９もし
くは１７３の位置で突然変異誘発されていることを特徴
とする、顆粒細胞を刺激するファクター（Ｇ−ＣＳＦ）
またはＧ−ＣＳＦ変種。 - 【請求項２】 −１の位置でＮ−末端Ｍｅｔ基を有す
る、請求項１記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項３】 配列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅのアミノ酸が別のアミノ酸に
よって置換されている、請求項１または２に記載のＧ−
ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項４】 Ｓｅｒ基が１７４のアミノ酸を有する
成熟Ｇ−ＣＳＦの５３の位置でかないしは１７７のアミ
ノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５６の位置で別のアミノ
酸によって置換されている、請求項１から３までのいず
れか１項に記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項５】 別のアミノ酸がＴｈｒである、請求項
４記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項６】 Ｌｅｕ基が１７４のアミノ酸を有する
成熟Ｇ−ＣＳＦの５４の位置でかないしは１７７のアミ
ノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの５７の位置で別のアミノ
酸によって置換されている、請求項１から３までのいず
れか１項に記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項７】 別のアミノ酸がＴｈｒである、請求項
６記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項８】 ４のＨｉｓ基の１個が１７４のアミノ
酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４３、７９、１５６もしく
は１７０の位置でかないしは１７７のアミノ酸を有する
成熟Ｇ−ＣＳＦの４６、８２、１５９もしくは１７３の
位置で別のアミノ酸によって置換されている、請求項１
または２に記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項９】 別のアミノ酸がＧｌｎである、請求項
８記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋白質。 - 【請求項１０】 組換えＤＮＡにおいて、請求項１か
ら９までのいずれか１項に記載のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋
白質に対してコード化していることを特徴とする、組換
えＤＮＡ。 - 【請求項１１】 組換えベクターにおいて、請求項１
０記載の組換えＤＮＡの少なくとも１つのコピーを有し
、かつ原核細胞の遺伝子表現に適当であることを特徴と
する、組換えベクター。 - 【請求項１２】 原核細胞において、請求項１０記載
の組換えＤＮＡまたは／および請求項１１記載の組換え
ベクターにより形質転換されていることを特徴とする、
原核細胞。 - 【請求項１３】 請求項１０記載の組換えＤＮＡを製
造する方法において、Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ変種
に対してコード化しているＤＮＡ配列を位置特異的に突
然変異誘発することを特徴とする、組換えＤＮＡの製造
法。 - 【請求項１４】 合成オリゴヌクレオチドを突然変異
誘発性プライマーとして使用する、請求項１３記載の方
法。 - 【請求項１５】 請求項１から９までのいずれか１項
に記載のＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質を取得する方法
において、１つの細胞を請求項１０記載の組換えＤＮＡ
または／および請求項１１記載の組換えベクターにより
形質転換し、この形質転換した細胞を適当な媒体中で培
養し、細胞または媒体からの蛋白質を取得することを特
徴とする、Ｇ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質を取得する方
法。 - 【請求項１６】 Ｇ−ＣＳＦ突然変異蛋白質を含有す
る医薬製剤において、請求項１から９までのいずれか１
項に記載の１種またはそれ以上のＧ−ＣＳＦ突然変異蛋
白質を、場合によっては常用の担持剤、充填剤および助
剤と一緒に含有することを特徴とする、Ｇ−ＣＳＦ突然
変異蛋白質を含有する医薬製剤。
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