JPH0556794A - 生理活性ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 遺伝子組換えによるアスパラギン酸−プロリ
ン配列を有さない生理活性ペプチドの製造法であって、
アスパラギン酸−プロリン配列を介して保護ペプチド
と、当該生理活性ペプチドとを結合した融合蛋白をコー
ドする遺伝子を含有する発現ベクターによって形質転換
された細胞を培養し、得られる培養物より融合蛋白を採
取し、該融合蛋白のアスパラギン酸−プロリン結合を酸
を用いて切断することを特徴とするアスパラギン酸−プ
ロリン配列を有さない生理活性ペプチドの製造法。 【効果】 本発明方法によれば、ｈＢＮＰに代表される
低分子量の生理活性ペプチドを組換えＤＮＡ技術を用い
て、容易かつ、効率よく生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト脳性ナトリウム利
尿ペプチド（ｈｕｍａｎＢｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒｅ
ｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ，以下ｈＢＮＰと略す）に代表
される生理活性ペプチドを、組換ＤＮＡ技術を用いて効
率よく生産するための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、微生物、植物、動物等から数多く
の生理活性ペプチドが見出され、その医薬等への応用が
なされている。一般にこれらの有用な生理活性ペプチド
を生産する方法としては、見出された動物臓器等から分
離精製する方法、化学的な合成法及び組換えＤＮＡ技術
を用いて形質転換体の中で生産させる方法が行なわれて
いる。このうち、組換えＤＮＡ技術を用いた方法は、生
産コスト低減という観点から優れた方法であり、近年さ
らにその技術が進歩している。

【０００３】しかしながら、分子量の小さいペプチド
を、組換えＤＮＡ法を用いて生産しようとする場合、一
般的に翻訳産物が得られにくいので、発現しやすい他の
蛋白との融合蛋白として生産させた後、化学的あるいは
酵素的な処理を行い、その融合蛋白から目的とするペプ
チドを切り出し、精製する方法が用いられている。かか
る融合蛋白を生産し、当該融合蛋白から目的のペプチド
を切り出す方法としては、（１）目的のペプチドがメチ
オニン残基を含まない場合には、目的ペプチドをメチオ
ニン残基を介した融合蛋白として生産した後、臭化シア
ン処理によりメチオニン残基を開裂させて目的のペプチ
ドを切り出す方法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８，１０５９
（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７６，１０６（１９７８）〕が用いられて
おり、（２）目的のペプチドがアルギニンやリジン残基
を含まない場合には、アルギニンやリジン残基を介した
融合蛋白として生産した後、アルギニンやリジン残基の
Ｃ末端を特異的に切断するトリプシン処理で目的のペプ
チドを切り出す方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２８５，４５６
（１９８０）〕等が用いられている。また、（３）目的
のペプチドがリジン残基を含まない場合には、リジン残
基を介した融合蛋白として生産した後、リジン残基のＣ
末端を特異的に切断する酵素アクロモバクター（Ａｃｈ
ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼ−１で処理し目的
ペプチドを切り出す方法（特公昭５４−１３５７８９
号）等が用いられる。しかしながら目的のペプチド内に
メチオニン、リジン、アルギニンを含んでいた場合、こ
れらの方法を用いることは不可能である。

【０００４】ところで、ｈＢＮＰは、ナトリウム利尿作
用、降圧作用、平滑筋弛緩作用を有する生理活性ペプチ
ドであり、そのＤＮＡ配列が須藤、前川、松尾〔Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，
１５９，１４２７〜１４３４（１９８９）〕により明ら
かにされ、さらに南野、松尾〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６７，６９３〜
７００（１９９０）〕により実際にヒト心房から抽出製
造され、そのアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであ
ることが明らかにされている。また、このペプチドの生
化学的、薬理学的性質について多くの研究が活発に行わ
れており、中尾らは心疾患患者の診断薬及び治療薬とし
て非常に有望であることを明らかにしている〔Ｌａｎｃ
ｅｔ，３３５，８０１（１９９０）、Ｎｅｗ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３，７５７〜７５８（１９９
０）〕。この様な状況においてｈＢＮＰのより簡便、か
つ大量に製造できる方法の確立が強く望まれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このｈ
ＢＮＰは配列番号１に示した構造（配列番号１中、２個
のシステインは結合している）から明らかなように低分
子量で、かつメチオニン、アルギニン及びリジン残基を
含んでおり、従来の技術では製造が困難であった。従っ
て、本発明の目的は組換えＤＮＡ技術により融合蛋白を
生産し、得られる融合蛋白より目的ペプチドを効率的に
切り出して生理活性ペプチドを効率よく製造するための
方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは、そのアミノ酸配列中にアスパラギン酸−プ
ロリン（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）配列を有さない生理活性ペプ
チド（例えばｈＢＮＰ）にＡｓｐ−Ｐｒｏ配列を介して
他のペプチドが結合した融合蛋白を生産するように設計
された組換えＤＮＡを構築し、これを含有する発現ベク
ターを用いて当該融合蛋白を生産し、これを酸を用いて
処理すればＡｓｐ−Ｐｒｏ間の結合が特異的に切断さ
れ、目的とする生理活性ペプチドが効率よく得られるこ
とを見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は遺伝子組換えによるＡ
ｓｐ−Ｐｒｏ配列を有さない生理活性ペプチドの製造法
であって、アスパラギン酸−プロリン配列を介して保護
ペプチドと、当該生理活性ペプチドとを結合した融合蛋
白をコードする遺伝子を含有する発現ベクターによって
形質転換された細胞を培養し、得られる培養物より融合
蛋白を採取し、該融合蛋白のアスパラギン酸−プロリン
結合を酸を用いて切断することを特徴とする当該生理活
性ペプチドの製造法である。

【０００８】本発明方法により製造される生理活性ペプ
チドは、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列を有さないことが必要であ
る。これは、本発明が融合蛋白を酸を用いて処理すれ
ば、Ａｓｐ−Ｐｒｏの結合が選択的に加水分解を受け、
目的とする生理活性ペプチドが容易に得られることを利
用したものだからである。このような生理活性ペプチド
としては、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列を有さないものであれば
特に制限されないが、比較的分子量の小さいペプチドが
好ましい。例えば、ｈＢＮＰは分子量が小さく、かつ配
列番号１の如くＡｓｐ−Ｐｒｏ配列を有さないため特に
好ましい。

【０００９】本発明に用いられる保護ペプチドは、遺伝
子組換え技術により製造できることが確認されているも
のであれば特に制限されないが、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列及
びシステイン残基を有さないものが好ましい。ｈＢＮＰ
製造のための保護ペプチドとしては、例えばマウスイン
ターロイキン−１（ｍＩＬ−１）またはラットインター
ロイキン−１（ｒＩＬ−１）由来のポリペプチド断片を
含む５０〜１６０残基のアミノ酸からなるポリペプチド
が好ましい。

【００１０】本発明の製造法を実施するには、（Ａ）発
現ベクターの構築、（Ｂ）宿主の形質転換、（Ｃ）融合
蛋白の生産、次いで（Ｄ）融合蛋白から目的ペプチドの
切り出し及び精製の順に行われる。以下、この工程をそ
れぞれ説明する。

【００１１】（Ａ）発現ベクターの構築 発現ベクターを構築するには、まず生理活性ペプチドを
コードするＤＮＡ配列に、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列をコード
するＤＮＡ配列を結合させる。かかるＤＮＡ配列の結合
法としては、通常のＤＮＡ分子の結合法、例えばＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより目的フラグメントを結合する方法等
が利用できる。なお、目的とする生理活性ペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列の５’末端付近にＰｒｏをコードす
るＤＮＡ配列があれば、この上流のＤＮＡ配列をＡｓｐ
をコードするＤＮＡ配列に変異させることにより、Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ配列をコードするＤＮＡ配列を作製してもよ
い。かかる遺伝子の変異は、例えば市販のｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ キット等を用いて行う
ことができる。次いで、保護ペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列と、上記Ａｓｐ−Ｐｒｏ−生理活性ペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列とを結合させ、これをプロモータ
ー、転写開始点、ターミネータ等の蛋白の発現に必要な
塩基配列を有するベクター（好ましくはプラスミドベク
ター）に組み込む。

【００１２】ｈＢＮＰとｍＩＬ−１またはｒＩＬ−１と
の融合蛋白をコードする発現ベクターの構築は、例えば
次の如くして行われる。まず、ｈＢＮＰをコードするＤ
ＮＡ配列（配列番号１）にＡｓｐ−Ｐｒｏ配列をコード
するＤＮＡ配列を導入するには、この配列の５’末端の
Ｓｅｒに対応するコドンＡＧＣを、Ａｓｐに対応するコ
ドンＧＡＣに変換する。これにより、５’末端にＡｓｐ
−Ｐｒｏに対応するＤＮＡ配列が導入されたこととな
る。ｈＢＮＰの場合、このように変異されたＤＮＡを用
いて融合蛋白を製造し、これを酸を用いて切断すれば、
天然に存在するものよりも一つ鎖長の短いＢＮＰ（配列
番号２〔配列番号２中、２個のシステインは結合してい
る〕）が得られるが、このＢＮＰは天然ｈＢＮＰと同等
の生理活性を有する。得られた変異ｈＢＮＰをコードす
るＤＮＡ配列とｍＩＬ−１またはｒＩＬ−１をコードす
るＤＮＡ配列との結合は、後者ＤＮＡの３’末端のみを
エキソヌクレアーゼIII（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ II
I）とマング−ビーンヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ−ｂｅａ
ｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）で適当に消化して平滑末端化
し、その下流に変異ｈＢＮＰをコードするＤＮＡを結合
させることにより行われる。このようにして得られる組
換えプラスミドとしては、ｔｒｃプロモーター等のプロ
モーターの下流に、図３または図４で示されるｈＢＮＰ
と保護ペプチドとの融合蛋白をコードする遺伝子を組み
込んだものが好ましい。

【００１３】また、このような発現プラスミドの具体例
としては、５．１ＫｂｐであるｐＫＫｍＩｈＢ（図
１）、５．１ＫｂｐであるｐＫＫｒＩｈＢ（図２）及び
３．８ＫｂｐであるｐＵＣｍＩｈＢ（図３）が挙げられ
る。

【００１４】（Ｂ）宿主の形質転換 上記で得られた発現ベクターを用いて細胞を形質転換す
るには、常法、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム
法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２５０〜２
５３，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９８２）〕等により導入することがで
きる。宿主細胞としては、大腸菌、酵母などの微生物、
特に大腸菌が好ましい。

【００１５】（Ｃ）融合蛋白の生産 形質転換体を培養し、その培養菌体から融合蛋白が採取
できる。培養法は、形質転換体の種類により異なるが、
宿主大腸菌の場合には、液体培養が好ましい。また、融
合蛋白は、大腸菌の場合、菌体破砕懸濁液の上清から抽
出される場合と、不溶画分から抽出される場合がある
が、ｍＩＬ−１−ｈＢＮＰ（またはｒ−ＩＬ−１−ｈＢ
ＮＰ）融合蛋白は不溶画分に存在するので、高濃度の尿
素溶液、高濃度の塩酸グアニジン溶液、または、ＳＤＳ
溶液等で抽出できる。これらの方法で抽出した不溶画分
から融合蛋白を精製する方法としては、イオン交換カラ
ムや、ゲルろ過カラムも考えられるが、粗精製としては
有機溶媒を用いて脱脂した後透析し、析出した沈澱を集
める方法が簡便である。なぜならば低分子（分子量５０
００位まで）のペプチドは水溶液に可溶性である場合が
多く、沈澱中には低分子のペプチドが殆ど含まれていな
いため、次の切断反応によって生成し得るｈＢＮＰ（２
−３２）（分子量３３７６．８）等の目的ペプチドの他
に可溶性の夾雑ペプチドが殆ど生成しないため、目的ペ
プチドの精製は、容易であるからである。

【００１６】（Ｄ）融合蛋白からの生理活性ペプチドの
切り出し及び精製 得られた融合蛋白から目的とする生理活性ペプチドを切
り出すには、融合蛋白を酸処理すればよい。融合蛋白の
酸処理は、例えば融合蛋白の粗精製物を有機酸または無
機酸の水溶液に溶解することにより行われる。融合蛋白
が不溶性であることを考えると、好ましくは７０％の蟻
酸または６Ｍ塩酸グアニジンを含む１０％酢酸を用いる
のがよい。反応液からｈＢＮＰ等の生理活性ペプチドの
精製はゲルろ過やイオン交換カラムまたは逆相カラム等
を用い、常法によって行うことができるが反応液が酸と
高分子蛋白を多量に含むことを考えれば、完全な精製を
行う前に逆相ＯＤＳカラムにより脱塩と高分子タンパク
の除去を同時に行うことにより、粗精製し、その後高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分取にて最
終精製を行うのがよい。

【００１７】

【実施例】以下、本発明の製造法について、ｈＢＮＰの
製造法を例にとり実施例をもって説明する。 実施例１．アミノ酸改変を目的としたＤＮＡの塩基置換 ｈＢＮＰを含むポリペプチドのＣ末端から３２番目のＳ
ｅｒをＡｓｐに変換することを目的として、ｈＢＮＰ遺
伝子を含むプラスミドｐＵＣ１１９−ｈＢＮＰのｈＢＮ
Ｐ遺伝子内に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ（ＴＡＫＡＲＡ製キット Ｍｕｔａｎ−Ｋ）により
塩基置換を行い、変異を入れた。ここで用いた大腸菌Ｍ
Ｖ１１８４株、ＢＷ３１３株、ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔ
Ｓ株、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７株はキットに添付
されているものを用いた。また用いたミューテーターは
２７個の塩基からなるオリゴマー（式１）で、ＤＮＡシ
ンセサイザーモデル３８０Ａ（Ａｐｐｌｙｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。

【００１８】

【化１】

【００１９】ＳｅｒをＡｓｐに変換するにはＳｅｒのコ
ドンＡＧＣをＡｓｐのコドンＧＡＣに変換すればよい。
常法によりｐＵＣ１１９−ｈＢＮＰの塩基置換反応を行
い、その反応生成物で大腸菌ＢＭＨ７１−１８株を形質
転換した。アンピシリン培地上に形成された多数のコロ
ニーからコロニーハイブリダイゼイション法を用いて塩
基置換されたプラスミドをもっていると思われるクロー
ンを選択し、さらにこれらのクローンより抽出したプラ
スミドの塩基配列の決定を行うことにより、期待される
変異プラスミドを選択した。

【００２０】実施例２．ｐＫＫｍＩｈＢの作製 図４の手順に従い、発現プラスミドｐＫＫｍＩｈＢを作
製した。すなわち、ｈＢＮＰ遺伝子を含むプラスミドｐ
ＵＣ１１９−ｈＢＮＰを、ＥｃｏＲＩとＨａｅIIで完全
に分解し、これをクレノー断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）で処理し、制限酵素切断端を平滑末端とし
た。そしてアガロースゲルで電気泳動を行って０．７Ｋ
ｂｐのｈＢＮＰＤＮＡ断片を回収した。またポリメラー
ゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりクローニン
グしたｍＩＬ−１遺伝子を発現ベクターｐＫＫ２３３・
２（ファルマシア製）に導入して、ｐＫＫ２３３・２−
ｍＩＬ−１を構築した。このｐＫＫ２３３・２−ｍＩＬ
−１をＨｉｎｄIIIで完全に分解し、クレノー断片処理
を行いＨｉｎｄIII切断面を平滑化した。これを分離ア
ガロース電気泳動によって５．１Ｋｂｐの断片として回
収した後、アルカリ性フォスファターゼ処理により脱リ
ン酸化した。次にｍＩＬ−１の３’末端側にｈＢＮＰを
連結させるため、さきに回収した０．７ＫｂｐのｈＢＮ
Ｐ遺伝子断片と、その後回収したＨｉｎｄIII消化ｐＫ
Ｋ２３３・２−ｍＩＬ−１遺伝子断片をライゲーション
し、その反応生成物を用いて大腸菌（ＭＣ１０６１株）
を形質転換した。この形質転換菌より回収したプラスミ
ドを用いてｐＫＫｍＩｈＢを製造するために図４に示す
ような処理を行い、２種類のＤＮＡ断片を回収した。先
ず第一にこのプラスミドをＡｆｌIIで消化し、マング−
ビーンヌクレアーゼを用いて平滑末端化した後、Ｐｖｕ
Ｉで完全に分解した。これを分離アガロースゲル電気泳
動を行い１ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次にもう一
つは、このプラスミドをＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩで完全に
分解し、これをエキソヌクレアーゼIIIで適当に消化
し、生じた一本鎖部分をマング−ビーンヌクレアーゼで
平滑末端化した後、ＰｖｕＩで完全に分解した。これを
アガロースゲルで電気泳動し４ＫｂｐのＤＮＡ断片とし
て回収した。先ほど回収した１ＫｂｐのＤＮＡ断片と、
後で回収した４ＫｂｐのＤＮＡ断片とをライゲーション
させた後、この反応生成物で大腸菌（ＭＣ１０６１株）
を形質転換し、アンピシリン耐性のクローンを得た。生
成した形質転換細胞からプラスミドを回収しＤＮＡ塩基
配列の決定を行い、目的とする正しい読み枠を持つクロ
ーンを選択した。またそれらの大腸菌の全蛋白をポリア
クリルアミド電気泳動で調べ、新しい蛋白を産生してい
るクローン〔ＭＣ１０６１／ｐＫＫｍＩｈＢ（微工研菌
寄第１２４２４号）〕を選択した。

【００２１】実施例３．ｐＫＫｒＩｈＢの作製 図５の手順に従い、発現プラスミドｐＫＫｒＩｈＢを作
製した。すなわち、ｐＫＫｒＩｈＢの作製はｐＫＫｍＩ
ｈＢの作製と同様な要領で行った。先ずｐＫＫｍＩｈＢ
をＮｃｏＩとＰｖｕＩで完全に消化しアガロースゲル電
気泳動を行い１．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ま
たＰＣＲ法によりクローニングしたラットインターロイ
キン−１（ｒＩＬ−１）遺伝子を発現ベクターｐＫＫ２
３３・２に組み入れた発現プラスミドｐＫＫ２３３・２
−ｒＩＬ−１を構築した。これをＮｃｏＩとＰｖｕＩで
完全消化し４Ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を回収した。これ
ら二つのＤＮＡ断片をライゲーションして生じた５．９
Ｋｂｐのプラスミドを回収した。このプラスミドを用い
てＸｍａＩで消化しクレノー断片で平滑化した後Ｅｃｏ
ＲＶで完全に分解した。その後アガロースゲル電気泳動
を行い５．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収し、セルフライ
ゲーションを行ってｒＩＬ−１とｈＢＮＰの融合蛋白を
作るプラスミドを構築した。またこのプラスミドも目的
とする正しい読み枠を持っていることを確認し、形質転
換された大腸菌〔ＭＣ１０６１／ｐＫＫｒＩｈＢ（微工
研菌寄第１２４２３号）〕内に新しい蛋白が産生してい
ることも確認した（図６）。

【００２２】実施例４．ｐＵＣｍＩｈＢの作製 図７の手順に従い、高発現プラスミドｐＵＣｍＩｈＢを
作製した。すなわち、大腸菌を用いた系において蛋白を
効率よく発現させるには、（１）プロモーター能の強
化、（２）プラスミドコピー数の増大等が考えられる。
前者については、ここで用いているｔｒｃプロモーター
は強力なプロモーターであり、ＩＰＴＧで転写能の誘導
もできる。後者についてであるが、コピー数の多いプラ
スミドとしてすでにｐＵＣシリーズが市販されておりこ
れらはコピー数を制御しているｒｏｐ蛋白遺伝子を除去
してある。これに改良を加えて高発現ベクター化する発
想は三木（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
１ １９８７）らによって示された。しかし彼らの方法
は、数カ所のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓを含む複雑なものであるため、我々は独自に開発し
た。図７にプラスミドの構築法を示すが、ｐＵＣ１９を
ＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIで完全に消化し、エキソヌクレ
アーゼIIIとマング−ビーンヌクレアーゼを作用させた
後、セルフライゲーションを行い、その反応生成物で大
腸菌（ＭＣ１０６１株）を形質転換した。出現したコロ
ニー（複製起点は削られていない）からプラスミドを採
り出し、この中からｌａｃプロモーターが除かれている
ものを塩基配列の決定を行い選び出した。このプラスミ
ドを、ＰｖｕＩとＢａｍＨＩで完全に消化した後、アガ
ロースゲル電気泳動により１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を
回収した。また発現プラスミドｐＫＫｍＩｈＢをＰｖｕ
ＩとＢａｍＨＩで完全に消化し、アガロースゲル電気泳
動により１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これら
二つのＤＮＡ断片をライゲーションし、この反応生成物
で大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。ＩＰＴＧを
含むＭ９培地でこの形質転換菌〔ＪＭ１０９／ｐＵＣｍ
ＩｈＢ（微工研菌寄第１２４２５号）〕を培養した結
果、融合蛋白の高発現が認められた（図８）。

【００２３】実施例５．蟻酸によるｈＢＮＰ（２〜３
２）の切り出し及び精製 実施例２で作成されたｐＫＫｒＩｈＢによって形質転換
された大腸菌ＭＣ１０６１（ＭＣ１０６１／ｐＫＫｒＩ
ｈＢ）をアンピシリンを含むＬ培地（バクトトリプトン
１％、バクトイースト菌抽出物０．５％、塩化ナトリウ
ム１％、pH７．４）で３７℃１６時間２０ｌ容量のジャ
ーファメンターで培養した。次に遠心集菌した菌体１ｌ
分（４．４ｇ）を２０mlリン酸緩衡液に浮遊させホモジ
ナイザー（Ｐｈｙｓｃｏｔｒｏｎ）を用いて破砕した後
超音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ；Ｈｅａｔｓｙｓｔｅ
ｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）を行い、遠心
して沈澱画分を得た。この操作を２回行った。そしてこ
の沈澱画分に２０ml ６Ｍ塩酸グアジニン（pH８．０）
を加えホモジナイザーで破砕し超音波処理を行って溶解
した。この溶液に水飽和エーテルを加え超音波処理をし
て遠心後塩酸グアニジン溶解相を回収した。つぎに２０
mlクロロホルムを加え超音波処理を行って遠心し再び塩
酸グアニジン相を回収した。この操作により脱脂を行っ
た。これを２０ｍＭトリス緩衡液（pH８．０）に対して
透析を行い再び析出した沈澱を遠心により回収した。こ
の沈澱の５分の１をとり、５０％蟻酸４mlに溶解し４０
℃で２４時間放置した。この溶液を水で１００倍希釈し
て１０mlのＯＤＳ樹脂（ＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰＷ−Ｃ−
ＯＤＳ、ケムコ製）に吸着させた後０．１％トリフルオ
ロ酢酸でよく洗浄し０．１％トリフルオロ酢酸を含む６
０％アセトニトリルで溶出した。これを減圧濃縮し、析
出した沈澱を遠心分離により取り除いた後、逆相カラム
にかけた。条件（カラム：ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １２０
３Ｃ１８ φ４．６×７５mm、流速：１ml／min、溶
媒系：（Ａ）水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ
酢酸＝９０：１０：１、（Ｂ）水：アセトニトリル：１
０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１、（Ａ）：
（Ｂ）＝１００：０を２分間流した後（Ａ）：（Ｂ）＝
９５：５から（Ａ）：（Ｂ）＝０：１００への８０分の
直線グラジエントをかけた）。２８分に溶出されたピー
クを分取し減圧濃縮して２７μｇのｈＢＮＰ（２−３
２）を得た。ＨＰＬＣチャートを図９に示す。得られた
ｈＢＮＰ（２−３２）のＨＰＬＣ上での保持時間は別途
合成したｈＢＮＰ（２−３２）のそれと一致した。ま
た、本実施例で得られたｈＢＮＰ（２−３２）をピコタ
グ−アミノ酸分析装置（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いてアミ
ノ酸組成を分析したところｈＢＮＰ（２−３２）のアミ
ノ酸配列から予測される値と一致した。分析値を表１に
示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】更にプロテインシークエンサーモデル４７
０Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）により分
析した本実施例で得られたｈＢＮＰ（２−３２）のアミ
ノ酸配列は別途合成したｈＢＮＰ（２−３２）のそれに
一致した。分析結果を図１０に示す。

【００２６】実施例６．ヒヨコ小腸による平滑筋弛緩活
性の測定 得られたｈＢＮＰ（２−３２）が別途合成したｈＢＮＰ
（２−３２）、ｈＢＮＰ（１−３２）と同等の平滑筋弛
緩作用を持つことを以下のようにして確認した。ヒヨコ
（４〜７日齢）の直腸を摘出し３mlオルガンバスを用い
てクレグス−ヘンスレイト栄養液中に浸した。オルガン
バス中の栄養液には９５％Ｏ₂−５％ＣＯ₂ ガスを通じ
３２℃に保温した。筋標本には０．５ｇの静圧をかけ約
３０分程度静置し、筋の自動運動が安定したところでペ
プチドを投与し、８〜１０分間筋の弛緩を測定した。結
果を図１１に示す。図１１中、Ａ〜Ｃはヒヨコ直腸標本
に、本実施例で製造したｈＢＮＰ（２−３２）、別途合
成したｈＢＮＰ（２−３２）及びｈＢＮＰ（１−３２）
１５０〜２００ｎｇをそれぞれ投与したときの弛緩長さ
の経時変化を示している。

【００２７】実施例７．１０％酢酸によるｈＢＮＰ（２
−３２）の切り出し及び精製 実施例３と同様に１ｌの培養液より取り出した大腸菌を
破砕し粗融合蛋白を抽出、脱脂、透析し、その沈澱の１
０分の１を６Ｍ塩酸グアニジンを含む１０％酢酸（ピリ
ジンを用いてpHを２．５に調整したもの）４mlに溶かし
３日間４０℃で放置した。その反応液の２分の１を実施
例３と同様に脱塩、除蛋白し、逆相カラムにかけた。条
件（カラム：ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １２０ ３Ｃ１８φ
４．６×７５mm、流速１ml／min：溶媒系：（Ａ）水：
アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝９０：１
０：１、（Ｂ）水：アセトニトリル：１０％トリフルオ
ロ酢酸＝４０：６０：１、（Ａ）：（Ｂ）＝１００：０
を４分間流した後（Ａ）：（Ｂ）＝０：１００への４０
分の直線グラジエンドをかけた）。約２２分に溶出され
たピークを分取し減圧濃縮して４μｇのｈＢＮＰ（２−
３２）を得た。ＨＰＬＣチャートを図１２に示す。得ら
れたｈＢＮＰ（２−３２）のＨＰＬＣ上での保持時間は
別途合成したｈＢＮＰ（２−３２）のそれと一致した。

【００２８】

【発明の効果】本発明方法によれば、ｈＢＮＰに代表さ
れる低分子量の生理活性ペプチドを組換えＤＮＡ技術を
用いて、容易かつ、効率よく生産することができる。

【００２９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp 5 10 15 Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30

【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg 5 10 15 Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30

【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：８８８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列 TCAGCACCTT ACACCTACCA GAGTGATTTG AGATACAAAC TGATGAAGCT CGTCAGGCAG 60 AAGTTTGTCA TGAATGATTC CCTCAACCAA ACTATATATC AGGGAGTGGA CAAACACTAT 120 CTCAGCACCA CTTGGTTAAA TGACCTGCAA CAGGAAGTAA AATTTGACAT GTATGCCTAC 180 TCGTCGGGAG GAGACGACTC TAAATATCCT GTTACTCTAA AAATCTCAGA TTCACAACTG 240 TTCGTGAGCG CTCAAGGAGA AGACCAGCCC GTGTTGCTGA AGGAGTTGCC AGAAACACCA 300 AAACTCATCA CAGGTAGTGA GACCGACCTC ATTTTCTTCT GGAAAAGTAT CAACTCTAAG 360 AACTACTTCA CATCAGCTGC TTATCCAGAG CTGTTTATTG CCACCAAAGA ACAAAGTCGG 420 GTGCACCTGG CACGGGGACT GCCCTCTATG ACAGACTTCC AGATGCACCC GCTGGGCAGC 480 CCCGGTTCAG CCTCGGACTT GGAAACGTCC GGGTTACAGG AGCAGCGCAA CCATTTGCAG 540 GGCAAACTGT CGGAGCTGCA GGTGGAGCAG ACATCCCTGG AGCCCCTCCA GGAGAGCCCC 600 CGTCCCACAG GTGTCTGGAA GTCCCGGGAG GTAGCCACCG AGGGCATCCG TGGGCACCGC 660 AAAATGGTCC TCTACACCCT GCGGGCACCA CGAGACCCCA AGATGGTGCA AGGGTCTGGC 720 TGCTTTGGGA GGAAGATGGA CCGGATCAGC TCCTCCAGTG GCCTGGGCTG CAAAGTGCTG 780 AGGCGGCATT AAGAGGAAGT CCTGGCTGCA GACACCTGCT TCTGATTCCA CAAGGGGCTT 840 TTTCCTCAAC CCTGTGGCCG CCTTTGAAGT GACTCATTTT TTTAATGT 888

【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：７３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列 ATGTCAGCAC CTCACAGCTT CCAGAATAAT TTGAGATACA AATTGATAAG GATCGTCAAG 60 CAGGAGTTCA TCATGAATGA TTCCCTCAAC CAAAATATAT ATGTGGATAT GGACAGAATA 120 CATCTCAAAG CTGCTTCGTT AAATGACCTG CAGCTTGAAG TAAAATTTGA CATGTATGCC 180 TACTCATCGG GAGGAGACGA CTCTAAATAT CCTGTGACTC TCAAAGTCTC AAATACTCAG 240 CTCTTTGTGA GTGCTCAGGG AGAAGACAAG CCTGTGTTGC TGAAGGAGAT TCCGGAAACA 300 CCAAAACTCA TCACAGGTAG TGAGACCGAC CTCATTTTCT TCTGGGAAAA AATCAACTCT 360 AAGAACTACT TCACATCCGC AGCTTTCCCA GAGCTGTTAA TTGCCACAAA AGAACAAAGT 420 CAGGTGCACC TGGCACGGGG ACTGCCCTCC ATGATAGATT TCCAGATCCG GGAGGTAGCC 480 ACCGAGGGCA TCCGTGGGCA CCGCAAAATG GTCCTCTACA CCCTGCGGGC ACCACGAGAC 540 CCCAAGATGG TGCAAGGGTC TGGCTGCTTT GGGAGGAAGA TGGACCGGAT CAGCTCCTCC 600 AGTGGCCTGG GCTGCAAAGT GCTGAGGCGG CATTAAGAGG AAGTCCTGGC TGCAGACACC 660 TGCTTCTGAT TCCACAAGGG GCTTTTTCCT CAACCCTGTG GCCGCCTTTG AAGTGACTCA 720 TTTTTTTAAT GT 732

【図面の簡単な説明】

【図１】発現プラスミドｐＫＫｍＩｈＢの説明図であ
る。

【図２】発現プラスミドｐＫＫｒＩｈＢの説明図であ
る。

【図３】発現プラスミドｐＵＣｍＩｈＢの説明図であ
る。

【図４】発現プラスミドｐＫＫｍＩｈＢの構築手順を示
す図である。

【図５】発現プラスミドｐＫＫｒＩｈＢの構築手順を示
す図である。

【図６】実施例３における大腸菌破砕物のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す写真である。（Ａ）におけるレーン１
は蛋白マーカーを、レーン２はＭＣ１０６１の全蛋白
を、レーン３はｍＩＬ−１を発現しているＭＣ１０６１
の全蛋白を、レーン４はｍＩＬ−１・ｈＢＮＰ融合蛋白
を発現しているＭＣ１０６１の全蛋白を示す。（Ｂ）に
おけるレーン１は蛋白マーカーを、レーン２は融合蛋白
を発現しているＭＣ１０６１の全蛋白を、レーン３はレ
ーン２の蛋白をリン酸緩衝液で洗浄した上清を、レーン
４はレーン２の蛋白をリン酸緩衝液で洗浄した沈澱を示
す。

【図７】発現プラスミドｐＵＣｍＩｈＢの構築手順を示
す図である。

【図８】実施例４における大腸菌破砕物のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す写真である。レーン１は蛋白マーカー
を、レーン２〜７は融合蛋白高発現ＭＣ１０６１の全蛋
白を、レーン８は非発現型ＭＣ１０６１の全蛋白を示
す。

【図９】実施例５で融合蛋白を蟻酸処理することにより
切り出されたｈＢＮＰのＨＰＬＣパターンを示す図であ
る。

【図１０】実施例５で得られたｈＢＮＰのアミノ酸配列
結果を示す図である。

【図１１】実施例５で得られたｈＢＮＰの平滑筋弛緩活
性の測定結果を示す図である。

【図１２】実施例６で、融合蛋白を酢酸処理することに
より切り出されたｈＢＮＰのＨＰＬＣパターンを示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＵ 8314−4Ｃ ＡＣＸ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/10 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 泉 篤志 茨城県竜ケ崎市向陽台３丁目３番１号 第 一化学薬品株式会社つくば工場探索合成グ ループ内 (72)発明者 須藤 哲司 茨城県竜ケ崎市向陽台３丁目３番１号 第 一化学薬品株式会社つくば工場探索合成グ ループ内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子組換えによる、アスパラギン酸−
   プロリン配列を有さない生理活性ペプチドの製造法であ
   って、アスパラギン酸−プロリン配列を介して保護ペプ
   チドと、当該生理活性ペプチドとを結合した融合蛋白を
   コードする遺伝子を含有する発現ベクターによって形質
   転換された細胞を培養し、得られる培養物より融合蛋白
   を採取し、該融合蛋白のアスパラギン酸−プロリン結合
   を酸を用いて特異的に切断することを特徴とするアスパ
   ラギン酸−プロリン配列を有さない生理活性ペプチドの
   製造法。
2. 【請求項２】 生理活性ペプチドが、ヒト脳性ナトリウ
   ム利尿ペプチドである請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 生理活性ペプチドが、配列番号２で表わ
   されるアミノ酸配列よりなるものである請求項１記載の
   製造法。
4. 【請求項４】 保護ペプチドが、マウスインターロイキ
   ン−１またはラットインターロイキン−１を含むポリペ
   プチドである請求項１記載の製造法。
5. 【請求項５】 配列番号３または４で表わされるＤＮＡ
   配列を組み込んだ組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 図１で示される構造を有するｐＫＫｍＩ
   ｈＢ、図２で示される構造を有するｐＫＫｒＩｈＢ、及
   び図３で示される構造を有するｐＵＣｍＩｈＢから選ば
   れる請求項５記載の組換えプラスミド。