JPS61132191A - ハイブリツドリンパ芽球様細胞−白血球ヒトインタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規ハイブリッドリンパ芽球様細胞−白血球ヒ
トインターフェロンをコードし、そして該ハイブリッド
インターフェロンの発現に有用なりボゾーム結合部位お
よびハイブリッドプロモーターを含むヌクレオチド配列
の構築方法に関する。その合成りＮＡ配列はプラスミド
ベクターに導入された後微生物中に導入される。

形質転換微生物および新規ノ・イブリッドインターフェ
ロンの発現についても記載される。

従来より、微生物に多くの商業的応用分野のあることは
よく知られている。例えば真核および原核微生物は、タ
ンパク源および医薬品源としての廃棄物の処理に、また
１次および２次代謝物への様々な生物学的変換に長い間
用いられてきている（　Ｓｃｉ、Ａｍｅｒ、　２４５　
：　６７〜７４（１９８１））。

より最近に至っては、効果的な遺伝子を微生物間で、ま
た微生物と各種のよシ高等な生命体との間で移動するこ
とも可能となっている。特に組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術
に関する遺伝子工学の近代的技術は今や、任意の遺伝子
または遺伝子群を微生物内で機能しうるプラスミドに移
すことも理論的に可能にしている。

遺伝子組換えは遺伝情報を染色体間で交換するための生
物学的プロセスである。古典遺伝学および分子遺伝学の
分野は、遺伝子組換えの複雑さの解明を伴う。組換えは
通常無関係の生物種間では起こらない。にもかかわらず
、新しい組換えＤＮＡ技術は今や関係のある生物間ある
いは無関係の生物間の遺伝子移動を可能にしている（　
Ａｍｅｒ、　Ｓｃｉ、、　６８　：　６６４〜６７４　
（１９８０）　：）。

遺伝子構造の遺伝子変換は特に工業微生物学に応用され
る（　Ｓｃｉ、　Ａｍｅｒ、　２４５　：　９１〜１０
２（１９８１））。

遺伝子組換えはＤＮＡ分子の切断とスプライシングを伴
う。今では、各種原核および真核源からＤＮＡ断片の形
で様々な遺伝情報を試験管内に集め、そしてこの遺伝物
質をクローニングベクターとして知られる自己複製遺伝
子部分に導入することが可能となっている。ＤＮＡ断片
、あるいは完全体の遺伝子でさえも、合成化学的手段に
よシ、所望の理論的遺伝子配列または既知の遺伝子配列
に対応するよう構築し、次いで所定のベクターに導入す
ることができる。クローニングベクターは通常細菌プラ
スミドまたはバクテリオファージである。プラスミドは
環状鋼のＤＮＡよ）なる自律性染色体外遺伝子単位であ
って大抵の細菌および一部の真核生物中に存在する。バ
クテリオファージは細菌のみに寄生するＤＮＡビールス
である。ハイブリッド遺伝子ベクターは次に形質転換と
して知られるプロセスによって所定の微生物に導入され
る。このように形質転換された微生物は、大量のクロー
ンされたＤＮＡを生産するための潜在的工場である。

クローニングベクター中“に存在する外来遺伝子情報は
しばしば形質転換微生物内で発現しない。非発現クロー
ニングベクターは外来ゲノムの発現が宿主生物に対し致
死的な生産物を産生しうる場合には望ましいこともある
。非発現または低発現クローニングベクターは、次に試
験管内で単離できそして発現ベクター（すなわち特に調
製されまたは選択されたプラスミド）に導入できる外来
遺伝物質の調法な供給源である。

外来ＤＮＡは発現ベクターの適当な位置におかれる（す
なわちｌａｃオイロン内に挿入舌れる）がそこでは内生
遺伝子配列は外来遺伝子情報が転写され（すなわち外来
遺伝子からｍＲＮＡが作られる）そして翻訳される（す
なわちｍＲＮＡ鋳匿か６のタンパク合成）ような配列と
なっていて（外来ＤＮＡにコードされた）目的生産物が
得られる。

クローニングベクターの製造の場合と同様、所定の微生
物に導入される発現ベクターおよび得られた形質転換微
生物は外来ＤＮＡ生産物の製造用工場として働く。

制御ａエンドヌクレアーゼとして知られる酵素群の開発
に伴い、今ではＤＮＡを適宜のトランスファー・ベクタ
ーへの挿入準備として、試験管内で特定位置で切断する
ことができる。制限エンドヌクレアーゼは、主として二
重鎖ＤＮＡを切断するが、場合によっては単鎖ＤＮＡを
切断する部位−特異的エンドヌクレアーゼにあたる酵素
である。すべての制限エンドヌクレアーゼは特異的ＤＮ
Ａ配列をＲ識する。■型制限エンドヌクレアーゼは特異
的配列のところで切断するのに対し、工型制限エンドヌ
クレアーゼはＤＮＡを無秩序に切断し不均質生産物を産
生ずるように思われる。様々な制限エン−ドヌクレアー
ゼは、様様な長さおよび夕、イブのＤＮＡ断片を生じる
。例えば一部の制限エンドヌクレアーゼは、両方のＤＮ
Ａ鎖を同じ位置で切断し「平滑末端Ｊ　ＤＮＡ断片を生
じるのに対し他の酵素は一方のＤＮＡ鎖を相補鎖から数
ヌクレオチド離れたところで切断し［粘着末端Ｊ　ＤＮ
Ａ断片を生じる。組換えＤＮＡ技術の実務家であれば対
象（５ｕｂｊｅｃｔ　）　ＤＮＡを処理するためのエン
ドヌクレアーゼを創造的に選択することによシ、次いで
ＤＮＡリガーゼの作用により結合されうる所望のＤＮＡ
断片を得ることができる。このようにして遺伝情報（Ｄ
ＮＡ）の切断およびスプライシングが行われる。外来Ｄ
ＮＡを微生物に挿入した後、クローンされた厳密な配列
をＤＮＡ配列決定法によシ決めることができる。

対象ＤＮＡ断片の末端配列を所望の配列とするために（
すなわち連結目的に）、かかるＤＮＡの末端部分にヌク
レオチドを付加することができる。例えばホモポリ・マ
ー・テーリングとして知られるプロセスにおいては、ク
ローニングベクター５′末端に一連の同一デオキシリボ
ヌクレオチドが付加され、またクローンすべきＤＮＡ断
片の６′末端に一連の相補デオキシリボヌクレオチドが
付加される。これらのＤＮＡ配列は次に一緒にして微生
物宿主に導入できる。

所望のＤＮＡ融合生産物を得るためのもう一つの一般的
方法はクローニングベクターまたはクローンされるべき
ＤＮＡ断片の一方または両方の末端に「アダプター」ま
たは「リンカ−断片」を付加する方法である。リンカ−
断片は制限エンドヌクレアーゼに対する１以上の認識配
列を含有するＤＮＡの小切片である。

外来ＤＮＡを微生物に挿入後、クローンされた厳密な配
列はＤＮＡ配列決定法によシ決めることができる。

トランスファー・ベクターに挿入するために外来ＤＮＡ
物質を得ることのできる方法にはいくつかある。親深か
ら直接得られたＤＮＡ断片は適宜のベクターに挿入でき
る。もう一つの方法は、親糸における活発な合成位置（
産生物発現領域）からｍＲＮＡを採取しそして単離され
たｍＲＮＡから酵素的に（逆転写酵素）合成された単鎖
相補ＤＮＡ鎖を得る方法である。次いで、その単鎖鋳型
から合成される。このようにして得られた二重鎖ＤＮＡ
は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）として知られている。一旦所
望のＤＮＡ配列が分かれば、微生物系、組織系または細
胞培養系でのクローニング／発現目的に遺伝子を試験管
内で化学合成することもできる。

インターフェロンはビールスにさらされた様様な動物細
胞により放出され他の細胞を感染に対し抵抗性としうる
一大タンパ、り群である。インターフェロンは種ごとに
異なる。それらの作用様式は未だ充分理解されていない
が、それらは一般に本質的に抗ビールス性であると考え
られている。恐らくインターフェロンはビールス性疾患
そして多分癌にも有効かもしれない。インターフェロン
は抗ビールス作用に寄与する以外の様々な生物学的活性
を有していることが知られている。ヒトインター７エｐ
ンには３種類のクラスないしグループ、すなわち、αま
たは白血球インターフェロン；βまたは線維芽細胞；お
よびγまたは免疫インターフェロンが確認されている。

αまたは白血球インターフェロンは、１６５または１６
６個のアミノ酸よシなる鎖長を有する関連タンパク群で
ある。白血球ｍＲＮＡからｃ　ＤＮＡをりａ−ニングす
ることによシ少くとも８種類のディスタンドなサブタイ
プが検出されている。

多くの異なるα−インター７二ロンがすでに単離され特
徴付けられている。組換えＤＮＡ技術を用いることによ
シ、今ではヒトインターフェロン遺伝子を単離して特徴
付け、そしてそれらを細菌または他の微生物中にクロー
ンして実験または医療目的に量的に有意量のインターフ
ェロンを産生ずることが可能である。

リンパ球はリンパ系組織で形成される白面細胞（白血球
）であシ、そしてリンパ芽球は未成熟ＩＪン／！！球で
ある。いくつかのヒト白血球インターフェロンの化学的
配列は知られている。しかしながら、ある種のリンパ芽
球様細胞インターフェロンのアミノ酸配列は未だ完全に
は特徴付けら五ていない。これら部分的にしか特徴付け
られていないインターフェロンの中ニ二二一カッスル病
ビールス、３１株でＮａｍａｌｖａ細胞を誘発すること
により産生されるリンパ芽球様細胞インターフェロンが
ある（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

８ｃｉ、　、　７６：　５６０１〜５６０５　（１９７
９）　＋Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２５２　：　（５５８５〜６５８７　（１９７７）　）
。このタンノ４りのアミノ酸配列の一部は決定されてい
るが、全体の配列は既知のα−インターフェロンに含ま
れていない。このリンパ芽球様細胞インターフェロンは
いくつかの理由から魅力的な遺伝子合成候補である。第
１に、このインターフェロンはビールス感染の結果、単
離および各種の生物学的ならびに生化学的研究に充分表
置で自然に発現する。第２に、このインターフェロンの
遺伝子は既知のクローンされたインターフェロン遺伝子
の中にはない。最後に、天然に存在するリンパ芽球様細
胞インターフェロンは現在、医療目的に臨床試験を受け
ている主たるインターフ二ロン群に入っている。

組換えＤＮＡ法を用いたインターフェロンの特徴付け、
精製、および製造については総説がある（　Ｓｃｉ、　
Ａｍｅｒ、　２４９　：　３７−４３　（１９８３）　
］。様々なハイ、ブリッドヒト白血球インターフェロン
が米国特許第４，４１４，１５０号明細書に記載されて
いる。更に遺伝子配列、組換えＤＮＡ分子、形質転換微
生物およびヒトインターフェロン様ポリペプチドの製造
方法が欧州特許出願筒３２，１３４号明細書に記載され
ている。

遺伝子工学分野の最近の進歩の一部、そしてより詳細に
はヒトインターフェロンの同定、化学的特徴付けおよび
製造について以上述べたことに照らし、新しいインター
フェロン遺伝子の改良された製造方法が極めて望まれる
。本発明の目的の１つは、リンパ芽球様細胞インターフ
ェロンと白血球インターフェロンとのポリペプチドセク
ションよシなる新規ハイブリッドヒトインターフェロン
を製造することにある。本発明のもう一つの目的は、適
宜のりボゾーム結合部位およびプロモーター領域をコー
ドする遺伝子セクションの合成を含む、新規リンパ芽球
様細胞−白血球ハイブリッドタンパクをコードする真核
遺伝子配列の合成である。本発明の更にもう一つの目的
は合成されたハイブリッドリンパ芽球様細胞−白血球遺
伝子配列を適宜のベクターおよび微生物系内にクローン
し、そして次いで生物学的活性を有する新規ハイブリッ
ドインターフェロンを発現させることである。本発明の
更にもう一つの目的は、抗ビールス剤として有用な新規
リンパ芽球様細胞−白血球ハイブリッドインターフェロ
ンをコードするヌクレオチド配列を含有する新規形質転
換微生物を開発することにある。これらの目的および他
の目的は以下の記載の中で明ら示となシ、そして特に特
許請求の範囲に述べられている。

ある穏のりンノぐ芽球様細胞インター７二ロ／および白
血球インタ−７二ロン配列を含有する遺伝子の合成が記
載される。具体例はαＣ，Ｆ。

塗たは工型白血球インターフェロン配列を含む。

合成方法は、リンパ芽球様細胞インターフェロン配列を
αＣ，Ｆまたは工型白血球インターフェロン配列と結合
できるように設計される。本発明のハイブリッドインタ
−７二ロン遺伝子配列の合成方法は化学的方法と酵素的
方法との組合せよシなる。更に、この遺伝子の発現に有
用なハイブリッドプロモーターおよび３つのハイブリッ
ドリボゾーム結合部位の由来を記載する。

リンパ芽球様細胞ハイブリッドインターフェロン遺伝子
は５９８塩基対ＤＮＡ二重鎖から構成されている。その
遺伝子配列は１６６アミノ酸の構造遺伝子、開始コドン
、２個の停止コドン、およびプロモーター、オＲレータ
−およびリボゾーム結合部位を含む制御領域をコードす
る。

この遺伝子のＤＮＡ塩基対配列をそれのコードするアミ
ノ酸と共に８１表に示す。そのＤＮＡ配列のすぐ上に２
０塩基対毎に番号がうっであるがこれらはセンス鋼上の
番号第１番にあたる５／ＥｃｏＲＩ切断部位に対するヌ
クレオチドを指定している。それら番号の上のブラケッ
トはラムダＰＲ／Ｔ７　Ａ２プロモーター、ｌａｃオペ
レーター、Ｒ１リボゾーム結合部位、および構造遺伝子
を規定している。Ｒ１を規定しているブラケットは第８
アミノ酸コドンまで及んでいる。リンパ芽球様細胞ハイ
ブリッド遺伝子のアミノ酸配列はＤＮＡセンス鎖の適宜
コドンの上に位置している。センス鎖の３′末端近傍に
２個の停止コドンが見られ、また５１末端にはＥｃｏＲ
Ｉ　３’切断部位がある。

下線によりいくつかのキーとなる制限部位も示されティ
る。すなわちＥｃｏＲＩ　（２ケ所）、ＡｌｕＩ。

Ｈａｅ　Ｍ　、　Ｄｄｅ　ＩおよびＨｉｎｄ　Ｉである
。この遺伝子の主要素であるプロモーター、リボゾーム
結合部位、およびタンパクコーディング領域はノ・イブ
リッド構造であシ、既知の天然ＤＮＡ配列のいずれにも
対応しない。

プロモーター（１−７１）は主としてラムダ・メジャー
・２イトワード・プロモーター（ｌａｍｂｄａｍａｊｏ
ｒ　ｒｉｇｈｔｗａｒｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｌａｍｂ
ｄａ　ＰＲ）およびｌａｃオペレーターである。ｌａｃ
制御下に転写的に極めて高活性のプロモーターを設計す
ることを目的に設定した。この企画を開始した当時、こ
のようなプロモーターは知られていなかった。

しかしながら、トリプトファン・第４ロン・プロモータ
ーと１ａｃプロモーターとの組合せはほぼ同時に独立に
開発され（ｔａｃプロモーター）そしてこれら２つの構
造は同時に公表された（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　、Ｍ、Ｈ
，ほか、［Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　、　５ｔｒｕｃｔｕｒ
ｅａｎｄ　ＦｕｎｃｔｉｏｎＪ（Ｒ，Ｒｏａｒｌｇｕｅ
ｚおよびＭ、　Ｏｈａｍｂｅｒｌｉｎｍ　）　Ｐｒａｅ
ｇｅｒ、Ｎ、Ｙ、　、　１９８２、ｐｐ、４３２−４５
１；ＤｅＢｏｅｒ、Ｈ，Ａ、ほか「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ
　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ（Ｒ，
ＲｏｄｒｉｎｇｕｅｚおよびＭ、Ｃ！ｈａｍｂｅｒ１１
ｎ編）、Ｐｒａｅｇｅｒ、Ｎ、Ｙ、　、　１９８２、ｐ
ｐ、４６２−４８１〕。更に、ラムダＰ８をｌａｃオは
レータと共に含むハイブリッドプロモーターの特異的な
選択は、タンパク−ＤＮＡ相互作用機構に関する独立の
研究のためのモデルシステムとして特に魅力のあるもの
であった。この特別なハイブリッドプロモーターばに、
ｃｏｌｉ　（大腸菌）　ＲＮＡポリメ２−ゼ、ｌａｃリ
プレッサー、ａｒｏ　１７プレツサーおよびｃＩＩＪプ
レツサーによシ認識されよう。それ故これら様々なタン
ノぐりとそれと同じＤＮＡ　（修飾または未修飾のもの
）との相互作用を研究できよう。ラムダＰＬ、に対して
ラムダＰＲが特異的に選択されたのはそれをラムダＰＲ
Ｍプロモーターを含めるように拡張できるからである。

２つのプロモーターを含むように拡張されれば、そのＤ
ＮＡ　′ｆ、、配列修飾の関数としてに、ｃｏｌｉＤＮ
Ａポリメラーゼによるプロモーター選択の研究に用いる
ことができよう。ハイブリッドラムダＰ　７Ｔ　７　Ａ
２／１　ａ　ｃプロモ−ターの初期の構造は６〜５０の
２ムダＰＲプロモ一ター配列（図示せず）と結合された
ｌａｃオペレーター配列（５１−７１の位置）に過ぎな
かった。しかしながら−１０領域と転写開始部位との間
の２ムダＰＲ配列（ｄＡＡＴＧＧＴ　）は５１−５６の
ｌａｃオにレータ−配列（ｄＡＡＴＴＧＴ　）と類似し
ていた。

この類似性は遺伝子のこの領域に位置する合成オリゴデ
オキシヌクレオチドを結合しようとする際にＴ４　ＤＮ
Ａ　ＩＪガーゼを用いた場合に困難を生じた。この類似
性は、ヌクレオチド４６−４９をＴ７　Ａ２プロモータ
ーのこれらの位置（転写開始に関して）に見られる配列
に変えることによシ除かれた。このような置き換えは、
ハイブリッドプロモーターの転写活性に有害なものとは
思われなかつな。何故なら、プロモーターの中でこの領
域の配列は極めて可変だからである。従って最終的なり
ＮＡ配列はラムダＰＲ（５−４５）、　Ｔ７Ａ２（４６
−５０）および１ａｃ（５１−７１）プロモーターの複
合体である。このハイブリッドプロモーターの転写活性
をｌａｃプロモーターの活性と比較した。両プロモータ
ーを同じプラスミド・パックグラウンド内にクローンし
、そしてＥ、ｃｏｌｉのｌａｃ欠失株におけるβ−ガラ
クトシダーゼ活性を測定した。ラムダＰＲ／ｆｒ７Ａ２
／ｌａｃハイブリッドプロモーターは十分に誘導された
ｌａｃプロモーターよりも約５０％高活性であり、異化
代謝産物リプレッション（グルコースを炭素源トスる）
下ではｌａＣプロモーターよシも約４倍高活性であるこ
とが分かる。

リボゾーム結合部位の構造は依然未確定のままである。

Ｅ、ｃｏｌｉにおけるリボゾーム結合部位からの翻訳が
シャイン・ダルガーノ！（Ｓｈｉｎｅ　ａｎｄＤａｒｇ
ａｒｎｏ　）配列と呼ばれるプリンに富むＤＮＡセグメ
ントから約６〜８ヌクレオチドのところに位置するＡＵ
Ｃ）またはＧＵＧコドンのいずれがから開始することは
明らかである。多数のりボゾーム結合部位の体系的比較
に基づき、その他、これら部位内の重要な配列要素に関
するいくつかの知見が想定されている（Ｓｃｈｅｒｅｒ
、Ｇ、ほか、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉａｓ　Ｒｅｓ、　
８　：　３８９５−３９０７　（１９８０）　）。第２
表はこれら様々なりボゾーム結合部位を示している。本
発明のリンパ芽球様細胞ハイブリッドインターフェロン
によシコードされる最初の８個のアミン末端アミノ酸が
示されている。このタンパク配列をコードするであろう
部分的リボゾーム結合部位のセット群をこれらアミノ酸
のすぐ下に示しである。更に、リボゾーム結合部位Ｒ１
，Ｒ２およびＲ６およびそれらから開発された理想化さ
れ念または既知のりボグーム結合部位（Ｒ，Ｂ、Ｓ、）
も示されている。

第２表　　リボゾーム結合部位 アミノ酸配列 アミノ酸コドン 誘導されたＲ１配列　　　　　ＡＡＡＡＡＵＵＡＡＧＧ
ＡＧＧＡＵＣＡＣ理想化された配列　　　　　　ａ　ａ
　ａ　ａ　ａ　、ｕ　ｕ　ａ　ａ　ｑ　ｑ　ａ　ｑ　ｑ
　ｕ　ａ　ｕ　ａ　ｕ誘導されたＲ２配列　　ＡＵ［Ｉ
ＡＣＣＣＡＡＣ［ＪＵＧＡＧＧＡＡＵＵＯＡＩ］Ｌ１１
　Ｒ，Ｂ、Ｓ、配列　　　ａｕｕａＣＣＣａａＣｕｕｑ
ａｑｑａａｕｕｕａｕ誘導されｉＲ３配列　　ＣＧＧＣ
ＣＣＣ（ＪＵＡＣＵＵＧＡＧＧＡＴＪＡＡ−ＡｔＪφＸ
Ｆ　Ｒ，Ｂ、Ｓ、配列　　　Ｃｑ　ｆａｒ　ＣＣＣＣｕ
　ｕ　ａ　Ｃｕ　ｕ　ｑ　ａ　Ｃ１ｑ　ａ　ｕ　ａ　ａ
　ａ　ｕｍｅｔ　−ａｙｓ　−ａｓｐ　−１ｅｕ　−ｐ
ｒｏ　−ｇｉｎ−けｗ　−ｈｉｓ　−口ＡＯＧＵＧＵＧ
ＡＵＵＵＧＣＣＧＣＡＧＡＣＯＣＡ口ｕａｕｑａａａａ
ａａａｕｕａａａａａａＣｕＣａａＡ　Ａ　Ｕ　Ｇ　Ｕ
　ＧてＴＧＡυ０　［Ｔ　Ａ　ＣＣＡ　ＣＡ　Ａ　Ａ　
ＣＣＣＡ　ＩＪａａｕｇｇｃｕａａｑａａａｇｕａｃａ
ａｇｃｃｕａｕＵＡＤＧＵＧｔ）ＧＡＵＣＵｔｌＣＣＡ
ＣＡＡＡＣＣＣＡＵｕａｕｇｕｃｕａａｕａｕｕｃａａ
ａｃｕｇｇｃｇｃｃこの研究を開始した時点で、ハイブ
リッドリボゾーム結合部位の設計の助けとなるいくつか
の知見が得られていた。５ｃｈｅｒｅｒら（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｌｄｇ　Ｒｅｇ、　８　：　５８９５−３９０
７　（１９８０）　）は６８個の既知のＥ、ｃＯｌｉ　
’）ボゾーム結合部位のコンピュータ分析に基づきリボ
ゾーム結合部位モデルを提案、していた。Ｒ１に対して
は、本発明者らはこの配列を更に修飾した後月いること
とした。

最初の修飾ではリンＡ芽球様細胞インターフェロンアミ
ノ酸をコードするアミノ酸コドンをＡＵ（）に対し３′
側に位置させた。可能な限ブリボゾーム結合部位七デル
のヌクレオチド配列を保存した。付加的な配列１１１飾
は各種リボゾーム結合部位をｃｒｏ遺伝子に対し５′側
に含む一連の組換えプラスミドの翻訳効率に関する工５
ｅｒｅｎｔａｎｔおよびＦｉｅｒｓによる分析（Ｇｏｎ
ｅ、９：１−１１２（１９８０））に基づいて行った。

彼等は理想的なりボゾーム結合部位は、ループ部分にＡ
ＵＣ）コドン含有する塩基対合ステム−ループ領域を有
する折シたたみ構造よ）なると結論した。好ましくはシ
ャイン・ダルガーノ配列はステムに対し５゛側としまた
単鎖領域にあるようにする。それ故にＲ１はＡＵ（）開
始コドンのいずれかの側（８６−９０および９６−１０
０）のヌクレオチドから形成される５塩基対を含むよう
に修飾された。これはりボゾーム結合部位配列の８６−
９０の配列を更に変えることによって行った。従って第
２表に示されるよりなＲ１は可能なところではモデル配
列に相当するヌクレオチドを含有していた。しかしなが
ら、リンフ９芽球様細胞インターフェロン遺伝子に対す
る正しいコドンを、含み、ＡＵＧコドンがヘアピン構造
のループ部分に位置し、そしてシャイン・ダルガーノ配
列が単鎖領域中塩基対合ステム構造に対し５′側に位置
するように修飾を行った。

既知のりボゾーム結合部位の修飾によ）リボゾーム部位
Ｒ２ｊ？よびＲ６を別様に誘導した。翻訳開始コンプレ
ックスを用いたＪ、５ｔｅｉｔｚによる初期の研究はＡ
ＵＧコドンを中心とするｍＲＮＡの４０個のりボヌクレ
オテドがリボゲームによるヌクレアーゼ消化から保護さ
れることを実証した（ＮａｔｕｒｅＮｅｗＢｔｏｌ、２
５６：７ｌ−７５（ｔ９７２））。この保躾された配列
は現在一般にリボゾーム結合部位として定義されている
。ＡＵＧコドンに対し３′側に位置する２０個程のヌク
レオチドは極めて可変で６Ｃ，＃定のタンパクのアミノ
末端アミノ酸配列に依存する。Ｒ２およびＲ３のヌクレ
オチドｆ：誘導するための第１段階はリンパ芽球様細胞
インターフェロンアミノ酸配列に潜在的類似性を有する
既知のりボゾーム結合部位を確認することでめった。こ
れは既知のりボゾーム結合部位配列（Ｓｃｈｅｒｅｒ、
Ｇ、Ｆｌ、ほか、＜ｊ９８ΩンＮｕｌｌ。

Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、８；３８９５−３９０７）のＡＵＯ
：２トンから次の７つのコドン（２１ヌクレオチド）を
潜在的リンノぞ芽球様細胞インターフェロン遺伝子リボ
ゾーム結合部位のり２スターとのＤＮＡ配列類似性を指
標に選別することにより行われ丸。

このクラスターはりンパ芽球様細胞インターフェロンの
最初の８個のアミノ酸に対するスヘテの可能なコドンに
由来する。従って既知のりボゾーム結合部位の各ヌクレ
オチドを、そのアミノ酸配列を一定に保ちつつインター
フェロン遺伝子の同じ相対的位置に挿入されうるすべて
の可能なヌクレオチドと比較した０例えば、Ｒ５はφｘ
ｙタン／ぞクリボゾーム結合部位から誘導した。

φＸＦＩＪボゾーム結合部位の３番目のコドンはアスパ
ラギンをコードするＡＡＵである。リンパ芽球様細胞遺
伝子についての３番目のアミノ酸は鯛およびＧＡＯのコ
ドンを有するアスパラギン酸である。従ってアスパラギ
ン酸コドンとして（）ＡＵを選択すれば、φＸＦタンパ
クおよびＲ５’）ボゾーム結合部位内の同じ相対的位置
にある３個のヌクレオチドのうち２個が一致する可能性
がある。

この検査方法を用いて、すべての既知のりボゾーム結合
部位を、潜在的リンパ芽球様細胞遺伝子部位のクラスタ
ー化したセットとの可能な類似性についてスクリーニン
グした。最初の８個のコドン（２４ヌクレオチド）にお
けるリンパ芽球様細胞クラスターとの最大一致率が約５
０俤でちるいくつかを確認した。恐らく多量のタンパク
の翻訳の開始に用いられるこれらのうちの２１固（Ｋ、
ｃｏｌｉ　Ｌｌ　１　タンノぐりおよびφＸＦタンパク
部位）をリンパ芽球様細胞インターフェロンリボゾーム
結合部位として選択した。これら既知ゐ部位のタンパク
コーディング領域（２４ヌクレオチド）内の可能なとこ
ろではＤＮＡ配列を維持した。しかしながら、いくつか
のヌクレオチドはＬｌｌまたはφＸＦアミノ酸のいずれ
よシもむしろリンパ芽球様細胞アミノ酸配列が発現され
Ｊ得るように置き換えられた。ＬｌｌおよびφＸＦタン
パク部位におけるＡＵＧコドンに対し５′側のヌクレオ
チド（各々２６ヌクレオチド）は修飾することなくそれ
ぞれＲ２およびＲ３部位の一部として維持した。いずれ
の設計計画も効果的でるるように思われる。何故々らば
すべて３個のりボゾーム結合部位からインターフェロン
ハイブリッドタンノでりが０．１−２”Ｐ／　０Ｄ５７
８ｎエリツトル量で産生されるからである。

リン／（芽球様細胞遺伝子配列はＮａｍａｌｖａ細胞を
ニューカッスル病ビールス、８１株で誘発することによ
って産生されたヒトリンパ芽球様細胞インター７二ロン
の部分アミノ酸配列から得た。

分析は全タンパクの７６俤をカバーし、またその分析に
よシこのりンノぞ芽球様細胞インターフェロンがａＤＮ
Ａクローニングを経由するかまたはゲノムクローンのＤ
ＮＡ配列決定を通して導かれた既知のヒトインターフェ
ロンの配列には列挙されていないことが示唆された。（
Ｇｏｅａｄｅｌ、Ｄ、Ｖ。

ほかｓ　（１９８ｊ　）Ｎａｔｕｒｅ　２９０　：　２
０−２６　；８ｔｅｂｂｉｎｇ。

Ｎ、およびＷｅａｋ、Ｐ、に、　＜　１９８３　）。「
Ｒｅａｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡＰｒｏｄｕｃｔｓ　、
　Ｉｎ５ｕ：ｔｉｎ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ　ａｎｄ
　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ。

Ａ、Ｂｏｌｌｅｎ編、　ＯＲＯＰｒｅｓ＋ｓ：Ｗｅｉｓ
ｓｍａｎｎ、Ｏ，ほか、（１９８２）ＵＣＬＡ　ｓ７ｍ
ｐ、ＭＯｌ、ｏｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、　２５：２９５−！
１２６）配列決定された領域は２−４６．６０−８５お
よび１１２−１６６のアミノ酸である。これらのポリに
プチドはＩＦＮ−αＯ，ＩＦＮ−α工および１囲−αＦ
のＤＮＡ配列に極めて類似していた。　２−４６の領域
では、リンパ芽球様細胞はプチドとＩＦＮ−αＦのアミ
ノ酸とのアミノ酸の違いは唯１個でめった（リンパ芽球
様細胞配列中の２６位１ｅｕはＩＦＮ−（ＩＰではプロ
リンであった）、シかしながら、カルボキシル末端（１
１２−１６６）の近くでは、リン／ぞ芽球様ｍ砲タンパ
クはＺＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−α工の方によシ類似し
てい丸、このヒトリンパ芽球様細胞インターフェロンが
サイズおよび一般的配列に関しすべての他のα−インタ
ーフェロンに類似していればハイブ芽球様細胞インター
フェロンンターフェロンを導くことができる。まずヒト
リンパ芽球様細胞インターフェロンのペプチド配列をＩ
ＦＮ−α０における類似位置にあわせ、そしてリンパ芽
球様細胞ハイブリッド遺伝子のこれら同じ相対位置く取
シ込んだ。次に装置のリンパ芽球様インターフェロン配
列の代わ〕にＩＦＮ−αＯぼプチド配列ｔ−まず用いた
（アミノ酸４７−５９および８６−１１１）、４７−５
９および８６−１１１位のＩＦＮ−αＣ挿入部分に代え
てＩＦＮ−ｃ＃またはＩＦＮ−α工の相当する配列で都
合よくも置き換えうる。しかしながら、ＩＦＮ−αＣと
ＩＦＮ−αＦ　とが４７−５９位において等価であるこ
とは知られている。このように最終的なインターフェロ
ンハイブリッド遺伝子は、これら２種類の恐らく関連し
たタンパクの複合体である。

本発明の開示は、４７−５９および８６−１１１位にα
Ｃ白血球インターフェロン挿入部を有するハイブリッド
インターフェロン遺伝子の合成に伴う詳細な手順に関す
る。しかしながら、同じ手順によって、これらの位置の
相当する白血球ＩＦＮ−αＦおよびＩＦＮ−α工配列を
導入できる。例えば、４７−５９および８６−１１１位
に白血球ＩＦＮ−αＦおよびα工に相当する配列含有す
る新しい合成りＮＡ断片を合成することができる。次に
これらセグメントを適宜のリンパ芽球様細胞セクション
に連結して付加的なハイブリッドインターフェロンを形
成することができる。これらの新しい遺伝子の構築には
、それら新しいセクションに相当する新しい制限部位を
用いなければならないでぬろう、これら新しい部位は、
単に遺伝子全体をすべての可能な制限部位についてスク
リーニングしそして極めて好都合に使用できるものを用
いることによって確定することができる。

リンパ芽球様細胞ハイブリッドインターフェロン構造遺
伝子のＤＮＡ配列はいくつかの考察に基礎を置いた。ま
ず、デオキシオリゴヌクレオチドを化学的に合成しそし
て酵素的に結合して全遺伝子を形成することとした。末
端１ａｏＲ１部位を含むこの全ＤＮＡ二本鎖は次いでｐ
ＵＯ８の単−ＥｉｃｏＲ１部位にクローンされよう、こ
れらのオリゴデオキシヌクレオチドは一般的に、相補セ
グメント間の重復が最大となシそして単鎖領域間の重復
が最小となるように設計された。遺伝子の設計は［、ａ
Ｏｌｌでの発現を目的としているので。

この生物により好まれるコドンを可能なところ−では選
択した。更にまた。一部のコドンは、酵素による連結反
応の際に重大な問題とな）うる逆位およびダイレクト・
リピート配列が最小となるかまたは排除されるように選
択された。化学合成されたオリゴデオキシヌクレオチド
全酵素的に結合して各々１０８〜２１４塩基対を含む４
種類の二本鎖を形成した。次にこれら４種の二本鎖を個
別罠プラスミド内で増幅し、単離し。

配列決定し、次いで都合のよい制限部位を通し−て順次
結合し、そしてクローンして最終的遺伝子を形成した。

この計画は極めて一般的であシ、そして一段と大きな遺
伝子に対しても用いることができる。何故ならば、比較
的に短い二本鎖（２５０塩基対程度）しか化学的および
酵素的方法によっては合成されないからである。

４セクシヨンとしての全遺伝子のクローニングを首尾よ
く行いつるるる種の制限部位を導入し九。そのほかにも
制限酵素が知られるようになることはメジうる。＄５表
の上の部分は遺伝子を模式的に示し丸ものである。各１
００塩基対および制限部位の大体の位置を示しである。

各種制限部位の正確な位置および配列をも列挙して６る
。

有利に導入された制限部位はＨＩＬｅｌｌｌ（１４９番
目の位置）ｓ　　Ｄｄｅｌ（２４６番目の位置ンおよび
Ｈｌｎｄｌ［（３８４番目の位置）である。これら３つ
の部位を用いて遺伝子をセクションＩＣ１〜１４９）、
ＩＩ（１５０〜２４６）、Ｉ（２４７〜３８４）および
Ｍ　（３８５〜５９８）としてクローンした。　Ｊ！！
、０Ｏ１ｉ中でプラスミドｐＢＲ１２２またはＰＵＯ８
の一部として増幅し、各セクションを単離しそして配列
決定した６次にセクションｌおよび■を％　ＫａｏＲｌ
およびＩＭｅｉ制限断片として、酵素的に結合し、クロ
ーンしそして増幅した。次のこの結合された二本鎖を酵
素的にセクション■に結合し％ＫａｏＲ１およびＨ１ｎ
ｄｌｌ断片としてクローンし％　ｊｌｌ、ａｏ１１中で
増幅し、そしてＫｃ　ｏＲ，ｌおよびＨｌｎｄ　ＩＩＩ
で制限後単離した。最後に、この１００ＲＩおよびＨ１
ｎｌｌ二本＠を酵素的にセクション■に結合した。最終
的な遺伝子を配列決定しセしてα−インターフェロンの
発現について試験した。

構造遺伝子、ハイブリッドプロモーター、および６つの
りボゾーム結合部位は９２個のオリゴデオキシヌクレオ
チド（各々９〜２６モノヌクレオチド）の合成を要した
。構造遺伝子、ハイブリッドプロモーターおよびリボゾ
ーム結合部位Ｒ１の合成計画は前記第１表に示しである
。２種類のＤＮＡ合成方法を用いた。ハイブリッドプロ
モーターとすべての３つのりボゾーム結合部位に対する
オリゴデオキシヌクレオチドはシントン（５ｙｎｔｈｏ
ｎ）として５′−ジメトキシトリチルデオキシヌクレオ
シド−５′−メトキシナト２ゾリルホスホルアミダイト
、ポリマー支持体として共有結合的に結合したデオキシ
ヌクレオシドを含有するシリカゲルを用いて合成した。

保護基を除去した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によプそれらオリゴデオキシヌクレオチドを様々な中間
体から精製した。次に生成物をそのゲルから溶出した。

短Ｇ５０／４０８ｅｐｈａｄｅｚカラムを通して塩類、
緩衝剤および可溶化されたゲル材料を除いた後、オリゴ
デオキシヌクレオチドを［ｒ−３２Ｐ）ＡＴＰおよびＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼで燐酸化した。ゲル電気
泳動分析結果は。

生成物が均質であシ、よシ大きいＤＮＡ二本鎖製造のた
めにＴ４　ＤＮＡ　Ｉ）ガーゼと共に用いうる状態にあ
ることを示してい友。

要約するに、本発明のリンパ芽球様細胞ハイブリッドイ
ンターフェロン遺伝子が合成され、そして４セクシヨン
としてクローンされた。次いでこれら４セクシヨンを結
合して全遺伝子を形成した。すなわち、各々１０〜２５
個のモノヌクレオチドを含有するオリゴデオキシヌクレ
オチドを化学的に合成した。相補セグメントは次のセグ
メントを所定位置に案内するための突出単鎖を含有した
。次にこれらのセグメントを酵素的に結合して各々２１
４以下の塩基対を含有するＤＮＡ二本鎖を形成し九、適
宜の制限部位を用いてこれら遺伝子セクションをクロー
ニングを通して増幅でき、単離し、そして順次相互に結
合して完全に集合した遺伝子を形成することができる。

この計画は極めて一般的でロフそして任意のサイズの遺
伝子を構築するのく用いることができる。各セクション
ともセクション■および■と同様に設計されるべきであ
る。構造遺伝子末端に高頻度（ｈｉｇｈ　ｆｒｅｑｕｅ
ｎｏｙン制限切断部位を有するこれら２セクシヨンはプ
ラスミドベクターにａＳな制限部位（ｆｆ１ａｏＲＩお
よびＨｌｎｄ　ｎ［）を有するリンカ−を用いて合成し
た。必要に応じ１次にその遺伝子セグメントを切シ出し
そしてゲル電気泳動を用いてプラスミドから分離するこ
とができる。ベクターは１つの大きな断片として、そし
て遺伝子セクションは１０８−２１４　’塩基対を含む
小さい二本鎖として移動しよう。

あるいはま九高Ｓ度切断部位（この場合にはＨａｓ■お
よびＤｄｅ　Ｉ　）を用いてそのセクションをプラスミ
ドから直接切シ出すことができる。その遺伝子セクショ
ン二本鎖がプラスミドの二本鎖を欠くゲルの特徴的領域
内を移動する場合にはこの可能性を用いることができる
。必要というわけではないが、特有の制限部位がリンカ
−配列よシはむしろ構造遺伝子の一部である場合には合
成がいくらか簡単となろう。セクション■はこのアプロ
ーチの一例である。遺伝子コードの重複性（ｒｅｄｕｎ
ｄａｎｃｙ）および様々なサイズの塩基対配列を認識す
る多数の制限酵素の故に、この代替方法は通常可能であ
る。

様々な制御領域の生物学的活性およびリンパ芽球様細胞
ハイブリッドインターフェロンは極めて興味深い。プロ
モーターは３つのプロモーター要素の複合体でメク、ま
たリボゾーム結合部位はインター７二ロン遺伝子の丸め
に設計されたので６っていかなる天然配列にも符号しな
い。インター７エロンタンパクはりンパ芽球様細胞およ
び白血球インターフェロンからの配列から成るハイブリ
ッド分子である。Ｃ−タイプ・インター７エはンからの
新しいハイブリッドインターフェロンのセクションは本
発明の好ましい一態様である。所望によってはαＣ−タ
イプ・インターフェロンに代えてαＦ−またはαニータ
イツ白血球インターフェロンセクションヲ用いてもよい
。これらの構造（すなわち、ハイブリッド制御要素およ
びハイブリッドインターフェロン）Ｆ！すべて極めて生
物活性が高かった。

ハイブリッドプロモーターは転写活性はあるが容易に制
御されるように設計した。それはλＰＲおよびＴ７Ａ２
プロモーター訃よびｌａａオイレーターの要素を含有す
る。実験結果はまた転写が］ｎｏレプレッサーおよびＩ
Ｐ’Ｉ”Ｇ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガ２クトシド）
で制御されうろことをも示している。

リンパ芽球様細胞ハイブリッドインターフェロンは２種
類のタンノセクから導れた。約７６饅ｉｊ　Ｎａｍａｌ
マａ細胞ヲニューカッスル病ビールス８１株で誘発する
ことによ）産生されたリンパ芽球様細胞インターフェロ
ンのアミノ酸配列に基づかせた。残）は、白血球インタ
ーフェロンのうちのＣ？ブタイブよシのものとじ九。こ
のハイブリッドタンパクは既知の天然インターフェロン
と同Ｓ度に生物学的に活性があった。ｃＤＮＡクローニ
ングおよび配列決定によシ、既に多くのα−インターフ
ェロンが同定されている。その他ニモコンセンサスイン
ターフエ四ンおよびＡおよびＤナプタイプ（Ｗｅｅｋ、
Ｐ、に、ほか、（１９８１）Ｎｕａｌｅｔｃ　Ａｃ１ａ
ｓ　Ｒｅｓ、９　：６１５！ｌ−６１６６）から形成さ
れる２種類の天然ハイブリッドが合成されそして生物学
的に活性であることが示されている。

（ＡｌｔＯｎ、に、ほか、　「ｐｒｏａｕａｔｌｏｎ、
ｏｈａｒａａｔａｒｉｚａｔｌｏｎａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｊ！ｆｆｆｏｒｔｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ　ＤＮＡＤｅｒｉｖ＠ｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｍ
ａｎ　ＩＦＮ−αａｎｄ　ＩＦＮ−ｒ　Ａｎａｌｏｇｓ
’。

Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　　Ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（１９８３）、！！、ＤｅＭ
ａｅｙｅｒ　ａｎＬ　Ｈ，５ｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ編、
ＥｌＢｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ　Ｂ、Ｖ、）。これらの結果はすべて、α−インター
フェロンが相当に多様性のあるタンパク群であるという
ことを示している。それ故に生物学的活性、収率を最大
とし、あるいは。

場合によっては精製方法を簡易化するために、更に修飾
を加えることも可能でｓｂうる。これらの修飾は、その
遺伝子が完全に合成によるものであシ、セクションとし
てクローンされそして各種制限酵素を介して容易にアク
セスできるものである場合に、最良に行うことができる
。

これと同じ方法は多くの様々なタンパクに対し、一般的
に有用なものとなろう。タンパクをアミノ酸変更により
容易に修飾できれば構造−機能関係に関する課題に極め
て容易にアプローチできる。一方これを柔軟なものとす
るには（多分都合のよい天然制限部位間の）タンパク遺
伝子の少くとも主たるセクションの合成が必要となる。

次に実施例を挙げて本発明を説明するが、それらは本発
明を制限するものではない。

実施例　１ ハイブリッドプロモーターの転写活性 本発明のハイブリッドプロモーターはラムダＰＲ１Ｔ７
Ａ２プロモーターおよびｌａｃプロモーター（すなわち
、それぞれ５−４５，４６−５０および５１−７１の位
置；第１表参照）の複合体である。

このハイブリッドプロモーターの転写活性をｌａｃプロ
モーターの活性と比較した。両プロモーターを同じプラ
スミドバックグラウンドにクローンし、セしてｌａｃ欠
失株（７１−１８）におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
を測定した。この株を用いてこれら２種類のプロモータ
の転写活性を比較した。その結果を第４表に示す。

第４表　ハイブリッドプロモーターの転写活性１活性、
β−ガラクトシダーセ単位２ １ａｃ　（野生Ｗ）　　　　　　　４８００　　　　　
１００００ＰＨ／Ｔ７Ａ２／ｌａｃ　　　　　　１８８
００　　　　　１５５００１　合成１ａｃプロモーター
は天然１ａｃプロモーターの−７４から＋２１の位置ま
でとした。従ってこのセグメントは完全塩基対合二本鎖
としてｌａｃプロモーター、　　ｌａｃオペレーターお
よびサイクリック馳しセプタータンノ１り結合部位を含
んだ、、ＰＲ／’Ｌ’７　Ａ２プロモーターは第１表に
示された遺伝子配列の１から７１までの塩基対合二本鎖
とした。これらの合成プロモーターをｐＲＺ５６０５に
クローンした。このプラスミドはりボゾーム結合部位配
列を含むｌａｃ　Ｚ遺伝子を含有するがプロモーターを
欠いている。ｌａｃ　Ｚ遺伝子の上流には５種類の制限
部位が存在する（　ＫｃｏＲＩ　、　８ｍａｌおよびＢ
ａｍＩＨ）。これら平滑末端二本鎖ｔ−８ｍａ１部征を
通して導入しそして制限地図作成およびＤＮＡ配列決定
により特徴付けた。

２　β−ガラクトシダーゼ活性は炭素源としてグルコー
スかまたはグリセリンを用いてＥ。

Ｃ０１１研究室株７１−１８に対し測定した。

類似のプロモーター構等体が同じプラスミドベクター内
で試験されるというこの測定方法の限界内において、ラ
ムダＰＲ／Ｔ７　Ａ２／ｌａｃハイブリッドプロモータ
ーは十分に誘発されたｌａｃプロモータ・−よりも約５
０％高活性であり、また異化代謝物リプレッション（炭
素源はグルコース）の下ではｌａｃプロモーターよりも
約４倍高活性である。　。

実施例　２ ハイブリッドリンパ芽球様細胞遺伝子のセクシヨンｆの
調製 １−１４９の配列に相当するセクションＩ（第１表参照
）ｔ−２種類の異々るアプローチにより調製した。第１
のアプローチでは、　ＥｃｏＲＩからＨｌｎｄｌｉでの
二本鎖（ヌクレオチド１−３８４）をクローンしようと
いう通常ではない試みからＥｃｏＲＩ−Ｈａｅｌ断片を
単離し九。第２のアプローチはより直接的である。ヌク
レオチド１−１５８を含着する二本鎖を合成してＫｃｏ
ＲＩ　−Ｈａｓ　ｍ断片（１−１４９）をクローンした
。

第１のアプローチにおける配列および相対する合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドを第５表にプロモータの５′側
のＥｃｏＲ１部位からセグメント３６８までのＤＮＡ配
列が示されている。Ｈ１ｎｄ瓜部位もまた示さ孔ている
。文字および数字を囲むブラケットは化学合成され九各
種ＤＮＡセグメントｔ−規定している。文字ＣおよびＳ
はそれぞれ制御領域および構造遺伝子領域を指す。ノ・
イブリッドプロモーター、　　ｌａｃオペレーターおよ
びＲ１１Ｊボゾ一ム結合部位は、大体、それぞれ１ｃｍ
１１ｃ、９ｃｍ１２ｃおよび１５ｃｍ　２０ｃを占めて
い本。Ｒ１内のＡＴＧ開始コドンは１７ｃに存在する。

第５表に示された合成断片まず結合してセグメント１　
ｃ−２０ｃ、１５−２８ｓ’および２９ｓ−５５ｓより
なる３個の二本鎖を形成した。次にこれら３つの二本鎖
を結合して１ｃｍ３３ｓを含有する二本鎖を形成した。

二本鎖１Ｃ−・２０ｃの合成は５つのＴ４−ＤＮＡＩＪ
ガーゼ触媒下の連結段階を踏んで完結させ念。セグメン
）５ｃｍ１０ｃおよび１１ｃｍ・２０ｃは独立的に合成
した。各二本鎖生成物は、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５０
／４０でのゲル浸透カラムクロマドグ２フイにより未連
結セグメントから精製しそしてゲル電気泳動によって分
析した。

最終段階は二本鎖３ｃｍ１０ｃ（５ピコモル）、二本鎖
１１ｃ＝２０ｃ（５ピコモル）、　［５’−５２Ｐ）セ
グメン）２ｃ（１０ピコモル）および未燐酸化１ｃ（２
０ピコモル）を含む多重連結である。この連結反応のケ
゛ル分析を行った。未反応出発材料（二本鎖１ｃｍ１０
ｃおよび１１ｃｍ２０ｃ）および生成物（二本＠１ｃｍ
２０ｃ）のほかに、２種類の特徴未確認の中間体もまた
ゲル電気泳動により同定した。［５１５２ｐ］セグメン
）２ｃはゲルから移動する。１１６および１１５モノヌ
クレオチドよりなるセグメントを含有する二本鎖１ｃｍ
２０ｃから二本鎖１ｃｍ１０ｃおよび１１ｃｍ２０ｃを
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１５０／４０カラムでのクロマドグ
２フイーによシ除いた。この精製段階のゲル電気泳動分
析は前記２種類の特徴未確認中間体が依然として二本鎖
１ｃｍ２０ｃの試料中に残っていることを示している。

二本鎖１ｃｍ２０ｃの収量は１５ピコモルでめった。二
本鎖１１　ｃ−２０ｃの除去は特に重要であった。この
二本鎖は二本鎖１　ｃ−２０ｃと同じ単鎖領域を構造遺
伝子に隣接して有している。二本鎖１１Ｃ−２００を除
かないと、それは。

次の適宜の連結段階の際に、構造遺伝子二本鎖を求めて
、二本鎖ＩＣ’−２０ｃと競合することとなろう。

構造遺伝子セグメン）　１ｇ−２８ａ’を含む二本鎖１
ｓ−２８ｓ’は段階的に合成した。セグメント１５−４
ｓ、　５ｇ’−１０ｓ、１１５１４ｓ’、１５ｓ−１８
ｓ’、１９ｓ’−２４ｓ’および２５ｓ′−２８ｓ’を
結合して中間体二本鎖を形成しそしてカラム精製した。

最終組み立ての第１段階では、二本鎖１ｓ−４ｓを５ｇ
−１０ｇに結合させることによシ二木調１　ｇ−１０ｓ
を合成した後８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５０／４０でのゲ
ル浸透クロマトグラフィにかけた。カラムクロマトグラ
フィ精製二本鎖１Ｂ−１０ｇ　（９０ピコモル）のゲル
電気泳動分析は、大部分の二本鎖５ａ−１０ｇおよび１
ｇ−４ｓが除かれていることを示す。次にこの二本鎖１
ｇ−１０ｇの試料を二本鎖１１ｇ−１４ｓ’に結合して
二本鎖１ｇ−１４ｓ’　（４５ピコモル）１−形成した
。ゲル浸透カラムクロマトグラフィの後には、ゲル電気
泳動分析によって見うるように、過剰の二本鎖１１　ｇ
−１４ｓ’は除かれていた。しかしながら二本鎖１　ｓ
−１４ｓ’は未反応１ｇ−１０ｇで汚染されていた。次
にこの鎖延長途上（ｇｒｏｖｒｉｎｇ）二本鎖を順次、
二本鎖１５ｓ′−１８ｓ’、１９ｓ’−２４ｓ’　。

および２５ｓ’　−２Ｂ、ｔと反応させて二本鎖１ｓ−
１８ｓ（２０ピコモル）　、　　１　ｓ／〜２４ｓ’　
（４５ピコモル）および１　ｇ’−２８ｓ’を形成した
。各中間体二本鎖を８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５０力ジム
クロマトグラフイによシ精製しそしてゲル電気泳動くよ
り分析した。明らかＫそのゲル浸透法は各々の新しく比
較的小さな二本鎖は除いたが、未反応の部分的鎖延長二
本鎖は除けなかった。これらの不完全二本鎖は更に進行
させ、そして二本鎖１ｓ−２８ｓ’の最終試料中に存在
するＤＮＡの大部分を構成している。

最終段階では１ｌｌｓ用ゲル電気泳動くより二本鎖１ｓ
’−２８ｓ’の精製を行った。適宜のバンドをゲルから
切り出し、溶出し、そして精製して塩類や緩衝剤を除い
た。二本鎖１ｇ−２８ｓ’の単離収量は１ピコモルであ
った。

二本鎖２９．９−３３５１を調製した。これらのセグメ
ントを酵素的に結合した後、その二本鎖を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ　１５０／４０でのカラムクロマトグラフィに
より精製しそしてゲル電気泳動により分析した。

二本鎖１　ｃ−５５ｓを二本鎖１ｃｍ２０ｃ、、　１ｇ
’−２９ｓ’および２９ｓ−５３ｓを結合することＫよ
り調製した。

二本鎖１ｃｍ２０ｃ　（１２５ピコモル）、二本鎖１ｓ
−２８ｓ’（α５３ピコモル）および二本鎖２９ｓ−５
３ｓ（５ピ″：Ｉ−Ｔニル）を各々７５℃からアニール
した。次に二本鎖１ｇ−２８ｓ’および二本鎖’１９ｓ
−３５８を混合し、４５℃に加温しそして室温まで冷却
した。

次に二本鎖１　ｃ−２０ｃを添加した。その溶液ｔ−３
７０に加温しそしてまず室温まで１次いで４Ｃまで冷却
した。最終容量は１５μｔであった。Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼ（２，５単位）を添加後１反応を一夜進行させた。

全反応混合物をゲル電気泳動により分画した。Ｈｐａｎ
によるｐＢＲ３２２消化により生じ丸サイズ・マーカー
を用いた。このゲルから精製された二本鎖１ｃｍ５３ｇ
の最終収率は５０フ工ムトモル（ｆｅｍｔｏｍｏＬｅ）
であった。

この反応のゲル電気泳動による分析は、その。

連結反応が１０〜２０ｓしか進行していないことを示し
た。ゲル上には未反応二本鎖１ｃｍ２０ｃ。

１５−２８ｇ’、および２９５−３３ｇの主バンドが存
在した。生成物を適宜のゲルスライスから溶出しセして
Ｈ１ｎｄ瓜で消化してｐＢＲ３２５でのクローニングに
対する準備の整った二本鎖を生成させた。

第２のアプローチによるセクション１の合成では構造遺
伝子のＥｃｏＲＩ−Ｈａｅｎｌ領域に焦点をあてた。配
列および合成計画を第６表に示す。

センス鋼上の５’　ＥｃｏＲ１部位から１４９位のＨａ
ｅ１１部位までのリンパ芽球様インター７エロンハイブ
リツド遺伝子が示されている。数字を伴うプラケットは
化学合成セグメントを囲っている。

“セグメン）１ｃから２０ｃまでは第５表に記載したも
のと同じである。従って、ハイブリッドプロモーター、
ｌａｃオにレータ−１およびＲ１リボゾーム結合部位は
大体、それぞれ配列１ｃｍ１１　ｃ’、　９ｃｍ１２ｃ
、および１５ｃｍ２Ｏｃ　ｔ−占める。Ｒ１中のＡＴＣ
）開始コドン配列は１７ｃＫ存在する。

合成については既に記載した二本鎖１ｃｍ２０ｃ（ｔ５
ピコモル）および二本鎖１ｓ−４ａ　（１５ピコモル）
を５７０からアニールし、そして混合した。３７℃から
４℃まで７ニールした後、　Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを添
加し、そして反応を一夜進行させた。ゲル電気泳動によ
る反応混合物の分析を行った。

Ｐｈａ　Ｉによる制限によりｐＢＲ３２２から生成させ
たサイズ・マーカーを用いた。ゲルから溶出した生成物
、二本鎖１ｃｍ４ｓ　ｔ−０，６ピコモル収量で単離し
た。合成後は、断片Ｉを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａ
１ｌで開裂したｐＢＲ３２２にクローンすることができ
る。セクションＩは二本鎖１ｃｍ２０ｃおよび二本鎖１
ｓ−４ｓから合成した。二本鎖１ｓ−４８を常法により
合成しそして８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５０カラムを用い
て精製した。次の段階では１０倍モル過剰の二本鎖１　
ｇ−４ｓを二本鎖１ｃｍ２０ｃに結合した。反応混合物
のゲル分析は最終生成物（二本鎖１ｃｍ４ｓ　）への転
化が極めて満足しうるものであることを示した。単離収
率（４０チ）がこれらの結果を確認した。

実施例　６ ハイブリッドリンパ芽球様細胞遺伝子のセクション■の
調製 ＥｃｏＲｌおよびＨ１ｎｄｌ１部位を含みそしてインタ
ー　７　ｘ　ａ　ｙ遺伝子のＨａｅｌ１１部位（１４９
位）からＤｄ＋３１部位（２４６位）まで延びるセクシ
ョンｎｔ−第７表に示す。

、Ｉｌｌ、１、」 この制限部位配置を用いてｐＵＣ８のユニークなＥｃｏ
ＲｌおよびＨｌｎｄ　ｍ部位間にセクションｒｉをクロ
ーンした。ｐＵｏ　８にクローンされた遺伝子断片ｔ−
Ｈａｅ　ｍおよびＤｄｅ　１で制限酵素開裂してセクシ
ョン■をインターフェロン遺伝子配列を含有するユニー
ク二本鎖として生成させた。セクションＨに相当する二
本鎖５ｓ１６ｓを２段階で調製した。第１段階では、［
：５／−５２ｐ：ｌ−標識セグメント５ｓ−８ｓ　、９
ｓ−１２ｓおよび１３ｓ−１６ｓｔ−アニールし、そし
て前述の如く（各々４００ピコモルのセグメント）３本
の別々の試鋏管内で連結した。次にこれら３種類の連結
された二本鎖を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　１５０／４０カ
ラムで精製し、プールし、５７℃から一緒にアニールし
そしてＴ４−　！Ｊガニゼ（５単位）を、用いて結合し
た。この連結結果をゲル電気泳動により評価した。最終
生成物である、６鎖に１１３個のモノヌクレオチドを含
有する二本鎖５Ｓ〜１６ｓを調製用ゲル電気泳動により
単離・精製しそしてキャブレートされたＤＮＡマーカー
を基準にサイズについての特徴付けを行った。単離され
た収率は６０ピコモルであった。アリコートの精製二本
鎖を、　Ｈｐａ　ｎで切断されたＩ）ＢＲ１＋２２　Ｄ
ＮＡ　ｔ−サイズ・マーカーとして用いてゲル電気泳動
によシ分析した。生成物はこれらサイズ・マーカーく対
し予測どおりに移動した。ゲル分析により測定したとこ
ろでは、主な連結生成物は特徴付けられていない中間体
二本鎖であった。かかる中間体はいくつかのメカニズム
【より生じうる。最も平凡な説明は化学量論上の問題で
ある。すべての（５／−３２ｐ）−標識オリゴチオ中ジ
ヌクレオチドを等しくないモル比を連結反応に用いた場
合には、収率上、制約している試薬に相当する中間体が
主生成物となろう。しかしながら極めてしばしば１分子
内または分子間二次的コンプレックスの形成により中間
体が蓄積される。これらのコンプレックスは容易には予
測されない。かかる問題は。

オーバーラツプする相補単鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ドを生成させるのく異なる位置を用いて再合成すること
Ｋより極めて容易に解決される。

実施例　４ ハイブリッドリンパ芽球様細胞遺伝子のセクション■の
調製 セクション■の構造遺伝子であるＥｃｏＲ１部位を含み
そしてインターフェロン配列の２４６位のＤｄｅ　１部
位から３８４位のＨｌｎｄ　１１部位まで延びる二本鎖
１７ｓ−２８ｓのＤＮＡ配列を１Ｍ８表に示す。

第８表に記載の制限部位配置を用いてｐＵＣ８のユ・二
一りなＥＣ０ＲＩおよびＨ１ｎｄｌ１部位間にセクショ
ンＩをクローンした。ｐＵＣｆＪ中のクローンされた遺
伝子断片をＤｄｅｌおよびＨｉｎｄｌｌにより制限酵素
開裂してセクション厘をユニーク二本鎖として生成させ
た。（５／−５２ｐ）−標識セグメント１７８〜２０ｓ
（各々１０ピコモル）、２１ｓ〜２−８（各々１００ピ
コモル）および２５ｓ〜２８ｓ（各々１００ピコモル）
をアニールしそして３本の別々の試験管内で連結した。

次にこれら二本鎖を精製することなく混合し、そしてＴ
４リガーゼを用いて酵素的に結合した。反応混合物をゲ
ル電気泳動により評価した。中間体（二本鎖１７ｓ−２
４ｓまたは２１ｓ−２８ｓ）に相当する主バンドがみら
れた。多くの中間体の発生は、恐らく結合段階で未結合
セグメントが存在したためである。各々１４６個のモノ
ヌクレオチドを含有する２頂類のオリボデオキシヌクレ
オチドとしての最終生成物を調製用ゲル電気泳動により
精製された形で単離ｔ、た（１３ピコモル；収率２６Ｔ
ｏ）。アリコートの精製二本鎖をＨｐａ　Ｉにより切断
されたｐＢＲ３２２ＤＮＡをサイズ・マーカーとして用
いたゲル電気泳動くよりサイズとしての特徴付けを行っ
た。精製二本鎖１７ｓ−２８ｓ　（セクションＩ）の収
率は１３ピコモル（収率２６％）でめった。

実施例　５ ハイブリッドリンパ芽球様細胞遺伝子のセクションｙの
調製 本発明のハイブリッドリンパ芽球様細胞遺伝子のセクシ
ョンｙはその遺伝子のＨｌｎｄｆｆｌ　（５８５位、第
１表参照）部位から末端ＥｃｏＲ１部位まで延びる。構
造遺伝子のＤＮＡ配列ｔｓｓｉ位からＢｃｏＲ１部位の
当該遺伝子の末端まで第９表に示す。

第１段階として、　　［５／−３２ｐ］−標識セグメン
ト２９ｓ＝３６ｓ、　５７ｓ〜４０ｓおよび４１ｓ〜５
４ｓを独立的に酵素的に結合して適宜の中間体ＤＮＡ二
本鎖を形成した。次にこれら６種類の二本鎖の各々を精
製しそして段階的に結合した。各二本鎖を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ１５０／４０でのカラムクロマトグラフィによ
り未反応セグメントから精製し、そして精製後にゲル電
気泳動により分析しな。４１　ｇ−５４ｓの精製後に得
られたゲルは１３５および１２３個のモノヌクレオチド
を含むＤＮＡ鎖が分離したことを示した。二本鎖３７５
−４０ｇ　（４５ピコそル）および４１ｓ−５４ｓ　（
１０ピコモル）をＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて酵素的
に結合した。この連結生成物（二本鎖３７ｓ−５４ｓ）
を８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５０／４０カラムで出発材料
から分画した。単離された収量は２．５ピコモル（２５
％）であった。精製二本鎖をゲル電気泳動により分析し
た。二本鎖３７８−５４ｓ　（２，５ピコモル）および
二本鎖２９ｓ−３６ｓ（１０ピコモル）を酵素的に結合
しそして反応混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　１５０／
４０でのカラムクロマトグラフィにより分画した。最終
生成物（二本鎖２９５−５４ｇ、１．６ピコモル）ｔ−
ゲル電気泳動により分析し念。このゲル分析には、ｐＢ
Ｒ３２２を切断することによシ生成させた一連のサイズ
・マーカーを用いた。制約試薬（二本鎖４１ｓ−５４ｇ
）に基づく１部分精製二本鎖２９ｓ−５４ｓの総括収率
は１６慢であった。カラム精製段階は未反応二本鎖２９
ｓ−５６ｓｆ首尾よく除去したが二本鎖３７６−５４ｇ
を生成物から除去できなかった。

実施例　６ リンパ芽球様細胞ハイブリッドインターフェロン遺伝子
のクローニング ５９８１）−ｐ−（塩基対）リンＡ芽球様細胞ハイブリ
ッド遺伝子の４つのサブ断片のクローニングおよび全遺
伝子の組み立てを第１図に概要を示した手順を用いて首
尾よく行った。第１図の最上段は、キーとなる制限部位
を有するインターフェロン遺伝子を概略的に示している
。中段はプラスミド内にクローンされた４つのセクショ
ンを示し、そして下段は段階的にこれらのセクションを
結合するための計画を概略的に示したものである。すな
わち、遺伝子をまず４セクシヨンとしてクローンした。

次に、これらセクションを順次クローンし、そして３段
階でクローンして全遺伝子を形成した。これらの段階を
まとめた結果を第２図に示す。キーとなる遺伝子セクシ
ョンの概要を示すプラスミド誘導体が示されている。５
’　Ｉ！１ｃｏＲ１部位から１４９位ＯＨａｓ厘切断部
位まで延びるセクションＩをＩｃｏＲｌから５８４位の
Ｈ１ａｌｌ切断部位をクローンしようという不成功に終
った試みから単離した。５’　１！！ｃｏＲ１部位（セ
ンス鎖につい【）からＨｌｎｃｌｌｌ［部位に延びる合
成二本鎖をｐＢＲ３２５にクローンした場合には、イン
ターフエ１２／配列の一部を含むクローンのみを単離し
えた。このクローンは２２３〜３７２（または２２５〜
３７４）位を欠失していた。しかしながら、５’　Ｆｌ
ａｏＲｊ部位からｌ１ａｅ（［切断部位までの配列はイ
ンタクトであった。ｐＢＲ３２５！ｌ導体（ｐＭＰｌ９
　）としてのこの遺伝子セグメントを用いてセクション
■を単離した。Ｈａｓ１１部位から２４６位のＤ（Ｌ・
１部位までの構造遺伝子配列を含有するセクション■を
ＩｃｏＲｌおよびＥＩｉｎｄ［ｌリンカーラ用いてクロ
ーン（ｐＭＰｌ）した。この方法によりｐσＣ８におけ
る工＝−りなＥｌｃｏＲｌ　−Ｅｆｉｎｄｌｉ二本鎖と
してのクローニング、単離および配列決定を容易に行う
ことができた。同様にして２４７位のＤ（ｌθ■部位か
らＨｌｎｄｎ［までの構造遺伝子配列を含むセクション
厘をｌｌ１００Ｒ１す／カーを用いてりｑ−ン（ｐＭＰ
３３）　Ｌ、３８４位のＨｌｎｄ［［切断部位から構造
遺伝子の３′末端の！！ｃｏ１１部位まで延びるセクシ
ョン■をｌｌ１ｃｏＲ１およびＨｌｎｄｌｉで開裂した
ｐｃｒ０８に挿入した。得られたプラスミド（ｐＭＰ２
　）はＤＮＡ配列決定によりセクション■を含有するも
のと特徴付けられた。

生体内でり四−ンされた遺伝子断片を増幅後、セグメン
トを単離しそしてｐσａ８中で段階的に組み立てた。セ
クション■は、ＦｉｃｏＲｌおよびＨａｅｌｌ制限酵素
で処理した後１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
用いて分画することによりｐＭＰ　１９から単離した。

同様に、セクション■はＨａｅＪｌおよびＨｌ　ｎｄｌ
ｌ［で処理した後ｐＭＰ１から単離した。２つのセグメ
ントをゲルから回収し、Ｔ４−ＤＮＡ　！ｊガーゼを用
いて結合し、そして１ｃｏＲＩおよびＨｌｎｄｌ［酵素
で開裂したｐσＣ８にクローンした。

５’Ｒ：ｃｏＲ１部位からＤｄａ１部位（セクション１
−ＩＩ　）まで延びる適宜の２４６塩基対二本鎖を含む
クローンを同定した（　ｐＭＰ４５６　）。そのプラス
ミドをまず１！：ｃ　ｏＲｌおよびＤｄｅ　ｌ酵素で処
理し次に調製用ゲル電気泳動くかけることによりセクシ
ョンＩ−■をｐＭＰ４５６から回収した。同様にしてｎ
ａｅｌおよびＨｌｎｄｌ［［を用いた酵素消化によりセ
クション■をｐＭＰ３３から回収した。次にセクション
Ｉ−ＩＩを共通のＤｄｅ　１部位を通してセクションｆ
ｆＩＫ結合し、そして生成物（セクションｌ−１−１１
１）　ヲｐσＣ８にクローンした。セクションｒ−ＩＩ
−［を含有するプラスミドを単離しくｐＭＰ１８）　ｓ
そして制限分析により特徴付けを行った。最終段階にお
いてセクションｉ−ｎ−ｍをセクション■と結合した。

セクションｌ−ｎ−１１およびセクション■を、　ｍｃ
ｏＲｌおよびＨｌｔｏｌｌ［を用いた酵素処理をした後
、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて単離
することにより、それぞれｐＭＰ１８およびｐＭＰ２か
ら単離した。これら２つのセクションをＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼで結合しそし”Ｃｐ［ｒ０８にクローンした後、
　　ｐＭＰ１０５中での遺伝子の正しい組み立てを制限
酵素分析およびＤＮＡ配列決定により確認した。ｐσＣ
８に関し両配列方向でインターフェロン遺伝子を含むク
ローンが得られた。

実施例　７ ハイブリッドリンパ芽球様細胞遺伝子へのりボゾーム結
合部位Ｒ２およびＲ３の組入れ最初に組み立てたインタ
ーフェロン遺伝子（第１図および第２図参照）はりボゾ
ーム結合部位Ｒ１を含有した。この遺伝子が繻レベルで
発現する可能性を最大とするために、さらに２つのりボ
ゾーム結合部位Ｒ２およびＲ３を構築した。

このようにして、３つの異なるリボゾーム結合部位から
の翻訳開始を正しくチェックできた。

何故ならプロモーターまたは構造遺伝子のいずれにもヌ
クレ亨チド配列の変更は導入されなかったからである。

Ｒ２およびＲ５に和尚する化学合成セグメントをｌｌ１
ｃｏＲ１−Ａｌｕｌ二本鎖として組み立てた。それ故、
各二本鎖はインターフェロン遺伝子の最初の９個のコド
ンと、λＰＲ／Ｔ７Ａ２プロモーター、　　ｌａａオは
レータ−および適宜のりボゾーム結合部位を含む全制御
領域とを含有した。

リボゾーム結合部位Ｒ２を含むＫｃｏＲｊ−Ａｌｕｌ二
本鎖の調製 Ｒ２二本鎖のＤＮＡ配列を第１０表に示す。

第１０表は、ＫＯ’ＯＲ）からＡｌｕＩまで延びそして
構造遺伝子のセグメント１ｓおよび２ｓを含む二本鎖を
示している。Ｒ１制御領域（第５表参照）との比較から
れかるように、プロモーター−ＩＬｃオイレーターおよ
び最初の２つの構造遺伝子セグメントにそれぞれ相当す
るセグメント１０〜１１ｃおよび１ｍ、’ｌｓは同一で
ある。Ｒ１のリボゾーム結合部位配列（１２ｃｍ２０ａ
）およびＲ２のそれ（２１Ｃ−２９ｃ）は相異している
。未燐酸化１ａ（２００ピコモル）および（５／−３２
ｐ〕−標ｖＩｔ２ｃを８μ℃リガーゼ緩衝液中で７５℃
からアニールした。〔５′−５２Ｐ〕−標識を有する予
め形成された二本ｆｌ１３ａ−１０ｃ（８０ピコモル）
を溶解し、　　１ｃおよび２Ｃと共にプールし、そして
その混合物を３７℃からアニールした。次にこれらのセ
グメントを予め形成されり［５／　−５２ｐ：］−標識
を有する二本鎖（２１ｃｍ２９ｃ）（６０ピコモル）と
組み合わせ、そしてその混合物を３５℃からアニールし
た。最終容量は４０μａであった。Ｔ４−ＤＮＡ　＋７
ガーゼ（５単位）を添加し、そして結合反応を一夜進行
させた。［５／−！２ｐ］−標識セグメント１ｍおよび
２ｇ（各１００ピコモル）およびで４−ＤＮＡリガーゼ
（２，５単位）を添加しそしてインキユベーシヨンを更
に６時間４℃で続けた。その連結反応混合物を真空乾燥
し、４０μｍホルムアミドに再溶解し、沸騰水浴中で３
分間加熱し、そし【８Ｍ尿素含有８ｅＩｋアクＩＪ　Ａ
／アミドゲルに載置した。Ｒ２生成物二本鎖（１ｃｍ２
ｇ）を含むアクリルアミドのバンドをゲルから切り出し
、そして二本鎖を抽出し、エタノールで沈殿させた。最
終収量は＆５ピコモルであった。二本鎖１ｃｍ２ｓ（５
ピコモル）を１０μＬ制限緩衝液中で７５℃からアニー
ルし、次いで３７℃で２時間Ａ１ｕｌ　（１０単位）で
処理した。この制限開裂により得られた生成物をゲル電
気泳動により分析した。Ａユｕ１部位での開裂によりｊ
ｓおよび２ｓから生成した小さな二本鎖はゲル底部近傍
にみられた。最も移動の遅いバンドは未制限二本鎖に対
応した。ＩａｏＲｌ−ｈｌｕ■二本鎖は分離鋼と同様に
移動し、また主な５２２−標識バンドであった。

ｐＢＲ５２２のＨｐＪ開裂により生成したサイズ・マー
カーを用いた。Ａｌｕ　ｌにより消化された二本鎖を８
ｓｐｈａｄｅｘ　（）　１５０／４０カラムで分画しそ
してゲル電気泳動により分析された。カラム溶出液はＲ
２のＩＣａｏＲｌ　−Ａｌｕｌ二本鎖および未消化二本
鎖１ａ−２８を含有した。回収量は＆５ピコモルであっ
た。

リボゾーム結合部位Ｒ３を含むｘａｏＲＩ−ａｌｕｌ二
本鎖の調製 Ｒ３二本鎖のＤＮＡ配列を第１１表に示す。

第１１表は、ＥｃｏＲｌからＡｉｌまで延び、そして構
造遺伝子のセグメノ）　１ｇおよび２ｓを含む二本鎖を
示している。Ｒ１制御領域（第５表参照ンとの比較から
れかるように、プロモーター−１就オ堅レータ−および
最初の２つ０Ｊ３１を造造伝子セグメントにそれぞれ相
当するセグメント１ｅ−１１ｃおよび１ｇ、２ｇは同一
である。Ｒ１のリボゾーム結合部位配列（１２ｃｍ２０
ｃ）およびＲ３のそれ（３０ｃｍ３８ｃ）は相違してい
る。Ｒ３を含む二本鎖１ｃｍ２ｓを形成するためのこれ
らセグメントの連結は、Ｒ２配列を含む同じ二本鎖の合
成について記載したのと同じ方法で完結した。セグメン
トの量は次のとおりであった：１ａ（３２０ピコモルン
ｅ　２ｃ　（１°６０ピコモル）　　：　３ｃｍ１０Ｃ
（８０ピコモル）　：　２９ｃｍ５８ｏ　（６０ピコモ
ル）：１ｓ（１００ピコモルン；　２ａ　（１００ピコ
モル）。

最終収量は１４ピコモルであった。前述の如（Ａｌｕｌ
で消化した後、Ｒ３含有ＥｃｏＲＩ−Ａｌｕｌ二本鎖を
５ピコモルの二本鎖ｊｃ−２ａから！Ｌ５ピコモルの収
量で単離した。この合成結果をケ゛ル電気泳動によって
分析した。

二本鎖１Ｑ−２８を前述の如くカラムクロマドグ之フイ
によりＩＷ製した。ｐＢＲ５２２をＨａｅｌで消化する
ことにより生成させたサイズ・マーカーを用いて次のも
のをケ゛ル電気泳動により分析した：連結されコラム精
製された二本鎖ｊａ−２ｓ　；ＡｌｕＴで消化後の二本
鎖１ｃｍ２ａからの反応混合′吻；カッム精製されたＡ
ｌｕ　ｌ消化混合物。ｐＢＲ３２２を制限酵素Ｈａ　ｏ
ＲｌおよびＰｕｕ　［で開裂した。Ｒ１およびＲ２を個
別に開裂プラスミドにＫｃｏＲｌ　−Ａｌｕｌ断片とし
てクローンした。

リボゾーム結合部位Ｒ２およびＲ６を含むハイブリッド
インターフェロン遺伝子の組み立て。

リボゾーム結合部位Ｒ２およびＲ５を含むインターフェ
ロン遺伝子の組み立ての概略説明が第３図に示されてい
る。図の上段にはＲ１を含むもとの遺伝子構成の概要が
示されている。まずＨｉ禰、次いでＡｌｕ　ｌで制限す
ることにより、　Ａｌｕ１４１ｎｄ［ｌ二本鎖を生成さ
せる。次に、　Ｒ２またはＲ３配列のいずれかを含むＢ
ｃｏＲｌ−Ａｌｕｌ二本鎖（図の左側部分）をＡｌｕｌ
　−Ｈ１ｎｄｌｌ二本鎖に結合する。第６図の下段に示
されているように次に全遺伝子を再合成する。

Ｒ１を含みそしてｐＭＰ　１０５中で組み立てたインタ
ーフェロン遺伝子を１ｎＣＯＲ１およびＨｌｎｄｌｌで
切断した。次にその３８４塩基対ＥｃｏＲ１−Ｈｌｎｄ
ｌｌ［二本鎖をＡｌｕｌで切断した。その遺伝子をまず
Ｈｌｎｄｌｌ［で切断することにより、遺伝子内の唯一
の他のＡｌｕ　ｌ認識部位（ａｔｎａ■部位）は単鎖と
して存在し、したがって不動化された。２６７塩基対Ａ
ｌｕｌ−Ｈｌｎｄ［［に二本鎖を単離し、そしてＲ２ま
たはＲ３のいずれかを含む］ｌ！！ｃｏＲ１−Ａ工ｕｌ
二本鎖に結合した。

次にこの新しいＥｌｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌ！二本鎖を
ｐσ０８にクローンし、増幅し、セして再単離した。最
後に。

Ｒ２またはＲ３のいずれかを含む各３８４塩基１！！ｃ
ｏＲ１−Ｈｌｎｃｌ［［二本鎖を遺伝子の残部（Ｈｔｎ
ａｌ［［−ｇｃｏｕｌ）に連結しそしてｐ［７０９に挿
入した。クローニングビイクルに関して両配列方向の遺
伝子を有する二本鎖をもったプラスミドを同定すること
ができた。

実施例　８ α−ロリンパ芽球様細胞ハイブリッドインターフェロン
のＥ、　ｃｏｌｉでの発現および生物学的活性 リンノぐ芽球様細胞ハイブリッドインターフェロン遺伝
子をｐＵ０８プラスミドとしてＬ　ｃｏｌｉで発現させ
、また、細胞変性作用阻止測定法による測定の結果、生
物学的に活性であることが認められた。リボゾーム結合
部位Ｒ１、Ｒ２およびＲ３を含む遺伝子の３種類の異な
る構築体について・測定した。各種実験結果を第１３表
および第１４表に示す。

第１３表　細胞変性阻止作用により測定されたリンパ芽
球様細胞ハイブリッドインターフェロン測定結果のまと
め１ Ｒｊ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，３Ｒ１０，１５ Ｒ１α１５ Ｒ２９ Ｒ２５ Ｒ２２ Ｒ３０，２ Ｒ３０，２ Ｒ３０，２ １ウシ腎細胞系統ＭＤ　ＢＫに対し、チャレンジ（攻撃
株）としてベジキュラー・ストマタイティス・ビールス
（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｌｒ
ｕｓ）　　を用いて測定を行った。

２　細胞は４〜５の０Ｄ５７８ｒＢで測定した。

第１４表　３種類のりボゾーム結合部位（Ｒ１、Ｒ２，
Ｒ３）を用いるす／パ芽球様細胞−白血球α−Ｃハイブ
リッドインターフェロン活性の力価測定Ｒ工Ａ＊　　　
ＯＰＫ＊＊ Ｒ３１１０１３１６０μｇ／Ａ　　７０ｆｉＪ１２　　
　　　　５　　　５５０μｇ／Ｚ　３５０μｍｔ３　　
　　　　３　　　　１００μシ／ｌ　　６０μｇ／Ｚ７
１１８　　　　１　　　　　　３　　　　７５μｇ／ｌ
　　６μｇ７ｔ２　　　　　　５　　　７００μｇ７’
１５００μｇ／１３　　　　　３　　　１５μνｌ　　
６μシｔ７９０２　　　　１　　　　　　３　　　　５
０μｇ／ｌ　２００ｔｔｇ／Ｌ２　　　　　　５２５μ
ｇ／ｌ　　　５μｇ／ｌ−３３５０゛μｇ／１２００μ
ｔＪＬ ＊Ｒ工Ａ−標準α−インターフェロン誰を用いた放射免
疫測定法＊＊ａｐｍ−クシ腎細胞系統（ＭＤＢＫ）およ
びチャレンジとしてベジキュラー・ストマタイテイス・
ビールスを用いた細胞変性作用阻止測定法。この測定法
による比活性は５−１０Ｘ１０８単位／キタンパクであ
った。

ヘシキュラー・ストマタイテイス・ビールスでチャレン
ジされたウシ腎細胞系統（ＭＤＢＫ　）を用いて測定さ
れたハイブリッドインターフェロンの比活性は１−ＩＸ
１０８単位／岬であった。すべて３種類のりボゾーム結
合部位は翻訳活性があるように思われる。翻訳開始活性
の順位はＲ２＞Ｒ３＞Ｒ１である。

発現レベルは、全細胞タンパクのゲル電気永動により評
価した。Ｒ１、Ｒ２およびＲ５により制御される遺伝子
を有する］！！、　ｃｏｌｉ株の菌体溶解物を評価した
。そのケ゛ル電気泳動のために、アンピシリンを補給し
、１０”−’Ｍ工ＰＴＧで誘発された栄養培地中でｐＭ
Ｐ１０５含有Ｆ！、ｃｏｌｉを０．４〜０．６０Ｄ５７
８まで増殖させることにより菌体溶解物を得た。

３時間後に集菌し、音波処理により溶解しそしてアリコ
ートをケ゛ルに載置した。各リボゾーム結合部位により
産生されたインターフェロンハイブリッドタンパク量は
、ビールス・チャレンジ測定法を用いて得られた結果と
一致する。Ｒ２がらは、　Ｒ３またはＲ１のいずれより
も多くのインターフェロンが産生されるように思われる
。

実施例　９ オリボデオーキシヌクレオチドの化学合成制御領域配列
（プロモーター、　１ａｃオペレーターおよびリボゾー
ム結合部位）を含むオリゴデオキシヌクレオチドは、５
′−ジメトキシトリチルデオキシヌクレオチド−６−テ
トラゾリルホスホルアミグイトをシント／として用いる
シリカゲル、［リマー支持体におい【合成した。他のす
べてのオリゴデオキシヌクレオチドも同様にしてシリカ
ゲルホリマー支持体において合成されたがシントンとじ
ては５′−ジメトキシトリチルデオキシヌクレオシド−
３’−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイトを用
いた。それら化学的手順は公表されているｌ：ｏｈｅｍ
ｉｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　Ｏｌｉｇｏｄｅｏ
ｘｙｎｕａｌｅｏｔｌｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｐｈ
ｏａｐｈｉｔｅＴｒｉｅａｔｅｒ　　工ｎｔｅｒｍｅｌ
ｉａｔｅｅ、Ｍ、Ｈ，０ａｒｕｔｈｅｒｓ。

口ｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｆｌｎｇｙｍａｔｉｃ
　　８ｙｎｔｈｅｓｉａ　　ｏｆ　　Ｇｅｎｅｒｒａｇ
ｍｅｎｔｓ＊　Ｇａ　Ｇａ５５ＯｎおよびＡｎｎＯＬａ
ｎｇ　　編。

Ｖ＠ｒｌａｇ　Ｏｈｅｍｉｅ、　Ｄｓ＠ｒｆｉｅｌｄ　
Ｂｅａｃｈ、　Ｆｌｏｒｉｄａ。

（１９８２））。合成完了後、各オリゴデオキシヌクレ
オチドから保護基を除き、そしてポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により単離した。合成デオキシオリゴヌクレ
オチドを含有するシリカゲルをまずトリエチルアンモニ
ウムトリノエノキサイドで処理してヌクレオチド間ホス
ホトリエステルからメチル基を除いた。次の段階では、
濃水酸化アンモニウムを２０℃で６時間用いて、オリゴ
デオキシヌクレオチドを支持体に結合しているエステル
を加水分解した。遠心分離を行い、そして失敗配列と正
しいオリゴデオキシヌクレオチドの混合物を含む上溝を
回収後、前記績水酸化アンモニウム溶液を５０℃で１２
時間加温することにより、デオキシ７トシ／およびデオ
キシアデノシンからはＮ−ベンゾイル基を、そしてデオ
キシグアノクンからはＮ−インブチリル基を除去した。

５′−〇−ジメトキシトリチル基は８０％酢酸を用い【
加水分解した。最終生成物をゲル電気泳動により失敗配
列から単離した。加水分解物を真空乾燥し、ホルムアミ
ドに溶解し、１００℃で５分間加温し、そしてトリス−
ボレート緩衝液（ｐＨａＯ）を用いた７Ｍ尿素中で調製
された１２慢ポリアクリルアミドに載置した。ゲル電気
泳動後、オリゴデオキシヌクレオチドを、ゲル後方のケ
イ光シリカケ゛ル・プレートと共に短波長紫外光を用い
てケ゛ル上で可視化した。ＤＮＡセグメントに相当する
紫外吸収バンドをケ゛ルから切り出し、そしてオリゴデ
オキシヌクレオチドを溶出した。溶出液をｎ　−ブタノ
ールで４回抽出し、乾燥し、１２ｍの水に再溶解し、１
０ｍＭ０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニラ　ＴＩＣＡＢ
で゛）゛平衡した５ａｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５０／４０
カラム（５ｄシリンジ）でのカラムクロマトグラフィに
より塩類を除いた。

実施例　１０ 〔５ｌ−５２Ｐ〕−標識オリゴデオキシヌクレオチドの
調製 オリゴデオキシヌクレオチド（１００〜５００ピコモル
）をＴａ−４リヌクレオチドキナーゼと２．５　１０Ｘ
１０’ｃｐｍ／ビニ’モＡ’Ｃ）比活性を有スル（ｒ−
５２Ｐ：１ＡＴＰで燐酸化した。５〜１５．Ｕｎの３３
　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｌ、　（ｐＨ７，５）、５．５
　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｊＬ２および５ｍＭ　ＤＴＴ中で反応
を完結させた。５７℃で３０〜４０分後反応混合物を７
５℃で加温してＴ４−キナーゼを失活させた。アリコー
トをポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した後
オートラジオグラフィにかけて結果を肉視できるように
した。

実施例　１１ 燐酸化オリゴデオキシヌクレオチドの連結ｓｌ　＋　燐
酸化オリゴデオキシヌクレオチド（１００〜５００ピコ
モル）、〔ｒ−３２ｐｌ　ＡＴＰ　、　　および失活し
たで＜−Ｍリヌクレオチドキナーゼを含む反応混合物は
通常精製することなく連結反応に用いた。各相補配列対
を燐酸化セグメントの合一溶液を９５℃に加温しそして
４℃まで徐冷することによりアニールした。次に相補単
鎖領域を有する２組のアニールされた二本鎖をプールし
、５７℃に加温し、そして４℃に徐冷した。

その溶液を最終容量２０〜３０μλ中Ｔｒｉ日−Ｈｃｔ
（ｐＨ７、５　）　６６ｍＭ、　ＭｇＣｌ２６．６ｍＭ
、　ＤＴＴ　１０ｍＭ　　およびＡＴＰ４００μＭとな
るように調節した。’ｒ４−　ＤＮＡリガーゼ（１〜２
単位）を添加後、反応混合物を１２〜１５時間インキュ
ベートし、次にポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い
て測定した。

反応混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５Ｑ／４０カラ
ムで分画した。４０〜５０ヌクレオチドの鎖長の連結さ
れたＤＮＡセグメントに対して、カラムサイズは１×２
０口であった。より大きな分子に対しては、サイズはＩ
　Ｘ　９０ｃｍであった。分画後、各カラムを１０　ｍ
Ｍ　ＴＫＡＢで十分洗浄し、モしてα５−の９５俤ホル
ムアミドを予め負荷した。連結反応混合物を乾燥し、４
０μＬの９５％ホルムアミドに溶解し、１００℃で３分
間加温し、セしてカラムにかけた。１０　ｍＭ　ＴＫＡ
Ｂを用いてＤＮＡな（Ｌ２〜０．４−画分として溶出し
、集め、そし【計数した。プールした画分な乾燥させそ
して１０ｍＭＴｌ！ｉＡＢまたは次の段階に適した緩衝
剤に再溶解した。

実施例　１２ ゲル精製 ７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミトメ／Ｉ／（８〜１０
チ）を用いて完全に均質なりＮＡ二本鎖を連結反応混合
物から単離した。常法に従って、連結反応混合物を乾燥
させ、９５チホルムアミドに再溶解し、１００℃で３分
間加温しそしてゲルに載置する。電気泳動後、ＤＮＡを
オートラジオグラフィにより位置測定し、セしてケ゛ル
から抽出した。２．５容エタノールを用いて抽出液から
沈殿させた。更に２回沈殿させた後、ＤＮＡを乾燥し、
そして１Ｑ　ｍＭ　ＴＫＡＢまたは次の段階に適した緩
衝剤に再溶解した。

【図面の簡単な説明】

第１図は５９８塩基対リンパ芽球様細胞ノ〜イブリッド
遺伝子の４つのサブ断片のクローニングおよび全遺伝子
の組み立ての手順を示す概略図である。 第２図は４セクシヨンを３段階でクローンして全遺伝子
を形成する過程を示す概略図である。 第３図はりボゾーム結合部位Ｒ２およびＲ３を含むハイ
ブリッドインターフェロン遺伝子の組み立て手順を示す
概略図である。 ％許出ｍ人　　ユニパーシティ・パテンツ・インコーホ
レイテッド 外２名 手続補正書（方式） 昭和６０年１２月２６日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　　殿 ■、事件の表示 昭和６０年特許願第１１９９９号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　ユニバーシティ・パテンツ・インコーホレイテッ
ド５、代理人 ５、補正命令の日付 ７、補正の内容 昭和６０年１１月６日付補正指令に基づき、以下の箇所
を各々別紙該当頁のものと差し替えます（内容に変更な
し）。 １）特許請求の範囲 、２）第４８〜４９頁　（第１表） ３）第５５頁　　（第２表） ４）第６８頁　　（第３表） ５）第８２頁　　（第５表） （第８２Ａ、８２Ｂ頁になった） ６）第９０頁　　（第６表） ７）第９３頁　　（第７表） ８）第９７頁　　（第８表） ９）第１ＯＯ頁　（第９表） １０）第１０９頁　（第１０表） １１）　　第１１３頁　（第１１表） 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次式 ５′−ＡＴＧ−Ｗ−Ｘ−Ｐ−Ｙ−Ｂ−Ｚ （式中ＷはＴＧＴまたはＴＧＣであり；Ｘはヒトリンパ
   芽球様細胞インターフェロン（ＬｂＩＦ）のアミノ酸２
   〜４６をコードするデオキシヌクレオチドより本質的に
   なり；Ｙは該ＬｂＩＦのアミノ酸６０〜８５をコードす
   るデオキシヌクレオチドより本質的になり；Ｚは該Ｌｂ
   ＩＦのアミノ酸１１２〜１６６をコードするデオキシヌ
   クレオチドより本質的になり；ＰはヒトαＣ−、αＦ−
   、またはαＩ−型白血球インターフェロン（ＬｅＩＦ）
   のアミノ酸４７〜５９をコードするデオキシヌクレオチ
   ドより本質的になり、そして【遺伝子配列があります】
   又は【遺伝子配列があります】 であり；Ｂは該αＣ −、αＦ−、またはαＩ−型ＬｅＩＦのアミノ酸８６〜
   １１１をコードするデオキシヌクレオチドより本質的に
   なり、そして 【アミノ酸配列があります】 である〕で表わ されるプラス鎖を有する、１６６アミノ酸を含みそして
   所望により付加的なメチオニンをＮ末端における通常の
   第１アミノ酸に結合させたハイブリットリンパ芽球様細
   胞−白血球ヒトインターフェロンをコードするデオキシ
   ヌクレオチド配列；および単一または多数の塩基置換部
   分、挿入部分および逆位部分を含む転写的および翻訳的
   等価物；およびその、前記ハイブリッドインターフェロ
   ンまたはその生物学的に活性な断片の発現を可能にする
   実質的断片（以上において、Ａはデオキシアデニルであ
   り、Ｇはデオキシグアニルであり、Ｃはデオキシシトシ
   ルであり、そしてＴはチミジルである）。 ２）Ｘが【アミノ酸配列があります】であり；Ｙが【ア
   ミノ酸配列があります】で あり；そして Ｚが【アミノ酸配列があります】 である特許請求の範囲第１項記載のデオキシヌクレオチ
   ド配列。 ３）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第２ 項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ４）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第２ 項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ５）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第２ 項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ６）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第２ 項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ７）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第２ 項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ８）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第２ 項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ９）特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の
   ＤＮＡ配列よりなる組換えＤＮＡ分子。 １０）そのＤＮＡ配列は発現制御配列に作用的に連結さ
   れている特許請求の範囲第９項記載の組換えＤＮＡ分子
   。 １１）発現制御配列がｌａｃ系；β−ｌａｃ系；ｔｒｐ
   系；λファージの主オペレーターおよびプロモーター領
   域；ラムダＰ＿ＲおよびＴ７Ａ２プロモーターおよびｌ
   ａｃプロモーターのハイブリッドプロモーター；および
   原核および真核細胞およびそれらのビールスの遺伝子の
   発現を制御する他の系よりなる群から選択される特許請
   求の範囲第１０項記載の組換えＤＮＡ分子。 １２）特許請求の範囲第９項〜第１１項のいずれかに記
   載の少くとも１つの組換えＤＮＡ分子で形質転換された
   宿主。 １３）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、
   枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、また
   は細菌、酵母またはその他の菌類、マウスまたはその他
   の動物、または植物宿主およびヒト組織細胞よりなる群
   から選択される特許請求の範囲第１２項記載の宿主。 １４）Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ　７１
   １８およびＥ．ｃｏｌｉ７９０２よりなる群から選択さ
   れる特許請求の範囲第１２項または第１３項記載の形質
   転換された宿主。 １５）特許請求の範囲第１２項〜第１４項のいずれかに
   記載の形質転換された宿主により産生されたハイブリッ
   トリンパ芽球様細胞−白血球ヒトインターフェロンの免
   疫学的または生物学的活性を示すポリペプチドまたはそ
   の断片および誘導体。 １６）次式 ５′−Ｌ−Ｏ−Ｑ−ΛＴＧ−Ｗ−Ｘ−Ｐ−Ｙ−Ｂ−Ｚ−
   Ｅ 〔式中、Ｌはプロモーター領域より本質的になり：Ｏは
   オペレーター領域より本質的になり；Ｑはリボゾーム結
   合部位の一部であり、そして【遺伝子配列があります】
   であり；ＷはＴＧＴまたはＴＧＣであり；Ｘはヒトリン
   パ芽球様細胞インターフェロン（ＬｂＩＦ）のアミノ酸
   ２〜４６をコードするデオキシヌクレオチドより本質的
   になり；Ｙは該ＬｂＩＦのアミノ酸６０〜８５をコード
   するデオキシヌクレオチドより本質的になり；ＺはＬｂ
   ＩＦのアミノ酸１１２〜１６６をコードするデオキシヌ
   クレオチドより本質的になり；ＰはヒトαＣ−、αＦ−
   、またはαＩ−型白血球インターフェロン（ｌｃＩＦ）
   のアミノ酸４７〜５９をコードするデオキシヌクレオチ
   ドより本質的になりそして 【遺伝子配列があります】又は 【遺伝子配列があります】であり； Ｂは該αＣ−、αＦ−、またはαＩ−型ｌｃＩＦのアミ
   ノ酸８６〜１１１をコードするデオキシヌクレオチドよ
   り本質的になり、そして 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】であり； Ｅは停止領域より本質的になる〕で表わされるプラス鎖
   を有する、ハイブリットプロモーター領域、オペレータ
   ー領域、リボゾーム結合部位、および１６６個のアミノ
   酸のポリペプチドをコードしそして所望により該ポリペ
   プチドのＮ−末端における通常の第１アミノ酸に結合し
   た付加的メチオニンをコードするポリペプチド・コーデ
   ィング領域および停止領域よりなるハイブリットリンパ
   芽球様細胞−白血球ヒトインターフェロンをコードする
   デオキシヌクレオチド配列；および単一または多数の塩
   基置換部分、挿入部分および逆位部分を含む転写的およ
   び翻訳的等価物；およびその、前記ハイブリッドインタ
   ーフェロンまたはその生物学的に活性な断片の発現を可
   能にする実質的断片（以上においてＡはデオキシアデニ
   ルであり、Ｇはデオキシグアニルであり、Ｃはデオキシ
   シトシルでありそしてＴはチミジルである）。 １７）Ｌが【遺伝子配列があります】であり；Ｏが【遺
   伝子配列があります】で あり；Ｘが【遺伝子配列があります】であり；Ｙが【遺
   伝子配列があります】 であり；そしてＺが 【遺伝子配列があります】であり；そして ＥがＴ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇである特許請求の範囲第１
   ６項記載のデオキシヌクレオチド配列。 １８）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第１７項記 載のデオキシヌクレオチド配列。 １９）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ２０）【遺伝子配列があります】　 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ２１）【遺伝子配列があります】　 で表わされる特許請求の範囲第１７項記 載のデオキシヌクレオチド配列。 ２２）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ２３）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ２４）【遺伝子配列があります】で 表わされる特許請求の範囲第１７項記載のデオキシヌク
   レオチド配列。 ２５）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ２６）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ２８）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１１項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ２９）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ３０）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範 囲第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ３１）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ３２）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ３３）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ３４）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ３５）【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲 第１７項記載のデオキシヌクレオチド配列。 ３６）特許請求の範囲第１６項〜第３５項のいずれかに
   記載のＤＮＡ配列よりなる組換えＤＮＡ分子。 ３７）特許請求の範囲第３６項記載の少くとも１つの組
   換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主。 ３８）大腸菌、枯草菌、その他の細菌、酵母またはその
   他の菌類、マウスまたはその他の動物、または植物宿主
   およびヒト組織細胞よりなる群から選択される特許請求
   の範囲第３７項記載の宿主。 ３９）Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ　３１１０、Ｅ、Ｃｏｌｉ　７
   １１８およびＥ．ｃｏｌｉ　７９０２よりなる群より選
   択される特許請求の範囲第３７項または第３８項記載の
   形質転換された宿主。 ４０）特許請求の範囲第３６項〜第３９項のいずれかに
   記載の形質転換された宿主により産生されたハイブリッ
   ドリンパ芽球様細胞−白血球ヒトインターフェロンの免
   疫学的または生物学的活性を示すポリペプチドまたはそ
   の断片および誘導体。 ４１）１６６個のアミノ酸よりなる、そして所望により
   Ｎ末端における通常の第１アミノ酸に付加的なメチオニ
   ンを結合したポリペプチドよりなる抗ビールス性および
   抗増殖性物質であって、該ポリペプチド化合物のアミノ
   酸配列が式 Ｈ＿２Ｎ〔ｍｅｔ〕−Ｃｙｓ＾１−Ｘ−Ｐ−Ｙ−Ｂ−Ｚ
   −ＣＯＯＨ 〔式中、Ｘはヒトリンパ芽球様細胞インターフェロン（
   ＬｂＩＦ）のアミノ酸２〜４６より本質的になり；Ｙは
   該ＬｂＩＦのアミノ酸６０〜８５より本質的になり；Ｚ
   は該ＬｂＩＦのアミノ酸１１２〜１６６より本質的にな
   り；ＰはヒトαＣ−、αＦ−、またはαＩ−型白血球イ
   ンターフェロン（ＬｅＩＦ）のアミノ酸４７〜５９より
   本質的になりそして【アミノ酸配列があります】 又は【アミノ酸配列があります】で あり；そしてＢはヒトαＣ−、αＦ−、またはαＩ−型
   白血球インターフェロン（ＬｅＩＦ）のアミノ酸８６〜
   １１１より本質的になり、そして【アミノ酸配列があり
   ます】 又は【アミノ酸配列があります】である〕で表わされ；
   そしてその実質的ポリペプチド部分および／または誘導
   体がヒトインターフェロンの生物学的または抗ビールス
   活性を有する前記物質。 ４２）Ｘが【アミノ酸配列があります】で表わされるア
   ミノ酸配列を有するＬｂＩＦセグメントであり； Ｙが【アミノ酸配列があります】 で表わされるアミノ酸配列を有するＬｂＩＦセグメント
   であり；そして Ｚが【アミノ酸配列があります】で表わ されるアミノ酸配列を有するＬｂＩＦセグメントである
   特許請求の範囲第１項記載のハイブリッドインターフェ
   ロンポリペプチド。 ４３）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の 範囲第２項記載のハイブリッドインターフェロンポリペ
   プチド。 ４４）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の 範囲第２項記載のハイブリッドインターフェロンポリペ
   プチド。 ４５）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の 範囲第２項記載のハイブリッドインターフェロンポリペ
   プチド。 ４６）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の 範囲第２項記載のハイブリッドインターフェロンポリペ
   プチド。 ４７）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の 範囲第２項記載のハイブリッドインターフェロンポリペ
   プチド。 ４８）【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の 範囲第２項記載のハイブリッドインターフェロンポリペ
   プチド。