JPS60149397A - インタフエロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 現在、形質転換微生物による、真核生物蛋白の発現効率
は、種々の要因によって影響７受けることが矧られてい
る。蛋白発現ビ規定し、支配している、最も重要な要因
の中の２つとして、ｍＲＮＡに挿入された遺伝子ン細菌
佃胞が転写する正確さ、と、細菌のリボ・戸−ムにより
、このｍＲＮＡか由月訳される効率を挙げることができ
る。一般に発現という言葉で知られている、転写とｎ＋
４４訳の効率は、ベクターＤＮＡ上の、クローン化され
た遺伝子の前に、定型的に（ｉ置する、ヌクレオチ１配
列に依存していると信じられている。これらの発現制御
配列には、大部分、ＲＮＡポリメラーゼと７１目互作用
して、転写を開始するプロモーター／オペレータ一部位
と、リボ・戸−ムが結合し、ｍ：ＲＮＡと４■互作用の
もとに、蛋白への翻訳欠開始する、リボ・アーム結合部
位（ＲＢＳ　）とが含まれている。

フ０ラズミド上に自然に存在するものとは異なった、各
１東の発現制御配列ン用いて、先行技術で真核生′１２
）ノの蛋白及び釧閑宿主中でのポリペプチド類の発現の
１ｌｉ１１ｆＩＩ→１方法が改良されてきた。これらの
例として（・ま、大腸菌の乳糖オペロンの、オペレータ
ー、）０ロモーター、リボ・アーム結合並びに相互作用
配列の利用、大腸菌のトリプトファン合成酵素系の相当
する配列及び、バクテリオ　ファージλ（ラムダ）の主
要オペレーター及びプロモーター領域（Ｈ，Ｂｅｒｎａ
ｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　５．５ｑ−７６（１
９７９））の利用ン挙げることかでさる。

ラムダ　ファージのブロモ−ターン、原核生物中にクイ
ローン化した真核生物及び原核生物蛋白の発現に利用し
てきた。ＰＬのプロモーターｍ　性力（１６’＞度感受
性リプレッサーを規定する温度ｊｉ＆受性遺伝子の存在
下で低温で抑制されるが、原核生物の蛋白乞発現する１
余には・典誘導で活性化できることがわかった。このゾ
ロモークー系欠利用する、先行技術の例は、１９８１年
４月１日提出のヨーロッパ特許用ｈ）ｆＪＢ　１３０１
４１３．１及び、Ｄｅｒｙｎｃｋ等のＮａｔｕｒｅ　２
３７．１９３−１９７（１９８０）の１又である。これ
らの参考資料では、ＰＬフ０ロモーター系ン、繊維芽細
１泡インターフェロンの如ぎ真核生物蛋白の発現に、全
細菌リボ・アーム結合部位と共に利用した。大腸菌で真
核生物の遺伝子を発現するために、真核６田胞Ｊ且伝子
上刃」Ｉ＆当な調節信号が欠除していることン克服する
目的で、２つの研究方法が組み換えＤＮＡ技術を利用し
て用いられてきた。即ち（１）細雨遺伝子のコードして
いる部位、即ち、β−ラクタマーービ遺伝子、内に、真
核細胞遺伝子のコードする配列馨挿入し、大腸菌遺云子
の全ＲＢＳン利用する方法、或いは、（２１５ｈｉｎｅ
　−Ｄａｌｇａｒｎｓ　（Ｓ　Ｄ　）配列、ＳＤ配列に
近接する（５′一方向に上流側）配列およびＡＵＧ開始
コドンと真核細胞ＤＮＡに由来する残りのコード配列よ
り成るいで わゆるバイブ１１　Ｆ　ＲＢＳ　ｙ構築することである
。

ＳＤ配列は塩基が、真核生物遺伝子のためのプロモータ
ーと、ｉｉ！４１訳１；１」始暗号の間に位置していて
、１６　Ｓ　ＩＪボ・戸−ムＲＮＡの６′−末端にある
祷基に対し泪ｔｎｊ的であるような、６から９塩基より
成る配列のことである。初めの方法の主な欠点は、融合
ポリペプチドの化ｆｆ１ｖ来たすこと、即ち、遺伝子生
成物の一部が、大腸菌ＤＮＡそして一部が真核生！Ｉ／
ＩＪＤＮＡによりコードされるということである。

第二の方法で、貝正で成熟した（プリ配列の付加されて
いない、完全で生物学的に活性な）、天然て生産される
、即ち、真核細胞で生産されるものと同一の遺伝子生産
物装作ることに成功した（　Ｄｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｇｅｎｅ　１７．５４−５５（１９８２）；及びＧ
ｈｅｙｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　、　１７．
５５−＜５３（１９８２））。

現在まで、両方法乞使って、白血球、繊維芽細胞、及び
免疫、の如き種々のヒト　インターフェロン種の発現が
試みられてきた。繊１碓芽細胞インターフェロン（工Ｆ
Ｎ−β）ン発現させる研究で、上述のＧｈｅｙｓ　ｅｎ
等はＰＬゾロモーター系と共に第一の方法（全細胞ＲＢ
Ｓ　）　ｑ利用した。この文献には生物学的に活性で、
非融合蛋白が得られたとあるが、そのＩＦＮ−β遺伝子
が、適当な紬訳開始配列ビ持っていない以上、融合工Ｆ
Ｎ−β蛋白が、細胞内で未知の非効率的機構による細胞
の処理工程の結果得られたものであることは明白である
。更にこの文献から明らかなことは、真核生物遺伝子産
物が、真核生物遺伝子の信号部分によりコーげされたア
ミノ酸配列を含んでいたことである。従って成熟形イン
ターフェロンは発現されていない。

以下の文献、Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ
　２９５．５０３−５０８（１９８２）、及び５ｈｅｐ
ａｒｃＬ　ｅｔａ’ｌ、、、　ＤＮＡ　１．１　２５−
１３１　（１９８２）、では、第二の方法６ハイプリド
ＲＢＩ３　”が用いられている。

しかしながら、これらの文献からも解るように、発現は
大腸菌のｔｒｐ　７°ロモーターの支配下にあり、バイ
ブリドＲＢＳは真核生物遺伝子のＡＴＧとＳＤ及びｔｒ
ｐ　ＩＪ−ダーのリンカ−配列由来であった。更に、こ
の両文献では、ＳＤ配列とＳＤ配列に近接（５′一方位
で上流）の配列は、未変化のま＼残うた。唯一の変化は
、リンカ−領域にあった。即ち、ＳＤ配列とＡＴＧコド
ン間のヌクレオチドの故と組成の変化である。

先行技術では、クロニン化した真核生物遺伝子の発現ぞ
選択的に増加させるに必要な融通性のあるハイプリー　
リボ・戸−ム結合部位ンデデインし組上げる方法が欠け
ていた。更に先行技術では、温度感受性プロモーター系
を使い、融合蛋白の独立した細ＩＩＩ処理工程ビ使わず
に、クローン化した真核生物遺伝子蛋白ケ、成熟した形
で発現される１口１］１卸法が欠けていた。

本発明は、改良したベクターや、成熟した人の白血球、
１載維芽細胞及び免疫インターフェロンの如キ、インタ
ーフェロン類ンコー−している、クローン化した遺伝子
の、宿主細歯細胞内での発現乞制御する方法７用いるこ
とにより、前述の様な、先行技術の欠点乞克服するもの
である。

広義に述べれば、本発明は原核生物に、ラムダパクテリ
オファーゾより分離したプロモーターとオペレーター遺
伝子、温度感受性（ｔｓ　）　ＩＪゾレッサー蛋白乞コ
ード１−る、ラムダ　ファージから分離した他の遺伝子
ＣＩ、ラムダファージのプロモーター／オペレーターの
向配列と関連１−る、ハイブリド　リボ・戸−ム結合部
泣、及び、ヒト　インターフェロンをコードする真核生
物の追云子乞供給することン特徴とする、ヒト白血球、
１或、碓芽細胞及び免疫インターフェロン蛋白の製造方
”法に関する。本発明は、生物により発現された成熟真
核生物蛋白ケ、成熟蛋白の活性に影響ビ与えることなく
放出させるため、１ａ生物細胞壁ン開くための宕圀方法
に関するものである。

本発明は好ましくは人の免疫インターフェロンノ如キイ
ンターフェロンの発現ン以下の方法により堤供する。

ａ）宿主生’ＩＩＹバクテリオファージλ由来のゾロモ
ーター及びオペレーターＤＮＡ配列、ノ１イゾリドリボ
デーム結合部位ＺコードするＤＮＡ配列および好ましく
は、人の免疫インターフェロンの如き、インターフェロ
ンンコ−１するＤＮＡ配列を含有するインターフェロン
発現ベクターおよび場合によりλバクテリオファージ由
来の変異Ｃエリプレッサー遺伝子で形゛菌転換し、この
変異遺伝子は温度感受性リゾレンサ蛋白乞コードするも
のであり、ｂ）　ステップａ）の発現ベクターによりコ
ー−されているインターフェロン乞生産づ−るような培
地で形・貢転換生９勿ン生育させ、 Ｃ）生￥／Ｊ乞直菌し、 ｄ）生成したけ間物からインターフェロンを回収するこ
とからなる方法である。

本発明の好ましい実施態様では、発現ベクターか或いは
、宿主が、染色体上に、λ７々クテリオファージ由来の
、変異ｃＩ　１７７０レッサー遺伝子乞含み、その変異
遺伝子は、温度感受性リゾレッサー蛋白乞コードしてい
る。また、上記で規定した如きインターフェロンの生産
工程では、宿主に遺伝子を発現させろことができ、又、
ステップ（ａ）の発現ベクターと充分に共存できる、別
の複製可能なベクターで形質転換することにより、１亥
変異リプレツサー遺伝子を供給する。

上記操作のステップ（ｂ）の４．１６１８胞乞衆知の方
法で集め、緩衝液にけん濁した後高ｌ！ｉする。こ＼で
用いられる各画という言葉は、宿主の１聞胞壁馨開くた
めのブ栗作乞示すもので、好ましくは酵素的に行なわれ
るが超音波的、醗（裁的或いは同業者に知られ、゛又用
いられている他のいかなる方法によっても行われる。イ
ンターフェロンは、同業者ニより知られるたん山積製の
手法、例えば碗気泳動或いはクロマトグラフィー（たと
えばｊ冗１本アフィニティー　クロマトグラフィー）、
により高菌〆夜より回収される。本発明で好ましい遺伝
子はヒト免疫インターフェロンの成熟型娑コーげし、即
ちフ０し自己タリ乞有していないものである。

本明細書および特許請求の範囲（で用いられる略語およ
び用語は特に説明のない限り、同業者Ｋ　一般に用いら
れ、知られているものである。

本発明に係るヒト免疫インターフェロンは次のＤＮＡ配
列によりコードされる。

（５’）ＴＧＴ　ＴＡＣＴＧＯＯＡＧ　ＧＡＣＱＣ！Ａ
　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡＧＯＡ　ＧＡＡ　Ａ
ＡＯＣ！ＴＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＡ
Ｔ　ＧＣＡ　ＧＧＴＯＡＴ　ＴＯＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　
ＧＯＧ　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＯＴＴ　Ｔ
ＴＯＴＴＡ　ＧＧＯＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＴ　
ＴＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＴＧＡ（１！　
ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＯＡＧ　ＡＧＯＯＡ
Ａ　ＡＴＴ　ＧＴＣ！　ＴＯＣ！ＴＴＴ　ＴＡＣ！　Ｔ
’Ｉ！、ＯＡＡＡ　ＯＴＴ　Ｔ、Ｔ、Ｔ　ＡＡＡ　ＡＡ
ＣＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴＧＡＣ！　ＯＡＧ　ＡＧＯＡ
ＴＯＯＡＡ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣ
ＡＴＯＡＡＧ、ＧＡＡ　ＧＡＯＡＴＧ　ＡＡＴ　ＧＴＣ
！　ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＯＡＡＴ　ＡＧＯＡＡＣ！　
ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＣ！　
’１”ＴＯＧＡＡ　ＡＡ、Ｇ　０ＴＧＡＣＴ　ＡＡＴ　
ＴＡＴ　ＴＯＧ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＧＡＯＴＴＧ　ＡＡ
Ｔ　ＧＴＣ！　０ＡＡＯＧＧ！　ＡＡＡ　ＧＯＡ　ＡＴ
Ａ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＣＡＴＣＯＡＡ　ＧＴ（）　
ＡＴ（）ＧＯＴ　ＧＡＡ　ＯＴＧ　ＴＯＧ　ＣＣＡ　Ｇ
ＯＡ　ＧＯＴ　ＡＡＡ　ＡＯＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧＯＧＡ
　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＡＧ’］”　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＯＴ
Ｇ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　０ＧＡＡＧＡ　ＧＯＡ　
Ｔｏｏ　ＯＡＧ　−Ｘ　（３’）　（１）但し、ＸはＴ
ＡＡ　、ＴＯＡ或いはＴＡＧである。

上記ＤＮＡ配列の５′末端には５’　ＡＴＧ　ＡＡＡ　
ＴＡＴＡＣＡ　ＡＧＴ　ＴＡＴ　ＡＴＣＴＴＧ　ＧＯＴ
　ＴＴＴ　ＯＡＧ　ＣＴＣＴＧＣＡＴＯＧＴＴ　ＴＴＧ
　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＯＴＴ　ＧＧＯろ’　（ＩＩＩ）或
いはメチオニンンコー−するＡＴＧ　）リゾ・レットが
存在してもよく、その場合もＮ末端にそれぞれＭｅｔ　
−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−工１ｅ−
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇ１ｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−工
１θ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙのプレ配列或いはメチオニンが結合した免疫インター
フェロンＹ　発現ｊ’る。発現ベクター上で免疫インタ
ーフェロンＺコートスるＤＮＡ配列は適当なプロモータ
ーオペレーク−配列の下流域にＳＤ配列７介して結合し
ている。

ＡＴＧ開示シグナル乞宮む前述のＤＮＡ配列ＩＫよりコ
ードされるヒト免疫インターフェロンたん白は次のアミ
ノ酸配列乞有する。

又、本発明の実施に於いてはＡＴＧ開始シグナルでコー
ドされる第一のアミノ酸であるメチオニンは発現した爾
礒生物により切断されることも考えられる。

ヒト　インターフェロンβおよびインターフェロンα（
いろいろの種）ヲ限定するアミノ酸配列はそれらをコー
ドする対応ＤＮＡ配列と共に既に報告されており、同業
者によく知られている。

本発明によれば、インターフェロンンコードするＤＮＡ
配列はゾラズミド或いはクローニングベクターのＤＮＡ
　Ｋ挿入され、組み換えＤＮＡ配列ぞ形成し、それを用
いて、通１信の方法により宿主ン形質転換する。本発明
によると、形質転換した宿主は、好ましくは試１、倹管
内実験で、クローン化される。

本発明による発現ベクターはさらにハイブリッドＲＢ８
乞コー１ｆるＤＮＡ配列を含む。宿主細胞において翻訳
を開始するために必要なＲＢＳは、（１）アミノ酸メチ
オニンに対する翻訳開始コードＡＴＧ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
の遺伝子生成物で知られるものは全て、アミノ酸メチオ
ニンで始まり、これは麦に切、＠されるごともされない
こともある。）、（２）　１６　Ｓリボ・戸−ムＲＮＡ
の６１末端に相補的な塩基で、ＳＤ配列として知られる
６個から９個の塩基の配列、および（３）リンカ一部位
として知られるこれら２つの間の塩基配列とから成る。

例えば、Ｅ、ｃｏｌｉのｌａｃ　Ｚ遺伝子の最初の配列
はＡｃｔ代部ＡＡＣ！ＡＧＯＴ　（ＡＴＧ　）−８下、
尿乞引いた配列がＳＤ配列で、これはＡ’ｒＧ　）　Ｉ
Ｊプレットから７塩基離れている。ＳＤ配列とＡＴＧ　
）リプレットとの間のリンカ一部位の長さは遺伝子によ
り５から１６頃法と異なり、この距誰とたん白発現の程
度との間に、１４１関関系があるようである。さらに、
リンカ一部位の配列も又発現の程度に大ぎく影響するこ
とが出来る。その上、１３Ｄ配列自体の性質だけでなく
それに接するＤＮＡ配列およびＡＴＧ開始コードもｍＲ
ＮＡの効率よい翻訳にとって重要であることがわかって
いる。

不発ゆ９のハイブリッドＲＢＳは天然に伴在するＲＢＳ
とＤＢＩＡ配列の長さおよび／又は配列内の塩基の順序
の点で異なる。異なるのは、リンカ一部位、ＥＩＤ配列
中、或いはＳＤ配列に接する配列中（５′−側に上流）
である、以下如示すハイブリッドＲ］３Ｓ−が特に興味
あるものである。

ＧＣＴＡＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣ００ＴＴＴ
ＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡ’［’ＴＯ’Ｉ’ＴＡ
ＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＯＡＧＧＡＧＡＡ
ＴＴＣＡＴＧ ＡＧ（）ＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴ　０ＡＴＧＡＧＧＡＧＡ
ＡＴＴＯＴＡＧＡＴＧ ＡＧＧＡＴＯＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＡ
ＡＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＯＴＧＡＡＴ
ＴＡＡＴＴＯＴＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＯＴＡＧ
Ｃ！ＴＡＧＡＴＧ　及びＡＧＧＡＴＯＴＧＡＡＴＴＯＴ
ＡＧＯＴＡＧＡＴＧ　一本発明の好ましい実施態様では
形質転換の手法で受容閑として用いられる微生物は英国
特許Ａ２０５５３８２Ａに記載さ」１ているＥ、ｃｏｌ
ｉＫ７１２　２９４株である。、１４１１：微生物ば１
９７８１ｏ月２８日にＡｍｅ−ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
（ｊｕ’１ｔｕｒｅＯｏ１１８ＱｔｉＯｎ　［ＡＴＯＯ
−３１４４６として’４４　’ＷＥ　８れており、入手
５Ｔ能である。さらに、こ＼に記載の全ての組み換えＤ
ＮＡ実験はＮａｔｉｏｎａｌ工ｎ５ｔｉｔｕｔｅｏｆ　
Ｈｅａｌｔｈ　（Ｎ工Ｈ）の適用がイドラインに従って
行なわれた。

最も好ましい実施態様として本発明はＥ、Ｃ，Ｏ’１ｉ
Ｋ−１２２９４株に関して記載されているが、Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　ＭＡ　２１　Ｄ又はＲＲ工のような公知のＥ。

００１１株或いはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　０ｕｌ
ｔｕｔｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎのような公認の教生物
寄託機関に寄託され、入手可能な１ｍの讃生物菌株も本
発明の実施に用いることが出来る。

本発明の発現ベクターはゾラズミｈｐＢＲ３２２如由来
しく第２図　５図、６図および７図参照）、バクテリオ
ファージ　ラムダＤＮＡから単離されたＰＬプロモータ
ーを含み、ｔｅｔＲおよびａｍｐ　遺伝子の間に両方向
に向は挿入されている（即ち、転写がａｍｐＲ遺伝子方
向に又はｔｅｔＲｍ伝子方向伝道方向）。ＰＬはλｃエ
リゾレッサーにより効率よく又便利に調節される非常に
強いプロモーター−であるため好まれるプロモーターで
ある。リデレッサ−’＆コードする遺伝子はＣ工ｔ’ｓ
　２又はＣ工ｔ８８５７の変異７有し、これらはリプレ
ッサーに温度感受性を与える。６０−Ｃに於いてはリプ
レッサーは正常に作用し、約６７°Ｃから約４２−Ｃで
は不活化される。従ってＰＬプロモーターは６０′Ｃで
抑制され（スイッチ　オンされ）、４２’０で抑制解除
（スイッチ　オン）される。この特徴は興味ある遺伝子
生成物が細胞に毒性ン有づ−る場合、或いは多量て存在
すると細胞生育に有害であるノ易合に望ましい。ＰＬゾ
ロモークーゲ調虫百できるということはｉｌ　’ｆ約３
０゛Ｃから約６６−Ｃの間で遺伝子生成物を発現するこ
となく生育さセることが出来、適当な時期に望む遺伝子
生成物ぞ生産させるために温度ビ約ろ７°Ｃから約４２
”Ｃに上昇させることが出来る。

本開示発明のベクターは全てまたＥｃｏ　ＲＩ切断部位
をＳＤ配列の６′方向（末端）に０，１或いは４塩基の
距、催に含有し、このため異なるハイゾリソｒＲＢＳを
構成する手段〉提供づ−る。ｇｃｏ　Ｒ工部位乞用いて
ハイブリッドＲＢＳ　を構成してＰＬ−ＳＤ配列とイン
ターフェロン？コードする遺伝子のＡＴＧコード配列と
結合すると、さらにｇｃｏ　Ｒ，Ｔ制限切１ｆｒシ、末
端乞りレナウ　ポリメラーゼ■をつなげ、得られる２つ
の末端ビＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪが−ゼで平滑末端結合す
ることで修飾することが出来る。

不発明乞さらに以下の実施例により具体的に説明する。

実施例１ ラムダのＰＬ　７°ロモーターＯＬオペレーターヲ含む
６５０頃基対（ｂｐ）所片乞単離するために２５０μｇ
のλＣＣ８４５７Ｓａ’ｍ７ＤＮＡ　（フィルスラボラ
トリーズ）　Ｙ　ｔｌｉｌＪ限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍ　ＨＸおよび３ｇ１エエ　で消化し、アガロース　グ
ルの電気泳動で生成物を分離した。ＰＬプロモーターＯ
Ｌオペレーターを含む１２０ＯｂＰＩＩ片をデルから単
離した（第１図参照）。

この１２００ｂｐ断片ＹＨｐａｌで完全に消化し、４５
　、Ｏｂｐ断片を得、これぞ再びＨｉｎｆ　工で部分消
化づ−る。５係ポリアクリルアミド　ケ９ル電気泳動（
ＰＡＧＥ　）により、ＰＬプロモーターおよびＯＬオペ
レータ一部位（ＯＬ□、ＯＬ２．ｏＬ３）ヒ含ミ、これ
にλｃ工ｌＪデレッサーが結合している３　５０　ｂｐ
断片乞単離した。ラムダＮ遺伝子のＳＤ配列とＮ遺伝子
の開始コドンの間にＨｉｎｆ　工部位があるため（第１
図および第２図参照）、外来遺伝子乞Ｌ　Ｃ０１ｉ中で
発現する目的でハイプリッ１　リポ・戸−ムー結合部位
の構成がｉｊＪ能である。このＨｉｎｆ　工部位はＥｃ
ｏ　Ｒ１部位にも変えられ得る。

３５０　ｂｐ　ノＥｇｌ工Ｉ　−Ｈｉｎｆ工、折片ン前
もってＩＪｊａｏ　ＲＩとＥｇｌエエで消化したゾラズ
ミドｐＲＣ！１にクローニングした。ｐＲｃｌはＥｃｏ
　ＲＩ部位に隣接してＢｇｌ　ｌ［部位ン有するｐＢＲ
３２２の誘導体である（第２図蚕照）。第２図はまた、
結合末端の配列を示し、ベクターのＥｃｏ　Ｒ工末端が
断片のＨｉｎｆ工末端にどのように結合でき、ＥｃｏＲ
工部位ぞ再溝成するかを示している。（第２図の丸印乞
したＡは細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ磯溝により・１じ１戻さ
れた。）得られた組換えゾラズミドはｐＲｏ　１４と名
づけだ。

ＰＬプロモーターヶ用いて数多くの他の発現ベクターも
構成された（第４図、５図、６図および７図）。ｐＲｏ
　１５は上述の６５０　ｂｐのＢｇｌエニーＨ１ｎｆ　
工断片に加えて、λｉｎｔ遺伝子の８Ｄ配列を含む５５
１）ｐ断片（Ｈ１ｎｆニーＭｂｏ工）を含有している（
第４図および５図参照）。−ｐＨ０２１およびｐＲｏ　
２２はそれぞれｐＲｏ　１４およびｐＲｏ　１５に同類
のもσ）である。これらのデラズミ−の主要な違いはＰ
Ｌ含有断片の挿入の方向であり、従って転写の方向の違
いである（第５図参照）。Ｉ）Ｒｅ　２３は”　ｃｏｎ
、５ｅｎｓｕｓ″ＲＢＳ　（リボ・戸−ム結合部位）（
５ｃｈｅｒｅｒ　ｅｔ　ａ’１．、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ａｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３巻６８９５貞：　１
９８０年〕ン含む合成オリゴヌクレオチド乞ＰＬプロモ
ーター乞含む２５０　ｂ’ｐのＢｇ’ｌ　ｎ　−Ｈａｅ
　］［１所片に結合し、結合生成物ケ第７図に示すよう
に１）Ｒｅ　２に・挿入することにより構成された。

実施例２ 白血球インターフェロンＡ（以後Ｌｅ工Ｆ−Ａ又はＬＩ
ＦＡとも呼ばれる）の遺伝子は以下の方法に従っている
いろのプラズミドに挿入され、宿主中で発現する。Ｌｅ
工Ｆ遺伝子の出所として、ｐＬｅ工ＦＡ　２５　（ＧＯ
ｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８７巷４１１頁（１９
８０年）〕からのＰｓｔニーＫｃｏ　ＲＩ断片ン単離し
、ｐＲｏ　１４から単離されたＥｃｏ　ＲニーＰｓｔ工
の大きい：断片と結合する。結合部位の配列乞第６図圧
示す。ＳＤ配列はＡＴＧ開始コドンから５頃基の距離に
ある。この距り［Ｅン９塩基とするためにｐＲｏ　１４
　／　ＬＩＦＡをＥｃｏ　ＲＩで消化し、イづ着末端乞
ポリメラーゼＩのフレナラ、す７片（＋ａＴＴＰ　、　
ａＡＴＰ）でうめ、十滑末端を再び結合１−ろ。このよ
うにして得られる結合部分の配列を第６図に示ず（ｐＲ
Ｃｌ　４１　Ｑ／ＬＩＦＡ　）。本実施例で利用される
新規ハイプリツ１す４ぐ・アーム結合部位の配列は、ｐ
ＲＣ１４／Ｌ工ＦＡで届Ｆ’ａＭＡＡＴＴＯＡ↑了、ｐ
Ｒ（１！１４１０／　ＬＩＦ’Ａで一乃写旬ＡＡＴＴＡ
ＡＴＴ　ＣＫ汀である（いずれも第６図に示しである）
。

前述のＰＬ発現プラズミドを染色体上に欠損デｏ　７７
−ゾ乞持ツＥ、Ｃｏ１１の菌株（ＭＡ２１０株）にトラ
ンスフオームする。デロファーゾのＣＩリゾレッサー遺
伝子は変異ｃＩｔｓ　８５７乞含み、これはりゾレッサ
ーの温度感受性ン促″′３−０即ち、リプレッサーは約
′５０℃から約６６℃で作用し、約６７−Ｃから約４２
℃で失活する。この特質はＰＬプロモーターの調節に便
利な機構乞提供する。この場合、細胞はＭ９−グルコー
ス培地中、５０’０で１　ｒｎｌｌ当り２１Ｘ１０８細
胞となるまで生げされ、それから４２”ＯＫ上げて２時
間おく。培養液中の細胞は次に７Ｍグアニシン頃酸で尋
菌し、宕菌ｇｇ、ンｄｉｌｌ定する。ｐＲｏ　１４１　
Ｑ　／　ＬＩＦＡケ用いてこの方法乞行なうと菌抽出液
或いは溶菌液中に１リットル当り１０７〜１０Ｂユニツ
トの収率のインターフェロン活性が検出される（第１表
）。ｐＲＣ１４／Ｌ工ＦＡの発現の程反はｐｕｃ　１４
１　Ｄ／Ｌ工ＦＡで得ら身１．るもののおよそ１０％で
ある。ｐＲｏ　１５／　ＬＩＦＡ　ハｐＲｏ　１４１０
　／　Ｌ工Ｆ’Ａと匹敵−ｊ　ルＬＩＦＡの発現の程度
が得られる（第１表）。

ａ）ＭＡ２１０株のＣＩリルッサー遺伝子は宿主染色体
の欠損プロファージとして存在し、温度感受性変異Ｃ工
８５７を有す。

ｂ）　ａｌリルッサー遺伝子は’Ｉ）ＢＲ３２，２の誘
導体と共存し得る低コピー数ゾラズミ１ＦｐＲＫ２４８
ｃ工ｔｓ　２中ノ２４００　’ｂｐ　Ｂｇｌ　ｍ挿入と
して存在する。

ｃ）　ｃＩ　ＩＪ　ｙ’ｖ　ｙ　ｔ−ａ伝子ハｐＲｏ　
１４　／　ＬＩＦＡのＢｇｌ　１部位に２４００　ｂｐ
挿入として可能な２つの方向のいずれかで存在する。

ｄ）提示の値は、細菌抽出物の１＝５ｏ希釈液希釈液口
た結果得られた数値である。従って、１０．０００単位
／ｒｆＬｌハ、抽出物ニラいテハ５ＸＩＱ５単位／−に
相当し、５Ｘ１［］８菌数／ｄの培養物については約５
Ｘ’１０４単位／ｄ（５Ｘ１０７単位／１３）に当たる
。

実施例３ 人繊維芽細胞インターフェロン遺伝子（ＰＩＦ）７以下
の如く（第８図）ベクター１）Ｒｅ　２１及び１）ＲＯ
２２に挿入した。別の反応で、１）ＲＯ２１及びｐＲｏ
　２２　Ｙ　、、ｈｃｏ　Ｒ工で消化し、末端乞りレナ
ウポリメラーゼＩで光てんし、ＢａｍＨＩで消化し、大
きな断片を分離した（　４．３　Ｋｂ　）。

Ｆ工Ｆ遺伝子の供給源である、ｐＦＦＩＦｔｒｐ　６９
（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｅ、　３．４０５７（１９８０））ｙ
Ｘｂａ工で消化し、末端Ｚフレナラ　ポリメラーゼＩで
元てんして平滑末端に変え、ＢａｍＨＩで消化し、ＰＩ
Ｆ′遺伝子ン含む、小断片（８５０ｂｐ　）乞分離した
。ＦＩＦ　８５０　ｂｐ断片乞４．６ＫｂＰＬ含有Ｉ所
含有詰所し、生成する構造ビ、制限解析で確認した。

ｐＬ−ＦＩＦ　シラスミドのＦｉＦ発現能力を険討する
ために、ｐＲＣ！２１／Ｆ工Ｆ及びｐＲＯ２２／Ｆ工Ｆ
で形質転換した犬腸菌乞Ｍ９−グルコース培地で６０′
Ｃ下、菌濃度、２〜３Ｘ１０”菌数／ｄになるまで生育
させ、４２°Ｃで誘導し、１ｄのサンプルビ取り、遠心
で集菌し、溶直させる目的で、７Ｍ＼グアニジンーＨＣ
Ｊ　（５Ｘ　１０９直故／ゴ）中に再懸濁した。菌体残
液ン遠沈で除去し、抗ウィルス活性検定に先立って、上
澄を５０倍に稀釈した。

結果を第２表に示す。

（第２表） 実施例４ 、ＰＩＦ発現に関して、新規ハイブリッド　リポ・戸−
ム結合部位の効果２決めるために、ｐＲ０２１／ＰＩＦ
とｐＲｃ！　２２　／　ＦＩＦ　ノ誘導体乞作成シタ。

ｐＲｏ２１７　ＦＩＦ及びｐ：Ｒｏ　２２／　ＦＩＦ　
ノＩＪ　’Ｊ　カー　域中の２つの制限部位Ｚ組合わせ
ると、バイブリドＲＢＳ中に幾つかの修飾ン施こす方法
躬−生まれた。

Ｅｃｏ　Ｒ工又はＸｂａ　Ｉ　Ｙ　ＩＪンヵー域内での
切１析に用い、フレナラ　ボリメラーｅｌｋ生ずる末端
の充てんに用い、平滑末端は再結合し、かくて、第６表
に示す如き各種の配列ン生成した。これら構成物が、形
質転換大腸菌株ＲＲ工（ｐＲＫ２４８酊ｔｓ）中でＦＩ
Ｆ　Ｙ発現するが否かぞテストした。これらＰＬ　−Ｐ
ＩＦプラスミドの２１１発」、能ンテストするタメニ、
Ｉ）Ｒｅ　２１　／　ＦＩＦ　、　ｐＲｃ　２２　／　
ＦＩＦ　、　ｐＲ０２１１／Ｆ工Ｆ、ｐＲＣ２２１／”
Ｚ　ｐＲｏ２１２／ＦＩＦ　、及びＩ）ＲＣ２２２／Ｆ
工Ｆより撰んだ単一のプラスミド変種で形質転換した菌
の各培養について以下の操作娶行なった。菌体ぞ３０”
Ｃ下、Ｍ９−グルコース培地で函□急度が２〜３Ｘ１０
”菌数／１．ａになるまで生育させ、４２°Ｃで約１２
０分間誘導し、１１１Ｌｌサンプルヶ採り、遠沈により
集萌し、溶歯させるために７Ｍグアニジン−ＨＣＪ　（
５，Ｘ　１０９菌体／ｒｎｌ）に再懸濁した。菌体残置
ヲ遠心で除去し上澄ケ抗−ウイルス活性の演定に先立っ
て５０倍に稀釈した。結果７第３表に示す。

実施例５ ヒト免役インターフェロン（ＩＦＩ’）　遺伝子を含む
、ＰＬ−発現ベクターも作成した。Ｈ”Ｉ遺伝子の供給
源はＰｓｔ　１部位に挿入した、ＩＪ”■、　ｍＲＮＡ
の１１００　ｂｐ　ｃｌ）ＮＡコピーを有するｐＢＲ３
２，２の銹導体の、ｐＨＩＴ　５７０９である。該挿入
物上に存在するＩＩ”Ｉをコードする配列は式Ｉにより
表わされる。ＩＦＩ遺伝子を含むプラスミド１）ＨＩＴ
　３７０９を、以下の方法により作成した。

（１）　ＩＩ”ＩをコードするｍＲＮＡの分離ヒト末梢
血より調製したリンパ球を、工Ｊ？■誘導ノタメ、１５
　ｎｇ　／　ｍ１３の１２−〇−テトラデカノイルーフ
ォルポル−１６−酢酸（ＴＰＡ　）と、４０μｇ　／　
ｍｔのコンカナバリンＡを含む■偏ニー１６４０培地（
１０％牛脂児血清含有）中で６７°Ｃで培養した。培養
２４時間後、この様にして誘尋したヒト　リンパ球（Ｉ
　Ｘ　１０１０訓胞）をテフロン　月くモｒナイず一部
の、チオグアニジン７谷孜（５Ｍグアニジン　チオシア
ン酸、５％メルカプトエタノール、５３　ｍＭ　トリス
−Ｈｃｉ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＥＤＴＡ　）中で破
壊し、変性させた。次いでナトリウム　Ｎ−ラウロイル
　サルコシネートを４％磯度になるように加え、均質化
後の混合層をｔ５１１７１の塩化セシウム７（ｌ液（５
，７Ｍ　Ｊ：ＡＭ化セシウ冶、Ｏ，’ＩＭＥＤＴＡ　）
上に層状にのせ、ベックマンＳＷ　２７０−ターを用い
て２４＋０００　ｒｐｍで６Ｕ時１ｆＩＪ　１５℃で遠
心して、ＲＮＡ沈殿物をイ句た。

このＩ（ＨＡ沈殿物を０．２５％Ｎ−ラウロイル　サル
コシネートに、容屏し、次いて゛エタノールで沈殿して
８．６ｍｇのＲＮＡを得た。このＲＮ’Ａを高塩娘Ｉ斐
の溶液中（０，５Ｍ　ＮａＣ’Ａ、１［］而面トリｙ、
　−ＨＣＪＩ　（ｐＨ７，６）、１１１１Ｍ　ＥＤ’ｌ
’Ａ、０−Ｅｒ％５ｔ）Ｓ　）でオリゴ（ｄＴ）セルロ
ース　カラムに吸７ａさぜ、低：Ｌ７１？Ｌ磯度訴液（
１［］　］ｎ１ｉ　）リス−Ｈｃ、ｉ　（ｐｌ（７，’
６　）、’ｌ　ｍＭ　Ｅｒ）ＴＡ　。

０．３　％　ＳＤＳ　）を用いてポリ（Ａ）　？Ｊ有＋
ｎＸ（ＩＪＡを浴出した。７００μｇのｍＲＮ’Ａを柔
めた。

このｍＲＮＡをエタノールで１弓沈殿し、次いで１０劇
トリス−ＨＯ２（ｐｌ４７．６　）、２　ｍＭ　Ｅｌ’
）ＴＡ及び［１，３％ＳＤＳを含む溶液０．２＃ｚ／（
にｉｊ％し、６５°Ｃで２分間処理し、ベックマン８Ｗ
　２７０−ター暑用い、２０°Ｃで２５．ＯＯＯｒｐｍ
、２１時間、１０−３５％蔗糖密度勾配遠心により、２
２部分に分画した。

谷両分の一部づつをＸｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ　（
南アフリカ産有爪維蛙）の卵母細胞に注射し、合成され
た蛋白のインターフェロン活性を検定した。このような
方法により、画分１２（沈降恒数が１２−１４８）が、
ｍ　ＲＡＮ　ｌミクロダラム当たり、１９５国際インタ
ーフェロン早泣０活性を示すことを認めた。このように
して取得した画分１２中のｍＲＮＡは約２０μｇであっ
た。

上記ｍＲＮＡ　５　μｇ　、オリゴ（ａＴ）５０μｇｓ
リバース　トランスクリプターゼ（逆転写酵素）１００
単位、各ｄＡＴＰ１ｄＣＴＰ１ｄ０ＴＰ及びｄＴＴＰを
１ｍＭづつ、ＭｇＣ，、Ｅ２８ｍ１Ａ、ＫＣＪＩ　５０
　ｍＭ　％ジチオスレイトールｉ　ｏ　ｍＭ及びトリス
−Ｈｃｚ’（ｐＨ８，３）５ＱｍＭを言む、１０．０μ
ノの反応混合液を４２℃で１時間インキュベートし、次
いで、フェノールで除蛋白し、ＲＮＡの変性を目的とし
て、０゜１ＮＮａＯＨで７０℃、２０分間処理した。

ＩＩ）　二重鎖ＤＮＡの合成 このようにして合成した単鎖相補ＤＮＡを、逆転写酵素
１０口単位、各ｄＡＴＰ１ｄＣＴＰ１ｄｄＴＰ及びｄ’
Ｉ’ＴＰを１ｍＭづつ、Ｍｇ（Ｊ２８　ｍＭ　、　ＫＣ
Ｊｌ　５０　ｍＭ　。

ジチオスレイトール１０ｍＭ及びトリス−Ｈα（ｐＨ８
，３）　５０康を含む、５０μノの反応混合液中で、４
２°Ｃ１２時間反応させて二重鎖（ａｓ　）１１ＮＡを
合成した。

（ＩＶ）　ｃｌｃテイルの付加 上記二重鎖ＤＮＡを０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，
５）、０．２５　Ｍ　ＮａＣ１，１、５ｍＭ　ｚｎｓｏ
４を含む、５０μＺの反応混合液中、６０ユニツトのヌ
クレアーゼｓ−１で室温下、６０分間処理した。反応混
液をフェノニルで除蛋白し、ＤＮＡをエタノールで沈殿
させ１．０．１４Ｍカコジル酸カリウム、０．６Ｍトリ
ス（ｐＨ７，６）、２１１１Ｍジチオスレイトール、１
　’　ｍＭ　ＣｏＣ’ｆｆ１２．０．１５　ｍＭ　ｄｃ
ＴＰ及び末を瑞トランスフェラーゼ６０単位を含む混合
液中で、６７°Ｃ１６分間、ｄｓ　ＤＮ’Ａの各６′末
端に約２０のデオキーシシチジン残基な付加するため、
末端トランスフェラーゼ反応に供した。

この一連の反応で二重鎖デオキシシ零ジン鎖含有Ｉ）Ｎ
Ａを約３００　ｎｇ取得した。

別に、１０μｇの大腸しｉシラスミドｐＢＲ６２２ＤＮ
Ａを５　Ｑ　ｒＩｌＩＡ　ＮａＣＡ、’　６　ｍＭ　ト
リス−ＨＣＪＬ　（ｐＨ７，４）、６　ｍＭ　ＭｇＣ，
Ａ２．６ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１００μｇ
　／　ｒｎＡの牛血清アルブミンを含む、５０μｌの反
応混液中で、制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　２　Ｑ羊位で６７°
Ｃ，３時間処理した。反応混液な次いでフェノールで１
余蛋白し、ＤＮＡを、さらに、０．１４Ｍカコデイルに
カリウム、０．３　Ｍ　）リス（ｐＨ７，６）２ｍＭジ
テオスレイトール、１ｍＭ　ＣｏＣｕ２及び０．１５ｍ
Ｍ　ｄＧＴＰを旨む反応混成５０μｌ中で、６０単位の
末端トランスフェラーゼで、シラスミドｐＢＲ３２２１
：）ＮＡの各６７−末端に約８デオキシグアニジン残基
な付加するために、６７℃で６分間処理した。

（ｖｌｃＹ）ＮＡのアニーリング及び大腸菌の形質転換
このようにして取浮したｄＣ−テール付き合成ｄｓＤＮ
Ａ　Ｏ，１μｇと上記ｄＯ−テール付きシラスミドｐＢ
Ｒ３２２Ｌ’）ＮＡＯ，５８ｇをＱ、　ｉ　’　Ｍ　Ｎ
ａＣＪｌ、５０　ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６）
及びｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｇ有酸中で、６５°Ｃ２分間
、次いで４５℃で２時間加熱してアニーリングを行い、
次棺に冷却した。大腸菌Ｘｉ　７７６の形質転換は、ｇ
ｎｅａ号の方法〔Ｊ、”Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９　（
５，４９５Ｃ１９７５）〕によって行った。

このようにして、約８，５００のテトラサイクリン耐性
コロニーを分離し、各コロニーのＤＮＡを、ニトロセル
ロース　フィルターＫ　固Ｍ　Ｌ　だＣＭ。

（）ｒｕｎｓｔｅｕｎ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｓ、　Ｈｏｇｎ
ｅｓｓ　、　Ｐｒ’ｏｃ’、　Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７２．３９６１（１Ｓ’７５））。

別にＧｒ＆７等により［：　Ｎａｔｕｒｅ　２９５．５
０３（１９８２））報告されている如く、工Ｊｒ′■の
アミノ酸配列に基づき、アミノ酸配列Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ　−Ｇｌｎ−Ａｓｐ　（１−５）及びＬｙｓ−
Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　（７７−８
２）に相当する二つの塩基配列５’　ＴＣＣＴＧＧＣ４
ＴＡ９ＣＢ’及び５’　ＡＣ’父’Ｉ”ＴＣＡ’［’父
’Ｉ’Ｃ’百ＴＣ百Ｔ　３’をトリエステル法（’　Ｒ
，Ｃｒｅａ等、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ　、−乙や−１５７
６５（１９７８）〕により、化学的に合成した。０．２
μｇのこれらオリゴヌクレオチドを、５０　ｍＭ　）リ
ス−ＨＣ４（ｐＨ８，０）、１０　ｍＭ　ＭｇＣＪ２．
１０　ｍＭ　メルカプトエタノール及び５０　ｔｔ　ａ
ｌｒ　−３２Ｐ−ＡＴＰ　馨含ｔｒ反応混液５０μＺ中
で６単位のＴ４ポリヌクレオチド　キナーゼで６７℃１
時間処理した。５′−末端に３２ｐで保識した、これら
オリゴヌクレオチｐをプローブとして利用し、上述のニ
トロセルロースフィルター上のｒ）ＮＡとＬａｕｎ等の
方法［ＮｎＣ１ｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、、９．６１０
３（１９８１））でアニールした。オート　ラジオグラ
フィーで、上記二つのオリゴヌクレオチド　プローブと
反応する４つのコロニーを同定した。

これら、それぞれのコロニーのｊｆａ　Ｍ　測ｘ＝中よ
りＢｉｒｎ　ｂｏ、ｉｍ　ａｎｄ　、［）ＯＩＹ　（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１．１５１３　
（１９７９）〕の方法に従って、プラスミｒＤＮＡを分
離した。プラスミドＤＮ’Ａ中の挿入部をＰｓｔＩ制限
酵素で切り出した。分離したプラスミドより、最長のｃ
　Ｉ）ＮＡ挿入８１ニを呂むものを選び、ｐＨＩＴ　３
７０９と命名した。ｉ（↓９１ネ１に、このプラスミド
の制限酵素地図を示す。

１）］：（ＩＴ　３７０９プラスミドに挿入されたｍＲ
１Ｒ１列配列次、購造（塩基配列）を、次いで、Ｓａｎ
ｇｅｒ等［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡス４．５４６６（１９７’７））の方法及
びＭａｙａｍ−（）ｉｌｂｅｒｔの方法により決定した
。第１０図にこの一次４；’ｉ　這を示した。

この−次倫造は、１４０位のアミノ酸がＣＡＡ（（）Ｉ
ｎ）の代りにＣ（）Ａ　（Ａｒｇ　）でコードされてい
る遣を除き、Ｃ）ｒａｙ等の￥１炙告した１、ｌ’ｌ：
　ｃｒ）ＮＡの一次構はと一致している。

一次栴造より、このプラスミドは工ｊＴ′■蛋口の全コ
ード域を苫んでいることは明１ヨである。この事実は、
このプラスミドに１−人されたｒｌＮＡを他の発現プラ
スミドに移すことにより、例えは大＋ｊ坊菌の如き宿主
に免役インターフェロンを生鉱させる可能性を示してい
る。

実７ｉｉｊ例６ ｐＨＩＴ　３７０９よりＨ”ＩをコーＰする配列の４３
０　ｂｐおよび４７０　ｂ、ｐの６′側非コード領域を
含む９００　ｂｐ　Ｏ）　Ｂｓｔ、ＮＩ断片を単離した
。本断片上に；Ｉｊ在しないのはＩＪ’Ｉのシグナルの
？：’ｉ：≦分および成熟たん白の最初の６個のアミノ
ド役のコドンである。久げている６個のコドンを回復し
、開始のメチオニン　コドンを共、ｉ合するため合成オ
リゴヌクレオチドを。・１Δ壊し、９００　ｂｐ１９ｉ
片に７１著合した（４１１図参照）。合成断片は両側の
ＢｓｔＮＩ末ＡｉＡをＥｃｏ　ＲＩ末端に変えた。招ら
れた断片を、ＥｃｏＲＩでｆｆｉ！Ｉ限切断したｐＲＣ
２２ベクター中にクローン化した。挿入１４１〜分の方
向性は６′側の非コード項域中をｂＪ　ｌｉするＢｇｌ
　Ｉでの制限切断分析により決定した。

全ての請合］≦Ｖ−作が期待通りに行なわれた事を確認
するために工ＪＴ′工：ｌａ仏子を含有するｐ）ｌｃ　
２２ベクター（ｐＲＣ２２／ＨＱ　−９００と命名）を
プロモーターと遺伝子の結合ご１≦位の周辺で配列決定
した（２）１１１図参照）０ 月？■遺伝子の発現を試１．倹するためにＥ、　ｃｏｌ
ｉＲＲＩ株（１）ＲＫ２４８ＣＩ　ｃｓ、　ｐＲＣ２２
／ＩＦＩ　−９００）をＭ９−グルコース」台地中、３
［］℃にて１ｍ１３当り６　４　Ｘ　１０”　１＝ｉｔ
［］＝となるまで生育し、その後４２℃で１時間誘発す
る。め発の前にさらにグルコースおよび力ずミノ酸をそ
れぞれ１．０％、０．５％となるよう添加した。１０Ｉ
ｒｌｌのサンプルを取り、遠心分離により粟菌し、Ｌｌ
、１ｍｅの５０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）、１０％熊Ａ
ノ１’ｊ中にげん濁し、けん７蜀液をドライアイス／エ
タノール（谷で脂、イ宋結した。、細胞を２０℃で噸’
＋４イし、氷１゛ｄに入れた０ＮａＣＪ！、を１　［１
０ｍＭ　、　Ｅｒ）ＴＡ　１０　ｍＭ　、スペルミジン
２０　ｍＭとなるよう、又リゾチームを１ｍｌ描り２０
０μｇ　？／＋、：加した。ｍ合（吻を水槽中４５分世
放置した後ろ７℃で２分装置いた。１ｌｌｌ　Ｉｌｉ！
残面を遠心分離により除去し、上澄敵のＷ　Ｉ　ＳＲ＋
１４１−ｌ廁を用いたＩＦＩ抗ウィルス活性を測定した
。この最初の実１１倹で１ｒｎ１４のｉ畑胞抽出液当り
１２８０ユニツトのＩｊ”Ｉ活性が得られた。

誘発のキネティックスを決だするために上記操作をくり
返えした。対照として１検体を６０℃で保存し、他の検
体を４２　’Ｏでの１ｉＡｉ　”Ａ後６０分、６０分、
９０分、１２０分および１８０分で取った。サンプルは
上述のとおり処理した。ｄ３４表に示すン・吉果による
と、６０℃では活性は見られず、４２℃で誘発後検出さ
れる活性は約９０分後で最大となり、その後次第に低下
することを示している。

第４表 ｐＲＣ２２／　Ｈ”■−９００）　５０°　０〃４２°
／６０分　１２０ 〃４２°／６０分　１２０ １４２８７９０分　６２０ 〃４２°／１２０分　１６０ 〃４２°／１８０分　４０ 実施例７ ｐ：ＲＣ２２／　Ｈ’Ｉ　−９００ＤＮＡをさらにＥｃ
ｏ　ＲＩテｆｌｉＵ限切切１析、■、ｐＩｆ含ム９００
ｂｐＦａｊ片ヲ単離し、前もってＥｃｏＲＩでｆｌｊｌ
ｊ　ｌ奴りＪ肋しであるｐＲＣ２３に挿入した（第１２
図し照）。得られる・１１４造、１１）ＲＣ，２３／　
ｘ」ｒｘ　−９００、はｐｌ（Ｃ２２／　１１ｉ’Ｉ甲
と有意に異なるＲＢＳを含んでいる（鵠１１図と第１２
図を比較のこと）。Ｔ１？１遺伝子の詑現を試験するた
めにＲＲＩ　（１）ＲＫ　２４８．、、、ｃＩｔｓ　、
　ｐＲＣ２５／■ＦＩ　−９００）株をＭ９−グルコー
ス培地中６０℃で１ａ当り６−４Ｘ１０”訓ノ地となる
まで・生育し、４２℃で１時間誘発をした。し・シ光の
前にさらにグルコースおよび力ずミノ隘をそれぞれ１．
０および０．５％となるよう添加した。Ｉ　Ｑ　ｍｌの
サンプルをトリ、ｉ　心分離により束ト（シ、Ｑ、１ｍ
ｇの５０　ｕ＋Ｍトリス（ＰＩ−１７，４）、↓１４？
　’ｌ・店１Ｄ％中にけんンｍａ　シ、リ−ん濁液をド
ライアイス／エタノール浴で急凍結（−だ。７朋）泡を
２０°Ｃで削１解し、氷イ１ｈ中に１４（。

ＮａＣ１を１００　ｍＭに、ｇｌ：＋ＴＡ　ｉ　Ｑ　ｍ
Ｍ　、スペルミジン２０　ｍＭとなるよう、又リゾチー
ムｌ　ｕｒｌｌ当り２００μｇを硲加し、この混合物を
水槽中４５分間、次いで６７°Ｃで２分間放置した。遠
心分離により訓）」１曳渣を１余去し、上澄液につき、
ＩＦＩ抗ウィルス活性をＷＩＳＨｉ（利血上で測定した
。第５表に示すように、 箱５表 誘発条件　工Ｊ”　１活性 址Ｉ　（ｐＲＫ　２４８　Ｃ工ｔｓ　。

ｐＲＣ２２／１：ＪＱ−９００）　４２°／９０　３２
０ＲＲ工（ｐＲＫ２４８　ｃｌｔｓ。

ｐＲＣ２３／Ｈ’ｌ−９００）　４２°／９０　１２８
０ＲＲＩ（１）五２４３ｃＩｔｓ。

ｐＲｃ２３１／工Ｊ’ｌ−９００）　４２°／９０　６
４０ｐＲＣ２３／　ｎｈ工を、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　ＲＲ
Ｉ株の形質転換に用いると、］）ＲＣ２２／　ＩＦＩよ
り約４倍高いＨ”Ｉ活性を生産した。

天施例８ ｐＲｃ　２５７　ｘｐｘぞさらにＥｃｏＲＩで２個の切
断）４１Ｓ位の片方のみが切断されるような条住下で制
限切断する。得られる分子をフレナラ　ポリメラーゼＩ
で処理してＥｃｏＲＩ末端を充填した。平滑末端なＴ、
’４ＤＮＡリガーゼで結合し、そのｒ）ＮＡでＲＲＩ（
ｐＲＫ　２４８　ｃＩｔｓ　）を形質転換した。ＩＪ’
Ｉ　、ａ伝号の最初のＥｃｏＲＩ都泣を欠損した形質転
換株を・険完し、２株が得られた。

ｐＲｏ　２３１　／　ＩＦＩ　−９００と超泡されたそ
の１つを用い、Ｈ”Ｉを発現させるためＥ、　ｃｏｌｉ
　ＲＲ王株を形質転換した。ＩＦ工遺伝子の発現を試、
験するためこのＲ：ＲＩ　（ｐ■２４８　ｃＩ　ｔｓ　
＋　ｐＲＣ２Ｊ　１　／　ＩＦＩ−９’ＯＯ）；床をＭ
９−グルコース増地中３０’Ｃでｉ　１ＩＩｌ当り、５
−４ＸＩＯ”π１月月位となるまで゛」＆ぞしし、その
・段４２°Ｃで１時間砺つ６した。８．ｄ元の前にさら
にグルコースおよび力ずミノ酸をそれぞれ１．０および
０．５％となるよう姫加した。１０　ｍｌのサンプルを
取り、遠心分１す［！：により東困し、０．１　ｕｔｌ
の５０ｍＭ　）リス（ｐｌ４７．４　）、１０％蔗糖に
けん７細し、す゛ん濁液をドライアイス／エタノール浴
で油、凍結した。ン１．田ｊ抱を２０°Ｃで１独犀ｉし
氷・ｌ・菌中に置いた。

ＮａＣＡを１００　ｍＭ、　ＥｒＪＴＡ　１０　ｍＭ、
スペルミジン２０　、ｍＭとなるように、又リゾチーム
を１１ｎｌ当り２００μｇ鋭加した。混合物を水浴で４
５分放置した後、６７℃で２分置いた。遠心分離により
細胞残渣を除去し、上澄液につき工ＪＱ抗ウィルス活性
をＷ、ＴＳＨ細胞で測定じた。その結果は第５表に示す
。

ｉ己載のｐＲＣ２６／　工Ｊｈｒの修飾はリンカ一部位
を６　ｂｐから１０　ｂｐに伸ばすために計画した。こ
りよ５７よ・１）〉飾でＬｅ町−へ発現ベクターでは党
現が１０〜２０倍増加した。ＩＪ”Ｉの場合にはその発
現に１０　ｂｐより６　ｂｐの距〜１ｔの方がよいよう
である。

−決約 以下の方法より成るインターフェロンの生産方法。

（ａ）　宿主微生物を、インターフェロンを発現するこ
とが出来、バクテリオファージ　ラムダに由来するプロ
モーターおよびオペレーターＤＮＡ配列、ハイブリッド
　リポゾーム結合部をコードする配列およびインターフ
ェロンをコードするｒ）ＮＡ配列を含む発現ベクターで
形質転換し、 （ｂ）　形質暫換した微生物を培地中で生育させ、それ
によって上記発現ベクターのインターフェロン遺伝子に
よりコードされるインターフェロンを生産させ、 （Ｃ）　形質転換微生物を浴し１し、そして＜Ｃ１）　
得られる溶菌液からインターフェロンを匹１収する。

４、１ＲＪ　ｉｆｉの１ｉ′３単な；説明第１図はＰＬ
ソ０ロモーターを含む１２０　［１ｂｐ　Ｑ）Ｂｇｌ　
ＩＩ　−Ｂａｍ、ＨＩ　［’片のｔｒｒｌｊ分制限切１
万図を示す。

第２図は、３５　Ｄ　ｂｐ伸大入部分ラムダＰ１プロモ
ーターを含む発現ベクターｐＲＣ１４の・［１ｙ戒につ
き説明している。

第６図ば、発現ベクター１１１１Ｒｃ　１４に押入した
、白血球インターフェロン遺伝子を１況明している。

第４図は、発現ベクターｐＲ０１５の５、ｊ１立用のバ
クテリオファージ　ラムダのｉｎｔ　Ａ’、ｉムチのた
めのＳＤ配列を含む８２　ｂｐ　断片を分離するために
用いた概要を説明したものである。

第５図は発現ベクターｐＲＣ丁５の構造につき説明。

第６図は、それぞれ、プラスミド１）ＲＣ１４及びｐＲ
ｃ’　１５由来の発現ベクターｐＲ０２１及びｐＲｏ　
２２のｌｌｉ成につき説明。

２１１７図は、化プロモーターおよび合成ＲＢＳを用い
る１）ＲＣ２プラスミドからのシＧ現ベクター１）ＲＣ
２６の構成を示す。

第８図は、繊維芽細胞インターフェロンをコードしてい
る眉伝号を、プラスミドｐＲ０２１及びｐＲｏ　２２に
挿入するため用いた方法の概要と、得られたプロモータ
ーと遺伝子の接合点の自己列を示している。

第９図は、実施例５　（ｖｉａ）で得られたプラスミド
１））（ＩＴ　５７０９の制限爵素切断地図を示し、國
凶部分は信−号ペプチドとなるべきペノチドをコードす
る配列を示し、図コ部分は、月？■ポリペプチドをコー
ドする配列を示す。

第１０図は、実施例５　（ｖｉｌ）で得られたプラスミ
ド］）ＨＩＴ　６７０９の塩基配列を示す。

ａ１１ｉ＋は、免役インターフェロンをコー１している
遺伝子を、発現ベクターｐＲ０２２に挿入す′るため用
いた方法の概要と、プロモーターと遺伝子の接合点の配
列を示している。

第１２図は、凭投インターフェロンｊ以仏子を発現ベク
ターｐＲ０２３に押入する方法と、フ０ロモーターと遺
伝子間の接合点の自己列並ひにその修偏を示している。

代理人　浅　村　晧 ★ 一〇かＡＴＴＣＴＣＣＴ　ｐ −ＣＴＴＡＡ桿膳−−１ ＤＮ 、Ｒ１ ＢａｍＨＩ Ｅ”ｃ’ｏ’ＲＩ ＥｃｏＲＩ Ｊ　ｐａｌｌ”フレナラ′によりうめる第４図 χ９旧５７５１ｍ７　ＤＮＡ　［ｄａｍ−］　−］４９
，０ＯＯｂｐ１８０−２２０ｂｐＱきざの区分と午離８
２ｂｐｆ７１１Ｈｔｎｆｌ−Ｈａｅｌｌ断片と竿飴■ 第７図 ｐｓｊ ２６５ｂｐ断片の単離 四　囲 ↓ｐｏｌｌ”フレナラ賀゛うめう　↓ｐｏｌｌ”フレ切
°１うめる第１１図 ↓ 合成オリゴヌクレオチドに絽含 Ｇ　ＴＡＣＡＣＡＡＴＡＡＣＡ　ＧＴ 今 ｃｏＲ１ 第１２図 ｃｏＲ１ ↓＋Ｅｃｏ　ＲＩ Ｊ　ｐｏｌｌ°′クレナウ″１゛うめるＩ　平滑末端結
合 ＰＬ→ＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡ爾ひ弘ＡＡＴＴＡＡ汀Ｃ雨
９．γ−ＩＦ回翌亜回更戸説」 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）バクテリオファージλに由来するプロモータ
   ーおよびオペレーターＤＮＡ配列、ハイプリン１リボ・
   アーム結合部位ンコードするＤＮＡ自己列およびイ／タ
   フエロンンコードづ−るＤＮＡ配列配列性含有１インタ
   フエロン発現ベクターぞ用いて宿主歳生物馨形直転換し
   、 ｂ）形質転換した宿主磯生物を培養夜中で生育させ、前
   記発現ベクターのインクフエロン遺伝子によりコードさ
   れるインクフエロン乞産生させ、 Ｃ）形質転換倣生物ゲｒ台菌し、そしてｄ）得られる―
   菌液からインクフエロンン採取づ−る ことン特１政とずろインタフエロンの製造方法。 （２＋　１＝主微生物か、染色体上に温度感受性リゾレ
   ッサータンパクＩ町ソコードづ−るバクテリオファージ
   λ由来の変異ＣＩリプレッサー遺伝子乞含む特許請求の
   範囲第（１）項記載の方法。 （３）工程（ａ）で用いる発現ベクターが、温度感受性
   リプレッサータンパク質をコー１するバクテリオファー
   ジλ由来の変異ｃＩＩＪプレツサー遺伝子を含む、特許
   請求の範囲第（１）項記載の方法。 （４）　徊主徽生物ケ、工程（ａ）の１麦に、あるいは
   工程（ａ）と同時に、温度感受性リフ０レッサータンパ
   ク質乞コードし、かつ工程（ａ）の発現ベクターと十分
   に４　合ｊ−ル、バクテリオファージλ由来の変異Ｃエ
   リデレッサー遺伝子’ａｊ［する別の複製しうる発現ベ
   クターで形質転換することＺ％徴とする特許請求σ）１
   ｍｌ囲第１項の方法。 （５）宿生成牛物を培地巾約３０°Ｃから約６６°Ｃの
   温度で生育させる特許請求の範囲第（１）Ｊ：ｎ−妃（
   ４）項のいずれか一つに記載の方法。 （６）工程（１））の直前に培地の温度を温度感受性リ
   ゾレッサータンパク質が失活するような温度まで上げる
   特許請求の範囲第（５）項記載の方法。 （７）温度感受性リプレッサータンパク質が完全に失活
   するｆｊ１１’１度が約３７’Ｏから約４２゛Ｃである
   特許請求の範囲第（６）項記載の方法。 （８）　Ｉ程（Ｃ１の溶菌乞酵素により行なう特許請求
   の範囲第（１）項一外（７）項のいずれか一つに記載の
   方法。 （９）　インクフエロン乞クロマトグラフィーにより採
   取する特許請求の範囲第（１）項〜第（８）項のいずれ
   か一つに記載の方法。 （１０ｊ　クロマトゲランイーが］冗イ本アフィニティ
   ークロマトグラフィーである特許請求の範囲第（１）項
   〜第（９）項のいずれか一つに記・戊の方法。