CZ283149B6

CZ283149B6 - Lidský nádorový nekrotický faktor, způsob jeho výroby, DNA kódující lidský nádorový nekrotický faktor, buňka transformovaná touto DNA, prostředek, který obsahuje lidský nádorový nekrotický faktor a prostředek vhodný pro léčení nádorů

Info

Publication number: CZ283149B6
Application number: CS855067A
Authority: CZ
Inventors: Bharat Bhushan Aggarwal; David Vannorman Goeddel; Sang He Lee; Glenn Evan Nedwin
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 1984-07-05
Filing date: 1985-07-05
Publication date: 1998-01-14
Also published as: EP0168214A2; IE65426B1; NO852673L; IL105271A; FI95472C; NZ212632A; YU113285A; JPH07291997A; JPS6140221A; JPH083061A; AU599571B2; EP0168214A3; YU47968B; DE3587939T2; JPH0928387A; FI95472B; BG60250B2; FI943750L; NL990033I1; JP2557341B2

Abstract

Lidský nádorový nekrotický faktor, který a) není glykosylován, b) podle SDS-PAGE má molekulovou hmotnost 17 000, c) je schopen přednostně destruovat nebo inhibovat růst nádorových buněk při srovnání s normálními buňkami za stejných podmínek, d) podle SDS-PAGE je v podstatě homologní a e) obsahuje: i) aminokyselinovou sekvenci zbytků 35 až 66 vzorce I, iii) aminokyselinovou sekvenci zbytků 110 až 133 vzorce I nebo iv) aminokyselinovou sekvenci Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro. Způsob výroby lidského nádorového nekrotického faktoru isolací z prostředku, který obsahuje lidský nádorový nekrotický faktor a heterogenní směs znečišťujících proteinů. DNA kodující lidský nádorový nekrotický faktor, buňka transformovaná touto DNA, prostředek, který obsahuje lidský nádorový faktor a prostředek vhodný pro léčení nádorů. ŕ

Description

Lidský nádorový nekrotický faktor, způsob jeho výroby, DNA kódující lidský nádorový nekrotický faktor, buňka transformovaná touto DNA, prostředek, který obsahuje lidský nádorový nekrotický faktor a prostředek vhodný pro léčení nádorů

Oblast techniky

Tento vynález se týká lidského nádorového nekrotického faktoru, způsobu jeho výroby, DNA kódující lidský nádorový nekrotický faktor, buňky transformované touto DNA, prostředku, který obsahuje lidský nádorový nekrotický faktor a prostředku vhodného pro léčení nádorů.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že imunní buňky, jako jsou například buňky B, buňky T, zabíječi a makrofágy, vyrábějí látky, které vykazují cytotoxickou účinnost na nádorové buňky, ale které jsou neškodné pro normální buňky. Tyto látky jsou nazývány různými jmény, například lymfotoxin, nádorový nekrotický faktor. NK buněčný cytotoxický faktor, hemorhagický nekrotický faktor, makrofágový cytotoxin nebo makrofágový cytotoxický faktor. V dnešní době není jasná identita proteinů, spojených s těmito názvy. Základní problémy jsou v tom, že biologické testy, které se používají k detekci proteinů, mezi nimi nerozlišují, že se zdá, že proteiny se vyskytují v přírodě jako agregáty nebo hydrolytické produkty a že až dosud se podařilo získat jenom tak malá množství, že je nebylo možné vyčistit do vyššího stupně čistoty, který je potřebný pro plné charakterizování těchto proteinů.

Takovéto cytotoxické látky se nacházejí v séru intaktovaných zvířat nebo v supematantu kultury lymfatických buněk nebo buněčných linií poté, co na zvířata nebo na buňky působila látka, o které je známo, že stimuluje proliferaci imunních buněk /induktor/. Sérum supematantu se izoluje a testuje na cílových nádorových buněčných liniích na cytotoxickou účinnost. Standardní buněčnou linií je L-929, linie myších nádorových buněk. Tato a jiné buněčné linie, které se používají v biotestech tohoto typu, nejsou ve své lytické odpovědi specifické, protože schopnost lyže má zřejmě mnoho produktů lymfatických buněk. Podobné nespecifické odpovědi byly pozorovány v testech nekrózy nádorů in vitro. Pro rozlišení různých cytotoxických lymfatických produktů nejsou tedy postačující cytolytické testy, které jsou založeny na lyži buněčných linií in vitro, nebo na nekróze nádoru in vivo.

Cytotoxické faktory se předběžně klasifikují podle lymfatických buněk, v nichž se indukují. Například lymfotoxin je název, který se obvykle používá pro cytotoxické sekreční produkty lymfocytů B nebo T nebo buněčných linií od nich odvozených, zatímco nádorový nekrotický faktor se často používá k popisu cytotoxických produktů makrofágů nebo od nich odvozených buněčných linií. Tento klasifikační systém však nebyl vyvinut do takového stupně, v němž by neexistovala jakákoliv nejistota, že se mluví o jediném proteinu, nebo že proteiny, které mají různé názvy, jsou ve skutečnosti různé.

Byly konány pokusy vyčistit a charakterizovat cytotoxické faktory, sekretované každým typem buněk. Citace se však liší, pokud jde o vlastnosti cytotoxického faktoru, nebo se ne zcela shodují v uváděných vlastnostech, z toho plyne, že buď byla chybná charakterizace, nebo že každý typ buněk sekretuje různé cytotoxické faktory. Například, cytotoxickým produktům, které jsou odvozené od makrofágů, monocytů nebo monocytických buněčných linií a kterým se někdy říká nádorový nekrotický faktor, se připisují vlastnosti, které neodpovídají teorii jediného cytotoxického produktu. Viz například následující literátům. R. MacFarlan a spol.: AJEBAK. 58/pt5/. 489 až 500 /1980/, D. Mannela spol.: Infection and Immunology 30/2, 523 až 530

- 1 CZ 283149 B6 /1980/, H. Ohnishi a spol.: Britský patent /přihláška/ č. 2 106 117A a J. Hammerstrom: Scand. J. Immunol. 15. 311 až 318 /1982/.

Na druhé straně C. Zacharchuk a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. /USA/ 80, 6341 až 6345 /1983/ navrhují, že lymfotoxin z morčat acytotoxický faktor zmakrofágú morčat jsou imunochemicky 5 podobné, jestliže vůbec nejsou totožné. Podobné závěry jsou uváděny i Ruffem a spol.: Lymphokines 2, 235 až 272 na str. 241 až 242 /1981/.

Pokusy charakterizovat imunní cytotoxické faktory byly zaměřeny také na použití séra nebo peritoneální kapaliny zvířat, které byly vystaveny imunogenním antigenům, jako výchozího materiálu. Tyto zdroje obsahují celou hojnost stresového imunního systému, na rozdíl od ío produktu z produktů jednoho buněčného typu nebo linie. Jako příklady předcházejícího jsou zde uvedeny následující příklady: S. Green a spol.: J. Nat. Cancer Inst. 68/6, 997 až 1003 /1982/ /indukční faktor nekrózy nádoru/, M. Ruff a spol.: J. Immunology 125/4/.1671 až 1677 /1980/ /nádorový nekrotický faktor/, H. Enemoto a spol.: Evropská patentová přihláška 86 475 /protinádorová látka/, H. Oettgen a spol.: Recent Results Cancer Res. 75, 207 až 212 /1980/ 15 /nádorový nekrotický faktor/, F. Kuli a spol.: J. Immunol. 126/4/, 1279 až 1283 /1981/ /cytotoxin nádorových buněk/, D. Mannel a spol.: Infection and Immunity 28/1, 204 až 211 /1980/ /cytotoxický faktor/, N. Matthews a spol.: Br. J. Cancer 42, 416 až 422 /1980/ /nádorový nekrotický faktor/, S. Green a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. /USA/ 73/2, 381 až 385 /1976/ /sérový faktor/, N. Satomi a spol.: Jpn. J. Exp. Med. 51/6, 317 až 322 /1981/, N. Matthews: Br. J. 20 Cancer 40, 534 až 539 /1979/ /Nádorový nekrotický faktor/, K. Haranaka a spol.: Jpn. J. Exp.

Med. 51/3, 191 až 194 /1981/ /nádorový nekrotický faktor/, L. Old a spol.: Evropská petantová přihláška 90 892, T. Umeda a spol.: Cellular and Molecular Biology 29/5, 349 až 352 /1983/ a H. Enomoto a spol.: Evropská patentová přihláška č. 86 475.

Lze konzultovat i další literaturu: J. Nissen-Meyer a a spol.: Infection and Immunity 38/1/, 67 až 25 73 /1982/, J. Klostergaard a spol.: Mol. Immunol. 18/12/, 1049 až 1054 /1981/,

N. Sloane; USA patent 4 359 415, H. Hayashi a spol.: USA patent 4 447 355, K. Hanamaka a spol.: Evropská patentová přihláška 90 892 /1983/ a G. Granger a spol.: Cellular Immunology 38, 388 až 402/1978/.

Evropská patentová přihláška č. 100 641 popisuje cytotoxický polypeptid, který byl vyčištěn tak, 30 že v podstatě neobsahuje nečistoty z lidské lymfoblastoidní buněčné kultury. Tento polypeptid byl nazván lymfotoxin, ačkoliv jeho vztah k jiným v literatuře popisovaným cytotoxickým polypeptidům pod názvem lymfotoxin je jen domnělý. Není známo, zda tento polypeptid je jediným cytotoxickým polypeptidem, který produkují imunní buňky, jak navrhoval Zacharchuk a spol. /viz tamtéž/, nebo jestli je jen jedním z velké rodiny cytotoxických faktorů.

Polypeptid z evropské patentové přihlášky č. 100 641 má dva aminové konce, větší varianta končí na Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gin Thr Ala Arg Gin His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr . . . . , menší varianta zkráceným aminovým koncem His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala ....

Podle přecházející literatury byly interferony, které vykazují inhibiční účinnost na některé nádory a které jsou chabě charakterizovaným proteinem s aminovým koncem Ala-Ala /Britská patentová přihláška č. 2 117 385A/, kandidáty nelymfotoxinových cytotoxických faktorů. Jak bude vidět, nádorový nekrotický faktor podle tohoto vynálezu není interferon, není lymfotoxin a nemá aminový končen Ala-Ala.

Předmětem tohoto vynálezu je: a/ nezvratně prokázat, zda existuje nebo neexistuje jiný nádorový nekrotický faktor než lymfotoxin a jestliže tomu tak je, identifikovat ho takovým způsobem, aby se dal jasně odlišit od jiných takových faktorů, b/ vyrábět takový faktor jinými způsoby než indukovanou buněčnou kulturou, což je drahé a získaný produkt je znečištěn indukčním činidlem, nebo indukcí periferních krevních lymfocytů, což je z ekonomického hlediska 50 nepraktické, špatně reprodukovatelné a získává se produkt, znečištěný homologními buněčnými

- 2 CZ 283149 B6 nebo plazmovými proteiny, c/ získat DNA kódující takový nekrotický nádorový faktor a expresovat DNA v rekombinantní kultuře, d/ syntetizovat takový faktor v rekombinantní kultuře v maturované formě, e/ modifikovat kódující sekvenci nebo strukturu takového faktoru, fí formulovat takový faktor do terapeutických dávkových forem a podávat ho zvířatům při léčení 5 nádorů, a g/ vyrábět diagnostická činidla, která se týkají takového faktoru.

Cytotoxický faktor se vyčistí do homogenity, charakterizuje se a exprimuje se v rekombinantní kultuře. Tento faktor se kvůli výhodnosti označuje nádorový nekrotický faktor (někdy se používá zkratka TMF od tumor necrosing factor). Jeho definice je uvedena níže. Z buněčné kultury se získává v podstatě v homogenní formě o specifické účinnosti vyšší než asi 10 milionů jednotek ío na mg proteinu, obvykle asi 100 milionů jednotek na 1 mg proteinu.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká lidského nádorového nekrotického faktoru, který

a) není glykosylován,

b) podle SDS-PAGE má molekulovou hmotnost 17 000,

c) je schopen přednostně destruovat nebo inhibovat růst nádorových buněk při srovnání s normálními buňkami za stejných podmínek,

d) podle SDS-PAGE je homologní, a

e) obsahuje:

i) aminokyselinovou sekvenci

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu

40

Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro

60 70

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

120

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

1 30 1 40

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile

150

Ala Leu,

157 ii) aminokyselinovou sekvenci zbytků 35 až 66, uvedených pod i),

-3 CZ 283149 B6 iii) aminokyselinovou sekvenci zbytků 110 až 133, uvedených pod i), nebo iv) aminokyselinovou sekvenci Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro.

Lidský nádorový nekrotický faktor je charakterizován (pokud je syntetizován v rekombinantní kultuře) přítomností nelidských buněčných složek, včetně proteinů, v takovém množství a s takovými vlastnostmi, které jsou fyziologicky přijatelné pro podávání pacientům. Tyto složky jsou obvykle kvasinkového, prokaryotického nebo nelidského vyššího eukaryotického původu a jsou přítomny v neškodných množstvích řádově menších než asi 1 hmotnostní procento. Rekombinantní buněčná kultura umožňuje dále výrobu nádorového nekrotického faktoru 10 absolutně bez homologních proteinů. Homologní proteiny jsou takové proteiny, které jsou normálně spojeny s nádorovým nekrotickým faktorem, jak se obvykle vyskytuje v přírodě, tj. v buňkách, v buněčných exudátech nebo v tělových kapalinách. Homologním proteinem lidského nádorového nekrotického faktoru je například lidský sérový albumin. Heterologní proteiny jsou opačné proteiny, tj. přirozeně nedoprovázejí, ani se nevyskytují v kombinaci s příslušným 15 nádorovým nekrotickým faktorem.

Podle tohoto vynálezu se získává DNA, která kóduje nádorový nekrotický faktor a která, jestliže v rekombinantní nebo v transformované kultuře dochází k její expresi, poskytuje nádorový nekrotický faktor v mnoha kopiích. Tato DNA je nová, protože cDNA, získaná reverzní transkripcí mRNA z indukovaných monocytických buněčných linií, neobsahuje žádný intron 20 a neobsahuje ani žádné sousedící oblasti, kódující jiné proteiny organismu, z něhož mRNA pochází.

Chromozomální DNA, kódující nádorový nekrotický faktor, se získává sondováním bank genomových DNA cDNA. Chromozomální DNA neobsahuje sousedící oblasti, kódující jiné proteiny, ale může obsahovat introny.

Izolovaná DNA nádorového nekrotického faktoru se snadno modifikuje substitucí /nahražením/, delecí /vynecháním/ nebo inzercí /přidáním/ nukleotidů. Získají se tak nové sekvence DNA, které kódují nádorový nekrotický faktor nebo jeho deriváty. Tyto modifikované sekvence se používají pro přípravu mutantního nádorového nekrotického faktoru k přímé expresi maturovaného nádorového nekrotického faktoru. Modifikované sekvence jsou užitečné také pro zvýšení exprese nádorového nekrotického faktoru ve vybraných systémech hostitel-vektor, příkladem může být modifikace přizpůsobením se výhodnému kodónu hostitelské buňky. Tyto nové sekvence DNA nebo jejich fragmenty se označí a použijí v hybridizačních testech genetického materiálu, kódujícího nádorový nekrotický faktor.

V procesu syntézy nádorového nekrotického faktoru se DNA, která kóduje nádorový nekrotický faktor, liguje s replikovatelným /reprodukovatelným/ vektorem. Vektorem se transformují hostitelské buňky, hostitelské buňky se kultivují a nádorový nekrotický faktor se izoluje z kultury. Tento obecný postup se používá pro konstrukci nádorového nekrotického faktoru, který má vlastnosti monocytového nádorového nekrotického faktoru, nebo pro konstrukci nových derivátů nádorového nekrotického faktoru, podle konstrukce vektoru a podle hostitelské buňky, 40 která byla vybrána pro transformaci. Mezi typy nádorového nekrotického faktoru, které zde mohou být syntetizovány, patří maturovaný nádorový nekrotický faktor /s valylovou skupinou na aminovém konci/, prenádorový nekrotický faktor /někdy je označován také pre-TNF/ a deriváty nádorového nekrotického faktoru, zahrnující, a/ napojené proteiny, v nichž nádorový nekrotický faktor nebo jakýkoliv jeho fragment /včetně maturovaného nádorového nekrotického faktoru/ je navázán na jiné proteiny nebo polypeptidy peptidovou vazbou na aminovém a/nebo karboxylovém konci aminokyselin nádorového nekrotického faktoru nebo jeho fragmentu, b/ fragmenty nádorového nekrotického faktoru včetně maturovaného nádorového nekrotického faktoru nebo fragmentů prenádorového nekrotického faktoru, v němž jakákoliv preproteinová aminokyselina znamená aminokyselinu na aminovém konci fragmentu, c/ mutanty nádorového 50 nekrotického faktoru nebo jeho fragmentů včetně maturovaného nádorového nekrotického

-4CZ 283149 B6 faktoru, v nichž jedna nebo více aminokyselinových skupin je substituována, inzerována nebo deletována a/nebo d/ adiční deriváty předcházejících proteinů, fragmentů nebo mutantů s methionylovou nebo modifikovanou methionylovou skupinou /jako je například formylmethionylový nebo jiný blokovaný methionylový typ/.

Jestliže je savčí buňka transformována a/ vektorem, obsahujícím úplný strukturní gen nádorového nekrotického faktoru /včetně 5' iniciačního kodonu/, nebo b/ genem maturovaného nádorového nekrotického faktoru nebo derivátu nádorového nekrotického faktoru, odštěpitelně ligovaného s eukaryotickým sekrečním signálem /který může také zahrnovat sekreční leader presekvenci nádorového nekrotického faktoru/, pak se obvykle buňka kultivuje a maturovaný ío nádorový nekrotický faktor se izoluje z kultury.

Jestliže DNA, která kóduje nádorový nekrotický faktor, je odštěpitelně napojena ve vektoru k sekrečnímu leaderu, který je patřičně procesován hostitelskou buňkou, jež má být transformována /obvykle organismus, z něhož se leader sekvence získala/, hostitel se transformuje vektorem, kultivuje a nádorový nekrotický faktor se pak syntetizuje bez 15 methionylové skupiny nebo blokované methionylové skupiny na aminovém konci. Detailněji uvedeno - E.coli, transformovaná vektory, v nichž DNA, kódující maturovaný nádorový nekrotický faktor, je ligována 5' kDNA, kódující signální polypeptid STU enterotoxinu, bude příslušným způsobem procesovat vysoké procento hybridního preproteinu pro maturovaný nádorový nekrotický faktor. Sekreční leadery a hostitelské buňky mohou být vybrány tak, že 20 výsledkem je příslušný transport maturovaného proteinu do buněčné periplazmy.

Do rozsahu tohoto vynálezu patří také deriváty nádorového nekrotického faktoru jiné než variace v aminokyselinové sekvenci, nebo glykosylace. Takové deriváty jsou charakterizovány kovalentní nebo agregační asociací s chemickými částicemi. Jde obvykle o deriváty tří tříd: soli, kovalentní modifikace vedlejšího řetězce a koncové skupiny a adsorbční komplexy.

Jestliže DNA, kódující maturovaný nádorový nekrotický faktor, je odštěpitelně ligována na vektor, vektor se použije k transformaci hostitelské buňky, buňky se kultivují a maturovaný nádorový nekrotický faktor se nalézá v buněčné cytoplazmě. Není tedy nutné navrhovat sekreční systém, který by poskytl maturovaný nádorový nekrotický faktor. To bylo překvapující, protože přímá exprese obvykle poskytuje methionylovaný protein. Protein je stabilní a rozpustný 30 v rekombinantní buněčné kultuře, tj. ani není proteolyticky štěpen intracelulámími proteázami, ani se neukládá jako refraktilní tělesa. Jsou tak tedy získány nové fermentace, vyznačující se tím, že nižší eukaryotické nebo prokaryotické buňky mají nemethionylovaný maturovaný nádorový nekrotický faktor umístěný v cytoplazmě.

I když se nádorový nekrotický faktor může připravovat kultivací zvířecích buněčných linií, např.

monocytických buněčných linií, indukovaných růstem za přítomnosti 12-myristát-13-acetátu 4beta-forbolu /PMA/, nebo nesmrtelných buněčných linií, jako jsou například hybridomy nebo transformované buňky EBV /USA patent 4 464 465/, je výhodné, jestliže se nádorový nekrotický faktor syntetizuje v rekombinantní buněčné kultuře, jak je níže popsáno.

Po přípravě nádorového nekrotického faktoru fermentací se nádorový nekrotický faktor vyčistí.

Izoluje se supematant kultivační kapaliny nebo lyžované buněčné kultury, pevné částice se odstraní, nádorový nekrozový faktor se ze supematantové směsi /která obsahuje nádorový nekrotický faktor a další proteiny/ adsorbuje na hydrofobní látce, nádorový nekrotický faktor se z této látky eluuje, pak se nádorový nekrotický faktor adsorbuje na anexu terciárního aminu, opět se z tohoto anexu eluuje, adsorbuje se na jiném anexu /s výhodou na kvarterním aminovém anexu/ o prakticky jednotné velikosti částic, a konečně se nádorový nekrotický faktor z pry skyřice eluuje. Roztok nádorového nekrotického faktoru se popřípadě zahustí a vyčistí chromatofokusací v kterémkoliv stupni čisticího procesu, například izoelektrickou fokusací nebo projitím sítem gelu, jako je například Sephadex G-25.

Nádorový nekrotický faktor, který je vyčištěn od rekombinantní nebo indukované buněčné 50 kultury, se pro terapeutické použití spojí s fyziologicky neškodnými stabilizátory a excipienty,

-5 CZ 283149 B6 načež se připraví v dávkové formě, například lyofilizací v dávkových fiolách, nebo se skladuje ve formě stabilizovaných vodných prostředků. Pro implantaci do nádorů nebo do míst, z nichž byly nádory chirurgicky odstraněny, se nádorový nekrotický faktor připraví na polymerní matrici. Získá se tak prostředek, ze kterého se nádorový nekrotický faktor pomalu uvolňuje ve 5 vysoké gradientově koncentraci v daném místě.

Příklady provedení vynálezu

Prostředky podle tohoto vynálezu se získávají bez znečištění jinými cytotoxickými faktory, jako je například lymfotoxin, interferony nebo jiné cytotoxické proteiny, citované v literatuře. Terapeutické aplikace nádorového nekrotického faktoru se však s výhodou spojují s předem 10 danými množstvími lymfotoxinu a/nebo interferonu. Prostředky, které obsahují nádorový nekrotický faktor a interferon, jako je například gama interferon, jsou zvláště užitečné, protože vykazují synergickou cytotoxickou účinnost. Prostředky s nádorovým nekrotickým faktorem se podávají zvířatům, zvláště pacientům s maligními nádory, v terapeuticky účinných dávkách. Vhodné dávky budou zřejmé odborníkům. Vhodné dávky závisí na terapeutických podmínkách, 15 jak bude níže popsáno.

Obrázek 1 ukazuje eluční profil nádorového nekrotického faktoru při eluci ze skla s kontrolovanou velikostí pórů.

Obrázek 2 ukazuje eluční profil nádorového nekrotického faktoru z diethylaminoethylcelulózy.

Obrázek 3 ukazuje eluční profil nádorového nekrotického faktoru z rychlé proteinové kapalinové 20 chromatografie.

Obrázek 4 ukazuje eluční profil nádorového nekrotického faktoru při chromatofokusaci.

Obrázek 5 ukazuje molekulovou hmotnost nádorového nekrotického faktoru podle SDS PAGE gelové elektroforézy.

Obrázek 6 ukazuje molekulovou hmotnost nádorového nekrotického faktoru podle HPLC eluce. 25 Obrázek 7 ukazuje eluční profil nádorového nekrotického faktoru z kolony HPLC C4.

Obrázek 8 ilustruje rozdělení fragmentů nádorového nekrotického faktoru po štěpení trypsinem na HPLC.

Obrázek 9 ilustruje cytotoxický efekt směsi gama interferonu s nádorovým nekrotickým faktorem.

Obrázek 10 uvádí nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci pre-lidského nádorového nekrotického faktoru včetně úplného sekrečního leader nádorového nekrotického faktoru.

Obrázek 11 ukazuje konstrukci expresního vektoru nádorového nekrotického faktoru.

Nádorový nekrotický faktor pro účely tohoto vynálezu je definován jako polypeptid, jiný než lymfotoxin, který má výhodnou cytotoxickou účinnost a který má oblast, vykazující funkční 35 aminokyselinovou homologii s aminokyselinovou sekvencí maturovaného nádorového nekrotického faktoru, uvedeného na obrázku 10, jeho fragmentu nebo derivátu takového polypeptidu nebo fragmentu. Výhodná cytotoxická účinnost je zde definována jako výhodná destrukce nebo inhibice růstu nádorových buněk při srovnání s normálními buňkami za stejných podmínek. Výhodná cytotoxická účinnost se stanovuje účinkem polypeptidu na nádorové buňky in vivo 40 nebo in vitro při srovnání s normálními buňkami nebo tkáněmi. Při pokusech in vitro je diagnostickým znakem účinnosti obvykle buněčná lyže, při pokusech in vivo nekróza nádorů. Cytotoxická účinnost se však může projevovat také jako cytostáza nebo jako antiproliferační účinnost. Vhodné testovací systémy jsou velmi dobře známé. Například pro stanovení specifické účinnosti nádorového nekrotického faktoru se používá test lyže buněk, jak popisují B. Aggarwal 45 a spol, v Thymic Hormones and Lymphokines, ed. A. Goldstein. Spring Symposium on Health

-6 CZ 283149 B6

Scienoes. George Washington University Medical Center, 1983. Buněčná linie A549, která je v této literatuře citovaná, je dostupná zATCC pod číslem CCL 185. Specifická účinnost nádorového nekrotického faktoru se udává spíše v termínech lyže cílových buněk, než cytostázy. Jedna jednotka nádorového nekrotického faktoru je definována jako takové množství nádorového nekrotického faktoru, kterého je zapotřebí pro lyži 50% cílových buněk, vysetých do každé jamky podle toho, jak je uvedeno v příkladu 1. To však neznamená, že by tím byly vyloučeny jiné testy měření specifické účinnosti, např. způsoby, založené na rychlosti růstu cílových buněk. Pre-nádorový nekrotický faktor je jeden z typů nádorového nekrotického faktoru, který spadá do předcházející definice nádorového nekrotického faktoru. Pre-TNF je charakterizován tím, že v molekule je přítomen signální /nebo leader/ polypeptid, který slouží k post-translačnímu nasměrování proteinu do místa uvnitř nebo vně buňky. Signální polypeptid /který nemá nádorově nekrotickou účinnost v pravém smyslu/ se proteolyticky odštěpí od zbylého proteinu /s účinností nádorového nekrotického faktoru/jako část sekrečního procesu, v němž je protein transportován do periplazmy hostitelské buňky nebo do kultivačního média. Signální polypeptid může být mikrobiální nebo savčí /včetně přírodního, presekvence o 76 skupinách/, s výhodou je to však signál, který je homologní k hostitelské buňce.

Přírodní nádorový nekrotický faktor z normálních biologických zdrojů má vypočtenou molekulovou hmotnost asi 17 000 podle elektroforézy s dodecylsulfátem sodným na polyakrylamidovém gelu /SDS-PAGE/, jak je níže popsáno, izoelektrický bod asi 5,3 aje citlivý na hydrolýzu trypsinem na mnoha místech. Přírodní nádorový nekrotický faktor, který se vyčistí HPLC na obrácených fázích, se hydrolyzuje trypsinem na alespoň devět fragmentů za podmínek dále popsaných. Přesný počet fragmentů, na který se nádorový nekrotický faktor trypsinem hydrolyzuje, závisí na takových faktorech, jako je účinnost trypsinu, na koncentraci nádorového nekrotického faktoru a na parametrech inkubace, včetně iontové síly, pH, teploty a doby inkubace.

Nezdá se, že by nádorový nekrotický faktor byl glykoprotein, jelikož se nezachycuje na afinitní koloně s lektinem a analýza odvozené aminokyselinové sekvence neobsahuje žádná glykosylační místa. A dále, materiál, který se produkuje v kultuře E.coli /která nemá schopnost glykosylace/, se pohybuje na SDS-PAGE spolu s přírodním nádorovým nekrotickým faktorem.

Stupeň homologie aminokyselinové sekvence polypeptidů, který spadá do rozsahu nádorového nekrotického faktoru podle tohoto vynálezu, závisí na tom, zda homologie mezi tímto proteinem a nádorovým nekrotickým faktorem se týká těch oblastí nádorového nekrotického faktoru, které jsou zodpovědné za cytotoxickou účinnost. Ty oblasti, které jsou rozhodující pro cytotoxickou účinnost, by měly vykazovat vysoký stupeň homologie, aby spadaly pod definici. Naproti tomu ty sekvence, které se netýkají zachování konformace nádorového nekrotického faktoru nebo uskutečnění vazby na receptor, mohou vykazovat relativně nižší homologii. Kritické oblasti mohou vykazovat cytolytickou účinnost a stále ještě zůstávají homologní podle zde uvedené definice, jestliže jsou skupiny, které obsahují funkčně podobné aminokyselinové vedlejší řetězce, substituovány. Funkčně podobné se týká hlavních vlastností vedlejších řetězců, jako je například bázicita, neutralita nebo kyselost, nebo přítomnost či nepřítomnost stericky objemné skupiny. Definice nádorového nekrotického faktoru podle tohoto vynálezu specificky vylučuje z této definice lymfotoxin.

Polypeptid, který je definován jako nádorový nekrotický faktor, obecně bude obsahovat oblasti, které jsou v podstatě homologní s proteinem na obrázku 10 nebo s jeho fragmenty v bloku asi od 20 do 100 skupin aminokyselin, zvláště v blocích, které jsou obklopeny zbytky 35 až 66 a 110 až 133.

Nejvýznamnějším faktorem pro zajištění identity polypeptidů jako nádorového nekrotického faktoru je schopnost antisér v podstatě neutralizovat cytolytickou účinnost maturovaného nádorového nekrotického faktoru, uvedeného na obrázku 10, a také vpodstatě neutralizovat cytolytickou účinnost dotyčného polypeptidů. Je však třeba si uvědomit, že imunologická identita a cytotoxická identita nejsou nutně totožné. Neutralizující protilátka nádorového

-7CZ 283149 B6 nekrotického faktoru z obrázku 10 nemusí vázat příslušný protein, protože neutralizující protilátka nesměřuje ke specifickému vazebnému místu na nádorovém nekrotickém faktoru, které je rozhodující pro jeho cytotoxickou účinnost. Místo toho se protilátka může vázat na neškodnou oblast a vykazovat svůj neutralizující účinek sterickou zábranou. Příslušný protein, který je v této neškodné oblasti mutován, nemůže už vázat neutralizující protilátku. Nicméně takový protein by byl nádorovým nekrotickým faktorem v termínech podstatné homologie i biologické účinnosti.

Důležité je zjištění, že takové vlastnosti, jako jsou například molekulová hmotnost, izoelektrický bod a podobné, pro nativní nebo divoký typ maturovaného nádorového nekrotického faktoru na obrázku 10, který byl získán z periferních lymfocytů nebo kultury buněčných linií, popisují pouze nativní typy nádorového nekrotického faktoru. Nádorový nekrotický faktor tak, jak ho uvádí předcházející definice, zahrnuje také jiné typy, které nebudou vykazovat všechny vlastnosti nativního nádorového nekrotického faktoru. Nádorový nekrotický faktor podle definice podle tohoto vynálezu zahrnuje jak nativní nádorový nekrotický faktor, tak i jiné podobné cytotoxické polypeptidy. Například, deriváty nádorového nekrotického faktoru, jako jsou inzertní mutanty, deleční mutanty nebo napojené proteiny shora popsané, změní molekulovou hmotnost natolik, že tyto nádorové nekrotické faktory nespadají pod definici nativního nádorového nekrotického faktoru, pokud jde o jeho molekulovou hmotnost. Napojené proteiny s maturovaným nádorovým nekrotickým faktorem nebo pre-nádorový nekrotický faktor sám a také inzertní mutanty mají větší molekulovou hmotnost než nativní maturovaný nádorový nekrotický faktor, zatímco deleční mutanty nativního maturovaného nádorového nekrotického faktoru budou mít nižší molekulovou hmotnost. Nádorový nekrotický faktor může být sestaven také tak, aby snižoval nebo eliminoval citlivost na hydrolýzu trypsinem nebo jinými proteázami. A konečně, post-translační procese lidského pre-TNF v buněčných liniích, odvozených od neprimátních savců, může produkovat mikroheterogenitu v oblasti na aminovém konci, takže valin už nebude znamenat aminokyselinu na aminovém konci.

Sekvence aminokyselin lidského nádorového nekrotického faktoru, odvozeného od jeho cDNA, je popsána na obrázku 10. Maturovaný nebo nativní nádorový nekrotický faktor je reprezentován aminokyselinovými skupinami 1 až 157. Tato sekvence obsahuje signální sekvenci 76 skupin, o kterých se předpokládá, že se odstraňují během normální procese translatovaného transkriptu při produkci maturovaného proteinu. Šipkami jsou označena místa, hydrolyzovatelná trypsinem.

Je třeba poznamenat, že výraz způsobilý /schopný/ cytotoxické účinnosti nebo nekrózy nádoru in vivo znamená, že nádorový nekrotický faktor obsahuje polypeptidy, které mohou být převedeny, například enzymatickou hydrolýzou, z neaktivního stavu analogického zymogenu na polypeptidový fragment, který vykazuje žádanou biologickou účinnost. Tak inaktivními prekurzory jsou spojené proteiny, ve kterých je maturovaný nádorový nekrotický faktor vázán peptidovou vazbou na karboxylový konec jiného lidského proteinu nebo jeho fragmentu.

Sekvence na této peptidové vazbě nebo blízko ní je vybrána tak, aby byla citlivá na proteolytickou hydrolýzu, při níž se uvolní nádorový nekrotický faktor buď in vivo, nebo jako část výroby in vitro. Nádorový nekrotický faktor, který se takto generuje, pak bude vykazovat definicí požadovanou cytotoxickou účinnost.

I když nádorový nekrotický faktor obvykle znamená lidský nádorový nekrotický faktor, pod definici nádorového nekrotického faktoru spadá nádorový nekrotický faktor také z jiných zdrojů, jako je například myší, vepřový, koňský nebo hovězí nádorový nekrotický faktor, pokud ovšem jinak odpovídá standardům, které jsou shora popsány pro homologní oblasti a pro cytotoxickou účinnost. Nádorový- nekrotický faktor není druhově specificky. Například lidský nádorový nekrotický faktor je účinný na nádory u myší. Nádorový nekrotický faktor z jednoho druhu se tedy může použít při terapii jiného druhu.

Nádorový nekrotický faktor zahrnuje také multimemí formy. Nádorový nekrotický faktor spontánně agreguje do multimerů, obvykle do dimerů nebo vyšších multimerů. Multimery jsou cytotoxické a podle toho jsou vhodné pro použití v terapii in vivo. I když je žádoucí, aby se nádorový nekrotický faktor expresoval a izoloval v podstatě jako homogenní multimer nebo

- 8 CZ 283149 B6 monomer, terapeuticky může být nádorový nekrotický faktor používán jako směs různých multimerů.

Pod termínem nádorový nekrotický faktor jsou zahrnuty také deriváty nádorového nekrotického faktoru. Mezi tyto deriváty patří mutanty aminokyselinové sekvence, glykosylační varianty a kovalentní nebo agregační konjugáty s jinými chemickými částmi. Kovalentní deriváty se připravují tak, že se funkční skupiny způsoby známými odborníkům naváží na skupiny, které se nacházejí v aminokyselinových bočních řetězcích nádorového nekrotického faktoru, nebo na Nči C-konci nádorového nekrotického faktoru. Mezi tyto deriváty patří například: alifatické estery nebo amidy karboxylového konce nebo skupin, obsahujících karboxylový vedlejší řetězec, např. asplO, 0-acyl—deriváty skupin, obsahujících hydroxylovou skupinu, jako je například ser52, ser3, ser4 nebo ser5, N-acyl-deriváty skupin s aminovou skupinou na konci, např. lysinu nebo argininu, a deriváty cyslOl acys69. Acylová skupina znamená skupinu, která je vybrána ze skupiny, sestávající z alkylových skupin /normální alkylové skupiny se třemi až deseti atomy uhlíku, které tvoří alkanoylové typy derivátů/, a karbocyklických nebo heterocyklických skupin, které tvoří aroylové typy derivátů. Reaktivními skupinami jsou s výhodou difiinkční sloučeniny, které jsou známé odborníkům pro použití ve zkříženě navázaných proteinech za vzniku nerozpustné matrice pomocí reaktivních vedlejších skupin. Výhodnými místy pro tvorbu derivátů jsou cysteinové a histidinové skupiny.

Kovalentní nebo agregační deriváty jsou užitečné jako činidla v imunotestu, nebo při afinitních čisticích postupech. Například pro použití v testu nebo při čištění protilátek nádorového nekrotického faktoru nebo buněčných povrchových receptorů se nádorový nekrotický faktor z roztoku izoluje tak, že se kovalentně naváže na Sepharosu, aktivovanou bromkyanem způsoby, dobře známými, nebo se adsorbuje na povrchu polyolefinu, a to buď zkříženě navázaný s glutaraldehydem, nebo bez něj. Nádorový nekrotický faktor se také značí detekkovatelnou skupinou, například radiojodací postupem s chloraminem T, kovalentní vazbou s cheláty vzácných zemin nebo konjugací sjiným fluorescenčním zbytkem, vhodným pro diagnostické účely, zvláště pro diagnózu hladin nádorového nekrotického faktoru v biologických vzorcích při kompetitivních typech imunotestů. Takové deriváty nemusí spadat pod shora uvedenou definici nádorového nekrotického faktoru, protože není nutné, aby vykazovaly cytotoxickou účinnost, ale pouze zkříženou reaktivitu s proti-nádorovým nekrotickým faktorem.

Mezi mutantní deriváty nádorového nekrotického faktoru patří předem stanovené, tj. místně specifické, mutace nádorového nekrotického faktoru nebo jeho fragmentů. Předmětem mutageneze je zkonstruovat takovou DNA, která kóduje shora uvedený nádorový nekrotický faktor, tj. nádorový nekrotický faktor, který vykazuje cytotoxickou účinnost na nádorové buňky in vitro, nebo způsobuje nekrózu nádorů in vivo, a který si zachovává zbytkovou homologii se sekvencí na obrázku 10, ale který vykazuje také zlepšené vlastnosti a zlepšenou účinnost. Mutantní nádorový nekrotický faktor je definován jako polypeptid, který spadá do homologní definice nádorového nekrotického faktoru shora uvedené, ale jehož sekvence aminokyselin se liší od sekvence nádorového nekrotického faktoru delecí, substitucí nebo inzercí. Například lysinová nebo argininová skupina nádorového nekrotického faktoru /arginin 2, 6, 82, 44 a 131 a lysin 98, 90 a 65/ může být mutována na histidinovou nebo jinou aminokyselinovou skupinu, která nezpůsobuje proteolytickou labilitu proteinu. Podobně může být cystein 101 nahražen jinými zbytky a chemicky zkříženě navázán, čímž se zvýší stabilita proti oxidaci. Není nutné, aby mutanty vyhovovaly požadavkům být účinné jako nádorový nekrotický faktor, protože i biologicky neaktivní mutanty budou užitečné při značení nebo immobilizaci jako činidla v imunotestech. V tomto případě si však mutanty zachovávají alespoň jedno epitopické místo, které vykazuje zkříženou reaktivitu s protilátkou nádorového nekrotického faktoru. Oblasti skupin 35 až 66 a 110 až 133 nádorové nekrotické molekuly vykazují podstatnou homologii /50 procent/ s lymfotoxinem. V podstatě jsou zachovány také hydrofobní karboxy-konce /zbytky 150 až 157 nádorového nekrotického faktoru/ obou molekul. Jelikož oba proteiny vykazují cytotoxickou účinnost nebo nekrózu nádoru in vivo, předpokládá se, že tyto oblasti jsou důležité ve sdílení účinnosti lymfotoxinu a nádorového nekrotického faktoru. Skupiny v těchto oblastech

-9CZ 283149 B6 jsou výhodné pro mutagenezi, přímo ovlivňující účinnost nádorového nekrotického faktoru v dané buňce. Relativně nezachovaná oblast skupin 67 až 109 nádorového nekrotického faktoru může ovlivňovat přesnou polohu dvou ji obklopujících homologních oblastí v konformaci, která je pro cytotoxickou účinnost podstatná. Takováto poloha, které lze v nádorovém nekrotickém 5 faktoru dosáhnout disulfidovou vazbou Cys69-Cysl01, může odpovídat podobné oblasti lymfotoxinu, a to může vysvětlovat rozdíly ve specifičnosti a účinnosti mezi těmito dvěma molekulami. Tyto zbytky představují aktivní obal nádorového nekrotického faktoru. Mohou být syntetizovány chemicky nebo deleční mutagenezi, jako je useknutí. Vzniknou tak krátké polypeptidy s účinností nádorového nekrotického faktoru.

ίο I když je místo mutace předem stanoveno, není nutné, aby mutace sama byla také předem stanovena. Například při optimalizaci mutantů v poloze 131 se provede náhodná mutageneze v kodónu argininu 131 aexpresované mutanty nádorového nekrotického faktoru se testují na optimální kombinaci cytotoxické účinnosti a proteázové rezistence. Techniky, kterými se provádějí substituční mutace na předem stanovených místech DNA, které mají známou sekvenci, 15 jsou velmi dobře známy odborníkům, například mutageneze primerem M13.

Mutageneze nádorového nekrotického faktoru se provádí tak, že se provede inzerce aminokyselin, obvykle řádu asi od 1 do 10 aminokyselinových skupin, nebo delece asi od 1 do 30 skupin. Pro přípravu konečné konstrukce se mohou mezi sebou kombinovat substituce, delece, inzerce a jakékoliv jejich subkombinace. Mezi inzerce patří napojení na aminový nebo 20 karboxylový konec, např. hydrofobní rozšíření karboxylového konce. S výhodou se však provádí pouze substituce. Mutace v kódující oblasti nesmí umístit sekvenci mimo čtecí oblast. Mutace také s výhodou nevytvářejí oblasti, které by mohly produkovat sekundární mRNA struktury.

Ne všechny mutace v DNA, která kóduje nádorový nekrotický faktor, budou expresovány v konečném sekretovaném produktu. Například hlavní třídou substitučních mutací DNA jsou 25 takové mutace, v nichž různý sekreční leader nebo signál substituuje přirozený lidský sekreční leader, a to buď delecemi s leader sekvencí, nebo substitucemi, v nichž většina nebo všechny přirozené leadery jsou vyměněny za leader, který bude pravděpodobněji rozeznáván zamýšleným hostitelem. Například při konstrukci prokaryotického expresního vektoru je lidský sekreční leader deletován ve prospěch leaderu bakteriální alkalické fosfatázy nebo tepelně stabilního 30 enterotoxinu II, v případě kvasinek je leader substituován leaderem kvasinkové invertázy, alfafaktoru nebo kyselinové fosfatázy. Lidský sekreční leader může být však rozeznáván jinými hostiteli, než jsou lidské buněčné linie, nejpravděpodobněji buněčnou kulturou vyšších eukaryotických buněk. Jestliže je sekreční leader hostitelem rozeznáván, pak napojený protein obsahuje nádorový nekrotický faktor a leader je obvykle štěpen na peptidové vazbě leader35 nádorový nekrotický faktor a dochází k sekreci nádorového nekrotického faktoru. I když je tedy k transformaci hostitele použita mutace pre-TNF DNA, mutantní pre-TNF se syntetizuje jako meziprodukt a výsledný nádorový nekrotický faktor je obvykle nativní maturovaný nádorový nekrotický faktor.

Jinou větší třídou mutantů DNA, které nejsou expresovány jako deriváty nádorového 40 nekrotického faktoru, jsou substituce nukleotidů, které zvyšují expresi, primárně tím, že jsou vynechány smyčky na aminovém konci transkribované mRNA /viz doprovázející USA patentovou přihlášku 303 687, která je zde zahrnuta jako citace/ nebo se získají kodóny, které jsou snadněji transkribovány vybraným hostitelem, např. dobře známé E.coli preferenční kodóny pro expresi v E.coli.

4? V podstatě homogenní nádorový' nekrotický faktor znamená nádorový nekrotický faktor, který v podstatě neobsahuje jiné proteiny, které jsou přirozené pro zdroj, z něhož byl nádorový nekrotický faktor izolován. To znamená, že nádorový nekrotický faktor /homogenní/ v podstatě neobsahuje proteiny krevní plazmy, jako je například albumin, fibrinogen, serinové proteázy, α-globuliny, cytotoxické polypeptidy, které nejsou nádorovým nekrotickým faktorem, jako je 50 lymfotoxin nebo interferony, nebo jiné proteiny buňky nebo organismu, sloužícího jako syntetický původce nádorového nekrotického faktoru, včetně celých buněk a zbytků buněk.

- 10 CZ 283149 B6

Homogenní nádorový nekrotický faktor může však obsahovat také látky, jako jsou níže popsané stabilizátory a excipienty, předem stanovená množství proteinu z buňky nebo organismu, který slouží jako syntetický původce, proteiny z jiných buněk nebo organismů než z těch, které jsou zdrojem nádorového nekrotického faktoru a syntetické polypeptidy, jako je například poly-L5 lysin. Rekombinantní nádorový nekrotický faktor, který se expresuje v allogenní, např.

v bakteriální, hostitelské buňce, se ovšem expresuje bez proteinů zdroje genů.

Nádorový nekrotický faktor se s výhodou syntetizuje v kultuře rekombinantních organismů. Žádoucí nejsou ani periferní krevní lymfocyty /PBLs/ ani buněčné linie. V praxi je obtížné získat PBLs jedné třídy tak, aby nebyly znečištěny buňkami jiné třídy, například je obtížné získat 10 makrofágy bez buněk B nebo T. Při takovém znečištění se na produkty těchto buněk budou obtížněji aplikovat separační postupy, protože přimíšené buňky uvolňují další potenciální cytotoxické faktory a proteiny. Nádorový nekrotický faktor, získaný z nerekombinantní kultury, je drahý a sestává pouze z nativního nádorového nekrotického faktoru. Takové kultury nemají flexibilitu rekombinantní kultury, kterou se vlastnosti nádorového nekrotického faktoru zlepšují.

DNA, která kóduje nádorový nekrotický faktor, se získává chemickou syntézou, vyhledáváním atestováním reverzních transkriptů mRNA z kultury PBL nebo buněčných linií, nebo vyhledáváním a testováním v genomových bankách buňky. Mezi vhodné kultuiy buněčných linií patří linie monocytických buněk, jako jsou například promyelocytické buněčné linie, odborníky označené „HL-60“, /jeden typ je dostupný z ATCC jako CCL 240/, a histiocytická lymfotická 20 buněčná linie U937 /ATCC CRL 1593/. Tyto a další buněčné linie jsou indukovány tak, aby vystavením buněk chemickým a nebo fyzikálním činidlům známým odborníkům, obecně nádorotvomým a mitogenním činidlům, došlo k expresi a sekreci nádorového nekrotického faktoru. Nádorový nekrotický faktor může být v jistých monocytických buněčných liniích efektivně indukován pouze PMA, jiná konvenční činidla, jako je například lipopolysacharid, stafylokokový en terotoxin B nebo thymosin a-1, nebyla při indukci nádorového nekrotického faktoru v těchto buněčných liniích tak efektivní jako PMA. Jelikož je pro lokalizaci buněčných linií, expresujících nádorový nekrotický faktor /a tudíž obsahujících žádanou mRNA/, požadováno různé množství testování a vyhledávání, je efektivnější jednoduše gen syntetizovat. Syntéza je výhodná, protože syntézou lze zavést jedinečná restrikční místa /tím se usnadní použití genu ve vektorech, které obsahují jiná restrikční místa, než jsou místa v nativní sekvenci/ a lze využít stupňů, ve kterých dojde ke zvýšení efektivnosti translace, jak je níže diskutováno.

Tato DNA je kovalentně označena detekovatelnou látkou, jako je například fluorescenční skupina, radioaktivní atom nebo chemiluminiscenční skupina, známými způsoby. Pak se použije v konvenčních hybridizačních testech. Tyto testy se používají pro identifikaci vektorů 35 a transformantů nádorového nekrotického faktoru, jak je níže popsáno v příkladech, nebo pro diagnózu in vitro, jako je například detekce mRNA nádorového nekrotického faktoru v krevních buňkách.

mRNA pro nádorový nekrotický faktor je překvapivě vzácná, dokonce i v indukovaných buňkách HL-60, možná díky nestabilitě, jejíž příčiny nejsou známé. Dále je důležitá doba, po které se od 40 indukce buňky objeví mRNA nádorového nekrotického faktoru, mRNA pro nádorový nekrotický faktor se v buňkách objevuje pouze po velmi krátkou dobu, asi 4 hodiny po indukci. Tento fakt je odlišný od lymfotoxinu, který se objevuje asi 12 hodin po indukci. Tím se může stát, že se cDNA snadno přehlédne, pokud se neví, co hledat. Avšak jestliže je jednou cDNA kompletně dostupná, jak je to umožněno objevy podle tohoto vynálezu, pak už je rutinní vyhledat cDNA nádorového 45 nekrotického faktoru v bance cDNA indukovaných HL-60 nebo PBLs za použití sond, které mají sekvenci takové DNA. Dvě banky fágu HL-60, testované příkladech, obsahují relativně stálý počet pozitivních plaků. takže je zřejmé, že rutinními hybridizačními testy se identifikuje fág, který' obsahuje žádanou cDNA.

Buňky buněčné linie HL-60, které syntetizují nádorový nekrotický faktor, se kultivují konvenčním způsobem, pokud nedosáhnou hodnoty asi 8 až 12.10⁵ buněk/ml. Buňky se z kultury odstraní, promyjí, přenesou do bezsérového média a kultivují se v médiu, které obsahuje PMA.

- II CZ 283149 B6

V kultivaci se pokračuje, dokud se v kultivačním médiu neakumuluje žádaná koncentrace nádorového nekrotického faktoru, obvykle asi 400 jednotek nádorového nekrotického faktoru v jednom mililitru. Kultivační supematant se s výhodou vyčeří centrifúgací nebo jiným způsobem. Odstraní se tak zbytky buněk od rozpustných složek. Centrifugace se provádí jen za 5 nízkých otáček, aby se pohybovaly pouze suspendované částice. Dále se supematant vyčistí níže popsaným způsobem.

Nebo se, a to s výhodou, nádorový nekrotický· faktor syntetizuje v hostitelských buňkách, které jsou transformovány vektory, obsahujícími DNA, kódující nádorový nekrotický faktor. Vektor je konstrukcí replikovatelné DNA. Vektory se zde používají buď k amplifikaci DNA, která kóduje 10 nádorový nekrotický faktor, a/nebo k expresi DNA, která kóduje nádorový nekrotický faktor.

Expresní vektor je konstrukce replikovatelné DNA, v níž je sekvence DNA, kódující nádorový nekrotický faktor, odštěpitelně napojena na vhodné regulační sekvence, které jsou schopné uskutečnit expresi nádorového nekrotického faktoru ve vhodném hostiteli. Takovými regulačními sekvencemi jsou transkribční promotor, případná operátorová sekvence pro regulaci 15 transkripce, sekvence, kódující vhodné ribosomální vazebné místo mRNA, a sekvence, která reguluje terminaci transkripce a translace.

Vektorem může být plazmid, virus /včetně fága/ nebo integrovatelný fragment DNA, tj. integrovatelný do hostitelova genomu rekombinací. Jakmile je jednou transformován do vhodného hostitele, vektor se replikuje a funguje nezávisle na hostitelském genomu, nebo se 20 v některých případech může integrovat do samotného genomu. V této přihlášce je pojem vektor generický k pojmu plazmid, ale plazmidy jsou v současné době nejobvykleji používanou formou vektoru. Avšak i všechny další formy vektorů, které mají stejnou funkci a které jsou nebo budou známé v odborné literatuře, jsou vhodné i pro použití zde. Vhodné vektory obsahují replikon a regulační sekvence, které jsou odvozeny od typů, slučitelných 25 s hostitelem zamýšlené exprese. Transformované hostitelské buňky jsou buňky, které jsou transformovány nebo transfektovány vektory nádorového nekrotického faktoru, zkonstruovanými za použití technik rekombinantní DNA. Transformované hostitelské buňky pravidelně expresují nádorový nekrotický faktor. Expresovaný nádorový nekrotický faktor se buď intracelulámě ukládá, nebo se sekretuje buď do periplazmového prostoru, nebo do kultivačního supematantu, 30 což závisí na vybrané hostitelské buňce.

Oblasti DNA jsou odštěpitelně napojeny /jestliže mezi nimi existuje funkční vztah/ mezi sebou. Například DNA presekvence nebo sekrečního leaderu jsou odštěpitelně napojeny na DNA polypeptidu, jestliže jsou expresovány jako preprotein, kteiý participuje při sekreci polypeptidu, promotor je odštěpitelně napojen na kódující sekvenci, jestliže reguluje transkripci sekvence; 35 nebo vazebné místo ribosomů je odštěpitelně napojeno na kódující sekvenci, jestliže je umístěno tak, že dovoluje translaci. Odštěpitelně navázán obvykle znamená styčný a v případě sekrečních leaderů styčný a v čtecí formě.

Vhodnými hostitelskými buňkami jsou prokaryoty, kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky. Mezi prokaryoty patří gramnegativní nebo grampozitivní organismy, například E.coli nebo 40 Bacilli. Mezi vyšší eukaryotické buňky patří buněčné linie savců, připravené, jak bude dále popsáno. Výhodnou hostitelskou buňkou je kmen E.coli W3110 /ATCC 27 325/, rezistentní na fágy, který je popsán v příkladech, i když jsou vhodné i jiné prokaryoty, jako je například E.coli B, E.coli XI776 /ATCC 31537/, E.coli 294 /ATCC 31446/, typy Pseudomonas nebo Serratia Marcesens.

Výhodný pro expresi nádorového nekrotického faktoru je systém prokaryotický hostitel-vektor. Molekula nádorového nekrotického faktoru obsahuje dvě cysteinové skupiny. Pro post-translační tvorbu potenciální disulfidové vazby je tak třeba mírných požadavků, například E.coli expresuje biologicky účinný nádorový nekrotický faktor. K dispozici je mnoho vhodných mikrobiálních vektorů. Mikrobiální vektor obvykle obsahuje počátek replikace, rozeznávaný zamýšleným 50 hostitelem, promotor, který bude fungovat v hostiteli, a fenotypický selekční gen, například gen, kódující proteiny, propůjčující antibiotickou rezistenci nebo dodávající auxotrofní požadavek.

- 12CZ 283149 B6

Pro jiné hostitele se sestavují podobné konstrukce E.coli se typicky transformuje plazmidem pBR322, plazmidem, odvozeným od typu E.coli /Bolivar a spol.: Gene 2, 95 /1977/.) Plazmid pBR322 obsahuje geny ampicilinové a tetracyklínové rozistence. Tím jsou dostupné snadné prostředky pro identifikaci transformovaných buněk.

Vektory musí obsahovat promotor, který je rozeznáván hostitelským organismem. Promotor je obvykle k zamýšlenému hostiteli homologní. Mezi promotory, které se nejčastěji používají při konstrukci rekombinantní DNA, patří β-laktamázový /pěnicilinázový/ a laktózový promotorový systém (Chang aspol. Nátuře 275, 615 /1978/ aGoeddel aspol.: Nátuře 281, 544 /1979/.), tryptofanový /trp/ promotorový systém (Goeddel a a spol.: Nucleic Acids Res. 8, 4057 /1980/ a přihlášková publikace evropského patentového úřadu č. 36 776) a tac promotor (H. DeBoer aspol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 21 až 25 /1983/.). I když tyto promotory jsou nejobvykleji používanými promotory, vhodné jsou ijiné známé mikrobiální promotory. Podrobnosti, týkající se jejich nukleotidových sekvencí, které byly publikovány, umožňují zručnému pracovníkovi odštěpitelné je ligovat na DNA, kódující nádorový nekrotický faktor v plazmidových vektorech (Siebenlist aspol.: Cell 20, 269 /1980/.) a DNA, kódující nádorový nekrotický faktor. V dnešní době je výhodným vektorem derivát pBR322, obsahující promotor E.coli alkalické fosfatázy s trp Shine-Dalgamo sekvencí. Promotor a Shine-Dalgamo sekvence jsou odštěpitelné napojeny na DNA, kódující nádorový nekrotický faktor, tj. jsou situovány tak, aby podporovaly transkripci mRNA nádorového nekrotického faktoru z DNA.

Vedle prokaryotů se transformují vektory, kódujícími nádorový nekrotický faktor, také eukaryotické mikroby, jako jsou například kvasinkové kultury. Saccharomyces cerevisiae, neboli obyčejné pekařské kvasnice, jsou nejobecněji používané nižší eukaryotické hostitelské mikroorganismy, i když běžně je dostupno mnoho jiných kmenů. Kvasinkové vektory obvykle obsahují počátek replikace z dvoumikronového kvasinkového plazmidu, nebo samostatně se replikující sekvenci /ARS/, promotor, nádorový nekrotický faktor, sekvence pro polyadenylaci a terminaci transkripce a selekční gen; vhodným plazmidem pro expresi nádorového nekrotického faktoru v kvasinkách je plazmid YRp7 (Stinchcomb a spol.: Nátuře 282 /1979/, Kingsman a spol.: Gene 7, 141 /1979/ a Tschemper a spol.: Gene 10, 157 /1980/.). Tento plazmid již obsahuje trpí gen, který poskytuje selekční znak /markér/ mutantnímu kmeni kvasinek, který nemá schopnost růst vtryptofanu, například ATCC č. 44 076 nebo PEP4-l(Jones: Genetics 85, 12 /1977/.). Přítomnost oblasti trpí v genomu kvasinkové hostitelské buňky tak poskytuje účinné okolí pro detekci transformace růstem za nepřítomnosti tryptofanu.

Mezi vhodné promotorové sekvence v kvasinkových vektorech patří promotory pro metallothionein, 3-fosfoglycerátkinázu (Hitzeman aspol.: J. Biol. Chem. 255, 2073 /1980/.) nebo jiné glykolytické enzymy (Hess aspol.: J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 /1968/ aHolland aspol.: Biochemistry 17, 4900 /1978/.), jako jsou například enoláza, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza, pyruvát-dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukózo-6-fosfátisomeráza, 3-fosfoglycerátmutáza, pyruvátkináza, triosofosfát-isomeráza, fosfoglukózoisomeráza a glukokináza. Vhodné vektory a vhodné promotory pro použití při expresi kvasinkami jsou dále popsány R. Hitzemanem a spol.: Publikace evropského patentového úřadu č. 73 657. Jinými promotory, které mají další výhodu transkripce, regulované podmínkami růstu, jsou promotor oblastí alkoholdehydrogenázy 2, isocytochrom C, kyselinová fosfatáza, degradativní enzymy, spojené s metabolismem dusíku, shora uvedený metalothionein a glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenázy a také enzymy, které jsou zodpovědné za využití maltózy a galaktózy. Při konstrukci vhodných expresních plazmidu se terminační sekvence, spojené s těmito geny, také ligují do expresního vektoru 3’ sekvencí, kódujících nádorový nekrotický faktor. Tím se zajistí polyadenylace mRNA a terminace.

Vedle mikroorganismů mohou být jako hostitelské buňky použity také kultury buněk, které jsou odvozené od mnoha buněčných mikroorganismů. Ty však nejsou výhodné, neboť až dosud byly s mikroby, které expresují nádorový nekrotický faktor, získány vynikající výsledky. V principu lze pracovat s jakoukoliv kulturou vyšších eukaryotických buněk, ať už kulturou z obratlovců či nikoliv. Největší zájem se soustřeďuje na buňky obratlovců. V posledních letech se množení

- 13 CZ 283149 B6 buněk obratlovců v kultuře /tkáňová kultura/ stalo rutinní záležitostí /Tissue Culture. Academie Press, ed. Kruše aPatterson, 1973./. Příklady užitečných hostitelských buněčných linií jsou buňky VĚRO a Hela, buněčné linie vaječníků čínského křečka /CHO/ a buněčné linie WI38, BHK, COS-7 a MDCK. Expresní vektory pro tyto buňky obsahují obvykle/jestliže je to nutné/ 5 počátek replikace, promotor, který je umístěn proti směru genu, který má být expresován, spolu s ribosomovým vazebným místem, místo střihu RNA, jestliže se používá intron obsahující genomová DNA, polyadenylační místo a sekvenci terminace transkripce.

Regulační sekvence transkripce a translace v expresních vektorech, které jsou určeny pro použití při transformaci buněk obratlovců, se často získávají z virových zdrojů. Tak například obvykle 10 používané promotory jsou odvozeny od Polyoma Adenovirus 2 a nejvýhodněji od typu Simian

Virus 40, tj. SV40. Tyto časné i pozdní promotory jsou zvláště užitečné, protože se snadno získávají z viru jako fragment, který obsahuje také SV40 virový počátek replikace (Fiers a spol. Nátuře 273. 113 /1978/.). Lze používat také větší nebo menší SV40 fragmenty za předpokladu, že obsahují sekvenci o přibližně 250 párech nukleotidů od Hind III místa k Bgl 1 místu, 15 umístěnou ve virovém počátku replikace. Dále je také možné, a často je to žádoucí, využít lidský genomový promotor, řídicí a/nebo signální sekvence, obvykle spojené s nádorovým nekrotickým faktorem za předpokladu, že takové řídicí sekvence jsou slučitelné se systémy hostitelských buněk.

Počátek replikace se může získat buď konstrukcí vektoru, který by zahrnul exogenní počátek, 20 jako například takový, který lze odvodit od SV40 nebo od jiných virových zdrojů /například

Polyoma. Adenovirus. VSV nebo BPV/, nebo se může získat chromozomálním replikačním mechanismem hostitelské buňky. Jestliže je vektor integrován v chromozomu hostitelské buňky, pak je často druhá možnost postačující.

Při výběru výhodné hostitelské savčí buňky pro transfekci vektorů, které obsahují DNA 25 sekvence, kódující jak nádorový nekrotický faktor, tak dihydrofolát-reduktázu /DHFR/, je vhodné vybrat hostitele podle toho, jaký typ DHFR proteinu se použije. Jestliže se používá DHFR protein divokého typu, pak je výhodné vybrat takovou hostitelskou buňku, která je defi citní na DHFR. To umožní použít DHFR kódující sekvence jako markérů pro úspěšnou transfekci do selektivního média s nedostatkem hypoxanthinu, glycinu a thymidinu. V tomto 30 případě je patřičnou hostitelskou buňkou buněčná linie vaječníků čínského křečka /CHO/, deficitní na DHFR aktivitu, která se připraví a namnoží způsobem, popsaným Urlaubem a Chasinem: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 4216 /1980/.

Naopak, jestliže se jako řídicí sekvence použije DNA, kódující DHFR protein s nízkou vazebnou afinitou k methotrexátu /MTX/, pak není nutné používat buňky rezistentní na DHFR. Jelikož 35 mutantní DHFR je rezistentní na MTX, lze použít médium, obsahující MTX jako prostředek selekce za předpokladu, že hostitelské buňky samy jsou na MTX citlivé. Většina eukaryotických buněk, které jsou schopné absorbovat MTX, je citlivá na methotrexát. Jednou z těchto užitečných buněčných linií je linie CHO, CHO-K1 /ATCC č. CCL 61/.

Nádorový nekrotický faktor se nejdříve izoluje z kultury. Transformované nesekretující buňky se 40 lyžují sonikací nebo jiným přijatelným způsobem. Zbytky buněk se odstraní odstřeďováním.

Supematanty ze sekretujících buněk /jako jsou například indukované buněčné linie/ se od buněk oddělí odstřeďováním. Potom se použije jeden nebo více z následujících stupňů a nebo se použijí úplně jiné způsoby. Podle násle dujícího způsobu se nádorový nekrotický faktor vyčistí do takového stupně, který je postačující pro sekvenování. Tento stupeň však není nutně vyčištěn do 45 takového stupně, jaký je požadován pro terapeutický produkt.

V prvém čisticím stupni se nádorový nekrotický faktor z lyžované kultury nebo supematantu kultivačního média adsorbuje na hydrofobní látce. Jako hydrofobní látka se s výhodou používá neželatinový hydrofobní povrch, jako je například křemičitan nebo polyolefin, ačkoliv je vhodná také alkyl-Sepharosa. Výhodným uspořádáním je sklo o regulované velikosti pórů. Připraví se 50 směs asi jednoho objemu skla o regulované velikosti pórů s 50 objemy supematantu. Při asi 4 °C se za třepání nechá probíhat adsorpce asi 30 minut až asi 2 hodiny, s výhodou po dobu asi jedné

- 14 CZ 283149 B6 hodiny, za mírně alkalických podmínek. Adsorbent by se měl obecně promýt vhodným pufrem, aby se odstranily zachycené přimíšené proteiny.

Adsorbovaný nádorový nekrotický faktor se z hydrofobní látky eluuje změnou solvatačních vlastností média. Eluce se může provádět tak, že se nechá procházet roztok, pufrovaný na pH asi 7 až 8,5, s výhodou na pH asi 8, obsahující 1M sůl a efektivní množství vodného roztoku s vodou mísitelného organického polyolu, jako je například ethylenglykol nebo glycerin, obvykle ethylenglykol v rozmezí 10 až 30 objemových procent, s výhodou asi 20 objemových procent. Optimální podmínky ovšem závisí na použitém polyolu. Frakce, které obsahují nádorový nekrotický faktor, se detekují testem in vitro, jak popsáno níže, nebo jiným vhodným testem. Čištění a výtěžek tohoto stupně z monocytické buněčné kultury, stejně jako následující stupně, jsou uvedeny níže v tabulce I.

Další čištění se provádí tak, že se nádorový nekrotický faktor adsorbuje na anexu terciárního nebo kvartémího aminu. Výhodnými pryskyřicemi pro tento účel jsou hydrofilní matrice, jako je například zkříženě navázaný polystyren, dextran nebo celulóza, substituované alkylovými terciárními nebo kvartémími aminovými skupinami. Komerční produkty tohoto typu jsou dostupné jako DEAE celulóza. QAE Sephadex nebo pod obchodním označením Mono Q /ve všech těchto případech alkylový substituent znamená ethylovou skupinu/. Nej lepších výsledků bylo dosaženo s rychlou proteinovou kapali novou chromatografií systémem, který popisuje J. Richey v Američan Laboratory, říjen 1982, za použití makroporézních v podstatě jednotných částic podle Ugelstadta a spol.: Nátuře 303, 95 až 96 /1983/. Tímto způsobem je možné vyčistit nádorový nekrotický faktor do vysokého stupně čistoty.

Vyčištění do v podstatě homogenity lze dosáhnout pouze dalším dělením SDS PAG elektroforézou nebo vysokotlakou

Tabulka I

Čištění lidského nádorového nekrotického faktoru z kultivačního média buněk HL-60

čisticí stupeň	konečný objem /ml/	celkový protein /mg/	cytolytická aktivita /jednotky/	relativní specifická aktivita /jedn./mg/	čištění	izolováno /procent/
výchozí materiál	58000	1964	14,2.10⁶	0,007. 10⁶	-	-
chromatografie na skle o regulované velikosti pórů	1080	88,9	11,1.10⁶	0,12.10⁶	17	78,5
chromatografie na DEAE-celuloze	285	9,05	8,9.10⁶	0,98 .10⁶	140	62,7
rychlá proteinová kapalinová chromatografie na Mono Q	75	0,44	6,9.10⁶	15,68.10⁶	2240	48,6
preparativní SDS PAG elektroforéza nebo HPLC na C4 na obrácených fázích	6	0,028	2,71,10⁶⁺	96,79.10⁶*	13387*	Ι9.Γ

⁺ Korigováno na částečnou destrukci aktivity nádorového nekrotického faktoru, která je způsobena SDS, kyselinou trifluoroctovou a propanolem.

- 15 CZ 283149 B6 kapalinovou chromatografií na obrácených fázích na C4 /HPLC/, jak je dále v příkladech popsáno. Tento produkt však není žádoucí pro terapii, protože ztratil podstatnou část účinnosti vystavením účinku SDA nebo organickým rozpouštědlům při HPLC. Koncentrace proteinu se 5 stanoví podle M. Bradforda: Anal. Biochem. 72, 248 až 254 /1976/. Během posledních stupňů čištění byla koncentrace proteinu stanovována pomocí složení aminokyselin a také sekvenováním aminokyselin.

Pro podávání se nádorový nekrotický faktor připraví smícháním nádorového nekrotického faktoru o žádaném stupni čistoty s fyziologicky přijatelnými nosiči, tj. nosiči, které v používalo ných dávkách a koncentracích nejsou toxické. Obvykle se nádorový nekrotický faktor spojí s pufry, antioxidanty, jako je například kyselina askorbová, polypeptidy o nízké molekulové hmotnosti /méně než asi 10 skupin/, proteiny, aminokyselinami, cukry včetně glukózy nebo dextrinů, chelatačními činidly, jako je například ethylendiaminotetraoctová kyselina /EDTA/, a jinými stabilizátory aexcipienty. Nosiče by měly být formulovány tak, aby stabilizovaly 15 nádorový nekrotický faktor jako dimer a/nebo, s výhodou, jako trimer. Toho lze dosáhnout tím, že se soli nebo detergenty nepoužívají v těch koncentracích, které disociují nádorový nekrotický faktor na monomery. Rovněž tak je třeba se vyhnout takovým podmínkám, při kterých nádorový nekrotický faktor agreguje do vyšších multimerů. Při čištění, lyofílizaci nebo skladování ve vodných roztocích se proto obvykle používá neiontové povrchově aktivní činidlo, jako je 20 například Tween 20. Nádorový nekrotický faktor, který se používá pro terapeutické účely, musí být sterilní. Toho se snadno dosáhne filtrací sterilními filtračními membránami. Nádorový nekrotický faktor se skladuje obvykle v lyofilizované formě.

Nádorový nekrotický faktor se pó případě používá v kombinaci s jinými protinovotvarovými činidly, jako jsou například chemoterapeutická antibiotika /aktinomycin-D, adriamycin, 25 aklacinomycin A/, nebo s činidly, která zvyšují nebo stimulují imunní odpověď, například s imunoglobuliny, jako je gama-globulin, včetně imunoglobulinů, které vykazují afinitu na buněčné povrchy antigenů novotvarů. Jelikož interferony působí synergicky s nádorovým nekrotickým faktorem v testech buněčné lyže, je žádoucí kombinovat alfa-, beta- nebo gamainterferony s prostředky s nádorovým nekrotickým faktorem, nebo s prostředky s nádorovým 30 nekrotickým faktorem a lymfotoxinem. Typický prostředek obsahuje nádorový nekrotický faktor a gama-interferon v takovém poměru, aby jednotková účinnost byla od asi 0,1:1 do asi 200:1, obvykle 10:1; část nádorového nekrotického faktoru může být nahrazena lymfotoxinem. Tyto poměry mohou být upraveny tak, jak to vyžaduje terapeutická zkušenost.

Prostředky s nádorovým nekrotickým faktorem se podávají živočichům, které mají nádory.

Způsob podávání je shodný se známými způsoby podávání, například intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulámě, vnitřní infuzí nebo injekcí s sterilního roztoku nádorového nekrotického faktoru, a nebo lze použít i níže popsaných systémů s pomalým uvolňováním nádorového nekrotického faktoru. Nádorový nekrotický faktor se podává do míst poškození, tj. přímo injekcí do pevných nádorů. V případě rozsetých nádorů, jako je například leukemie, je 40 výhodné podávat nádorový nekrotický faktor intravenózně nebo do lymfatického systému.

Nádory orgánů v břišní dutině, jako je například rakovina vaječníku, se s výhodou léčí in traperitoneální infuzí použitím přístrojů pro intraperitoneální dialýzu atomu odpovídajících roztoků. Obvykle se však nádorový nekrotický faktor podává kontinuálně infuzí, i když je přijatelné i podávání bolus injekcí.

Je žádoucí, aby nádorový nekrotický faktor byl podáván ve formě implantovatelných prostředků, pomalu jej uvolňujících. Příklady vhodných systémů pro proteiny, které mají molekulovou hmotnost, odpovídající dimerům nebo trimerům nádorového nekrotického faktoru, jsou kopolymery L-glutamové kyseliny a gama ethyl-L-glutamátu (U. Sidman a spol.: Biopolymers 22/1/, 547 až 556 /1983/.), poly-/2-hydroxyethylmethakrylát/ (R. Langer aspol.: J. Biomed.

Mater. Res. 15, 167 až 277 /1981/ a R. Langer: Chem. Těch. 12, 98 až 105 /1982/.), nebo ethylen-vinylacetát /R. Langer aspol.: tamtéž./. Tyto prostředky se implantují do míst, z nichž

- 16CZ 283149 B6 byly nádory chirurgicky odstraněny. Nádorový nekrotický faktor se také používá v polopropustných mikrotobolkách nebo liposomech pro injekční podání do nádoru. Tento způsob podávání je zvláště užitečný u chirurgicky neodstranitelných nádorů, např. u mozkových nádorů.

Množství nádorového nekrotického faktoru, které se při podávání používá, závisí například na způsobu podávání, na typu nádoru a na stavu pacienta. Při použití injekce do místa poškození je třeba menšího množství nádorového nekrotického faktoru /vztaženo na tělesnou hmotnost/, než při intravenózní infuzi, přičemž některé typy nádorů jsou na nádorový nekrotický faktor rezistentnější než jiné typy, např. leukemické. Bude tedy nutné, aby terapeuti stanovili dávku 10 a modifikovali způsob podávání tak, jak je žádoucí pro získání optimální cytotoxické účinnosti na cílový nádor, to lze stanovit například biopsií nádoru nebo diagnostickými testy na údajné rakovinové znaky, jako je například karcinoembryonní antigen, z pohledu jakékoliv rekombinantní toxicity ve vyšších dávkách. Bylo zjištěno, že dávky asi až 120 mikrogramů na kg tělesné hmotnosti za den u myší při intravenózním podávání jsou obvykle v podstatě netoxické 15 a účinné in vivo.

Předpokládá se, že cytotoxická účinnost nádorového nekrotického faktoru není druhově specifická. To znamená, že se při terapii lidských nádorů může použít i jiný nádorový nekrotický faktor než lidský nádorový nekrotický faktor, například nádorový nekrotický faktor z hovězího nebo vepřového zdroje. Je však žádoucí, aby byl používán nádorový nekrotický faktor z těch 20 druhů, které jsou jím léčeny, aby se zabránilo potenciální tvorbě autoprotilátek.

Pro zjednodušení příkladů bude na některé často se vyskytující způsoby odkazováno krátkými frázemi.

Plazmidy jsou označovány malým p, za kterým následují velká písmena a/nebo číslice. Výchozí plazmidy, používané v této přihlášce, jsou komerčně dostupné, jsou veřejně dostupné bez 25 nějakých restrikčních omezení, nebo je lze z takových dostupných plazmidů zkonstruovat podle publikovaných způsobů. Vedle toho jsou v odborné literatuře známé ekvivalentní plazmidy, jak je zřejmé odborníkovi.

Pojem štěpení DNA se týká katalytického štěpení DNA enzymem, který působí na jistých místech v DNA. Takové enzymy se nazývají restrikční enzymy. Místa, na která jsou tyto enzymy 30 specifické, se nazývají restrikční místa. Pojem částečné štěpení znamená neúplné rozštěpení restrikčním enzymem, tj. štěpení probíhá za takových podmínek, že některá místa, ale ne všechna, v DNA substrátu jsou štěpena danou restrikční endonukleázou. Různé restrikční enzymy, které se zde používají, jsou komerčně dostupné. Při jejich používání se postupuje podle návodu dodavatelů enzymů, pokud jde o reakční podmínky, kofaktory a další požadavky. 35 Restrikční enzymy jsou obvykle označeny zkratkami, které se skládají z velkého písmena, po němž následují další písmena a potom obvykle číslo, reprezentující organismus, z něhož byl restrikční enzym původně získán. Obvykle se pracuje s asi 1 mikrogramem plazmidů nebo fragmentu DNA a asi jednou jednotkou enzymu v asi 20 μΐ pufrovaného roztoku. Množství příslušných pufrů a substrátů pro ten který restrikční enzym jsou dána výrobcem. Obvykle se 40 pracuje při inkubační době asi jednu hodinu při teplotě 37 °C, ale oboje se může měnit podle instrukcí dodavatelů. Po inkubaci se protein odstraní extrakcí fenolem a chloroformem a štěpená nukleová kyselina se z vodné frakce izoluje vysrážením ethanolem. Po štěpení restrikčním enzymem následuje někdy hydrolýza terminálního 5' fosfátu bakteriální alkalickou fosfatázou. aby se zabránilo tomu, aby restrikčně rozštěpené konce fragmentu DNA opět zcirkularizovaly.

nebo aby se vytvořily uzavřené smyčky, což by překáželo inzerci jiného fragmentu DNA do restrikčně rozštěpeného místa. Pokud není jinak uvedeno, nenásleduje po štěpení plazmidů defosforylace na 5' konci. Pro defosforylaci se používají konvenční postupy a činidla (T. Maniatis a spol.: Molecular Cloning, str. 133 až 134 /1982/.).

Pojem izolace daného fragmentu DNA z restrikčního štěpení znamená, že se rozštěpená část 50 oddělí elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Fragment, o který se zajímáme, se identifikuje srovnáním jeho pohyblivosti s fragmenty o známé molekulové hmotnosti, odstraní se

- 17 CZ 283149 B6 sekce gelu, obsahující žádaný fragment, a gel se oddělí od DNA. Tento postup je obecně známý. Viz například: R. Lawn a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 6103 až 6114 /1981/ a D. Goeddel a spol.: Nucleic Acids Res. 8, 4057 /1980/.

Southemova analýza je způsob, kterým se přítomnost sekvencí DNA v rozštěpené části nebo 5 v prostředku, obsahujícím DNA, potvrdí hybridizací na známý značený oligonukleotid nebo na známý fragment DNA. Southemova analýza zde bude znamenat rozdělení štěpů na 1% agaróze, denaturaci a přenesení na nitrocelulózu způsobem podle E. Southema: J. Mol. Biol. 98, 503 až 517 /1975/ a hybridizací tak, jak ji popsal T. Maniatis a spol.: Cell 15, 687 až 701 /1978/.

Pojem transformace znamená zavedení DNA do organismu tak, že DNA je schopna replikace, ío a to buď jako mimochromozomální prvek, nebo jako integrální část chromozomu. Pokud není jinak uvedeno, pak způsob, použitý v této přihlášce pro transformaci E.coli, je způsob s chloridem vápenatým podle Mandela a spol.: J. Mol. Biol. 53, 154 /1970/.

Pojem ligace označuje proces tvoření fosfodiesterových vazeb mezi dvěma fragmenty dvouvláknové nukleové kyseliny /T. Maniatis a spol.: tamtéž, str. 146/. Pokud není jinak 15 uvedeno, provádí se ligace za použití známých pufrů a za zn mých podmínek s 10 jednotkami T4 DNA ligázy /ligasa/ a 0,5 μg přibližně ekvimolámích množství fragmentů DNA, které mají být ligovány.

Pod pojmem příprava DNA z transformantů se rozumí izolace plazmidové DNA z mikrobiální kultury. Pokud není jinak uvedeno, může se použít alkalický/SDS způsob podle Maniatise 20 a spol.: tamtéž, str. 90.

Pojem oligonukleotidy znamená krátké jednovláknové nebo dvouvláknové polydeoxynukleotidy, které se chemicky syntetizují známými způsoby, načež se vyčistí na polyakrylamidových gelech.

Všechny citace literatury jsou zde výslovně zahrnuty jako odkazy.

Příklad 1

Testy

Specifická účinnost nádorového nekrotického faktoru se stanovuje dříve popsaným modifikovaným testem lyže buněk (B. Spofford: J. Immunol. 112, 2111 /1974/.). Myší fibroblastové buňky L-929 /ATCC CCL-929/ se kultivují v 96 jamkách misek s plochým dnem /3040, Falcon 30 Plastics. Oxford. Ca., USA/ v množství 30 000 buněk /objem 0,1 ml/ na jamku za přítomnosti pg/ml aktinomycinu D a seriálově zřeďovaného testovaného vzorku /0,125 ml/. Buňky se inkubují ve vlhké atmosféře při teplotě 37 °C s 5% oxidu uhličitého. Testovaný vzorek se po 18 hodinách odstraní, desky se promyjí a lyže buněk se stanoví vybarvením desek 0,5% roztokem krystalové violeti ve směsi methanol-voda /1:4, objemové díly/. Koncový bod 35 mikrotitrovacích desek byl stanoven pomocí přístroje Microelisa autoreader /firmy Dynatech/ změřením absorpce při 450 nm a transmise při 570 nm. Buňky, které byly kultivovány jen v samotném kultivačním médiu, vykázaly 0% lyži, buňky, které byly kultivovány s 3M roztokem hydrochloridu guanidinu, vykázaly 100% lyži. Jedna jednotka nádorového nekrotického faktoru se definuje jako takové množství nádorového nekrotického faktoru /jestliže je testován v objemu 40 0,125 ml/, kterého je potřeba k lyži 50% buněk.

Nádorový nekrotický faktor byl testován také testem nekrózy nádoru in vivo. Ve stručnosti tento test se provádí tak, že se buňky Metli A Sarcoma /5.10’ buněk/ nechají růst v myších samicích CB6Fj (BALB/c x C57BL/6)F| po dobu sedmi až deseti dnů. Vzorek nádorového nekrotického faktoru se pak podá injekČně do nádoru. Po 24 hodinách se myši usmrtí přerušením 45 cév, nádory se odstraní a nekróza se vyhodnotí histologicky, jak je popsáno E. Carswellem a spol, v Proč. Nati. Acad. USA 72, 3666 až 3670 /1975/.

- 18 CZ 283149 B6

Příklad 2

Využití PBLs nebo monocytických buněčných linií pro syntézu nádorového nekrotického faktoru.

Ve dvoulitrových kulatých baňkách /890 cm²/ se v 500 ml media RPMI 1640 /Irvine Soientifio.

Santa Ana. Kalifornie. USA/, které obsahuje lOmM HEPES, 0,05mM β-merkaptoethanolu, 100 jednotek penicilinu na mililitr, 100 pg streptomycinu na ml a 10% fetální telecí sérum, nechá růst linie lidských promyelotických buněk H-60 o buněčné hustotě 1.10³ buněk na mililitr. Po třech dnech při teplotě 37 °C, kdy buněčná hustota stoupla na 8 až 12.10’ buněk/ml, se buňky izolují odstřeďováním při 1 000 G po dobu 10 minut, promyjí se dvakrát bezsérovým médiem to RPMI 1640 a přenesou se do stejného shora popsaného média v buněčné hustotě 15 až 20.10⁵buněk na mililitr. Buňky se kultivují ve dvoulitrových kulatých baňkách za přítomnosti 10 ng/ml PMA. Po 16 až 24 hodinách se buňky odfiltrují 3 pm filtrem Scalkleen ZPall Trinity Micro Corp. Cortland. N. Y. USA/. Čirý filtrát se testuje na aktivitu nádorového nekrotického faktoru, vyčistí se a charakterizuje. Tímto postupem se získá asi 400 jednotek nádorového nekrotického faktoru 15 na mililitr supematantu kultivačního média.

Pro produkci nádorového nekrotického faktoru se používají také lidské perfifemí krevní monocyty. Krev, z níž byly odstraněny krevní destičky, lze dostat od amerického červeného kříže /Američan Red Cross. Boston. Ma. , USA/. Tato krev se použije do 24 hodin od získání. Nejdříve se oddělí monocyty od erythrocytů odstřeďováním na Ficoll-Hypaque gradientech při 20 1000 G po dobu 30 minut. Získané buňky se promyjí třikrát solným roztokem fosfátového pufru.

Monocyty od každého dárce byly odděleně kultivovány ve dvoulitrových kulatých baňkách v bezsérovém médiu RPMI 1640 na buněčnou hustotu 2,5.10⁶ buněk na mililitr. Ke kultuře se přidá 1 pg/ml stafylokokového enterotoxinu B /SEB/ a 1 pg/ml rekombinantního thymosinu a-1. Buňky se pak inkubují ve vlhké atmosféře při 37 °C s 10% oxidu uhličitého. Po 24 až 25 72 hodinách, podle typu donoru, se buněčné supematanty izolují a zpracují se stejným způsobem jako supematanty, odvozené od buněčné linie HL-60. Výtěžky nádorového nekrotického faktoru z kultur PBL se značně různí podle použitého indukčního činidla. Jestliže se ke shora popsanému indukčnímu systému přidá PMA, zvýší se cytolytická účinnost buněčných supematantú. Buněčné supematanty však obsahovaly jak nádorový nekrotický faktor, tak lymfotoxin. Stanovení 30 nádorového nekrotického faktoru nebo lymfotoxinu ve směsi nádorového nekrotického faktoru a lymfotoxinu se provádí tak, že se provede test lyže buněk testovaným vzorkem, který byl předem inkubován s králičí neutralizující protilátkou na nádorový nekrotický faktor nebo lymfotoxin, načež se stanoví zbytková aktivita v testu lyže buněk L-929.

Příklad 3

Chromatografie na skleněných perličkách o regulované velikosti pórů

Aktivita nádorového nekrotického faktoru z buněčné kultury se po dávkách adsorbuje na skleněných perličkách o regulované velikosti pórů /č. katalogu CPG 00350, Electro-Nucleonics. Fairfield. NJ, USA/ ekvilibrovaným pufrem s lOmM fosforečnanem sodným, pH 8,0, za stálého míchání při teplotě 4 °C. Na 5 litrů média se použije 100 ml skleněných perliček. Po jedno40 hodinovém míchání se perličky nechají usadit a supematant se dekantuje. Za teploty místnosti se pak perličkami naplní kolona /5 x 50 cm/. Kolona se promyje pufrem lOmM fosforečnanu sodného, pH 8,0, který obsahuje IM chlorid sodný. Aktivita nádorového nekrotického faktoru se ze skleněných perliček eluuje 20% ethylenglykolem v pufru lOmM fosforečnanu sodného. pH 8.0, který obsahuje IM chlorid sodný. Eluční profil supematantu HL-60 z kolony je uveden 45 na obrázku 1.

- 19CZ 283149 B6

Příklad 4

Chromatografie na DEAE celulóze

Eluát z příkladu 3 se přímo aplikuje na kolonu o velikosti 2,5 x 20 cm s DEAE celulózou 53 /Whatman/, ekvilibrovanou lOmM pufrem fosforečnanu sodného, pH 8,0, a 0,01% Tweenu 20 při průtoku přibližně 500 ml/hodinu. Průtok se upraví na 100 ml/h. Na kolonu se nanese 1,080 ml vzorku se 4,2.10⁶ jednotek nádorového nekrotického faktoru při 4 °C. Kolona se promyje ekvilibračním pufrem a eluuje se stupňovým gradientem 75mM, 150mM a 500mM chloridu sodného v lOmM fosforečnanovém pufru, pH 8,0. Zjišťuje se absorbance eluátu při 280 nm a účinnost nádorového nekrotického faktoru jako funkce eluovaných frakcí. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 2.

Příklad 5

Rychlá proteinová kapalinová chromatografie

Frakce s aktivitou nádorového nekrotického faktoru z příkladu 4 se zahustí a dialyzují se proti 20mM Tris-HCl, pH 8,0, obsahující 0,01% Tween 20 a lmM azid sodný /pufr A/ v cele Amicon s membránou YM-10 nebo s jinou dialyzační membránou s molekulovými hmotnostmi nižšími než je molekulová hmotnost nádorového nekrotického faktoru. Membrána se promyje dvakrát pufrem A. Kolona s perličkami Sepharosy, která je substituovaná kvartémí amoniovou skupinou /perličky o velikosti 9,8 μιη, kolona 5 x 0,5 cm, prodává se pod označením Mono Q resin firmou Pharmacia/, v jednotce rychlé proteinové kapalinové chromatografie /FPLC, fy. Pharmacia/ s gradientovým programátorem /GP-250/ a dvěma pumpami /P-500/ se nejdříve ekvilibruje dialyzačními pufry přes supersmyčku při průtoku 1 ml/min, jak je popsán J. Richeym v Američan Laboratory, strana 1, říjen 1982. Kolona se naplní spojenými promývacími podíly s dialyzačním koncentrátem. Kolona se promyje pufrem A. Potom se kolona eluuje lineárním gradientem 40 až 75mM chloridu sodného v pufru A. Lineární gradient byl naprogramován následujícím způsobem: 0 až 5 minut: ekvilibrační pufr, 5,1 až 15 minut: 25mM chlorid sodný, 15,1 až 25 minut: 40mM chlorid sodný, 25 až 60 minut: lineární gradient 40 až 75mM chloridu sodného, 60 až 65 minut: 75mM chlorid sodný, 65,1 až 70 minut: lOOmM chlorid sodný, 70 až 80 minut: lineární gradient 100 až lOOOmM chloridu sodného, 80 až 90 minut: lOOmM chlorid sodný a 90,1 až 110 minut: ekvilibrační pufr. Eluát se odebírá ve frakcích po dvou mililitrech. Zjišťuje se absorbance eluátu při 280 nm, jeho vodivost a účinnost nádorového nekrotického faktoru. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 3.

Příklad 6

Chromatofokusace

Chromatofokusace se provádí na koloně Pharmacia Mono P o velikosti 20 x 0,5 cm systémem FPLC jako v příkladu 5. Biologicky aktivní frakce /pokud jde o nádorový nekrotický faktor/, která se eluuje jako frakce 37 až 45 v příkladu 5, se zkoncentruje a dialyzuje na celeAmicon stir cell s membránou YM-10 proti koloně ekvilibračního pufru, tj. 0,025M bis-Tris HCI, pH 6,7. Vzorek se nanese na kolonu Mono P za teploty místnosti přes supersmyčku při průtoku jeden mililitr za minutu. Kolona se promývá ekvilibračním pufrem, dokud se absorbance při 280 nm nevrátí na základní hodnotu. Potom se eluuje lineárním gradientem pH (kolona se promývá 7,5% polypufrem 74 při pH 4,7 /Pharmacia/). Odebírají se frakce po l ml a měří se jejich absorbance při 280 nm a pH. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4. Jak je z obrázku 4 vidět, izoelektrický bod nádorového nekrotického faktoru je asi 5,3.

-20CZ 283149 B6

Příklad 7

Preparativní SDS elektroforéza na polyakrylamidovém gelu

Modifikací postupu podle U. Laemmliho: Nátuře 227, 680 až 685 /1970/ se připraví 15% polyakrylamidové gely /11x16 cm/ o tloušťce 1,5 až 3,0 mm. Dělicí i vrstvené gely obsahovaly 0,1% SDS a 0,05% Tween 20. Další pufry a koncentrace zkříženě navázaného činidla byly stejné jako u analytických SDS-PAGE gelů. Frakce s aktivitou nádorového nekrotického faktoru z příkladů 5 nebo 6 se spojí, zkoncentrují adialyzují proti 6,25M tris-HCL, pH 7,0, obsahující 0,005% SDS na cele Amicon stir cell s membránou YM-10. Po odstranění dialyzovaného koncentrátu se membrána promyje třikrát malým množstvím vzorku pufru /0,2% SDS, 0,02% Tween 20, 30% glycerol, 0,03M Tris HCI, pH 6,8, 0,005% stopové barvivo/. Dialyzovaný koncentrát a promyté podíly se spojí. Celkový objem je 1 až 4 ml. Pro dosažení SDS PAGE redukujících podmínek se popřípadě přidá merkaptoethanol a vzorek se nanese do velké jamky ve vrstveném gelu. Malé jamky, přilehlé k jamce se vzorkem, se použijí pro označení různých molekulových hmotností pomocí fosforylázy a/94 000/, hovězího sérumalbuminu /67 000/, ovalbuminu /43 000/, uhličitanové anhydrázy /30 000/, inhibitoru trypsinu ze sojových bobů /20 000/ a lysozomu /14 000/. Elektroforéza gelů probíhala ve vertikálním elektroforetickém systému Biorad, ochlazeném na 12 °C za konstantního proudu 20 mA na mm tloušťky gelu, dokud barvivo nedosáhlo konec gelu.

Po elektroforéze se jedna ze skleněných desek odstraní z gelu. Zaznamená se poloha vzorku o dané molekulové hmotnosti. Pás, který obsahuje aplikovaný vzorek nádorového nekrotického faktoru, se pak rozřeže na 0,25 cm sekce podle mole kulových hmotností tak, jak je udaly proteiny, které byly použity jako vzorky. Tyto pásky gelu se pak umístí do polypropylenových trubic, které obsahují 1 až 2 ml lOmM hydrogen uhličitanu amonného a 0,01% Tween 20, pH 8, a nechají se eluovat 16 hodin při 4 °C. Tyto eluáty se pak testují na účinnost nádorového nekrotického faktoru. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 5. Molekulová hmotnost nádorového nekrotického faktoru na SDS gelu byla asi 17 000 za redukujících i neredukujících podmínek, což naznačuje, že jde o molekulu s jednoduchým řetězcem.

Protein bez solí a bez látek o nízké molekulové hmotnosti se izoluje z eluátů pásků gelu následujícím postupem: Připraví se malé kolony, které obsahují 0,2 ml pryskyřice Sep-pak Cl8, která byla předem promyta acetonitrilem, 1-propanolem, 1% kyselinou trifluoroctovou /TFA/ a destilovanou vodou. Pak se ekvilibruje lOmM hydrogenuhličitanem amonným, obsahujícím 0,01% Tween 80, pH 8,0. Eluát z gelu se nanese na kolonu. Eluát z kolony se spojí. Pryskyřice se pak promyje přibližně 5 ml destilované vody a 5 ml 0,1% kyseliny trifluoroctové, čímž se odstraní volné aminokyseliny a soli pufru. Nádorový nekrotický faktor se z pryskyřice eluuje 1 ml 50% 1-propanolu v 0,1% kyselině trifluoroctové. Pryskyřice se pak eluuje dalším 1 ml 50% 1-propanolu v 1% kyselině trifluoroctové a 1 ml 99% 1-propanolu v 1% kyselině trifluoroctové, protein se však obvykle eluuje již prvním pufrem. V tomto stupni dochází přibližně k 80% inaktivaci bioaktivity nádorového nekrotického faktoru. I když takto získaný nádorový nekrotický faktor se může použít pro sekvenční analýzu, je výhodné použít pro tento účel eluent z HPLC, popsané v příkladu 8.

Příklad 8

Vysokotlaká kapalinová chromatografie

Molekulová hmotnost přírodního nádorového nekrotického faktoru se stanoví vysokotlakou gelovou chromatografií. Chromatografie se provádí za teploty místnosti na HPLC koloně /Alltech Associates. Deerfield. II. , USA/ o velikosti 7,5 x 60 mm s gelem TSK G2000 SW. Jeden mililitr vzorku, vyčištěného podle příkladu 5, který obsahuje přibližně 1 pg proteinu a 15 600 jednotek aktivity, se izokraticky eluuje z kolony s gelem pufrem /0,2M fosforečnan sodný, pH 7,0/ při průtoku 0,5 ml/minutu. Kolona se kalibruje hovězím sérualbuminem

-21 CZ 283149 B6 /molekulová hmotnost 66 000/, ovalbuminem /molekulová hmotnost 45 000/, hovězí uhličitanovou anhydrázou B /molekulová hmotnost 29 000/ a lysozomem /molekulová hmotnost 14 300/. Odebírají se jednomililitrové frakce, které se testují na aktivitu nádorového nekrotického faktoru. Frakce, které vykazují aktivitu nádorového nekrotického faktoru, se eluují 5 v rozsahu molekulových hmotností 45 000 ± 6000 /viz obrázek 6/.

Příklad 9

HPLC na obrácených fázích

Nádorový nekrotický faktor se čistí také HPLC na obrácených fázích na kolonách C4 Synchropak na chromatografickém systému Water Associates. Inc., jak bylo dříve popsáno (W. io Kohr a spol.: Anal. Biochem. 122, 348 až 359 /1982/.). Maxima proteinů byla zjištěna při 210 nm a při 280 nm po eluci lineárním gradientem 1 až 23% /objemová procenta/ 1-propanolu v 0,1% vodné kyselině trifluoroctové během prvních 15 minut a a 23 až 30% 1-propanolu v 0,1% vodné kyselině trifluoroctové během dalších 15 minut při průtoku jeden mililitr za minutu. Testuje se cytolytická aktivita maxim. Vlivem organických rozpouštědel, která se 15 používají při eluci nádorového nekrotického faktoru z kolony C4, se aktivita nádorového nekrotického faktoru snížila o asi 80 procent. Nádorový nekrotický faktor, který byl vyčištěn podle tohoto způsobu, se vysuší ve vakuu a pak se podrobí aminokyselinové analýze a sekvenovaní. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 7. Obrázek 7 ukazuje, že nádorový nekrotický faktor, který se získá z eluentu z příkladu 5, obsahuje biologicky neaktivní proteinové 20 přimíšeniny, které se eluují s retenčními časy asi 16 a 19 minut. Podle kriteria aminoterminální sekvence je bioaktivní eluent z C4-RP-HPLC v podstatě homogenní.

Příklad 10

Určení částečné sekvence aminokyselin nádorového nekrotického faktoru

Nádorový nekrotický faktor se štěpí trypsinem následujícím způsobem: Homogenní nádorový 25 nekrotický faktor z příkladu 9 se rozpustí, vysuší a znovu rozpustí v pufru /lOOmM hydrogenuhličitan amonný, pH 8,0/, obsahujícím 5 hmotnostních procent trypsinu TPCK /Worthington Biochemicals/, lmM CaCl₂ a 0,01% Tweenu 20. Poměr enzymu k substrátu je 1:20, inkubace probíhá 6 hodin/37 °C. Přidá se dalších 5 hmotnostních procent trypsinu a hydrolyzační směs se inkubuje dalších 12 hodin při 37 °C. Reakční směs se rozdělí na peptidové fragmenty na C4 30 HPLC. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 8. Pozoruje se celkem 9 fragmentů. Fragmenty 2 a 2 se eluují společně jako maximum, které je na obrázku 8 označeno T2. Předpokládá se, že dalších 10 fragmentů se kolonou nezadrží. Sekvence aminokyselin neporušeného nádorového nekrotického faktoru z příkladů 8 a 9 a fragmenty hydrolýzy trypsinem v tomto příkladu se stanoví automatickou sekvenační Edmanovou degradací modifikovaným přístrojem Beckamn sequencer 35 model 890B, opatřeným vymrazovačem. Jako nosič v kelímku se používá polybren /1,25 mg/.

Podle složení aminokyselin neporušené molekuly je molekulová hmotnost neporušeného nádorového nekrotického faktoru 17 000. Toto číslo je v souhlasu s daty SDS-PAGE a potvrzuje nepřítomnost glykosylace.

Příklad 11

Synergické působení nádorového nekrotického faktoru a gamainterferonu

Na mikrotitrovací desku se vysejí buňky myšího melanomu B16 /Mason Research. Worcester. Ma., USA/, buněčná linie původu C57B1/6, v množství 5 000 buněk na jamku a inkubují se 4 hodiny při 37 °C ve vlhkém inkubátoru s 5% oxidu uhličitého před přidáním lymfokinů.

Nádorový nekrotický faktor, získaný podle příkladu 1, se vyčistí HPLC v podstatě do 45 homogenity a jeho účinnost se kvantitativně stanoví shora popsaným testem cytolýzy buněk L929. Podobně se vyčištěný rekombinantní myší gama interferon (P. Gray a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 5842 až 5846 /1983/.) testuje na protivirovou účinnost na EMC-infekto

-22CZ 283149 B6 váných L-buňkách (D. Goeddel aspol.: Nátuře /London/ 287, 411 až 416 /1980/.). Myší gama interferon a lidský nádorový nekrotický faktor se odděleně zředí na zředění, uvedená na obrázku 10. Do označených jamek se přidá nejdříve gama interferon, pak se ihned přidá zředěný nádorový nekrotický faktor na konečný objem 0,2 ml na jamku. Po 72 hodinách inkubace se buňky obarví 0,5% krystalovou violetí ve 20% methanolu. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 10. B16 je relativně rezistentní jak na samotný nádorový nekrotický faktor, tak na samotný IFN-γ; v dávce 1000 jednotek/ml nádorového nekrotického faktoru nebyla pozorována žádná viditelná cytolýza. Přidáním velmi malých množství gama interferonu /tak malých jako je 5 jednotek/ml/ však již došlo k cytolýze.

Příklad 12

Izolace mRNA

Celková RNA z kultury buněk HL-60 /4 hodiny po PMA indukci/ nebo z periferních krevních lymfocytů, kultivovaných, jak je popsáno v příkladu 2, se extrahuje v podstatě podle Warda a spol.: J. Virol. 9, 61 /1972/. Buňky se odstřeďováním peletují a pak se resuspendují v lOmM chloridu sodném, lOmM Tris-HCI, pH 7,5 a l,5mM chloridu hořečnatém. Přidáním NP-40 na konečnou koncentraci 1 % dojde k lyži buněk. Jádra se odstřeďováním peletují. Supematant obsahuje celkovou RNA, která se dále vyčistí mnohonásobnou extrakcí fenolem a chloroformem. Vodná fáze se upraví tak, aby byla 0,2M na chlorid sodný. Celková RNA se vysráží přidáním dvou objemů ethanolu. Z 1 g kultivovaných buněk je typický výtěžek asi 6 mg celkové RNA. Způsobem podle H. Aviva a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69, 1403 až 1412 /1972/ se získá asi 100 pg polyadenylované mRNA na oligo/dT/celulóze.

Příklad 13

Banka cDNA

Postupným působením reverzní transkriptázy. Klenowova fragmentu DNA polymerázy aSl nukleázy se 7,5 pg póly/A/*mRNA z příkladu 12 převede na dvouvláknovou cDNA (P. Gray a spol.: Nátuře 295, 503 až 508 /1982/, M. Wickers a spol.: J. Biol. Chem. 253, 2483 až 2495 /1978/.). Z polyakiylamidového gelu se izoluje 80 ng cDNA o délce větší než 600 párů nukleotidů.

Na cDNA se liguje syntetická DNA adaptorová sekvence

5' AATTCATGCGTTCTTACAG 3'

3’ GTACGCAAGAATGTC 5'.

Vytvoří se kohezivni konec EcoRI. Jak je obvyklé pro odborníky, adaptor se chemicky syntetizuje jako dvě oddělená vlákna, 5' konec jednoho z vláken se fosforyluje polynukleotidkinázou a obě vlákna se anelují. Z polyakrylamidového gelu se pak znovu izoluje cDN /20 ng/, ligací se vloží do Xgt-10 rozštěpeného EcoRI, zabalí se do fágových částic a množí se v E.coli kmenu C600 hfl (Huynh a spol.:Practical Approaches in Biochemistry, IRL press Ltd. , Cxford. Anglie, 1984.) nebo v jiném známém kmeni, který je vhodný pro množení lambda fágů. Získá se tak banka cDNA o asi 200 000 nezávislých kmenech.

Příklad 14

Příprava deoxynukleotidové sondy pro cDNA nádorového nekrotického faktoru

N základě publikované frekvence používaných kodónů (R. Grantham a spol.: Nucleic Acids Res. 9,43 až 74 /1981/.), výhodnosti lidského IFN-γ (P. Gray a spol.: Nátuře 295, 503 až 508 /1982/.) a lidského lymfotoxinu byla sestavena hybridizační sonda DNA o 42 nukleotidech, založená na předběžné sekvenci aminokyselin trypsinového peptidu TD-6 /E-T-P-E-G-A-E-A-K.-P-W-Y-E-K/

-23 CZ 283149 B6 nádorového nekrotického faktoru. Předběžná sekvence má chybu /koncové K by mělo být P/. Nicméně tato sekvence vede k úspěšné sondě. Syntetická sonda má sekvenci: 5' dGAAACCCCTGAAGGGGCTGAAGCCAAGCCCTGGTATGAAAAG 3' a syntetizuje se způsobem podle R. Crea a spol.: Nucl. Acids Res. 8, 2331 až 2348 /1980/. Sonda se fosforyluje 5 působením γ-³²Ρ/ΑΤΡ a T4 polynukleotid kinázou způsobem dříve popsaným (Goeddel a spol.: Nátuře 281, 544/1979/.).

Příklad 15

Identifikace cDNA klonu, který obsahuje sekvence, kódující nádorový nekrotický faktor

Asi 200 000 rekombinantních fágů z banky Xgt 10 cDNA se testuje DNA hybridizací s použitím 10 ³²P-značeného 42-meru z příkladu 14 za nízkoselektivních podmínek podle A. Ullricha a spol.:

EMBO J. 3, 361 až 364 /1984/ (nebo také: P. Gray a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 5842 až 5846 /1983/, S. Anderson a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 6836 až 6842 /1983/ aM. Jaye a spol.: Nucleic Acids Res. 11. 2325 až 2335 /1983/.). Devět různých klonů se hybridizuje sondou a vyčistí se přes jednotlivé plaky. Pomocí mRNA z neinduko váných buněk HL- 60 se 15 připraví cDNA značená ³²P. DNA ze sedmi z těchto devíti klonů fágů se nehybridizuje těmito neindukovanými sondami. Jsou proto považovány za kandidáty sekvencí cDNA nádorového nekrotického faktoru. Klon cDNA, který obsahuje největší inzert, se označí λ42-4. Tento inzert se sekvenuje dideoxy-způsobem (A. Smith: Methods in Enzymology 65, 560 až 580 /1980/ a F. Sanger a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463 až 5467 /1977/.) po subklonování do 20 vektoru M13mp8 (J. Messing a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 309 až 321 /1981/.).

Sekvence cDNA, získaná z λ42-4, obsahuje úplnou kódovací oblast maturovaného nádorového nekrotického faktoru plus část jeho signálního peptidu. Správná orientace a čtecí oblast DNA byly odvozeny srovnáním se sekvencí aminokyselin trypsinového peptidu T4 nádorového nekrotického faktoru. Valinová skupina na aminovém konci nádorového nekrotického faktoru je 25 označena jako aminokyselina 1. V čtecí oblasti následuje 156 dalších aminokyselin aterminační kodón. Vypočtená molekulová hmotnost je 17 356.

Příklad 16

Identifikace klonu cDNA, obsahující sekvence, kódující úplný prenádorový nekrotický faktor

Klon cDNA X42-4 obsahuje úplnou kódující oblast maturovaného nádorového nekrotického 30 faktoru, chybí tam však sekvence, kódující úplný signální peptid, jak je zřejmé z toho, že chybí iniciační kodón. Aby se získala chybějící sekvenční informace, syntetizuje se chemicky hexadekanukleotidový primer dTGGATGTTCGTCCTCC /doplňkový k nukleotidům 855 až 870, obrázek 10/. Tento primer se aneluje k mRNA z příkladu 12. Pak se způsobem podle příkladu 13 syntetizuje cDNA. Způsobem popsaným v příkladu 13 se připraví ve XgtlO nová banka s asi 35 2 0 0 0 00 klony cDNA. Tato banka se testuje hybridizační analýzou s použitím sondy X42-4 cDNA inzertu, značeného ³²P. Získá se 16 pozitivních klonů. Nejdelší z těchto klonů, λ16-4, obsahuje inzert cDNA, který je na 5' straně delší o 337 párů nukleotidů než inzert λ42-4. Složení sekvence cDNA inzertů nádorového nekrotického faktoru λ 16-4 /nukleotidy 1 až 870/ aÁ42-4 /nukleotidy 337 až 1643/je uvedeno na obrázku 10. ^{40 * * * * 45}

Příklad 17

Konstrukce expresního vektoru pro přímou expresi nádorového nekrotického faktoru

Postup, který byl použit pro expresi sekvence cDNA nádorového nekrotického faktoru, získané v příkladu 15, je uveden na obrázku 11. Fág X42-4 z příkladu 15, který obsahuje kódující sekvenci úplného maturovaného nádorového nekrotického faktoru a část údajného sekrečního leaderu nádorového nekrotického faktoru, se rozštěpí působením EcoRI. Izoluje se fragment

-24 CZ 283149 B6 o přibližně 800 párech nukleotidů, který obsahuje kódující oblast nádorového nekrotického faktoru. Tento fragment se rozštěpí působením Ava I a Hind ΙΠ. Izoluje se fragment o 578 párech nukleotidů, který je na obrázku 11 omáčený C . Tento fragment kóduje aminokyseliny 8 až 157 nádorového nekrotického faktoru.

Připraví se dva syntetické deoxynukleotidy /na obrázku 11 omáčené jako fragment B; viz konstrukce sekvence adaptoru v příkladu 13/, které zahrnují kohezivní konec Xbal na 5' konci a kohezivní konec Ava 1 na 3' konci, iniciační kodón met a kodóny prvních sedmi aminokyselin na aminovém konci nádorového nekrotického faktoru. Kodóny těchto aminokyselin se vyberou na základě výhodnosti pro E.coli. Sekvence AATT proti směru počátečního kodónu se vybere tak, aby se patřičně umístil počáteční kodón od trp ribosomové vazebné sekvence a aby v kombinaci s kodóny aminokyselin eliminovala potenciální smyčku messenger RNA.

Trojnásobnou ligací se pak segmenty B a C spojí s derivátem pBR322, který obsahuje sekvenci promotoru s Shine-Dalgamo sekvencí trp leader peptidu /evropská patentová přihláška č. 36 776/. Získá nebo navrhne se derivát, který mezi trp promotorem a TeÚ genem obsahuje jediná místa Xbal a Hind ΙΠ.

Vhodnými výchozími vektory tohoto typu jsou buď pLTtrpl (Gray a spol.: Nátuře 312, 721 až 724 /1984/.) nebo ptrpETA (Gray a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 2645 až 2649 /1984/.), i když mohou být z pBR322, trp promotoru a jakýchkoliv žádoucích syntetických linkerů zkonstruovány i jiné vektory. Jak pBR322, tak plazmidy, obsahující trp promotor, jsou veřejně dostupné. Částí vybraného vektoru pBR322 může mít deletován segment Ava 1 - Pvu II od páru nukleotidu 1424 do 2065, což je v názvu plazmidu označeno XAP. Kterýkoliv z předcházejících plazmidů se rozštěpí současným působením Xba 1 a Hind III. Izoluje se velký vektorový fragment. Tento fragment se spolu s fragmenty B a C liguje T4 DNA ligázou. Ligační směs se použije k transformaci E.coli 294 /ATCC 31446 /. Vyberou se kolonie, které jsou rezistentní na ampicilin. Izoluje se plazmidová DNA. Plazmidová DNA se charakterizuje mapováním restrikčními endonukleázami a sekvenováním. Izoluje se tak plazmid pTrpXAPTN, který obsahuje inzerty B a C.

Příklad 18

Exprese nádorového nekrotického faktoru v E.coli

E. coli ATCC 31446, který byl transformován pTNFtrp, se kultivuje v médiu M9, které obsahuje 20 μ/ml ampicilinu. Kultura se nechá růst do A550 = 0,3. Přidá se indolyloctová kyselina na konečnou koncentraci 20 μg/ml a kultura se nechá růst do A₅₅₀ = 1,10 ml buněk se zkoncentruje a resuspenduje v solném roztoku, pufrovaném fosforečnanem. Buňky se sonikují. Sonikované buňky se zředí pro stanovení nádorového nekrotického faktoru podle testu z příkladu 1. Získá se tak přibližně 1O⁵jednotek aktivity na mililitr kultury. Tato účinnost se neutralizuje preinkubací s králičím protisérem z králíků, imunizovaných proti lidskému nádorovému nekrotickému faktoru.

Příklad 19

Exprese nádorového nekrotického faktoru v E.coli

Tento způsob je výhodnější než způsob, který je uveden v příkladu 18. Hostitelem pro použití ve shora uvedených vektorech je s výhodou nerevertibilní kmen tonA E.coli. Takovéto kmeny jsou rezistentní na bakteriofágy. Jsou tedy mnohem výhodnější pro kultivaci ve velkém měřítku, než kmeny divoké. Následuje popis vhodného způsobu získání takových kmenů. E.coli W3110 se transdukuje λ : :Tnl0, bakteriofágem λ, který obsahuje transponovatelný element TnlO. Vznikne tak Tnl0hop pool E.coli W3110 (N. Klecker a spol.: J. Mol. Biol. 116, 125 /1977/.).

E.coli W3110: :TnlO’’hop pool se kultivuje v kultivačním médiu L při teplotě 37 °C do buněčné hustoty asi 1.10⁹ buněk v mililitru. Půl mililitru této kultury se odstředí, peleta se suspenduje

-25 CZ 283149 B6 v 0,2 ml lyzátu Xphi80 /nebo TI/, který obsahuje 7,0.10⁹ jednotek, tvořících plak. Fág se nechá adsorbovat třicet minut při 37 °C. Tato suspenze se pak rozstříká na desky EMB s tetracyklinem: 15 pg/ml. Po inkubaci přes noc se světle růžové kolonie přenesou do 3 ml kultivačního média L, nechají se růst přes noc při 37 °C, dvakrát se pro myjí a resuspendují se v kultivačním médiu L.

Tato kultura se infektuje bakteriofágem PÍ kc a fágový lyzát se izoluje /J. Miller: Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, strana 304, 1972./.

E.coli AT 982 /č. 456. E.coli Genetic Stock Center. New Haven. Conn. , USA/ se tímto způsobem účinkem lyzátu PÍ kc transdukuje na tetracyklinovou rezistenci. Selekce transformantů se provede na deskách s kultivačním médiem L, doplněným otetracyklin (15 pg/ml) adap 10 (diaminopimelová kyselina, 40 pg/ml). Výsledné transduktanty se testují na tetracyklinovou rezistenci a regeneraci dap genu /dap⁺, tet^R/. Transduktanty dap⁺ , tet^R se pak testují na rezistenci Xphi80 /nebo TI/.

Z několika dap⁺ , tet^R, Xphi80 /nebo TI/ rezistentních kmenů se připraví PÍ kc lyzáty. Tyto lyzáty se použijí pro transdukování E.coli W3110 na tetracyklinovou rezistenci.

Transduktanty se testují a vyberou se ty, které jsou rezistentní na Xphi80 /nebo TI/.

Z transduktantů W3110 fhuA::Tnl0-Xphi80R se vyberou ty izoláty, které jsou citlivé na tetracyklin (S. Naloy a spol.. J. Bact. 145, 1110 /1981/.). Po přečištění přes jednotlivé kolonie se zkontroluje rezistence těchto izolátů na fág Xphi80 a citlivost na tetracyklin.

Z několika mutantů, které jsou citlivé na tetracyklin a rezistentní na fág Xphi80, se izoluje DNA.

DNA se rozštěpí působením Sstll. DNA rozštěpená Sstll se charakterizuje Southemovým blotovacím postupem s použitím radioaktivně označené a působením Sstll rozštěpené λ::Τη10 DNA jako sondy. Zjistí se tak, zda došlo kexcisi TnlO (R. Davis aspol.: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980.). Jeden z izolátů citlivých na tetracyklin vykazuje ztrátu dvou TnlO hybridizačních pásů při srovnání s hybridizací DNA ζλ::Τη10 a W3110 fhuA:TnlOXphi8OR. Třetí hybridizační pás má změněnou pohyblivost, což znamená, že došlo k deleci, způsobené nepřesnou excisí TnlO.

SDS-gelová elektroforéza vnějšího membránového preparátu z kmene s nepřesnou excisí TnlO ukázala, že pás, o kterém se předpokládá, že je protein fhuA, má změněnou elektrofore tickou pohyblivost při srovnání s divokým typem proteinu fhuA. Výsledný protein není funkční jako 30 receptorový protein fágu Xphi80. Druhý nezávislý kmen, který má také nepřesnou excisi TnlO, nevykazuje na gelu SDA žádný protein fhuA.

Žádný z těchto kmenů nevykazuje reverzi rezistence na tetracyklin nebo citlivost na Xphi80, což ukazuje na existenci nepřesné excise celého nebo části transposonu TnlO společně s buď částečnou nebo úplnou deleci genu fhuA. Jeden z takových kmenů W3110 /NL106/ se s výhodou 35 používá jako hostitel pro zde popsané vektory, kódující nekrotický nádorový faktor.

NL106 se transformuje ptrpXAPTNF a naočkuje se do 10 litrů média o pH 7,4, které má následující složení:

složka gramů v litru

síran amonný	5,0
hydrogenfosforečnan draselný	6,0
dihydrogenfosforečnan sodný	3,0
citran sodný	1,0
L-tryptofan	0,2
NZ amin AS	4,0
kvasnicový extrakt	4,0
síran hořečnatý	1,2
glukóza	25,0

-26CZ 283149 B6

složka	obsah
roztok se stopovými prvky /ionty
Fe. Zn. Co. Mo. Cu. B a Mn/	0,5 ml
tetracyklin	1,0 mg

Ke kultuře se přidává glukóza rychlostí 1 g/min, jakmile A550 kultury dosáhne asi 20. Fermentace se provádí při 37 °C, dokud A550 nedosáhne 136 /asi dvacet hodin/. Odstřeďováním kultury se získá buněčná pasta. Pak se tato pasta třicet minut extrahuje při pH 8,0 a za teploty místnosti 10 pufrem který obsahuje 50mM tris, lOmM ethyladiaminotetraoctovou kyselinu, lOOOmM chlorid sodný, 2000mM močovinu a0,1% β-merkaptoethanol. Extrakt se zředí atestuje, jak shora uvedeno v příkladu 1. V tomto testu bylo zjištěno, že ekvivalent 1 mg nádorového nekrotického faktoru je 1.10⁸ jednotek aktivity nádorového nekrotického faktoru. Z jednoho litru kultury se získají až asi 2 gramy nádorového nekrotického faktoru. Sekvenování na aminovém konci 15 ukazuje, že asi od 75 do 86 hmotnostních % je /maturovaný/ nádorový nekrotický faktor s valylovou skupinou na aminovém konci, zbývající část je met-nádorový nekrotický faktor. Navíc, vedle vysokých hladin exprese, protein není přítomen v refřaktilních tělesech, ani není toxický pro buňky, jak bylo prokázáno získanými extrémně vysokými buněčnými hustotami.

Příklad 20

Konstrukce a exprese genu mutantního nádorového nekrotického faktoru

V tomto příkladu se zopakují příklady 17 až 18 stím, že oligonukleotidový fragment B se syntetizuje s histidinovým kodónem CAT místo argininového 6 kodonu CGT. Expresuje se mutantní nádorový nekrotický faktor.

Příklad 21

Konstrukce a exprese jiného genu mutantního nádorového nekrotického faktoru

V tomto příkladu se opakuje postup z příkladů 17 až 18 s oligonukleotidovým fragmentem B, kódujícím leucin /CTT/ místo zbytku 2 argininového kodonu. V prvních pokusech se získá asi 1200 mg aktivity maturovaného nádorového nekrotického faktoru na litr kultury. V kultuře nebyl detekován neprocesovaný nádorový nekrotický faktor. ^{30 * * * * 35 * * * * 40}

Příklad 22

Konstrukce vektoru, kódujícího spojení nádorového nekrotické ho faktoru se sekvencí sekrečního signálu

Sekvenci E.coli tepelně stabilního enterotoxinového genu STII popisuje Picken a spol.: Infection and Immunity 42/1/, 269 až 275 /1983/. V tomto příkladu se liguje fragment, obsahující sekreční signál STII a Shine-Dalgamo sek věnci, po vláknu promotoru E.coli alkalické fosfatázy. Po signálu STII ve směru 3' následuje syntetický oligonukleotid, který obsahuje kodóny iniciačních sedmi aminokyselin nádorového nekrotického faktoru na aminovém konci a zbytek kódující sekvence nádorového nekrotického faktoru. Všechny předcházející části se umístí do vektoru pBR.322.

Plazmid pWM501 (Picken a spol.: Infection and Immunity 42/1/, 269 až 275 /1983/.) obsahuje gen STII. pWM501 se rozštěpí působením Xbal aNsil. Izoluje se fragment o přibližně 90 párech nukleotidů. Tento fragment by se mohl syntetizovat také organicky způsoby, známými odborníkům /fragment A/.

-27 CZ 283149 B6

Plazmid pBR322-Trp, který je popsán v příkladu 17 /p20kLT/, se rozštěpí působením Xbal a HindlII. Izoluje se velký vektorový fragment /fragment B/. Tento fragment obsahuje počátek replikace E.coli a gen, propůjčující fenotypu ampicilinovou rezistenci.

Syntetický oligonukleotid se syntetizuje jako dvě vlákna. Anelací se získá následující struktura 5 /jsou uvedeny také přečnívající konce restrikčních míst a aminokyseliny, kódované oligonukleotidy/:

VAL ARG SER SER SER ARG THR

5’ GTA CGT TCT TCT TCT CGT ACT 3’

ACGT CAT ACG AGA AGA AGA GCA TGA GGCT

Nsil Aval

Tato struktura je označena jako fragment C.

Plazmid pTNFtrp z příkladu 18 se rozštěpí působením Aval a Hind III. Izoluje se fragment AvalHindlII /fragment D/ o 578 párech nukleotidů. Tento fragment obsahuje všechny kódující 15 sekvence nádorového nekrotického faktoru kromě prvních sedmi aminokyselin.

Sekvence DNA, která obsahuje promotor E.coli alkalické fosfatázy /AP/, napojený na heterologní Shine-Dalgamo /S. D./ sekvenci /trp/ a která má konce EcoRI a Xbal, se zkonstruuje následujícím způsobem. Fragment DNA, který obsahuje část promotoru AP, se izoluje z plazmidů pHI-1 (H. Inouye a spol.: J. Bacteriol. 146, 668 až 675 /1981/.), i když lze použít 20 jakékoliv příslušné zdroje, obsahující promotor AP DNA. Plazmid pHI-1 se rozštěpí působením

Hpal za vzniku otevřeného plazmidů. Syntetický RcoRI linker GAATTCGAATTC

CTTAAGCTTAAG se liguje s plazmidem. Navázaný plazmid se rozštěpí nadbytkem EcoRI a nedostatkem Rsal, čímž se rozštěpí všechna místa EcoRI a část míst Rsal. Tyto dva stupně, tj. štěpení působením EcoRI 25 a působením Rsal, je lépe provést postupně než současně. Z tohoto EcoRI-Rsal štěpení se izoluje fragment o 420 párech nukleotidů, který obsahuje promotor AP.

Sekvence trp S. D. se získá následujícím způsobem. Plazmid nebo organismus, který obsahuje trp promotor (plFN-beta 2, D. Leung a spol.: Biotechnology 2, 458 až 464 /1984/.), se rozštěpí působením Xbal a Rsal. Izoluje se fragment o 30 párech nukleotidů, který obsahuje trp S. D. 30 sekvenci. Tento fragment se liguje s promotorovým fragmentem AP o 420 párech nukleotidů.

Získá se fragment E /fragment EcoRI-Xbal/ o 450 párech nukleotidů. Fragment E má sekvenci nukleotidů:

EcoRI

GAATTCAACTTCTCCATACTTTGGATAAGGAAATACAGACATGAAAAATCTCATTGC

TGAGTTGTTATTTAAGCTTGCCCAAAAAGAAGAAGAGTCGAAAGAACTGGTGCGCA

GGTAGAAGCTTTGGAGATTATCGTCACGTCAATGCTTCGCAATATGGCGCAAAATGA

CCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCGATG CCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTATTGA AGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGTGTCATAAAGTTGTCACGGC 40 CGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTACGCAAGTTCACGTA AA

AAGGGTATCTAGA trpS. D. Xbal

Fragmenty A, B, C aD se ligují čtyřstupňovou ligací. Ligační směs se použije kE.coli 294. 45 Transfor manty se identifikují kultivací na deskách LB, obsahujících ampicilin. Z kolonie transformantů se izoluje plazmid trpSTIITNF. Tento plazmid se rozštěpí působením Xbal

-28 CZ 283149 B6 a EcoRI. Odstraní se tak trp promotor. Zbytek plazmidů se liguje s fragmentem E /fragment EcoRI-Xbal/ o 450 párech nukleotidů, který obsahuje E.coli promotor alkalické fosfatázy. Výsledný plazmid se nazývá pAPSTIITNF.

Příklad 23

Exprese a procese napojení nádorového nekrotického faktoru se sekvencí sekrečního signálu

E.coli se transfektuje plazmidem pAPSTIITNF a pak se naočkuje do 10 litrů média /pH 7,0/ o následujícím složení:

složky gramů na litr

síran amonný	5,0
hydrogenfosforečnan draselný	2,6
dihydrogenfosforečnan sodný	1,3
citran sodný	1,0
chlorid draselný	1,5
NZ amin AS	5,0
kvasnicový extrakt	2,0
síran hořečnatý	1,2
glukóza	25,0
roztok se stopovými prvky /ionty Fe,
Zn. Co. Mo. Cu. B a Mn/	0,5 ml
ampicilin	20,0 mg

Kultivace se provádí stejným způsobem, jak bylo shora popsáno v příkladu 19, až na to, že se kultivace provádí, dokud A_55O nedosáhne 140. V tomto okamžiku obsahuje kultura asi 400 mg nádorového nekrotického faktoru v jednom litru kultury. Podle elektroforézy na gelech se asi 70 až 80 hmotnostních procent tohoto množství získá jako maturovaný protein. Ex trakcí buněk způsobem podle příkladu 19 /využitím osmotického šoku buněk/ se získá přibližně tatáž aktivita nádorového nekrotického faktoru, jako při extrakci celých buněk.

Příklad 24

Konstrukce a exprese dalších derivátů nádorového nekrotického faktoru

Mutantní deriváty sekvence aminokyselin nádorového nekrotického faktoru z obrázku 10 se připravují tak, aby uspokojily alespoň jeden nebo více z následujících požadavků: zvýšení poločasu života in vivo, zvýšení cytolytické účinnosti, zvýšení čisté diferenční cytolytické účinnosti na nádorové buňky versus normální buňky, příprava imunogenú nádorového nekrotického faktoru pro získání protilátek proti nádorovému nekrotickému faktoru pro diagnostická použití, příprava unikátních míst pro kovalentní modifikaci /například tehdy, kdyženzymová značení jsou kovalentně navázána při přípravě diagnostických činidel EMIT nebo ELISA/ a změna fyzikálních vlastností nádorového nekrotického faktoru, např. jeho pohyblivosti, pí a podobných. Stanovení žádané účinnosti vybraných derivátů se provádí rutinním testováním vhodnými testy, známými odborníkům.

Nádorový nekrotický faktor a jeho deriváty s výhodou nezahrnují ty nádorové nekrotické faktory, jejichž sekvence odpovídají sekvencím neprimátů. Nádorový nekrotický faktor a jeho deriváty s výhodou nemají ani aminový konec nádorového nekrotického faktoru neprimátů, např. aminový konec desValArg, který je charakteristický pro králičí nádorový nekrotický faktor, ani aminový konec genu nádorového nekrotického faktoru, který má sekvenci Val-Arg-Ser-Arg

-29CZ 283149 B6

Thr-Pro—SerAsp—Lys—Pro—Val—Ala—Val—Ser—Val—Ala—Asn—Pro—Aln—Ala-Glu—Gly-(Wang a spol.: Science 228, 149 až 154 /1985/.).

Následující způsob je obecně aplikovatelný (podle J. Adelmana aspol.: DNA 2/3/,183 až 193.) na konstrukci a expresi sekvencí DNA jakéhokoliv mutantního nádorového nekrotického faktoru, 5 které obsahují tiché mutace nebo které kódují mutantní nádorový nekrotický faktor. Pro ilustraci jsou zde uvedeny reprezentativní deriváty: Arg 32 je změněn na histidylovou skupinu /substituce/, His 73 je vynechán /deleční mutace/ a na Leu 157 je napojena leucylová skupina /došlo tedy k inzerci/. Tomu je však nutno rozumět tak, že stejným způsobem se získávají další typy mutantů.

Odborníkům jsou známy další způsoby, které jsou vhodné pro tvorbu tichých nebo expresovaných mutací v DNA, kódující nádorový nekrotický faktor. Například, mutantní DNA se zkonstruuje tak, že se jednoduše chemicky syntetizuje úplná sekvence, nebo se syntetizuje část sekvence a fragment se liguje se zbytkem DNA. Chemická syntéza DNA je výhodná tehdy, jestliže si odborník přeje připravit mutant přímo bez získání DNA, kódující nádorový nekrotický 15 faktor, z nádorových zdrojů. Obvykle však výchozí DNA kóduje přírodní sekvenci aminokyselin, včetně jejich alelických variant. Je tedy žádoucí připravit z nich jisté mutantní deriváty.

Při přípravě DNA, kódující mutantní deriváty nádorového nekrotického faktoru, je žádoucí, aby nedošlo ke změnám kodónů, které by umožnily, aby mRNA z nich transkribovaná tvořila silné struktury se spárovanými a nespárovanými oblastmi /stem and loop structure/. Jestliže se podaří 20 vyhnout se těmto strukturám, má to obvykle za následek vyšší výtěžky. Ze stejného důvodu by měly být použity kodóny, které jsou výhodné pro hostitele transformantu.

Vhodnou výchozí DNA je fragment EcoRI-HindlII plazmidu pTrpXAPTNF /příklad 17/. Tento fragment se získá postupným štěpením působením EcoRI a Hind ΠΙ, po němž se izoluje fragment, obsahující gen TNF. Tento fragment zahrnuje trp pro motor a strukturní gen pro 25 methionylový nádorový nekrotický faktor. Pro získání jednovláknové kopie tohoto genu, vhodné pro mutagenezi, se fragment EcoRI-HindlII klonuje do polylinkerového místa fágu M13 mp8 RF-DNA (J. Messing aspol.: Gene 19, 269 až 276 /1982/, RF znamená replikativní formu fágu; tento fág je komerčně dostupný.). Příslušný podíl rozštěpené směsi EcoRI-HindlII se přidá k ligační reakci, která obsahuje 10 ng M13 mp8 RF-DNA, který byl předem rozštěpen 30 působením EcoRI a HindlII. Po dvouhodinové inkubaci za teploty místnosti se ligační směs použije k transformaci E.coli JMI03 /komerčně dostupný kmen; lze použít také kmen JM101. /. Transformované buňky se vysejí na vrchní agar, obsahující X-GAL /dibrom-dichlor-indolylgalaktosid/ a IPTG /isopropylthiogalaktosid/. Pro izolaci Ml 3 mp8/TNF RF-DNA minitestovacím postupem (Bimboim a Doly: Nucl. Acids Res. 7, 1513 až 1523 /1980/.) se použijí 35 bakteriální kultury /jeden mililitr/, infektované fágem, získaným z bezbarvých plaků. Výsledný rekombinantní fág Ml3 mp8/TNF nese kódující vlákno genu nádorového nekrotického faktoru.

Pro místně řízenou mutagenezi se syntetizují oligodeoxyribonukleotidy /mutagenní oligomery/ se sekvencí, doplňující 15 bází na některé straně mutačního místa, jak je ukázáno v následujících diagramech. V těchto diagramech N znamená doplňkové báze a M znamená nukleovou kyselinu, 40 která má být vložena, vynechána nebo substituována. Inzerce nebo delece se obvykle dělají ve skupinách po 3. Tím se udrží gen po změně vlákna ve fázi.

Pro delece:

Pro substituce:

Pro inzerce:

oligomer vektor DNA oligomer DNA vektor DNA oligomer DNA vektor DNA dna/n/₁₅/n/₁₅ /N/₁₅/M/ /N/15 /N/|₅/M,//N/₁₅/N/|₅/M₂/ /N/|5 /n/₁₅/m/ /n/₁₅ /n/₁₅ /n/₁₅

-30CZ 283149 B6

Mi znamená bázi nebo oligomer, který není doplňkový kbázi nebo oligomeru M₂. Mi zde znamená žádanou mutantní sekvenci; obvykle se připravují také oligomery, které současně způsobují více než jeden typ mutace.

Oligomerem s opačným smyslem pro mutace Arg-his 32 je:

p CAG GAG GGC ATT GGC ATG GCG GTT CAG CCA CTG-OH.

Oligomerem s opačným smyslem pro deleci His 73 je:

p GTG GGT GAG GAG CAC GGT GGA GGG GCA GCC-OH.

Oligomerem s opačným smyslem pro inzerci Leu 158 je:

p TGT TCG TCC TCC TCA AAG CAG GGC AAT GAT CCC-OH.

Tyto primery se syntetizují konvenčními způsoby. Pro použití při mutagenezi se 10 pmolů oligomerů nebo lac primeru 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' fosforyluje třicet minut při 37 °C v 10 μΐ 50 mM Tris-HCl /pH 7,5/, 0,lmM EDTA, lOmM chloridu hořečnatého, lOmM dithiothreitolu a0,lmM ATP, obsahujících dvě jednotky T4 polynukleotid kinázy. Pro použití jako sonda /viz níže/ se 2 pmol syntetických oligonukleotidů fosforylují, jak shora uvedeno, až na to, že se místo 0,lmM ATP použije 1 μΜ γ-³²Ρ ATP /Amersham/. Specifická aktivita je běžně vyšší než 5.10⁶ impulzů za minutu na pikomol oligonukleotidového řetězce.

Hybridizace jak oligomeru, tak lac primeru na jednovláknové DNA zfága M13 mp8/TNF, následovaná zvětšením primeru, vede k tvorbě částečně heteroduplexních DNA, jejichž jedno vlákno obsahuje mutantní DNA.

Při částečné tvorbě heteroduplexu se jednovláknová M13 mp8 TNF DNA /300 ng/ zahřívá na 80 °C /dvě minuty/, 50 °C /pět minut/ a za teploty místnosti /pět minut/ ve 20 mikrolitrech lOmM Tris-HCl, pH 7,5, 0,lmM EDTA a 50mM chloridu sodného, obsahujících 1 pikomol fosforylovaného oligomeru nebo primeru /přidány jako stejné podíly z kinázové reakce/. Zvětšení primeru začíná přidáním 30 μΐ 50mM Tris-HCl /pH 8,0/, 0,lmM EDTA, 12mM chloridu hořečnatého, lOmM dithiothreitolu, 0,7mM ATP, 0,07mM dATP, 0,2mM dGTP, 0,2mM dTTP aO,2mM dCTP, obsahujících 2 jednotky E.coli DNA polymerázy 1, velký fragment a 20 jednotek T4 DNA ligázy. Po třiceti minutách za teploty místnosti se reakční směs inkubuje čtyři hodiny při 37 °C a pak při 4 °C přes noc. Stejné podíly se extrahují fenolem. DNA se vysráži ethanolem a rozpustí v 15 μΐ vody. DNA v těchto podílech se použije pro transformaci E.coli JM103.

Lac primer hybridizuje fág v místě 5' na oligomer. Prodloužením primeru se stabilizuje heteroduplexová struktura. Oligomer a primer se enzymaticky fosforylují, čímž umožní spojit spojující řetězce DNA T4 DNA ligáze.

Fenolem extrahovaná duplexová DNA z podílu C /10 μΐ/ se přidá k 10 μΐ 0,06M octanu sodného o pH 4,5, 0,6M chloridu sodného a 0,6mM chloridu zinečnatého, obsahujících 200 jednotek Sj nukleázy. Po pětiminutové inkubaci při 37 °C se přidá 5 pg kvasnicové tRNA. Extrakcí fenolem avysrážením ethanolem se izolují nukleové kyseliny. 30 ng jednovláknové M13 mp8 DNA /asi 10 000 jednotek tvořících plak/ za použití stejných Si podmínek poskytne méně než 100 plaků v testu transformace DNA, přičemž stejné množství RF-DNA si zachová více než 80 % svých transformačních možností. DNA, na kterou bylo působeno S_b se použije pro transformaci E. coli JMI03. Výsledný fág se analyzuje in šitu testováním plaků.

Bakteriální desky /o průměru 15 cm/, které obsahují několik set plaků rekombinantního fága M13, se testují in šitu hybridizací plaků Benton aspol.: Science 196, 180 až 182 /1977/.) na původní i mutogenní genotyp pomocí příslušných značených oligomerů na oddělených sadách filtrů /asi 106 impulzů za minutu na filtr/. Hybridizace se provádí přes noc při 50 °C ve 40% formamidu, 5 x SSC. Filtry se promyjí při 45 °C, 2 x SSC, 0,02% dodecylsulfátem sodným, vysuší na vzduchu a exponují na rentgenový film při -70 °C s kontrastním filtrem.

Aby se oddělila hybridizace oligomeru k mutantnímu DNA vláknu /úplný doplněk/ od hybridizace k výchozí DNA, je nutné změnit selektivitu hybridizačního procesu /změnou

-31 CZ 283149 B6 koncentrace SSC/. Každý mutant má jinou schopnost hybridizace podle povahy a počtu substituovaných, vynechaných nebo vložených bází. Například, jestliže se má stanovit mutace jediné báze, tedy mutace malé, jsou potřeba vysoceselektivní podmínky, aby se mohla rozlišit mutovaná DNA od původní nemutované DNA. Např, při deleci kodónu nebo substituci 1 až 3 5 bází by měla hybridizovaná sonda být menší než mutující se oligomer. Takovou typickou sondou je sonda asi 14 až 20 bází. Úkol vyhledávání mutantních deleci je usnadněn tím, jestliže se pro testování ztráty sekvence použije sonda, která obsahuje nebo tvoří deletovanou sekvenci. Jestliže tato sonda nehybridizuje DNA z vybraného plaku, lze z toho vyvodit, že došlo k žádané ztrátě cílové sekvence.

Vybere se plak, který se hybridizuje značeným oligomerem, a naočkuje se do E.coli JMI03. Ze supematantu se připraví jednovláknová /ss/DNA. Z buněčných pelet se připraví dvouvláknová /ds/DNA. ssDNA se použije jako templát pro dideoxy-sekvenaci klonu využitím doplňkových sekvencí Ml3 univerzálního primeru nebo syntetického oligomeru ve 3' místě mutované sekvence DNA nádorového nekrotického faktoru. Dideoxy-sekvenování potvrzuje, že izolovaný 15 plak obsahuje mutovanou DNA. Tento fág se označí M13 mp8/TNFmtnt.

Fág M13 mp8/TNFmtnt se rozštěpí působením EcoRI a HindlII. Izoluje se fragment, který kóduje nádorový nekrotický faktor. Působením EcoRI a Hind III se rozštěpí pTrpXAPTNF. Izoluje se vektorový fragment. Mutantní fragment se pak liguje do vektorového fragmentu. Ligační směsí se tranformuje E.coli W3110, NL106 nebo 294 /ATCC 31446/. Způsobem podle 20 příkladů 18 nebo 19 se izoluje mutantní nádorový nekrotický faktor. Další informace, které se týkají M13 mutace, lze získat z britské patentové přihlášky 2 130 219A.

Mutanty, které se připravují podle tohoto způsobu, se dělí na tři třídy: substituce, delece a inzerce. Dělení v těchto třídách je uvedeno v následující tabulce. Pokud není jinak uvedeno, jde o mutanty maturovaného nádorového nekrotického faktoru z obrázku 10.

místo na nádorovém reprezentativní modifityp mutantu__________nekrotickém faktoru__________kace na označeném místě______________

A. Substituce

I. Modifikace, které se týkají stupně nebo povahy náboje

30	1.	arg 6	his
	2.	lys 65	arg
	3.	pro 20	arg
	4.	asp 10	his
	5.	glu 53	thr
35	6.	gin 47	asp
	7.	asp 45	gin nebo asn
	8.	asn 39	asp
	9.	asn 34	gin
	10.	leu 29	asp
40	11.	tyr 115	ile
	12.	glu 116	lys
	13.	pro 117	thr
	14.	glu 127	tyr
	15.	lys 128	his
45	16.	ala 134	tyr
	17.	glu 135	lys
	18.	tyr 141	pro
	19.	asp 143	ser
	20.	ala 145	thr
50	21.	glu 146	asn
	22.	gin 149	lys
	23. leu 120	lys

-32CZ 283149 B6

	typ mutantu	místo na nádorovém nekrotickém faktoru	reprezentativní modifikace na označeném místě
5	II. Modifikace, kt<	íré se týkají hydrofilního nebo h	ydrofobního charakteru
	1.	leu 57	tyr
	2.	ser 52	leu
	3.	val 41	tyr
10	4.	gly 108	phe
	5.	leu 120	thr
	6.	ser 133	gly
	7.	ala 134	thr
	8.	gly 148	ser
15	9.	val 16	thr

ΙΠ. Sterické modifikace /změny v objemnosti vedlejšího řetězce/

1.	Leu 63	phe
20	2.	Ser 52	tyr
	3.	ile 58	leu
	4.	gly 40	ile
	5.	val 13	phe
	6.	leu 120	phe
25	7.	ile 146	gly
	8.	asn 137	gglu
	9.	ile 154	phe
	10.	ile 155	giy
	11.	phe 144	ile
30	B. Inzerce
	1.	po Leu 157	gly gly-COOH
	2.	mezi Asp 10 a Lys 11	his
35	3.	mezi ile 58 a tyr 59	leu
	4.	mezi Ser 60 a gin 61	lys
	5.	mezi arg 31 a arg 32	ala
	6.	mezi gly 121a gly 122	gly
	7.	před val 1	imunogenní polypeptid
40	8.	po leu 157	imunogenní polypeptid
	9.	mezi gin 149 a val 150	gly gly
	10.	mezi ala-1 a val prenádorového nerotického faktoru	lys arg
45	C. Delece
	1.	Gly 149
	2.	lys 112
	3.	val 1 až arg 2
50	4.	val 1 až pro 8
	5.	ala 22
	6.	arg 32

-33 CZ 283149 B6

typ mutantu	místo na nádorovém nekrotickém faktoru	reprezentativní modifikace na označeném místě
7.	glu 53
8.	ala 111 až lys 112
9.	ala 123
10.	ile 154
11.	glu 127
D. Kombinace
1.	ile 58	leu
	leu 57	phe
2.	gin 149	delece
	tyr	phe
3.	lys 112	delece
	glu 115	lys
4.	val 1	thr
	ala 22	lys
	gly 24	asn
	ala 33	asp
5.	tyr 115	phe

glu 116 lys

6. inzerce gly mezi gly 121 a gly 122 přidání gly gly-COOH po leu 157

7.	delece val 1 až gly 66 a substituce NH₂-Leu Ala Ile Ile Gly Phe Tyr Val Gin GlySer Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Asp Pro Arg AsnIle Glu Ala Ser Leu Arg Asp Gly Lys Glu LeuGln Phe Val Gly Gly Leu Tyr Ile Pro Glu TyrTrp Pro Lys Ala Glu Ala Gly Glu Pro Thr-
8.	delece ala 111 ala 109	gin
	leu 120	his
9.	asn 19	gin
	asn 92	gin
	asn 137	gin

Za povšimnutí stojí mutace, v nichž jsou místa arg 2, arg 6 /viz příklady 20 a 21/, arg 32 a arg 131, kde dochází khydrolýze trypsinem, vynechána nebo pozměněna tak, že pak nejsou citlivá na trypsin. To by mohlo prodloužit poločas života nádorového nekrotického faktoru in vivo, přičemž se sníží možnost fermentačního odštěpení. Místa arg 2 a arg 6 nejsou rozhodující pro biologickou účinnost, protože tato zůstane zachována, i když se obě tyto oblasti odstraní. Avšak štěpením v místech arg 32 a arg 131 se účinnost ztrácí. Proto je žádoucí, aby arg 32 a/nebo arg 131 byly substituovány histidinylovou skupinou nebo, méně výhodně, skupinou gin. Tím se odstraní nebo sníží vnímavost místa na enzym, ale zůstane zachována bázicita postranního řetězce. Ze stejného důvodu se arg 31 substituuje histidinylovou skupinou, nebo méně výhodně glutaminem. Místa, v nichž dochází k hydrolýze působením enzymu, jsou vložena také mezi napojení polypeptidů a sekvencí TNF, neboť se tak získají místa, která jsou před určena pro uvolnění maturovaného nebo mutovaného nádorového nekrotického faktoru. Nebojsou takovými

-34CZ 283149 B6 místy substituovány skupiny v leader sekvenci pre-nádorového nekrotického faktoru. Předpokládá se, že substituce asn za asp 45 a exprese v hostitelské buňce /například kvasinkové nebo savčí buňce/, která je schopna glykosylace, vede ke glykosylovanému nádorovému nekrotickému faktoru.

Příklad 25

Exprese nádorového nekrotického faktoru v kvasinkách za regulace ADH promotorem

Podle postupu, popsaného v příkladu 17, se zkonstruuje plazmid TrpXAPTNF až na to, že p20KLT nebo ptrpETA /nebo plazmid pBR322/ se rozštěpí spíše působením EcoRl a Hind ΠΙ než Xba 1 a Hind III a že se syntetický fragment B připraví spíše s EcoRl kohezivním zakončením než s Xba 1 kohezivním zakončením. Ligační směs se pak použije pro transformaci E.coli ATCC 31446. Restrikční analýzou se identifikuje plazmid pTNFRI, který obsahuje DNA, kódující nádorový nekrotický faktor, navázanou EcoRl místy. Plazmid pTNFRI se izoluje, rozštěpí se působením EcoRl a izoluje se fragment T-l, který obsahuje DNA nádorového nekrotického faktoru.

Plazmid pFRPn /Evropský patent č. 60 057A/ se rozštěpí působením EcoRl. Pro zabránění recirkularizace se na rozštěpený plazmid působí alkalickou fosfatázou, pomocí T4 DNA ligázy se liguje na fragment TI nádorového nekrotického faktoru. Ligační směs se použije pro transformaci E.coli ATCC 31446. Kolonie, které jsou rezistentní na ampicilin, poskytují dvě série plazmidů s opačnými orientacemi inzertu T-l, jak bylo stanoveno restrikční analýzou elektroforézou na agarosových gelech. Plazmidy z E.coli transformantů se vyčistí a použijí pro transformaci kvasinek, které mají trpí mutaci /například kvasinkový kmen RH218, neomezeně uložený v ATCC č. 44 076/, na trp* fenotyp. Bylo zjištěno, že plazmidy, orientované tak, že počáteční kodón segmentu T-l je umístěn vedle fragmentu promotoru alkoholdehydrogenázy, transformují kvasinky, které pak expresí poskytují nádorový nekrotický faktor. Nádorový nekrotický faktor se izoluje z extraktů kvasinkových transformantů. Stabilita plazmidu při fermentacích ve větším měřítku se zlepší tím, že se používá expresní plazmid, obsahující dvoumikronový počátek replikace místo pFRPn chromozomálniho počátku replikace /ars 1/ a že se používá slučitelný hostitelský kmen (J. Beggs: Nátuře 275, 104 až 109 /1978/.).

Příklad 26

Exprese nádorového nekrotického faktoru v savčích buňkách

Plazmid pEHER /Evropský patent č. 117 060 A/ se rozštěpí působením EcoRl. Na rozštěpený plazmid se působí telecí střevní alkalickou fosfatázou a pak se liguje do fragmentu T-l z příkladu 25. Ligační směs se použije pro transformaci E.coli ATCC 31446. Izolují se dva plazmidy /označené pEHERTNF I apEHERTNF II/, které obsahují DNA nádorového nekrotického faktoru s opačnými orientacemi, jak bylo stanoveno restrikční analýzou na polyakrylamidových gelech. Tyto plazmidy se použijí pro transfektování a selekci buněk CHO DHFR-DUX-B 11, CHO 1 a Ltk'.

Buňky tkáňové kultury se transfektují smícháním shora připraveného 1 pg pEHERTNF I nebo pEHERTNF II s 10 pg krysí DNA v objemu 250 pl, 0,25M CaCL, pak se přikape 250 pl pufrovaného solného roztoku HEPES /280nM chlorid sodný, l,5mM hydrogenfosforečnan sodný, 50mM HEPES, pH 7,1/. Po třiceti minutách za teploty místnosti se roztok přidá k buňkám tkáňové kultury, které se kultivují v 60 mm plastických miskách pro tkáňové kultury. Používají se buňky CHO 1, CHO DHFR-DUX-B11 a Ltk’. Misky obsahují 3 ml kultivačního média, odpovídajícího hostitelské buňce.

Pro buňky CHO1 a CHO DHFR-DUX-B 11 se jako médium použije médium Ham F-12 /Gibco /, doplněné 10 % telecího séra, 100 pg/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a2nM L

-35CZ 283149 B6 glutaminu. Pro buněčnou linii Ltk’ se použije Dulbeccem modifikované Eaglovo médium /DMEM/, doplněné jak shora uvedeno.

Po 3 až 16 hodinách se médium odstraní a buňky se promyjí 20% glycerolem v solném roztoku, pufrovaném fosforečnanem. Na každou desku se přidá čerstvé médium a buňky se inkubují další dva dny.

Transfektované hostitelské buňky se vyberou trypsinizací buňky po 2 dnech kultivace /trypsinizace znamená, že se na buňky působí 0,5 mg/ml sterilního trypsinu, který obsahuje 0,2 mg/ml ethylendiaminotetraoctové kyseliny/. Asi 3.10⁵ buněk se přidá klOmm deskám s tkáňovou kulturou se selektivním médiem. Pro buňky dhfr' se připraví médium /F-12 Gibco/ bez glycinu, hypoxanthinu athymidinu /GHT médium/. Pro hostitelské buňky DHFR⁺ se k normálnímu kultivačnímu médiu přidává methotrexát /100 až 1000 nM/. Kontroly se provádějí za transfekčních podmínek bez plazmidu nebo s plazmidem pFD-11 /Evropský patent č. 117 060A/, který obsahuje normální DHFR. Kolonie, které vzniknou z buněk, expresujících DHFR plazmid, jsou zřejmé během 1 až 2 týdnů. Identifikují se transformanty, které expresují nádorový nekrotický faktor.

Claims

1. Lidský nádorový nekrotický faktor, který

a) není glykosylován,

b) podle SDS-PAGE má molekulovou hmotnost 17 000,

d) podle SDS-PAGE je homologní, a

e) obsahuje:

i) aminokyselinovou sekvenci

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu

30 40

Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro

60 70

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

120

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

130 140

-36CZ 283149 B6

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile . 150

Ala Leu,

157 ii) aminokyselinovou sekvenci zbytků 35 až 66, uvedených pod i), iii) aminokyselinovou sekvenci zbytků 110 až 133, uvedených pod i), nebo iv) aminokyselinovou sekvenci Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro.

2. Lidský nádorový nekrotický faktor podle nároku 1, který má specifickou aktivitu větší než 10 milionů jednotek/mg proteinu.

3. Lidský nádorový nekrotický faktor podle nároku 1, který je vyčištěn do stupně, postačujícího pro sekvenování neporušeného nádorového nekrotického faktoru nebo jeho hydrolyzačního fragmentu trypsinem sekvenační Edmanovou degradací na sekvenátoru s vymrazovačem a s rotujícím kelímkem a s Polybrenem jako nosičem v sekvenačním kelímku.

4. Lidský nádorový nekrotický faktor podle nároku 1, který neobsahuje jiné cytotoxické proteiny.

5. Lidský nádorový nekrotický faktor podle nároku 1, který neobsahuje protein, který je vybrán ze skupiny, sestávající z lymfotoxinu, alfa-globulinů, serinových proteáz a interferonu.

6. Lidský nádorový nekrotický faktor podle nároku 1, který je lyofilizován.

7. Nádorový nekrotický faktor, který je schopen přednostně destruovat nádorové buňky nebo inhibovat jejich růst při srovnání s normálními buňkami za stejných podmínek a který obsahuje variantu sekvence aminokyselin 1 až 157, uvedených na obrázku 10, přičemž v místě uvnitř zbytků aminokyselin 35 až 66, 110 až 133 nebo 150 až 157, jak jsou uvedeny na obrázku 10, je alespoň jedna z těchto aminokyselin substituována, deletována nebo vložena.

8. Způsob výroby lidského nádorového nekrotického faktoru, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu

30 40

Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro

60 70

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

120

-37CZ 283149 B6

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

130 140

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile

150

Ala Leu,

157 izolací z prostředku, který obsahuje lidský nádorový nekrotický faktor a heterogenní směs znečišťujících proteinů, vyznačující se t í m , že zahrnuje stupně:

nanesení tohoto prostředku na alespoň jeden z následujících adsorbentů: oxid křemičitý, sklo s regulovanou velikostí pórů, alkylsepharosu nebo částice anexu s v podstatě stejnoměrnou velikostí částic, na němž se nádorový nekrotický faktor adsorbuje, a eluování adsorbovaného lidského nádorového nekrotického faktoru tak, že se získá izolovaný lidský nádorový nekrotický faktor.

9. Způsob výroby lidského nádorového nekrotického faktoru podle nároku 8, vyznačující se tím, že adsorbovaný lidský nádorový nekrotický faktor je eluován ethylenglykolem.

10. Způsob výroby lidského nádorového nekrotického faktoru podle nároku 8, vyznačující se tím, že se jako anex používá kvartemí aminovou skupinou substituovaný zesíťovaný polystyrénový anex.

11. DNA, kódující lidský nádorový nekrotický faktor, přičemž tato DNA nemá žádné intervenující nepřeložené sekvence a nádorový nekrotický faktor má aminokyselinovou sekvenci

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu

30 40

Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro

60 70

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

120

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

130 140

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile

150

Ala Leu,

157

12. DNA podle nároku 11, kterou je syntetická DNA.

-38CZ 283149 B6

13. DNA podle nároku 11, která je přítomna v replikovatelném vektoru.

14. DNA podle nároku 13, v němž vektor znamená plazmid nebo virus.

15. Buňka, transformovaná DNA podle nároku 11.

16. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje lidský nádorový nekrotický faktor a složku z buňky, která není buňkou člověka, který je fyziologicky přijatelný při podání pacientům, přičemž nádorový nekrotický faktor má tuto sekvenci aminokyselin:

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu

30 40

Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro

60 70

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

120

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

130 140

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile

150

Ala Leu,

157

17. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že se jako složka používá prokaryotický protein.

18. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje buňku, která obsahuje heterologní lidský nádorový nekrotický faktor, který má následující sekvenci aminokyselin:

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu

30 40

Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro

60 70

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

-39CZ 283149 B6

Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

120

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

130 140

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile

150

Ala Leu,

157

19. Prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že se jako buňka používá prokaryot nebo nižší eukaryot.

20. Prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje lidský nádorový nekrotický faktor podle nároku 1 spolu s fyziologicky přijatelným pufrem, aminokyselinou, neiontovým povrchově aktivním činidlem nebo jejich směsmi.

21. Prostředek, vhodný pro léčení nádorů, vyznačující se tím, že sestává z lidského neglykosylovaného nádorového nekrotického faktoru s molekulovou hmotností 17 000 na SDS-PAGE a z lidského interferonu.

22. Prostředek, vhodný pro léčení nádorů, podle nároku 21, vyznačující se tím, že se jako interferon používá gamainterferon.