JPH083061A - 腫瘍壊死因子含有組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 腫瘍壊死に有用な組成物を提供する。 【構成】 ヒト起源のものである腫瘍壊死因子及びγ−
インターフェロンを含有し、他の血漿性のタンパク質、
細胞、リンホトキシンを含まない組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はリンホカイン類に関す
る。更に詳しくは、本発明はリンパ細胞から分泌される
細胞毒性因子類、並びにそれを組換え細胞内で製造する
方法に関する。

【０００２】

【従来技術】Ｂ細胞、Ｔ細胞、天然のキラー細胞および
マクロファージ等の免疫細胞は、正常細胞にとっては無
毒であるが、腫瘍細胞に対しては細胞毒性作用を及ぼす
物質を産生することが知られている。これらの物質には
様々な名称、たとえばリンホトキシン、腫瘍壊死因子、
ＮＫ細胞細胞毒性因子、出血性壊死因子、マクロファー
ジ細胞毒素またはマクロファージ細胞毒性因子の如き名
称が付されている。現時点において、これらの名称の下
で示されるタンパク質は明確に同定されていない。それ
を困難ならしめている根本的な点は、これらのタンパク
質を検出するために利用される生物学的分析によって
は、これらを識別することができないこと、また、天然
に見出されるこれらタンパク質は凝集または加水分解産
物の形をとっているらしいこと、更に、これまでに得ら
れた量が余りに少く、タンパク質を完全に特徴づけるの
に必要とされる程度にまで精製することができなかった
こと、にある。

【０００３】一般にその様な細胞毒性物質は、免疫細胞
の増殖刺激物質であるとされている物質(ある種の「イン
ジューサー」)で処理された無傷(インタクト)の動物の血
清、あるいは同じく処理されたリンパ細胞またはセルラ
インの細胞培養物上清の中に見出される。処理後、血清
または上清を回収し、標的とする腫瘍セルライン(細胞
系統)に対する細胞毒性活性を測定する。標準的な標的
はネズミの腫瘍セルラインの、Ｌ−９２９である。この
種の型のバイオアッセイに用いられるセルライン、また
は他のセルラインは、それに対して明らかに別々のリン
パ細胞産物が溶解作用を示すことから、非特異的な溶解
応答性を有すると思われる、インビトロにおける腫瘍壊
死分析においても、同様に、非特異的応答が認められ
る。この様に、インビトロでの腫瘍細胞の溶解の観察、
およびインビボでの腫瘍壊死の観察に基く細胞溶解分析
法は、種々の細胞毒性リンパ球産物を識別するのには不
適当である。

【０００４】これまで、細胞毒性因子は、それが導かれ
るリンパ細胞に基いて、仮に分類されてきた。例えば、
リンホトキシンは、ＢまたはＴリンパ細胞からの細胞毒
性分泌物、あるいはそれらから得られるセルラインに付
される一般名であり、他方、腫瘍壊死因子は、マクロフ
ァージまたはそれから導かれるセルラインの細胞毒性分
泌物を表すのによく用いられる。しかしながら、この分
類システムでは、その名称が唯１個のタンパク質を表し
ている、あるいは、名称の異るタンパク質は、事実上異
なっている、ということが何ら保証されていない。

【０００５】各細胞型によって分泌される細胞毒性因子
を精製し、確認する試みがなされてきた。細胞毒性因子
の性質に関する報告が様々に異っている、または、それ
らが特定の性質に関して完全に食い違っているので、特
徴づけが誤っていたか、あるいは各細胞型から多数の別
個の細胞毒性因子が分泌されると結論することができ
る。例えば、マクロファージ、単球細胞または単球性セ
ルラインから導かれる細胞毒性産物は、時に腫瘍壊死因
子の名称で総括されるが、単一の細胞毒性産物について
の理論とは矛盾した性質を有していることが報告されて
いる。以下の文献例を参照されたい:Ｒ.マックファーラ
ン(Ｒ.Ｍac Ｆarlan)ら、１９８０、“ＡＪＥＢＡＫ"５
８(pt５):４８９−５００;Ｄ.マネル(Ｄ.Ｍannel)ら、
１９８０[インフェクション・アンド・イムノロジィ(Ｉ
nfection and Ｉmmunology)]３０(２):５２３−５３
０;Ｈ,オオニシ(Ｈ.Ｏhnishi)ら、英国特許出願２,１０
６,１１７Ａ;およびＪ.ハマーストロム(Ｊ.Ｈammerstro
m)１９８２「スカンＪ.イムノロ(Ｓcand Ｊ.Ｉmmuno
l．)」１５ ３１１−３１８。

【０００６】また、Ｃ.ザッハーチャック(Ｃ.Ｚacharch
uk)らは、モルモットのリンホトキシンとモルモットマ
クロファージから得られる細胞毒性因子は免疫学的に、
同一ではないが似通っていることを示唆している[１９
８３、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミイ・オブ・サイエンスイズ(プロナス)(Ｐroc.
Ｎat.Ａcad.Ｓci.)ＵＳＡ」８０:６３４１−６３４５]。
ラフ(Ｒuff)らも同様の結論に達している[リンホカイン
(Ｌymphokines)２巻pp２３５−２７２、pp２４１−２４
２]。

【０００７】免疫性細胞毒性因子の特徴づけは、免疫原
性抗原にさらされた動物の血清または腹水を出発物質と
して集中的に行われた。これらの供給源は単一のセルタ
イプまたはセルラインから得られる産物(類)とは対照的
に、緊張(ストレス)状態下にある免疫システムの蓄積物
の全てを含有している。これに関連する出版物の例を次
に挙げる:Ｓ.グリーン(Ｓ.Ｇreen)ら、１９８２「ジエイ
・ナト・カンサー・インスト(Ｊ.Ｎat.Ｃancer Ｉnst)」
６８(６):９９７−１００３[「腫瘍壊死−誘導因子(Ｔum
or necrosis inducing factor)」];Ｈ.エノモト(Ｈ.
Ｅnomoto)ら、ヨーロッパ特許出願８６４７５[「抗腫瘍
物質(antitumor substance)」]:Ｈ.エットゲン(Ｈ.Ｏet
tgen)ら、１９８０[「がん研究における最近の成果(Ｒec
ent Ｒesults Ｃancer Ｒes．)」]７５:２０７−２１
２[「腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)．」];Ｆ．
クル(Ｆ.Ｋull)ら、１９８１「ジャーナル・オブ・イム
ノロジィ(Ｊ.Ｉmmunol)」１２６(４):１２７９−１２８
３[「腫瘍細胞細胞毒素:」);Ｄ.マンネル(Ｄ.Ｍannel)
ら、１９８０「インフェクション・アンド・イムニティ
(Ｉnfection and Ｉmmunity)」２８(１):２０４−２１
１(「細胞毒性因子」);Ｎ.マシュー(Ｎ.Ｍatthews)ら、１
９８０「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・カンサー
(Ｂr.Ｊ.Ｃancer )」:４２ ４１６〜４２２(「腫瘍壊死
因子」);Ｓ.グリーン(Ｓ.Ｇreen)ら、１９７６「プロナス
(Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.)ＵＳＡ」:７３(２):３８１−
３８５(「血清因子」);Ｎ.サトミ(Ｎ.Ｓatomi)ら、１９８
１、「ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディソン(Ｊpm Ｊ.Ｅxp.Ｍed.)」５１(６):
３１７−３２２;Ｎ.マシュース(Ｎ.Ｍathews)１９７９
「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・カンサー(Ｂr.
Ｊ.Ｃancer )」４０:５３４−５３９(「腫瘍壊死因子」);
Ｋ.ハラナカ(Ｋ.Ｈaranaka)ら、１９８１「ジャパニーズ
・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディソ
ン」５１(３):１９１−１９４(「腫瘍壊死因子」;および
Ｌ.オールド(Ｌ.Ｏld)ら、ヨーロッパ特許出願９０８９
２;Ｔ.ウメダ(Ｔ.Ｕmeda)ら、１９８３「細胞および分子
生物学(Ｃellular and Ｍolecular Ｂiology)」２９
(５):３４９−３５２;およびＨ.エノモトら、１９８３
ヨーロッパ特許出願８６,４７５。

【０００８】その他の参照文献として、Ｊ.ニッセン−
メイヤー(Ｊ.Ｎissen−Ｍeyer)ら、１９８２「感染と免
疫(Ｉnfection and Ｉmmunity)」３８(１):６７−７
３;Ｊ.クロスターガード(Ｊ.Ｋlostergaard)ら、１９８
１「モレキュラー・イムノロジィ(Ｍol.Ｉmmunol)」１８
(１２):１０４９−１０５４;Ｎ.スラーネ(Ｎ.Ｓloane)
ら、アメリカ特許４,３５９,４１５;およびＨ.ハヤシ
(Ｈ.Ｈayashi)ら、アメリカ特許４,４４７,３５５;Ｋ.
ハナマカ(Ｋ.Ｈanamaka)ら、１９８３、ヨーロッパ特許
出願９０,８９２;およびＧ.グランガー(Ｇ.Ｇranger)
ら、１９７８「セルラー・イムノロジィ(Ｃellular Ｉm
munology)」３８:３８８−４０２。

【０００９】ヨーロッパ特許出願公開番号１００６４１
には、実質上ヒト−リンパ芽球様細胞培養に起因する不
純物を含まない様に精製された細胞毒性ポリペプチドに
関する記載がある。このポリペプチドは、これと、他の
文献記載のリンホトキシンの名前を有するポリペプチド
との関係は推測の域を出ないが、リンホトキシンと命名
された。このポリペプチドが、ザッハチャックら(同上)
の示唆した、免疫細胞によって生成される単独の細胞毒
性ポリペプチドであるか、または、それが細胞毒性因子
の潜在ファミリィの一員であるのかはわかっていない。

【００１０】上記１００６４１出願のポリペプチドは２
つのアミノ末端を有しており、大きい方の変異型のアミ
ノ末端は、Ｌeu Ｐro Ｇly Ｖal Ｇly Ｌeu Ｔhr
Ｐro Ｓer Ａla Ａla Ｇln Ｔhr Ａla Ａrg
Ｇln Ｈis Ｐro Ｌys Ｍet Ｈis Ｌeu Ａla Ｈ
is Ｓer Ｔhr ．．．．であり、小さい方の変異型の
アミノ末端はＨis Ｓer Ｔhr Ｌeu Ｌys Ｐro Ａ
la Ａla ．．．の如く先端を切断されている。

【００１１】先行文献によると、いくらかの抗腫瘍活性
を示し、Ａla Ａla アミノ末端を有するが、その特徴
づけが殆んどなされていないタンパク質であるインター
フェロン(イギリス特許出願公開番号２,１１７,３８５
Ａ)が、非−リンホトキシン細胞毒性因子の候補者とさ
れている。明らかに、本発明の腫瘍壊死因子はインター
フェロンでもリンホトキシンでもなく、またＡla Ａla
アミノ末端を有していない。

【００１２】本発明の目的は、(a)リンホトキシン以外
の腫瘍壊死因子が存在するか否かを確定すること、およ
び、もし存在するならば、それを、他の同様の因子類と
明瞭に区別し得る方法で同定する;(b)その様な因子を、
誘導細胞培養(多額の経費を要し、生産物は誘導用の試
薬で汚染されている)または末梢血管リンパ球の誘導(経
済上、非実用的であり、再生産性に乏しく、得られる産
物はホモローガスな細胞や血漿タンパク質で汚染されて
いる)以外の方法で生産する;(c)その様な腫瘍壊死因子
をコードしているＤＮＡを得、該ＤＮＡを組換え培養中
で発現させる;(d)その様な因子を組換え培養中で成熟な
形で発現させる;(e)その様な因子の暗号配列または構造
を改良する;(f)その様な因子を治療用投与剤形に製剤化
し、それを、腫瘍の治療のために、動物に投与する;そ
して(g)その様な因子に関連した診断用試薬を製造する
ことにある。

【００１３】要約 本発明者らは、細胞毒性因子をホモジーニティ(同質)な
程度にまで精製し、特徴付けを行い、組換え培養内で発
現させることに成功した。便宜上、この因子を腫瘍壊死
因子(ＴＮＦ)と称することとし、その定義を後述する。
この物質は細胞培養から、非活性約１０⁷単位／タンパ
ク質mg以上、通常約１０⁸単位／mg以上を示すものとし
て実質上、ホモジーニアス(同質の)な形で得られる。

【００１４】組換え培養内で生成されたヒト腫瘍壊死因
子は、該腫瘍壊死因子と一緒に患者に投与されても、そ
の性質および量において生理学的に許容し得るものであ
る非−ヒト細胞成分(タンパク質を含む)を含んでいるこ
とを特徴とする。通常、これらの成分は、酵母、原核細
胞およびより高等な非−ヒト真核細胞に由来し、重量比
で約１％以下の、不純物含有量として無毒な程度に存在
している。更に、組換え細胞培養によって、ホモローガ
スな(同質の)タンパク質を全く含まない腫瘍壊死因子を
生産することができる。ホモローガスなタンパク質と
は、天然に見出される如く、正常な状態で、腫瘍壊死因
子に伴なっているタンパク質であり、例えば、細胞内で
の細胞分泌物または体液等である。ヒト腫瘍壊死因子に
とってホモローガスなタンパク質の１例はヒト血清アル
ブミンである。ヘテロローガスな(異質の)タンパク質と
は逆に、天然状態では問題の腫瘍壊死因子に随伴せず、
あるいはそれと一緒に見出されることのないタンパク質
である。

【００１５】本発明に係るＤＮＡには腫瘍壊死因子がコ
ードされており、組換えまたは形質転換培養中で発現し
たとき、夥しい量の腫瘍壊死因子を与える。このＤＮＡ
は、誘導された単球性(モノサイティック)セルラインか
らのmＲＮＡの逆転写によって得られたcＤＮＡであり、
イントロンを含まず、また、mＲＮＡの供給源である生
物の、他のタンパク質をコードしている非翻訳領域を全
く含んでいない、新規なＤＮＡである。

【００１６】ＴＮＦをコードしている染色体ＤＮＡは、
ゲノムＤＮＡライブラリィをcＤＮＡでプローブするこ
とにより、得ることができる。染色体ＤＮＡは他のタン
パク質をコードしている非翻訳領域を含まないが、イン
トロンは含んでいるであろう。

【００１７】単離した腫瘍壊死因子はヌクレオチドの置
換、欠失または挿入によって容易に修飾され、腫瘍壊死
因子またはその誘導体をコードしている新規なＤＮＡ配
列を与える。これらの修飾を施されたＤＮＡ配列(改良
配列)は、突然変異腫瘍壊死因子の生産、及び成熟腫瘍
壊死因子の直接的な発現のために用いられる。改良配列
は、選択された宿主−ベクター系における腫瘍壊死因子
の発現の促進にとっても有用である(例えば、宿主細胞
に好都合なコドンと適応すべく修飾する)。

【００１８】これらの新規なＤＮＡ配列およびそのフラ
グメントをラベルし、腫瘍壊死因子をコードしている遺
伝物質のハイブリダイゼーション・アッセイに用いるこ
とができる。

【００１９】腫瘍壊死因子を合成するには、腫瘍壊死因
子をコードしているＤＮＡを複製可能な(再生産性の)ベ
クターにライゲートし、このベクターを用いて宿主細胞
を形質転換し、この宿主細胞を培養してその培養から腫
瘍壊死因子を回収する。この一般工程を用い、ベクター
の組立て方および形質転換に用いる宿主の選択に応じ
て、単球性腫瘍壊死因子の特徴を有する腫瘍壊死因子を
組立てたり、腫瘍壊死因子の新規な誘導体を組立てるこ
とができる。本発明に従って合成し得る腫瘍壊死因子種
(species)には、成熟腫瘍壊死因子[バリル(バリン)アミ
ノ末端)、プレ腫瘍壊死因子(本明細書中で定義する「プ
レＴＮＦ」)並びに以下のＴＮＦ誘導体:(a)ＴＮＦまたは
そのフラグメント(成熟腫瘍壊死因子を含む)と他のタン
パク質またはポリペプチドとが、ＴＮＦまたはそのフラ
グメントのアミノおよび／またはカルボキシ末端におい
て、ペプチド結合を介して結合している融合タンパク
質;(b)ＴＮＦフラグメント(成熟腫瘍壊死因子またはプ
レＴＮＦのフラグメントを含む)であって、そのフラグ
メントのアミノ末端が何らかのプレタンパク質やアミノ
酸である様なＴＮＦフラグメント;(c)１またはそれ以上
のアミノ酸残基が置換、挿入または欠失されているＴＮ
Ｆ突然変異体またはそのフラグメント(成熟腫瘍壊死因
子を含む);および／または、(d)上記タンパク質、フラ
グメントあるいは突然変異体のアミノ末端に、メチオニ
ルまたは修飾されたメチオニル(メチオニル誘導体、例
えばホルミルメチオニルあるいは保護されたメチオニル
種)が付加することにより得られる物質が含まれる。

【００２０】通常、哺乳類細胞を(a)腫瘍壊死因子の全
構造遺伝子(５'開始コドンを含む)あるいは(b)真核性分
泌リーダー(これには、腫瘍壊死因子分泌リーダーのプ
レ配列を含んでいてよい)と機能的にライゲート(結合)
している、成熟腫瘍壊死因子または腫瘍壊死因子誘導体
の遺伝子を含有するベクターによって形質転換し、この
細胞を培養した後、該培養から成熟腫瘍壊死因子を回収
する。

【００２１】同様に、形質転換すべき宿主(通常、これ
はリーダー配列の供給源である)によって適切にプロセ
ス(処理)される分泌リーダーと機能的にライゲートして
いる場合に、この宿主をベクターで形質転換して培養す
れば、アミノ末端にメチオニルあるいは保護されたメチ
オニルを有しない腫瘍壊死因子が合成される。特に、成
熟腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡの５'と、ＳＴ
ＩＩエンテロトキシンシグナルポリペプチドをコードし
ているＤＮＡとがライゲートしているベクターによって
形質転換された大腸菌(Ｅ.coli)は、ハイブリッド−プ
レタンパク質を高い比率で適切にプロセスし、成熟腫瘍
壊死因子を与える。分泌リーダーおよび宿主細胞はま
た、成熟タンパク質を細胞壁周囲(ペリプラズマ)に適切
に移行させるべく選択される。

【００２２】アミノ酸配列の変化またはグリコシル化以
外による腫瘍壊死因子誘導体もまた本発明の範囲内に含
まれる。その様な誘導体は、化学的な部分に対し、共有
(コバレント)結合的または集合(アグリゲート)的に結合
している。これらの誘導体は、一般に３つのクラスに分
けることができる:塩、側鎖および末端残基の共有結合
的修飾物、および吸着コンプレックス。

【００２３】もしも成熟腫瘍壊死因子をコードしている
ＤＮＡがベクター内に機能的にライゲートしているなら
ば、このベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、この
細胞を培養すると、この細胞の細胞質内に成熟腫瘍因子
が見出される。従って、成熟腫瘍壊死因子を得るために
分泌系を配慮する必要がない。これは、普通ならば、直
接発現によって得られるタンパク質はメチオニル化され
たタンパク質であることから、驚異的な事柄である。そ
の上、このタンパク質は組換え宿主細胞培養内で安定か
つ可溶性である、即ち、これは、細胞内プロテアーゼ
(タンパク分解酵素)によりタンパク分解的に開裂された
り、屈析性物質として沈降したりすることがない。従っ
て、本発明は下等な真核細胞または原核細胞であって、
その細胞質にメチオニル化されていない成熟腫瘍壊死因
子を含有している細胞からなる新規な発酵物質を提供す
るものである。

【００２４】腫瘍壊死因子は動物のセルライン[例えば
４−β−ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセ
テート(ＰＭＡ)の存在下で増殖させて誘導した単球性セ
ルラインあるいはハイブリドーマまたはＥＢＶ形質転換
細胞(アメリカ特許４,４６４,４６５)の如き不死のセル
ライン]を培養することによって製造することができる
が、以下に述べる如く、組換え細胞培養を用いて合成す
ることが好ましい。

【００２５】腫瘍壊死因子が発酵によって製造されたな
らば、通常、培養液上清または細胞溶解液上清を回収し
て固型物質を除去し、この上清混合物(腫瘍壊死因子と
他のタンパク質を含む)中の腫瘍壊死因子を疎水性物質
に吸着させ、該物質から腫瘍壊死因子を溶離し、次いで
腫瘍壊死因子を三級アミノ陰イオン交換樹脂に吸着さ
せ、該樹脂から腫瘍壊死因子を溶離し、更に腫瘍壊死因
子を実質上均一な粒径の陰イオン交換樹脂(好ましくは
四級アミノ−置換樹脂)に吸着させ、該樹脂から腫瘍壊
死因子を溶離することにより、精製する。所望により、
この腫瘍壊死因子組成物は、その精製過程の任意の段階
で、例えば等電点泳動法の如きクロマトフォーカス法や
セファデックスＧ−２５の如きふるいゲルを通す方法等
によって濃縮および精製される。

【００２６】組換え細胞培養または誘導細胞培養から精
製された腫瘍壊死因子は、治療に用いるために生理学的
に無毒な安定剤および賦形剤と一緒にし、投薬ビン内で
凍結乾燥して投与剤形に製剤化したり、安定化された水
性製剤中で保存しておく。あるいは、腫瘍壊死因子をポ
リマー・マトリックスに組み込み、腫瘍そのもの、ある
いは腫瘍切除術後の外科的部位に植え込み、該腫瘍壊死
因子が局所的に高い濃度勾配で好機に放出される様にす
ることもできる。

【００２７】本発明の組成物は、リンホトキシンおよび
インターフェロン、その他文献記載の細胞毒性タンパク
質を含まない状態で得られる。しかしながら、治療に用
いる際には、予め定めた量のリンホトキシンおよび／ま
たはインターフェロンと一緒に腫瘍壊死因子を用いるの
が良い。腫瘍壊死因子とγ−インターフェロン等のイン
ターフェロンを含む組成物は、それらが相乗的な細胞毒
活性を現すことが知られているので、特に有用である。

【００２８】腫瘍壊死因子組成物は、動物、特に悪性腫
瘍に罹患している患者に対してその治療有効量を投与さ
れる。治療に好適な用量は治療に携わる関係者にとって
は自明であり、詳細については後述する。

【００２９】図面についての説明 図１は調節多孔性ガラスからの腫瘍壊死因子の溶離像を
示す。図２はジエチルアミノエチルセルロースからの腫
瘍壊死因子の溶離像を示す。図３は高速タンパク質液体
クロマトグラフィーからの腫瘍壊死因子の溶離像を示し
ている。図４はクロマトフォーカシングにおける腫瘍壊
死因子の溶離像を示している。図５はＳＤＳ ＰＡＧＥ
ゲル電気泳動で求めた腫瘍壊死因子の分子量を示してい
る。図６は腫瘍壊死因子の分子量を示すＨＰＬＣ溶離像
である。図７はＨＰＬＣ Ｃ４カラムからの腫瘍壊死因
子の溶離像を示している。図８は腫瘍壊死因子のトリプ
シン消化フラグメントのＨＰＬＣによる分離状態を示す
グラフである。図９はγ−インターフェロンと腫瘍壊死
因子との混合物の細胞毒性作用を示している。図１０は
全腫瘍壊死因子分泌リーダーを含む、プレ−ヒト腫瘍壊
死因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示してい
る。図１１はヒト腫瘍壊死因子の発現ベクターの組立て
模式図である。

【００３０】詳しい記述 本明細書中、腫瘍壊死因子という物質は、好ましい細胞
毒性活性を有する、リンホトキシン以外のポリペプチド
であって、図１０に示した成熟腫瘍壊死因子のアミノ酸
配列と機能的なアミノ酸ホモロジィ(相同性)を示す領域
を持つポリペプチド、またはそのフラグメント、あるい
はそれらポリペプチドまたはフラグメントの誘導体を対
象とするものと定める。

【００３１】好ましい細胞毒性活性とは、同一条件下で
の正常細胞との比較において、腫瘍細胞を好都合に破壊
し、またはその増殖を阻害する活性をいう。好ましい細
胞毒性活性は、インビボまたはインビトロにおいて、ポ
リペプチドの腫瘍細胞に対する作用を、正常細胞または
正常組織に対する作用と比較することにより、検出され
る。細胞溶解作用は通常、インビトロで得られる診断上
の指針であり、腫瘍壊死はインビボにおいて経験的に診
断される指針である。しかしながら、細胞毒性活性は静
細胞(cytostasis)活性または抗増殖活性として発現する
こともある。好適なアッセイ(分析)システムは良く知ら
れている。例えば、腫瘍壊死因子の比活性を測定するた
めの細胞溶解分析は、次の文献に記載されている分析法
で行うことができる:Ｂ.アガーワル(Ｂ.Ａggarwal)ら、
「胸腺ホルモンとリンホカイン(Ｔhymic Ｈormons and
Ｌymphokines)」１９８３ Ａ.ゴールドスタイン(Ａ.
Ｇoldstein)編、スプリングシンポジウム・オン・ヘル
スサイエンスイズ(ＳpringＳymposium on Ｈealth
Ｓciences)ジョージワシントン大学メディカルセンター
(この文献中で言及されているＡ５４９セルラインは、
ＡＴＣＣから、ＣＣＬ１８５の下で入手可能である)。

【００３２】本明細書中では、ＴＮＦの比活性を静細胞
作用ではなく、標的細胞に対する溶解作用を意味するも
のとする。腫瘍壊死因子１単位を、実施例１に示す如
く、各ウエルに入れた標的細胞の内、５０％を溶解させ
るのに必要な量と定義する。しかしながら、このことは
他の比活性測定法、例えば標的細胞の増殖速度に基く方
法等を排除することを意味するものではない。

【００３３】プレＴＮＦは、前記の腫瘍壊死因子に関す
る定義内に包含される腫瘍壊死因子種である。この物の
特徴は、分子内に、転写された後、タンパク質を細胞の
内、あるいは外のいずれに存在せしめるかの指令を行う
機能を有する、シグナル(またはリーダー)ポリペプチド
を有することにある。一般に、シグナルポリペプチド
(それ自身は本来、腫瘍壊死因子活性を有することを要
しない)は、タンパク質を宿主細胞のペリプラズマ(細胞
壁外)あるいは培地に移行させる過程において、即ち分
泌プロセスの一行程において、腫瘍壊死因子活性を有す
る残余タンパク質からタンパク分解的に切り離される。
このシグナルペプチドは微生物起源であっても哺乳動物
起源(固有の、７６残基から成るプレ配列を含む)であっ
ても良いが、宿主細胞とホモローガスなシグナルである
ことが好ましい。

【００３４】正常な生物学的供給源から得られる固有の
腫瘍壊死因子は、後述の如くドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)に基
く分子量の測定値が約１７,０００であり、等電点が約
５.３であって、複数のトリプシン加水分解感受性部位
を有している。後述の条件下、逆相ＨＰＬＣで精製され
た固有の腫瘍壊死因子はトリプシンによって少くとも９
つのフラグメントに加水分解される。トリプシンによる
加水分解で腫瘍壊死因子が正確にいくつかのフラグメン
トに分れるかは、トリプシンの活性、腫瘍壊死因子の濃
度並びにイオン強度、pＨ、温度およびインキュベーシ
ョン時間等のインキュベーションパラメーターによって
左右される。

【００３５】腫瘍壊死因子は、レクチンアフィニティカ
ラムに保持されず、また、推定アミノ酸配列分析におい
て何ら、グリコシル化部位と思われる部位が認められな
いことから、糖タンパク質ではないと思われる。また、
組換え大腸菌培養(グリコシル化機能を有しない)におけ
る生産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、天然のＴＮＦ
と共−泳動(co−migrate)する。

【００３６】ある候補タンパク質が本発明に係る腫瘍壊
死因子の定義の範囲内に含まれるのに必要なアミノ酸配
列上のホモロジィの程度は、該タンパク質と腫瘍壊死因
子とのホモロジィ部分が腫瘍壊死因子の細胞毒性活性に
係る領域内にあるか否かによって左右される;前の定義
内に含まれるためには、細胞毒活性に臨界的な領域での
ホモロジィ度は高くなければならないが、腫瘍壊死因子
のコンホメーションの維持に関与しない配列や受容体と
の結合に影響しない配列の場合に要求されるホモロジィ
度はもっと近くなる。また、臨界的な領域は、それが、
機能的に類似であるアミノ酸側鎖を含む残基で置換され
ている場合には細胞毒性活性を示し、本明細書で定義し
たホモローガスの範囲に止まる。機能的に類似、とは、
側鎖の主な性質、例えば塩基性、中性または酸性、ある
いは立体的な大きさを有するか否か、等に関して言う。
ただし、本明細書で定義される腫瘍壊死因子からは、特
にリンホトキシンは、除外される。

【００３７】通常、腫瘍壊死因子は図１０に示すタンパ
ク質またはそのフラグメントと、約２０〜１００アミノ
酸残基からなる連続したブロック(範囲)(特に、残基３
５−６６および１１０−１３３に囲まれたブロック内の
アミノ酸残基)にわたって実質上ホモローガスな領域を
含有している。

【００３８】あるポリペプチドを腫瘍壊死因子であると
同定する上で最も重要なファクターは、図１０に示す成
熟腫瘍壊死因子の細胞毒性活性を実質上中和し得る抗血
清が、その問題のポリペプチドの細胞毒性活性を実質上
中和することができる、という点にある。しかしながら
免疫学的な同一性と細胞毒性上の同一性とは必ずしも同
一枠内にあるわけではない。ということは明らかであろ
う。図１０の腫瘍壊死因子の中和抗体は、たまたま、そ
の抗体が腫瘍壊死因子の細胞毒性活性にとって臨界的な
部位と特異的に結合すべく形成されていないという理由
で腫瘍壊死因子の候補タンパク質と結合しないかもしれ
ない。むしろ、この中和抗体は、非活性な領域に結合
し、立体障害を介して中和効果を現わしているのかもし
れない。従って、この非活性な(無害な)領域に突然変異
を生じた候補タンパク質は最早中和抗体と結合しない
が、それにも拘らず、実質上ホモロジィという定義、お
よびその生物学的活性という意味において、腫瘍壊死因
子である。

【００３９】末梢リンパ球培養または確立されているセ
ルライン培養から得られた、図１０に示される固有のま
たは野生型の成熟ヒト腫瘍壊死因子に関する特徴、例え
ば分子量、等電点等の値は、単にこれら固有の腫瘍壊死
因子について示される値にすぎないということを知って
おくことが重要である。既にその定義について考慮した
如く、腫瘍壊死因子には、固有の腫瘍壊死因子の特徴の
全てを現わすわけではない、他の種のポリペプチドも含
まれる。本明細書中で定義した腫瘍壊死因子には、固有
の腫瘍壊死因子が含まれるが、その他の関連する細胞毒
性ポリペプチドも該定義内に含まれる。例えば、前記の
如き、ＴＮＦの挿入による突然変異体、欠失による突然
変異体、あるいは融合タンパク質等のＴＮＦ誘導体とし
ての腫瘍壊死因子の分子量は固有のヒト腫瘍壊死因子に
関して確立されている分子量の範囲外になるであろう
(成熟腫瘍壊死因子との融合タンパク質またはプレＴＮ
Ｆそのもの、並びに挿入突然変異体の分子量は固有の成
熟腫瘍壊死因子のそれよりも大きく、他方、固有の成熟
腫瘍壊死因子の欠失による突然変異体の分子量はより小
さい)。同様に、腫瘍壊死因子を工作してトリプシン等
のタンパク分解酵素による加水分解を受け難くすること
もできる。最後に、ヒト−プレＴＮＦが霊長類以外の哺
乳動物に由来するセルライン内で翻訳後のプロセッシン
グを受けると、アミノ末端領域に微妙な不均一性が生
じ、アミノ末端のアミノ酸はバリンでなくなる。

【００４０】cＤＮＡから推定されるヒト腫瘍壊死因子
のアミノ酸配列を図１０に示した。成熟または固有の腫
瘍壊死因子は、アミノ酸残基１〜１５７で表わされる。
この配列には、翻訳された転写物が正常にプロセッシン
グされて成熟タンパク質となる間に除去されると思われ
る７６残基のシグナル配列が含まれていることに注意さ
れたい。トリプシンで加水分解される部位を矢印で示し
た。

【００４１】“細胞毒活性を有する"あるいはインビボ
における“腫瘍壊死作用を有する"という語句は、腫瘍
壊死因子という言葉が、例えば酵素的加水分解を受け
て、酵素原に似た不活性な形から、所望の生物学的活性
を現わすポリペプチドフラグメントに転換され得るポリ
ペプチドをも包含している、ということを意味するもの
であることに注目されたい。不活性な前駆体の代表例
は、腫瘍壊死因子のカルボキシ末端に、ヒトタンパク質
またはそのフラグメントがペプチド結合を介して結合し
ている融合タンパク質である。インビボで、あるいは製
造工程の一段階での、タンパク分解的加水分解を受け易
くすることにより、腫瘍壊死因子を放出させるために、
このペプチド結合またはその近くの配列を選択する。こ
の様にして生成された腫瘍壊死因子は、明確な、所望の
細胞毒活性を現わす。

【００４２】通常、腫瘍壊死因子とはヒト−腫瘍壊死因
子を表わすが、ネズミ、ブタ、ウマまたはウシの様な他
の供給源から得られた腫瘍壊死因子も、それが、ホモロ
ーガス領域および生物学的活性に関して述べた前の基準
に合致する限り、腫瘍壊死因子の定義内に含まれる。Ｔ
ＮＦは種特異的でなく、例えばヒト−ＴＮＦはマウスの
腫瘍に対して活性である。従って、ある種から得たＴＮ
Ｆを他の種の治療に用いることができる。

【００４３】腫瘍壊死因子には重合形も含まれる。腫瘍
壊死因子は自然に凝集し、通常、二量体またはそれ以上
のマルチマーに重合する。マルチマーは細胞毒性を有す
るのでインビボでの治療に用い得る。腫瘍壊死因子は、
実質上均質なマルチマー、またはモノマーとして発現さ
せ、回収することが好ましいが、腫瘍壊死因子は、種々
のマルチマーの混合物としても治療上有用である。

【００４４】腫瘍壊死因子の誘導体も腫瘍壊死因子とい
う語句の範囲内に含まれる。これら誘導体には、アミノ
酸配列における突然変異体、グリコシル化変異体、並び
に他の化学的物質との共有結合的または凝集(集合)的な
結合に基く誘導体が含まれる。共有結合的誘導体は、機
能を有する物質と、ＴＮＦアミノ酸側鎖に見出される
基、あるいはＮ−またはＣ−末端とを、当業者周知の方
法で結合させることにより、得られる。この様な誘導体
の例を次に示す:ＴＮＦのカルボキシ末端またはカルボ
キシ側鎖を有する残基(例えばasp１０)の脂肪族エステ
ルまたはアミド誘導体;ser５２、ser３、ser４またはse
r５等のヒドロキシ含有残基のＯ−アシル誘導体;アミノ
末端アミノ酸またはアミノ基含有残基(例えばリジンま
たはアルギニン)のＮ−アシル化誘導体;並びにcys１０
１およびcys６９の誘導体。アシル基をアルキル基(Ｃ３
〜Ｃ１０直鎖アルキルを含む)の内から選択することに
より、アルカノイル種を得、または炭素環状あるいは異
項項状化合物から選択することにより、アロイル種を得
る。反応に用いる基は、反応性の側鎖グループを介して
タンパク質を交差結合させ、不溶性のマトリックス構造
を形成させ得ることが自体既知である二機能性化合物で
あることが好ましい。その様な誘導体を生成させるのに
好ましい残基部位はシステインおよびヒスチジン残基で
ある。

【００４５】共有結合または凝集反応誘導体はイムノア
ッセイまたはアフィニティ精製法に用いることができ
る。例えば、腫瘍壊死因子を臭化シアン−活性化セファ
ロースと自体既知の方法で共有結合的に結合させて不溶
化するか、あるいはポリオレフィン表面(グルタルアル
デヒド交差結合を持つまたは持たない)に吸着させるこ
とにより不溶化し、抗−ＴＮＦ抗体または細胞表面受容
体の分析または精製に用いる。また、腫瘍壊死因子を診
断分析、特に競合型イムノアッセイによって生物学的試
料中のＴＮＦレベルを測定する診断分析法に用いるため
に、例えば、クロラミンＴ法によって放射性沃素化す
る、希土類キレート化合物と共有結合させる、あるいは
別の蛍光成分と結合させる、等の方法で標識する。この
様な誘導体に要求されるのは抗−ＴＮＦとの交差反応性
のみであって、細胞毒活性を示す必要がないので、本発
明のＴＮＦの定義に該当しなくてもよい。

【００４６】突然変異による腫瘍壊死因子誘導体には予
め定められた、即ち部位特異性の、ＴＮＦまたはそのフ
ラグメントの突然変異誘導体が含まれる。突然変異誘発
の目的は、前記の定義に従う腫瘍壊死因子を得ること、
即ち、インビトロにおいて、腫瘍細胞に対する細胞毒作
用を、そしてインビボにおいては腫瘍壊死作用を現わ
し、図１０に示した配列とホモロジィな残基を保持する
ものであって、更に改良された特性および活性を有する
腫瘍壊死因子を得ることにある。突然変異腫瘍壊死因子
は、欠失、置換または挿入の結果、腫瘍壊死因子と異な
るアミノ酸配列を有しているが、そうでなければ本明細
書中に記載の腫瘍壊死因子のホモロジィに関する定義に
含まれる物質であると定義する。例えば、腫瘍壊死因子
のリジンまたはアルギニン残基(アルギニン２,６,８２,
４４および１３１、リジン９８,９０および６５)を、ヒ
スチジン等の、上記タンパク質をタンパク分解的加水分
解され難くするアミノ酸残基で置換する。同様に、酸化
に対する安定性を得るために、システイン１０１を他の
残基で置換して化学的に交差結合させることもできる。
生物学的には不活性な突然変異体であっても、イムノア
ッセイにおける試薬として標識したり固定化する上では
有用であるという理由から、突然変異体は、腫瘍壊死因
子として必要な活性を必ずしも有していなくて良い。し
かしながら、この様な場合には、この突然変異体は腫瘍
壊死因子に対する抗体と交差反応し得る抗原決定基を少
くとも１個保持していることが必要である。

【００４７】腫瘍壊死因子の分子領域中、残基３５〜６
６および１１０〜１３３(これらの数値を含む)の範囲は
リンホトキシンと実質上ホモロジィ(５０％)である。こ
れら両分子の疎水性のカルボキシ末端(腫瘍壊死因子の
１５０〜１５７残基)もまた、重要な保存的配列であ
る。これら両タンパク質は細胞毒活性および生体内腫瘍
壊死作用を示すので、上記の領域はリンホトキシンと腫
瘍壊死因子とに共通の活性にとって重要な部分であると
考えられている。従って、特定の細胞に対する腫瘍壊死
因子活性に、直接的な影響を及ぼすことを目的とする場
合には、これらの領域内の残基に突然変異を誘発するこ
とが好ましい。相対的に非保存的な領域である腫瘍壊死
因子の残基６７−１０９は、それを囲む相対的にホモロ
ーガスな両領域を細胞毒活性にとって不可欠なコンホメ
ーションをとる様、正しく位置させる機能を有している
のかもしれない。その様な位置決めは腫瘍壊死因子のＣ
ys６９−Ｃys１０１ジスルフィド結合によってなされて
いると思われ、リンホトキシンにおいても同様に、対応
する領域でなされているであろうが、この位置決めが、
両分子の特異性および活性における相違に関与している
のかもしれない。この様に、これらの残基が腫瘍壊死因
子の活性中心(核)であると仮定されるので、それらを化
学合成するか欠失による突然変異を誘発することによ
り、腫瘍壊死因子活性を有する切断された、鎖長の短い
ポリペプチドを得ることができる。

【００４８】突然変異誘発部位は予め定めておくが、突
然変異そのものを予め定めておく必要はない。例えば１
３１位での突然変異を適切に行うためには、アルギニン
１３１に関するコドンに無作為な変異誘発を行い、発現
された腫瘍壊死因子突然変異体を、細胞毒活性とタンパ
ク分解酵素耐性の適当な組合わせについてスクリーニン
グする。既知の配列を有するＤＮＡの予定の部位で置換
突然変異を誘発する方法はよく知られている(例、Ｍ１
３プライマー突然変異誘発)。

【００４９】腫瘍壊死因子の突然変異誘発は、通常、ア
ミノ酸残基数約１〜１０程度の挿入、または約１〜３０
残基の欠失が含まれる。置換、欠失、挿入、またはそれ
らの併用、等を組合わせて最終的な組立てを行う。挿入
には、アミノ末端またはカルボキシ末端の融合、例えば
カルボキシ末端に疎水性の延長部分を付加すること、も
含まれる。しかしながら、置換的突然変異誘発だけを行
うことが好ましい。言うまでもなく、暗号ＤＮＡ内にお
ける突然変異は、その配列をリーディングフレーム外に
位置せしめるようなものであってはならず、また、mＲ
ＮＡの二次構造を形成させる可能性のある相補領域をつ
くらないことが好ましい。

【００５０】腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡに於
ける突然変異の全てが最終的な分泌生産物として発現さ
れるわけではない。例えば、置換型のＤＮＡ突然変異体
の主なものは、固有のヒト分泌リーダーが、そのリーダ
ー配列内での欠失、または置換のいずれかによって異る
分泌リーダーまたはシグナルで置き換えられ、固有のリ
ーダー配列の全部または大部分が所望の宿主によって一
層認識され易いリーダーに変化されたものである。例え
ば、原核性の発現ベクターを組立てるには、ヒト分泌リ
ーダーを細菌性のアルカリ性ホスファターゼまたは熱安
定性エンテロトキシンＩＩリーダーに有利な様に欠失さ
せ、酵母のための発現ベクターを組立てるには、リーダ
ー配列を酵母インバターゼ、アルファ因子、または酸ホ
スファターゼ・リーダーに好都合な様に置換する。しか
しながら、ヒト分泌リーダーはヒトセルライン以外の宿
主によっても認識されるが、高等な真核細胞の細胞培養
内で最もよく認識される。宿主によって分泌リーダーが
“認識"されると、通常、腫瘍壊死因子とリーダーから
なる融合タンパク質はリーダー−腫瘍壊死因子間のペプ
チド結合の位置で切り開かれ、ついに、腫瘍壊死因子が
分泌される。この様に、宿主の形質転換に突然変異プレ
ＴＮＦ ＤＮＡを用いても、そして、この突然変異プレ
ＴＮＦが中間体として合成されたものであっても、得ら
れる腫瘍壊死因子生産物は、通常、固有の成熟腫瘍壊死
因子である。

【００５１】腫瘍壊死因子誘導体として発現されないも
う一つの主要なＤＮＡ突然変異体は、発現を促進する様
にヌクレオチド置換を行なうものであり、それは、主と
して転写されたmＲＮＡ内でアミノ末端ループ構造が生
じることを避ける(同時出願係属中のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.３０
３,６８７号参照)か、あるいは選択した宿主内で、より
転写され易いコドンを与える(例えば、大腸菌内で発現
させるには、よく知られている大腸菌にとって好ましい
コドンがある)ためにヌクレオチド置換を行なうもので
ある。

【００５２】実質的にホモジーニアスな腫瘍壊死因子と
いう語句は、実質上、この腫瘍壊死因子が単離された供
給源に固有の他のタンパク質を含まない腫瘍壊死因子で
あることを意味する。即ち、ホモジーニアスな腫瘍壊死
因子は実質上、アルブミン、フィブリノゲン、セリンプ
ロテアーゼ、α−グロブリン、リンホトキシンまたはイ
ンターフェロンの如き腫瘍壊死因子以外の細胞毒性ポリ
ペプチド等の血漿タンパク質、あるいは腫瘍壊死因子の
合成(生成)場所を与える細胞または微生物に由来する他
のタンパク質(全細胞および微粒子状の細胞分屑を含む)
を含有していない。しかしながら、ホモジーニアスな腫
瘍壊死因子は、後述する安定剤や賦形剤、並びに合成場
所を供給する細胞や微生物に由来するタンパク質、腫瘍
壊死因子の供給源である細胞または微生物以外に由来す
るタンパク質、およびポリ−Ｌ−リジンの如き合成ポリ
ペプチドを、予め定めた量、含有していてもよい。異型
的な(例えば細菌性の)宿主細胞内で発現される組換え腫
瘍壊死因子は、遺伝子の供給源であるタンパク質を全く
含まずに発現されることは言うまでもない。

【００５３】腫瘍壊死因子は組換え生物の培養内で好適
に産生される。末梢性の血中リンパ球(ＰＢＬs)もセル
ラインも好ましくない。現実に、ある１つのクラスのＰ
ＢＬを他のクラスの細胞類で汚染されていない状態で得
ること(例えばＢまたはＴ細胞を伴なわずにマクロファ
ージを得ること)は困難である。その様な汚染は、これ
ら汚染に係る細胞から他の細胞毒性因子やタンパク質が
放出される可能性がある故に、これら細胞の産物に適用
される分離行程を一層困難にする。その上、非組換え培
養による腫瘍壊死因子の製造は高い費用を要し、また、
得られる腫瘍壊死因子は固有の腫瘍壊死因子のみであ
る。従って、その培養は、組換え培養の如き腫瘍壊死因
子の特徴を改良する際の融通性を有しないものである。

【００５４】腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡは、
化学合成するか、ＰＢＬまたはセルライン培養からのm
ＲＮＡ逆転写物をスクリーニングする、あるいは何らか
の細胞からのゲノムライブラリィをスクリーニングする
ことにより、得ることができる。適当なセルライン培養
には、前骨髄球セルラインであって当該技術分野で「Ｈ
Ｌ−６０」と称されるもの(その内の１つはＡＴＣＣから
ＣＣＬ２４０の下に入手可能である)、あるいは組織球
性リンパ腫セルラインＵ９３７(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５
９３)の如き単球性セルラインが含まれる。これら、並
びに他のセルラインは、これらの細胞を、当該技術分野
で周知の化学的または物理的試薬(一般に、腫瘍誘発物
質またはミトゲン性物質)にさらすことにより、腫瘍壊
死因子の発現および分泌を誘導することができる。腫瘍
壊死因子の誘導は、ある単球性セルラインをＰＭＡで誘
導することによってのみ、効果的に行われる;その他の
一般的な試薬である、リポ多糖類、ブドウ球菌のエンテ
ロトキシンＢあるいはチモシンα−１等は、これらのセ
ルラインにおける腫瘍壊死因子の誘導に関し、ＰＭＡ
程、有効でない。あるセルラインを腫瘍壊死因子を発現
するセルライン(従って、所望のmＲＮＡを含有するも
の)であると分類するためには、様々な量でスクリーニ
ングしなければならないので、所望の遺伝子を単純に合
成する方が効率が良い。合成法の場合には、以下に述べ
る様に、単一の制限部位を導入することができ(そのこ
とにより、天然の配列中には存在しない制限部位を有す
る、ベクター内での遺伝子の利用を促進することがで
き、また翻訳効率を高めるための手段を講じることがで
きるので好都合である。

【００５５】ＤＮＡは自体既知の方法に従い、蛍光性の
基、放射活性な原子、あるいは化学発光性の基等の検出
可能な物質で共有結合的に標識される。次いで、この物
質を通常のハイブリダイゼーションアッセイに適用す
る。その様なアッセイは、後述する実施例の如くＴＮＦ
ベクターおよび形質転換体の同定、あるいは、血球中の
ＴＮＦmＲＮＡの検出の如きインビトロでの診断に利用
される。

【００５６】意外にもＴＮＦのためのmＲＮＡは、その
原因は不明であるが、おそらく不安定であるために、誘
導されたＨＬ−６０細胞内においてさえもかなり希れに
しか存在しない。さらに、細胞を誘導してからＴＮＦm
ＲＮＡが現れるまでの時間の経過が重要である。ＴＮＦ
mＲＮＡは、誘導後約４時間目に、極く短時間、細胞内
に現れるにすぎない。この出現までの時間に関して言え
ば、リンホトキシンは誘導後約１２時間目に現れること
から、リンホトキシンのそれとは全く異なっている。上
記の事情があるので、探し出すべき対象に関する知識が
ないと、このcＤＮＡは見過されてしまい勝ちである。
しかしながら、一度その存在が正しく認識され、相補的
なＤＮＡを得ることができた(本発明において開示して
いる様に)ならば、その様なＤＮＡ配列を有するプロー
ブを用いて誘導ＨＬ−６０またはＰＢＬのcＤＮＡライ
ブラリィをスクリーンすることは日常的な操作となる。
実施例においてスクリーンした２つのＨＬ−６０ファー
ジライブラリィは、陽性プラークの数においてかなりの
一致を示しているので、日常的なハイブリダイゼーショ
ンアッセイによって所望のcＤＮＡを含有しているファ
ージを同定することができることが明らかとなった。

【００５７】まず、ＨＬ−６０セルラインの腫瘍壊死因
子−合成細胞を、約８−１２×１０⁵細胞／mlの濃度に
達するまで常法通り培養する。培養混合物から細胞を除
き、洗浄して血清不含−培地に移し、ＰＭＡを含有する
培地中で増殖させる。次いで、培地中に腫瘍壊死因子が
所望の濃度(通常、約４００腫瘍壊死因子単位／ml)蓄積
されるまで培養を続ける。好ましくはその後、遠心分離
その他の、可溶性成分から細胞分屑(断片)を分離し得る
方法により、培養上清を澄ませる。遠心分離は、懸濁状
態の粒子だけを分離させる様、低速で行わねばならな
い。次いで、上清を後述の如く精製する。

【００５８】別法として、腫瘍壊死因子をコードしてい
るＤＮＡを含有するベクターで形質転換した宿主細胞内
で該腫瘍壊死因子を合成させる方法があり、これは好ま
しい方法である。ベクターは複製可能なＤＮＡ組立て物
である。本発明においては、腫瘍壊死因子をコードして
いるＤＮＡの増幅および／または腫瘍壊死因子をコード
しているＤＮＡの発現のためにベクターを用いる。発現
ベクターは、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡと、
その腫瘍壊死因子の適当な宿主内での発現に影響を及ぼ
し得る適当なコントロール配列とが機能的に結合してな
る複製可能なＤＮＡ組立て物である。その様なコントロ
ール配列には転写プロモーター、転写をコントロールす
るための任意のオペレーター配列、適切なmＲＮＡリボ
ゾーム結合部位をコードしている配列、および転写およ
び翻訳の終止をコントロールするための配列が含まれ
る。

【００５９】ベクターにはプラスミド、ウイルス(ファ
ージを含む)、および組込み可能なＤＮＡフラグメント
(即ち、組換えによって宿主のゲノム内に組込まれ得る
もの)が含まれる。適当な宿主に導入(トランスフォー
ム)されると、ベクターは宿主ゲノムとは独立に複製、
機能し、または、ある場合にはゲノムそのものの中に組
込まれる。プラスミドは、今日最も普通に用いられるベ
クターであるが、本明細書中では、「ベクター」を、「プ
ラスミド」をも含む総括的な用語として用いることとす
る。しかしながら、同等の機能を有し、当該技術分野で
知られており、またはいずれ知られるであろう、その他
の形のベクターも全て、本発明方法に用いるのに好適で
ある。好適なベクターは、発現させようとする宿主と適
合し得る種から導かれたレプリコンおよびコントロール
配列を含んでいる。形質転換された宿主細胞とは、組換
えＤＮＡ技術を用いて組立てられた腫瘍壊死因子ベクタ
ーで形質転換され、もしくはトランスフェクトされた細
胞である。形質転換された宿主細胞は、通常、腫瘍壊死
因子を発現する。発現された腫瘍壊死因子は、選択され
た宿主細胞により、細胞内に止まるか、あるいはペリプ
ラスミック空間、または培養上清中に分泌される。

【００６０】ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に
関連している場合は、機能的に結合している。例えば、
プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それが
ポリペプチドの分泌に与るプレタンパク質として発現さ
れるならば、該ポリペプチドに関するＤＮＡと機能的に
結合している;プロモーターは、それが結合している暗
号配列の転写をコントロールするならば、該配列と機能
的に結合している;リボゾーム結合部位は、それが結合
している暗号配列を翻訳され得る位置に置くならば、該
暗号配列と機能的に結合している。一般に、機能的に結
合している、ということは近接(コンティギュアス)して
いることを意味し、分泌リーダー配列の場合には、近接
し、かつ解読相内にあることを意味する。

【００６１】適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞お
よびより高等な真核細胞である。原核生物にはグラム陰
性またはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌やバチル
ス(桿菌、Ｂacilli)が含まれる。より高等な真核細胞に
は、以下に述べる如く哺乳類動物起源から得られたセル
ラインが含まれる。好適な宿主細胞は実施例に記載し
た。ファージ耐性のＥ.coli Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２
７,３２５)株であるが、他の原核生物、例えばＥ.coli
Ｂ、Ｅ.coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１,５３７)、Ｅ.c
oli ２９４(ＡＴＣＣ３１,４４６)、シュードモーナス
(pseudomonas)種、あるいはセラシア・マーセサンス(Ｓ
erratia Ｍarcesans、霊菌)等も適する。

【００６２】腫瘍壊死因子の発現には原核性宿主−ベク
ター系が好ましい。腫瘍壊死因子分子は２個のシステイ
ン残基を有しており、このことは、転写後、潜在的なジ
スルフィド結合を形成させる様な適当なプロセッシング
が必要であることを示唆しているが、例えば、大腸菌は
生物学的に活性な腫瘍壊死因子を発現させることができ
る。適当な微生物系ベクターは、多数手に入れることが
できる。一般に、微生物類のベクターは所望の宿主が認
識し得る複製起源、宿主内で機能し得るプロモーター、
並びに表現型の選択性遺伝子(例えば抗生物質耐性を付
与する遺伝子、または栄養要求変異種の要求を満す様な
遺伝子)を含む。他の宿主に関しても、同様な組立て物
を作ることができる。大腸菌は、通常、Ｅ.coli種から
得られるプラスミドpＢＲ３２２を用いて形質転換され
る(ボリバー(Ｂolivar)ら、１９７７、“ジーン(Ｇen
e)"２:９５)。pＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性のための遺伝子を含有しており、これら
は形質転換細胞を容易に同定し得る手段となる。

【００６３】ベクターは宿主微生物によって認識され得
るプロモーターを含有していなければならない。一般に
プロモーターは所望の宿主にとってホモローガスであ
る。組換えＤＮＡの組立てに最も普通に用いられるプロ
モーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およ
びラクトースプロモーター系[チャン(Ｃhang)ら、１９
７８“ネイチャー"、２７５:６１５;およびゲッデル(Ｇ
oeddel)ら、１９７９“ネイチャー"２８１:５４４]、ト
リプトファン(trp)プロモーター系[ゲッデル(Ｇoeddel)
ら、１９８０“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"３:
４０５７およびＥＰＯ出願公開番号３６,７７６]、並び
にtacプロモーター[Ｈ.ドウボエル(Ｈ.Ｄe Ｂoer)ら、
“プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンスイズ、Ｕ.Ｓ.Ａ."８０:２１−
２５(１９８３)]が含まれる。これらが最も普通に用い
られているが、その他の既知の微生物プロモーターも使
用し得る。それらの詳しいヌクレオチド配列は公開され
ているので、当業者は、それらをプラスミドベクター内
の、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡ(シーベンリ
スト(Ｓiebenlist)ら、１９８０、“セル"２０:２６
９)、および腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡと、
機能的にライゲート(結合)させることができる。現在の
ところ好ましいベクターは、大腸菌アルカリ性ホスファ
ターゼプロモーターとtrpシャイン−ダルガノ配列を有
するpＢＲ３２２誘導体である。このプロモーターおよ
びシャイン−ダルガノ配列を、腫瘍壊死因子をコードし
ているＤＮＡと機能的に結合させる(即ち、ＤＮＡから
のＴＮＦmＲＮＡの転写を促進する位置に結合させる)。

【００６４】原核生物に加えて、酵母培養の如き真核性
微生物も腫瘍壊死因子−暗号ベクターにより、形質転換
される。下等な真核性宿主微生物の内、サッカロミケス
・セレビシエ(Ｓaccharomyces cereviciae)または通常
のパン酵母が最も一般的に用いられるが、その他多数の
菌株も普通に用い得る。酵母ベクターは、通常、２ミク
ロン酵母プラスミドからの複製起源または自律的複製配
列(ＡＲＳ)、プロモーター、ＴＮＦ、並びにポリアデニ
ル化および転写の終止のための配列、および選択性遺伝
子配列を含有している。酵母内で腫瘍壊死因子を発現さ
せるのに好適なプラスミドはＹＲ_p7である(ステインチ
コム(Ｓtinchcomb)ら、１９７９、“ネイチャー"２８
２:３９;キングスマン(Ｋingsman)ら、１９７９、“ジ
ーン"、７:１４１;チェンパー(Ｔschemper)ら、１９８
０、“ジーン"１０:１５７)。このプラスミドは既にtrp
１遺伝子を含有しており、この遺伝子は、酵母の突然変
異株、(例えばＡＴＣＣＮo.４４０７６またはＰＥＰ４
−１[ジョーンズ(Ｊones)、１９７７、“ジエネテック
ス"８５:１２]にトリプトファン中で増殖する能力を持
たないという選択マーカーを与える。この酵母宿主細胞
ゲノムはtrp１障害を有するので、形質転換体をトリプ
トファンの非存在下で増殖させることで、形質転換体の
検出に効果的な環境を得ることができる。

【００６５】酵母用ベクターの好適なプロモーティング
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る:メタロチオナイン(metallothionein)、３−ホスホグ
リセレート・キナーゼ[ヒッツマン(Ｈitzeman)ら、１９
８０“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ィ“２５５:２０７３]またはエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベ
ート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラー
ゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼ
等の他の解糖酵素類[ヘス(Ｈess)ら、１９６８、“ジャ
ーナル・オブ・アドバンスイズ・イン・エンザイム・レ
グ(Ｊ.Ａdv.Ｅnzyme Ｒeg.)"７:１４９;およびホランド
(Ｈolland)ら、１９７８、“バイオケミストリィ"１７:
４９００]。更に、酵母内で発現させる上で好適なベク
ターおよびプロモーターはＲ.ヒッツマン(Ｒ.Ｈitzema
n)らにより、ＥＰＯ公開番号第７３,６５７号の中に記
述されている。

【００６６】その他、増殖条件によって転写がコントロ
ールされるという利点をも有するプロモーターとして、
アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、
前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよび
ラクトースの利用に与る酵素類等に関するプロモーター
領域が含まれる。適当な発現プラスミドを組立てるに
は、これらの遺伝子に伴なった終止配列を、発現ベクタ
ー内の、腫瘍壊死因子暗号配列の３'側にライゲート
し、mＲＮＡのポリアデニル化および終止を与える。

【００６７】微生物に加えて、多核生物からの細胞培養
を宿主として用いることもできる。しかしながら、腫瘍
壊死因子の発現は、これまで微生物によって卓越した成
果が得られているので、それが好ましいとは言えない。
原則として、脊椎動物であるか無脊椎動物であるかに拘
らず、あらゆる高等な真核細胞培養を使用し得る。しか
しながら、最近では脊椎動物細胞に大きい関心が寄せら
れており、培養(組織培養)で脊椎動物細胞を増殖させる
ことは日常的な操作となっている[ティッシュ・カルチ
ャー(Ｔissue Ｃulture)アカデミック・プレス、クル
スおよびパターソン(Ｋrus and Ｐatterson)編、(１
９７３)]。有用な宿主セルラインの例には、ＶＥＲＯお
よびＨeＬa細胞、チャイニーズハムスターの卵巣(ＣＨ
Ｏ)セルライン、並びにＷＩ ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７
およびＭＤＣＫセルライン等が含まれる。その様な細胞
のための発現ベクターには、通常(必要ならば)複製起源
および発現されるべき遺伝子の前方に位置しているプロ
モーターが、リボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部
位(イントロン含有ゲノムＤＮＡを用いる場合)、ポリア
デニル化部位および転写終止配列と共に含有されてい
る。

【００６８】脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現
ベクター用のための転写およびコントロール配列は、し
ばしばウイルス起源から供給される。例えば、普通用い
られているプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス
２、および最も好ましくはシミアンウイルス４０(ＳＶ
４０)から導かれる。アーリィ(早期)およびレイト(後
期)プロモーターは、いずれもＳＶ４０ウイルスの複製
起源含有フラグメントとして該ウイルスから容易に得ら
れるので特に有用である[ファイヤーズ(Ｆiers)ら、１
９７８、“ネイチャー"２７３:１１３]。ＳＶ４０のよ
り小さい、またはより大きいフラグメントも、それらが
ウイルス性複製起源内に位置するＨind ＩＩＩ部位から
Ｂgl Ｉ部位に至る約２５０bpの配列を含有している限
り用いることができる。更に、正常な状態で腫瘍壊死因
子と関連しているヒト−ゲノムプロモーター、コントロ
ールおよび／またはシグナル配列も、その様なコントロ
ール配列が宿主細胞系に適合し得ることを条件として用
いることができ、またしばしば好ましいことである。

【００６９】複製起源は、例えばＳＶ４０その他のウイ
ルス性起源(例えばポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳ
Ｖ、ＢＰＶ等)から導かれる複製起源等の外来性起源を
含む様にベクターを組立てることにより、あるいは宿主
細胞の染色体性複製機構により、与えられる。もしもベ
クターが宿主細胞染色体に組込まれるのなら、しばし
ば、後者の機構でも十分である。

【００７０】腫瘍壊死因子とデヒドロ葉酸還元酵素(Ｄ
ＨＦＲ)の両者をコードしているＤＮＡ配列を含むベク
ターでトランスフェクトするのに好適な哺乳類宿主細胞
を選択するに際しては、用いるＤＨＦＲタンパク質のタ
イプに従って宿主を選択するのが適当である。野生型Ｄ
ＨＦＲタンパク質を用いる場合には、ＤＨＦＲ欠損宿主
細胞を選択するのが好ましく、そうすることにより、ヒ
ポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択用培
地内で、満足のいくトランスフェクションを選択するた
めのマーカーとしてＤＨＦＲ暗号配列を用いることがで
きる。この場合、好ましい宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠
くチャイニーズハムスターの卵巣(ＣＨＯ)セルラインで
あり、これは、ウーラウブおよびチャッシン(Ｕrlaub
and Ｃhasin)(１９８０、“プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイ
ズ"(ＵＳＡ)７７:４２１６)の述べた如くにして調製
し、増殖させることができる。

【００７１】他方、メトトレキセート(ＭＴＸ)に対する
結合親和性の低いＤＨＦＲタンパク質をコードしている
ＤＮＡをコントロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ
耐性細胞を用いる必要はない。何故ならば突然変異ＤＨ
ＦＲはＭＴＸ耐性であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感
受性であるならば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として
用いることができるからである。ＭＴＸを吸収すること
のできる真核細胞の大多数は、メトトレキセート感受性
であると思われる。その様な、有用なセルラインの１つ
はＣＨＯ系、ＣＨＯＫ１(ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ６１)で
ある。

【００７２】まず、腫瘍壊死因子を培養物から回収す
る。形質転換した非分泌型細胞の場合は、音波処理等の
許容し得る方法で細胞を溶解し、遠心して細胞分屑を分
離して上清を得るが、分泌型細胞(誘導されたセルライ
ン等)の場合には遠心して細胞を分離するだけで上清を
得ることができる。次いで、下記の手順のどれかを使用
すること、またはそれに更に他の手順を加えること、あ
るいは、全く別の方法で置換えることにより、処理す
る。以下に示す方法は、配列決定を行うのに充分な程度
にまで腫瘍壊死因子を精製するのに用いた方法である。
このことは、治療用の生産物にとって必要な精製法とは
必ずしも一致しない。

【００７３】精製の第一段階として、溶解された培養液
または培地上清中の腫瘍壊死因子を疎水性物質に吸着さ
せる。疎水性物質としては非ゼラチン性の疎水性表面を
有するケイ酸塩やポリオレフィン等が好ましいが、アル
キルセファロースもまた適する。調節多孔性ガラス(con
trolled pore glass)によって好適な状態が得られ
る。この調節多孔性ガラス約１容量と上清５０容量とを
混合し、約４℃において、攪拌せずに約３０分〜２時
間、好ましくは１時間にわたり、微アルカリ性条件下で
吸着させる。通常、この吸着物は、その後、吸着された
汚染タンパク質を除くために適当な緩衝液で洗浄する必
要がある。

【００７４】周囲媒質の溶媒和特性を変えることによっ
て疎水性物質に吸着された腫瘍壊死因子を該物質から溶
離させる。溶離は、pＨ約７〜８.５(好ましくはpＨ約
８)に緩衝化された溶液であって、１Ｍの塩と、エチレ
ングリコールまたはグリセリンの如き水と混ざり合う有
機ポリオールの有効量(通常は、エチレングリコールを
１０〜３０v／v％、好ましくは約２０v／v％用いる)と
を含有する溶液を通すことにより、行う。勿論、好適な
条件は使用されるポリオールによって異る。得られた腫
瘍壊死因子を含有する溶出液画分を、下記のインビトロ
アッセイ、または別の適当なアッセイによって検出す
る。この段階並びに、その後の段階における単球細胞培
養からの精製(度)および収率を表Ｉに示す。

【００７５】

【表１】

【００７６】それ以上の精製は、腫瘍壊死因子を三級ま
たは四級アミノ陰イオン交換樹脂に吸着させて行う。こ
の目的に好適な樹脂はアルキル三級アミノ基またはアル
キル四級アミノ基で置換されている交差結合したポリス
チレン、デキストラン、あるいはセルロースの如き親水
性のマトリックス樹脂である。この型の市販製品は、Ｄ
ＥＡＥセルロース、ＱＡＥセファデックスまたは商標名
モノ(Ｍono)Ｑ(各場合において、これら各製品のアルキ
ル置換基はエチル基である)の名の下に入手可能であ
る。最良の結果は、ウゲルスタット(Ｕgelstadt)ら(１
９８３、“ネイチャー"３０３:９５−９６)の示した実
質上均一なマクロポーラス粒子を用い、Ｊ.リッケイ
(Ｊ.Ｒichey)らが示した高速タンパク質液体クロマトグ
ラフィー系[１９８２年１０月、“アメリカン・ラボラ
トリィ(Ａmerican Ｌaboratory)"]により、得られる。
この系によれば、腫瘍壊死因子を高レベルに精製するこ
とができる。

【００７７】実質上均質な程度にまで精製するには、後
述の実施例に示す如く、更にＳＤＳＰＡＧ電気泳動また
はＣ４−逆相高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)に
かけて分離する以外に方法はない。しかしながら、この
様にして得られる生産物は、ＳＤＡまたはＨＰＬＣの有
機溶媒にさらされることにより、実質上その活性を失な
っているので、治療に用いるのは不適当である。タンパ
ク質濃度はＭ.ブラッドフォード(Ｍ.Ｂradford)の方法
[１９７６、アナリティカル・バイオケミストリィ(Ａna
l．Ｂiochem．)７２:２４８−２５４]によって測定され
た。精製の最終段階では、このタンパク質濃度はアミノ
酸組成およびアミノ酸配列から見積って算出された。

【００７８】腫瘍壊死因子は、所望の純度の該腫瘍壊死
因子と、生理学的に許容し得る担体、即ち、使用される
用量および濃度においては、被投与者にとって無毒な担
体を混合することにより、投与のために製剤化される。
通常、この様な製剤化には腫瘍壊死因子と緩衝液、アス
コルビン酸等の抗酸化剤、低分子量(１０残基以下)ポリ
ペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデ
キストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡの如きキレート
剤、並びにその他の安定剤および賦形剤とを混合する必
要がある。ダイマー(二量体)および／または、好ましく
はトリマー(三量体)の形で、腫瘍壊死因子を安定化する
様、担体を処方する必要がある。このことは、腫瘍壊死
因子をモノマー(単量体)に解離させる様な塩濃度または
洗浄剤濃度になることを避けることによってなされる。
他方、腫瘍壊死因子をこれ以上の多量体に集合させる様
な条件も避けなければならない。一般に、凍結乾燥およ
び水性液中での保存の場合と同様に、精製過程において
も、過剰の凝集を阻止するために、トウイーン２０(Ｔw
een２０)の如き非イオン性界面活性剤を用いる。治療の
ために投与される腫瘍壊死因子は滅菌されねばならな
い。滅菌処理は、滅菌濾過膜を通すことにより、容易に
行うことができる。通常、腫瘍壊死因子は、凍結乾燥し
た形で保存する。

【００７９】腫瘍壊死因子は、随意、化学療法剤抗生物
質(アクチノマイシン−Ｄ)、アドリアマイシン、アクラ
シノマイシンＡ)等の他の抗新生物剤、あるいはガンマ
グロブリン等の免疫グロブリンの様な免疫応答を増し、
刺激する様な物質(新生物細胞の表面抗原に親和性を有
する免疫グロブリンを含む)と併用することができる。
更に、インターフェロンは細胞溶解分析において腫瘍壊
死因子と相乗的に作用するもので、α、βまたはγ−イ
ンターフェロンを、腫瘍壊死因子組成物、または腫瘍壊
死因子とリンホトキシンを含有する組成物に配合するこ
とが好ましい。代表的な処方は、腫瘍壊死因子とγ−イ
ンターフェロンとを、単位活性化比にして、０.１:１〜
２００:１、通常は１０対１の割合で含有するものであ
る。これらの割合は、治療上、経験的に生じた必要性に
応じて改良に委ねられるものであることは言うまでもな
い。

【００８０】腫瘍壊死因子組成物は、腫瘍を有する動物
に投与することができる。投与経路は、静脈内、腹腔
内、筋肉内投与、滅菌腫瘍壊死因子溶液の病巣内注入ま
たは注射の如き既知の方法により、あるいは以下の述べ
る如き放出時間調節系により投与することもできる。腫
瘍壊死因子は病巣内投与(即ち、固状の腫瘍内に直接注
射する)し得る。白血病の様な播種性腫瘍の場合には、
静脈内またはリンパ系への投与が好ましい。卵巣腫瘍の
様な腹部器官の腫瘍は、腹膜透析器を使用し、腹膜適合
性の溶液で腹腔内に注入することにより、有効に治療で
きる。ボーラス注入も可能であるが、通常、腫瘍壊死因
子は連続注入法で投与する。

【００８１】腫瘍壊死因子は、埋め込み可能な、時間調
節製品を介して投与することができる。腫瘍壊死因子の
二量体または三量体の分子量を有するタンパク質に対す
る適当な系の例には、Ｌグルタミン酸とγ−エチル−Ｌ
−グルタマートとのコポリマー[Ｕ.シドマン(Ｕ.Ｓidma
n)ら、１９８３、“バイオポリマーズ(Ｂiopolymers)"
２２(１):５４７−５５６]、ポリ(２−ヒドロキシエチ
ル−メタクリレート)[Ｒ.ランガー(Ｒ.Ｌanger)ら、１
９８１“ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリ
アルズ・リサーチ(Ｊ.Ｂiomed.Ｍater.Ｒes.)"１５:１
６７−２７７、およびＲ.ランガー、１９８２“ケミカ
ル・テクノロジィ(Ｃhem.Ｔech.)"１２:９８−１０５]
またはエチレングリコール(Ｒ.ランガーら、同)が含ま
れる。この製品は腫瘍が切除された後の外科的部位に埋
め込まれる。別法として、腫瘍壊死因子を半透膜のマイ
クロカプセルまたはリポゾーム内に封入し、腫瘍内部へ
注射してもよい。この方法は、脳腫瘍の如き外科的な切
除術を適用できない腫瘍に対して特に有用である。

【００８２】腫瘍壊死因子の投与量は、例えば、投与経
路、問題となっている腫瘍、および患者の症状等によっ
て左右される。腫瘍壊死因子の体重当りの必要量は、静
注よりも病巣内投与の場合の方が少なくてすむが、ある
型の腫瘍(例えば固型腫瘍)は他の型の腫瘍(例えば白血
病)よりも腫瘍壊死因子に対して抵抗性を有する様であ
る。治療を施す者は、標的腫瘍に対して適切な細胞毒性
を奏す様に、例えば腫瘍の生検、または胎生期ガン抗原
の如き推定の腫瘍マーカーの診断学的測定、等により、
用量の増加に伴なうあらゆる組換え体の毒性を考慮しな
がら用量を検定し、投与経路を改良する必要がある。マ
ウスに対しては、通常、腫瘍壊死因子を最大投与量約１
２０μg／kg体重／日までの静注投与が実質上、非毒性
であり、インビボで有効であることが分っている。

【００８３】腫瘍壊死因子はその細胞毒活性において種
特異性ではないと考えられるので、ヒト腫瘍壊死以外の
腫瘍壊死因子、例えばウシまたはウマ起源のものもヒト
の腫瘍の治療に用いることができる。しかしながら、自
己抗体が生成する危険性を避けるために、被治療種に由
来する腫瘍壊死因子を用いることが好ましい。

【００８４】実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す。プラスミドは小
文字のpを先頭にし、そして／または大文字および／ま
たは数字を続けることによって表わされる。本発明の出
発物質であるプラスミドは市販されているか、または非
制限的な施設から一般に入手可能であり、あるいはこの
様にして入手し得るプラスミドから、公知の方法に従っ
て組立てることができる。更に、その他の同等なプラス
ミドも当業者には知られており、通常の技術者にとって
自明であろう。

【００８５】ＤＮＡの“消化"とは、ＤＮＡを、該ＤＮ
Ａのある位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂
することを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵
素にとって特異的な部位を制限部位(サイト)と称する。
“部分"消化とは、制限酵素による不完全な消化であ
り、与えられたエンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ基質
中の部位の全てでなく、そのうちのいくつかを開裂する
様な条件を選んで行う。本発明において用いる様々な制
限酵素は市販されており、その反応条件、コファクタ
ー、およびその他必要なものは、酵素の供給業者の指示
に従って使用した。制限酵素類は、各制限酵素が最初に
得られた微生物を表示する大文字、次いで他の文字、更
に、通常、数字からなる略号で表わされる。一般に、約
１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２
０μlの緩衝液中の約１単位の酵素と共に使用する。特
定の酵素について適当な緩衝液および基質の量は、製造
業者によって明示されている。通常、インキュベーショ
ン時間は３７℃で１時間とするが、供給者の指示に従っ
てかえてもよい。インキュベーションした後、フェノー
ルおよびクロロホルムでタンパク質を抽出して除き、水
性フラクションからエタノール沈殿によって消化された
核酸を回収する。時たま、制限酵素による消化の後、
５'末端のホスフェートを細菌性アルカリホスファター
ゼで加水分解することがある。これは、ＤＮＡフラグメ
ントの２つの制限的開裂末端が“閉環(サーキュライデ
ィング)"したり、閉じたループを形成することにより、
該制限部位に他のＤＮＡフラグメントが挿入されにくく
なるのを防止するためである。明示しない限り、プラス
ミドの消化には、５'末端の脱りん反応は伴なわないも
のとする。脱りんの方法および試薬は常法に従う[Ｔ.マ
ニアティス(Ｔ.Ｍaniatis)ら、１９８２、モレキュラー
・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)pp．１３３−１
３４]。

【００８６】制限酵素による消化によって得られたＤＮ
Ａフラグメントの“回収"または“単離"とは、この消化
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、
フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフ
ラグメントのそれと比較して所望のフラグメントを同定
し、該フラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲ
ルからＤＮＡを分離することを意味する。この方法は一
般的に知られている。例、Ｒ、ローン(Ｒ.Ｌawn)ら、１
９８１、“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"９:６１
０３−６１１４およびＤ.ゲッデル(Ｄ.Ｇoeddel)ら、１
９８０“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"８:４０５
７参照。

【００８７】“サザーン分析"とは、消化物またはＤＮ
Ａ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識し
たオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハ
イブリダイゼーションによって確認する方法である。本
明細書中では、特に断らない限り、サザーン分析という
時は、Ｅ.サザーン(Ｅ.Ｓouthern)、１９７５“ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジィ(Ｊ.Ｍol.Ｂi
ol.)"９８:５０３−５１７、の方法に従って、消化物を
１％アガロース上で分離し、変性し、そしてニトロセル
ロース上に移し、Ｔ.マニアティスらの方法[１９７８、
“セル"１５:６８７−７０１]に従ってハイブリダイゼ
ーションを行なうことを意味する。

【００８８】“形質転換"とは、ＤＮＡを生物内に導入
することを意味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl₂法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ィ"５３:１５４)を採用する。

【００８９】“ライゲーション(結合)"とは、２個の二
重鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(Ｔ.マニアティスら、前掲p１４６)。
特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と
条件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤＮＡフ
ラグメント０.５μg当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ(“リガ
ーゼ")１０単位を用いて行う。

【００９０】形質転換体からＤＮＡを“調製する"と
は、プラスミドＤＮＡを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアティスらのアル
カリ性／ＳＤＳ法(同上p.９０)を採用する。

【００９１】“オリゴヌクレオチド"とは、短かい一本
鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、実
施例１に記載の引用文献の方法によって化学的に合成さ
れ、次いでポリアクリルアミドゲル上で精製されたもの
である。引用した文献は全て参照例として示した。

【００９２】

【実施例】実施例１ アッセイ(分析法) 腫瘍壊死因子の比活性は前述の改良細胞溶解アッセイ
[Ｂ.スポッフォード(Ｂ.Ｓpofford)「ジャーナル・オブ
・イムノロジィ」１１２:２１１１]に従って測定した。
マウスＬ−９２９線維芽細胞(ＡＴＣＣ ＣＣＬ−９２
９)を、９６のウエルを設けた底が平らなトレー[３０４
０;ファルコンプラスチックス(Ｆalcon Ｐlastics)、
オックスフォード、ＣＡ]を用い、３０,０００／ウエル
の割合で細胞を、アクチノマイシン１μg／mlと連続的
に希釈した被検試料(０.１２５ml)の存在下において増
殖させる。加温雰囲気下、３７℃においてＣＯ₂５％の
存在下で細胞を増殖させる。１８時間後、被検試料を除
き、平板を洗浄し、この平板をメタノール:水(１:４v／
v)中の０.５％クリスタル・バイオレット溶液で染色す
ることにより、細胞溶解を検出した。マイクロタイター
平板の終末点をマイクロリザ(Ｍicrolisa)オートリーダ
ー[ダイナテク(Ｄynatech)]を用いて４５０nmにおける
吸収および５７０nmにおける透過率を測定して定めた。
培地のみにさらされた細胞を０％溶解と定め、３Ｍグア
ニジン塩酸塩溶液にさらしたものを１００％溶菌の終末
点とした。５０％の細胞を溶解するのに必要な腫瘍壊死
因子の量(測定に用いた量が０.１２５mlである場合)を
腫瘍壊死因子１単位と定義する。

【００９３】腫瘍壊死因子はまたインビボでの腫瘍壊死
因子アッセイによっても分析することができる。簡単に
述べると、この分析法は、Ｍeth Ａサルコーマ(肉腫)細
胞(５×１０⁵細胞)をＣＢ₆Ｆ₁雌マウス(ＢＡＬＢ／c×
Ｃ５７ＢＬ／６)Ｆ₁中で７−１０日間増殖させた後、被
検腫瘍壊死因子と一緒に腫瘍内に注入することからなる
方法である。２４時間後、マウスを頸部脱臼法で殺し、
腫瘍を切除してＥ.カースウエル(Ｅ.Ｃarswell)らの方
法(１９７５、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ、７２:３６
６６−３６７０)に従い、組織学的に壊死を採点する。

【００９４】実施例２ 腫瘍壊死因子を合成するための
ＰＢＬまたは単球性セルラインの利用

【００９５】２lのローラービン(８９０cm²)を用い、１
０mＭ ＨＥＰＥＳ、０.０５mＭ β−メルカプトエタノ
ール、１００単位／mlペニシリン、１００μg／mlスト
レプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を含んだ５０
０mlのＲＰＭＩ １６４０培地[アーヴィン・サイエンテ
ィフィック(Ｉrvine Ｓcientific)サンタ・アンナ・Ｃ
Ａ]中でＨＬ−６０ヒトプロ骨髄球セルラインの種培養
(細胞密度１×１０⁵細胞／ml)を増殖させた。３７℃で
３日間経過し、培養物の細胞密度が８−１２×１０⁵細
胞／mlに達した時点で、１０００g×１０分間の遠心に
よって細胞を集め、血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地で
２回洗浄し、前記と同じ培地(血清を含まず)に移し、細
胞密度１５−２０×１０⁵になる様調節した。２l−ロー
ラービンの中で１０ng／mlのＰＭＡの存在下、細胞を増
殖させた。１６〜２４時間後、３μmシールクリーンフ
ィルター[ポール・トリニティ・マイクロ・コーポ(Ｐal
lＴrinity Ｍicro corp．)、コートランド、ＮＹ]に
通して細胞を濾去した。澄明な濾液の腫瘍壊死因子活性
を測定し、引き続き精製および特徴付けに付した。この
方法により、培地上清中に腫瘍壊死因子４００単位／ml
を得た。

【００９６】腫瘍壊死因子は、ヒト末梢血中の単球細胞
からも製造された。アメリカ赤十字(ボストン、ＭＡ)か
らプラットレットフェレシス(platletpheresis)残渣を
入手し、収集後２４時間以内に用いた。まず、Ｆicoll
−Ｈypaqveグラディエントを用いて遠心(１０００g×３
０分間)することにより赤血球から単球を分離した。境
界面に集められた細胞を、リン酸緩衝化食塩水で３回洗
浄した。各供給源からの単球を別々に、２lのローラー
ビン内で、血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地中、細胞密
度２.５×１０⁶細胞／mlにおいて増殖させた。１μg／m
lづつのブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)および
組換えチモシンα−１をこの培地に加え、加湿雰囲気
下、３７℃において、１０％ＣＯ₂の存在下で細胞をイ
ンキュベートした。供給源に応じて、２４−７２時間後
に、細胞上清を収穫し、ＨＬ−６０セルラインの場合と
同様の方法で処理した。ＰＢＬ培養からの腫瘍壊死因子
の収率は用いた誘導試薬によって広範囲に変化し得る。
上記の如く、この誘導系にＰＭＡを加えると細胞上清の
細胞溶解活性が増加した。しかしながら、得られた細胞
上清中には腫瘍壊死因子とリンホトキシンの両者が含有
されていた(腫瘍壊死因子とリンホトキシンとの混合物
中の腫瘍壊死因子またはリンホトキシンの測定は、被検
試料を腫瘍壊死因子またはリンホトキシンに対するウサ
ギ中和抗体とプレインキュベートし、Ｌ−９２９細胞溶
解分析で残存活性を測定することからなる細胞溶解法に
よって行った)。

【００９７】実施例３ 調節多孔性ガラスビーズクロマ
トグラフィー 細胞培養中に含まれる腫瘍壊死因子活性を、１０mＭり
ん酸ナトリウム緩衝液(pＨ８.０)で平衡化した調節多孔
性ガラスビーズ[カタログＮo.ＣＰＧ００３５０、エレ
クトロヌクレオニックス(Ｅlectro−Ｎucleonics)フェ
アーフィールド、ＮＪ]と、４℃で一定速度で攪拌する
ことにより、これらビーズにバッチ(束)吸着させた。培
地５ Ｌに対してガラスビーズ１００mlを用いた。１時
間攪拌した後、ビーズを鎮静させ、上清をデカントして
除いた。次いで、室温で５×５０cmカラムにビーズを入
れ、１０mＭりん酸ナトリウム緩衝液(pＨ８.０、１Ｍ
ＮaＣl含有)により、洗浄した。１０mＭりん酸ナトリウ
ム緩衝液(pＨ８.０、１Ｍ ＮaＣl含有)中の２０％エチ
レングリコールを用いてガラスビーズから腫瘍壊死因子
活性を溶離した。カラムからのＨＬ−６０上清の溶離像
を図１に示す。

【００９８】実施例４ ＤＥＡＥセルロースクロマトグ
ラフィー 実施例３で得た溶出液を直接、１０mＭりん酸ナトリウ
ム緩衝液(pＨ８.０)および０.０１％Ｔween２０で平衡
化したＤＥＡＥセルロース５３[ワットマン(whatman)]
カラム(２.５×２０cm、流速約５００ml／h)にかけた。
カラムの流速を１００ml／hに調節した後、４℃におい
て、試料１,０８０ml(腫瘍壊死因子４.２×１０⁶単位)
を充填し、このカラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、１
０mＭりん酸緩衝液(pＨ８.０)中に塩化ナトリウム、７
５mＭ、１５０mＭおよび５００mＭを含有する段階的(ス
テップアップ)グラディエントで溶離した。溶出液を２
８０nmにおける吸収に基いてモニターし、腫瘍壊死因子
活性を溶離フラクションの関数として表した。結果を図
２に示す。

【００９９】実施例５ 高速タンパク質液体クロマトグ
ラフィー 実施例４で得た腫瘍壊死因子活性を示すフラクションを
濃縮し、アミコン・スター・セル(Ａmicon stir cel
l)中、ＴＮＦの分子量よりも小さい分子量カット−オフ
(保持限界)を示すＹＭ−１０膜その他の半透膜を使用
し、０.０１％Ｔween２０および１mＭナトリウムアジド
を含有する２０mＭトリスＨＣl(pＨ８.０)(バッファー
Ａ)に対して透析した。次いで、半透膜をバッファーＡ
で２回洗浄した。グラディエントプログラマー(ＧＰ−
２５０)と２個のポンプ(p−５００)を備えた高速タンパ
ク質液体クロマトグラフィー(ＦＰＬＣ)装置[ファルマ
シア(Ｐharmacia)]中の四級アンモニウム基−置換セフ
ァロースビーズカラム[５×０.５cmカラム中にビーズ
９.８μＭを含む;商品名モノ(Ｍono)Ｑ樹脂、ファーマ
シア製]をＪ.リッケイ(Ｊ.Ｒichey)の記載した如く
[“アメリカンラボラトリィ(Ａmerican Ｌaboratory)"
１９８２年１０月、pp１]、透析緩衝液をスーパールー
プ(superloop)から流速１ml／minで流してプレ−平衡処
理した。プールした洗浄液および透析濃縮物をこのカラ
ムに充填し、該カラムをバッファーＡで洗浄した後、バ
ッファーＡ中に塩化ナトリウム４０−７５mＭを含有せ
しめた線状グラディエントにより、溶離した。線状グラ
ディエントは次の様に計画されていた:０−５分:平衡緩
衝液;５.１−１５分２５mＭ ＮaＣl;１５.１−２５分、
４０mＭ ＮaＣl;２５−６０分、４０−７５mＭ ＮaＣl
線状グラディエント;６０−６５分、７５mＭ ＮaＣl;６
５.１−７０分、１００mＭ ＮaＣl;７０−８０分、１０
０−１０００mＭ ＮaＣl線状グラディエント;８０−９
０分、１００mＭ ＮaＣl;９０.１−１１０分、平衡緩衝
液。溶出液を２mlづつのフラクションとしてとり、２８
０nmにおける吸収、伝導率、および腫瘍壊死因子活性を
モニターした。結果を図３に示す。

【０１００】実施例６ クロマトフォーカシング クロマトフォーカシング(Ｃhromatofocusing)は、実施
例５で用いたＦＰＬＣ系においてファルマシアモノＰカ
ラムを用いることにより、行った。実施例５におけるフ
ラクション番号３７〜４５で溶出した生物学的に活性
(腫瘍壊死因子活性)なフラクションを濃縮し、ＹＭ−１
０半透膜を使用し、アミコン・スター・セル中で、カラ
ム平衡化緩衝液(０.０２５Ｍビス−トリスＨＣl、pＨ
６.７)に対して透析した。試料を、室温において、流速
１ml／minでスーパーループからモノＰカラムに充填し
た。このカラムを、２８０nmにおける吸収が基準線に戻
るまで平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、このカラムをp
Ｈ４.７において７.５％ポリバッファー７４(ファルマ
シア)で洗浄することからなる線状pＨグラディエントに
より、溶離した。フラクションを１mlづつ集め、溶出液
の２８０nmにおける吸収およびpＨを記録した。結果を
図４に示す。図４から分る様に、腫瘍壊死因子の等電点
は約５.３である。

【０１０１】実施例７ プレパラティブＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動 Ｕ.レムリ(Ｕ.Ｌemmli)の方法(１９７０、“ネイチャ
ー"２２７:６８０−６８５)の改良法により、厚さ１.５
−３.０mmの１５％ポリアクリルアミドゲル(１１×１６
％)を調製した。分離用(レゾルビング)ゲルおよび堆積
用(スタッキング)ゲルはいずれも０.１％ＳＤＳと０.０
５％Ｔween２０を含有していた。その他、緩衝液や交差
結合用試薬の濃度は分析法ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの場合
と同様である。実施例５または６の方法で得た腫瘍壊死
因子活性を有するフラクションをプールして濃縮し、ア
ミコン・スター・セル中でＹＭ−１０半透膜を使用し、
０.００５％ＳＤＳを含有する６.２５mＭトリスＨＣl(p
Ｈ７.０)に対して透析した。透析濃縮物を除いた後、半
透膜を少量の試料緩衝液[０.２％ＳＤＳ、０.０２％Ｔw
een２０、３０％グリセリン、０.０３ＭトリスＨＣl、p
Ｈ６.８、０.００５％の追跡染料(トラッキングダイ)]
で３回洗浄した。透析濃縮物および洗液をプールし(全
量１−４ml)、所望によりメルカプトエタノールを加え
てＳＤＳ ＰＡＧＥ 還元条件にし、この試料をスタッ
キング・ゲル内の大きいウエル鋳型中に充填した。試料
の入ったウエルに隣接する小さいウエルは、予め染色さ
れた分子量マーカーのホスホリラーゼ−a(９４Ｋ)、ウ
シ血清アルブミン(６７Ｋ)、オバルブミン(４３Ｋ)、炭
酸脱水酵素(３０Ｋ)、大豆トリプシン阻害物質(２０Ｋ)
およびリゾチーム(１４.４Ｋ)のために用いた。このゲ
ルをバイオラッド(Ｂiorad)垂直電気泳動系で１２℃で
冷却して、追跡用染料がゲルの下端に達するまで、２０
mＡ／mm(ゲルの厚み)の一定の電流により、展開させ
た。

【０１０２】電気泳動の後、ガラス平板の１つをゲルか
ら除去し、分子量マーカーの位置を記した。次いで、用
いた腫瘍壊死因子試料のレーンを、マーカータンパク質
の分子量と一致させ、０.２５cmの断片に切り分けた。
これらのゲル断片を、１０mＭ重炭酸アンモニウム１−
２mlおよび０.０１％Ｔween２０、pＨ８の入ったポリプ
ロピレンチューブに入れ、４℃で１６時間、溶離した。
次いで溶出液の腫瘍壊死活性を測定した。結果を図５に
示す。ＳＤＳゲルに基く腫瘍壊死因子の分子量は、還元
または非還元条件のいずれにおいても約１７,０００で
あり、これが一本鎖分子の分子量であることを示してい
る。

【０１０３】ゲル断片の溶出液を以下の如く処理し、該
溶出液から塩類および低分子量物質を含まない状態で所
望のタンパク質を回収した:即ち、予めアセトニトリ
ル、１−プロパノール、１％トリフルオロ酢酸、および
蒸留水で洗浄し、次いで０.０１％Ｔween２０、pＨ８.
０を含む１０mＭ重炭酸アンモニウムで平衡化されたＳe
p−pak Ｃ１８樹脂０.２mlを入れた小さいカラムを調製
した。このカラムにゲル溶出液を充填し、溶出液を収集
した。次いで、この樹脂を約５mlづつの蒸留水および
０.１％ＴＦＡで洗浄し、遊離アミノ酸と緩衝液の塩類
を除去した。腫瘍壊死因子は、０.１％ＴＦＡ中に５０
％１−プロパノールを含む混合物でこの樹脂から溶離さ
れた。更に、１mlづつの１％ＴＦＡ中の５０％１−プロ
パノール、および１％ＴＦＡ中の９９％１−プロパノー
ルによって溶離させたが、通常、タンパク質は最初に用
いた緩衝液によって溶離された。この段階で約８０％の
腫瘍壊死因子の生物学的活性が失われた。この様にして
得られた腫瘍壊死因子を配列決定に用いることはできる
が、この使用目的には、次の実施例８で述べるＨＰＬＣ
で得られる溶出液の方が好適である。

【０１０４】実施例８ 高速液体クロマトグラフィー 固有の、無傷の腫瘍壊死因子の分子量を高速ゲル浸透ク
ロマトグラフィーで測定した。これは、ＴＳＫＧ２００
０ＳＷゲルＨＰＬＣカラム[オールテックアソシエーツ
(Ａlltech Ａssociates)ディアーフィールド、１ Ｌ]
(７.５×６０mm)を使用し、室温で行った。およそ、１
μgのタンパク質と１５,６００単位の活性を含有する。
実施例５から得られた精製腫瘍壊死因子の試料１mlを、
０.２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液(pＨ７.０)を用いて流
速０.５ml／minで、このゲルカラムからイソクラティッ
ク(isocratic)に溶出させた。カラムをウシ血清アルブ
ミン(ＭＷ６６,０００)、オバルブミン(ＭＷ４５,００
０)、ウシ炭酸脱水素酵素(ＭＷ２９,０００)およびリゾ
チーム(ＭＷ１４,３００)により、検定した。１mlのフ
ラクションを得、その腫瘍壊死活性を測定した。腫瘍壊
死因子活性を示すフラクションは分子量４５,０００±
６,０００に相当する位置で溶出した。

【０１０５】実施例９ 逆相ＨＰＬＣ 腫瘍壊死因子を、既知のクロマトグラフシステムであ
る、Ｃ４シンクロパックカラム(Ｓynchropack colum)
[ウォーターズ・アソシエーツ(Ｗater's Ａssociates,
Ｉnc.)]を用いた逆相ＨＰＬＣをも用いて精製した[Ｗ.
コール(Ｗ.Ｋohr)ら、１９８２、アナリティカル・バイ
オケミストリィ、１２２:３４８−３５９]。このカラム
を最初の１５分間は０.１％ＴＦＡ水溶液中１−２３％v
／v １−プロパノール、続く１５分間は０.１％ＴＦＡ
中２３−３０％v／v １−プロパノールを用いて、流速
１ml／minで線状グラディエント溶出し、２１０nmおよ
び２８０nmにおけるタンパク質ピークを検出した。ピー
クに相当する部分の細胞溶解活性を測定した。Ｃ４カラ
ムから腫瘍壊死因子を溶出させるのに用いた有機溶媒に
よって、腫瘍壊死因子活性が約８０％減少した。この様
にして精製した腫瘍壊死因子を真空乾燥し、次いでアミ
ノ酸分析および配列決定に付した。結果を図７に示す。
図７は、実施例５で調製した溶出液から得られた腫瘍壊
死因子が保持時間約１６および１９分で溶出する生物学
的に不活性な汚染タンパク質を含有していることを示し
ている。Ｃ４−ＲＰ−ＨＰＬＣから得られる生物学的に
活性な溶出液はアミノ末端配列を基準にしたとき、実質
的にホモジーニアスである。

【０１０６】実施例１０ 腫瘍壊死因子の部分アミノ酸
配列 以下の如くにして腫瘍壊死因子をトリプシン消化した:
実施例９で得たホモジーニアスな腫瘍壊死因子を乾燥
し、これを、５％w／w ＴＰＣＫトリプシン[ウーシント
ン・バイオケミカルス(Ｗorthington Ｂiochemical
s)]、１mＭ ＣaＣl₂および０.０１％Ｔween２０(酵素:
基質、１:２０)を含有する１００mＭ重炭酸アンモニウ
ム緩衝液(pＨ８.０)に再溶解して３７℃で６時間インキ
ュベートし、次いで５％のトリプシン(重量％)を追加
し、得られた加水分解混合物を更に１２時間、３７℃で
インキュベートした。ペプチドフラグメントを分離する
ために、この反応混合物を上記の如く、Ｃ₄ＨＰＬＣに
適用した。結果を図８に示す。９フラグメントの全てが
示されている(図８において、フラグメント２と２'は、
Ｔ２と名付けたピークの位置で、一緒に溶出した)。第
１０番目のフラグメントはこのカラムに保持されないと
思われる。

【０１０７】実施例８および９で得た無傷の腫瘍壊死因
子および本実施例で得たトリプシン加水分解フラグメン
トのアミノ酸配列は、コールド・トラップ(冷却トラッ
プ)を備えた、ベックマン・シーケンサー(Ｂeckman se
quencer)モデル８９０Ｂの改良機種を用いて、自動配列
決定用エドマン分解法(automated sequential Ｅdman
degradation)により、決定した。カップ中の担体には
ポリブレン(polybrene)１.２５mgを用いた。無傷の分子
のアミノ酸組成に基く無傷の腫瘍壊死因子の分子量は１
７,１００であった。この数値はＳＤＳ−ＰＡＧＥから
のデーターと一致しており、グリコシル化されていない
ことが確認された。

【０１０８】実施例１１ 腫瘍壊死因子とγ−インター
フェロンとの相乗作用 Ｃ５７Ｂ１／６起源のセルラインの１つである、ネズミ
・メラノーマ(色素細胞種)Ｂ１６[メイソン・リサーチ
(Ｍason Ｒesearch)、ウオセスター、ＭＡ]の細胞をマ
イクロタイター平板に、５,０００細胞／ウエルの割合
でまき、リンホカイン類を加えるまで、５％ＣＯ₂−加
湿インキュベーター内で、３７℃において４時間インキ
ュベートした。実施例１で得た腫瘍壊死因子をＨＰＬＣ
により、実質上、均質になるまで精製し、その生物学的
活性を、前に述べたＬ９２９細胞の細胞溶解に基くバイ
オアッセイによって測定した。同様に、精製組換えネズ
ミγ−インターフェロン[p.グレイ(Ｐ.Ｇray)ら、１９
８３“プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミィ・オブ・サイエンスイズ、ＵＳＡ"８０:５８４
２−５８４６]の、ＥＭＣ−感染Ｌ細胞[Ｄ.ゲッデル
ら、１９８０、“ネイチャー"(ロンドン)２８７:４１１
−４１６]に対する抗ウイルス活性を測定した。ネズミ
γ−インターフェロンとヒト腫瘍壊死因子とを、図１０
に示す如く別々に希釈した。まず最初にγ−インターフ
ェロンを意図するウエルに入れ、その直後に希釈した腫
瘍壊死因子を、最終容量０.２ml／ウエルとなる様に加
えた。７２時間インキュベーションした後、細胞を２０
％メタノール中０.５％クリスタルバイオレットで染色
した。結果を図１０に示す。Ｂ１６は腫瘍壊死因子また
はＩＦＮ−γのいずれに対しても、単独ではかなり抵抗
性を有する;腫瘍壊死因子１,０００単位／mlの場合に
は、肉眼で観察し得る細胞溶解は認められなかった。し
かしながら、極く少量のγ−インターフェロン(５単位
／mlという少量)を加えただけで、細胞溶解が起きた。

【０１０９】実施例１２ メッセンジャーＲＮＡの単離 ＨＬ−６０細胞培養(ＰＭＡ誘導後４時間目)または実施
例２と同様に培養した末梢血中の単球細胞培養から、実
施上、ワード(ward)らの報告(１９７２、“ジャーナル
・オブ・ヴイロロジィ"９:６１)に従い、全ＲＮＡを抽
出した。遠心して細胞をペレット化し、１０mＭ ＮaＣ
l、１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ７.５)、１.５mＭ ＭgＣl
₂の混合物中に再懸濁した。ＮＰ−４０(終濃度１％)を
加えて細胞を溶解し、遠心して核をペレット化した。全
ＲＮＡを含む上清をフェノールおよびクロロホルムによ
る複数回抽出に付し、更に精製した。水層を０.２Ｍ Ｎ
aＣlに調節し、２倍容のエタノールを加えることによ
り、全ＲＮＡを析出させた。培養細胞１gからの全ＲＮ
Ａの収量は、通常約６mgであった。Ｈ.アビブ(Ｈ.Ａvi
v)らの方法(１９７２、“プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ、ＵＳ
Ａ"６９ １４０８−１４１２)に従い、オリゴ(dＴ)セ
ルロースを用いてポリアデニル化mＲＮＡ(約１００μg)
を得た。

【０１１０】実施例１３ cＤＮＡライブラリィ 実施例１２で調製したポリ(Ａ)⁺mＲＮＡ７.５μgに、逆
転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼクレノー(Ｋlenow)フラ
グメント、およびＳ１ヌクレアーゼを順次作用させるこ
とにより、これを二本鎖cＤＮＡに変換した[Ｐ.グレイ
(Ｐ.Ｇray)ら、１９８２“ネイチャー"２９５:５０３−
５０８;Ｍ.ウィッカーズ(Ｍ.wickers)ら、１９７８“ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ"２５
３:２４８３−２４９５]。ポリアクリルアミドゲルか
ら、鎖長６００bp以上のcＤＮＡ約８０ngを単離した。

【０１１１】このcＤＮＡに、式:

【化１】 ５'ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＴＴＡＣＡＧ ３' ３'ＧＴＡＣＧＣＡＡＧＡＡＴＧＴＣ ５' で示される合成ＤＮＡアダプター配列をライゲート(結
合)させ、ＥcoＲＩ粘着末端を作成した。当該技術分野
では常法であるが、このアダプターは、２本の鎖を別々
に合成し、１方の鎖の５'末端をポリヌクレオチドキナ
ーゼでりん酸化した後、２本の鎖をアニールすることに
より、化学合成した。次いでcＤＮＡをポリアクリルア
ミドゲルから再単離し、ＥcoＲＩ消化λgt−１０にライ
ゲーションすることにより、挿入し、ファージ粒子(パ
ーティクル)にパッケージし、次いで大腸菌Ｃ６００hf
１株[ヒユイ(Ｈuynh)ら、１９８４、プラクティカル・
アプローチイズ・イン・バイオケミストリィ(Ｐractica
l Ａpproaches in Ｂiochemistry)、ＩＲＬ Ｐress
ＬＴＤ.オックスフォード、イギリス]またはその他
の、ラムダ・ファージの増殖に適した既知の菌株内で増
殖させた。約２０,０００の独立したクローンからなるc
ＤＮＡライブラリィが得られた。

【０１１２】実施例１４ 腫瘍壊死因子cＤＮＡのため
のデオキシオリゴヌクレオチドプローブの製造 腫瘍壊死因子のトリプシン処理(トリプチック)ペプチド
ＴＤ６(Ｅ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｋ−Ｐ−Ｗ
−Ｙ−Ｅ−Ｋ−)の予備的なアミノ酸配列を基に、公表
されているコドン利用頻度[Ｒ.グランサム(Ｒ.Ｇrantha
m)ら、１９８１、“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"９:４３−７４]、およびヒトＩＦＮ−γのコドンバ
イアス(性癖)[Ｐ.グレイら、１９８２“ネイチャー"２
９５:５０３−５０８]、並びにヒトリンホトキシンの配
列に基づいて、４２ヌクレオチドからなるＤＮＡハイブ
リダイゼーションプローブを設計した。調製に用いた上
記の配列は間違っていた(最後のＫはＰであるべきであ
った)。それにも拘らず、この配列からのプローブ作成
は成功であった。合成プローブの配列は、式:

【化２】 ５'dＧＡＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣ ＴＧＧＴＡＴＧＡＡＡＡＧ３' で示され、その合成は、Ｒ.クレア(Ｒ.Ｃrea)らの方法
(１９８０、“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"８:
２３３１−２３４８)に従って行われた。既知の方法(ゲ
ッデルら、１９７９、“ネイチャー"２８１:５４４)に
従って、(γ−³²Ｐ)ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼにより、このプローブをりん酸化した。

【０１１３】実施例１５ 腫瘍壊死因子の暗号(コーデ
ィング)配列を含有するcＤＮＡクローンの同定 λgt１０cＤＮＡライブラリィからの、約２００,０００
個の組換えファージを、実施例１４で調製した。³²Ｐ−
標識４２マ−(量体)を用い、Ａ．ウールリッヒ(Ａ．Ｕl
lrich)らの低ストリジエンシィ条件[１９８４、"ＥＭＢ
Ｏジャーナル"３:３６１−３６４、あるいは、Ｐ.グレ
イら、１９８３、“プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ ＵＳ
Ａ"８０:５８４２−５８４６、Ｓ.アンダーソン(Ｓ.Ａn
derson)ら、“プロシーディングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ ＵＳＡ"８
０:６８３６−６８４２、または、Ｍ.ジャエ(Ｍ.Ｊaye)
ら、１９８３“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"１
１:２３２５−２３３５]の下で、ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法により、スクリーンした。９個の別個のクロ
ーンがプローブとハイブリダイズし、得られたプラーク
を精製した。次いで、非−誘導ＨＬ−６０細胞から得た
mＲＮＡを用いて³²Ｐ−標識cＤＮＡを調製した。これら
９個のファージクローンの内７個は、この“非誘導プロ
ーブ"とハイブリダイズせず、従ってこれらを腫瘍壊死
因子のcＤＮＡ配列に関する候補者と判定した。最も大
きい挿入体を含有しているcＤＮＡクローンをλ４２−
４と命名した。この挿入体をベクターＭ１３mp８[Ｊ.メ
ッシング(Ｊ.Ｍessing)ら、１９８１、“ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ"９:３０９−３２１]にサブクロ
ーンし、ジデオキシ鎖ターミネーション法[Ａ．スミス
(Ａ．Ｓmith)１９８０、“メソッド・イン・エンザイモ
ロジィ"６５:５６０−５８０およびＦ.サンガー(Ｆ.Ｓa
nger)ら、１９７７“プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ ＵＳ
Ａ"７４:５４６３−５４６７]により、配列決定した。

【０１１４】λ４２−４に関して得られたcＤＮＡ配列
は、全成熟腫瘍壊死因子およびその信号ペプチドの一部
分を表す暗号領域を含んでいた。このＤＮＡの正しい方
向性および解読フレームを、腫瘍壊死因子のトリプシン
処理ペプチドＴ４のアミノ酸配列との比較に基いて推定
した。タンパク質配列決定によって定められた腫瘍壊死
因子のアミノ末端のバリン残基をアミノ酸を１とする
と、解読相内の終止コドンの前まで、さらに１５６個の
アミノ酸が後続している。分子量の計算値は１７,３５
６ダルトンである。

【０１１５】実施例１６ 完全なプレＴＮＦ暗号配列を
含有しているcＤＮＡクローンの同定 cＤＮＡクローンλ４２−４は、それが開始コドンを有
していないことで証明される様に、成熟ＴＮＦの全暗号
領域は含んでいるが、完全なシグナルペプチドの暗号配
列は有していない。この失なわれている配列に関する情
報を得るために、ヘキサデカヌクレオチドプライマー:d
ＴＧＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＣＴＣＣ(図１０のヌクレオ
チド８５５〜８７０に相補的な配列)を化学合成した。
このプライマーを、実施例１２で得たmＲＮＡにアニー
ルし、次いで、実施例１３の方法に従ってcＤＮＡを合
成した。実施例１３に記載の方法に従い、λgt１０内
で、約２００,０００cＤＮＡクローンからなる新しいラ
イブラリィを調製した。このライブラリィを、³²Ｐ−標
識を付されたλ４２−４cＤＮＡ挿入体をプローブに用
いて、ハイブリダイゼーション法でスクリーンした。１
６個の陽性クローンが得られ、その内最長のクローン
(λ１６−４)は、λ４２−４挿入体の５'側から、更に
３３７bp伸長しているcＤＮＡ挿入体を含有していた。
λ１６−４のＴＮＦ cＤＮＡ挿入体(ヌクレオチド１−
８７０)およびλ４２−４の挿入体(ヌクレオチド３３７
−１６４３)の合成配列を図１０に示した。

【０１１６】実施例１７ 腫瘍壊死因子の直接発現のた
めの発現ベクターの組立て 実施例１５で得た、腫瘍壊死因子のためのcＤＮＡを発
現させるのに用いた方法は図１１に示されている。実施
例１５において得られた、全成熟壊死因子の暗号配列と
部分的な推定の腫瘍壊死因子分泌リーダーとを含有して
いるファージλ４２−４をＥcoＲＩ消化し、腫瘍壊死因
子暗号領域を含む約８００bpフラグメントを回収した。
このフラグメントをＡva ＩおよびＨind ＩＩＩで消化
し、５７８bpフラグメント(図１１において“Ｃ"と表示
されている)を回収した。このフラグメントは、腫瘍壊
死因子のアミノ酸８−１５７をコードしている。

【０１１７】５'末端にＸba Ｉ粘着末端、３'末端にＡv
a Ｉ粘着末端、さらにmet開始コドンおよび腫瘍壊死因
子の最初の７個のアミノ末端アミノ酸のためのコドンが
一体となっている合成デオキシオリゴヌクレオチド(図
１１においてフラグメント“Ｂ"と表示されている)を調
製した(実施例１３のアダプター配列の組立て方法参
照)。これらのアミノ酸に関するコドンは大腸菌にとっ
て好都合な様に選択された。開始コドン上流のＡＡＴＴ
配列は、開始コドンとリボゾーム結合配列との間隔を適
当にし、アミノ酸コドンとの結合により、メッセンジャ
ーＲＮＡのループ構造が生じる可能性を失くする様、選
択されている。

【０１１８】セグメントＢおよびＣを、trpリーダーペ
プチドのシャイン−ダルガノ(Ｓhine−Ｄargano)配列
(ヨーロッパ特許出願公開番号３６７７６)とtrpプロモ
ーターとを含んでいるpＢＲ３２２誘導体とによる３重
ライゲーションで結合させた。上記誘導体はtrpプロモ
ーターとＴet^R 遺伝子との間に１個のＸba ＩおよびＨi
ndＩＩＩ部位を含んで得られ、または含む様、設計され
ている。この型のベクターの出発物質としては、pＬＴt
rp１(グレイら、１９８４“ネイチャー"３１２:７２１
−７２４)またはptrpＥＴＡ(グレイら、１９８４“プロ
シーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・
オブ・サイエンスイズ ＵＳＡ"８１:２６４５−２６４
９)が適するが、pＢＲ３２２、trpプロモーターおよび
必要な合成リンカーから組立てることもできる。pＢＲ
３２２およびtrpプロモーターを含むプラスミドは公の
施設から入手し得る。選択された、ベクター中のpＢＲ
３２２部分は、bp１４２４から２０６５までのＡva Ｉ
−Ｐvu ＩＩセグメントを欠失したもの(プラスミド名
“ＸＡＰ"を表わす)であってもよい。前記のプラスミド
の内、任意のものをＸba ＩおよびＨind ＩＩＩで同時
に消化し、大きいベクターフラグメントを回収する。こ
のフラグメント、フラグメントＢおよびフラグメントＣ
をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートし、得られたライゲ
ーション混合物を用いて大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４
４６)を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを選
択し、プラスミドＤＮＡを回収して制限エンドヌクレア
ーゼマッピングおよびＤＮＡ配列決定により、特徴づけ
た。挿入体ＢおよびＣを含有しているpＴrpＸＡＰＴＮ
Ｆが得られた。

【０１１９】実施例１８ 大腸菌内での腫瘍壊死因子の
発現

【０１２０】pＴＮＦtrpで形質転換した大腸菌ＡＴＣＣ
３１４４６をアンピシリン２０μg／mlを含有するＭ９
培地で増殖させ、培養物をＡ₅₅₀＝０.３に達するまで増
させた。インドール酢酸を終濃度２０μg／mlまで加
え、培養物をＡ₅₅₀＝１まで増殖させた。細胞１０mlを
濃縮し、りん酸緩衝化食塩水に懸濁させた。細胞を音波
処理し、実施例１の分析法によって腫瘍壊死因子を測定
するために希釈した。培養物１ml当り約１０⁵単位の活
性が得られた。この活性は、ヒト腫瘍壊死因子に対して
免疫されたウサギから得たウサギ抗血清と一緒にプレイ
ンキュベーションすることにより、中和された。

【０１２１】実施例１９ 大腸菌内での腫瘍壊死因子の
発現 この方法は実施例１８の方法よりも好ましい。前記ベク
ターを使用するための宿主は非−リバータブル(非−復
帰型)のtonＡ大腸菌株が好ましい。この様な菌株はバク
テリオファージ耐性であるため、野生型菌株よりも大規
模な培養に適している。この様な菌株を得るために適し
た方法を以下に示す。Ｅ.coli Ｗ３１１０を、トランス
ポーザブルエレメントＴn１０を含有しているラムダバ
クテリオファージ、λ::Ｔn１０によって形質導入(トラ
ンスジュース)し、大腸菌Ｗ３１１０のＴn１０ hop poo
l(ホップ・プール)を得た[Ｎ.クレッカー(Ｎ.Ｋlecker)
ら、１９７７“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジィ"１１６:１２５]。

【０１２２】この大腸菌Ｗ３１１０::Ｔn１０ hop pool
を３７℃において、細胞密度が約１×１０⁹／mlに達す
るまで増殖させた。培養物０.５mlを遠心し、得られた
ペレットを７.０×１０⁹のpfuを含むλphi８０(または
Ｔ１)リゼイト(溶菌液)０.２mlに懸濁した。３７℃で３
０分間、ファージを吸着させた。次いでこの懸濁液を、
テトラサイクリン(１５μg／ml)を補充したＥＭＢ平板
上に広げた。３７℃で一夜インキュベートした後、薄桃
色のコロニーを３mlのＬブロスにプールし、３７℃で一
夜増殖させた後、２回洗浄し、再びＬブロスに懸濁させ
た。この培養物をバクテリオファージＰ１ kcに感染さ
せ、ファージリゼイトを回収した[Ｊ.ミラー(Ｊ.Ｍille
r)１９７２“分子生物学実験(Ｅxperiments in Ｍole
culer Ｂiology)"コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリィ(Ｃold Ｓpring Ｈarbar Ｌaboratory)
p３０４]。

【０１２３】このＰ１ kcリゼイトで形質導入し、大腸
菌ＡＴ９８２[no.４５４６、イー・コリ・ジェネティッ
ク・ストック・センター(Ｅ.coli Ｇenetic Ｓtock
Ｃenter)ニューヘブン、コネクチカット]をテトラサイ
クリン耐性にした。形質導入体を、テトラサイクリン
(１５μg／ml)とdap(ジアミノピメリン酸)(４０μg／m
l)と含んだＬブロス平板上で選択した。得られた形質導
入体をテトラサイクリン耐性およびdap遺伝子(dap⁺、te
t^R )の再生に関してスクリーンした。次いで、dap⁺、te
t^R 形質導入体のλphi８０(またはＴ１)耐性を試験し
た。

【０１２４】次いで数個のdap⁺、tet^R 、λphi８０(ま
たはＴ１)耐性菌株について、Ｐ１ kcリゼイトを作成し
た。大腸菌Ｗ３１１０をテトラサイクリン耐性にするた
めに、このリゼイトを用いて形質導入した。形質導入体
をλphi８０(またはＴ１)耐性に関してスクリーンし
た。

【０１２５】テトラサイクリン感受性単離体をＷ３１１
０fhuＡ::Ｔn１０−λphi８０Ｒ形質導入体から選択し
た[Ｓ.ナロイ(Ｓ.Ｎaloy)ら、１９８１"ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジィ(Ｊ.Ｂect)"１４５:１１１０]。
これらの単離体の単１のコロニーを精製した後、そのフ
ァージλphi８０耐性およびテトラサイクリン感受性を
調べた。

【０１２６】数個のテトラサイクリン感受性λphi８０
ファージ耐性突然変異体からＤＮＡを単離し、Ｓst Ｉ
Ｉで消化した。このＳst ＩＩ消化ＤＮＡを、放射活性
に標識され、Ｓsst ＩＩで消化されたλ::Ｔn１０ＤＮ
Ａをプローブに用いたサザーン・ブロット法に適用し、
Ｔn１０が切除されたか否かに関して特徴付けた[Ｒ.デ
イビス(Ｒ.Ｄavis)ら、１９８０“アドバンスド・バク
テリアル・ジェネテックス(Ａdvanced Ｂacterial Ｇ
enetics)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リィ]。テトラサイクリン感受性単離体の内の１つが、
λ::Ｔn１０、並びに元のＷ３１１０fhuＡ::Ｔn１０λp
hi８０Ｒとのハイブリダイゼーションの場合に比較し
て、２本のＴn１０ハイブリダイゼーション・バンドを
有していないことが明らかになった。三本目のハイブリ
ダイゼーション・バンドは移動度が変化しており、不正
確なＴn１０の切除に起因する欠失が起こっていること
を物語っている。

【０１２７】不正確なＴn１０切除に係る株から調製し
た外層膜標本のＳＤＳ−ゲル電気泳動により、fhuＡタ
ンパク質のものと推測されるバンドの電気泳動における
移動度は野生型fhuＡタンパク質のそれとの比較におい
て、変化していることが分った。得られたタンパク質
は、λphi８０ファージ受容体タンパク質としての機能
を有していなかった。これもまたＴn１０の不正確な切
除に係る、第２の独立した株は、ＳＤＳゲルにかけたと
き、fhuＡタンパク質の存在を示さなかった。

【０１２８】これらの菌株はどれもテトラサイクリン耐
性またはλphi８０感受性株への復帰を証明するもので
なく、fhuＡ遺伝子の部分的な、または完全な欠失を伴
なう、Ｔn１０トランスポゾンの全て、または一部の不
完全な切除が起きていることを示すものであった。その
様なＷ３１１０株(ＮＬ１０６)の内の１つを、本明細書
に示すＴＮＦ−暗号化ビヒクルの宿主として用いること
が好ましい。

【０１２９】ＮＬ１０６をptrpＸＡＰＴＮＦで形質転換
し、以下の組成の培地(pＨ７.４)１０ Ｌに接種した。

【表２】 成 分 gms／Ｌ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ５.０ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ６.０ ＮaＨ₂ＰＯ₄ ３.０ クエン酸・Ｎa １.０ Ｌ−トリプトファン ０.２ ＮＺアミンＡＳ ４.０ 酵母エキス ４.０ ＭgＳＯ₄ １.２ グルコース ２５.０ 微量原素溶液 (Ｆe、Ｚn、Ｃo、Ｍo、 Ｃu、ＢおよびＭnイオン) ０.５ml テトラサイクリン １.０mg

【０１３０】培地のＡ₅₅₀が約２０に達した時点でグル
コースを培地に１g／min速度で加えた。Ａ₅₅₀が１３６
に達するまで、３７℃で発酵させた(約２０時間)。この
培養物を遠心して細胞ペーストを形成させ、次いでこの
ペーストを、５０mＭトリス、１０mＭ ＥＤＴＡ、１０
００mＭ ＮaＣl、２０００mＭ尿素および０.１％β−メ
ルカプトエタノールを含む緩衝液により、pＨ８.０にお
いて室温で３０分間抽出した。この抽出液を希釈し、実
施例１で述べた如くにして分析した。この分析で、腫瘍
壊死因子１mgと等価の活性として１×１０⁸単位の腫瘍
壊死因子活性が確立された。培養物１ Ｌから、最高約
２gの腫瘍壊死因子活性が得られた。アミノ末端配列決
定により、約７５〜８６重量％がバリルアミノ末端(成
熟)腫瘍壊死因子であり、残りはmet−ＴＮＦであること
が分った。更に、高レベルの発現に加えて、得られたタ
ンパク質は屈析体の状態で存在することがないばかり
か、それが得られた細胞は非常に高密度であるという理
由から、他の毒性を有していないと思われる。

【０１３１】実施例２０ 突然変異腫瘍壊死因子遺伝子
の組立ておよび発現 この実施例においては、アルギニン６コドンＣＧＴの代
りにヒスチジンコドンＣＡＴを含むオリゴヌクレオチド
フラグメントＢを合成することを除いて、実施例１７−
１８の方法を踏襲して行なった。突然変異的腫瘍壊死因
子は発現された。

【０１３２】実施例２１ 他の突然変異体腫瘍壊死因子
遺伝子の組立て この実施例においては、残基２のアルギニンコドンの代
りにロイシン(ＣＴＴ)をコードしているオリゴヌクレオ
チドフラグメントＢを用いて実施例１７−１８と同様に
行った。最初の試みで、培養物１ Ｌから約１２００mg
の成熟ＴＮＦ活性が得られた。培養物中から、プロセス
されていないＴＮＦは検出されなかった。

【０１３３】実施例２２ 分泌シグナル配列との腫瘍壊
死因子融合物をコードしているベクターの組立て

【０１３４】大腸菌の熱に安定なエンテロトキシ遺伝子
ＳＴ ＩＩは、ピッケン(Ｐicken)らによって示された
[１９８３“感染症と免疫(Ｉnfection and Ｉmmunit
y)"４２(１):２６９−２７５]。この実施例では、ＳＴ
ＩＩ分泌シグナルおよびシャイン−ダルガ／配列を含有
するフラグメントを大腸菌アルカリ性ホスファターゼプ
ロモーターの下流にライゲートした。このＳＴ ＩＩシ
グナルの３'側には、腫瘍壊死因子の最初の７個のアミ
ノ末端アミノ酸に関するコドンを与える合成オリゴヌク
レオチドおよび、残りの腫瘍壊死因子に関する暗号配列
が続いている。前記の配列全てをpＢＲ３２２ベクター
内で合体させた。

【０１３５】pＷＭ５０１[ピッケン(Ｐicken)ら、１９
８３“感染と免疫(Ｉnfection andＩmmunity)"４２
(１):２６９−２７５]は、このＳＴ ＩＩ遺伝子を含有
している。pＷＭ５０１をＸbo ＩおよびＮsi Ｉで消化
し、約９０bpのフラグメントを単離した。このフラグメ
ントも自体既知の方法で有機合成することができる(フ
ラグメントＡ)。

【０１３６】実施例１７の述べた如く(p２０kＬＴ)、p
ＢＲ３２２をＸba ＩおよびＨind ＩＩＩで消化し、大
きいベクターフラグメントを回収した(フラグメント
Ｂ)。このフラグメントは大腸菌の複製起源とアンピシ
リン耐性の表現型を付与する遺伝子を含有している。

【０１３７】２本の鎖として、合成オリゴヌクレオチド
を合成し、アニールして下記の構造のものを得た(この
オリゴヌクレオチドがコードしている制限部位粘着末端
およびアミノ酸も示されている)。

【化３】 ＶＡＬ ＡＲＧ ＳＥＲ ＳＥＲ ＳＥＲ ＡＲＧ ＴＨＲ ５' ＧＴＡ ＣＧＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＡＣＴ ３' ＡＣＧＴ ＣＡＴ ＡＣＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＣＡ ＴＧＡ ＧＧＣＴ ＮsiＩ ＡvaＩ これをフラグメントＣと命名した。

【０１３８】実施例１８で得たpＴＮＦ trpをＡva Ｉお
よびＨind ＩＩＩで消化した。５７８bpのＡva Ｉ−Ｈi
nd ＩＩＩフラグメントを回収した(フラグメントＤ)。
このフラグメントは、最初の７個のアミノ酸を除く全て
のＴＮＦ暗号配列を含有している。

【０１３９】ヘテロローガスなシャイン・ダルガノ(Ｓ.
Ｄ.)配列(trp)と結合した大腸菌アルカリ性ホスファタ
ーゼ(ＡＰ)プロモーターからなり、ＥcoＲ ＩおよびＸb
a Ｉ末端を有するＤＮＡ配列を次の様にして組立てた。
ＡＰプロモーターの一部を含有するＤＮＡフラグメント
をプラスミドpＨＩ−１[Ｈ.イノウエ(Ｈ.Ｉnoue)ら、１
９８１“ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ"１４６:
６６８−６７５]から単離した。もちろん、その他のＡ
ＰプロモーターＤＮＡを含有するあらゆる適当な供給源
を用いてよい。pＨＩ−１をＨpa Ｉ消化に付してプラス
ミドを開環させ、合成ＥcoＲ Ｉリンカー:

【化４】 ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣ ＣＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＧ をこのプラスミドにライゲートし、このリンカーを加え
たプラスミドをＥcoＲＩの過剰量で消化して全ＥcoＲ
Ｉ部位を開裂すると共に、Ｒsa Ｉ活性不足量のＲsa Ｉ
で消化して全Ｒsa Ｉ部位の部分的な開裂をもたらした
(これらＥcoＲ ＩおよびＲsa Ｉ処理法は、同時にでな
く連続的に行うこともできる)。ＥcoＲ Ｉ−Ｒsa Ｉ部
分消化により、ＡＰプロモーターを含有する４２０bpフ
ラグメントが得られた。

【０１４０】trpＳ.Ｄ.配列は以下の如くにして得られ
た。trpプロモーターを含有するプラスミドまたは生物
[pＩＦＮ−ベータ２、Ｄ.ルング(Ｄ.Ｌeung)ら、１９８
４、“バイオテクノロジィ(Ｂiotechnology)"２:４５８
−４６４]をＸba ＩおよびＲsaＩ消化し、trpＳ.Ｄ.配
列を含む３０bpフラグメントを回収した。このフラグメ
ントを４２０bpのＡＰプロモーターフラグメントにライ
ゲートし、４５０bpのＥcoＲ Ｉ−Ｘba Ｉフラグメント
Ｅを得た。フラグメントＥのヌクレオチド配列を次に示
す。

【０１４１】

【化５】

【０１４２】フラグメントＡ、Ｂ、ＣおよびＤを４重ラ
イゲーションに付し、得られたライゲーション混合物を
用いて大腸菌２９４を形質転換した。アンピシリンを含
んだＬＢ平板上で増殖させ、形質転換体を同定した。形
質転換体コロニーからプラスミドtrp ＳＴ ＩＩ ＴＮＦ
を単離した。このプラスミドＸba ＩおよびＥcoＲ Ｉで
消化してtrpプロモーターを除き、次いで大腸菌アルカ
リ性ホスファターゼプロモーターを含有する長さ４５０
bpのＥcoＲ Ｉ−Ｘba ＩフラグメントＥにライゲートし
た。得られたプラスミドをpＡＰＳＴ ＩＩ ＴＮＦと称
する。

【０１４３】実施例２３ 分泌シグナルリーダーとの腫
瘍壊死因子融合物の発現およびプロセッシング 大腸菌ＮＬ１０６をpＡＰＳＴ ＩＩ ＴＮＦによってト
ランスフェクトし、以下の組成を有する培地(pＨ７.０)
１０ lに接種した。

【０１４４】

【表３】 組 成 gms／Ｌ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ５.０ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２.６ ＮaＨ₂ＰＯ₄ １.３ クエン酸・Ｎa １.０ ＫＣl １.５ ＮＺアミンＡＳ ５.０ 酵母エキス ２.０ ＭgＳＯ₄ １.２ グルコース ２５.０ 微量元素溶液 (Ｆe、Ｚn、Ｃo、Ｎo、 Ｃu、ＢおよびＭnイオン) ０.５ml アンピシリン ２０.０mg

【０１４５】培養は、Ａ₅₅₀が１４０になるまで行うこ
とを除いて、前記実施例１９の方法と同様にして実施さ
れた、この時点で、培養物中には腫瘍壊死因子約４００
mg／lが含有されており、その約７０−８０重量％が適
当にプロセスされ、成熟タンパク質になっていることが
ゲル電気泳動によって示された。実施例１９において使
用した全細胞抽出法によって回収された腫瘍壊死因子活
性は、細胞の浸透圧ショックによって回収された活性と
ほぼ同様であった。

【０１４６】実施例２４ 付加的な腫瘍壊死因子誘導体
の組立ておよび発現 少くとも次に示す目的の１つまたはそれ以上をかなえる
ために、図１０に示したＴＮＦアミノ酸配列の突然変異
誘導体を調製した:目的とは、インビボでの半減期の延
長、細胞毒活性の増大、腫瘍細胞と正常細胞に対する細
胞毒活性の差異(正味の)の増大、診断用抗−ＴＮＦ抗体
を製造するためのＴＮＦ免疫原の調製、共有結合的な修
飾を施すために単１の部位を工作すること(例えば、Ｅ
ＭＩＴまたはＥＬＩＳＡ法での診断用試薬製品では、酵
素標識が共有結合的に結合している)、並びにＴＮＦの
物性(例えば溶解性やＰＩ等)を変えること等である。選
択された誘導体の所望の活性は自体既知の適当なアッセ
イを用いて常法通りスクリーンすることにより、測定さ
れる。

【０１４７】ＴＮＦまたはその誘導体は、非霊長類のＴ
ＮＦ配列に相当するＴＮＦを含まないことが好ましく、
また、非霊長類のアミノ末端(例えば、ウサギ腫瘍壊死
因子に特徴的なデスＶal Ａrg アミノ末端)や、配列:Ｖ
al−Ａrg−Ｓer−Ａrg−Ｔhr−Ｐro−Ｓer−Ａsp−Ｌys
−Ｐro−Ｖal−Ａla−Ｖal−Ｓer−Ｖal−Ａla−Ａsn−
Ｐro−Ａln−Ａla−Ｇlu−Ｇly−によって同定されるＴ
ＮＦ遺伝子[ウオン(Ｗang)ら、“サイエンス"２２８:１
４９−１５４、１９８５)のアミノ末端を有していない
ことが好ましい。

【０１４８】以下に示すＪ.アデルマン(Ｊ.Ａdelman)ら
の方法[“ＤＮＡ"２(３):１８３−１９３]に基く方法
は、サイレント突然変異を含んだ、または突然変異ＴＮ
Ｆをコードしている、あらゆる突然変異ＴＮＦＤＮＡ配
列を組立て、発現させる上で一般的に適用することがで
きる。重複を避けるために、Ａrg³²がヒスチジルに変換
され(置換による)、Ｈis７３が欠失され(欠失突然変
異)、そしてロイシルがＬeu１５７に融合している(挿入
による)、代表的な誘導体を例として示す。しかしなが
ら、同様の方法で他のあらゆる突然変異種も生成され得
ることは理解されるはずである。

【０１４９】腫瘍壊死因子−暗号ＤＮＡ内にサイレント
な、または発現される突然変異を生成させる他の方法は
当業者には知られている。突然変異ＤＮＡは、例えば、
単にその全配列を化学合成するか、あるいはその配列の
一部を合成し、このフラグメントを所望のＤＮＡの残余
部分にライゲートすることによって組立てることができ
る。ＤＮＡの化学合成は、技術者が、まず最初に天然起
源から腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡを得る、と
いう工程なしに、直接的に突然変異体を調製することを
欲する場合には有利な方法である。しかしながら、通常
は、出発物質であるＤＮＡは天然のアミノ酸(そのアレ
ル変異種も含めて)をコードしており、そのものから、
ある突然変異型誘導体を調製するのが望ましい。

【０１５０】突然変異型ＴＮＦ誘導体をコードしている
ＤＮＡの調製にあたっては、そのものから転写されたm
ＲＮＡに強力なステム・アンド・ループ構造を生ぜしめ
ない様、コドンを変化させることが望ましい。上記の如
き構造を回避することにより、通常、高収率をあげるこ
とができる。加えて、同様の理由から形質転換体宿主に
とって好ましいコドンを用いる必要がある。

【０１５１】適当な出発物質ＤＮＡはpＴrpＸ ＡＰＴＮ
Ｆ(実施例１７)をＥcoＲ ＩとＨindＩＩＩで連続消化
し、次いで、ＴＮＦ遺伝子含有フラグメントを単離する
ことにより得られる。該プラスミドのＥcoＲ Ｉ−Ｈind
ＩＩＩフラグメントである。このフラグメントはtrpプ
ロモーターとメチオニル−腫瘍壊死因子の構造遺伝子を
含有している。突然変異誘発に適した、この遺伝子の一
本鎖コピーを得るために、該ＥcoＲ Ｉ−Ｈind ＩＩＩ
フラグメントをファージＭ１３mp８ＲＦ−ＤＮＦ[Ｊ.メ
ッシング(Ｊ.Ｍessing)ら、１９８２“ジーン"１９:２
６９−２７６;“ＲＦ"は、複製可能な型のファージであ
ることを表す;このファージは市販品を入手し得る]のポ
リリンカー部位にクローンする。ＥcoＲ Ｉ−Ｈind Ｉ
ＩＩ消化混合物の一部を、予めＥcoＲ ＩとＨind ＩＩ
Ｉで消化したＭ１３mp８ＲＦ−ＤＮＡ１０ngを含むライ
ゲーション反応物に加える。室温で２時間インキュベー
トした後、このライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０３(市販品から入手可能な菌株;ＪＭ１０１も使用
できる)を形質転換する。形質転換された細胞をＸ−Ｇ
ＡＬ(ジブロモ−ジクロロ−インドリル−ガラクトシッ
ド)とＩＰＴＧ(イソプロピルチオガラクトシッド)とを
含んだトップ・アガー(top ager)により、平板培養し
た。無色のプラークから、ファージ感染された細菌性培
養物(１ml)を選び取り、これを、ミニスクリーン法[バ
ーンボイムおよびドーリィ(Ｂirnboim and Ｄoly)１
９８０"ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"７:１５１
３−１５２３]によるＭ１３mp８／ＴＮＦＲＦ−ＤＮＡ
の単離に用いた。得られた組換えファージＭ１３mp８／
ＴＮＦはＴＮＦ遺伝子の暗号鎖を担っていた。

【０１５２】部位指向的突然変異を誘発するために、以
下に図式的に示す様に、突然変異部位のどちらの側にも
伸びる１５塩基と相補的な配列を有するオリゴデオキシ
リボヌクレオチド(突然変異誘発オリゴマー)を合成し
た:式中、Ｎは相補的な塩基であることを表し、Ｍは挿
入、欠失または置換されるべき核酸を表す)。挿入体ま
たは欠失体は、遺伝子の下流部分を相内に保持するため
に、３つのグループの中で作成される。

【０１５３】

【表４】 欠失体のため: オリゴマーＤＮＡ (Ｎ)₁₅(Ｎ)₁₅ ベクター ＤＮＡ (Ｎ)₁₅(Ｍ)(Ｎ)₁₅ 置換体のため: オリゴマーＤＮＡ (Ｎ)₁₅(Ｍ₁)(Ｎ)₁₅ ベクター ＤＮＡ (Ｎ)₁₅(Ｍ₂)(Ｎ)₁₅ 挿入体のため: オリゴマーＤＮＡ (Ｎ)₁₅(Ｍ)(Ｎ)₁₅ ベクター ＤＮＡ (Ｎ)₁₅(Ｎ)₁₅ Ｍ₁は、塩基またはオリゴマーであるＭ₂と相補性を有さ
ない塩基またはオリゴマーを表わす。ここに、Ｍ₁は所
望の突然変異配列である。通常、オリゴマーは、一度に
１個以上の突然変異型を生成する様にも作られる。

【０１５４】Ａrg−his３２突然変異体のためのアンチ
センス(非転写)オリゴマーは、pＣＡＧ ＧＡＧ ＧＧＣ
ＡＴＴ ＧＧＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＣＡ
ＣＴＧ−ＯＨである。

【０１５５】Ｈis７３欠失突然変異体のためのオリゴマ
ーは、pＧＴＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＧＴ
ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＣＡ ＧＣＣ−ＯＨである。

【０１５６】Ｌeu１５８挿入突然変異体のためのオリゴ
マーは、pＴＧＴ ＴＣＧ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＡＡＧ
ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＣＣ−ＯＨである。

【０１５７】これらのプライマーは常法通り合成され
る。突然変異誘発法に用いるため、１０pmolのオリゴマ
ーまたはlacプライマー５'−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣ
ＡＣＧＡＣ−３'の各々を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ２単位を含む、５０mＭトリスＨＣl(pＨ７.５)、
０.１mＭ ＥＤＴＡ、１０mＭ ＭgＣl₂、１０mＭジチオ
トレイトール、０.１mＭ ＡＴＰの混合物１０μl中で、
３７℃において３０分間りん酸化する。プローブとして
用いるために(下記参照)、合成オリゴヌクレオチド２pm
olを、０.１mＭ ＡＴＰの代りに１μＭ γ−³²Ｐ ＡＴ
Ｐ(アマーシャム)を使用する外は上記と同様にりん酸化
した。比活性は常に５×１０⁶cpm／ピコモル(オリゴヌ
クレオチド鎖)以上である。

【０１５８】各オリゴマーおよびlacプライマーをファ
ージＭ１３mp８／ＴＮＦから得た一本鎖ＤＮＡとハイブ
リダイゼーションさせ、次いでプライマー延長させるこ
とにより、１方の鎖が突然変異型ＤＮＡを含んでいる、
部分的なヘテロ二本鎖ＤＮＡを得る。

【０１５９】この部分的ヘテロ二本鎖ＤＮＡを得るに
は、一本鎖Ｍ１３mp８／ＴＮＦ ＤＮＡ(３００ng)を、
１pmolづつのりん酸化オリゴマーおよびプライマーを含
有する(キナーゼ反応から得た一部を加える)１０mＭト
リス−ＨＣl(pＨ７.５)、０.１mＭ ＥＤＴＡおよび５０
mＭ ＮaＣlの混合物２０μl中で、８０℃(２分間)、５
０℃(５分間)および室温(５分間)加熱する。２単位の大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージフラグメントと２０
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する５０mＭトリス−
ＨＣl(pＨ８.０)、０.１mＭ ＥＤＴＡ、１２mＭ ＭgＣl
₂、１０mＭジチオトレイトール、０.７mＭ ＡＴＰ、０.
０７mＭ dＡＴＰ、および０.２mＭづつのdＧＴＰ、dＴ
ＴＰ、dＣＴＰの混合物３０μlを加えてプライマー延
(伸)長を開始させる。室温で３０分間経過した後、反応
混合物を３７℃で４時間、次いで４℃で一夜インキュベ
ートする。一部をフェノール抽出し、ＤＮＡをエタノー
ル沈殿させ、水１５μlに溶かす。これら各部分のＤＮ
Ａを大腸菌ＪＭ１０３の形質転換に用いる。

【０１６０】lacプライマーはファージと、オリゴマー
の５'位置で雑種形成する。プライマー伸長によってヘ
テロ二本鎖構造が安定化される。オリゴマーおよびプラ
イマーを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡ鎖の連結
がなされる様、酵素的にりん酸化しておく。

【０１６１】前記の部分Ｃ(１０μl)からのフェノール
抽出ヘテロ二本鎖ＤＮＡを２００単位のＳ₁ヌクレアー
ゼを含む０.０６Ｍ酢酸ナトリウム(pＨ４.５)、０.６Ｍ
ＮaＣl、０.６mＭ ＺnＣl₂の混合物１０μlに加える。
３７℃で５分間インキュベーションした後、酵母tＲＮ
Ａ(５μg)を加え、フェノール抽出とエタノール沈殿に
より、核酸を回収する。同じＳ₁条件下では、３０ngの
一本鎖Ｍ１３mp８ＤＮＡ(約１０,０００プラーク−形成
単位)は、ＤＮＡ形質転換分析において１００個以下の
プラークしか与えないが、同一量のＲＦ−ＤＮＡの場合
には、形質転換された性質の８０％以上が保持されてい
る。Ｓ₁−処理ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０３を形質
転換し、得られたファージをそのままの(in situ)プラ
ーク・スクリーニング法で分析する。

【０１６２】数百個の組換えＭ１３ファージプラークを
含んだ細菌平板(直径１５cm)を、別々のフィルターセッ
ト上に付した適当な標識オリゴマー(フィルター当り約
１０⁶cpm)を使用し、元の(親の)、あるいは突然変異体
の遺伝型両者に関し、in situ(そのままの)プラーク・
スクリーニング法[ベントン(Ｂenton)ら、１９７７“サ
イエンス"１９６:１８０−１８２]でスクリーンする。
４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ中において、５０℃で
一夜ハイブリダイゼーションする。フィルターを４５℃
で、２ＸＳＳＣ、０.０２％ドデシル硫酸ナトリウムに
より洗浄して風乾し、強化スクリーンを用いて−７０℃
においてＸ線にさらす。オリゴマーと突然変異ＤＮＡ鎖
とのハイブリダイゼーション(完全に相補的)を、出発物
質であるＤＮＡとのハイブリダイゼーションに対抗させ
て分割させる様、ハイブリダイゼーションのストリジエ
ンシィを変える必要がある(ＳＳＣ濃度を変えることに
より);各突然変異体は本質的に、並びに、置換、欠失ま
たは挿入された塩基の数に応じてハイブリダイズし得る
能力が変化するであろう。例えば、唯１個の塩基に関す
る突然変異体を検出する場合、その突然変異が微少な程
度である突然変異体と非−突然変異型の親ＤＮＡとを判
別するために、高いストリジエンシィを必要とするであ
ろう(例えば、１個のコドンの欠失または１−３塩基の
置換の場合、ハイブリダイゼーションプローブは突然変
異オリゴマーよりも小さいものでなければならない)。
一般に、この様なプローブは約１４〜２０塩基からな
る。突然変異体の欠失のスクリーニング作業は、配列の
喪失を検出するために、その欠失された配列を含む、ま
たは、その様な配列で構成されたプローブを用いること
により、容易なものとなる。ある特定のプラークから得
たＤＮＡがこのプローブとハイブリダイズしない場合に
は、目的とする配列の所望の喪失が起きていると結論し
得る。

【０１６３】標識したオリゴマーとハイブリダイズする
プラークを選択して取り、大腸菌ＪＭ１０３に接種す
る。上清から一本鎖(ss)ＤＮＡを調製し、細胞ペレット
から二本鎖(ds)ＤＮＡを調製する。このssＤＮＡを、Ｍ
１３普遍(ユニバーサル)プライマーまたは腫瘍壊死因子
ＤＮＡの突然変異領域の３'側に位置する合成オリゴマ
ー相補配列を用いて行う、クローンのジデオキシ配列決
定における鋳型に用いた。ジデオキシ配列決定の結果、
回収したプラークには突然変異ＤＮＡが含有されている
ことが確認された。その様なファージをＭ１３mp８／Ｔ
ＮＦmtntと命名する。

【０１６４】Ｍ１３mp８／ＴＮＦmtntをＥcoＲ ＩとＨi
nd ＩＩＩで消化し、ＴＮＦ−暗号化フラグメントを回
収する。pＴrp ＸＡＰＴＮＦをＥcoＲ ＩとＨind ＩＩ
Ｉで消化し、ベクターフラグメントを回収する。次いで
突然変異フラグメントをベクターフラグメントにライゲ
ートし、このライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｗ３
１１０,ＮＬ１０６、または２９４(ＡＴＣＣ３１４４
６)を形質転換する。実施例１８または１９の方法に従
って突然変異ＴＮＦを回収する。Ｍ１３突然変異誘発原
に関する情報はイギリス特許出願第２,７３０,２１９Ａ
によって提供されている。

【０１６５】この方法に従って得られた突然変異体は３
つのクラスに分けることができる:置換体、欠失体およ
び挿入体の３クラスであり、さらに、次の表１に示す如
く、再分割することができる。特に言及しない限り、突
然変異体は図１０に示す成熟腫瘍壊死因子の突然変異体
を表すものとする。

【０１６６】 表 ５ 突然変異の型 ＴＮＦ部位 支持された部位での 代表的な修飾 Ａ．置換 Ｉ．荷電性の程度にお ける修飾(改良) １． arg ６ his ２． lys ６５ arg ３． pro ２０ arg ４． asp １０ his ５． glu ５３ thr ６． gln ４７ asp ７． asp ４５ glnまたはasn ８． asn ３９ asp ９． asn ３４ gln １０． leu ２９ asp １１． tyr １１５ ile １２． glu １１６ lys １３． pro １１７ thr １４． glu １２７ tyr １５． lys １２８ his １６． ala １３４ tyr １７． glu １３５ lys １８． tyr １４１ pro １９． asp １４３ ser ２０． ala １４５ thr ２１． glu １４６ asn ２２． gln １４９ lys ２３． leu １２０ lys ＩＩ．親水性または疎水における修飾 １． leu ５７ tyr ２． ser ５２ leu ３． val ４１ tyr ４． gly １０８ phe ５． leu １２０ thr ６． ser １３３ gly ７． ala １３４ thr ８． gly １４８ ser ９． val １６ thr ＩＩＩ．立体的な修飾 (側鎖の立体的なかさの変化) １． leu ６３ phe ２． ser ５２ tyr ３． ile ５８ leu ４． gly ４０ ile ５． val １３ phe ６． leu １２０ phe ７． ile １４６ gly ８． asn １３７ glu ９． ile １５４ phe １０． ile １５５ gly １１． phe １４４ ile Ｂ．挿入 １． Ｌeu １５７後方 gly gly−ＣＯＯＨ ２． Ａsp １０とＬys １１の間 his ３． ile ５８とtyr ５９の間 leu ４． ser ６０とgln ６１の間 lys ５． arg ３１とarg ３２の間 ala ６． gly １２１とgly１２２の間 gly ７． val １の前 免疫原性ポリペプチド ８． leu １５７の後 免疫原性ポリペプチド ９． gln １４９とＶal１５０の間 gly gly １０． プレＴＮＦのala−１とval１の間 lys arg Ｃ．欠失 １． Ｇln １４９ ２． lys １１２ ３． val １−arg ２ ４． val １からpro ８ ５． ala ２２ ６． arg ３２ ７． glu ５３ ８． ala １１１−lys １１２ ９． ala １２３ １０． ile １５４ １１． glu １２７ Ｄ．併用 １． ile ５８ leu leu ５７ phe ２． gln １４９ 欠失 tyr １５１ phe ３． lys １１２ 欠失 glu １１５ lys ４． val １ thr ala ２２ lys gly ２４ asn ala ３３ asp ５． tyr １１５ phe glu １１６ lys ６．gly１２１とgly１２２の間にglyを挿入し、leu１５７の後にgly gly−ＣＯＯＨを付加する。 ７．val１からgly６６を欠失させ、 ＮＨ₂−Ｌeu Ａla Ｉle Ｉle Ｇly Ｐhe Ｔyr Ｖal Ｇln Ｇly Ｓer Ｇlu- Ａla Ｐhe Ａsp Ｌeu Ｔyr Ａsp Ｐro Ａrg Ａsn Ｉle Ｇlu Ａla Ｓer- Ｌeu Ａrg Ａsp Ｇly Ｌys Ｇlu Ｌeu Ｇln Ｐhe Ｖal Ｇly Ｇly Ｌeu- Ｔyr Ｉle Ｐro Ｇlu Ｔyr Ｔrp Ｐro Ｌys Ａla Ｇlu Ａla Ｇly Ｇlu- Ｐro Ｔhr- で置換する。 ８． ala １１１ ala １０９ gln leu １２０を欠失 his ９． asn １９ gln asn ９２ gln asn １３７ gln

【０１６７】注目される突然変異体は、arg２、arg６
(実施例２０および２１)、arg３２およびarg１３１のト
リプシン加水分解部位を欠失するか、あるいはトリプシ
ンに対する感受性を持たない様に修飾して得られる突然
変異体である。このことにより、ファーメンテイティブ
・クリッピング(発酵的刈り取り)の可能性は減少する
が、腫瘍壊死因子の生体内半減期は延長される。arg２
およびarg６部位は、これらに関連する領域を除去した
後も生物学的活性は維持されていることから、臨界的な
部位ではない。しかしながら、arg３２およびarg１３１
部位を開裂すると活性が失なわれる。従って、arg３２
および／またはarg１３１部位をヒスチジルで置換する
ことが望ましく、あるいは、左程好ましくはないが、gl
nで置換する。この置換では、該部位の酵素感受性は喪
失もしくは減少されるが、側鎖の塩基性は保持される。
また、arg３１をヒスチジルで置換するか、あるいは同
じ理由から、左程好ましくはないがグルタミンで置換す
る。また、酵素加水分解部位を融合ポリペプチドとＴＮ
Ｆ配列との間に挿入し、予定通りに成熟または突然変異
ＴＮＦを放出させること、あるいは、上記の如き部位を
プレＴＮＦのリーダー配列内の残基で置換することもで
きる。

【０１６８】asp４５のasnによる置換体をグリコシル化
能を有する宿主細胞(例えば酵母または哺乳動物)内で発
現させることにより、グリコシル化された腫瘍壊死因子
を生産することができると思われる。

【０１６９】実施例２５ 酵母に於ける、ＡＤＨプロモ
ーターのコントロール下での腫瘍壊死因子の発現 p２０ＫＬＴまたはptrpＥＴＡ(またはpＢＲ３２２)を、
Ｘba ＩおよびＨindＩＩＩではなくＥcoＲ ＩおよびＨi
nd ＩＩＩで開裂させ、Ｘba Ｉ粘着末端ではなくＥcoＲ
Ｉ粘着末端を持った合成フラグメントＢを調製する外
は実施例１７と同様にして、プラスミドＴrpＸＡＰＴＮ
Ｆを組み立てる。このライゲーション(結合)混合物を使
って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形質転換し、ＥcoＲ
Ｉ部位に囲まれた腫瘍壊死因子暗号化ＤＮＡを含んでい
るプラスミドpＴＮＦＲＩを制限分析により同定する。
プラスミドpＴＮＦＲＩを分離し、ＥcoＲ Ｉを分離し、
ＥcoＲ Ｉで消化し、腫瘍壊死因子ＤＮＡ含有フラグメ
ントＴ−１を回収する。

【０１７０】プラスミドpＦＲＰn(ＥＰ６０,０５７Ａ)
をＥcoＲ Ｉで消化し、再環化を防止するためにアルカ
リホスファターゼで処理し、Ｔ４ＤＮＡ リガーゼを使
ってＴ−１腫瘍壊死因子フラグメントに結合させ、この
ライゲーション混合物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４
６を形質転換する。アガロース電気泳動ゲル上での制限
分析で判明することだが、アンピシリン耐性コロニー
は、方向を異にするＴ−１挿入体を持った２種類のプラ
スミドを産生する。プラスミドを大腸菌形質転換体から
精製し、これを使ってtrp１変異を持った酵母(例えば酵
母株ＲＨ２１８、非制限ＡＴＣＣ寄託番号４４０７６)
を形質転換してtrp⁺表現型とする。断片Ｔ−１の開始コ
ドンがアルコールデヒドロゲナーゼプロモータフラグメ
ントに隣接する様に配向されたプラスミドが、酵母を、
腫瘍壊死因子を発現させる様に形質転換することがわか
る。酵母形質転換体の抽出物から腫瘍壊死因子を回収す
る。pＦＲＰn染色体複製起源(ars１)の代りに２ミクロ
ン複製起源を含有する発現プラスミド、および適合し得
る宿主株を使用することにより、大規模な発酵における
プラスミドの安定を改善する[ジエー・ベッグス(Ｊ.Ｂe
ggs)、１９７８、ネーチャー(Ｎature)、２７５:１０４
−１０９]。

【０１７１】実施例２６ 哺乳動物細胞中での腫瘍壊死
因子の発現 プラスミドpＥＨＥＲ(ＥＰ１１７,０６０Ａ)をＥcoＲ
Ｉで消化し、牛腸アルカリフォスファターゼで処理し、
実施例２５からのフラグメントＴ−１に結合させ、この
ライゲーション混合物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４
６を形質転換する。ポリアクリルアミドゲル上の制限分
析により判明した、方向を異にするＴＮＦ ＤＮＡ含有
プラスミド(pＥＨＥＲＴＮＦ ＩおよびpＥＨＥＲＴＮＦ
ＩＩと命名)を分離する。これらのプラスミドを使って
トランスフェクトを行ない、ＣＨＯ ＤＨＦＲ−ＤＵＸ
−Ｂ１１、ＣＨＯ１およびＬtＫ^-細胞を選択する。

【０１７２】上で調製した１μgのpＥＨＥＲＴＮＦ Ｉ
またはpＥＨＥＲＴＮＦ ＩＩを、２５０μlの０.２５Ｍ
ＣaＣl₂中、ラットキャリアーＤＮＡ１０μgと混合し、
次いで２５０μlのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水(２８０mＭ Ｎ
aＣl １.５mＭ Ｎa₂ＰＯ₄、５０mＭ ＨＥＰＥＳ、pＨ
７.１)を滴加することにより組織培養細胞をトランスフ
ェクトする。室温で３０分間放置した後、この溶液を、
６０mmのプラスチック製組織培養皿中で増殖させた組織
培養細胞に添加する。ＣＨＯ１、ＣＨＯ ＤＨＦＲ−Ｄ
ＵＸ−Ｂ１１およびＬtＫ^-細胞を使用する。この皿は、
宿主細胞に適切な培養培地３mlを含んでいる。

【０１７３】ＣＨＯ１およびＣＨＯ ＤＨＦＲ−ＤＵＸ
−Ｂ１１細胞のための培地は、１０％牛血清、１００μ
g／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマイシ
ンおよび２μmＭ のＬ−グルタミンを補足したＨamＦ−
１２培地(Ｇibco)である。ＬtＫ^-セルラインのための培
地は、上記と同様に補足したＤulbeccoの改良イーグル
培地(ＤＭＥＭ)である。

【０１７４】３〜１６時間後に培地を除去し、細胞を燐
酸緩衝食塩水中の２０％グリセリンで洗浄する。新しい
培地を各プレートに加え、細胞を更に２日間インキュベ
ートする。

【０１７５】細胞を２日間増殖させた後トリプシン処理
し(滅菌細胞を、０.２mg／mlＥＤＴＡ含有トリプシン
０.５mg／mlで処理する)、選択培地を入れた１０mmの組
織培養プレートに約３×１０⁵細胞を加えることによ
り、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を行なう。
dhfr^-細胞のための培地はグリシン、ヒポキサンチンお
よびチミジンを欠く(Ｆ−１２ ＧＩＢＣＯ)培地の製剤
である(ＧＨＴ^-培地)。ＤＨＦＲ⁺宿主細胞用には、通常
の増殖培地にメトトレキセート(１００−１０００nＭ)
を加える。プラスミドを使わないもの、および正常なＤ
ＨＦＲを含んでいるプラスミドpＦＤ−１１(ＥＰ１１
７,０６０Ａ)を使用し、トランスフェクション条件下に
コントロール(対照)試験を行なう。ＤＨＦＲプラスミド
を取り込んで発現する細胞から生じるコロニーは１〜２
週間以内に現われる。腫瘍壊死因子を発現する形質転換
体を同定する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 調節多孔ガラスからの腫瘍壊死因子の溶離像
を図式化したグラフである。

【図２】 ジエチルアミノエチルセルロースからの腫瘍
壊死因子の溶離像を図式化したグラフである。

【図３】 高速タンパク質液体クロマトグラフィーにお
ける腫瘍壊死因子の溶離像を図式化したグラフである。

【図４】 クロマトフォーカシングにおける腫瘍壊死因
子の溶離像を図式化したグラフである。

【図５】 ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動による腫瘍壊
死因子の分子量測定結果を図式化したグラフである。

【図６】 ＨＰＬＣからの腫瘍壊死因子の溶離像を図式
化したグラフである。

【図７】 ＨＰＬＣ Ｃ４−カラムからの腫瘍壊死因子
の溶離像を図式化したグラフである。

【図８】 トリプシン消化腫瘍壊死因子のフラグメント
のＨＰＬＣによる分離状態を図式化したグラフである。

【図９】 γ−インターフェロンと腫瘍壊死因子との混
合物の細胞毒性作用を示す写真の模写図である。

【図１０】 全腫瘍壊死因子分泌リーダーを含むプレ−
ヒト腫瘍壊死因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を
示す模式図である。

【図１１】 ヒト腫瘍壊死因子の発現ベクターの組立て
模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/21 Ｃ０７Ｋ 14/525 8318−4Ｈ 14/57 8318−4Ｈ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ａ６１Ｋ 9/14 Ｌ 37/66 Ｇ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (31)優先権主張番号 ６７７１５６ (32)優先日 1984年12月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６７７２５７ (32)優先日 1984年12月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６７７４５４ (32)優先日 1984年12月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 サン・ヒー・リー アメリカ合衆国カリフォルニア94018、エ ル・グラナダ、サン・カーロス・アベニュ ー1035番 (72)発明者 グレン・エバン・ネドウィン アメリカ合衆国コネチカット06437、ギル フォード、エス・フープ・ポール・ロード 429番

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍壊死因子とインターフェロンとを含
   有する組成物。
2. 【請求項２】 他の細胞毒性ポリペプチドを含まない請
   求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 他の血漿性のタンパク質または細胞を含
   まない請求項２記載の組成物。
4. 【請求項４】 更に、生理学的に許容し得る緩衝液、抗
   酸化剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、アミノ
   酸、炭水化物または陰イオン界面活性剤、あるいはこれ
   らの混合物を付加してなる請求項１記載の組成物。
5. 【請求項５】 凍結乾燥されている請求項１記載の組成
   物。
6. 【請求項６】 ヒト起源のものである請求項１記載の組
   成物。
7. 【請求項７】 リンホトキシンを含まない請求項１記載
   の組成物。
8. 【請求項８】 インターフェロンがγ−インターフェロ
   ンである請求項１記載の組成物。
9. 【請求項９】 請求項１記載の組成物をヒトを除く動物
   に投与することからなる、腫瘍を有する宿主の治療方
   法。
10. 【請求項１０】 治療上有効量の組成物を投与すること
    からなる請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 その量が腫瘍壊死を引き起こすのに充
    分な量である請求項１０記載の方法。