JPS6354327A - 治療用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌および真菌類による感染症の治療に関す
るものである。詳細には、本発明は、この様な治療にお
けるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｃｓ）の使用に関す
る。なかでも本発明は、抗感染症剤としての、サイトカ
イン、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の使用に関
する。

本発明の抗感染症剤によって治療される感染症は、食細
胞に欠陥があるために生じる感染症である。単核細胞、
多形核好中球、マクロファージおよび好酸球を包含する
食細胞は、通常、細菌および真菌類病原体を取り込む。

この食細胞は、［呼吸激発（ｂｕｒｓｔ）Ｊによって証
拠だてられる様に、酸素を利用すると思われる未知の機
構によって、取り込んだ病原菌を殺す。ある種の病気で
は、食細胞は、病原体を取り込むことによって血液およ
び組織からこれらを除去することができるが、捕食した
微生物を殺すことはできない。これらの非殺菌性食細胞
に含有されている微生物は、生育可能である。慢性肉芽
腫症（ＣＯＤ）は、非殺菌性多形核好中球を生じる遺伝
的欠陥に起因する症状の一例である。慢性肉芽腫症は子
供に最も頻繁に起こるが、成人にも観察される。慢性肉
芽腫症を有する患者は、感染症に対して過度の感受性を
示す（ハカンソン等（Ｈａｋａｎｓｓｏｎ、Ｌ、　ｅｔ
　ａｌ、　）、Ａｒｃｈ。

Ｄｉｓ、　Ｃｈｉｌｄ、　５５．７７６（１９８０））
。慢性肉芽腫症は、重大な小児科上の問題となっており
、不完全な食細胞によるこの様な病気の一例である。

ＣＯＤの特徴は、その他の全ての点において正常である
らしい食細胞による呼吸激発が実質上全く存在しないこ
とである。ＣＯＤ患者は、そのリンパ節、肝臓、骨、皮
膚および呼吸器に、しばしば重篤でしばしば致死的な感
染症を有する。

呼吸激発は、酸素ラジカルの産生を示す。この酸素消費
は、最も一般的な細菌および真菌類病原体を殺すための
最適条件を作り出すために必要とされると考えられる。

酸素が欠乏している細胞は、ある種の病原菌を取り込む
が、効果的に殺さない（マンデル（Ｍａｎ４ｅｌｌ、　
Ｇ、　Ｌ、　）、ｊｎｆｅｃｔ、　　ｆｍｕｎ、　９−
１３３７．１９７４）。病原体を殺すことに関係してい
ると思われる物質であって、酸素を要求する物質には、
過酸化物、ヒドロキシラジカル、原子状酸素および過酸
化水素がある。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と呼ばれている物質は、自然に
痛症状が軽減している患者が同時に細菌感染症を有して
いることが観察された時、初めて記載された。腫瘍壊死
因子アルファは、生物学的活性および構造において種々
の程度の類似性を有する一群の蛋白質類に属するようで
ある。時折カケクチン（ｃａｃｈｅｃｔ　ｉｎ）とも呼
ばれる腫瘍壊死因子ベータ（以前はリンホトキシンと呼
ばれていた）は、この蛋白質群に含まれるその他の既知
分子の一例である。感染症における腫瘍壊死因子アルフ
ァの役割についての推論はあるが、一定の範囲の細菌お
よび真菌類で試験した結果は、直接の腫瘍壊死因子アル
ファ感受性の証拠を示さなかった（オールド（Ｏｌｄ、
Ｌ、Ｊ、）、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　　２３０．６３２（１
９８５）における概説）。腫瘍壊死因子アルファは、ヒ
ト謄静脈内皮細胞単層へのヒト好中球の粘着性を高める
ことが示された（ギャンブル等（ＧａＩＩｌｂｌｅ、　
Ｊ　、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　）、ＰＮＡＳ　　８２，８
６６７（１９８５））。内皮細胞に対するＰＭＮの粘着
′　性のこの増大は、腫瘍拒否における腫瘍壊死因子の
効果の１要素であると考えられた（前掲８６６７）。組
換えヒトインターフェロンガンマ（ｒＨｕＩＦＮ−γ）
および天然のヒト腫瘍壊死因子ベータ（ｎＨｕＴＮＦ−
β）は、イン・ビトロにおいてＰＭＮの食菌活性を高め
ることが、ＰＭＨのラテックスビーズ取り込み能によっ
て測定された（シャラビー等（Ｓｈａｌａｂｙ、　Ｍ、
　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　）、ＡＳＢＣ／ＡＡ　Ｉ　（１
９８４））。ヒトインターフェロンガンマおよびヒト腫
瘍壊死因子ベータは、ＰＭＮに媒介される抗体依存性細
胞の細胞毒性を高め、またＯｆ−の産生を増加すること
が示された（シャラビー等（Ｓｈａｌａｂｙ、　Ｍ、　
Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　）、Ｊ、ｏｆＩ　ｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ、↓３５（３）、２０６９（１９８５））。

腫瘍壊死因子は、投与量に依存してヒト好酸球の、寄生
体を殺す能力を高めることが示された（シルバースタイ
ン（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ、Ｄ、　Ｓ、　）およびデ
ィピッド（Ｄａｖｉｄ、Ｊ、　　Ｒ，）、Ｐ、Ｎ、Ａ、
Ｓ、８３．１０５５（１９８６））。

本発明は、ヒト腫瘍壊死因子アルファが多形核好中球（
ＰＭＮ）を活性化するという新しい観察に基づいている
。本発明者らは、ヒト腫瘍壊死因子アルファがイン・ビ
トロでＰＭＮの食菌活性を高めることを見い出した。本
発明者らはまた、ヒト腫瘍壊死因子アルファがＸ−関連
ＣＯＤに罹患した男性患者の不活性なＰＭＮをイン・ビ
トロで変性させ、呼吸激発を生じさせることを見い出し
た。

本発明は、食菌作用を必要とする種々の感染症のための
抗感染症治療剤を提供することを目的とするものである
。より詳細には、ヒト腫瘍壊死因子アルファを、正常な
食細胞を有する、種々の感染症に罹患している患者にお
ける抗感染症剤として使用することができる。

本発明はまた、不完全な食菌細胞を活性化するための抗
感染症治療剤を提供することを目的とするものである。

発明の要約 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子アルファが、正常および不
完全な多形核好中球（ＰＭＮ）を活性化するという新し
い蚊察に基づいている。従って、本発明の一態様は、正
常な食細胞を存する感染症患者における抗感染症治療と
して、ヒト腫瘍壊死因子アルファを含存している組成物
を投与することである。本発明の別の態様は、不完全な
食細胞を有する患者にこの組成物を投与し、抗病原菌応
答をもたらすことである。

咀匡符μｓ団 第１図は、ヒト腫瘍壊死因子アルファによる、正常（Ａ
）およびＣ０Ｄ（Ｂ）提供者からのＰＭＮの食菌作用の
活性化を示す。食菌作用の検定は、実施例１の一般的な
物質および方法に記載した様にして行った。食菌細胞の
分類は、ＦＡＣＳのプロファイルによって示す。Ｘ軸に
近い曲線は、バックグラウンドの自己蛍光および／また
はビーズを取り込まなかった細胞を表わす。（Ａ）では
、非処理正常ＰＭＮを（−）で、ヒト腫瘍壊死因子アル
ファで処理した正常ＰＭＮを（−）で表わし、（Ｂ）で
は、非処理ＣＧＤＰＭＮを（−）で、ヒト腫瘍壊死因子
アルファで処理したＣＧＤＰＭＮを（−）で表わす。

詳細な説明 多形核好中球（ＰＭＮ）、単核細胞、マクロファージお
よび好酸球を包含する食細胞は、細菌および真菌類病原
体に起因する感染症を排除する役割を有する。宿主の防
御メカニズムへの食菌細胞の関与は、よく調べられてい
る。ＰＭＮは、腫瘍細胞およびウィルス感染細胞に対し
、抗体依存性の細胞毒性活性を示すことができる（プレ
グリ等（Ｄｅｌｌｅｇｒｉ、Ｆ、　ｅｔ　ａｔ、　）、
ｒ　Ｉｌｌｍｕｎｏｌｏｇｙ　４８　、２７３（１９８
３））。Ｐ〜ＩＮはまた、病原体の排除に独特の方法を
示す。ＰＭＮはまず、病原菌を取り込み、次いで急速に
多量の酸素を消費することによって病原菌を殺ず。酸素
の消費は、最も一般的な細菌および真菌類病原体を殺す
ための最適条件を作り出すために必要とされる。酸素由
来の代謝産物は、病原菌を殺すことに関与する（ベイビ
オ−（Ｂａｂｉｏｒ、Ｂ、　Ｍ、　）、Ｎ、　Ｅｎｇｌ
、　Ｊ　、　Ｍｅｄ。

玄先影、６５９（＋９７８））。

ある種の病気では、食細胞は、血液および組織から病原
体を取り込むことができるが、捕食した微生物を殺すこ
とはできない。リンパ腺炎、肺炎、肝臓膿瘍および蜂巣
炎の様な感染症は、この様な、食細胞に欠陥がある場合
に発症する。スタフィロコッカス０アウレウス（Ｓ　ｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、エンテロ
バクタ−・アエロゲネス（Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、
セラチアψマルセツセンス（Ｓ　ｅｒａｔｔｉａ　ｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）およびアスペルギルス・
フミガッス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｒｕｍｉｇａｔ
ｕｓ）を包含する種々の微生物が、この様な状態の病巣
から培養された。これらの病原体を殺すことができない
食細胞、即ち不完全な食細胞によって取り込まれた病原
体は、抗生物質から保護される。

従って、この様な低者における抗生物質の使用は制限さ
れる。本発明は、細胞内微生物に起因する感染症の治療
をら包含する。より詳細には、本発明は、正常な食細胞
を有する感染症の患者の治療をも包含する。本発明は特
に、慢性肉芽腫症に罹患している低音を含む不完全な食
細胞を存する信者に生じるこれらの感染症に適用するこ
とができる。

腫瘍壊死因子アルファ、および組換え細胞培養からの回
収を包含するその製造方法は、よく知られている（ヨー
ロッパ特許出願第８５３０４７５８．７号）。組換え、
天然または合成供給源からの腫瘍壊死因子アルファが、
腫瘍壊死因子アルファの範囲に含まれる。アミノ酸が置
き換えおよび／または除去および／または付加された腫
瘍壊死因子アルファの変異体、その有機および無機塩、
および腫瘍壊死因子アルファの共有結合的に修飾された
誘導体も腫瘍壊死因子アルファの範囲に含まれる。

本発明に使用するに当たっては、腫瘍壊死因子アルファ
を注射用または局所用製剤のいずれかに製剤化すること
ができる。非経口的製剤は知られていて、本発明の使用
に好適であり、筋肉内または静脈内投与用製剤が好まし
い。これらの製剤は、腫瘍壊死因子アルファの治療的有
効量を含有する滅菌溶液剤、懸濁液剤または凍結乾燥物
のいずれかであり、安定化剤または賦形剤を含有してい
てもよい。凍結乾燥組成物は通常、適当な希釈剤、例え
ば注射用の水、生理食塩水等で約、００１ｍｇ／ｃｃか
らｌｏｍｇ／ｃｃの濃度、即ち繊維芽細胞（Ｌ−Ｍ）で
測定した生物学的活性が約≧４　Ｘ　１０’単位／ｍｇ
となる−ように復元する。

腫瘍壊死因子アルファは、皮膚科用賦形薬に治療的有効
濃度の腫瘍壊死因子アルファを含有させることにより、
局所治療のための外用製剤に製剤化される。投与すべき
腫瘍壊死因子アルファの量、および局所用製剤中の腫瘍
壊死因子アルファの濃度は、選ばれる賦形薬、叡者の臨
床的症状、使用される腫瘍壊死因子アルファの種類およ
び製剤中の腫瘍壊死因子の安定性によって決まる。従っ
て、医師は、製剤中に適当な濃度の腫瘍壊死因子アルフ
ァを含有している適当な製剤、および問題の患者または
同等の患者についての臨床上の経験によって決められる
投与すべき製剤の量を使用しなければならない。通常、
局所用製剤のための濃度は、約、　０１　ｍｇ／　ｍｌ
−１００ｍｇ／　ｍ１以上の範囲である。

腫瘍壊死因子アルファの固形分散剤および可溶化製剤を
使用することができる。従って、賦形薬中に使用される
正確な濃度は、治療上の応答を最も効果的にするために
、適度の実験的処理によって決められるであろう。皮膚
感染症の治療では、Ｉ％Ｗ／Ｗの水酸化アルミニウムゲ
ル賦形薬を用い、賦形薬１００グラム当たり約１０ｍｇ
以上の腫瘍壊死因子を使用することができる。ゲル以外
の好適な賦形薬は、鉱油、ワセリン等を使用した水中油
型または油中水型の乳濁液である。

腫瘍壊死因子アルファは、経皮治療系を使用して、局所
的に投与することができる（バリー（Ｂａｒｒｙ）、１
９８３、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｏｒ＋＋＋
ｕｌａｔｉｏｎｓ。

ｐ、Ｉ８１およびその引用文献）。この様な系は、主と
して低分子量薬物の経皮投与のためにデザインされてき
たが、これらは、範囲を限定することにより経皮投与す
ることができる。これらは、速度調節用多孔性膜を適当
に選択することにより、腫瘍壊死因子アルファおよび関
連する治療用タンパク質に容易に適用することができる
。しかしながら、この皮膚結合粘着剤が初回投与量の腫
瘍壊死因子を含有している必要はない。

腫瘍壊死因子アルファの局所用（外用）製剤は、全身ま
たは局所投与のいずれかのために使用することができ、
非経口投与のための上記の賦形薬、および相互溶媒、界
面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、保存剤、安定化剤
および抗酸化剤の様な局所用製剤に使用されるその他の
賦形薬を含有することができる。例えばトリスまたはリ
ン酸緩衝液のような、薬理学的に許容し得る緩衝液を使
用することができる。場合により、局所用製剤に、腫瘍
壊死因子アルファの経皮浸透を高めるための薬物または
その他の薬物の様な、増進剤、界面活性剤、反応促進剤
、吸着促進剤または浸透増進剤と呼ばれるＩまたはそれ
以上の薬物を含有させてもよい。この様な薬物は、好ま
しくは当業者に知られている以下の特性、即ち薬理学的
に不活性であり、体液または電解質の損失を促進せず、
腫瘍壊死因子アルファと共存することができ（不活化し
ない）、そして所望によりクリーム、ゲルまたはその他
の局所投与系に製剤化することができるという性質の幾
つかまたは全てを有しているべきである。

好ましいｌ態様では、クリーム基剤の局所用製剤は以下
の成分を含有する： クリーム基剤　　　　　　　　グラム／１００グラムｒ
ＴＮＦ　　　　　　　　　　　Ｏ，０１−１，０グリセ
リルステアリン酸 エステル　　　　　　　　　　　３．０イソプロピルミ
リスチン酸 エステル　　　　　　　　　　　４．０プロピレングリ
コール　　　　　　３．０ＰＥＧ−４０ステアレート　
　　　１．０セチルアルコール　　　　　　　　２，０
ヒドロキシエチルセルロース　　０．５−１．０保存剤
　　　　　　　　　　　　９５ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　１００その他の
例では、クリーム基剤の局所用製剤は以下の成分を含有
する クリーム基剤　　　　　　　　グラム／１００グラムｒ
−ＴＮＦ　　　　　　　　　　Ｏ，０１−１，０ステア
リン酸　　　　　　　　　１５．０グリセリン　　　　
　　　　　　８０ 水酸化カリウム　　　　　　　　　０．７保存剤　　　
　　　　　　　　　９５ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７６．３局
所用製剤の更に別の例では、ゲルまたは軟膏はそれぞれ
以下の成分を含有するニ ゲル　　　　　　　　　　　　　グラム／１００グラム
ｒＴＮＦ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０１−１，０リ
ン酸ナトリウム緩衝液　　　　９５ 塩化ナトリウム　　　　　　　　　　ｌ保存剤　　　　
　　　　　　　　９５ メチルセルロース　　　　　　　　２ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００均貴
− ｒ−ＴＮＦ扮末　　　　　　　０．０１−１．０ラノリ
ン　　　　　　　　　　　１５ 保存剤　　　　　　　　　　　　９５ 白色ワセリン　　　　　　　　　　９５−！００腫瘍壊
死因子アルファは、約２５μ９／Ｍ”／　Ｅｌより多い
投与量で筋肉内注射することにより、局所的ではなく、
全身的に投与することができる。

投与ｍは、使用する腫瘍壊死因子アルファ種の特性、例
えばその活性および生物学的半減期、製剤中の腫瘍壊死
因子アルファの濃度、投与の部位および割合、問題の憶
者の臨床的な耐久力、を者が罹廖ｊ７ている感染症等、
医師の技量の範囲内で決められる。

本発明の腫瘍壊死因子アルファは、溶液状で投与するこ
とができる。溶液のｐＨは、ｐ１１５〜９゜５、好まし
くはｐＨ６，５〜７．５の範囲にするべきである。腫瘍
壊死因子アルファは、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタ：／−ＭＣＩ２またはクエン酸塩等の
様な適当な薬学的に許容し得る緩衝液を含有する溶液に
するべきである。緩衝液の濃度は、１１−１Ｏ０ｉの範
囲にするべきである。腫瘍壊死因子アルファの溶液は、
塩化ナトリウムまたは塩化カリウ与の様な塩を５０〜７
５０肩Ｍの濃度で含有することもできる。腫瘍壊死因子
アルファを含有しでいる溶液または溶液が調製される組
成物に、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミ
ンまたはプロタミンの塩の様な安定化剤の有効量を含有
させてもよく、加えることができる。

腫瘍壊死因子アルファの全身投与は、毎日、通常筋肉的
注射によって行なわれるが、静脈内注射してもよい。鼻
腔内またはその他の非注射経路によって投与してもよい
。腫瘍壊死因子アルファを、血液などのある種の組織に
適用するためのミクロスフェア−、リポソームまたはそ
の他の微粒子からなる投与系によって投与することもで
きる。局所用製剤は、毎日直接皮膚または粘膜に塗布し
、次いで好ましくはこの局所用製剤を通さない包帯（帯
具）、ポリオレフィンフィルムまたはその他の防御物質
でおおう。

実施例１−一般的物質および方法 組換え腫瘍壊死因子アルファ（ｒＨｕＴＮＦ−α）をク
ローンしてＥ、コリ中で発現させ、９９パ一セント純度
以上に精製した（ペニカ等（Ｐ　ｅｎｎｉｃａ。

Ｄ、　ｅＬ　ａｌ、　）、Ｎａｔｕｒｅ　３↓メー、７
２４（１９８４））。腫瘍壊死因子アルファの力価を、
アクチノマインンＤで処理したｉ、−Ｍマウスの繊維芽
細胞における細胞溶解活性を測定することにより計算し
た。Ｉｄ、分析結果に基づくと、組換えヒト腫瘍壊死因
子アルファの比活性は、４．０ｘｌＯ７Ｕ／ｍｇタンパ
ク質であった。全ての腫瘍壊死因子アルファ製剤は、ル
ミラス・アモエボサイト・リゼイト（Ｌｕｍｕｌｕｓ　
ａＩＲｏｅｂｏｃｙｔｃ　１ｙｓａｔｅ）法（マリンク
０−）ト（Ｍａｌｉｉｎｋｒｏｄｔ）、セント・ルイス
（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ）によって試験した
ところ、リポポリサッカライド汚染について陰性であっ
た。

末梢血液中の単核細胞（ＰＢＭＣ）および多形核好中球
（ＰＭＮ）をシャラビー等（Ｓｈａｌａｂｙ、　Ｍ。

Ｉｌ、　ｅｔ　ａｌ、　）、Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ
ｌ　、上３５，２０６９．１９８５の記載に従って分離
した。フィコール−ハイバークグラジェント上で、ヘパ
リン化した血液を遠心することにより、簡便にＰＢＭＣ
を得た。

パイロジエンを含んでいないデキストラン（ファルマシ
ア・ラボラトリーズ（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｌ　ａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ビスカッタウェイ（Ｐ　ｉｓｅ
ａｔａｗａｙ）、ニューシャーシー）の沈降によりＰＭ
Ｈに富んだベレットから赤血球を除去し、次いで蒸留水
中で約２０秒間低張的に溶解させた。ギエムサ（Ｇｉｅ
ｍｓａ）染色した細胞標本をモニターすると、最終的な
ｐＭＮ細胞懸濁液は通常、〉９７パ一セント純度であっ
た。トリパン青エクスクルージョンによって求めた細胞
の生存率は、−貫ｊ２て〉９５パーセントであ・った。

Ｐ　Ｂ　Ｍ　Ｃを、１０％熱不活化（５０℃で３０分間
）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、アーヴイン・サイエンティフ
ィ”）り（Ｉ　ｒｖｉｎｅ　Ｓ　１ｅｎｔｉｆｉｃ）、
アーヴイン、カリフォルニア））、１％Ｉ、−グルタミ
ン、１％非必須アミノ酸およびペニシリン／ストレプト
マイシン（完全ＭＥＭ）を補足したイーグルの最小必須
培地（ＭＥ！ｖＬグランド・アイランド・バイオロジカ
ル・コル（Ｇｒａｎｄ　　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｃｏｔ）、グランド・アイランド、ニューヨ
ーク）中で３回洗浄した。完全ＭＥＭ２籾中の４Ｘ１０
’ＰＢＭＣを２４ウ工ル組織培養プレート（コスタ−（
Ｃｏｓｔａｒ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒ　ｉｄｇｅ
）、マサチューセッッ）に入れ、５ｎｇ／ｎ＋ｌの１２
−β−ホルボール−１２−β−ミリステート−１３−α
−アセテ　　　。

−ト（ＰＭＡＸング？（ＳｉｇＩＩＩａ））、および／
または１：５００希釈のフィトヘマグルチンーＰ　（Ｐ
　ＨＡ−Ｐ）（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト、ミシガン
）で刺激した。

腫瘍壊死因子アルファの測定のために、刺激の２４．４
８および７２時間後に試料を集めた。

腫瘍壊死因子アルファの濃度を、特異的ＥＬＩＳＡ検定
により測定した。腫瘍壊死因子アルファのためのＥＬＩ
ＳＡは、＞　０　、４　ｎｇ／ｍｌを検出する（ヴアド
ハンーラジコ等（Ｖａｄｈａｎ　−Ｒａｊ、　Ｓ　、　
。

ｅｔ　ａｌ　）、Ｊ　、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏ
ｌｏｇｙ　４−１Ｉ３７（１９８６））。

５％熱不活化ＦＢＳ（アーヴイン・サイエンティフィッ
ク）を補足した最小必須培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））
にＰＭＮを懸濁した（２　、５　Ｘ　１０　”／ｍｌ）
。

０．５ｍｌずつの細胞を種々のヒト腫瘍壊死因子アルフ
ァ投与量の存在または不在下、１２Ｘ７５ｍｍプラスチ
ックチューブに分注し、円弧を描く振盪機にて３７℃で
２０分間インキュベートした。各培養に、１．５ミクロ
ンの蛍光ラテックスビーズを単分散させた懸濁液（１０
’／１ｌ）（ポリサイエンシズ・インコーホレイテッド
（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　　Ｉｎｃ、　）、ワーリ
ントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）、ペンシルバニア）６
０マイクロリツトルを加え、チューブを更に３７℃で６
０分間培養した。等容量の２％グルタルアルデヒド（シ
グマ、セント・ルイス、ミズーリ）を加えて細胞を固定
し、ＦＢＳグラジェント上で遠心することにより、取り
込まれなかったビーズを除いた。蛍光活性化細胞選別機
（ＦＡＣ８ＩＶ、ベクトン・ディキンソン・アンド・カ
ンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ
　Ｃｏ、　）、サニーベイル（Ｓ　ｕｎｎｙｖａｌｅ）
、カリフォルニア）を使用し、捕食したＰＭＮの数を調
べた。

アルゴンレーザーを通り過ぎる時の前部角度の光散乱（
細胞サイズ）および蛍光（捕食されたラテックスビーズ
）について、’ＦＡＣ９■によりＰＭＮ（８ｘｌＯ’→
を分析した。これらの測定は、１個ずつの細胞に基づい
て行い、度数分布ヒストグラムとしてディスプレイした
。取り込まれなかったビーズ、細胞残骸、細胞凝集塊お
よび蛍光ビーズを含有している細胞を電気的に区別する
ように、ＦＡＣ９ＩＶをプログラムした。取り込まれた
ビーズを含有しているＰＭＮを、ヒストグラム上にディ
スプレイされたその相対蛍光に基づいて定量した。幾つ
かの試料を顕微鏡試験にも付し、取り込まれなかったか
または破壊作用を受けたビーズが除外されていることを
確認した。

抗体依存性細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を、ＰＭＮ
を完全培地に懸濁し、種々の投与量でのヒト腫瘍壊死因
子アルファの存在または不在下、３７℃で２時間インキ
ュベートすることにより検定した。次いで、種々の数の
ＰＭＮを含有している０、１１容量を３個の丸底＠１ａ
定プレート（コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）、ケンブリッジ
、マサチューセッツ）に移した。ｌウェル当たり、１０
’個の”Ｃｒ標識されたニワトリ赤血球（ＣＲＢＣ）を
含有しているＯ、１ｍｌずつを加え、次いで抗体を加え
た。

４時間インキュベートした後、上清を集め（スカトロン
・インコーホレイテッド（Ｓ　ｋａｔｒｏｎ、　Ｉ　ｎ
ｃ、）、スターリング（Ｓ　ｔｅｒｌｉｎｇ）、バージ
ニア）、自動ガンマカウンターモデル２８０３７（マイ
クロメゾイック・システムズ・インコーホレイテッド（
Ｍｉｅｒｏｍｅｄｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉ　ｎｃ、
　）、ホージャム（Ｈｏｒｓｈａｍ）、ペンシルバニア
）を使用して、放射活性を測定した。細胞毒性の百分率
で表される比標的溶解活性を以下の様にして計算したニ −Ｂ 式中、Ａは試験上清（対照または処理ＰＭＮと共培養さ
れた標的）中の平均ｃｐｍを表わし、Ｂは自然放出平均
ｃｐｍ（単独で培養された標的）を表わし、Ｃは最大放
出平均ｃｐｍ（１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−
４０で溶解された標的）を表わす。抗体の不在下、常法
により試験した死細胞毒性は５％またはそれ以下であっ
た。

実施例２　　ＰＭＮ　　ＡＤＣＣの増大試験した少なく
とも２０人の提供者からの結果は、ヒト腫瘍壊死因子ア
ルファでｐＭＮを処理すると、９０％以上のケースにお
いてＡＤＣＣを高めるということを示した。第１図にお
ける結果は、ヒト腫瘍壊死因子アルファがＰ　Ｍ　Ｎ　
−Ａ　Ｄ　ＣＣ活性を高めるということを示している。

投与量応答検定試験を行ない、３回の実験からの代表的
な結果を第１表に示す。ヒト腫瘍壊死因子アルファ処理
した後、試験した全ての投与量で一致して、ＰＭＮ−Ａ
ＤＣＣの実質的増大が明らかであった。

■またはＩＯＵ／ｍｌでの処理についての細胞毒性パー
セントは０，０５であった。以下の第１表に、ＣＲＢＣ
に対するＰＭＮ媒介ＡＤＣＣにおける、種々の投与量の
ヒト腫瘍壊死因子アルフｌの影響を示す。

見上森 ａ：細胞をヒト腫瘍壊死因子アルファで処理した。

細胞を２時間インキュベートした後、種々の数の非処理
またはヒト腫瘍壊死因子アルファ処理ＰＭＮを含有して
いるＯ、１ｍｌを微量滴定プレートに移した。５１　Ｃ
ｒ標識したＣＲＢＣおよび抗体を加え、４時間インキュ
ベートした後上清を集め、その放射活性を測定した。３
回の培養の比標的物溶解率（ｓ　ｌ　Ｃｒの放出）を細
胞毒性パーセントとして表わす。それぞれの場合、ＣＲ
ＢＣに対する抗体を除くと、０−５％の細胞毒性を生じ
た。

ｂ：Ｅ　：Ｔ−エフェクタ一対標的の比実施例３　　ｏ
、−産生の増加 第２表に示す様に、正常な提供者からのＰＭＮは、１２
−β−ホルボール−１２−β−ミリステート−１３−α
−アセテート（ＰＭＡ）刺激後、有意な濃度のＯｔ−を
産生じた（非刺激０．４４ｎｍに対し、ＰＭＡ刺激２．
５９　；　ｐ＜　０．００１）。Ｐ　Ｍ　Ａは、ＰＭＮ
活性に効果があることが知られている。

０、−濃度は、ＰＭＡ刺激したものについて０．５７ｒ
＋ｍ０ｔ−から５．６ｒ＋ｎＯｔ＼培地対照群について
０〜１．３７ｎｍｏｔ−の範囲であった。これに対し、
３人の男性Ｘ−関連ＣＧＤｔｕＢｌ（ＤＤ、ＪＭによび
ＲＤ）からのＰＭＮは、ＰＭＡ刺激後、正常者に比較し
て有意に低い濃度のＯｔ−を産生した（それぞれ０．１
７ｎｍＯ，一対２．５９ｎｍＯｚ→（ｐ＜　０　、　Ｑ
Ｏｆ）。２人の女性ＣＧＤキャリヤー（ＪＲおよびＣＭ
）によって産生された０、−濃度は、正常者と有意差が
なかった。この結果は、３人の男性患者がＸ−関連ＣＧ
Ｄであるという臨床上の診断を裏付けした。以下の第２
表に、正常およびＣＯＤ提供者由来のＰＭＮによる０！
−産生を示す。

第２表 ａ：正常音については５０〜９０分間、ＣＯＤ者および
ＣＧＤギヤリヤーにフいては９０〜１２０分間、０．−
量を測定した。

ｂ：１５人の正常な提供台からの２０回の試験の結果の
平均値 ０．３人の男性Ｘ−関連ＣＧＤ提供台からの４回の試験
の結果の平均値 ｄ、２人のＣＯＤキャリヤーｔＤＪ者からの６回の試験
の結果の平均値 第３表に示１−だ様に、ヒト腫瘍壊死因子アルファは、
正常な提供台の末梢血液から得たＰＭＮにおいて、刺激
の６０分後、非処理対照群に比較してａ色な０１４１１
［：ヲ生シｊｊ（ｐ＜　０　、００１　）。ヒト腫瘍壊
死因子アルファおよび腫瘍壊死因子ベータ（リンホトキ
ンンとら呼ばれる）の両方が好中球活性を刺激するが、
ヒト腫瘍壊死因子アルファは、腫瘍壊死因子ベータより
大きい好中球活性の増大を示した。以下の第３表に、ｒ
Ｉ−１ｕＴ　Ｎ　Ｆ−αによる０、−産生を示す。

町−表− ａ、刺激の６０分後に測定した。

第４表に示した様に、ヒト腫１壊死因子アルファは、正
常咎、ＣＯＤキャリヤーおよびＸ−関連ＣＧＤ提供者か
ら得たＰＭＮを刺激し、非刺激対照群に比較して有意に
高い濃度の０．−を産生した。

Ｐ　Ｍ　Ａおよびヒト腫瘍壊死因子アルファの両者によ
って誘導される０、−は、過酸化物分子変位補酵素（Ｓ
ＯＤ）によって阻害され、それによって、測定された活
性が事実上Ｏｔ−であり、Ｘ−関連ＣＧＤ提供考からの
Ｐ　Ｍ　ＮがＯｆ−を産生じ得るということが証明され
た。以下の第４表に、ｒＨｕＴＮＦ−αで刺激した後の
０．−産生を示す。

寒す− ａ：刺激の６０〜９０分後にＯ２゛を測定した。結果は
、３〜４回の反復試験の平均値である。

ｂ３人の提供者からの３回の試験の平均値０１２人の提
供者からの２回の試験の平均値実施例４　食菌作用の刺
激 ヒト腫瘍壊死因子アルファの刺激によるＰＭＮ媒介食菌
作用の増大を調べた。第１図のＡおよびＢ枠に示した様
に、正常（ＭＷ）およびＣＯＤ（ＪＭ）の両提供音から
のＰＭＮはそれぞれ、ヒト腫瘍壊死因子アルファＩＯＵ
／ｍｌで刺激した後、食菌作用が高まった。これは、３
個以北の捕食されたラテックスビーズを合資しているＰ
ＭＮの数によって測定した。この結果は、ＣＯＤ提供音
からのＰＭＮは、０ｆｆｉ−発生系の欠陥にしかかわら
ず、正常な食菌作用を保持していることを証明１−でい
る。

ＣＯＤ提供者の免疫機能障害がＰ〜ＩＮの０２−発生系
に限定されているのか、またはサイト力インの産生にも
影響するのかを決定する）′：、めに、ＰＨＡ−Ｐ、Ｐ
〜ＩＡまたはＰ　ＨＡ　−Ｐ　／　Ｐ　ＭＡで刺激した
後、ＩＦＮ−γおよびＴ　Ｎ　Ｉ”−αを産生ずる末梢
血液中の単核細胞の能力を調べた。３回の実験の内の１
つの結果を第５表に示す。Ｉ！ｌ］ら、第５表は、正常
なＣＧＤキャリヤーおよびＣＯＤ提供者の末梢血液中単
核細胞による、インターフェ［７ンガンマおよび腫瘍壊
死因子アルファの産生を示す。

第５表 ａ、フィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＩ−Ｐ）を、１・
５００の終濃度で、１２−Ｂポルボール１２−Ｂミリス
テート１３−α−アセテート（ＰＭＡ）をｌｏｎｇ／ｍ
ｌで使用した。

ｂ：標準以下 正常よｊよびＣＧ　Ｉ）キャリヤーからのＰ　）Ｉ　Ｍ
　ＣをＰＭＡで刺激］また後、ナノグラムのＬ［のイン
ターフェロン−ガンマが産生されただけであっノー。し
かしながら、驚くべきことに、ＰＮＡ単独は、Ｘ−関連
ＣＯＤ患者（ＤＤおよび、ｉＭ）からのＰＢＭＣにおい
て高濃度のＩ　Ｆ　Ｎ−γの産生を刺激した（第３日に
は、Ｘ−関連ＣＯＤ提供名については３６１±２４７ｎ
ｇ／ｍｌであるのに対（２、正常およびＣＯＤキャリヤ
ーについては１．９５±０　、２　ｎｇ／１ｌｌＬ　ｐ
＜　０．００１であった）。更１４六　ｒ−’　ＨＡ　
−Ｐ／ＰＭＡで刺激されたＸ−関連ＣＯＤ提供考からの
ＰＢＭＣは、第３日（５７４ｉ１８１ｎｇ／ｍｌ対７３
±１６日ｇ／ｍｌ、　ｐ＜　０．００１）、および第１
および２日（データは示さず）に、正常’１ＵＺＩよＣ
ＯＤキャリヤーに比較して有きに多いインターフェロン
ガンマを産生じた。別の試験（第５表）では、腫瘍壊死
因子アルファの産生においても同様の増加が得られた。

即ち、ＰＭＡで刺激したＸ−関連ＣＯＤ提供者からのＰ
ＢＭＣは、第３日（５９５２±１３８９　ｐｇ／ｍｌ対
１５！対土５！０±７　ｐｇ／ｍｌｐ＜０．００１）、
および第１および２日（データは示さず）に、正常また
はＣＧＤキャリヤーに比較して有意に高いａ度の腫瘍壊
死因子アルファを産生した。これに対し、ＰＨＡ−Ｐ／
ＰＭＡで刺激したＣＧＤ、正常またはＣＯＤキャリヤー
提供者からのＰ　Ｂ　Ｍ　Ｃは、第３日（正常ＣＯＤキ
ャリヤー提供者にライて１１６６９±４７５０　ｐｇ／
＋ｎｌ対Ｘ−関連ＣＧＤについて＋１６１５±６１１７
ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝ｎｓ）、および第２日（データは示さ
ず）に、同等のレベルの腫瘍壊死因子アルファを産生じ
た。

Ｘ−関連ＣＧｏｎにおけるＰＨＡ−Ｐ／ＰＭＡ刺激後の
腫瘍壊死因子アルファの産生は、第１日（データは示さ
ず）のみ、有意に高かった。

これらの結果は、正常な提供者に比較して、ＣＯＤ提供
者からのＰ　Ｂ〜ＩＣは、マイトツエン（ｆｆｌｉｔｏ
ｇｅｎ）による刺激後、ＩＦＮ−γを産生するためのそ
の能力に種々の変化を示すということを証明している。

腫瘍壊死因子アルファの産生においても同様の変化か観
察された。ＣＧ　Ｉ）提供者からのＰＢＭＣはまた、Ｐ
ＭＡおよびＰ〜ＩＡ／ＰＨＡ−Ｐ刺激後、正常な提供者
からのＰＲＭＣに比較して、共に有意に高い濃度のＴＮ
Ｆ−αおよびＩＦＮ−γを産生じた。先の研究は、ＰＭ
Ａは、正常な提供者からのＰ　Ｂ　Ｍ　Ｃ培養において
マイトジェンとして作用し、これは単独では有意な濃度
のＩＦＮ−γまたはインターロイキン−２の産生を刺激
することはできないが、マイトジェンの存在下ではリン
ホカインの産生を有意に高めるということを示した（バ
ールシュタイン等（Ｐ　ｅａｒｌｓｔｅｉｎ、　Ｋ　。

Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　）、　Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ
５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｅｉｆｉｅｒｓ　２．８１−９１
（１９８３））。従ってこれらの結果は、正常な提供者
からのＰＢＭＣに比較し５て、ＣＯＤ患者におけるＰＢ
ＭＣの活性化に必要なシグナルには有意な差が存在する
ことを示しており、この病気における免疫機能障害は、
従来考えられていたより重大であるということを示唆し
ている（シーガル（Ｓｅｇａｌ、Ａ、　Ｗ、　）、Ｔｈ
ｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｊ　ｕｎｅ１５、＋３７８−１３
８２、（１９８５））。

ｕ１腫−カンジダ・アルビカンスによる好中球の活性化
に対する腫瘍壊死因子アルファの影響カンジダ・アルビ
カンスによるＰ〜ＩＮの活性化に対する、組換え腫瘍壊
死因子アルファの影響を調べた。先のデータは、非オプ
ソニン化菌糸に比較して、オプソニン化粒子（ザイモサ
ンまたは菌糸）によって誘導されたＰＭＮ応答に差があ
ることを示唆した。ＰＭＮを得、末梢血液から分離した
。Ｐ〜ＩＮを腫瘍壊死因子アルファｃｔｏｏ単位１０”
ＰＭＮ）と−緒に３０分間インキュベートした結果、過
酸化物（Ｏｆ−）の非刺激ベースライン放出に対する影
響は全く観察されなかった。ＰＭＮを腫瘍壊死因子アル
ファ（１００単位／　１０　ｓ）と−緒に３０分間ブレ
インキュベートすると、ザイモサン（２０，２％）、お
よびオンソニン化菌糸（３８，６％）および非オプソニ
ン化菌糸（４２，０％）によるＯｆ−の発生が増加する
。過酸化物（０，→放出の阻害剤として知られている百
日咳の毒素（ＰＴ）５００ｎｇ／ｍｌ　２時間、および
カルシウム（Ｃａ＋＋）キレート化（細胞内、有機緩衝
液ＢＡＰＴＡで負荷させることによる：細胞外、ＥＧＴ
Ａで負荷させることによる）。ＰＴを加えた、または加
えなかったＢ　Ａ　Ｐ　Ｔ　ＡまたはＥ　Ｇ　Ｔ　Ａは
、腫瘍壊死因子アルファの予備処理に関係なく、オンソ
ニン化ザイモサンに対するＰＭＮのＯ２一応答をほとん
ど完全に除＜（９５−９９％）。しかしながら、オプソ
ニン化されたか否かにかかわらず、菌糸によって腫瘍壊
死因子アルファ刺激ＰＭＮから誘導された呼吸激発応答
は、部分的に低下しただけであった（オンソニン化菌糸
対非オブソニン化菌糸によるそれぞれの阻害二ＰＴによ
り、２４．６＋４．３対２５．０＋２．４％、ＢＡＰＴ
Ａにより、２０．０＋８．４対４５．５＋４．９％、Ｅ
ＧＴＡにより、４７．３＋２．４対２７．５＋１．４％
、および３種全ての組み合わせにより、６８．９＋２．
８対５４．３＋３．３％）。全ての場合、即ち一連の条
件について、菌糸に対するＰＭＮの０２一応答は、腫瘍
壊死因子アルファによって有意に高められた（ｐ＜０．
０５）。これらのデータは、腫瘍壊死因子アルファは、
サイトソリツク（ｃｙｔｏｓｏｌ　ｉｃ）カルシウム濃
度の変化で、検出し得るカルシウムイオン流によって媒
介される「セカンド・メツセンジャー」応答またはＰＴ
−阻害能を有するグアニンヌクレオチド調節プロティン
の関係する活性化過程に近い部位において、ＰＭＮの呼
吸激発を高めるように作用するということを示唆してい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト腫瘍壊死因子アルファによる、正常（Ａ
）およびＣＧＤ（Ｂ）提供者からのＰＭＮの食菌作用の
活性化を示すグラフである。 特許出願人　ジェネンテク、インコーポレイテッド代理
　人　弁理士　青　山　葆　外１名宝光ａｆＡ（ＬｏＧ
ｌｏ） Ｆｉｇ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、感染症を有する患者に、腫瘍壊死因子アルファの治
   療的有効量を投与することを特徴とする感染症の治療方
   法。 ２、感染症が患者の食細胞の欠陥に関連する第１項に記
   載の方法。 ３、感染症が患者の多形核好中球の欠陥に関連する第１
   項に記載の方法。 ４、感染症が慢性肉芽腫症の結果生じる第１項に記載の
   方法。 ５、腫瘍壊死因子アルファを筋肉内投与する第１項に記
   載の方法。 ６、腫瘍壊死因子アルファを静脈内投与する第１項に記
   載の方法。 ７、腫瘍壊死因子アルファを局所投与する第１項に記載
   の方法。 ８、治療が更に抗生物質を含む第１項に記載の方法。