PT85076B

PT85076B - Metodo para o tratamento de doencas infecciosas pela administracao de factor de necrose tumoral-alfa

Info

Publication number: PT85076B
Application number: PT85076A
Authority: PT
Inventors: Michael Angelo Palladino; Arthur J Ammann
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-06-16
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 1990-07-31
Also published as: AU598817B2; AU7422387A; JPS6354327A; DK302887D0; PT85076A; DK302887A; PH26613A; JPH07100662B2; NZ220686A; EP0250192A3; IL82862A0; EP0250192A2

Description

GENENTECH, INC.

MÉTODO PARA 0 TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS PELA ADMINISTRAÇÃO DE FACTOR DE NECROSE TUMORAL-ALFA

Este método de tratamento aplica-se nomeadamente a infeccoes, fúngicas e bacterianas e consiste, essencialmente, na administraçao de uma dose terapeuticameri te eficaz de factor de necrose tumoral a um paciente tendo tal doença.

As vias de administraçao preferidas sao a via intramuscular, intravenosa ou tópica.

Este pedido de patente é uma continuação em parte de U.S.S.N. 06/874 736 apresentado em 16 de Junho de 1986.

Fundamento presente invento está relacionado com o tratamento de infecçoes bacterianas e fúngicas. Em particular, o presente invento está relacionado com a utilização de citocinas em tal tratamento. Especificamente o invento relaciona-se em a utilização da citocina, factor de necrose tumoral-alfa (TNF-<X) como agente anti-infeccioso.

As infeccoes tratadas pelos agentes anti-infecciosos do presente invento sao as que ocorrem em consequência de um defeito nas células fagocitárias. Os fagócitos incluem monócitos, neutrófilos, polimorfonucleares, macrófagos e eosinófilos que normalmente fagocitam agentes patogénicos bacterianos ou fúngicos. 0 fagócito mata o micrci bio ingerido através de um mecanismo desconhecido que pode utilizar oxigénio conforme evidenciado por uma explosão res piratória. Em certas doenças os fagócitos sao capazes de re^ mover os agentes patogénicos do sangue e tecidos capturand£ -os mas sao incapazes de destruir os microorganismos fagocitados. Estes fagócitos nao assassinos hospedam microorganismos viáveis. A doença granulomatosa crónica (CGD) é um exemplo de um estado resultante de um defeito genético que dá origem a neutrófilos polimorfonucleares nao-assassinos. A doença granulomatosa crónica ocorre mais frequentemente em crianças mas é também observada em adultos. Os pacientes com doença granulomatosa crónica manifestam uma excessiva suscej) tibilidade a infecções. Hakansson, L. et al., Arch. Dis. Child, 55, 776 (1980). A doença granulomatosa crónica constjí tui um problema pediátrico importante e nao é senão um exem pio de tais doenças de fagocitos defeituosos. A marca do cojn traste de CGD é essencialmente uma ausência completa da expl. losao respiratória nos fagócitos que parecem ser normais em todos os outros aspectos. Os pacientes com CGD tem frequentes infecções graves e muitas vezes fatais nos seus nódulos linfáticos, fígado, ossos, pele e tracto respiratório.

A explosão respiratória evidencia a produção de radicais oxigénio. Este consumo de oxigénio crê-se ser necessário para produzir condiçoes óptimas para a morte da maior parte dos agentes patogénicos bacterianos e fúngicos. As células privadas de oxigénio fagocitam mas nao matam eficazmente alguns micróbios. Mandell, G.L., Infect. Immun. 9_, 337, 1974. As substâncias que podem estar associa das à morte do agente patogénico e que necessitam de oxigénio incluem superóxido, o radical hidroxilo, oxigénio singleto e peróxido de hidrogénio.

Uma substância designada factor de necrose tumoral (TNF) foi primeiro descrita quando se obser; vou que pacientes com regressão espontânea de cancro possuíam simultâneamente infecções bacterianas. 0 factor de necrose tumoral-alfa parece pertencer a uma família de proteínas que têm graves variáveis de semelhança no que respeita à actividade biológica e estrutura. 0 factor de necrose tumoral-beta (inicialmente designado linfotoxina) também por vezes designado cachetina é um exemplo de uma outra molécula presentemente conhecida incluida nesta família. Se bem que hou vesse especulação relativamente a um possível papel do fac tor de necrose tumoral-alfa em doenças infecciosas, testes numa série de. bactérias e fungos nao mostraram evidência pa_ ra uma sensibilidade directa ao factor de necrose tumoral-alfa. Revisto em Old, L.J., Science 230, 632 (1985). Mostrou-se que o factor de necrose tumoral alfa aumenta a aderência de neutrófilos humanos a monocamadas de células end£ teliais da veia umbilical humana. Gamble, J.R. et al., PNAS 82, 8667 (1985). Este aumento de aderência de PMN a células endoteliais foi considerado um elemento de efeito do factor de necrose tumoral na região de tumores. Supra na 8667. Interferao gama humano reconbinante (rHuIFN-Y) e factor de necrose tumoral-beta humano (nHuTNF-|3) provocaram um aumento in vitro da capacidade fagocitárica de PHN conforme nre dído pela capacidade de PMN em fagocitar esferas de latex. Shalaby, M.R., et al., ASBC/AAI (1984). Observou-se que o interferao gama humano e o factor de necrose tumoral-beta humano provocam um aumento da citotoxicidade celular dependente de anticorpos e mediada por PMN e também aumentam a produção de O^» Shalaby, M.R. et al., J. of Immunology, 135 (3), 2069 (1985). Verificou-se que o factor de necrose tumoral aumenta a morte de parasitas por eosinófilos humanos de um modo dependente da dose. Silberstein, D.S. and David, J.R., P.N.A.S. 83, 1055 (1986), presente invento baseia-se na nova observação de que o factor de necrose tumoral humano-alfa activa os neutrófilos polimorfonucleares (PMN). Encoii trou-se que o factor de necrose tumoral-alfa humano aumenta in vitro a capacidade fagocitária de PMN. 0 factor de necrose tumoral-alfa humano verificou-se ainda reverter in vitro a incapacidade de PMNs de pacientes macho com CGD li_ gado a X em gerar uma explosão respiratória.

Um objectivo do presente invento é proporcionar um agente terapêutico anti-infeccioso para as várias doenças infecciosas que necessitam da acçao fagocitária. Mais especificamente o factor de necrose tumoral-alfa humano pode ser usado como um agente anti-infeccioso em pacientes com váris infeccoes, tendo fagócitos normais.

Um outro objectivo deste invento é proporcionar um agente terapêutico anti-infeccioso para actA var células fagocitárias defectivas.

Sumário do invento presente invento baseia-se na nova observação de que o factor de necrose tumoral-alfa humano activa neutrófilos polimorfonucleares (PMN) normais e defectivos. Deste modo, num aspecto o invento é dirigido à administraçao de uma composição compreendendo factor de n£ crose tumoral-alfa humano como numa terapia anti-infecciosa em pacientes infectados possuindo fagócitos normais. Num outro aspecto a composição é administrada a pacientes com fagócitos deficientes para efectivar uma resposta anti-microbiana.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Activaçao de fagocitose em PMN pelo factor de necrose tumoral-alfa humano de dadores normais (A) e com CGD (B). 0 ensaio de fagocitose foi efectuado conforme descrito no Exemplo 1, Materiais e Métodos Gerais. A distribuição de células fagocitárias está ilustrado pelos perfis FACS. As curvas mais próximas do eixo do X representam autofluorescência de fundo e/ou células sem esferas ingeridas. Em (A) PMN normais não tratados (-); PMN normais tratados com o factor de necrose tumoral humano-alfa (—); e em (B): PMN de CGD nao tratados (-); PMN de CGD tratados com factor de necrose tumoral humano-alfa (—).

Descrição detalhada

Fagócitos incluindo neutrófilos polimorfonucleares (PMN), monócitos, macrófagos e eosinófilos desempenham um papel na eliminação de infeccoes derivadas de agentes patogénicos bacterianos e fúngicos. A participaçao de células fagocitárias nos mecanismos de defesa dos hospedeiros está bem estabelecida. PMNs podem exercer actividades celulares citotóxicas dependentes de anticorpos contra células de tumor e células infectadas por vírus. Dellegri, F.

et al.,

Immunology 48,

273 (1983).

PMNs também demonstram um processo invulgar na eliminação de agentes patogénicos.

PMNs ingerem primeiro o micróbio e depois matam o micróbio pelo consumo rápido de uma grande quantidade de oxigénio.

consumo de oxigénio é necessário para produzir condiçoes ój) timas para a morte da maior parte dos patogénios comuns ba£ terias e fungos. Os produtos metabólicos derivados do oxigénio têm sido implicados na morte microbiana. Babior, B.M.,

N. Engl. J. Med. 298, 659 (1978).

Em certas doenças os fagócitos sao capazes de ingerir os agentes patogénicos do sangue e tecidos mas sao incapazes de destruir os microorganismos fagocitados. Infecçoes tais como linfadenite, pneumonia, abcessos do fígado e celulite surgem em tais casos de fagócitos defectivos. Vários organismos foram cultivados a partir de lesões em tais condiçoes incluindo Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, E. coli, Serattia marcescens, Candida albicans e Aspergillus fumigatus. Os agentes patogénicos capturados e ingeridos pelos fagócitos que sejam incapazes de os matar ou por fagócitos defectivos ficam protegidos dos antibióticos. Portanto em tais pacientes os antibióticos sao de uso limitado. Este invento abrange o tratamento de infecçoes que envolvam microorganismos intracelulares. Mais particularmente o invento engloba o tratamento de paci^ entes infectados que tenham fagócitos normais. 0 invento é particularmente aplicável às infecçoes que surjam em pacien tes com fagócitos defectivos incluindo os que sofram de doença granulomatosa crónica.

Sao bem conhecidos o factor de necrose tumoral-alfa e seus métodos de preparaçao, incluindo recuperação em cultura de células recombinante. Pedido de Patente EP N⁹ 85304758.7. No âmbito do factor de necrose t_u moral-alfa estão incluídos factores de necrose tumoral-alfa de origem recombinante, natural ou sintética. Estão também incluídas variantes do factor de necrose tumoral-alfa tendo substituições e/ou deleçoes e/ou adições de aminoácidos, sais orgânicos e inorgânicos e derivados covalentemente modificados do factor de necrose tumoral-alfa.

Para usar no invento aqui tratado, o factor de necrose tumoral-alfa pode ser formulado para uma preparaçao injectável ou tópica. Conhecem-se formulações parentais e sao adequadas à utilização no invento, de preferência para administraçao i.m. ou i.v.. Estas formulações cortem quantidades terapêuticamente eficazes do factor de ne. crose tumoral-alfa, sao soluçoes líquidas, suspensões líquji das ou versões liofilizadas estéreis e facultativamente coii têm estabilizadores ou excipientes. Tipicamente, as composi^ çoes liofilizadas sao reconstituídas com diluentes adequados (e.g.) água para injeccao, soro fisiológico e similares num nivel de cerca de 0,001 mg/cm a 10 mg/cm em que a actividade biológica é cerca de 4 x 10? unidades/mg caforme medido em células fibroblásticas (L-M).

factor de necrose tumoral-alfa é formulado em preparações tópicas para terapia local através da inclusão de uma concentração terapêuticamente eficaz de factor de necrose tumoral-alfa num veículo dermatológico. A quantidade de factor de necrose tumoral-alfa a ser administrada e a concentração do factor de necrose tumoral-alfa nas formulações tópicas, dependerá do veículo seleccionado, do estado do paciente, da espécie de factor de necrose tumoral usada e da estabilidade do factor de necrose tumoral na formulação. Assim, o terapeuta empregará necessáriamente a preparaçao adequada contendo a concentração apropriada do factor de necrose tumoral-alfa na formulação, assim como a quantidade de formulação administrada dependendo da experiência clínica com o paciente em questão ou com pacientes semelhantes. Tipicamente, a concentração para as formulações tópicas está na gama superior a cerca de 0,01 mg/ml até 100 mg/ml. Pode-se usar dispersões sólidas do factor de necrose tumoral-alfa assim como preparações solubilizadas. Assim a concentração precisa a ser usada no veiculo sera submetida a alguma manipulação experimental para optimizar a resposta terapêutica. Mais de aproximadamente 10 mg de fac tor de necrose tumoral-alfa /100 gramas de veículo pode ser útil com veículos de 1% p/p de hidrogel no tratamento de iii fecçoes da pele. Além dos géis, sao veículos adequados emujL soes de óleo em água ou de água em óleo usando óleos minerais, petrolato e similares.

Facultativamente, o factor de necrose tumoral-alfa é administrado tópicamente pela utilização de um sistema terapêutico transdermico (Barry, 1983, Dermatological Formulations, p. 181 e literatura aqui citada). Se bem que tais sistemas tenham sido projectados largamente para administraçao transdérmica de drogas de baixo peso molecular, por definição eles sao capazes de fazer libertação percutânea. Eles podem ser fácilmente adaptados à administraçao de factor de necrose tumoral-alfa e proteínas terapêuticas associadas por selecçao adequada da menbrana microporosa controladora do fluxo. No entanto, nao é necessário que o adesivo de ligaçao à pele contenha uma dose de factor de necrose tumoral-alfa.

Podem ser empregues preparações t£ picas de factor de necrose tumoral-alfa para libertação si£ témica ou local e podem conter excipientes como descrito atrás para administraçao parenteral e outros excipientes usa dos numa preparaçao tópica tais como co-solventes, tensioactivos, óleos humidificantes, emulientes, preservativos, estabilizadores e anti-oxidantes. Pode-se usar qualquer tam pao farmacologicamente aceitável, e.g. tampões tris ou fosfato. As formulações tópicas podem também incluir facultativamente um ou mais agentes vários designados estimuladores, tensioactivos, aceleradores, promotores da absorçao ou estimuladores da penetração tais como, um agente para aumentar a penetração percutânea do factor de necrose tumoral-alfa ou outros agentes. Tais agentes deverão possuir algumas ou todas as seguintes características como é do conhecimento dos familiarizados com a matéria: ser farmacológicamente inerte nao promover a perda de líquidos do corpo ou electrólito, ser compatível com o factor de necrose tumoral-alfa (nao inactivar) e poder ser formulado em cremes, géis ou outros sistemas de libertação tópica conforme se pretender.

Numa execução preferida uma preparaçao tópica de base cremosa compreende:

Base cremosa gramas/100 gramas

rTNF	0,01 - 1,0
Estearato de glicerilo	3,0
Miristato de isopropilo	4,0
Propilenoglicol	3,0
Estearato de PEG-40	1,0
Álcool cetílico	. 2,0?
Hidroxietilcelulose	0,5 - 1,0
Preservativo	95

Agua

100

Num outro exemplo uma preparação tó pica de base cremosa compreende:

Base cremosa gramas/100 gramas

r-TNF	0,01 - 1,0
Acido esteárico	15,0
Glicerina	8,0
Hidróxido de potássio	0,7
Preservativo	95
Agua	76,3

paraçao lógica,

Gel

Ainda noutros exemplos de uma preum gel ou pomada compreende respectivamente:

gramas/100 gramas

rTNF	0,01 - 1,0
Tampao fosfato de sódio	95
Cloreto de sódio	1
Preservativo	95
Metilcelulose	2

Agua

100

gramas/100 gramas

0,01 - 1,0

- 100

Pomada rTNF em pó

Lanolina

Preservativo Petrolato branco factor de necrose tumoral-alfa pode ser administrada sistémicamente, em vez de tópicamente, por injecçao i.m. numa dosagem superior a cerca de 25ug/m / /dia. A dose dependerá das propriedades das espécies de fac. tor de necrose tumoral-alfa empregues, e.g. a sua actividade e semi-vida biológica, a concentração do factor de necrose tumoral-alfa na formulação, o sitio e velocidade de dosagem, a tolerância clínica do paciente envolvido, as infecçoes do paciente e similares que serão do conhecimento do médico.

factor de necrose tumoral-alfa do presente invento pode ser administrado em solução. 0 pH da solução deverá ser da gama de pH 5 a 9,5, de preferência pH 6,5 a 7,5. 0 factor de necrose tumoral-alfa deverá estar numa solução tendo um tampao farmacêuticamente aceitável cci mo seja fosfato, tris(hidroximetil) aminometano-HCL ou citrja to e similares. As concentrações do tampao deverão ser da gama de 1 a 100 mM. A solução do factor de necrose tumoral-alfa pode também conter um sal, como seja cloreto de sódio ou cloreto de potássio numa concentração de 50 a 750 mM. Uma quantidade eficaz de um agente estabilizador como seja uma albumina, uma globulina, uma gelatina, uma protamina ou um sal de protamina pode também ser incluído e pode ser adicijo nado a uma solução contendo factor de necrose tumoral-alfa ou à composição a partir da qual a solução é preparada.

A administraçao sistémica do factor de necrose tumoral-alfa é feita diáriamente, geralmente por injecção intramuscular, se bem que infusão i.v. seja aceita vel. A administraçao pode também ser intranasal ou por outras vias nao parentais. 0 factor de necrose tumoral-alfa p£ de também ser administrado via microsferas, lipossomas ou 011 tros sistemas de libertação de micropartículas colocados em certos tecidos incluindo o sangue. As preparações tópicas são aplicadas directamente sobre a pele ou mucosa e depois de preferência isoladas, i.e. protegidas colocando sobre elas uma ligadura, película de poliolefina ou outra barreira impermeável para a preparaçao tópica.

Exemplo I

Materiais e Métodos

Gerais factor de necrose tumoral-alfa recombinante (rHuTNF-cX) foi clonado e expresso em E. coli e purificado até mais de 99 por cento de pureza. Pennica, D. et al., Nature 312, 724 (1984). Calcularam-se os títulos do factor de necrose tumoral-alfa medindo a actividade citolítica em células fibroblásticas de ratinho L-M tratado com actinomicina D. Id. Com base nestes resultados, a actividade específica foi de 4,0 x 10? U/mg de proteína do factor de n£ crose tumoral-alfa recombinante. Todas as preparações de fa£ tor de necrose tumoral-alfa mostram-se negativas relativamente à contaminaçao com lipopolissacáridos conforme testado pelo método do lisado do amoebócito Limulus (Mallinkrodt, St. Louis, M.O.).

Células mononucleares do sangue

periférico (PBMC) e neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) foram separados conforme descrito por Shalaby, M.R. et al., J.Immunol. 135, 2069, 1985. Resumidamente obtiveram-se PBMC por centrifugação de sangue heparinizado sobre um gradiente de Ficoll-hypaque. Os glóbulos vermelhos foram eliminados do sedimento rico em PMN por sedimentação com dextrano apirog^e nico (Pharmacia Laboratories, Piscataway, N.J.) seguido de lise hipotónica em água destilada durante aproximadameíltê 20 segundos. A suspensão final de células PMN foi de rotina Ç>97 por cento pura conforme controlado em citopreparaçoes coradas com Giemsa. A viabilidade celular conforme determina, do por exclusão com azul tripano era consistentemente superi_ or a 95 por cento.

Lavaram-se PBMC três vezes em meio mínimo essencial de Eagles (MEM, Grand Island Biological Col, Grand Island, N.Y.) suplementado com 10 por cento de soro f£ tal bovino (FBS, Irvine Scientific, Irvine, CA) inactivado pelo calor (30 min. a 50°C), 1 por cento de L-glutamina, 1 por cento de aminoácidos nao essenciais e penicilina/estreptomicina (MEM completo). 4 x 10^ PBMC em 2 ml de MEM complje to, foram colocados em placas de cultura de tecidos de 24 p£ ços (Costar, Cambridge, MA) e estimulados com 5 mg/ml de 12- β-í orbol-12- p -miristato-13-íX-acetato (PMA), (Sigma), e/ou diluição a 1:500 de fito-hemaglutinina-P (PHA-P), (Difco Laboratories, Detroit, MI). Colheram-se amostras 24, 48 e 72 h após a estimulação para determinações do factor de necrose tumoral-alfa.

Os níveis de factor de necrose tumoral-alfa foram determinados por ensaios específicos ELISA. A ELISA para o factor de necrose tumoral-alfa detecta 0,4 ng/ml. Vadhan-Raj, S., et al., J. Clinicai Oncology 4, 137 (1986).

PMNs foram suspensos (2,5 x 10 /ml) em meio mínimo essencial (GIBCO) suplementado com 5 por cen to de FBS inactivado pelo calor (Irvine Scientific). Alíqu£ tas de 0,5 ml de células foram distribuídas por tubos de plástico de 12 x 75 mm na ausência ou presença de doses va riáveis do factor de necrose tumoral-alfa e incubadas num agitador orbital a 37°C durante 20 minutos. Adicionou-se ses senta microlitros de uma suspensão monodispersa de esferas de latex de 1,5 microns fluorescentes (10 /ml) (Polysciences Inc. Warrington, PA) a cada cultura e os tubos foram ainda incubados durante 60 minutos a 37°C. As células foram fixadas pela adiçao de um volume igual de glutaraldeído a 2 por ceji to (Sigma, St. Louis, M0) e centrifugadas sobre gradientes FBS para eliminar as esferas nao ingeridas. 0 número de PMNs fagocitários foi determinado usando um classificador de células activado por fluorescência (FACS IV, Becton Dickinson and Co., Sunnyvale, CA).

Analizaram-se PMNs (8 x 10^ ) por FACS IV relativamente à dispersão do ângulo da luz incidente (tamanho das células) e fluorescência (esferas de latex fagocitadas) à medida que passam por um laser de Argon. Estas medições foram efectuadas numa base de células isoladas e apresentadas como histogramas de distribuição das frequências. 0 FACS IV foi programado para descriminar entre esferas nao ingeridas, detritos celulares, agregados de células e células contendo pérolas fluorescentes. PMNs contendo esferas in geridas foram quantificados com base na sua fluorescência rje lativa apresentada nos histogramas. Algumas amostras foram também submetidas ao exame microscópico para confirmar a eli minaçao de pérolas nao ingeridas ou ligadas.

Fez-se análise das actividades citotóxicas celulares dependentes de anticorpos (ADCC) por sus

pensão de PMNs em meio completo e incubação durante 2 h a 37°C na ausência ou presença do factor de necrose tumoral-al. fa em doses várias. A partir daqui transferiram-se para pia. cas de microtitulaçao de fundo redondo (Costar, Cambridge, MA) volumes de 0,1 ml em triplicado contendo diferentes números de PMN. Adicionou-se então alíquotas de 0,1 ml/poço con tendo 10^A glóbulos vermelhos de galinha (CRBC) marcados com

Cr e anticorpos. Após 4 h de incubaçao, colheram-se os sobrenadantes (Skatron, Inc., Sterling, VA) e a radioactivjl dade foi determinada usando um contador gama automático modelo 28037 (Micromedic Systems, Inc., Horsham, PA). Calculou -se a lise específica do alvo, expressa em percentagem de ci. totoxicidade, como se segue:

Percentagem de citolóxicidade = A - B x 100

C - B em que A representa a média de cpm nos sobrenadantes a testar (alvos cocultivados com PMN testemunha ou tratado), B re presenta a média de cpm libertados espontaneamente (alvos cul tivados sozinhos) e C representa a média de cpm da libertação máxima (alvos lisados com 1% Nonidet P-40). De rotina a citotoxicidade específica testada na ausência de anticorpo era 5% ou menos.

Exemplo 2

Aumento de PMN-ADCC

Os resultados de pelo menos 20 dadores testados mostraram que o tratamento de PMN com factor de necrose tumoral humano-alfa provocou um aumento de cerca de 90 por cento dos casos. Os resultados na figura 1 mostram que o factor de necrose tumoral-alfa resultou no aumen to de actividade PMN-ADCC. Foram conduzidos estudos de análise de dose-resposta e resultados representativos de três experiências estão resumidos na Tabela I. Consistentemente, num aumento substancial de PMN-ADCC era evidente após trata_ mento com todas as doses testadas do factor de necrose tunw ral-alfa humano pc. 0,05· para tratamento com 1 ou 10 U/ml.

Tabela 1

Efeito de diferentes doses de factor de necrose tumoral-alfa humano em ADCC mediada por PMN contra CRBC

Percentagem de Citotoxicidade após tratamento com factor de necrose tumoral humano-(U/ml)^a

E:T	0,0	0,1	1,0	10,0
8:1	26	37	42	46
4:1	18	25	34	39
2:1	11	14	22	27

θ. *

Trataram-se as células com factor de necrose tumoral-alfa humano. Após 2 h de incubaçao das células, transferiu_ -se para as placas de microtitulação 0,1 ml contendo diferentes números de PMN nao tratado ou tratado com factor de necrose tumoral-alfa humano. Adicionou-se CRBC marcado com ^^Cr e anticorpo e após 4 h de incubaçao os sobrenadantes foram colhidos e determinada a sua radioactividade. A lise específica de alvos de culturas em triplicado (libertação de cr) está expressa em percentagem de citotoxicidade. Em cada um dos casos a eliminação dos anti^ corpos contra CRBC resultou em 0-5 por cento de citotoxi_ cidade.

¹³ E:T = razao entre efector e alvo.

Exemplo 3

Aumento da produção de 0^

Como se mostra na Tabela 2, após e_s timulação com 12- |3-forbol-12- β-miristato-13- eX-acetato (PMA), PMNs de dadores normais produziram níveis significativos de 0₃ (0,44 nm para nao estimulados comparado com 2,59 de estimulados com PMA; p<^0,001). Sabe-se que o PMA induz actividade de PMN. Os níveis de 0% variam entre 0,57 nm e 5,6 nm 0^ para estimulados com PMA e entre 0 e 1,37 nm 0^ para meios testemunhas. Ao contrário, PMN de três dadores macho com CGD ligado a X (DD,JM e RD) produziu níveis signi^ ficativamente inferiores de 0^ após estimulação com PMA com parado com normais (0,17 nm 0^ versus 2,59 nm O2 , respectjl vamente) (ρ<ζθ,ΟΟ1). Os níveis de 0^ produzidos pelas duas fêmeas portadoras de CGD (JR e CM) nao foram significantemente diferentes dos normais. Os resultados confirmaram 0 diagnóstico clínico de CGD ligado a X nos três pacientes raa chos.

Tabela 2

Produção de 0£ por PMN derivado de dadores normais e com CGD

Dadores nm 0

Produção de nm 0£ apos estimulação com

Meio PMA

„ · ^bNormais	0,44	±	0,50	2,59	±	1,54
CGDs^C	0	±	0,01	0,17	+	0,24
J Portadores de CGD^a	0,12	+	0,10	1,6	±	1,1

Determinaram-se medições de O2 entre 50 e 90 minutos para os normais e 90 a 120 minutos para os CGDs e portadores de CGD.

b Resultados médicos de vinte testes de 15 dadores normais.

^c Resultados médios de quatro testes de três dadores machos com CGD ligado a X.

Resultados médios de seis testes de dois dadores portadores de CGD.

Como se mostra na Tabela 3, o factor de necrose tumoral-alfa induziu níveis significativos de 0 60 minutos após a estimulação em PMNs obtidos do sangue periférico de dadores normais comparado com as testemunhas não tratadas (p<( 0,001). Se bem que tanto o factor de necro se tumoral-alfa como o factor de necrose tumoral-beta (também designado linfotoxina) humanas estimulem a actividade dos neutrófilos, o factor de necrose tumoral-alfa humano mos trou um maior aumento da actividade dos neutrófilos do que o factor de necrose tumoral-beta.

Tabela 3

Produção de 0₂ por rHuTNF-cK

Estímulo	Produção de nm 0₂
Media	0,06
PMA	3,90
PMA + SOD	0,19
2,5 x 10³ U rHuTNF-	2,50

a * **

Determinado 60 minutos apos estimulação.

Como se mostra na Tabela 4, o factor de necrose tumoral-alfa humano estimulou PMNs obtidos de dadores normais, portadores de CGD e com CGD ligado a X para produzirem níveis significativamente mais altos de 0₂ com parado com testemunhas nao estimuladas. 0₂ induzido tanto por PMA como pelo factor de necrose tumoral-alfa humano foi inibido pela superóxido dismutase (SOD) confirmado assim que a actividade medida era de facto 0₂ e que PMN de dadores com CGD ligado a X podem produzir 0₂.

Tabela 4

Produção de 0₂ após estimulação com rHuTNF-c<

Estímulo nm 0? Produzido a

CGD ligado a X^{b Z} Portador de

CGD^c

Meios	0	0,07		0,09
PMA	0,29 + 0,27	1,74	+	0,23
PMA + SOD	0,05 + 0,08	0,10	+	0,13
1 x 10⁴ U rHuTNF-<X	0,67 + 0,28	1,09	+	0,17
2,5 x 10³ U rHuTNF-<X	0,48 + 0,08	0,85	+	0,08
1 x 10⁴ U rHuTNF-<x + SOD	0,03 + 0,04	0,20	+	0,10

0₂ foi determinado entre 60 e 90 minutos apos estimulação.

Os resultados sao a média de três a quatro réplicas.

^b Média de 3 testes de 3 dadores

^c Média de 2 testes de 2 dadores.

Exemplo 4

Estimulação da fagocitose

Estudou-se o aumento da fagocitose mediada por PMN através da estimulação com factor de necrose tumoral-alfa humano. Como se mostra nos painéis A e B da fi gura 1, PMNs de dadores normais MW) e CGD (JM), respectivamente, apresentaram um aumento de fagocitose após estimulação com 10 U/ml do factor de necrose tumoral-alfa humano confo£ me determinado pelo número de PMNs com mais de três pérolas de latex fagocitadas. Os resultados confirmam que PMNs de da. dores com CGD mantêm a fagocitose normal apesar do defeito no sistema de geraçao de 0_2>

Para determinar se a disfunção imu ne em dadores com CGD estava confinada ao sistema de geraçao de 0” no PMN ou poderia afectar também a produção de citocjÍ na, estudou-se a capacidade das células mononucleares do sangue periférico para produzir IFN-V e TNF-c< após estimulação com PHA-P, PMA ou PHA-P/PMA. Na Tabela 5 estão apresen tados resultados de uma de três experiências.

Tabela 5

Produção de interferao-gama e de factor de necrose tumoral-alfa por células mononucleares do sangue periférico de dadores normais portadores de CGD e com CGD.

Produção de Linfocina

Dador Estímulo³ IFN-Y(ng/ml) TNF-íX(pg/ml)

TR (normal)	-	1,14	LTS^b
	PHA-P	22,75	787,95
	PMA	1,95	783,4
	PHA-P/PMA	84,34	8310,25
JR (portador)	-	1,06	220,3
	PHA-P	12,26	1106,3
	PMA	1,74	2236,55
	PHA-P/PMA	67,02	15028,0
DD (CGD)	-	1,25	329,9
	PHA-P	102,20	3306,45
	PMA	535,65	7341,0
	PHA-P/PMA	702,15	15940,0
JM (CGD)	-	1,49	249,7
	PHA-P	17,92	815,7
	PMA	187,00	4563,9
	PHA-P/PMA	446,55	7289,0

³ Usou-se fito-hemaglutinina-P (PHA-P) numa concentração fji

Inferior ao padrao (LTS)

Apenas níveis de nanogramas de interferao-gama foram produzji dos após estimulação com PMA de PBMC de indivíduos normais e portadores de CGD. No entanto, surpreendentemente, PMA s£ zinho estimulou a produção de níveis elevados de IFN-V em PBMC dos dois pacientes com CGD ligado a X (DD e JM) (1,95 +0,2 ng/ml para normais e portadores de CGD comparado com 361 + 247 ng/ml para dador com CGD ligado a X no dia 3, p ^0,001). Em adição, PBMC de dadores com CGD ligado a X e_s timulados com PHA-P/PMA produziram muito mais interferao-gji ma do que indivíduos normais ou portadores de CGD no dia 3 (574 + 181 ng/ml vs 73 + 16 ng/ml, p<^0,001) e dias 1 e 2 (resultados nao apresentados). Noutros estudos (Tabela 5) foram também obtidos aumentos semelhantes na produção de fac. tor de necrose tumoral-alfa, i.e., PBMC de dadores com CGD ligado a X estimulados com PMA produziram níveis significat_i vamente maiores de factor de necrose tumoral-alfa comparado com indivíduos normais ou portadores de CGD no dia 3 (5952 + 1389 pg/ml vs 1510 + 727 pg/ml), p<Ç0,001 e dias 1 e 2 (resultados nao apresentados). Ao contrário PBMC de dadores normais ou portadores de CGD estimulados com PHA-P/PMA produziram níveis semelhantes de factor de necrose tumoral-alfa no dia 3 (11669 + 4750 pg/ml para dadores normais portadores de CGD vs 11615 + 6117 pg/ml para CGDs ligados a X, p= ns) e dia 3 (resultados nao apresentados). A produção de factor de necrose tumoral-alfa após estimulação com PHA-P/PMA no grupo de CGD ligado a X foi significativamente maior apenas no dia 1 (resultados nao apresentados).

Estes resultados confirmam que PBMC de dadores com CGD comparado com dadores normais mostram alterações diferentes na sua capacidade para produzir IFN-\ após estimulação mitogénica. Observaram-se alterações semelhantes na produção de factor de necrose tumoral-alfa. PBMC de dadores com CGD também produziram concentrações signifi^ cativamente mais altas de TNF-«X e IFN-Y após estimulação com PMA e PMA/PHA-P comparado com PBMC de dadores normais. Estudos anteriores mostraram que PMA funciona em culturas de PBMC de dadores normais como um mitogénio que sozinho nao estimula níveis significativos de produção de IFN-Y ou de interleucina-2 mas aumenta significativamente a produção de linfocina na presença de um mitogénio. Pearlstein, K.T., et al., J. Biol. Response Modifiers 2, 81-91 (1983). Estes resultados indicam portanto que existem diferenças significativas nos sinais necessários à activaçao de PBMC em pacientes com CGD comparado com PBMC de dadores normais e sugere que a desregulaçao imune nesta doença seja de uma dimensão maior do que previamente se pensava, Segai, A.W., The Lancet, Junho 15, 1378-1382, (1985).

Exemplo 5

Efeito do factor de necrose tumoral-alfa sobre a activaçao de neutrófilos por Candida albicans

Estudou-se o efeito do factor de n£ crose tumoral-alfa recombinante sobre a activaçao de PMN por Candida albicans. Resultados anteriores sugeriram diferenças nas respostas de PMN induzidas por partículas opsonizadas, (zimosano ou hifas) comparado com hifas nao opsonizadas. Obtiveram-se e separam-se PMNs do sangue periférico. PMNs fo_ ram incubados com factor de necrose tumoral-alfa (100 unida des 10° PMNs) durante trinta (30) minutos e nao se observou qualquer efeito na linha de base da libertação de superóxido (0„) nao estimulada. A pré-incubaçao de PMNs com factor de 6 necrose tumoral-alfa (100 unidades/10 ) durante trinta minu. tos aumentou a produção de 0₂ pelo zimosano (20,2%) assim como por hifas opsonizadas (38,6%) e nao opsonizadas (42,0%). A toxina de pertussis (PT), um conhecido inibidor da libertação de superóxido (0?), 500 ng/ml durante 2 horas e quela * 4-4· taçao de cálcio (Ca ) (intracelular, por carga com um tampao orgânico, BAPTA; e extracemular com EGTA). BAPTA ou EGTA, com ou sem PT, quase complrtamente eliminaram (95-99%) as respostas de 0₂ de PMN ao zimosano opsonizado, independente mente do pré-tratamento com o factor de necrose tumoral-alfa. No entanto, houve apenas uma redução parcial nas respostas dos bursts respiratórios de PMN estimulados com factor de ne crose tumoral-alfa induzidas por hifas, opsonizadas ou nao (inibição respectiva com hifas opsonizado vs. nao opsonizadas: 24,6*4,3 vs 25,0 + 2,4% por PT, 20,0 + 8,4 vs 45,5 + 4,9% por BAPTA, 47,3 + 2,4 vs. 27,5 + 1,4% por EGTA e 68,9 + 2,8 vs 54,37 + 3,3% por combinação dos três). Em todos os casos, i.e. para todos os tipos de condiçoes, as respostas de 0₂ de PMN as hifas foram aumentadas significativamente pelo factor de necrose tumoral-alfa (p<^0,05). Estes resultados sugerem que o factor de necrose tumoral-alfa alfa para aumentar a ejç plosao respiratória num local do processo de activaçao próximo do envolvimento das proteínas reguladoras do nucleotídeo guaninainibíveis por PT ou respostas de segundo mensageiro mediadas por fluxos detectáveis do iao cálcio com al. teraçoes dasconcentraçoes citossólicas de cálcio.

Claims

REIVINDICAÇÕE

11. - Método de tratamento de uma doença infecciosa, por exemplo associada a uma doença das células fegocitárias do paciente ou a uma deficiência nos neutrofilos polimorfinucleares do paciente, ou ser consequente da doença granulomatosa crónica, caracterizado por compreender a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de factor de necrose tumural-alfa a um paciente tendo tal doença de
2 preferência em dosagens superiores a 25qg/m /dia numa formu3 3 lação de cerca de 0,001 mg/cm a 10 mg/cm para injecções e em dosagens de cerca de 0,01 mg/ml a 100 mg/ml de preferência 10 mg/100 g de veiculo para preparações tópicas.

21. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença infecciosa estar associada a uma doença das células fagocitárias do paciente.

31. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença infecciosa estar associada a uma deficiência nos neutrófilos polimorfonucleares do paciente.

41. - Método deacordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença infecciosa ser consequente da doença granulomatosa crónica.

51. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor de necrose tumoral-alfa ser administrado intramuscularmente a uma dosagem maior do que cerca de 25 qg/m /dia.

61. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor de necrose tumoral-alfa ser administrado intravenosamente a uma dosagem maior do que 25 yg/m /dia.

-297â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor de necrose tumoral-alfa ser administrado topicamente numa gama maior do que cerca de 0,01 mg/ml até 100 mg/ml.

8a. _ Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tratamento incluir adicionalmente um antibiótico.