SK279897B6 - Spôsob izolácie ľudského nekrotizujúceho faktora ( - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu izolácie ľudského nekrotizujúceho faktora (TNF), ľudského TNF, zmesi s obsahom TNF, variantu TNF, DNA kódujúcej TNF, bunky transformovanej s DNA a farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje ľudský neglykozylovaný TNF a ľudský interferón.

Doterajší stav techniky

Je známe, že imúnne bunky, ako sú napríklad bunky B, bunky T, zabíjači a makrofágy, vyrábajú látky, ktoré majú cytotoxickú účinnosť na nádorové bunky, ale ktoré sú neškodné pre normálne bunky. Tieto látky sú nazývané rôznymi menami, napríklad lymfotoxín, nádorový nekrotický faktor, makrofágový cytotoxický faktor, hemoragický nekrotický faktor, makrofágový cytotoxín alebo makrofágový cytotoxín, alebo makrofágový cytotoxický faktor. V súčasnosti nie je jasná identita proteínov spojených s týmito názvami. Základné problémy sú v tom, že biologické testy, ktoré sa používajú na detekciu proteínov, medzi nimi nerozlišujú, že sa zdá, že proteíny sa vyskytujú v prírode ako agregáty alebo hydrolytické produkty a že až doposiaľ sa podarilo získať iba také malé množstvá, že ich nebolo možné vyčistiť na vyšší stupeň čistoty, ktorý je potrebný pre úplné charakteristiky týchto proteínov.

Takéto cytotoxické látky sa nachádzajú v sére intaktovaných zvierat alebo v supematante kultúry lymfatických buniek, alebo bunkových línií po tom, čo na zvieratá alebo bunky pôsobila látka, o ktorej je známe, že stimuluje proliferáciu imunných buniek („induktor“). Sérum supematantu sa izoluje a testuje na cieľových nádorových bunkových líniách na cytotoxickú účinnosť.

Štandardnou bunkovou líniou je L-929, línia myších nádorových buniek. Táto a iné bunkové línie, ktoré sa používajú v biotestoch tohto typu, nie sú vo svojej lytickej odpovedi špecifické, pretože schopnosť lýzie má zrejme mnoho produktov lymfatických buniek. Podobné nešpecifické odpovede boli pozorované v testoch nekrózy nádorov in vitro. Na rozlíšenie rôznych cytotoxických lymfatických produktov nie sú teda postačujúce cytolytické testy, ktoré sú založené na lýzii bunkových línií in vitro alebo na nekróze nádoru in vivo.

Cytotoxické faktory sa predbežne klasifikujú podľa lymfatických buniek, v ktorých sa indukujú. Napríklad lymfotoxín je názov, ktorý' sa obyčajne používa pre cytotoxické sekrečné produkty lymfocytov B alebo T, alebo bunkových línií od nich odvodených, zatiaľ čo nádorový nekrotický faktor sa často používa k opisu cytotoxických produktov makrofágov alebo od nich odvodených bunkových línií. Tento klasifikačný systém však nebol vyvinutý do takého stupňa, v ktorom by neexistovala hocijaká neistota, že sa hovorí o jedinom proteíne, alebo že proteíny, ktoré majú rôzne názvy, sú v skutočnosti rôzne.

Boli robené pokusy vyčistiť a charakterizovať cytotoxické faktory sekretované každým typom buniek. Citácie sa však líšia pokiaľ ide o vlastnosti cytotoxického faktora alebo sa nie celkom zhodujú v uvádzaných vlastnostiach, z čoho vyplýva, že buď bola chybná charakterizácia, alebo že každý typ buniek sekretuje rôzne cytotoxické faktory. Napríklad, cytotoxickým produktom, ktoré sú odvodené od makrofágov, monocytov alebo monocytických bunkových línií a ktorým sa niekedy hovorí nádorový nekrotický faktor (TNF), sa pripisujú vlastnosti, ktoré nezodpovedajú teórii jediného cytotoxického produktu. Pozri napríklad nasledujúcu literatúru: R. MacFarlan a spol.: „AJEBAK“

58(pt5), 489 až 500 (1980), D. Mannela a spol.: Infection and Immunology 30(2), 523 až 530 (1980), H. Ohnishi a spol.: GB patent (prihláška) č. 2 106 177A a J. Hammerstrom: Scand. J. Immunol. 15, 311 až318 (1982).

Na druhej strane C. Zacharchuk a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 6341 až 6345 (1983) navrhujú, že lymfotoxín z morčiat a cytotoxický faktor z makrofágov morčiat sú imunochemicky podobné, ako vôbec nie totožné. Podobné závery sú uvádzané i Ruffom a spol.: Lymphokines 2, 235 až 272 na str. 241 až 242 (1981).

Pokusy charakterizovať imúnne cytotoxické faktory boli zamerané taktiež na použitie séra alebo peritoneálnej kvapaliny zvierat, ktoré boli vystavené imunogénnym antigénom ako východiskového materiálu. Tieto zdroje obsahujú celú bohatosť stresového imúnneho systému, na rozdiel od produktu z jedného bunkového typu alebo línie. Ako príklady predchádzajúceho sú tu uvedené nasledujúce príklady: S. Green a spol.: J. Nat. Cancer Inst. 68(6), 997 až 1003 (1982) (indukčný faktor nekrózy nádoru), M. Ruff a spol.: J. lmmunology 125(4), 1671 až 1677 (1980) (nádorový nekrotický faktor), H. Enemoto a spol.: Európska patentová prihláška 86 475 (protinádorová látka), H. Oettgen a spol.: Recent Results Cancer Res. 75, 207 až 212 (1980) (nádorový nekrotický faktor), F. Kuli a spol.: J. Immunol. 126 4, 1279 až 1283 (1981) (cytotoxín nádorových buniek), D. Mannelaspol.: Infection and Immunity 28(1), 204 až 211 (1980) (cytotoxický faktor), N. Matthews a spol.: Br. J. Cancer 42, 416 až 422 (1980) (nádorový nekrotický faktor), S. Green a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72(2), 381 až 385 (1976) (sérový faktor), N. Satomi a spol.: Jpn. J. Exp. Med. 51(6), 317 až 322 (1981), N. Matthews: Br. J. Cancer 40, 534 až 539 (1979) (Nádorový nekrotický faktor), K. Haranaka a spol.: Jpn. J. Exp. Med. 51(3), 191 až 194 (1981) (nádorový nekrotický faktor), L. Old. a spol.: Európska patentová prihláška 90 892, T. Umeda a spol.: Cellular and Molecular Biology 29(5), 349 až 352 (1983) a H. Enomoto a spol.: Európska patentová prihláška č. 86 475.

Je možné konzultovať aj ďalšiu literatúru: J. Nissen-Meyer a spol.: Infection and Immunity 38(1), 67 až 73 (1982), J. Klostergaard a spol.: Mol. Immunol. 18(12), 1049 až 1054 (1981), N. Sloane, US patent 4 359 415, H. Hayashi a spol.: US patent 4 447 355, K. Hanamaka a spol.: Európska patentová prihláška 90 892 (1983) a G. Granger a spol.: Cellular Immunology 38, 388 až 402 (1978).

Európska patentová prihláška č. 100 641 opisuje cytotoxický polypeptid, ktorý bol vyčistený tak, že v podstate neobsahuje nečistoty z ľudskej lymfoblastoidnej bunkovej kultúry. Tento polypeptid bol nazvaný lymfotoxín, hoci jeho vzťah k iným v literatúre opisovaným cytotoxickým polypeptidom pod názvom lymfotoxín je iba domnienkou. Nie je známe, či tento polypeptid je jediným cytotoxickým polypeptidom, ktorý produkujú imúnne bunky, ako ich navrhoval Zacharchuk a spol. (pozri tamtiež), alebo ak je iba jedným z veľkej rodiny cytotoxických faktorov.

Polypeptid z európskej patentovej prihlášky č. 100 641 má dva amínové konce, väčší variant končí na Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Cln Thr Ala Arg Gin His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr...., menší variant skráteným amínovým koncom His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala......

Podľa predchádzajúcej literatúry boli interferóny, ktoré majú inhibičnú účinnosť na niektoré nádory, a ktoré sú chabo charakterizovaným proteínom s amínovým koncom Ala-Ala (GB patentová prihláška č. 2 117 385A), kandidáti nelymfotoxinových cytotoxických faktorov. Ako uvidíme, nádorový nekrotický faktor podľa tohto vynálezu nie je interferón, nie je lymfotoxín a nemá amínový koniec Ala-Ala.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa týka spôsobu izolácie ľudského nádory nekrotizujúceho faktora (TNF) z heterogénnej zmesi s obsahom iných proteínov, ktorý pozostáva z týchto krokov:

- aplikácia kompozície na najmenej jeden silikát, sklo s kontrolovanou veľkosťou pórov, alkyl sefarózu alebo častice živice s vlastnosťou aniónového meniča s jednotnou veľkosťou, na absorpciu ľudského TNF a

- elúcia adsorbovaného ľudského TNF.

Ľudský TNF je eluovaný etylénglykolom a aniónovou živicou je kvartérna amino-substituovaná polystyrénová aniónová živica.

Predmetom vynálezu je aj ľudský TNF, ktorý

a) nie je glykolyzovaný,

b) má molekulovú hmotnosť asi 17 000 stanovenú pomocou SDS-PAGE,

c) je schopný prednostnej deštrukcie alebo zastavenia rastu nádorových buniek v porovnaní s normálnymi bunkami pri rovnakých podmienkach,

d) je úplne homogénny podľa stanovenia SDS-PAGE,

e) obsahuje

i) poradie aminokyselín uvedené na obr. 10, ii) poradie zvyškov aminokyselín 35-66 uvedené na obr. 10, alebo iii) poradie zvyškov aminokyselín 110-133 uvedené na obr. 10, alebo iv) poradie aminokyselín Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro,

f) má špecifickú aktivitu vyššiu ako asi 10 miliónov jednotiek/gram proteínu,

g) je purifíkovaný na stupeň dostatočný na sekvenovanie intaktného TNF alebo na trypsínovú hydrolýzu jeho fragmentu pomocou Edmanovej degradácie v sekvenátori aminokyselín vybavenom studenými zachycovačmi a použitím polybrénového nosiča.

Tento ľudský’ TNF neobsahuje iné cytotoxické proteíny a neobsahuje proteín patriaci medzi lymfotoxíny, a-globulíny, serín proteázy a interferón.

Ľudský TNF je v prímesi s fyziologicky prijateľným pufrom, aminokyselinovej alebo neiónovej povrchovo aktívnej látky alebo ich zmesami a je lyofilizovaný.

Predmetom vynálezu je aj zmes s obsahom ľudského TNF, ktorá obsahuje fyziologicky prijateľnú zložku z bunky nie ľudského pôvodu a TNF s poradím aminokyselín uvedených na obr. 10, pričom fy ziologicky prijateľnou zložkou je prokaryotický proteín. Táto zmes je tvorená bunkou obsahujúcou heterológny ľudský TNF s poradím aminokyselín uvedených na obr. 10 a bunkou je prokaryotická alebo nižšia eukaryotická bunka.

Ďalším predmetom vynálezu je variant TNF, ktorý je schopný prednostnej deštrukcie alebo zastavenia rastu nádorových buniek v porovnaní s normálnymi bunkami pri rovnakých podmienkach a ktorý obsahuje poradie aminokyselín 1 až 157 uvedené na obr. 10, ale na mieste lokalizovanom v polohe medzi 35 až 66, 110 až 133, alebo 150 až 157 zvyškov aminokyselín najmenej jedna z aminokyselín je substituovaná, vynechaná alebo vložená.

Predmetom vynálezu je aj DNA kódujúca TNF uvedená na obr. 10, ktorá je syntetická, je prítomná v replikovateľnom vektore, pričom vektorom je plazmid alebo vírus.

Ďalším predmetom vynálezu je bunka transformovaná s DNA a farmaceutický prostriedok na liečenie nádorov, kto rý obsahuje ľudský neglykolyzovaný TNF a ľudský interferón, najmä τ-interferón.

Úlohou tohto vynálezu bolo: a) nezvratné preukázať, či existuje alebo neexistuje iný nádorový nekrotický faktor ako lymfotoxín, a ak áno, potom ho identifikovať takým spôsobom, aby sa dal jasne odlíšiť od iných takých faktorov, b) vyrábať takýto faktor inými spôsobmi ako indukovanou pletivovou kultúrou, čo je drahé a získaný produkt je znečistený indukčným činidlom alebo indukciou periférnych krvných lymfocytov, čo je z ekonomického hľadiska nepraktické, zle reprodukovateľné a získava sa produkt znečistený homológnymi bunkovými alebo plazmovými proteínmi, c) získať DNA kódujúcu takýto nekrotický nádorový faktor a expresovať DNA v rekombinantnej kultúre,

d) syntetizovať takýto faktor v rekombinantnej kultúre v maturovanej forme, e) modifikovať kódujúcu sekvenciu alebo štruktúru takéhoto faktora, f) formulovať takýto faktor od terapeutických dávkových foriem a podávať ho zvieratám pri liečení nádorov a g) vyrábať diagnostické činidlá, ktoré sa týkajú takého faktora.

Cytotoxický faktor sa vyčisti do homogenity, charakterizuje sa a expresuje sa v rekombinantnej kultúre. Tento faktor sa kvôli výhodnosti označuje ako nádorový nekrotický faktor (niekedy sa používa skratka TNF od „tumor necrosing factor“). Jeho definícia je uvedená. Z pletivovej kultúry sa získava v podstate v homogénnej forme so špecifickou účinnosťou väčšou ako 10 miliónov jednotiek na mg proteínu, obyčajne asi 100 miliónov jednotiek na jeden miligram proteínu.

Ľudský TNF je charakterizovaný (pokiaľ je syntetizovaný v rekombinantnej kultúre) prítomnosťou neľudských bunkových zložiek, vrátane proteínov, v takom množstve a s takými vlastnosťami, ktoré sú fyziologicky prijateľné na podávanie pacientom. Tieto zložky sú obyčajne kvasinkového, prokaryotického alebo neľudského vyššieho eukaryotického pôvodu a sú prítomné v neškodných množstvách rádovo menších ako asi 1 hmotn. %. Rekombinantná pletivová kultúra umožňuje ďalej výrobu nádorového nekrotického faktora absolútne bez homológnych proteínov. Homológne proteíny sú také proteíny, ktoré sú normálne spojené s nádorovým nekrotickým faktorom ako sa obyčajne vyskytuje v prírode, t. j. v bunkách, vo výlučkoch buniek (bunkové exudáty) alebo v telových kvapalinách. Homológnym proteínom ľudského nádorového nekrotického faktora je napríklad ľudský sérumalbumín. Heterológne proteíny sú opačné proteíny, t. j. prirodzene nesprevádzajú ani sa nevyskytujú v kombinácii s príslušným nádorovým nekrotickým faktorom.

Podľa tohto vynálezu sa získava DNA, ktorá kóduje nádorový nekrotický faktor a ktorá, ak je v rekombinantnej alebo transformovanej kultúre dochádza k jej expresii, poskytuje nádorový nekrotický faktor v mnohých kópiách. Táto DNA je nová, pretože cDNA získaná reverznou transkripciou mRNA z indukovaných monocytických bunkových línií neobsahuje žiadny intrón a neobsahuje ani žiadne susediace oblasti kódujúce iné proteíny organizmu, z ktorého mRNA pochádza.

Chromozomálna DNA kódujúca nádorový nekrotický faktor sa získava sondovaním buniek genómových DNA cDNA. Chromozomálna DNA neobsahuje susediace oblasti kódujúce iné proteíny, ale môže obsahovať intróny.

Izolovaná DNA nádorového nekrotického faktora sa ľahko modifikuje substitúciou (nahradením), deléciou (vynechaním) alebo inzerciou (pridaním) nukleotidov. Získajú sa tak nové sekvencie DNA, ktoré kódujú nádorový nekrotický faktor alebo jeho deriváty. Tieto modifikované sekvencie sa používajú na prípravu mutantného nádorového nekrotického faktora a priamej expresie maturovaného nádorového nekrotického faktora. Modifikované sekvencie sú užitočné taktiež pri zvýšení expresie nádorového nekrotického faktora vo vybraných systémoch hostiteľ-vektor, príkladom môže byť modifikácia prispôsobením sa výhodnému kodónu hostiteľskej bunky. Tieto nové sekvencie DNA alebo ich fragmenty sa označia a použijú v hybridizačných testoch genetického materiálu kódujúceho nádorový nekrotický faktor.

V procese syntézy nádorového nekrotického faktora sa DNA, ktorá kóduje nádorový nekrotický faktor, liguje s replikovateľným (reprodukovateľným) vektorom. Vektorom sa transformujú hostiteľské bunky, hostiteľské bunky sa kultivujú a nádorový nekrotický faktor sa izoluje z kultúry. Tento všeobecný postup sa používa na konštrukciu nádorového nekrotického faktora, ktorý má vlastnosti monocytového nádorového nekrotického faktora alebo na konštrukciu nových derivátov nádorového nekrotického faktora, podľa konštrukcie vektora a podľa hostiteľskej bunky, ktorá bola vybraná pre transformáciu. Medzi typy nádorového nekrotického faktora, ktoré tu môžu byť syntetizované, patrí maturovaný nádorový nekrotický faktor (s valylovou skupinou na amínovom konci), pre-nádorový nekrotický faktor (niekedy je označovaný taktiež „pre-TNF“) a deriváty nádorového nekrotického faktora zahrnujúce: a) napojené proteiny, v ktorých nádorový nekrotický faktor alebo akýkoľvek jeho fragment (vrátane maturovaného nádorového nekrotického faktora) je naviazaný na iné proteíny alebo polypeptidy peptidovou väzbou na amínovom a/alebo karboxylovom konci aminokyselín nádorového nekrotického faktora alebo jeho fragmentov, b) fragmenty nádorového nekrotického faktora vrátane maturovaného nádorového nekrotického faktora alebo fragmentov prenádorového nekrotického faktora, v ktorom akákoľvek proteínová aminokyselina znamená aminokyselinu na amínovom konci fragmentu, c) mutanty nádorového nekrotického faktora alebo jeho fragmentov vrátane maturovaného nádorového nekrotického faktora, v ktorých jedna alebo viacej aminokyselinových skupín je substituovaných, inzerovaných alebo deletovaných a/alebo d) adičné deriváty predchádzajúcich proteínov, fragmentov alebo mutantov s metionylovou alebo modifikovanou metionylovou skupinou (ako je napríklad formylmetylionylový alebo iný blokovaný metionylový typ).

Ak je cicavčia bunka transformovaná a) vektorom obsahujúcim úplný štruktúrny gén nádorového nekrotického faktora (vrátane 5 iniciačného kodónu), alebo b) génom maturovaného nádorového nekrotického faktora alebo derivátu nádorového nekrotického faktora odštiepiteľne ligovaného s eukaryotickým sekrečným signálom (ktorý môže taktiež zahrnovať sekrečný leader presekvencie nádorového nekrotického faktora), potom sa obyčajne bunka kultivuje a maturovaný nádorový nekrotický faktor sa izoluje z kultúry.

Ak DNA, ktorá kóduje nádorový nekrotický faktor, je odštiepiteľne napojená vo vektore k sekrečnému leaderu, ktorý je patrične procesovaný hostiteľskou bunkou, ktorá má byť transformovaná (obyčajne organizmus, z ktorého sa leader sekvencie získala), hostiteľ sa transformuje vektorom, kultivuje a nádorový nekrotický faktor sa potom syntetizuje bez metionylovej skupiny alebo blokovanej metionylovej skupiny na amínovom konci. Detailnejšie uvedené - E. coli transformovaná vektormi, v ktorých DNA kódujúca maturovaný nádorový nekrotický faktor je ligovaná 5 k DNA kódujúcej signálny polypeptid STII enterotoxínu, bude príslušným spôsobom procesovať vysoké percento hybridného preproteinu pre maturovaný nádorový nekrotický faktor. Sekrečné leadery a hostiteľské bunky môžu byť vybrané tak, že výsledkom je príslušný transport maturovaného proteínu do bunkovej periplazmy.

Do rozsahu tohto vynálezu patria taktiež deriváty nádorového nekrotického faktora iné ako variácie v aminokyselinovej sekvencii alebo glykozylácie. Takéto deriváty sú charakterizované kovalentnou alebo agregačnou asociáciou s chemickými časticami. Ide obyčajne o deriváty troch tried: soli, kovalentné modifikácie vedľajšie reťazca a koncovej skupiny a adsorpčné komplexy.

Ak DNA kódujúca maturovaný nádorový nekrotický faktor je odštiepiteľne ligovaná na vektor, vektor sa použije na transformáciu hostiteľskej bunky, bunky sa kultivujú a maturovaný nádorový nekrotický faktor sa nachádza v bunkovej cytoplazme. Nie je nutné navrhovať sekrečný systém, ktorý by poskytol maturovaný nádorový nekrotický faktor. To bolo prekvapujúce, pretože priama expresia obyčajne poskytuje metionylovaný proteín. Proteín je stabilný a rozpustný v rekombinantnej pletivovej kultúre, t. j. ani nie je proteolyticky štiepený intracelulámymi proteázami, ani sa neukladá ako refraktilné telesá. Takto sú získané nové fermentácie, vyznačujúce sa tým, že nižšie eukaryotické alebo prokaryotické bunky majú nemetionylovaný maturovaný nádorový nekrotický faktor umiestnený v cytoplazme.

Aj keď sa nádorový nekrotický faktor môže pripravovať kultiváciou zvieracích bunkových línií, napr. monocytických bunkových línií indukovaných rastom za prítomnosti 12-myristát-13-acctátu 4-bety-forbolu (PMA) alebo nesmrteľných bunkových línii, ako sú napríklad hybridómy alebo transformované bunky EBV (US patent 4 464 465), je výhodné, ak sa nádorový nekrotický faktor syntetizuje v rekombinantnej bunkovej kultúre, ako je opísané.

Po príprave nádorového nekrotického faktora fermentáciou sa nádorový nekrotický faktor vyčistí. Izoluje sa supematant kultivačnej kvapaliny alebo lyzovanej bunkovej kultúry, pevné častice sa odstránia, nádorový nekrotický faktor sa zo supematantovej zmesi (ktorá obsahuje nádorový nekrotický faktor a ďalšie proteiny) adsorbuje na hydrofóbnej látke, nádorový nekrotický faktor sa z tejto látky eluuje, potom sa nádorový nekrotický faktor adsorbuje na anexe terciámeho amínu, znova sa z toho anexu eluuje, adsorbuje sa na inom anexe (výhodne na kvartémom amínovom anexe) s prakticky jednotnou veľkosťou častíc a konečne sa nádorový nekrotický faktor zo živice eluuje. Roztok nádorového nekrotického faktora sa prípadne zahustí a vyčistí chromatofokusáciou v hociktorom stupni čistiaceho procesu, napríklad izoelektrickou fokusáciou alebo prejdením sitom gélu, ako je napríklad Sephadex G-25.

Nádorový nekrotický faktor, ktorý- je vyčistený od rekombinantnej alebo indukovanej bunkovej kultúry, sa pre terapeutické použitie spojí s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a excipientmi, pričom sa pripraví v dávkovej forme, napríklad lyofilizáciou v dávkových fóliách, alebo sa skladuje vo forme stabilizovaných vodných prostriedkov. Pre implantáciu do nádorov alebo miest, z ktorých boli nádory chirurgicky odstránené, sa nádorový nekrotický faktor pripraví na polymérnej matrici. Získa sa tak prostriedok, z ktorého sa nádorový nekrotický faktor pomaly uvoľňuje vo vysokej gradientovej koncentrácii v danom mieste.

Prostriedky podľa tohto vynálezu sa získavajú bez znečistenia inými cytotoxickými faktormi, ako je napríklad lymfotoxín, interferóny alebo iné cytotoxické proteiny citované v literatúre. Terapeutické aplikácie nádorového nekrotického faktora sa však výhodne spájajú s vopred danými množstvami lymfotoxinu a/alebo interferónu. Prostriedky, ktoré obsahujú nádorový nekrotický faktor a interferón, ako je napríklad τ-interferón, sú obzvlášť užitočné, pretože majú synergickú cytotoxickú účinnosť. Prostriedky s ná dorovým nekrotickým faktorom sa podávajú zvieratám, no najmä pacientom s malígnymi nádormi, v terapeuticky účinných dávkach. Vhodné dávky budú zrejmé odborníkom. Vhodné dávky závisia od terapeutických podmienok, ako bude opísané.

Nádorový nekrotický faktor na účely tohto vynálezu je definovaný ako polypeptid iný ako lymfotoxín, ktorý má výhodnú cytotoxickú účinnosť a ktorý má oblasť majúcu funkčnú aminokyselinovú homológiu s aminokyselinovou sekvenciou maturovaného nádorového nekrotického faktora uvedeného na obrázku 10, jeho fragmentu alebo derivátu takéhoto polypeptidu alebo fragmentu. Výhodná cytotoxická účinnosť je tu definovaná ako výhodná deštrukcia alebo inhibícia rastu nádorových buniek v porovnaní s normálnymi bunkami za rovnakých podmienok. Výhodná cytotoxická účinnosť sa stanovuje účinkom polypeptidu na nádorové bunky in vivo alebo in vitro v porovnaní s normálnymi bunkami alebo tkanivami. Pri pokusoch in vitro je diagnostickým znakom účinnosti obyčajne bunková lýzia, pri pokusoch in vivo nekróza nádorov. Cytotoxická účinnosť sa však môže prejavovať taktiež ako cytostáza alebo ako antiproliferačná účinnosť. Vhodné testovacie systémy sú veľmi dobre známe. Napríklad na stanovenie špecifickej účinnosti nádorového nekrotického faktora sa používa test lýzie buniek, ako opisuje B. Aggarwal a spol. v „Thymic Hormones and Lymphokines“, ed. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center, 1983. Bunková línia A549, ktorá je v tejto literatúre citovaná, je dostupná z ATCC pod číslom CCL 185. Špecifická účinnosť nádorového nekrotického faktora sa udáva skôr v termínoch lýzie cieľových buniek ako cytostáza. Jedna jednotka nádorového nekrotického faktora je definovaná ako také množstvo nádorového nekrotického faktora, ktoré je potrebné na lýziu 50 % cieľových buniek vysiatych do každej jamky podľa toho, ako je uvedené v príklade 1. To však neznamená, že by tým boli vylúčené iné testy merania špecifickej účinnosti, napr. spôsoby založené na rýchlosti rastu cieľových buniek.

Pre-nádorový nekrotický faktor je jeden z typov nádorového nekrotického faktora, ktorý spadá do predchádzajúcej definície nádorového nekrotického faktora. Pre-TNF je charakterizovaný tým, že v molekule je prítomný signálny (alebo leader)polypeptid, ktorý slúži na posttranslačné nasmerovanie proteínov do miesta dovnútra alebo zvonku bunky. Signálny polypeptid (ktorý nemá nádorovú nekrotickú účinnosť v pravom slova zmysle) sa proteolyticky odštiepi od zvyšného proteínu (s účinnosťou nádorového nekrotického faktora) ako časť sekrečného procesu, v ktorom je proteín transportovaný do periplazmy hostiteľskej bunky alebo kultivačného média. Signálny polypeptid môže byť mikrobiálny alebo cicavčí (vrátane prírodného, presekvencia so 76 skupinami), výhodne je to však signál, ktorý je homológny k hostiteľskej bunke.

Prírodný nádorový nekrotický faktor z normálnych biologických zdrojov má vypočítanú molekulovú hmotnosť asi 17000 podľa elektroforézy s dodccylsulfátom sodným na polyakrylamidovom géle (SDS-PAGE), ako je opísané, izoelektrický bod asi 5,3 a je citlivý na hydrolýzu trypsínom na mnohých miestach. Prírodný nádorový nekrotický faktor, ktorý sa vyčistí HPLC na obrátených fázach, sa hydrolyzuje trypsínom na aspoň deväť fragmentov pri podmienkach opísaných ďalej. Presný počet fragmentov, na ktorý sa nádorový nekrotický faktor trypsínom hydrolyzuje, závisí od takých faktorov, ako je účinnosť trypsinu, od koncentrácie nádorového nekrotického faktora a parametrov inkubácie, vrátane iónovej sily, pH, teploty a času inkubácie.

Nezdá sa, že by nádorový nekrotický faktor bol glykoproteín, pretože sa nezachytáva na afinitnej kolóne s lektínom a analýza odvodenej aminokyselinovej sekvencie neobsahuje žiadne glykolyzačné miesta. A ďalej, materiál, ktorý sa produkuje v kultúre E. coli (ktorá nemá schopnosť glykozylácie), sa pohybuje na SDS-PAGE spolu s prírodným nádorovým nekrotickým faktorom.

Stupeň homológie aminokyselinovej sekvencie polypeptidu, ktorý spadá do rozsahu nádorového nekrotického faktora podľa tohto vynálezu, závisí od toho, či homológia medzi týmto proteínom a nádorovým nekrotickým faktorom sa týka týchto oblastí nádorového nekrotického faktora, ktoré sú zodpovedné za cytotoxickú účinnosť. Tie oblasti, ktoré sú rozhodujúce pre cytotoxickú účinnosť, by mali mať vysoký stupeň homológie, aby spadali pod definíciu. Naproti tomu tie sekvencie, ktoré sa netýkajú zachovania konformácie nádorového nekrotického faktora alebo uskutočnenia väzby na receptor, môžu mať relatívne nižšiu homológiu. Kritické oblasti môžu mať cytolytickú účinnosť a stále ešte zostávajú homológne podľa tu uvedenej definície, ak sú skupinami, ktoré obsahujú funkčne podobné aminokyselinové vedľajšie reťazce, substituované. „Funkčne podobné“ sa týka hlavných vlastností vedľajších reťazcov, ako je napríklad alkalita, neutralita alebo kyslosť, alebo prítomnosť, či neprítomnosť stericky objemnej skupiny. Definícia nádorového nekrotického faktora podľa tohto vynálezu špecificky vylučuje z tejto definície lymfotoxín.

Polypeptid, ktorý je definovaný ako nádorový nekrotický faktor, všeobecne bude obsahovať oblasti, ktoré sú v podstate homológne s proteínom na obrázku 10 alebo s jeho fragmentmi v bloku asi od 20 do 100 skupín aminokyselín, zvlášť v blokoch, ktoré sú obklopené zvyškami 36 až 66 a 110 až 133.

Najvýznamnejším faktorom pre zaistenie identity polypeptidu ako nádorového nekrotického faktora je schopnosť antisér v podstate neutralizovať cytolytickú účinnosť maturovaného nádorového nekrotického faktora uvedeného na obrázku 10 a taktiež v podstate neutralizovať cytolytickú účinnosť dotyčného polypeptidu. Je si však treba uvedomiť, že imunologická identita a cytotoxická identita nie sú totožné. Neutralizujúca protilátka nádorového nekrotického faktora z obrázka 10 nemusí viazať príslušný proteín, pretože neutralizujúca protilátka nesmeruje k špecifickému väzobnému miestu na nádorovom nekrotickom faktore, ktoré je rozhodujúce pre jeho cytotoxickú účinnosť. Namiesto toho sa protilátka môže viazať na neškodnú oblasť a mať svoj neutralizujúci účinok stcrickou zábranou. Príslušný proteín, ktorý je v tejto neškodnej oblasti mutovaný, nemôže už viazať neutralizujúcu protilátku. Viac-menej takýto proteín by bol nádorovým nekrotický faktorom v termínoch podstatnej homológie i biologickej účinnosti.

Dôležité je zistenie, že takéto vlastnosti, ako sú napríklad molekulová hmotnosť, izoelektrický bod a podobne, pre natívny alebo divoký typ maturovaného nádorového nekrotického faktora na obrázku 10, ktorý bol získaný z periférnych lymfocytov alebo kultúry bunkových línií, opisujú iba natívne typy nádorového nekrotického faktora. Nádorový nekrotický faktor tak, ako ho uvádza predchádzajúca definícia, zahrnuje tiež iné typy, ktoré nebudú mať všetky vlastnosti natívneho nádorového nekrotického faktora. Nádorový nekrotický faktor podľa definície podľa tohto vynálezu zahŕňa jednako nádorový nekrotický faktor, tak i iné podobné cytotoxická polypeptidy. Napríklad, deriváty nádorového nekrotického faktora, ako sú inzertné mutanty, delečné mutanty alebo opísané napojené proteiny zmenia molekulovú hmotnosť natoľko, že tieto nádorové nekrotické faktory nespadajú pod definíciu natívneho nádorového nekrotického faktora, pokiaľ ide o jeho molekulovú hmotnosť. Napojené proteíny s maturovaným nádorovým nekrotickým faktorom alebo pre-nádorový nekrotický faktor sám a tiež inzertné mutanty majú väčšiu molekulovú hmotnosť ako natívny maturovaný nádorový' nekrotický faktor, zatiaľ čo delečné mutanty natívneho maturovaného nádorového nekrotického faktora budú mať nižšiu molekulovú hmotnosť. Nádorový nekrotický faktor môže byť zostavený taktiež tak, aby znižoval alebo eliminoval citlivosť na hydrolýzu trypsínom alebo inými proteázami. A konečne, post-translačný proces ľudského pre-TNF v bunkových líniách odvodených od ncprimátnych cicavcov môže produkovať mikroheterogenitu v oblasti na amínovom konci, takže valín už nebude znamenať aminokyselinu na amínovom konci.

Sekvencia aminokyselín ľudského nádorového nekrotického faktora odvodeného od jeho cDNA je opísaná na obrázku 10. Maturovaný alebo natívny nádorový nekrotický faktor je reprezentovaný aminokyselinovými skupinami 4 až 157. Povšimnime si, že táto sekvencia obsahuje signálne sekvencie 76 skupín, o ktorých sa predpokladá, že sa odstraňujú počas normálneho procesu translatovaného transkriptu pri produkcii maturovaného proteinu. Šípkami sú označené miesta hydrolyzovateľné trypsínom.

Je potrebné poznamenať, že výraz „spôsobilý“ (schopný) cytotoxickej účinnosti alebo nekrózy nádoru in vivo znamená, že nádorový nekrotický faktor obsahuje polypeptidy, ktoré môžu byť premenené, napríklad enzymatickou hydrolýzou, z neaktívneho stavu analogického zymogénu na polypeptidový fragment, ktorý má žiadanú biologickú účinnosť. Tak inaktívnymi prekurzormi sú spojené proteíny, v ktorých je maturovaný nádorový nekrotický faktor viazaný peptidovou väzbou na karboxylový koniec iného ľudského proteinu alebo jeho fragmentu.

Sekvencia na tejto peptidovej väzbe alebo blízko nej je vybraná tak, aby bola citlivá na proteolytickú hydrolýzu, pri ktorej sa uvoľní nádorový nekrotický faktor buď in vivo, alebo ako časť výroby in vitro. Nádorový nekrotický faktor, ktorý sa takto generuje, potom bude mať definíciou požadovanú cytotoxickú účinnosť.

Aj keď nádorový nekrotický faktor obyčajne znamená ľudský nádorový nekrotický faktor, pod definíciu nádorového nekrotického faktora spadá nádorový nekrotický faktor taktiež z iných zdrojov, ako je napríklad myší, bravčový, konský alebo hovädzí nádorový nekrotický faktor, pokiaľ ale inak zodpovedá štandardom, ktoré sú opísané pre homológne oblasti a pre cytotoxickú účinnosť. Nádorový nekrotický faktor nie je druhovo špecifický. Napríklad ľudský nádorový nekrotický faktor je účinný na nádory myší. Nádorový nekrotický faktor z jedného druhu sa môže taktiež použiť pri terapii iného druhu.

Nádorový nekrotický faktor zahrňuje taktiež multimérne formy. Nádorový nekrotický faktor spontánne agreguje do multimérov, obyčajne do dimérov alebo vyšších multimérov. Multiméry sú cytotoxické a podľa toho sú vhodné na použitie v terapii in vivo. Aj keď je žiaduce, aby sa nádorový nekrotický faktor expresoval a izoloval v podstate ako homogénny multimér alebo monomér, terapeuticky môže byť nádorový nekrotický faktor používaný ako zmes rôznych multimérov.

Pod termínom nádorový nekrotický faktor sú zahrnuté taktiež deriváty nádorového nekrotického faktora. Medzi tieto deriváty patria mutanty aminokyselinovej sekvencie, glykolyzačné varianty a kovalentné alebo agregačné konjugáty s inými chemickými časťami. Kovalentné deriváty sa pripravujú tak, že sa funkčné skupiny spôsobmi známymi odborníkom naviažu na skupiny, ktoré sa nachádzajú v a minokyselinových bočných reťazcoch nádorového nekrotického faktora alebo na N- či C-konci nádorového nekrotického faktora. Medzi tieto deriváty patria napríklad alifatické estery alebo amidy karboxylového konca alebo skupín obsahujúcich karboxylový vedľajší reťazec, napr. asplO, O-acyl-deriváty skupín obsahujúcich hydroxylovú skupinu, ako je napríklad ser52, ser3, ser4 alebo ser5, N-acyl-deriváty skupín s amínovou skupinou na konci, napr. lyzínu alebo arginínu, a deriváty cyslOl a cys69. Acylová skupina znamená skupinu, ktorá je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z alkylových skupín (normálne alkylové skupiny s troma až desiatimi atómami uhlíka), ktoré tvoria alkanoylové typy derivátov a karbocyklických alebo heterocyklických skupín, ktoré tvoria aroylové typy derivátov. Reaktívnymi skupinami sú výhodne difunkčné zlúčeniny, ktoré sú známe odborníkom na použitie v skrížené naviazaných proteinoch za vzniku nerozpustnej matrice pomocou reaktívnych vedľajších skupín. Výhodnými miestami pre tvorbu derivátov sú cysteínové a histidínové skupiny.

Kovalentné alebo agregačné deriváty sú užitočné ako činidlá v imunoteste alebo pri afinitných čistiacich postupoch. Napríklad na použitie v teste alebo pri čistení protilátok nádorového nekrotického faktora alebo bunkových povrchových receptorov sa nádorový nekrotický faktor z roztoku izoluje tak, že sa kovalentné naviaže na Sepharosu aktivovanú bromkyánom spôsobmi dobre známymi, alebo sa adsorbuje na povrchu polyolefinu a to buď skrížené naviazaný s glutaraldehydom, alebo bez neho. Nádorový nekrotický faktor sa taktiež značí detegovateľnou skupinou, napríklad radiojodáciou postupom s chloramínom T, kovalentnou väzbou s chelátmi vzácnych zemín alebo konjugáciou s iným fluorescenčným zvyškom vhodným na diagnostické účely, zvlášť na diagnózu hladín nádorového nekrotického faktora v biologických vzorkách pri kompetitívnych typoch imunotestov. Takéto deriváty nemusia spadať pod uvedenú definíciu nádorového nekrotického faktora, pretože nie jc nutné, aby mali cytotoxickú účinnosť, ale len skríženú reaktivitu s protinádorovým nekrotickým faktorom.

Medzi mutantné deriváty nádorového nekrotického faktora patria vopred stanovené, t. j. miestne špecifické mutácie nádorového nekrotického faktora alebo jeho fragmentov. Predmetom mutagenézy je skonštruovať takú DNA, ktorá kóduje uvedený nádorový nekrotický faktor, t. j. nádorový nekrotický faktor, ktorý má cytotoxickú účinnosť na nádorové bunky in vitro alebo spôsobuje nekrózu nádorov in vivo a ktorý si zachováva zvyškovú homológiu so sekvenciou na obrázku 10, ale ktorý má taktiež zlepšené vlastnosti a zlepšenú účinnosť. Mutantný nádorový nekrotický faktor je definovaný ako polypeptid, ktorý spadá do homológnej uvedenej definície nádorového nekrotického faktora, ale ktorého sekvencia aminokyselín sa líši od sekvencie nádorového nekrotického faktora deléciou, substitúciou alebo inzerciou. Napríklad lyzínová alebo arginínová skupina nádorového nekrotického faktora (arginín 2, 6, 82, 44 a 131 a lyzín 98, 90 a 65) môže byť mutovaná na histidínovú alebo inú aminokyselinovú skupinu, ktorá nespôsobuje proteolytickú labilitu proteinu. Podobne môže byť cysteín 101 nahradený inými zvyškami a chemicky skrížené naviazaný, čím sa zvýši stabilita proti oxidácii. Nie jc nutné, aby mutanty vyhovovali požiadavkám byť účinné ako nádorový nekrotický faktor, pretože i biologicky neaktívne mutanty budú užitočné pri značení alebo mobilizácii ako činidlá v imunotestoch. V tomto prípade si však mutanty zachovávajú aspoň jedno epitopické miesto, ktoré má skríženú reaktivitu s protilátkou nádorového nekrotického faktora. Oblasti skupín 35 až 66 a 110 až 133 nádoro vej nekrotickej molekuly majú podstatnú homológiu (50 %) s lymfotoxínom. V podstate sú zachované taktiež hydrofóbne karboxy-konce (zvyšky 150 až 157 nádorového nekrotického faktora) obidvoch molekúl. Pretože obidva proteíny majú cytotoxickú účinnosť alebo nekrózu nádoru in vivo, predpokladá sa, že tieto oblasti sú dôležité v oznamovaní účinnosti lymfotoxinu a nádorového nekrotického faktora. Skupiny v týchto oblastiach sú výhodné pre mutagenézu priamo ovplyvňujúcu účinnosť nádorového nekrotického faktora v bunke. Relatívne nezachovaná oblasť skupín 67 až 109 nádorového nekrotického faktora môže ovplyvňovať presnú polohu dvoch ju obklopujúcich homológnych oblastí v konformácii, ktorá je pre cytotoxickú účinnosť podstatná. Takáto poloha, ktorú je možné v nádorovom nekrotickom faktore dosiahnuť disulfidovou väzbou Cys69-Cysl01, môže zodpovedať podobnej oblasti lymfotoxinu a to môže vysvetľovať rozdiely v špecifickosti a účinnosti medzi týmito dvoma molekulami. Tieto zvyšky predstavujú aktívny obal nádorového nekrotického faktora. Môžu byť syntetizované chemicky alebo delečnou mutagenézou, ako je useknutie. Vzniknú tak krátke polypeptidy s účinnosťou nádorového nekrotického faktora.

Aj keď je miesto mutácie vopred stanovené, nie je nutné, aby mutácia sama bola taktiež vopred stanovená. Napríklad pri optimalizácii mutantov v polohe 131 sa vykoná náhodná mutagenéza v kodóne arginínu 131a expresované mutanty nádorového nekrotického faktora sa testujú na optimálnu kombináciu cytotoxickej účinnosti a proteázovej rezistencie. Techniky, ktorými sa robia substitučné mutácie na vopred stanovených miestach DNA, ktoré majú známu sekvenciu, sú veľmi dobre známe odborníkom, napríklad mutagenéza primérom M13.

Mutagenéza nádorového nekrotického faktora sa robí tak, že sa vykoná inzercia aminokyselín, obyčajne radu asi od 1 do 10 aminokyselinových skupín, alebo delécia asi od 1 do 30 skupín. Na prípravu konečnej konštrukcie sa môžu medzi sebou kombinovať substitúcie, dclccic, inzercie a hocijaké ich subkombinácie. Medzi inzercie patrí napojenie na amínový alebo karboxylový koniec, napr. hydrofóbne rozšírenie karboxylového konca. Výhodne sa však robí iba substitúcia. Mutácia v kódujúcej oblasti nesmie umiestniť sekvenciu mimo čítaciu oblasť. Mutácie taktiež výhodne nevytvárajú oblasti, ktoré by mohli produkovať sekundárne mRNA štruktúry.

Nie všetky mutácie v DNA, ktorá kóduje nádorový nekrotický faktor, budú expresované v konečnom sekretovanom produkte. Napríklad hlavnou triedou substitučných mutácií DNA sú také mutácie, v ktorých rôzny sekrečný leader alebo signál substituuje prirodzený ľudský sekrečný leader a to buď deléciami s leader sekvenciou, alebo substitúciami, v ktorých väčšina alebo všetky prirodzené leadery sú vymenené za leader, ktorý bude pravdepodobne rozpoznávaný zamýšľaným hostiteľom. Napríklad pri konštrukcii prokaryotického expresného vektora je ľudský sekrečný leader delegovaný v prospech leaderu bakteriálnej alkalickej fosfatázy alebo tepelne stabilného entorotoxínu II, v prípade kvasiniek je leader substituovaný leaderom kvasinkovej invertázy, alfafaktora alebo kyselinovej fosfatázy. Ľudský sekrečný leader môže byť však rozpoznávaný inými hostiteľmi ako sú ľudské bunkové línie, najpravdepodobnejšie bunkovou kultúrou vyšších eukaryotických buniek. Ak je sekrečný leader hostiteľom rozoznávaný, potom napojený proteín obsahuje nádorový nekrotický faktor a leader je obyčajne štiepený na peptidovej väzbe leader-nádorový nekrotický faktor a dochádza k sekrécii nádorového nekrotického faktora. Aj keď je teda na transformáciu hostiteľa použitá mutácia pre-TNF DNA, mutantný pre-TNF sa syntetizuje ako medziprodukt a výsledný nádorový nekrotický faktor je obvykle natívny maturovaný nádorový nekrotický faktor.

Inú väčšiu triedu mutantov DNA, ktoré nie sú expresované ako deriváty nádorového nekrotického faktora, sú substitúcie nukleotidov, ktoré zvyšujú expresiu primáme tým, že sú vynechané slučky na amínovom konci transkribovanej mRNA (pozri sprievodnú US patentovú prihlášku 303 687, ktorá je tu zahrnutá ako citácia) alebo sa získajú kodóny, ktoré sú ľahšie transkribované vybraným hostiteľom, napr. dobre známe E. coli preferenčnými kodónmi pre expresiu v E. coli.

V podstate homogénny nádorový nekrotický faktor znamená nádorový nekrotický faktor, ktorý v podstate neobsahuje iné proteíny, ktoré sú prirodzené pre zdroj, z ktorého bol nádorový nekrotický faktor izolovaný. To znamená, že nádorový nekrotický faktor (homogénny) v podstate neobsahuje proteíny krvnej plazmy, ako je napríklad albumín, fibrinogén, serínové proteázy, α-globulíny, cytotoxické polypeptidy, ktoré nie sú nádorovým nekrotickým faktorom, ako je lymfotoxin alebo interferóny, alebo iné proteíny bunky alebo organizmu slúžiaceho ako syntetický pôvodca nádorového nekrotického faktora, vrátane celých buniek a zvyškov buniek. Homogénny nádorový nekrotický faktor môže však obsahovať také látky, ako sú nižšie opísané stabilizátory a excipienty, vopred stanovené množstvá proteínu z bunky alebo organizmu, ktorý slúži ako syntetický pôvodca, proteíny z iných buniek alebo organizmov ako z tých, ktoré sú zdrojom nádorového nekrotického faktora a syntetické polypeptidy, ako je napríklad poly-L-lyzín. Rekombinantný nádorový nekrotický faktor, ktorý sa expresuje v allogénnej, napr. v bakteriálnej, hostiteľskej bunke, sa ale expresuje bez proteinov zdroja génov.

Nádorový nekrotický faktor sa výhodne syntetizuje v kultúre rekombinantných organizmov. Žiaduce nie sú ani periférne krvné lymfocyty (PBLs), ani bunkové línie. V praxi je ťažko získať PBLs jednej triedy tak, aby neboli znečistené bunkami inej triedy, napríklad je ťažko získať makrofágy bez buniek B alebo T. Pri takomto znečistení sa na produkty týchto buniek budú ťažšie aplikovať separačné postupy, pretože primiešané bunky uvoľňujú ďalšie potenciálne cytotoxické faktory a proteíny. Nádorový nekrotický faktor získaný z nerekombinantnej kultúry je drahý a pozostáva iba z natívneho nádorového nekrotického faktora. Takéto kultúry nemajú flexibilitu rekombinantnej kultúry, ktorou sa vlastnosti nádorového nekrotického faktora zlepšujú.

DNA, ktorá kóduje nádorový nekrotický faktor, sa získava chemickou syntézou, vyhľadávaním a testovaním rezervných transkriptov mRNA z kultúry PBL alebo bunkových línií, alebo vyhľadávaním a testovaním v genómových bankách bunky. Medzi vhodné kultúry bunkových línií patria línie monocytických buniek, ako sú napríklad promyelocytické bunkové línie odborníkmi označené „HL-60“ (jeden typ je dostupný z ATCC ako CCL 240) a histiocytická lymfatická bunková línia U937 (ATCC CRL 1593). Tieto a ďalšie bunkové línie sú indukované tak, aby vystavením buniek chemickým a/alebo fyzikálnym činidlám, došlo k expresii a sekrécii nádorového nekrotického faktora. Nádorový nekrotický faktor môže byť v istých monocytických bunkových líniách efektívne indukovaný iba PMA, iné konvenčné činidlá, ako je napríklad lipopolysacharid, stafylokokový enterotoxín B alebo tymozín a-1, nebola indukcia nádorového nekrotického faktora v týchto bunkových líniách tak efektívna ako PMA. Pretože je pre lokalizáciu bunkových línií expresujúcich nádorový nekrotický faktor (a teda obsahujúca žiadanú mRNA) požadované rôzne množstvo testovania a vyhľadávania, je efektív7 nejšie jednoducho gén syntetizovať. Syntéza je výhodná, pretože syntézou je možné zaviesť jedinečné reštrukčné miesta (tým sa uľahčí použitie génu vo vektoroch, ktoré obsahujú iné reštrikčné miesta ako sú miesta v natívnej sekvencii) a je možné využiť stupne, v ktorých dôjde k zvýšeniu efektívnosti translácie, ako je diskutované.

Táto DNA je kovalentne označená detegovateľnou látkou, ako je napríklad fluorescenčná skupina, rádioaktívny atóm alebo chemiluminiscenčná skupina známymi spôsobmi. Potom sa použije v konvenčných hybridizačných testoch. Tieto testy sa používajú na identifikáciu vektorov a transformantov nádorového nekrotického faktora, ako je opísané v príkladoch alebo na diagnózu in vitro, ako je napríklad detekcia mRNA nádorového nekrotického faktora v krvných bunkách.

mRNA pre nádorový nekrotický faktor je prekvapivo vzácna, dokonca i v indukovaných bunkách HL-60, možná vďaka nestabilite, ktorej príčiny nie sú známe. Ďalej je dôležitý čas, po ktorom sa od indukcie bunky objaví mRNA nádorového nekrotického faktora. mRNA pre nádorový nekrotický faktor sa v bunkách objavuje po veľmi krátky čas, asi 4 hodiny po indukcii. Tento fakt je odlišný od lymfotoxínu, ktorý sa objavuje asi 12 hodín po indukcii. Tým sa môže stať, že sa cDNA ľahko prehliadne, pokiaľ sa nevie, čo hľadať. Ale ak je raz cDNA kompletne dostupná, ako je to umožnené zisteniami podľa tohto vynálezu, potom už je rutinné vyhľadať cDNA nádorového nekrotického faktora v banke cDNA indukovaných HL-60 alebo PBLs s použitím sond, ktoré majú sekvenciu takejto DNA. Dve banky fágu HL-60 testované na príkladoch obsahujú relatívne stály počet pozitívnych plakov, takže je zrejmé, že rutinnými hybridizačnými testami sa indikuje fág, ktorý obsahuje žiadanú cDNA.

Bunky bunkovej línie HL-60, ktoré syntetizujú nádorový nekrotický faktor, sa kultivujú konvenčným spôsobom, pokiaľ nedosiahnu hodnotu asi 8 až 12.10⁵ buniek/ml. Bunky sa z kultúry odstránia, premyjú, prenesú do bezsérového média a kultivujú v médiu, ktoré obsahuje PMA. V kultivácii sa pokračuje, pokiaľ sa v kultivačnom médiu neakumuluje žiadaná koncentrácia nádorového nekrotického faktora, obyčajne asi 400 jednotiek nádorového nekrotického faktora v jednom mililitri. Kultivačný supematant sa výhodne vyčerí centrifugáciou alebo iným spôsobom. Odstránia sa tak zvyšky buniek od rozpustných zložiek. Centrifugácia sa robí iba pri nízkych otáčkach, aby sa pohybovali iba suspendované častice. Ďalej sa supematant vyčistí opísaným spôsobom.

Alebo sa, a to výhodne, nádorový nekrotický faktor syntetizuje v hostiteľských bunkách, ktoré sú transformované vektormi obsahujúcimi DNA kódujúcou nádorový nekrotický faktor. Vektor je konštrukciou replikovateľnej DNA. Vektory sa tu používajú buď na amplifikáciu DNA, ktorá kóduje nádorový nekrotický faktor a/alebo na expresiu DNA, ktorá kóduje nádorový nekrotický faktor. Expresný vektor je konštrukciou replikovateľnej DNA, v ktorej je sekvencia DNA kódujúca nádorový nekrotický faktor odštiepiteľne napojená na vhodné regulačné sekvencie, ktoré sú schopné uskutočniť expresiu nádorového nekrotického faktora vo vhodnom hostiteľovi. Takými regulačnými sekvenciami sú transkripčný promótor, prípadná operátorova sekvencia na reguláciu transkripcie, sekvencie kódujúce vhodné ribozomálne väzbové mieste mRNA a sekvencia, ktorá reguluje termináciu transkripcie a translácie.

Vektorom môže byť plazmid, vírus (vrátane fágu) alebo integrovateľný fragment DNA, t. j. integrovateľný do hostiteľovho genómu rekombinácií. Len čo je raz transformovaný do vhodného hostiteľa, vektor sa replikuje a funguje nezávisle od hostiteľského genómu. V tejto prihláške je pojem „vektor“ genetický k pojmu „plazmid“, ale plazmidy sú v súčasnosti najobvyklejšie používanou formou vektora. Ale aj všetky ďalšie formy vektorov, ktoré majú rovnakú funkciu a ktoré sú alebo budú známe v odbornej literatúre, sú vhodné i pre použitie tu. Vhodné vektory obsahujú replikón a regulačné sekvencie, ktoré sú odvodené od typov zlučiteľných s hostiteľom zamýšľanej expresie. Transformované hostiteľské bunky sú bunky, ktoré sú transformované alebo transfektované vektormi nádorového nekrotického faktora skonštruovanými s použitím techník rekombinantnej DNA. Transformované hostiteľské bunky pravidelne expresujú nádorový nekrotický faktor. Expresovaný nádorový nekrotický faktor sa buď intraceluláme ukladá alebo sa sekretuje buď do periplazmového priestoru alebo do kultivačného supematantu, čo závisí od vybranej hostiteľskej bunky.

Oblasti DNA sú odštiepiteľne napojené (ak medzi nimi existuje funkčný vzťah) medzi sebou. Napríklad DNA pre-sekvencie alebo sekrečného leadera sú odštiepiteľne napojené na DNA polypeptidov, ak sú expresované ako preproteín, ktorý participuje pri sekrécii polypeptidov, promótor je odštiepiteľne napojený na kódujúcu sekvenciu, ak reguluje transkripciu sekvencie, alebo väzbové miesto ribozómu je odštiepiteľne napojené na kódujúcu sekvenciu, ak je umiestnené tak, že dovoľuje transláciu. Odštiepiteľne naviazaný obyčajne znamená styčný a v prípade sekrečných leaderov styčný v čítacej forme.

Vhodnými hostiteľskými bunkami sú prokaryoty, kvasinky alebo vyššie eukaryotické bunky. Medzi prokaryoty patria negatívne alebo grampozitívne organizmy, napr. E. coli alebo Bacilli. Medzi vyššie eukaryotické bunky patria bunkové línie cicavcov pripravené opísaným spôsobom. Výhodnou hostiteľskou bunkou je kmeň E. coli W3110 (ATCC 27 325) rezistentnej na fágy, ktorý je opísaný v príkladoch, aj keď sú vhodné i iné prokaryoty, ako je napríklad E. coli B, E. coli X1776, (ATCC 31 446), E. coli 294 (ATCC 31 537), typy Pseudomanas alebo Serraiia Marcesens.

Výhodný pre expresiu nádorového nekrotického faktora je systém prokaryotický hostiteľ-vektor. Molekula nádorového nekrotického faktora obsahuje dve cysteinové skupiny. Pre post-translačnú tvorbu potenciálnej disulfidovej väzby sú potrebné mierne požiadavky, napríklad E. coli expresuje biologicky účinný nádorový nekrotický faktor. K dispozícii jc mnoho vhodných mikrobiálnych vektorov. Mikrobiálny vektor obyčajne obsahuje začiatok replikácie rozpoznávaný zamýšľaným hostiteľom, promótor, ktorý bude fungovať v hostiteľovi, a fenotypický selekčný gén, napríklad gén kódujúci proteíny prepožičiavací antibiotickú rezistenciu alebo dodávajúcu auxotrofnú požiadavku. Pre iných hostiteľov sa zostavujú podobné konštrukcie. E. coli sa typicky transformuje plazmidom pBR322, plazmidom odvodenými od typu E. coli (Bolivar a spol.: Gene 2, 95 (1977)). Plazmid pBR322 obsahuje gény ampicilínovej a tetracyklínovej rezistencie. Tým sú dostupné ľahké prostriedky pre identifikáciu transformovaných buniek.

Vektory musia obsahovať promótor, ktorý je rozpoznávaný hostiteľským organizmom. Promótor je obyčajne k zamýšľanému hostiteľovi homológny. Medzi promótory, ktoré sa najčastejšie používajú pri konštrukcii rekombinantnej DNA patrí β-laktamázový (penicilinázový) a laktózový promótorový systém (Chang a spol.: Náture 275, 615 (1978) a Goeddel a spol.: Náture 281, 544 (1979)), tryptofánový (trp) promótorový systém (Goeddel a spol.: Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) a prihlášková publikácia európskeho patentového úradu č. 36 776) a tac promótor (H.

DeBoer a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 až 25 (1983)). Aj keď tieto promótory sú najobvyklejšie používanými promótormi, vhodné sú aj iné známe mikrobiálne promótory. Podrobnosti týkajúce sa ich nukleidových sekvencií, ktoré boli publikované, umožňujú zručnému pracovníkovi odštiepiteľne ich ligovať na DNA kódujúcu nádorový nekrotický faktor v plazmidových vektoroch (Siebenlist a spol.: Celí 20, 269 (1980)) a DNA kódujúce nádorový nekrotický faktor. Dnes je výhodným vektorom derivát pBR322 obsahujúci promótor E. coli alkalickej fosfatázy a trp Shine-Dalgamo sekvenciu. Promótor a Shine-Dalgamo sekvencie sú odštiepiteľne napojené na DNA kódujúcu nádorový nekrotický faktor, t. j. sú situované tak, aby podporovali transkripciu mRNA nádorového nekrotického faktora z DNA.

Vedľa prokaryotov sa transformujú vektormi kódujúcimi nádorový nekrotický faktor taktiež eukaryotické mikróby, ako sú napríklad kvasinkové kultúry. Saccharomyces cerevisiae alebo obyčajné pekárske kvasnice, sú najvšeobecnejšie používané nižšie eukaryotické hostiteľské mikroorganizmy, aj keď bežne je dostupných mnoho iných kmeňov. Kvasinkové vektory obyčajne obsahujú začiatok replikácic z dvojmikrónového kvasinkového plazmidu alebo samostatne sa replikujúcu sekvenciu (ARS), promótor, nádorový nekrotický faktor, sekvenciu pre polyadenyláciu a termináciu transkripcie a selekčný gén; vhodným plazmidom pre expresiu nádorového nekrotického faktora v kvasinkách je plazmid YRp7 (Stinchcomb a spol.: Náture 282 (1979), Kingsman a spol.: Gene 7, 141 (1979) a Tschemper a spol. Gene 10, 157 (1980)). Tento plazmid už obsahuje trpí gén, ktorý poskytuje selekčný znak (marker) mutantnému kmeňu kvasiniek, ktorý· nemá schopnosť rásť v tryptofáne, napríklad ATCC č. 44 076 alebo PEP4-1 (Jones: Genetics 85, 12 (1977)). Prítomnosť oblastí trpí v genóme kvasinkovej hostiteľskej bunky tak poskytuje účinné okolie na detekciu transformácie rastom za neprítomnosti tryptofánu.

Medzi vhodné promótorové sekvencie v kvasinkových vektoroch patria promótory pre metalotionein, 3-fosfoglycerátkinázu (Hitzeman a spol.: J. Biol. Chem. 255, 073 (1980)) alebo iné glykolytické enzýmy (Hess a spol.: J. Adv. Enzýme Reg. 7, 149 (1968) a Holland a spol.: Biochemistry 17, 4900 (1978)), ako sú napríklad enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát-dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukózo-6-fosfát-izomeráza, fosfoglukózo-izomeráza a glukokináza. Vhodne vektory a vhodné promótory na použitie pri expresii kvasinkami sú ďalej opísané R. Hitzemanom a spol.: Publikácia európskeho patentového úradu č. 73 657. Inými promótormi, ktoré majú ďalšiu výhodu transkripcie regulovanej podmienkami rastu, sú promótor oblasti alkoholdehydrogenázy 2, izocytochróm C, kyselinová fosfatáza, degradatívne enzýmy spojené s metabolizmom dusíka, uvedený metalotionein a glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenázy a taktiež enzýmy, ktoré sú zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy. Pri konštrukcii vhodných expresných plazmidov sa terminačné sekvencie spojené s týmito génmi taktiež ligujú do expresného vektora 3 sekvenciou kódujúcou nádorový nekrotický faktor. Tým sa zaistí polyadenylácia mRNA a terminácia.

Okrem mikroorganizmov môžu byť ako hostiteľské bunky použité taktiež kultúry buniek, ktoré sú odvodené od mnohobunkových mikroorganizmov. Tie však nie sú výhodné, pretože až doposiaľ boli s mikróbmi, ktoré expresujú nádorový nekrotický faktor, získané vynikajúce výsledky. V princípe je možné pracovať s hociktorou kultúrou vyšších eukaryotických buniek, či už kultúrou zo stavov cov, alebo nie. Najväčší záujem sa sústreďuje na bunky stavovcov. V posledných rokoch sa množenie buniek stavovcov v kultúre (pletivová kultúra) stalo rutinnou záležitosťou (Tissue Culture, Academic Press, ed. Kruse a Patterson, 1973). Príkladmi užitočných hostiteľských bunkových línií sú bunky VERO a Hela, bunkové línie vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) a bunkové línie WI38, BHK, COS-7 a MDCK. Expresné vektory pre tieto bunky obsahujú obyčajne (ak je to nutné) začiatok replikácie, promótor, ktorý je umiestnený proti smeru génu, ktorý má byť expresovaný, spolu s ribozómovým väzbovým miestom, miesto strihu RNA, ak sa používa intrón obsahujúci genómové DNA, polyadenylačné miesto a sekvenciu terminácie transkripcie.

Regulačné sekvencie transkripcie a translácie v expresných vektoroch, ktoré sú určené na použitie pri transformácii buniek stavovcov, sa často získavajú z vírusových zdrojov. Tak napríklad obyčajne používané promótory sú odvodené od Polyoma Adenovirus 2 a najvýhodnejšie od typu Simian Vírus 40, t. j. SV40. Tieto skoré a neskoré promótory sú zvlášť užitočné, pretože sa ľahko získavajú z vírusu ako fragment, ktorý obsahuje taktiež SV40 vírusový začiatok replikácie (Fiers a spol.: Náture 273, 113 (1978)). Je možné používať taktiež väčšie alebo menšie SV40 fragmenty za predpokladu, že obsahujú sekvenciu s približne 250 pármi nukleotidov od Hind III miesta k Bgl I miestu umiestnenú vo vírusovom začiatku replikácie. Ďalej je taktiež možné, a často je to aj žiaduce, využiť ľudský genómový promótor, riadiace a^zalebo signálne sekvencie obyčajne spojené s nádorovým nekrotickým faktorom za predpokladu, že takéto riadiace sekvencie sú zlučiteľné so systémami hostiteľských buniek.

Začiatok replikácie sa môže získať buď konštrukciou vektora, ktorý by zahŕňal exogénny začiatok, ako napríklad taký, ktorý' je možné odvodiť od SV40 alebo od iných vírusových zdrojov (napríklad Polyoma, Adenovirus, VSV alebo BPV), alebo sa môže získať chromozomálnym replikačným mechanizmom hostiteľskej bunky. Ak je vektor integrovaný v chromozóme hostiteľskej bunky, potom je často druhá možnosť postačujúca.

Pri výbere vhodnej hostiteľskej cicavčej bunky na transfekciu vektorov, ktoré obsahujú DNA sekvencie kódujúce tal nádorový nekrotický faktor ako dihydrofolát-reduktázu (DHFR), je vhodné vybrať hostiteľa podľa toho, aký typ DHFR proteínu sa použije. Ak sa používa DHFR proteín divokého typu, potom je výhodné vybrať takú hostiteľskú bunku, ktoré j c deficitná na DIIFR. To umožní použiť DHFR kódujúce sekvencie ako markérov pre úspešnú transfekciu do selektívneho média s nedostatkom hypoxantínu, glycínu a tymidínu. V tomto prípade je patričnou hostiteľskou bunkou bunková línia vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) deficitná na DHFR aktivitu, ktorá sa pripraví a namnoží spôsobom opísaným Urlaubom a Chasinom: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,4216 (1980).

Naopak, ak sa ako riadiaca sekvencia použije DNA kódujúca DHFR proteín s nízkou väzbovou afinitou k metotrexátu (MTX), potom nie je nutné používať bunky rezistentné na DHFR. Pretože mutantná DHFR je rezistentná na MTX, je možné použiť médium obsahujúce MTX ako prostriedok selekcie za predpokladu, že hostiteľské bunky samy sú na MTX citlivé. Väčšina eukaryotických buniek, ktoré sú schopné absorbovať MTX, je citlivá na metotrexát. Jednou z týchto užitočných bunkových línii je línia CHO, CHO-K1 (ATCC č. CCL61).

Nádorový nekrotický faktor sa najskôr izoluje z kultúry. Transformované nesekretujúce bunky sa lyžujú sonikáciou alebo iným prijateľným spôsobom. Zvyšky buniek sa odstránia odstreďovaním. Supematanty zo sekretujúcich buniek (a ko sú napríklad indukované bunkové línie) sa od buniek oddelia odstreďovaním. Potom sa použije jeden alebo viac z nasledujúcich stupňov a/alebo sa použijú úplne iné spôsoby. Podľa nasledujúceho spôsobu sa nádorový nekrotický faktor vyčistí do takého stupňa, ktorý je postačujúci pre sekvenovanic. Tento stupeň však nie je nutne vyčistený do takého stupňa, aký je požadovaný pre terapeutický produkt.

V prvom čistiacom stupni sa nádorový nekrotický faktor z lyzovanej kultúry alebo supematantu kultivačného média adsorbuje na hydrofóbnu látku. Ako hydrofóbna látka sa výhodne používa neželatínový hydrofóbny povrch, ako je napríklad kremičitan alebo polyolefm, hoci je vhodná taktiež alkyl-Sepharosa. Výhodným usporiadaním je sklo s regulovanou veľkosťou pórov. Pripraví sa zmes asi jedného objemu skla s regulovanou veľkosťou pórov s 50 objemami supematantu. Pri asi 4 °C sa za trepania nechá uskutočňoval adsorpcia asi 30 minút až asi 2 hodiny, výhodne počas asi jednej hodiny, za mierne alkalických podmienok. Adsorbent by sa mal potom premyť vhodným pufrom, aby sa odstránili zachytené primiešané proteíny.

Adsorbovaný nádorový nekrotický faktor sa z hydrofóbnej látky eluuje zmenou solvatačných vlastností média. Elúcia sa môže robiť tak, že sa nechá prechádzať roztok pufrovaný na pH asi 7 až 8,5, výhodne na pH asi 8, obsahujúci IM soľ a efektívne množstvo vodného roztoku s vodou miešateľného organického polyolu, ako je napríklad etylénglykol alebo glycerín, obyčajne etylénglykol v rozmedzí 10 až 30 objemových percent, výhodne asi 20 objemových percent. Optimálne podmienky ale závisia od použitého polyolu. Frakcie, ktoré obsahujú nádorový nekrotický faktor, sa detekujú testom in vitro, ako je opísané, alebo iným vhodným testom. Čistenie a výťažok tohto stupňa z monocytickej bunkovej kultúry, rovnako ako nasledujúce stupne, sú uvedené v tabuľke I.

Ďalšie čistenie sa robí tak, že sa nádorový nekrotický faktor adsorbuje na anexe terciámeho alebo kvartémeho amínu. Výhodnými živicami na tento účel sú hydrofilné matrice, ako je napríklad skrížené naviazaný polystyrén, dextrán alebo celulóza, substituované alkylovými terciárnymi alebo kvartémymi amínovými skupinami. Komerčné produkty tohto typu sú dostupné ako DEAE celulóza, QAE Sephadex alebo pod obchodným označením Mono Q (vo všetkých týchto prípadoch alkylový substituent znamená etylovú skupinu). Najlepšie výsledky boli dosiahnuté s rýchlou proteínovou kvapalinovou chromatografiou systémom, ktorý opisuje J. Richey v „Američan Laboratory“, október 1982, s použitím makroporéznych v podstate jednotných častíc podľa Ugelstadta a spol.: Náture 303, 95 až 96 (1983). Týmto spôsobom je možné vyčistiť nádorový nekrotický faktor na vysoký stupeň čistoty'.

Vyčistenie do v podstate homogenity je možné dosiahnuť len ďalším delením SDS PAG elektroforézou alebo vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou na obrátených fázach na C4 (HPLC), ako je ďalej opísané v príkladoch. Tento produkt však nie je žiaduci pre terapiu, pretože stratil podstatnú Časť účinnosti vystavením účinku SDA alebo organickým rozpúšťadlám pri HPLC. Koncentrácia proteínu sa stanoví podľa M. Bradforda. Anál. Biochem. 72, 248 až 254 (1976). Počas posledných stupňov čistenia bola koncentrácia proteínu stanovovaná pomocou zloženia aminokyselín a tiež sekvenovaním aminokyselín.

Tabuľka I

Čistenie ľudského nádorového nekrotického faktora z kultivačného média buniek HL 60

čistiaci stupeň	konečný objem (ml)	celkový proteín (mg)	cytolytická aktivita (jednotky)	relatívna špecifická aktivita (jedn./mg)	čistenie	izolované (%)
východiskový materiál	58 000	1964	14,2.10°	0,007.10’	-	-
chromatografia na skle s regulovanou veľkosťou pórov	1 080	88,9	11,1.10°	0,12.10°	17	78,5
chromatografia na DEAE-celulóze	285	9,05	8,9.10°	0,98.10°	140	62,7
rýchla proteínová kvapalinová chromatografia na Mono Q	75	0,44	6,9.10°	15,68.10°	2240	48,6
preparativna SDS PAG elektroforézy alebo HPLC na C4 na obrátených fázach	6	0,028	2,71.10°	96,79.10°*	13387*	19,D

+ Korigované na čiastočnú deštrukciu aktivity nádorového nekrotického faktora, ktorá je spôsobená SDS, kyselinou trifluóroctovou a propanolom

Na podávanie sa nádorový nekrotický faktor pripraví zmiešaním nádorového nekrotického faktora so žiadaným stupňom čistoty s fyziologicky prijateľnými nosičmi, t. j. nosičmi, ktoré v používaných dávkach a koncentráciách nie sú toxické. Obyčajne sa nádorový nekrotický faktor spojí s puframi, antioxidantmi, ako je napríklad kyselina askorbová, polypeptidy s nízkou molekulovou hmotnosťou (menej ako asi 10 skupín), proteínmi, aminokyselinami, cukrami vrátane glukózy alebo dextrínov, chelatačnými činidlami, ako je napríklad etyléendiaminotetraoctová kyselina (ED-TA), a inými stabilizátormi a excipientmi. Nosiče by mali byť formulované tak, aby stabilizovali nádorový nekrotický faktor ako dimér a/alebo, výhodne, ako trimér. Toto je možné dosiahnuť tým, že sa solí alebo detergenty nepoužívajú v takých koncentráciách, ktoré disociujú nádorový nekrotický faktor na monoméry. Tiež je potrebné sa vyhnúc takým podmienkam, pri ktorých nádorový nekrotický faktor agreguje do vyšších multimérov. Pri čistení, lyofilizácii alebo skladovaní vo vodných roztokoch sa preto obyčajne používa neiónové povrchovoaktívne činidlo, ako je napríklad Tween 20. Nádorový nekrotický faktor, ktorý sa používa na terapeutické účely, musí byť sterilný. Toto sa ľahko dosiahne filtráciou sterilnými filtračnými membránami.

SK 279897 Β6

Nádorový nekrotický faktor sa skladuje obyčajne v lyofilizovanej forme.

Nádorový nekrotický faktor sa prípadne používa v kombinácií s inými protinovotvarovými činidlami, ako sú napríklad chemoterapeutické antibiotiká (aktinomycín-D, adriamycin, aklacinomycín A), alebo s činidlami, ktoré zvyšujú alebo stimulujú imúnnu odpoveď, napríklad s imunoglobultnmi, ako je gama-globulín, vrátane imunoglobulínov, ktoré majú afinitu na bunkové povrchy antigénov novotvarov. Pretože interferóny pôsobia synergicky s nádorovým nekrotickým faktorom v testoch bunkovej lýzie, je žiaduce kombinovať alfa-, beta- alebo gama-interferóny s prostriedkami s nádorovým nekrotickým faktorom a lymfotoxínom. Typický prostriedok obsahuje nádorový nekrotický faktor a gama-interferón v takom pomere, aby jednotková účinnosť bola od asi 0,1 : 1 do asi 200 : 1, obyčajne 10:1; časť nádorového nekrotického faktora môže byť nahradená lymfotoxínom. Tieto pomery môžu byť upravené tak, ako to vyžaduje terapeutická skúsenosť.

Prostriedky s nádorovým nekrotickým faktorom sa podávajú živočíchom, ktoré majú nádory. Spôsob podávania je zhodný so známymi spôsobmi podávania, napríklad intravenózne, intraperitoneálne, intramuskuláme, vnútornou infúziou alebo injekciou sterilného roztoku nádorového nekrotického faktora a/alebo je možné použiť aj opísané systémy s pomalým uvoľňovaním nádorového nekrotického faktora. Nádorový nekrotický faktor sa podáva do miest poškodenia, t. j. priamo injekciou do pevných nádorov. V prípade rozosiatych nádorov, ako je napríklad leukémia, je výhodné podávať nádorový nekrotický ťaktor intravenózne alebo do lymfatického systému. Nádory orgánov v brušnej dutine, ako je napríklad rakovina vaječníkov, sa výhodne liečia intraperitoneálnou infúziou použitím prístrojov pre intraperitoneálnu dialýzu a tomu zodpovedajúcich roztokov. Obyčajne sa však nádorový nekrotický faktor podáva kontinuálne infúziou, aj keď je prijateľné aj podávanie bolus injekcií.

Je žiaduce, aby nádorový nekrotický faktor bol podávaný vo forme implantovateľných prostriedkov pomaly ho uvoľňujúcich. Príkladmi vhodných systémov pre proteíny, ktoré majú molekulovú hmotnosť zodpovedajúcu dimérom alebo trimérom nádorového nekrotického faktora, sú kopolyméry L-glutamovej kyseliny a gama etyl-L-glutamátu (U. Sidman a spol.: Biopolymers 22(1), 547 až 556(1983)), poly-(2-hydroxyetylmetakrylát) (R. Langer a spol.: J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 až 277 (1981) a R. Langer. Chem. Tech. 12, 98 až 105 (1982)) alebo etylén-vinylacetát (R. Langer a spol.: tamtiež). Tieto prostriedky sa implantujú do miest, z ktorých boli nádory chirurgicky odstránené. Nádorový nekrotický faktor sa taktiež používa v polopriepustných mikrotobolkách alebo lipozómoch pre injekčné podanie do nádorov. Tento spôsob podávania je zvlášť vhodný pri chirurgicky neodstrániteľných nádoroch, napr. pri mozgových nádoroch.

Množstvo nádorového nekrotického faktora, ktorého sa pri podávaní používa, závisí napríklad od spôsobu podávania, od typu nádorov a od stavu pacienta. Pri použití injekcie do miesta poškodenia je potrebné menšie množstvo nádorového nekrotického faktora (vztiahnuté na telesnú hmotnosť), ako pri intravenóznej infúzii, pričom niektoré typy nádorov sú na nádorový nekrotický faktor rezistentnej šie ako iné typy, napr. leukemické. Bude teda nutné, aby terapeuti stanovili dávku a modifikovali spôsob podávania tak, ako je žiaduce na získanie optimálnej cytotoxickej účinnosti na cieľový nádor, to je možné stanoviť napríklad biopsiou nádoru alebo diagnostickými testami na údajné rakovinové znaky, ako je napríklad karcinoembryonný antigén, z pohľadu hociktorej rekombinantnej toxicity vo vyšších dávkach. Bolo zistené, že dávky asi 120 pg na kg telesnej hmotnosti za deň pri myšiach pri intravenóznom podávaní sú obyčajne v podstate netoxické a účinné in vivo.

Predpokladá sa, že cytotoxická účinnosť nádorového nekrotického faktora nie je druhovo špecifická. To znamená, že sa pri terapii ľudských nádorov môže použiť i iný nádorový nekrotický ťaktor ako ľudský nádorový nekrotický· faktor, napríklad nádorový nekrotický faktor z hovädzieho alebo bravčového zdroja. Je však žiaduce, aby bol používaný nádorový nekrotický faktor z tých druhov, ktoré sú ním liečené, aby sa zabránilo potenciálnej tvorbe autoprotilátok.

Na zjednodušenie príkladu bude na niektoré často sa vyskytujúce spôsoby odkazované krátkymi frázami.

Plazmidy sú označované malým p, za ktorým nasledujú veľké písmená a/alebo číslice. Východiskové plazmidy používané v tejto prihláške sú komerčne dostupné, sú verejne dostupné bez nejakých reštrikčných obmedzení alebo je ich možné z takýchto dostupných plazmidov skonštruovať podľa publikovaných spôsobov. Okrem toho sú v odbornej literatúre známe ekvivalentné plazmidy, ako je zrejmé odborníkovi.

Pojem „štiepenie DNA“ sa týka katalytického štiepenia DNA enzýmom, ktorý pôsobí na istých miestach DNA. Takéto enzýmy sa nazývajú reštrikčné enzýmy. Miesta, na ktoré sú tieto enzýmy špecifické, sa nazývajú reštrikčné miesta. Pojem „čiastočné“ štiepenie znamená neúplné rozštiepenie reštrikčným enzýmom, t. j. štiepenie prebieha za takých podmienok, že niektoré miesta, ale nie všetky, v DNA substráte sú štiepené danou reštrikčnou endonukleázou. Rôzne reštrikčné enzýmy, ktoré sa tu používajú, sú komerčne dostupné. Pri ich používaní sa postupuje podľa návodu dodávateľa enzýmov, pokiaľ ide o reakčné podmienky, kofaktory a ďalšie požiadavky. Reštrikčné enzýmy sú obyčajne označené skratkami, ktoré sa skladajú z veľkého písmena, po ktorom nasledujú ďalšie písmená, a potom obyčajne číslo reprezentujúce organizmus, z ktorého bol reštrikčný enzým pôvodne získaný. Obyčajne sa pracuje s asi 1 pg plazmidu alebo fragmentu DNA a asi jednou jednotkou enzýmu v asi 20 pl pufrovaného roztoku. Množstvo príslušných pufrov a substrátov pre ten ktorý reštrikčný enzým sú dané výrobcom. Obyčajne sa pracuje pri inkubačnom čase asi jednu hodinu pri teplote 37 °C, ale oboje sa môže meniť podľa inštrukcií dodávateľov. Po inkubácii sa protein odstráni extrakciou fenolom a chloroformom a štiepená nukleová kyselina sa z vodnej frakcie izoluje vyzrážaním etanolom. Po štiepení reštrikčným enzýmom nasleduje niekedy hydrolýza terminálneho 5’ fosfátu bakteriálnou alkalickou fostatázou, aby sa zabránilo tomu, aby reštrikčné rozštiepené konce fragmentu DNA znova „scirkularizovali“ alebo aby sa vytvorili uzavreté slučky, čo by prekážalo inzercii iného fragmentu DNA do reštrikčné rozštiepeného miesta. Pokiaľ nie je inak uvedené, nenasleduje po štiepení plazmidov defosforylácia na 5’ konci. Pre defosforyláciu sa používajú konvenčné postupy a činidlá (T. Maniatis a spol.: Molecular Cloning, str. 133 až 134 (1982)).

Pojem „izolácia“ daného fragmentu DNA z reštrikčného štiepenia znamená, že sa rozštiepená časť oddelí elektroforézou na polyakrylamidovom géli. Fragment, o ktorý sa zaujímame, sa identifikuje porovnaním jeho pohyblivosti s fragmentmi o známej molekulovej hmotnosti, odstráni sa sekcia gélu obsahujúca žiadaný fragment a gél sa oddelí od DNA. Tento postup je všeobecne známy. Pozri napríklad. R. Lawn a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 6103 až 6114 (1981) a D. Goeddel a spol.: Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).

„Southemova analýza“ je spôsob, ktorým sa prítomnosť sekvencii DNA v rozštiepenej časti alebo v prostriedku obsahujúcom DNA potvrdí hybridizáciou na známy značený oligonukleotid alebo známy fragment DNA. Southemova analýza tu bude znamenať rozdelenie štepov na 1 % agaróze, denaturáciu a prenesenie na nitrocelulózu spôsobom podľa E. Southerna. J. Mol. Biol. 98, 503 až 517 (1975) a hybridizáciu tak, ako ju opísal T. Maniatis a spol.: Celí 15, 687 až 701 (1978).

Pojem „transformácia“ znamená zavedenie DNA do organizmu tak, že DNA je schopná replikácie a to buď ako mimochromozomálny prvok, alebo ako integrálna časť chromozómu. Pokiaľ nie je inak uvedené, potom spôsob použitý v tejto prihláške pre transformáciu E. coli je spôsob s chloridom vápenatým podľa Mandela a spol.: J. Mol. Biol. 53, 154(1970).

Pojem „ligácia“ označuje proces tvorenia fosfodiesterových väzieb medzi dvoma fragmentmi dvojvláknovej nukleovej kyseliny (T. Maniatis a spol.: tamtiež, str. 146). Pokiaľ nie je inak uvedené, robí sa ligácia s použitím známych pufrov a za známych podmienok s 10 jednotkami T4 DNA ligázy („ligasa“) a 0,5 pg približne ekvimolámych množstiev fragmentov DNA, ktoré majú byť ligované.

Pod pojmom „príprava“ DNA z transformantov sa rozumie izolácia plazmidovej DNA z mikrobiálnej kultúry. Pokiaľ nie je inak uvedené, môže sa použiť alkalický/SDS spôsob podľa Maniatisa a spol. tamtiež, str. 90.

Pojem „oligonukleotidy“ znamená krátke jednovláknové alebo dvojvláknové polydeoxynukleotidy, ktoré sa chemicky syntetizujú známymi spôsobmi, pričom sa vyčistia na polyakrylamidových géloch.

Všetky citácie literatúry sú tu výslovne zahrnuté ako odkazy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 ukazuje elučný profil nádorového nekrotického faktora pri elúcii zo skla s kontrolovanou veľkosťou pórov.

Obrázok 2 ukazuje elučný profil nádorového nekrotického faktora z dietylaminoetylcelulózy.

Obrázok 3 ukazuje elučný profil nádorového nekrotického faktora z rýchlej proteínovej kvapalinovej chromatografíe.

Obrázok 4 ukazuje elučný profil nádorového nekrotického faktora pri chromatofokusácii.

Obrázok 5 ukazuje molekulovú hmotnosť nádorového nekrotického faktora podľa SDS PAGE gólovej clcktroforczy.

Obrázok 6 ukazuje molekulovú hmotnosť nádorového nekrotického faktora podľa HPLC elúcie.

Obrázok 7 ukazuje elučný profil nádorového nekrotického faktora z kolóny HPLC C4.

Obrázok 8 ilustruje rozdelenie fragmentov nádorového nekrotického faktora po štiepení trypsínom na HPLC.

Obrázok 9 ilustruje cytotoxický efekt zmesí gama-interferónu s nádorovým nekrotickým faktorom.

Obrázok 10 uvádza nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu pre-ľudského nádorového nekrotického faktora vrátane úplného sekrečného leader nádorového nekrotického faktora.

Obrázok 11 ukazuje konštrukciu expresného vektora nádorového nekrotického faktora.

Príkladu uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Testy

Špecifická účinnosť nádorového nekrotického faktora sa stanovuje opísaným modifikovaným testom lýzie buniek (B.

Spofford: J. Immunol. 112, 2111 (1974)). Myšie ŕibroblastové bunky L-929 (ATCC CCL-929) sa kultivujú v 96 jamkách misiek s plochým dnom (3040), (Falcon Plastics, Oxford, Ca., USA) v množstve 30 000 buniek (objem 0,1 ml) na jamku za prítomnosti 1/pg/ml aktinomycínu D a seriálovo zrieďovanej testovanej vzorky (0,125 ml). Bunky sa inkubujú vo vlhkej atmosfére pri teplote 37 °C s 5 % oxidu uhličitého. Testovaná vzorka sa po 18 hodinách odstráni, dosky sa premyjú a lýzia buniek sa stanoví vyfarbením dosiek 0,5 % roztokom kryštálovej violete v zmesi metanol-voda (1:4, objemové diely). Koncový bod mikrotitrovacích dosiek bol stanovený pomocou prístroja Microelisa autoreader (firmy Dynatech) zmeraním absorpcie pri 450 nm a transmisie pri 570 nm. Bunky, ktoré boli kultivované len v samotnom kultivačnom médiu, mali 0 % lýziu, bunky, ktoré boli kultivované s 3M roztokom hydrochloridu guanidínu, mali 100 % lýziu. Jedna jednotka nádorového nekrotického faktora sa definuje ako také množstvo nádorového nekrotického faktora (ak je testovaný v objeme 0,125 ml), ktoré je potrebné na lýziu 50 % buniek.

Nádorový nekrotický faktor bol testovaný tiež testom nekrózy nádoru in vivo. V stručnosti - tento test sa robí tak, že bunky Meth A Sarcoma (5.10³ buniek) sa nechajú rásť v myších samiciach CB6F1 (BALB/c x C57BL/6)F_] počas siedmich až desiatich dní. Vzorka nádorového nekrotického faktora sa potom podá injekčné do nádoru. Po 24 hodinách sa myši usmrtia prerušením ciev, nádory sa odstránia a nekróza sa vyhodnotí histologický, ako je opísané E. Carswellom a spol. v Proc. Natl. Acad. USA 72, 3666 až 3670 (1975).

Príklad 2

Využitie PBLs alebo monocytických bunkových línií na syntézu nádorového nekrotického faktora.

V dvojlitrových guľatých bankách (890 cm²) sa v 500 ml média RPMI 1640 (Irvine Scientific, Šanta Ana, Kalifornia, USA), ktoré obsahuje 10 mM HEPES, 0,05 mM β-merkaptoetanol, lOOjednotiek penicilínu na mililiter, 100 ug streptomycínu na ml a 10 % fetálnebo teľacieho séra, nechá rásť línia ľudských promyelotických buniek HL-60 s bunkovou hustotou 1.10⁵ buniek na mililiter. Po troch dňoch pri teplote 37° C, keď bunková hustota stúpla na 8 až 12.10⁵ buniek/ml, sa bunky izolujú odstreďovaním pri 1000 G počas 10 minút, premyjú sa dvakrát bezsérovým médiom RPMI 1640 a prenesú sa do rovnakého opísaného média v bunkovej hustote 15 až 20.10⁵ buniek na mililiter. Bunky sa kultivujú v dvojlitrových guľatých bankách za prítomnosti 10 ng/ml PMA. Po 16 až 24 hodinách sa bunky odfiltrujú 3 pm filtrom Scalkleen (Pall Trinity Micro Corp. Cortland. N. Y. USA). Číry fíltrát sa testuje na aktivitu nádorového nekrotického faktora, vyčisti sa a charakterizuje. Týmto postupom sa získa asi 400 jednotiek nádorového nekrotického faktora na mililiter supernatantu kultivačného média.

Pre produkciu nádorového nekrotického faktora sa používajú tiež ľudské periférne krvné monocyty. Krv, z ktorej boli odstránené krvné doštičky, je možné dostať od amerického červeného kríža (Američan Red Gross, Boston, Ma., USA). Táto krv sa použije do 24 hodín od získania. Najskôr sa oddelia monocyty od erytrocytov odstreďovaním na Ficoll-Hypague gradientoch pri 1000 G počas 30 minút. Získané bunky sa premyjú trikrát soľným roztokom fosfátového pufŕa. Monocyty' od každého darcu boli oddelene kultivované v dvojlitrových guľatých bankách v bezsérovom médiu RPMI 1640 na bunkovú hustotu 2,5.10⁶ buniek na mililiter. Ku kultúre sa pridá 1 pg/ml stafylokokového enterotoxínu B(SEB) a 1 pg/ml rekombinantného tymozínu a-L Bunky sa potom inkubujú vo vlhkej atmosfére pri 37 °C s 10 % oxidu uhličitého. Po 24 až 72 hodinách, podľa typu donoru, sa bunkové supematanty izolujú a spracujú sa rovnakým spôsobom ako supematanty odvodené od bunkovej línie HL-60. Výťažky nádorového nekrotického faktora z kultúr PBL sa značne rôznia podľa použitého indukčného činidla. Ak sa k opísanému indukčnému systému pridá PMA, zvýši sa cytolytická účinnosť bunkových supematantov. Bunkové supematanty však obsahoval tak nádorový nekrotický faktor, ako aj lymfotoxín. Stanovenie nádorového nekrotického faktora alebo lymfotoxínu v zmesi nádorového nekrotického faktora a lymfotoxinu sa robí tak, že sa urobí test lýzie buniek testovanou vzorkou, ktorá bola predtým inkubovaná s králičou neutralizujúcou protilátkou na nádorový nekrotický faktor alebo lymfotoxín, pričom sa stanoví zvyšková aktivita v teste lýzie buniek L-929.

Príklad 3

Chromatografia na sklenených perličkách s regulovanou veľkosťou pórov.

Aktivita nádorového nekrotického faktora z bunkovej kultúry sa po dávkach adsorbuje na sklenených perličkách s regulovanou veľkosťou pórov (č. katalógu GPG 00350, Electro-Nucleonics, Fairfield, NJ, USA) ekvilibrovaným pufrom s 10 mM fosforečnanom sodným, pH 8,0 za stáleho miešania pri teplote 4 °C. Na 5 litrov média sa použije 100 ml sklenených perličiek. Po jednohodinovom miešaní sa perličky nechajú usadiť a supematant sa dekantuje. Za teploty miestnosti sa potom perličkami naplní kolóna (5 x 50 cm). Kolóna sa premyje pufrom lOmM fosforečnanu sodného, pH 8,0, ktorý obsahuje IM chlorid sodný. Aktivita nádorového nekrotického faktora sa zo sklenených perličiek eluuje 20 % etylénglykolom v pufre 10 nM fosforečnanu sodného, pH 8,0, ktorý obsahuje IM chlorid sodný. Elučný profil supernatantu HL-60 z kolóny je uvedený na obrázku 1.

Príklad 4

Chromatografia na DEAE celulóze

Eluát z príkladu 3 sa priamo aplikuje na kolónu veľkosti 2,5 x 20 cm s DEAE celulózou 53 (Whatman) ekvilibrovaňou 10 mM pufrom fosforečnanu sodného, pH 8,0 a 0,01 % Tweenu 20 pri prietoku približne 50 ml/hodinu Prietok sa upraví na 100 ml/h. Na kolónu sa nanesie 1,080 ml vzorky so 4,2.10⁶ jednotiek nádorového nekrotického faktora pri 4 °C. Kolóna sa premyje ekvilibračným pufrom a eluuje sa stupňovým gradientom 75 mM, 150 mM a 500 mM chloridu sodného v 10 mM fosforečnanovom pufre, pH 8,0. Zisťuje sa absorbancia eluátu pri 280 nm a účinnosť nádorového nekrotického faktora ako funkcie eluovaných frakcií. Výsledky sú uvedené na obrázku 2.

Príklad 5

Rýchla proteínová kvapalinová chromatografia

Frakcie s aktivitou nádorového nekrotického faktora z príkladu 4 sa zahustia a dialyzujú sa proti 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 obsahujúci 0,01% Tween 20 a 1 mM azid sodný (pufer A) v bunke Amicon s membránou YM-10 alebo s inou dialyzačnou membránou s molekulovými hmotnosťami nižšími ako je molekulová hmotnosť nádorového nekrotického faktora. Membrána sa premyje dvakrát pufrom A. Kolóna s perličkami Sepharosy, ktorá je substituovaná kvartérnou amóniovou skupinou (perličky s veľkosťou 9,8 pm, kolóna 5 x 0,5 cm, (predáva sa pod označením Mono Q resin firmou Pharmacia), v jednotke rýchlej proteínovej kvapalinovej chromatografie (FPLC, fy. Pharmacia) s gradientovým programátorom (GP-250) a dvoma pumpami (P-500) sa najskôr ekvilibruje dialyzačnými puf rami cez superslučku pri prietoku 1 ml/min., ako je opísané J. Richeym v Američan Laboratory, strana 1, október 1982. Kolóna sa naplní spojenými premývacimi podielmi s dialyzačným koncentrátom. Kolóna sa premyje pufrom A. Potom sa kolóna eluuje lineárnym gradientom 40 až 75 mM chloridu sodného v pufre A. Lineárny gradient bol naprogramovaný nasledujúcim spôsobom. 0 až 5 minút, ekvilibračný pufor; 5,1 až 15 minút, 25 mM chlorid sodný, 15,1 až 25 minút; 40 mM chlorid sodný, 25 až 60 minút; 75 mM chlorid sodný, 65,1 až 70 minút; 100 mM chlorid sodný, 70 až 80 minút; lineárny gradient 100 až 1000 mM chloridu sodného, 80 až 90 minút; lOOrmM chlorid sodný 90,1 až 110 minút, ekvilibračný pufor. Eluát sa odoberá vo frakciách po dvoch mililitroch. Zisťuje sa absorbancia eluátu pri 280 nm, jeho vodivosť a účinnosť nádorového nekrotického faktora. Výsledky sú uvedené na obrázku 3.

Príklad 6

Chromatofokusácia

Chromatofokusácia sa robí na kolóne Pharmacia Mono P s veľkosťou 20 x 0,5 cm systémom FPLC ako v príklade 5. Biologicky aktívna frakcia (pokiaľ ide o nádorový nekrotický faktor), ktorá eluuje ako frakcia 37 až 45 v príklade 5, sa skoncentruje a dialyzuje na bunke ,Amicon stir celí“ s membránou YM-10 proti kolóne ekvilibračného pufra, t. j. 0.025M bis-Tris HC1, pH 6,7. Vzorka sa nanesie na kolónu Mono P pri teplote miestnosti cez superslučku pri prietoku jeden mililiter za minútu. Kolóna sa premýva ekvilibračným pufrom pokiaľ sa absorbancia pri 280 nm nevráti na základnú hodnotu. Potom sa eluuje lineárnym gradientom pH (kolóna sa premýva 7,5 % polypufrom 74 pri pH 4,7 (Pharmacia)). Odoberajú sa frakcie po 1 ml a meria sa ich absorbancia pri 280 nm a pH. Výsledky sú uvedené na obrázku 4. Ako je vidno z obrázka 4, izoelektrický bod nádorového nekrotického faktora je asi 5,3.

Príklad 7

Preparativna SDS elektroforéza na polyakrylamidovom géli Modifikáciou postupu podľa U. Laemmliho: Náture 227, 680 až 685 (1970) sa pripravia 15 % polyakrylamidové gély (11 x 16 cm) o hrúbke 1,5 až 3,0 mm. Deliace aj vrstvené gély obsahovali 0,1% SDS a 0,05 % Tween 20. Ďalšie pufry a koncentrácia skríženého naviazaného činidla boli rovnaké ako pri analytických SDS-PAGE géloch. Frakcie s aktivitou nádorového nekrotického faktora z príkladu 5 alebo 6 sa spoja, skoncentrujú a dialyzujú proti 6,25 M tris-HCI, pH 7,0, obsahujúce 0,005 % SDS na bunke „Amicon stir celí“ s membránou YM-10. Po odstránení dialyzovaného koncentrátu sa membrána premyje trikrát malým množstvom vzorky pufra (0,2 % SDS, 0,02 % Tween 20, 30 % glycerol, 0,03 M Tris HC1, pH 6,8, 0,005 stopové farbivo). Dialyzovaný koncentrát a premyté podiely sa spoja. Celkový objem je 1 až 4 ml. Na dosiahnutie SDS PAGE redukujúcich podmienok sa prípadne pridá merkaptoetanol a vzorka sa nanesie do veľkej jamky vo vrstvenom géli. Malé jamky priľahlé k jamke so vzorkou sa použijú pre označenie rôznych molekulových hmotností pomocou fosforylázy a (94 000) hovädzieho sérumalbumínu (67 000), ovoalbumínu (43 000), uhličitanovej anhydrázy (30 000), inhibítora trypsínu zo sójových bôbov (20 000) a lyzozómu (14 000). Elektroforéza gélov sa uskutočňovala vo vertikálnom elektroforetickom systéme Biorad ochladenom na 12 °C za konštantného prúdu 20 mM na mm hrúbky gélu pokiaľ farbivo nedosiahlo koniec gélu.

Po elektroforczc sa jedna zo sklenených dosiek odstráni z gélu. Zaznamená sa poloha vzorky s danou molekulovou hmotnosťou. Pás, ktorý obsahuje aplikovanú vzorku ná dorového nekrotického faktora, sa potom rozreže na 0,25 cm sekcie podľa molekulových hmotností tak, ako sa zadali proteíny, ktoré boli použité ako vzorky. Tieto pásky gélu sa potom umiestnia do polypropylénových trubíc, ktoré obsahujú 1 až 2 ml 10 mM hydrogénuhličitanu amónneho a 0,01 % Twccn 20, pH 8, a nechajú sa eluovať 16 hodín pri teplote 4 °C. Tieto eluáty sa potom testujú na účinnosť nádorového nekrotického faktora. Výsledky sú uvedené na obrázku 5. Molekulová hmotnosť nádorového nekrotického faktora na SDS géli bola asi 17 000 za redukujúcich aneredukujúcich podmienok, čo naznačuje, žc ide o molekulu s jednoduchým reťazcom.

Proteín bez solí a bez látok s nízkou molekulovou hmotnosťou sa izoluje z eluátu páskov gélu nasledujúcim postupom. Pripravia sa malé kolóny, ktoré obsahujú 0,2 ml živice Scp-pak C18, ktorá bola predtým premytá acetonitrilom, 1-propanolom, 1 % kyselinou trifluóroctovou (TFA) a destilovanou vodou. Potom sa ekvilibruje 10 mM hydrogénuhličitanom amónnym obsahujúcim 0,01 % Tween 80, pH 8,0. Eluát z gélu sa nanesie na kolónu. Eluát z kolóny sa spojí. Živica sa potom premyje približne 5 ml destilovanej vody a 5 ml 0,1 % kyseliny trifluóroctovej, čím sa odstránia voľné aminokyseliny a soli pufra. Nádorový nekrotický faktor sa zo živice eluuje 1 ml 50 % 1-propanolu v 0,1 % kyseline trifluóroctovej. Živica sa potom eluuje ďalším 1 ml 50 % 1-propanolu v 1 % kyseline trifluóroctovej, proteín sa však obyčajne eluuje už prvým pufrom. V tomto stupni dochádza približne k 80 % inaktivácii bioaktivity nádorového nekrotického faktora. Aj keď takto získaný nádorový nekrotický faktor sa môže použiť pre sekvenčnú analýzu, je výhodné použiť na tento účel eluent z HPLC opísanej v príklade 8.

Príklad 8

Vysokotlaková kvapalinová chromatografia

Molekulová hmotnosť prírodného nádorového nekrotického faktora sa stanoví vysokotlakovou gélovou chromatografiou. Chromatografia sa robí pri teplote miestnosti na HPLC kolóne (AUtech Associates, Deerfield, II.,USA) s veľkosťou 7,5 x 60 mm s gélom TSK 62000 SW. Jeden mililiter vzorky vyčistenej podľa príkladu 5, ktorý obsahuje približne 1 pg proteínu a 15 600 jednotiek aktivity sa izokraticky eluuje z kolóny s gélom pufrom (0,2M fosforečnan sodný, pH 7,0) pri prietoku 0,5 ml/minútu. Kolóna sa kalibruje hovädzím sérumalbumínom (molekulová hmotnosť 66 000), ovalbuminom (molekulová hmotnosť 45 000), hovädzou uhličitanovou anhydrázou B (molekulová hmotnosť 29 000) a lyzozómom (molekulová hmotnosť 14 300). Odoberajú sa jednomililitrové frakcie, ktoré sa testujú na aktivitu nádorového nekrotického faktora, eluujú sa v rozsahu molekulových hmotností 45 000 ± 6000 (pozri obrázok 6).

Príklad 9

HPLC na obrátených fázach

Nádorový nekrotický faktor sa čistí taktiež HPLC na obrátených fázach na kolónach C4 Synchropak na chromatografickom systéme Water Associates, Inc. ako je už opísané (W. Kohr a spol.: Anál. Biochem. 122, 348 až 359 (1982)). Maximum proteínov bolo zistene pri 210 nm a pri 280 nm po elúcii lineárnym gradientom 1 až 23 % (objemové percentá) 1-propanol v 0,1% vodnej kyseline trifluóroctovej počas prvých 15 minút a s 23 až 30 % 1-propanolu v 0,1 % vodnej kyselina trifluóroctovej počas ďalších 15 minút pri prietoku jeden mililiter za minútu. Testuje sa cytolytické aktivita maxím. Vplyvom organických rozpúšťadiel, ktoré sa používajú pri elúcii nádorového nekrotického faktora z kolóny C4, sa aktivita nádorového nekro tického faktora znížila o asi 80 %. Nádorový nekrotický faktor, ktorý bol vyčistený podľa tohto spôsobu, sa vysuší vo vákuu a portom sa podrobí aminokyselinovej analýze a sekvenovaniu. Výsledky sú uvedené na obrázku 7. Obrázok ukazuje, že nádorový nekrotický faktor, ktorý sa získa z eluentu z príkladu 5, obsahuje biologicky neaktívne proteínové prísady, ktoré sa eluujú s retenčnými časmi asi 16 až 19 minút. Podľa kritéria aminoterminálnej sekvencie je bioaktívny eluent z C4-RP-HPLC v podstate homogénny.

Príklad 10

Určenie čiastočnej sekvencie aminokyselín nádorového nekrotického faktora

Nádorový nekrotický faktor sa štiepi trypsínom nasledujúcim spôsobom. Homogénny nádorový faktor z príkladu 9 sa rozpustí, vysuší a znova rozpustí v pufri (100 mM hydrogénuhličitan amónny, pH 8,0) obsahujúcim 5 hmotn. % trypsínu TPCK (Worthington Biochemicals), 1 mM CaCl₂ a 0,1 % Tween 20. Pomer enzýmu k substrátu je 1 : 20, inkubácia prebieha 6 hodín pri 37 °C. Reakčná zmes sa rozdelí na peptidové fragmenty na C4 HPLC. Výsledky sú uvedené na obrázku 8. Pozoruje sa celkom 9 fragmentov. Fragmenty 2 a 2 sa eluujú spoločne ako maximum, ktoré je na obrázku označené T2. Predpokladá sa, že ďalších 10 fragmentov sa kolónou nezadrží. Sekvencie aminokyselín neporušeného nádorového nekrotického faktora z príkladov 8 a 9 a fragmenty hydrolýzy trypsínom v tomto príklade sa stanovia automatickou sekvenčnou Edmanovou degradáciou modifikovaným prístrojom Beckamm sequencer model 890B opatreným vymrazovačom. Ako nosič v tégliku sa používa polybren (1,25 mg). Podľa zloženia aminokyselín neporušenej molekuly je molekulová hmotnosť neporušeného nádorového ľaktora 17 000. Toto číslo je súhlasné s údajmi SDS-PAGE a potvrdzuje neprítomnosť glykozylácie.

Príklad 11

Synergické pôsobenie nádorového nekrotického faktora a τ-interferónu

Na mikrotitrovaciu dosku sa vysejú bunky myšacieho melanómu B16 (Mason Research, Worcester, Ma., USA), bunková línia pôvodu C57B1/6, v množstve 5 000 buniek na jamku a inkubujú sa 4 hodiny pri teplote 37 °C vo vlhkom inkubátore s 5 % oxidu uhličitého pred pridaním lymfokínov. Nádorový nekrotický faktor, získaný podľa príkladu 1, sa vyčistí HPLC v podstate do homogenity a jeho účinnosť sa kvantitatívne stanoví opísaným testom cytolýzy buniek L929, Podobne sa vyčistený rekombinantný myšací τ-interferón (P. Gray a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5842 až 5846 (1983)) testuje na protivírusovú účinnosť na EMC-infektovaných L-bunkách (D. Goeddcl a spol.: Náture (Londýn) 287, 411 až 416 (1980)). Myšací τ-interľerón a ľudský nádorový nekrotický faktor sa oddelene zriedia na zriedenia uvedené na obrázku 10. Do označených jamiek sa pridá najskôr gama interferón, potom sa ihneď pridá zriedený nádorový nekrotický faktor na konečný objem 0,2 ml na jamku. Po 72 hodinách inkubácie sa bunky zafarbia 0,5 % kryštálovou violeťou v 20 % metanole. Výsledky sú uvedené na obrázku 10. B16 je relatívne rezistentný ako na samotný nádorový nekrotický faktor INF-τ; v dávke 1000 jednotiek/ml nádorového nekrotického faktora nebola pozorovaná žiadna viditeľná cytolýza. Pridaním veľmi malých množstiev gama interferónu (takých malých ako je 5 jednotiek) však už nastala cytolýza.

Príklad 12 Izolácia mRNA

Celková RNA z kultúry buniek HL-60 (4 hodiny po PMA indukcii) alebo z periférnych krvných lymfocytov kultivovaných ako je opísané v príklade 2, sa extrahuje v podstate podľa Warda a spol.: J. Virol. 9, 61 (1972). Bunky sa odstreďovaním peletujú a potom sa resuspendujú v lOmM chloridu sodného, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a

1.5 mM chloridu horečnatom. Pridaním NP-40 na konečnú koncentráciu 1 % dôjde k lýzii buniek. Jadrá sa odstreďovaním peletujú. Supematant obsahuje celkovú RNA, ktorá sa ďalej vyčistí mnohonásobnou extrakciou fenolom a chloroformom. Vodná fáza sa upraví tak, aby bola 0,2M na chlorid sodný. Celková RNA sa vyzráža pridaním dvoch objemov etanolu. Z 1 g kultivovaných buniek je typický výťažok asi 6 mg celkovej RNA. Spôsobom podľa H. Aviva a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1403 až 1412 (1972) sa získa asi 100 pg polyadenylovanej mRNA na oligo/dT/celulóze.

Príklad 13 Bunka cDNA

Postupným pôsobením rezervnej transkriptázy, Klenowovho fragmentu DNA polymerázy a SI nukleázy so

7.5 pg poly/A/’ mRNA z príkladu 12 prevedie sa na dvojvláknovú cDNA (P. Gray a spol. Náture 295, 503 až 508 (1982), M. Wickers a spol.: J. Biol. Chem. 253, 2483 až 2495 (1978)). Z polyakrylamidového gélu sa izoluje 80 ng cDNA s dĺžkou väčšou ako 600 párov nukleotidov.

Na cDNA sa liguje syntetická DNA adaptorová sekvencia

5’ AATTCATGCGTTCTTACAG 3’

3’GTACGCAAGAATGTC 5’

Vytvorí sa kohezívny koniec EcoRI. Ako je obvyklé pre odborníkov, adaptor sa chemicky syntetizuje ako dve oddelené vlákna, 5’ koniec jedného z vlákien sa fosforyluje polynukleotid-kinázou a obidve vlákna sa anelujú. Z polyakrylamidového gélu sa potom znova izoluje cDNA (20 ng), ligáciou sa vloží do λ gt-10 rozštiepeného EcoRI, zabalí sa do fágových častíc a množí sa v E. coli kmeni C600 hfl (Huynh a spol.: „Practical Approaches in. Biochemistry“, IRL Press Ltd., Oxford, Anglia, 1984), alebo v inom známom kmeni, ktorý je vhodný pre množenie lambda fágov. Získa sa tak banka cDNA s asi 200 000 nezávislými kmeňmi.

Príklad 14

Príprava deoxynukleotidovej sondy pre cDNA nádorového nekrotického faktora

Na základe publikovanej frekvencie používaných kodónov (R. Grantahm a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 43 až 474 (1981)) výhodnosti ľudského IFN-τ (P. Gray a spol.: Náture 295, 503 až 508 (1982)) a ľudského lymfotoxínu bola zostavená hybridizačná sonda DNA so 42 nukleotidmi, založená na predbežnej sekvencií aminokyselín trypsínového peptidu TD-6 (E-T-P-E-G-A-E-K-P-W-Y-E-K) nádorového nekrotického faktora. Predbežná sekvencia má chybu (koncové K by malo byť P). Napriek tomu táto sekvencia vedie k úspešnej sonde. Syntetická sonda má sekvenciu 5’ dGAAACCCCTGAAGGGTGCCAACCCTGGTATGAAAAG 3’ a syntetizuje sa spôsobom podľa R. Grea a spol.: Nucl. Acids Res. 8, 2331 až 2348 (1980). Sonda sa fosforyluje pôsobením τ³²Ρ/ΑΤΡ a T4 polynukleotid kinázou opísaným spôsobom (Goeddel a spol.: Náture 281, 544 (1979)).

Príklad 15

Identifikácia cDNA klonu, ktorý obsahuje sekvencie kódujúce nádorový nekrotický faktor

Asi 200 000 rekombinantných fágov z banky gt 10 cDNA sa testuje DNA hybridzáciou s použitím ³²P-značeného 42-méru z príkladu 14 za nizkoselektívnych podmienok podľa A. Ullricha a spol.: EMBO J. 3, 361 až 364 (1984) (alebo taktiež. P. Gray a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5842 až 5846 (1983), S. Anderson a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6836 až 6842 (1983) a M. Jaze a spol.: Nucleic Acids Res. 11, 2325 až 2335 (1983)). Deväť rôznych klonov sa hybridizuje sondou a vyčistí sa cez jednotlivé plaky. Pomocou mRNA z neindukovaných buniek HL-60 sa pripraví cDNA značená ³²P. DNA zo siedmich z týchto deviatich klonov fágov sa nehybridizuje týmito „neindukovanými“ sondami. Sú preto považované za kandidátov sekvencií cDNA nádorového nekrotického faktora. Kloň cDNA, ktorý obsahuje najväčší inzert, sa označí λ 42-4, ktorý sa sekvenuje didoxy-spôsobom (A. Smith: Methods in Enzymology 65, 560 až 580 (1980) a F. Sangcr a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 až 5467 (1977)) po subklonovaní do vektora M13mp8 (J. Messing a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 309 až 321 (1981)).

Sekvencia cDNA získaná z λ 42-4 obsahuje úplnú kódovaciu oblasť maturovaného nádorového nekrotického faktora a časť jeho signálneho peptidu. Správna orientácia a čítacia oblasť DNA boli odvodené porovnaním so sekvenciou aminokyselín trypsínového peptidu T4 nádorového nekrotického faktora. Valinová skupina na amínovom konci nádorového nekrotického faktora je označená ako aminokyselina 1. V čítacej oblasti nasleduje 156 ďalších aminokyselín a terminačný kodón. Vypočítaná molekulová hmotnosť je 17 356.

Príklad 16

Identifikácia klonu cDNA obsahujúca sekvencie kódujúce úplný prenádorový nekrotický faktor

Kloň cDNA λ 42-4 obsahuje úplnú kódujúcu oblasť maturovaného nádorového nekrotického faktora, chýba tam však sekvencia kódujúca úplný signálny peptid, ako je zrejmé z toho, že chýba iniciačný kodón. Aby sa získala chýbajúca sekvenčná informácia, syntetizuje sa chemicky hexadekanukleotidový primer dTGGATGTTCGTCCTCC (doplnkový k nukleotidom 855 až 870, obrázok 10). Tento primér sa aneluje k mRNA z príkladu 12. Potom sa spôsobom podľa príkladu 13 syntetizuje cDNA. Spôsobom opísaným v príklade 13 sa pripraví v gtlO nová banka a asi 200 000 klonmi cDNA. Táto banka sa testuje hybridizačnou analýzou s použitím sondy λ 42-4 cDNA inzertu značeného ³²P. Získa sa 16 pozitívnych klonov. Najdlhší z týchto klonov, λ 16-4, obsahuje inzert cDNA, ktorý je na 5 strane dlhší o 337 párov nukleotidov ako inzert λ 42-4. Zloženie sekvencie cDNA inzertov nádorového nekrotického faktora λ 16-4 (nukleotidy 1 až 870) a λ 42-4 (nukleotidy 337 až 1643) je uvedené na obrázku 10.

Príklad 17

Konštrukcia expresného vektora pre priamu expresiu nádorového nekrotického faktora

Postup, ktorý bol použitý pre expresiu sekvencie cDNA nádorového nekrotického faktora získanej v príklade 15, je uvedený na obrázku 11. Fág λ 42-4 z príkladu 15, ktorý obsahuje kódujúcu sekvenciu úplného maturovaného nádorového nekrotického faktora a časť údajného sekrečného leadera nádorového nekrotického faktora, sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Izoluje sa fragment s približne 800 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje kódujúcu oblasť nádorového nekrotického faktora. Tento fragment sa rozštiepi pôsobením Ava I a Hind III. Izoluje sa fragment so 578 pármi nukleotidov, ktorý je na obrázku 11 označený „C“. Tento frag15 ment kóduje aminokyseliny 8 až 158 nádorového nekrotického faktora.

Pripravia sa dva syntetické deoxynukleotidy (na obrázku 11 označené ako fragment „B“, pozri konštrukcie sekvencie adaptoru v príklade 13), ktoré zahrnujú kohezivny koniec Xbal na 5’ konci a kohezivny koniec na 3 konci, iniciačný kodón met a kodóny prvých siedmich aminokyselín na amínovom konci nádorového nekrotického faktora. Kodóny týchto aminokyselín sa vyberú na základe výhodnosti pre E. coli. Sekvencia AATT proti smeru začiatočného kodónu sa vyberie tak, aby sa patrične umiestnil začiatočný kodón od trp ribozómovej väzbovej sekvencie a aby v kombinácií s kodónmi aminokyselín eliminovala potenciálnu slučku messenger RNA.

Trojnásobnou ligáciou sa potom segmenty B a C spoja s derivátom pBR322, ktorý obsahuje sekvenciu promótora s Shine-Dal-gamo sekvenciou trp lcadcr peptidu (európska patentová prihláška č. 36 776). Získa alebo navrhne sa derivát, ktorý medzi trp promótorom a Tet^R génom obsahuje jediné miesta Xbal a Hind III.

Vhodnými východiskovými vektormi tohto typu sú buď pLTtrpl (Gray a spol.: Náture 312, 721 až 724 (1984)), alebo ptrpETA (Gray a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2645 až 2649 (1984)), aj keď môžu byť z pBR322, trp promótora a akýchkoľvek žiaducich syntetických linkerov skonštruované aj iné vektory. Tak pBR322, ako aj plazmidy obsahujúce trp promótor sú verejne dostupné. Časť vybraného vektora pBR322 môže mať deletovaný segment Ava I - Pvu II od páru nukleotidu 1424 do 2065, čo je v názve plazmidov označené „XAP“. Hociktorý z predchádzajúcich plazmidov sa rozštiepi súčasným pôsobením Xba I a Hind III. Izoluje sa veľký vektorový fragment. Tento fragment sa spolu s fragmentmi B a C liguje T4 DNA ligázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli 294 (ATCC 31 446). Vyberú sa kolónie, ktoré sú rezistentné na ampicilín. Izoluje sa plazmidová DNA. Plazmidová DNA sa charakterizuje mapovaním reštrikčnými endonukleázami a sekvenovaním. Izoluje sa tak plazmid pTrpXAPTNF, ktorý obsahuje inzerty B a C.

Príklad 18

Expresia nádorového nekrotického faktora v E. coli

E. coli ATCC 31 446, ktorý bol transformovaný pTNFtrp, sa kultivuje v médiu M9, ktoré obsahuje 20 pg/ml ampicilínu. Kultúra sa nechá rásť do A₅₅o = 0,3. Pridá sa indolyloctová kyselina na konečnú koncentráciu 20 pg/ml a kultúra sa nechá rásť do A₅5_O = 1.10 ml buniek sa skoncentruje a resuspenduje v soľnom roztoku pufrovanom fosforečnanom. Bunky sa sonikujú. Sonikované bunky sa zriedia pre stanovenie nádorového nekrotického faktora podľa testu z príkladu 1. Získa sa tak približne 10⁵ jednotiek aktivity na mililiter kultúry. Táto účinnosť sa neutralizuje preinkubáciou s králičím protisérom z králikov imunizovaných proti ľudskému nádorovému nekrotickému faktoru.

Príklad 19

Expresia nádorového nekrotického faktora v E. coli

Tento spôsob je výhodnejší ako spôsob, ktorý je uvedený v príklade 18. Hostiteľom na použitie uvedených vektorov je výhodne nereverzibilný kmeň tonA E. coli. Takéto kmene sú rezistentné na bakteriofágy. Sú teda omnoho výhodnejšie pre kultiváciu vo veľkom meradle ako kmene divoké. Nasleduje opis vhodného spôsobu získania takýchto kmeňov. E. coli W3110 sa transdukuje λ :: TnlO, bakteriofágom λ, ktorý obsahuje transponovateľný element TnlO. Vznikne tak TnlO „hop pool“ E. coli W3110 (N. Klecker a spol.: J. Mol. Biol. 116,125(1977)).

E. coli W3U0 :: TnlO „hop pool“ sa kultivuje v kultivačnom médiu L pri teplote 37 °C do bunkovej hustoty asi 1.10⁹ v mililitri. Pol mililitra tejto kultúry sa odstredí, peleta sa suspenduje v 0,2 ml lyzátu λ phi80 (alebo TI), ktorý obsahuje 7,0.10⁹ jednotiek tvoriacich plak. Fág sa nechá adsorbovať 30 minút pri 37 °C. Táto suspenzia sa potom rozstrieka na dosky EMB s tetracyklínom: 15 pg/ml. Po inkubácii počas noci sa bledoružové kolónie prenesú do 3 ml kultivačného média L, nechajú sa Tásť počas noci pri 37 °C, dvakrát sa premyjú a resuspendujú sa v kultivačnom médiu L. Táto kultúra sa infektuje bakteriofágom PI kc a fágový lyzát sa izoluje (J. Miller: „Experiment in Molecular Biology“, Cold Sping Harbor Laboratory, strana 304, 1972).

E. coli AT 982 (č. 4546, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn., USA) sa týmto spôsobom účinkom lyzátu PI kc transdukuje na tetracyklínovú rezistenciu. Selekcia transformantov sa robí na doskách s kultivačným médiom L doplneným o tetracyklín (15 pg/ml) a dap (diaminopimelová kyselina, 40 pg/ml). Výsledné transduktanty sa testujú na tetracyklínovú rezistenciu a regeneráciu dap génu (dap⁺, tet^R). Transduktanty dap⁺, tet^R sa potom testujú na rezistenciu phiSO (alebo TI).

Z niekoľkých dap⁺, tet^R, phi80 (alebo TI) rezistentných kmeňov sa pripravia PI kc lyzáty. Tieto lyzáty sa použijú na transdukovanie E. coli W3110 na tetracyklínovú rezistenciu. Transduktanty sa testujú a vyberú sa tie, ktoré sú rezistentné naphi80 (alebo TI).

Z transduktantov W3110 fhuA:Tnl0- phi80R sa vyberú tie izoláty, ktoré sú citlivé na tetracyklín (S. Naloy a spoť: J. Bact. 145, 1110 (1981)). Po prečistení cez jednotlivé kolónie sa skontroluje rezistencia týchto izolátov na fág phi80 a citlivosť na tetracyklín.

Z niekoľkých mutantov, ktoré sú citlivé na tetracyklín a rezistentné na fág phi80, sa izoluje DNA. DNA sa rozštiepi pôsobením SstlI. DNA rozštiepená SstlI sa charakterizuje Southemovým blotovacím postupom s použitím rádioaktívne označenej a pôsobením SstlI rozštiepenej ::Tnl0 DNA ako sondy. Zistí sa tak, či došlo k excisii TnlO (R. Davis a spol. ,Advanced Bacterial Genetics“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980). Jeden z izolátov citlivých na tetracyklín má stratu dvoch TnlO hybridizačných pásov pri porovnaní s hybridizáciou DNA z :: TnlO a W3110 fhuA : : TnlO phi80R. Tretí hybridizačný pás má zmenenú pohyblivosť, čo znamená, že došlo k delécii spôsobenej nepresným resekovaním TnlO.

SDS-gélová elektroforéza vonkajšieho membránového preparátu z kmeňa s nepresným resekovaním TnlO ukázala, že pás, o ktorom sa predpokladá, že je proteín fhuA, má zmenenú elektroforetickú pohyblivosť pri porovnaní s divokým typom proteínu fhuA. Výsledný proteín nie je funkčný ako receptorový proteín fágu λ phi80. Druhý nezávislý kmeň, ktorý má taktiež nepresné resekovanie TnlO, nemá na géli SDA žiadny proteín fhuA.

Žiadny z týchto kmeňov nemá reverziu rezistencie na tetracyklín alebo citlivosť na λ phi80, čo ukazuje na existenciu nepresného resekovania celého alebo časti transpozónu TnlO spoločne s buď čiastočnou alebo úplnou deléciou génu fhuA. Jeden z takýchto kmeňov W3110 (NL106) sa výhodne používa ako hostiteľ pre tu opísané vektory kódujúce nekrotický nádorový faktor.

SK 279897 Β6

NL106 sa transformuje ptrpXAPTNF a naočkuje sa do 10 litrov média s pH 7,4 ktoré má nasledujúce zloženie, zložka gramov v litre

síran amónny	5,0
hydrogénfosforečnan draselný	6,0
dihydrogénfosforečnan sodný	3,0
citran sodný	1,0
L-tryptofán	0,2
NZ amín AS	4,0
kvasnicový extrakt	4,0
síran horečnatý	1,2
glukóza	25,0
zložka	obsah

roztok so stopovými prvkami (ióny Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B a Mn) 0,5 ml tetracyklín 1,0 mg

Ku kultúre sa pridáva glukóza rýchlosťou lg/min., len čo A550 kultúry dosiahne asi 20. Fermetrácia sa robí pri 37 °C poklal A_S50 nedosiahne 136 (asi 20 hodín). Odstreďovaním kultúry sa získa bunková pasta. Potom sa táto pasta 30 minút extrahuje pri pH 8,0 a za teploty miestnosti pufrom, ktorý obsahuje 1000 nM tris, 10 mM ctyldiaminotetraoctovú kyselinu, 1000 mM chlorid sodný, 2000 nM močovinu a 0,1% β-merkaptoetanol. Extrakt sa zriedi a testuje ako je uvedené v príkladu 1. V tomto teste bolo zistené, že ekvivalent 1 mg nádorového nekrotického faktora je 1.10⁸ jednotiek aktivity nádorového nekrotického faktora. Z jedného litra kultúry sa získajú až asi 2 gramy nádorového nekrotického faktora. Sekvenovanie na amínovom konci ukazuje, že asi od 75 do 86 hmotnostných % je (maturovaný) nádorový nekrotický faktor s valylovou skupinou na amínovom konci, zvyšná časť je met-nádorový nekrotický faktor. Navyše, okrem vysokých hladín expresie, proteín nie je prítomný v refraktilných telesách ani nie je toxický pre bunky, ako bolo preukázané získanými extrémne vysokými bunkovými hustotami.

Príklad 20

Konštrukcia a expresia génu mutantného nádorového nekrotického faktora

V tomto príklade sa opakujú príklady 17 až 18 s tým, že oligonukleotidový fragment B sa syntetizuje s histidínovým kodónom CAT miesto arginínového 6 kodónu CGT. Expresuje sa mutantný nádorový nekrotický faktor.

Príklad 21

Konštrukcia a expresia iného génu mutantného nádorového nekrotického faktora

V tomto príklade sa opakuje postup z príkladov 17 až 18 s oligonukleotidovým fragmentom B kódujúcom leucín (CTT) namiesto zvyšku 2 arginínového kodónu. V prvých pokusoch sa získa asi 1200 mg aktivity maturovaného nádorového nekrotického faktora na liter kultúry. V kultúre nebol detekovaný neprocesovaný nádorový nekrotický faktor.

Príklad 22

Konštrukcia vektora kódujúceho spojenie nádorového nekrotického faktora so sekvenciou sekrečného signálu

Sekvenciu E. coli tepelne stabilného entorotoxínového génu AT11 opisuje Picken a spol.: Infection and Immunity 42(1), 269 až 275 (1983). V tomto príklade sa liguje fragment obsahujúci sekrečný signál STU a Shine-Dalgamo sekvencie po vlákne promótora E. coli alkalickej fosfatázy. Po signáli STII v smere 3' nasleduje syntetický oligonukle otid, ktorý obsahuje kodóny iniciačných siedmich aminokyselín nádorového nekrotického faktora na amínovom konci a zvyšok kódujúcej sekvencie nádorového nekrotického faktora. Všetky predchádzajúce časti sa umiestnia do vektora pBR322.

Plazmid pWM501 (Picken s spol.: Infection and Immunity 42(1), 269 až 275 (1983)) obsahuje gén STII. pWM501 sa rozštiepi pôsobením Xbal a Nsil. Izoluje sa fragment s približne 90 pármi nukleotidov. Tento fragment by sa mohol syntetizovať taktiež organicky spôsobmi známymi odborníkom (fragment A).

Plazmid pBR322-Trp, ktorý je opísaný v príklade 17 (p20kLT), sa rozštiepi pôsobením Xbal a HindlII. Izoluje sa veľký vektorový fragment (fragment B). Tento fragment obsahuje začiatok replikácie E. coli a gén prepožičiavajúci fenotypu ampicilínovú rezistenciu.

Syntetický oligonukleotid sa syntetizuje ako dve vlákna. Apeláciou sa získa nasledujúca štruktúra (sú uvedené taktiež prečnievajúce konce reštrikčných miest a aminokyseliny kódované oligonukleotidmi).

VAL ARG SER SER SER ARG THR ’ GRA CGT TCT TCT TCT CGT ACT 3 ’

ACGT CAT ACG AGA AGA AGA GCA TGA GGCT

Nsil Aval

Táto štruktúraje označená ako fragment C.

Plazmid pTNFtrp z príkladu 18 sa rozštiepi pôsobením Aval a HindlII. Izoluje sa fragment Aval - HindlII (fragment D) s 578 pármi nukleotidov. Tento fragment obsahuje všetky kódujúce sekvencie nádorového nekrotického faktora okrem siedmich aminokyselín.

Sekvencia DNA, ktorá obsahuje promótor E. coli alkalickej fosfatázy (AP) napojený na heterolognú Shine-Dalgamo (S. D) sekvenciu (trp) a ktorá má konce EcoRI a Xbal, sa skonštruuje nasledujúcim spôsobom. Fragment DNA, ktorý obsahuje časť promótora AP, sa izoluje z plazmidu pHI-1 (H. Inouye a spol.: J. Bacteriol. 146, 668 až 675 (1981)), aj keď je možné použiť akékoľvek príslušné zdroje obsahujúce promótor AP DNA. Plazmid pHI-1 sa rozštiepi pôsobením Hpal za vzniku otvoreného plazmidu. Syntetický EcoRI linker GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG sa liguje s plazmidom.

Naviazaný plazmid sa rozštiepi nadbytkom EcoRI a nedostatkom Rsal, čím sa rozštiepia všetky miesta EcoRI a časť miest Rsal. Tieto dva stupne, t. j. štiepenie pôsobením EcoRI a pôsobením Rsal je lepšie vykonať postupne ako súčasne. Z tohto EcoRI-Rsal štiepenia sa izoluje fragment so 420 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje promótor AP.

Sekvencia trp S. D. sa získa nasledujúcim spôsobom. Plazmid alebo organizmus, ktorý obsahuje trp promótor (pIFN-beta 2, D. Leung a spol.: Biotechnology 2, 458 až 464 (1984)), sa rozštiepi pôsobením Xbal a Rsal. Izoluje sa fragment s 30 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje trp S. D. sekvenciu. Tento fragment sa liguje s promótorovým fragmentom AP so 420 pármi nukleotidov. Získa sa fragment E (fragment EcoRI-Xbal) so 450 pármi nukleotidov. Fragment E má sekvenciu nukleotidov:

EcoRI

CAATTCAAOTtcicaATÁCTTTaaiiuaajiuuaAuaxiaxiLUTaTOÁTTocT

GAGTTGT'IATTTAAGCTTGCCCAAAAAOAAQAAGAGTCOAAAGAAOTGGTGCGGXGGT

ACAACCTTTGaAGAMATOGTOAOÍTeAATGCMCMUÍATGaCaGAAAATGACCAA cAGCccTTaATTCATCAaaTAaAaasaaaocTaiAcaAaaTAAAaeccaATaccAaoA TTCCTGACGACOATACGGAOaTtJCTQCQCOATTACQTAAAOAAartATTQAAOCATCC TCGTCAaTAAAAAGTTAATCTTTTGAACAGTOrOATAAAOTTOTOAOGGGOGAOACTT ATAGTCGCMTGTTIlT*MTTWAATaiATTTGTAC<>CAAGMOA®ltAAA AAGGGTATCTAGA trpS.D. Xbal

Fragmenty A, B, C a D sa ligujú štvorstupňovou ligáciou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli 294. Transformanty sa identifikujú kultiváciou na doskách LB obsahujúcich ampicilín. Z kolónie transformantov sa izoluje plazmid trpSTIITNF. Tento plazmid sa rozštiepi pôsobením Xbal a EcoRI. Odstráni sa tak trp promótor. Zvyšok plazmidu sa liguje s fragmentom E (fragment EcoRI-Xbal) so 450 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje E. coli promótor alkalickej fostatázy. Výsledný plazmid sa nazýva pAPAS-TIITNF.

Príklad 23

Expresia a spôsob napojenia nádorového nekrotického faktora so sekvenciou sekrečného signálu

E. coli sa transfektuje plazmidom pAPSTIITNF a potom sa naočkuje do 10 litrov média (pH 7,0) s nasledujúcim zložením: zložky gramov na liter síran amónny5,0 hydrogénfosforečnan draselný2,6 dihydrogénfosforečnan sodný1,3 citran sodný1,0 chlorid draselný1,5

NZ amín AS5,0 kvasnicový extrakt2,0 síran horečnatý1,2 glukóza25,0 roztok so stopovými prvkami (ióny Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B a Mn) 0,5 ml ampicilín 20,0mg

Kultivácia sa robí rovnakým spôsobom ako je opísané v príklade 19 až na to, že sa kultivácia robí pokiaľ A_55O nedosiahne 140. V tomto okamihu obsahuje kultúra asi 400 mg nádorového nekrotického faktora v jednom litri kultúry. Podľa elektroforézy na géloch sa asi 70 až 80 hmotn. % tohto množstva získa ako maturovaný proteín. Extrakciou buniek spôsobom podľa príkladu 19 (využitím osmotického šoku buniek) sa získa približne tá istá aktivita nádorového nekrotického faktora ako pri extrakcii celých buniek.

Príklad 24

Konštrukcia a expresia derivátov nádorového nekrotického faktora

Mutantné deriváty sekvencie aminokyselín nádorového nekrotického faktora na obrázku 10 sa pripravujú tak, aby uspokojili aspoň jeden alebo viac z nasledujúcich požiadaviek: zvýšenie cytolytickej účinnosti, zvýšenie čistej diferenčnej cytolytickej účinnosti na nádorové bunky versus normálne bunky, príprava imunogénov nádorového nekrotického faktora na získanie protilátok proti nádorovému nekrotickému faktom pre diagnostické použitie, príprava unikátnych miest pre kovalentnú modifikáciu (napríklad vtedy, keď enzýmové označenia sú kovalentne naviazané pri príprave diagnostických činidiel EMIT alebo ELISA) a zmena fyzikálnych vlastností nádorového nekrotického faktora, napr. jeho pohyblivosti, pi a podobných. Stanovenie žiadanej účinnosti vybraných derivátov sa robí rutinným testovaním vhodnými testami známymi odborníkom.

Nádorový nekrotický faktor a jeho deriváty výhodne nezahrnujú tie nádorové nekrotické faktory, ktorých sekvencie zodpovedajú sekvenciám neprimátov. Nádorový nekrotický faktor a jeho deriváty výhodne nemajú ani amínový koniec nádorového nekrotického faktora neprimátov, napr. amínový koniec desValArg, ktorý je charakteristický pre králičí nádorový nekrotický faktor, ani amínový koniec génu nádorového nekrotického faktora, ktorý má sekvenciu Val-Arg-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-Ser-Val-Ala-Asn-Pro-Aln-Ala-Glu-Gly- (Wang a spol.: Science 228,149 až 154(1985)).

Nasledujúci spôsob je všeobecne aplikovateľný (podľa J. Adelmana a spol.: DNA 2(3), 183 až 193) na konštrukciu a expresiu sekvencií DNA akéhokoľvek mutantného nádorového nekrotického faktora, ktoré obsahujú tiché mutácie alebo ktoré kódujú mutantný nádorový nekrotický faktor. Na ilustráciu sú tu uvedené reprezentatívne deriváty: Arg 32 je zmenený na histidylovú skupinu (substitúcia), His 73 je vynechaný (delečná mutácia) a na Leu 157 je napojená leucylová skupina (došlo teda k inzercii). Tomu je však nutné rozumieť tak, že rovnakým spôsobom sa získavajú ďalšie typy mutantov.

Odborníkom sú známe ďalšie spôsoby, ktoré sú vhodné na tvorbu tichých alebo expresovaných mutácií v DNA kódujúcej nádorový nekrotický faktor. Napríklad, mutantná DNA sa skonštruuje tak, že sa jednoducho chemicky syntetizuje úplná sekvencia alebo sa syntetizuje časť sekvencie a fragment sa liguje so zvyškom DNA. Chemická syntéza DNA je výhodná vtedy, ak si odborník želá pripraviť mutant priamo bez získania DNA kódujúcej nádorový nekrotický faktor z nádorových zdrojov. Obyčajne však východisková DNA kóduje prírodnú sekvenciu aminokyselín, vrátane ich alelických variantov. Je potom žiaduce pripraviť z nich isté mutantné deriváty.

Pri príprave DNA kódujúcej mutantné deriváty nádorového nekrotického faktora je žiaduce, aby nedošlo k zmenám kodónov, ktoré by umožnili, aby mRNA z nich transkribovaná tvorila silné štruktúry so spárovanými a nespárovanými oblasťami (stem and loop structure). Ak sa podarí vyhnúť týmto štruktúram, má to obyčajne za následok vyššie výťažky. Z rovnakého dôvodu by mali byť použité kodóny, ktoré sú výhodné pre hostiteľa transformantu.

Vhodnou východiskovou DNA je fragment EccRI-HindlII plazmidu pTrpXAPTNF (príklad 17). Tento fragment sa získa postupným štiepením pôsobením EcoRI a Hind III, po ktorom sa izoluje fragment obsahujúci gén THF. Tento fragment zahrnuje trp promótor a štruktúrny gén pre metionylový nádorový nekrotický faktor. Na získanie jednovláknovej kópie tohto génu vhodnej pre mutagenézu sa fragment EcoRI-Hind III klonuje do polylinkerového miesta fágu M13 mp8 RF-DNA (J. Messing a spol.: Gene 19, 269 až 276 (1982), „RF“ znamená replikatívnu formu fágu, tento fág je komerčne dostupný). Príslušný podiel rozštiepenej zmesi EcoRI-IhdlII sa pridá k iigačnej reakcii, ktorá obsahuje 10 ng Ml3 mp8 RF-DNA, ktorý bol vopred rozštiepený pôsobením EcoRI a HinlII. Po dvojhodinovej inkubácii pri teplote miestnosti sa ligačná zmes použije na transformáciu E. coli JM103 (komerčne dostupný kmeň: je možné použiť taktiež kmeň JM101). Transformované bunky sa vysejú na vrchný agar obsahujúci X-GAL (dibróm-dichlór-indolyl-galaktozid) a IPTG (izopropyltiogalaktozid). Na izoláciu Ml3 mp8/TNF RF-DNA minitestovacím postupom (Bimboim a Doly: Nucl. Acids Res. 7, 1513 až 1523 (1980)) sa použijú bakteriálne kultúry (jeden mililiter) infikované fágom získaným z bezfarebných plakov. Výsledný rekombinantný fág M13 mp8/TNF nesie kódujúce vlákno génu nádorového nekrotického faktora.

Pre miestne riadenú mutagenézu sa syntetizujú oligodeoxyribunukleotidy (mutagénne oligoméry) so sekvenciou doplňujúcou 15 báz na niektorej strane mutačného miesta, ako je ukázané v nasledujúcich diagramoch. V týchto diagramoch N znamená doplnkové bázy a M znamená nukleovú kyselinu, ktorá má byť vložená, vynechaná alebo sub stituovaná. Inzercia alebo delécia sa obyčajne robia v skupinách po 3. Tým sa udrží gén po zmene vlákna vo fáze.

Pre deléciu:	oligomér DNA	(N)15(N)I5
	vektor DNA	(N)is(M) (N)|5
Pre substitúciu:	oligomér DNA	(N)15(M), (N),s
	vektor DNA	(N)1s(M2) <N)1S
Pre inzerciu.	oligomér DNA	(N)i5(M) (N),,
	vektor DNA	(N)1S (N)15

M) znamená bázu alebo oligomér, ktorý nie je doplnkový k báze alebo oligoméru M₂. M! tu znamená žiadanú mutantnú sekvenciu. Obyčajne sa pripravujú také oligoméry, ktoré súčasne spôsobujú viac ako jeden typ mutácie.

Oligomérom s opačným zmyslom pre mutáciu Arg-his 32 je: p CAG GAG GGC ATT GGC ATG GCG GTT CAG CCA CTG-OH.

Oligomérom s opačným zmyslom pre deléciu His 73 je: p GTG GGT GAG GAG CAC GGT GGA GGG GCA GCC-OH.

Oligomérom s opačným zmyslom pre inzerciu Leu 158 je: p TGT TCG TCC TCC TCA AAG CAG GGC AAT GAT CCC-OH.

Tieto priméry sa syntetizujú konvenčnými spôsobmi. Na použitie pri mutagenéze sa 10 pmólov oligomérov alebo lac priméru 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’ fosforyluje 30 minút pri 37 °C v 10 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 10 mM chloridu horečnatého, 10 mM ditiotreitolu a 0,1 mM ATP obsahujúcich dve jednotky T4 polynukleotid kinázy. Na použitie ako sonda (pozri nižšie) sa 2 pmóly syntetických oligonukleotidov fosforylujú ako je uvedené až na to, že sa namiesto 0,1 mM ATP použije 1 μΜ τ-³²Ρ ATP (Amersham). Špecifická aktivita je bežne vyššia ako 5.10⁶ impulzov za minútu na pikomól oligonukleotidového reťazca.

Hybridizácia tak oligoméru, ako lac priméru na jednovláknové DNA z fágu Ml3 mp8/TNF nasledovaná zväčšením priméru vedie k tvorbe čiastočne heteroduplexných DNA, ktorých jedno vlákno obsahuje mutantnú DNA.

Pri čiastočnej tvorbe heteroduplexu sa jednovláknová M13 mp8 TNF DNA (300 ng) zahrieva na 80 °C (dve minúty), 50 °C (päť minút) a pri teplote miestnosti (päť minút) v 20 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA a 50 mM chloridu sodného obsahujúcich 1 pikomól fosforylovaného oligoméru alebo priméru (pridané ako rovnaké podiely z kinázovej reakcie). Zväčšenie priméru začína pridaním 30 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 12 mM chloridu horečnatého, lOmM ditiotreitolu, 0,7 mM dATP, 0,2 mM dGTP, 0,2M DTTP a 0,2 mM dCTP obsahujúcich 2 jednotky E. coli DNA polymerázy I, veľký fragment a 20 jednotiek T4 DNA ligázy. Po 30 minútach pri teplote miestnosti sa reakčná zmes inkubuje štyri hodiny pri 37 °C a potom pri 4 °C počas noci. Rovnaké podiely sa extrahujú fenolom. DNA sa vyzráža etanolom a rozpusti v 15 μΐ vody. DNA v týchto prípadoch sa použije na transformáciu E. coli JM103.

lac primer hybridizuje fág v mieste 5’ na oligomér. Predĺžením priméru sa stabilizuje heteroduplexová štruktúra. Oligomér a primér sa enzymaticky fosforylujú, čim umožnia spoju spojujúce reťazce DNA T4 DNA ligáze.

Fenolom extrahovaná duplexová DNA z podielu C (10 μΐ) sa pridá k 10 μΐ 0,06 M octanu sodného s pH 4,5, 0,6 M chloridu sodného a 0,6 mM chloridu zinočnatého obsahujúcich 200 jednotiek S, nukleázy. Po päťminútovej inkubácii pri 37 °C sa pridá 5 pg kvasnicovej tRNA. Extrakciou fenolom a vyzrážaním etanolom sa izolujú nukleové kyseliny. 30 ng jednovláknovej M13 mp8 DNA (asi 10 000 jednotiek tvoriacich plak) s použitím rovnakých S, podmienok poskytne menej ako 100 plakov v teste transformácie

DNA, pričom rovnaké množstvo RF-DNA si zachová viac ako 80 % svojich transformačných možností. DNA, na ktorú bolo pôsobené S,, sa použije na transformáciu E. coli JM103. Výsledný fág sa analyzuje in situ testovaním plakov.

Bakteriálne dosky (s priemerom 15 cm), ktoré obsahujú niekoľko sto plakov rekombinantného fága M13 sa testujú in situ hybridizáciou plakov (Benton a spol.: Science 196, 180 až 182 (1977)) na pôvodný i mutogénny genotyp pomocou príslušných značených oligomérov na oddelených súpravách filtrov (asi 10⁶ impulzov za minútu na filter). Hybridizácia sa robí počas noci pri 50 °C v 40 % formamide, 5 x SSC. Filtre sa premyjú pri 45 °C, 2 x SSC, 0,02 % dodecylsulfátom sodným, vysušia na vzduchu a exponujú na rontgenový film pri -70 °C s kontrastným filtrom.

Aby sa oddelila hybridizácia oligomérov k mutantnému DNA vláknu (úplný doplnok) od hybridizácie k východiskovej DNA je nutné zmeniť selektivitu hybridizačného procesu (zmenou koncentrácie SSC). Každý mutant má inú schopnosť hybridizácie podľa povahy a počtu substituovaných, vynechaných alebo vložených báz. Napríklad, ak sa má stanoviť mutácia jedinej bázy, teda mutácie malej, sú potrebné vysokoselektívne podmienky, aby sa mohla rozlíšiť mutovaná DNA od pôvodnej nemutovanej DNA. Napr. pri delécii kodónu alebo substitúcii 1 až 3 báz by mala hybridizovaná sonda byť menšia ako mutujúci sa oligomér. Takouto typickou sondou je sonda asi 14 až 20 báz. Úloha vyhľadávania mutantných delécii j c uľahčená tým, ak sa na testovanie straty sekvencie použije sonda, ktorá obsahuje alebo tvorí delegovanú sekvenciu. Ak táto sonda nehybridizuje DNA z vybraného plaku, je možné z toho vyvodiť, že došlo k žiadanej strate cieľovej sekvencie.

Vyberie sa plak, ktorý sa hybridizuje značeným oligomérom a naočkuje sa do E. coli JM103. Zo supernatantu sa pripraví jednovláknová (ss)DNA. Z bunkových peliet sa pripraví dvojvláknová (ds)DNA. ssDNA sa použije ako templát pre dideoxy-sekvenáciu klonu využitím doplnkových sekvencií M13 univerzálneho priméru alebo syntetického oligoméru v 3 ’ mieste mutovanej sekvencie DNA nádorového nekrotického faktora. Dideoxy-sekvenovanie potvrdzuje, že izolovaný plak obsahuje mutovanú DNA. Tento fág sa označí M13 mp8/TNFmtnt.

Fág M13 mp8/TNFmtnt sa rozštiepi pôsobením EcoRI a Hind III. Izoluje sa fragment, ktorý kóduje nádorový nekrotický faktor. Pôsobením EcoRI a Hind III sa rozštiepi pTrpXAPTNF. Izoluje sa vektorový fragment. Mutantný fragment sa potom liguje do vektorového fragmentu. Ligačná zmes sa transformuje E. coli W3110, NL106 alebo 294 (ATCC 31 446). Spôsobom podľa príkladov 18 alebo 19 sa izoluje mutantný nádorový nekrotický faktor. Ďalšie informácie, ktoré sa týkajú M13 mutácie, je možné získať z GB patentovej prihlášky 2 130 219A.

Mutanty, ktoré sa pripravujú podľa tohto spôsobu, sa delia do troch tried: substitúcie, delécie a inzercie. Delenie v týchto triedach je uvedené v nasledujúcej tabuľke. Pokiaľ nie je uvedené inak, ide o mutanty maturovaného nádorového nekrotického faktora z obrázka 10.

typ mutantu	miesto na nádorovom nekrotickom faktore	reprezentatívna modifikácia na označenom mieste
A. Substitúcie 1. Modifikácie, ktoré sa týkajú stupňa alebo povahy náboja
1.	arg 6	his
2.	lys 65	arg
3.	pro 20	arg
4.	asp 10	his
5.	glu 53	thr
6.	pln 47	asp

7.	asp 45	gin alebo asu
8.	asn 39	asp
9.	asn 34	gin
10.	leu 29	asp
11.	tyr 115	ile
12.	glu 116	lys
13.	pro 117	thr
14.	glu 127	fyr
15.	lys 128	his
16.	ala 134	tyr
17.	glu 135	lys
18.	tyr 141	pro
19.	asp 143	ser
20.	ala 145	thr
21.	glu 146	asn
22.	gin 149	lys
23.	leu 120	lys

typ mutantu miesto na nádorovom reprezentatívna nekrotickom faktore modifikácia na označenom mieste

II. Modifikácie, ktoré sa týkajú hydrofilného alebo hydrofóbneho charakteru

1.	leu 57	tyr
2.	ser 52	leu
3.	val 41	tyr
4.	gly 108	phe
5.	leu 120	thr
6.	ser 133	giy
7.	ala 134	thr
8.	gly 148	ser
9.	val 16	thr

III. Stérické modifikácie (zmeny v objemnosti vedľajšieho reťazca)

1.	leu 63	phe
2.	ser 52	tyr
3.	ile 58	leu
4.	gly 40	ile
5.	val 13	phe
6.	leu 120	phe
7.	ile 146	gly
8.	asn 137	glu
9.	ile 154	phe
10.	ile 155	gly
11.	phe 144	ile

B. Inzercie

1.	po leu 157	gly gly-COOH
2.	medzi Asp 10 a Lys 11	his
3.	medzi ile 58 a tyr 59	leu
4.	medzi Ser 60 a gin 61	lys
5.	medzi erg 31 a arg 32	ala
6.	medzi gly 121 gly 122	gly
7.	pred val 1	imunogénny
8.	po leu 157	polypeptid imunogénny
9.	medzi gin 149 a val 150	polypeptid giy giy
10.	medzi ala-1 a val prenádorového nekrotického faktora	lys arg

C. Delécie

1. Gly 149

2. lys 112

3. val 1 až arg 2

4. val 1 až pro 8

5. ala 22

6. arg 32

7. glu 53

8. ala 111 až 112

9. ala 123

10. ile 154

11. glu 127

D. Kombinácie

1. ile 58 leu leu 57 phe

2. gin 149 delécia tyr phe

3. lys 112 delécia glu 115lys

4. val 1thr ala 22lys gly 24asn ala 33asp

5. tyr 115phe glu 116lys

6. inzercia gly medzi gly 121 a gly 122 pridanie gly gly-COOH po leu 157

7. delécia val 1 až gly 66 a substitúcia

NH₂-Leu Ala Ile Ile Gly Phe Tyr Val Gin GlySer Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Asp Pro Arg AsnIle Glu Ala Ser leu arg Asp Gly Lys Glu LeuGln Phe Val Gly Gly Leu Tyr Íle Pro Glu TyrTrp Pro Lys Ala Glu Ala Gly Glu Pro Thr-

8. delécia ala 111 ala 109gin leu 120his

9. asn 19 gin asn 92 gin asn 137 gin

Za povšimnutie stoja mutácie, v ktorých sú miesta arg 2, arg 6 (pozri príklady 20 a 21), arg 32 a rag 131, kde dochádza k hydrolýze trypsínom, vynechané alebo pozmenené tak, že potom nie sú citlivé na trypsín. To by mohlo predĺžiť polčas života nádorového nekrotického faktora in vivo, pričom sa zníži možnosť fermentačného odštiepenia. Miesta arg 2 a arg 6 nie sú rozhodujúce pre biologickú účinnosť, pretože táto zostane zachovaná aj keď sa obidve tieto oblasti odstránia. Ale štiepením v miestach arg 32 a arg 131 sa účinnosť stratí. Preto je žiaduce, aby arg 32 a/alebo arg 131 boli substituované histidinylovou skupinou alebo, menej výhodné, skupinou gin. Tým sa odstráni alebo zníži vnímavosť miesta na enzým, ale zostane zachovaná bazicita postranného reťazca. Z rovnakého dôvodu sa arg 31 substituuje histidinylovou skupinou alebo, menej výhodne, glutamínom. Miesta, v ktorých dochádza k hydrolýze pôsobením enzýmu, sú vložené taktiež medzi napojenia polypeptidov a sekvenciou TNF, lebo takto sa získajú miesta, ktoré sú predurčené na uvoľnenie maturovaného alebo mutovaného nádorového nekrotického faktora. Alebo sú takými miestami substituované skupiny v leader sekvencii pre-nádorového nekrotického faktora. Predpokladá sa, že substitúcia asn za asp 45 a expresia v hostiteľskej bunke (napríklad kvasinkovej alebo cicavčej), ktorá je schopná glykozylácie, vedie ku glykozylovanému nádorovému nekrotickému faktoru.

Príklad 25

Expresia nádorového nekrotického faktora v kvasinkách za regulácie ADH promótorom

Podľa postupu opísaného λ' príklade 17 sa skonštruuje plazmid TrpXAPTNF až na to, že p20KLT alebo ptrpETA (alebo plazmid pBR322) sa rozštiepi skôr pôsobením EcoRI a Hind III ako Xba I a Hind III, a že sa syntetický fragment B pripraví skôr s EcoRI kohezívnym zakončením ako s Xba I kohezívnym zakončením. Ligačná zmes sa potom použije na transformáciu E. coli ATCC 31 446. Reštrikčnou analýzou sa identifikuje plazmid pTNFRI, ktorý obsahuje DNA kódujúcu nádorový nekrotický faktor naviazanú EcoRI miestami. Plazmid pTNFRI sa izoluje, rozštiepi sa pôsobením EcoRI a izoluje sa fragment T-l, ktorý obsahuje DNA nádorového nekrotického faktora.

Plazmid pFRPn (európsky patent č. 60 057A) sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Na zabránenie recirkulácie sa na rozštiepený plazmid pôsobí alkalickou fosfatázou, pomocou T4 DNA ligázy sa liguje na fragment TI nádorového nekrotického faktora. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli ATCC 31 446. Kolónie, ktoré sú rezistentné na ampicilín, poskytujú dve série plazmidov s opačnými orientáciami inzertu T-l, ako bolo stanovené reštrikčnou analýzou elektroforézou na agarózových géloch. Plazmidy z

E. coli transformantov sa vyčistia a použijú na transformáciu kvasiniek, ktoré majú trpí mutáciu (napríklad kvasinkový kmeň RH218, neobmedzene uložený v ATCC č. 44 076), na trp⁺ fenotyp. Bolo zistené, že plazmidy orientované tak, že začiatočný kodón segmentu T-l je umiestnený vedľa fragmentu promótora alkoholdehydrogenázy, transformujú kvasinky, ktoré potom expresiou poskytujú nádorový nekrotický faktor. Nádorový nekrotický faktor sa izoluje z extraktov kvasinkových transformantov. Stabilita plazmidu pri fermentáciách vo väčšom meradle sa zlepší tým, že sa používa expresný plazmid obsahujúci dvojmikrónový začiatok replikácie namiesto pFRPn chromozomálneho začiatku replikácic (ars 1) a že sa používa zlúčiteľný hostiteľský kmeň (J. Beggs. Náture 275, 104 až 109 (1978)).

Príklad 26

Expresia nádorového nekrotického faktora v cicavčích bunkách

Plazmid pEHER (európsky patent č. 117 060 A) sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Na rozštiepený plazmid sa pôsobí teľacou črevnou alkalickou fosfatázou a potom sa liguje do fragmentu T-l z príkladu 25. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli ATCC 31 446. Izolujú sa dva plazmidy (označené pEHERTHF I a pEHERTNF II), ktoré obsahujú DNA nádorového nekrotického faktora s opačnými orientáciami ako bolo stanovené reštrikčnou analýzou na polyakrylamidových géloch. Tieto plazmidy sa použijú na transfektovanie a selekciu buniek CHO DHFR-DUX-Bll.CHO 1 a Ltk’.

Bunky pletivovej kultúry sa transfektujú zmiešaním pripraveného 1 pg pEHERTNF I alebo pEHERTNF II s 10 pg krysej DNA v objeme 250 pl, 0,25M CaCl₂, potom sa prikvapká 250 pl pufrovaného soľného roztoku HEPES (280 nM chlorid sodný, 1,5 mM hydrogénfosforečnan sodný, 50 mM HEPES, pH 7,1). Po 30 minútach pri teplote miestnosti sa roztok pridá k bunkám pletivovej kultúry, ktoré sa kultivujú v 60mm plastických miskách pre pletivové kultúry. Používajú sa bunky CHO 1, CHO DHFR-DUXBll a Ltk’. Misky obsahujú 3 ml kultivačného média zodpovedajúce hostiteľskej bunke.

Pre bunky CHO1 a CHO DHFR-DUX-B11 sa ako médium použije médium Ham F-12 (Gibco) doplnené 10 % teľacieho séra, 100 pg/ml penicilínu, 100 pg/ml streptomy cínu a 2nM L-glutamínu. Pre bunkovú líniu Ltk’ sa použije Dulbecom modifikované Eaglové médium (DMEM) doplnené ako je uvedené.

Po 3 až 16 hodinách sa médium odstráni a bunky sa premyjú 20 % glycerolom v soľnom roztoku pufrovanom fosforečnanom. Na každú dosku sa pridá čerstvé médium a bunky sa inkubujú ďalšie dva dni.

Transfektované hostiteľské bunky sa vyberú trypsinizáciou bunky po 2 dňoch kultivácie (trypsinizácia znamená, že sa na bunky pôsobí 0,5 mg/ml sterilným trypsínom, ktorý obsahuje 0,2 mg/ml etyléndiaminotetraoctovej kyseliny). Asi 3.10⁵ buniek sa pridá k 10 mm doskám s pletivovou kultúrou so selektívnym médiom. Pre bunky DHFR’ sa pripraví médium (F-12 Gibco) bez glycínu, hypoxantínu a tymidínu (GHT’ médium). Pre hostiteľské bunky DHFR⁺ sa k normálnemu kultivačnému médiu pridáva metotrexát (100 až 1000 nM). Kontroly sa robia za transfekčných podmienok bez plazmidu alebo s plazmidom pFD-11 (európsky patent č. 117 060A), ktorý obsahuje normálnu DHFR. Kolónie, ktoré vzniknú z buniek expresujúcich DHFR plazmid, sú zrejmé počas 1 až 2 týždňov. Identifikujú sa transformanty, ktoré expresujú nádorový nekrotický faktor.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob izolácie ľudského nádoru nekrotizujúceho faktora (TNF) z heterogénnej zmesi s obsahom iných proteínov, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z týchto krokov:

   - aplikácia kompozície na najmenej jeden silikát, sklo s kontrolovanou veľkosťou pórov, alkyl seľarózu alebo častice živice s vlastnosťou aniónového meniča s jednotnou veľkosťou, na absorpciu ľudského TNF a

   - elúcia adsorbovaného ľudského TNF.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ľudský TNF je eluovaný etylénglykolom.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že anión meničovou živicou je kvartéma amino-substituovaná polystyrénová anión meničová živica.
4. 4. Ľudský TNF, ktorý

   a) nie je glykozylovaný,

   b) má molekulovú hmotnosť asi 17 000 stanovenú pomocou SDS-PAGE,

   c) je schopný prednostnej deštrukcie alebo zastavenia rastu nádorových buniek v porovnaní s normálnymi bunkami pri rovnakých podmienkach,

   d) je úplne homogénny podľa stanovenia SDS-PAGE,

   e) obsahuje

   i) poradie aminokyselín uvedené na obr. 10 alebo ii) poradie zvyškov aminokyselín 35 - 66 uvedené na obr. 10, alebo iii) poradie zvyškov aminokyselín 110-133 uvedené na obr. 10, alebo iv) poradie aminokyselín Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro,

   f) má špecifickú aktivitu vyššiu ako asi 10 miliónov jednotiek/mg proteínu,

   g) je purifikovaný na stupeň dostatočný na sekvenovanie intaktného TNF alebo na trypsínovú hydrolýzu jeho fragmentu pomocou Edmanovej degradácie v sekvenátori aminokyselín vybavenom studenými zachycovačmi a použitím polybrénového nosiča.
5. 5. Ľudský TNF podľa nároku 4, ktorý neobsahuje iné cytotoxické proteíny.
6. 6. Ľudský TNF podľa nároku 4, ktorý neobsahuje proteín patriaci medzi lymfotoxíny, α-globulíny, serín proteázy a interferón.
7. 7. Ľudský TNF podľa nároku 4, ktorý je v prímesi s fyziologicky prijateľným pufrom, aminokyselinovej alebo neiónovej povrchovo aktívnej látky alebo ich zmesi.
8. 8. Ľudský TNF podľa nároku 4, ktorý je lyofilizovaný.
9. 9. Zmes s obsahom ľudského TNF podľa nároku 4, ktorá obsahuje fyziologicky prijateľnú zložku z bunky nie ľudského pôvodu a TNF s poradím aminokyselín uvedených na obr. 10.
10. 10. Zmes podľa nároku 9, v ktorej fyziologicky prijateľnou zložkou je prokaryotický proteín.
11. 11. Zmes podľa nároku 9, ktorá je vlastne tvorená bunkou obsahujúcou heterológny ľudský TNF s poradím aminokyselín uvedených na obr. 10.
12. 12. Zmes podľa nároku 11, v ktorej bunkou je prokaryotická alebo nižšia eukaryotická bunka.
13. 13. Variant TNF podľa nároku 4, ktorý je schopný prednostnej deštrukcie alebo zastavenia rastu nádorových buniek v porovnaní s normálnymi bunkami pri rovnakých podmienkach, a ktorý obsahuje poradie aminokyselín 1 až 157 uvedených na obr. 10, ale na mieste lokalizovanom v polohe medzi 35 až 66, 110 až 133, alebo 150 až 157 zvyškov aminokyselín najmenej jedna z aminokyselín je substituovaná, vynechaná alebo vložená.
14. 14. DNA kódujúca TNF podľa nárokov 4 až 13 uvedená na obr. 10.
15. 15. DNA podľa nároku 14, kde táto DNA je syntetická.
16. 16. DNA podľa nároku 14 prítomná v replikovateľnom vektore.
17. 17. DNA podľa nároku 16, kde vektorom je plazmid alebo vírus.
18. 18. Bunka transformovaná s DNA podľa nároku 14 až 17.
19. 19. Farmaceutický prostriedok na liečenie nádorov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ľudský neglykozylovaný TNF podľa nároku 4 až 13 a ľudský interferón.
20. 20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že interferónom je gama-interferón.