JP2628961B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は配列番号１で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドの、第１番目のアミノ酸残基が
チロシン（Ｔｙｒ）に、第３番目のアミノ酸残基がイソ
ロイシン（Ｉｌｅ）に、第４番目のアミノ酸残基がアル
ギニン（Ａｒｇ）に、第５番目のアミノ酸残基がセリン
（Ｓｅｒ）に、および第１７番目のアミノ酸残基がセリ
ン（Ｓｅｒ）に置換されたポリペプチド（以下、ＮＣ５
９と略称する）、ならびに該ＮＣ５９をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該
プラスミドを含む微生物および該微生物を用いるＮＣ５
９の製造法に関する。

【０００２】ｈＧ−ＣＳＦは、造血幹細胞を増殖・分化
させ種々の血球を形成させる際に必須なポリペプチドの
１種で、主として顆粒球、なかでも好中球の増加を促進
する効果をもつ。好中球は生体の感染防御において重要
な役割を担っているが寿命が短く、前駆細胞の恒常的な
増殖・分化によって常に補給されていなければならな
い。近年広く行われている増殖性腫瘍に対する治療は、
同時に好中球前駆細胞の増殖を阻止するため、担癌患者
の感染防御機能を低下させるという重篤副作用をもつ。
ｈＧ−ＣＳＦは、好中球の増加を促進することにより、
この副作用を軽減し、他方、感染症を予防・治療する効
果をもつものと期待される。さらに、ｈＧ−ＣＳＦに
は、白血病細胞株を in vitro において分化させる活性
があり、白血病に対する治療薬となる可能性もあるもの
とみられる。本発明のｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体
は、既知のｈＧ−ＣＳＦよりすぐれたｈＧ−ＣＳＦ活性
を有しており、医薬品としての利用が期待される。

【０００３】

【従来の技術】近年急速に発展してきた組換えＤＮＡ技
術により、血球の増殖・分化に係わるタンパク質性の因
子の遺伝子が次々と単離されてきた。それらの因子は、
微生物や動物細胞を利用して遺伝子工学の手法で生産さ
れている。ｈＧ−ＣＳＦは、長田らがヒト扁平上皮癌細
胞株ＣＨＵ−IIよりｃＤＮＡを単離してその塩基配列を
決定し、ＣＯＳ細胞での発現を報告している〔長田ら：
ネイチャー（Nature）319, 415（1986）〕。また、スー
ザ(Souza) らはヒト膀胱癌細胞株5637よりｃＤＮＡを単
離してその塩基配列を決定し、大腸菌での発現を報告し
ている〔スーザら：サイエンス（Science）232, 61（19
86）〕。

【０００４】配列番号１および下記表１に示したよう
に、上記２つのｃＤＮＡによってコードされるタンパク
質のアミノ酸配列と本発明者が正常人抹消血マクロファ
ージより単離したｃＤＮＡによってコードされるタンパ
ク質のアミノ酸配列とは一致している。

【０００５】

【表１】 1 10 20 30 40 50 ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAG ThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysCysLeuGlu 1 60 70 80 90 100 110 CAAGTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAAGCTGTGTGCCACC GlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLysLeuCysAlaThr 120 130 140 150 160 170 TACAAGCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCCCC TyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSerLeuGlyIlePro 180 190 200 210 220 TGGGCTCCCCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTGCTTG TrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGlyCysLeu 230 240 250 260 270 280 AGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTGCAGGCCCTGGAAGGG SerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGlnAlaLeuGluGly 290 300 310 320 330 ATCTCCCCCGAGTTGGGTCCCACCTTGGACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGAC IleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValAlaAsp 340 350 360 370 380 390 TTTGCCACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCTGCAG PheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGln 400 410 420 430 440 450 CCCACCCAGGGTGCCATGCCGGCCTTCGCCTCTGCTTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGG ProThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGly 460 470 480 490 500 GTCCTAGTTGCCTCCCATCTGCAGAGCTTCCTGGAGGTGTCGTACCGCGTTCTACGC ValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArg 510 520 CACCTTGCCCAGCCCTGA HisLeuAlaGlnPro*** 174

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、比活
性が高く、血中での安定性の高いｈＧ−ＣＳＦポリペプ
チド誘導体を安価に大量に製造する手段を提供すること
にある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、配列番号
１で示されたｈＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡを改変し、改変し
たｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを担う大腸菌を培養
し、比活性の高いｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体を製
造することにより、本発明を完成するに至った。

【０００８】本発明によれば、新規なｈＧ−ＣＳＦポリ
ペプチド誘導体、該ポリペプチド誘導体をコードするＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いる新規なｈ
Ｇ−ＣＳＦポリペプチド誘導体の製造法が提供される。
本発明のｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体は、配列番号
１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの、第
１番目のアミノ酸残基がチロシン（Ｔｙｒ）に、第３番
目のアミノ酸残基がイソロイシン（Ｉｌｅ）に、第４番
目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）に、第５番目
のアミノ酸残基がセリン（Ｓｅｒ）に、および第１７番
目のアミノ酸残基がセリン（Ｓｅｒ）に置換されたＮＣ
５９である。

【０００９】本発明の組換え体プラスミドは、上記ｈＧ
−ＣＳＦポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片が
ＤＮＡの発現機能を持つ適当なプラスミドに組み込まれ
たものである。

【００１０】配列番号１で示されるｈＧ−ＣＳＦをコー
ドするＤＮＡとしては、ｈＧ−ＣＳＦをコードするメッ
センジャーＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得
られるｃＤＮＡ（ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ）または染色体
ＤＮＡから得られるｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡな
どが利用できる。ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡとしては、ｈＧ
−ＣＳＦをコードしているものであればいかなるものも
用いることができるが、具体的にはｐＣＳＦ１−２を用
いることができる。ｐＣＳＦ１−２は、本発明者によっ
て製造されたものであり、その製造法は参考例１に記載
されている。

【００１１】ｐＣＳＦ１−２中のｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ
は、Ｍ１３ファージを用いたディデオキシ・シークエン
ス(dideoxy sequence)法[ ジェイ・メシング(J,Messin
g)ら：ジーン (Gene) 19, 269 (1982)] により決定され
た配列番号１で表される塩基配列を有している。宿主微
生物としては、本発明のプラスミドを発現できるもので
あればいずれの微生物でもよく、例えば細菌、好ましく
は大腸菌が用いられる。ｐＣＳＦ１−２は図１に示した
制限酵素地図を有するプラスミドで、それを含む大腸菌
はEscherichia coli ECSF 1-2 (FERM BP-1220)として昭
和61年11月27日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されている。

【００１２】ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体をコード
するＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、大腸菌で該
ＤＮＡが発現できるものならいかなるプラスミドでも使
うことができる。好ましくは、適当なプロモーター、例
えば、ｔｒｐ系、ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来
ＤＮＡを挿入することができ、しかもシャイン−ダルガ
ノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と開始コドン (ＡＴ
Ｇ) の間を適当な距離、例えば６〜18塩基対に調節した
プラスミドを用いることができる。

【００１３】具体的に好適なプラスミドとしては、ｐＫ
ＹＰ10（特開昭58−110600) 、ｐＬＳＡ１（参考例
３）、ｐＧＥＬ１〔関根ら：プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.
Natl. Acad. Sci.)、USA 82, 4306 (1985) 〕、ｐＫＹ
Ｐ26（特開昭62−48699) 、ｐＢＲ322 〔ボリバー(Boli
var) ら：ジーン (Gene) ２，95 (1977) 〕などがあげ
られる。

【００１４】ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドおよびその誘導
体をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、
制限酵素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ技法を用いて行
うことができる。結合に際しては、制限酵素を用いて消
化したＤＮＡ断片の末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩ・ク
レノー断片を用いる埋め込み反応、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる埋め込み反応または削り込み反応を利用し
て加工する方法やＤＮＡリンカーを用いる方法によって
も行うことができる。

【００１５】ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡとしてｐＣＳＦ１−
２を、該ＤＮＡを組み込むためのプラスミドとしてｐＧ
ＥＬ１，ｐＫＹＰ10，ｐＫＹＰ26，ｐＢＲ322, ｐＬＳ
Ａ１を用い、また必要な場合には、化学合成したＤＮＡ
リンカーや部位特異的変異を用いて、ｈＧ−ＣＳＦポリ
ペプチド誘導体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え
体プラスミドを造成する例を以下に述べる。

【００１６】図１に示したようにしてｐＣＳＦ１−２
〔約4.5キロベース（以下kbと略記する）〕をＡｐａＩ
とＢａｍＨＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動
法（ＬＧＴ法）〔エル・ウィスランダー (L. Wieslande
r）：アナリティカル・バイオケミストリイ（Analytica
l Biochemistry）98，305 （1979）〕にて約1.5kbのＤ
ＮＡ断片を精製する。

【００１７】次いで、ｐＬＳＡ１をＢａｎIIIとＢａｍ
ＨＩで切断した後、ＬＧＴ法にて約2.8kbのＤＮＡ断片
を精製する。このようにして得られた両ＤＮＡ断片と、
図１に示した合成ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結
合しｐＣｆＴＡ１を得る。次いで、図２に示したように
して、ｐＣｆＴＡ１をＢａｍＨＩで切断後、クレノー断
片で処理することにより突出末端を平滑末端に変換し、
さらにＥｃｏＲＩで切断後、約2.5kbのＤＮＡ断片をＬ
ＧＴ法により精製する。別にｐＣｆＴＡ１をＥｃｏＲＩ
とＤｒａＩで切断後、約1.0kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。このようにして得たＤＮＡ断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐＣｆＴＢ20を得る。

【００１８】さらに、図３のように、ｐＣＳＦ１−２を
ＡｐａＩとＢａｍＨＩで切断後、約1.5kbのＤＮＡ断片
をＬＧＴ法により精製する。また、ｐＧＥＬ１をＨｉｎ
ｄIII、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断後、約1.7kbの
ＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。一方、ｐＫＹＰ
10をＰｓｔＩとＢａｎIIIで切断後、約1.1kbのＤＮＡ断
片をＬＧＴ法により精製する。これら３つのＤＮＡ断片
と図３に示した合成ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
結合し、ｐＣｆＴＬ23，ｐＣｆＴＬ38，ｐＣｆＴＬ35，
ｐＣｆＴＬ41を得、また、これら３つのＤＮＡ断片と図
４に示した合成ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
し、ｐＣｆＴＭ14，ｐＣｆＴＭ17，ｐＣｆＴＭ113を得
る。

【００１９】さらに、図５に示すように、ｐＣｆＴＡ１
をＢａｎIIIとＳｔｕＩで切断後、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮ
Ａを含む約1.3kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製す
る。また、ｐＫＹＰ26をＢａｍＨＩで切断後、ＤＮＡポ
リメラーゼＩ・クレノー断片で処理することにより突出
末端を平滑末端に変換し、さらにＰｓｔＩで切断後、Ｌ
ＧＴ法にて約1.8kbのＤＮＡ断片を精製する。一方、ｐ
ＧＥＬ１をＢａｎIIIとＰｓｔＩで切断後、約1.0kbのＤ
ＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして得られた
３つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合すること
により、ｐＣｆＷＤ１を得る。

【００２０】さらに、図６に示すように、ｐＣｆＴＬ38
をＨｉｎｄIIIとＢｇｌIIで切断後約2.6kbのＤＮＡ断片
をＬＧＴ法により精製する。また、ｐＣｆＴＬ38をＨｉ
ｎｄIIIとＤｐｎＩで切断後、約300bpのＤＮＡ断片をＬ
ＧＴ法により精製する。一方、ｐＣｆＴＢ20をＡｖａＩ
で切断後、クレノー断片で処理することにより突出末端
を削り、さらにＢｇｌIIで切断後、約480bpのＤＮＡ断
片をＬＧＴ法により精製する。こうして得た３つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合することによりｐＣ
ｆＴ95Ｋ19を得る。さらに、同じく図６に示すようにし
て、ｐＣｆＴ95Ｋ19をＢａｎIIIとＢｇｌＩで切断後約
1.0kbのＤＮＡ断片を、またＢｇｌＩのみで切断後約1.8
kbのＤＮＡ断片を、ＬＧＴ法により精製する。一方、ｐ
ＣｆＴ95Ｋ19をＢｇｌＩとＳａｕ３Ａで切断後、約350b
pのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして得
られる３つのＤＮＡ断片と、図６中段に示した合成ＤＮ
ＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＣｆＡＡ１を得
る。さらに、同じく図６に示すようにして、ｐＣｆＡＡ
１をＸｈｏＩとＢｇｌＩで切断後、約3.0kbのＤＮＡ断
片をＬＧＴ法により精製する。このＤＮＡ断片と上記ｐ
ＣｆＴ95Ｋ19のＢｇｌＩ−Ｓａｕ３Ａ断片（約350bp)お
よび図６下段に示す合成ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合し、ｐＣｆＡＢ５およびｐＣｆＡＢ14を得る。さら
に、図７に示すように、ｐＣｆＡＢ５をＡｖａＩとＢｇ
ｌIIで切断後、約2.8kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により
精製する。また、ｐＣｆＷＤ１をＢｇｌIIとＡｖａＩで
切断後、約1.3kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製す
る。こうして得られた両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガー
ゼで結合し、ｐＣｆＢＡ８を得る。また、ｐＣｆＡＢ14
をＡｖａＩとＢｇｌIIで切断後ＬＧＴ法により精製され
る約2.８kbのＤＮＡ断片と、前記ｐＣｆＷＤ１のＢｇｌ
II、ＡｖａＩ断片約1.3kbとをＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合し、ｐＣｆＢＡ32を得る。さらに、同じく図７に示す
ように、ｐＣｆＢＡ８をＢａｎIII、ＢｇｌII、Ｘｈｏ
Ｉで切断後、約1.4kbと約2.7kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。こうして得られる２つのＤＮＡ断片と
図７に示した合成ＤＮＡリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させ、ｐＣｆＢＢ101、ｐＣｆＢＣ52、ｐＣｆＢ
Ｃ59、ｐＣｆＢＤ28、ｐＣｆＢＤ56、ｐＣｆＢＣ42Ｂ
１、ｐＣｆＢＣ45、ｐＣｆＢＣ76、ｐＣｆＢＣ77、ｐＣ
ｆＢＣ93、ｐＣｆＢＣ95、ｐＣｆＢＣ97、ｐＣｆＢＤ82
を得る。図８に示すように、ｐＢＲ322をＰｓｔＩで切
断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで突出末端を削り、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いてＢｇｌIIリンカーを挿入し、さ
らにＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで切断後、約3.6kbのＤＮＡ
断片をＬＧＴ法により精製する。

【００２１】一方、上記で得られるｐＣｆＢＢ101、ｐ
ＣｆＢＣ52、ｐＣｆＢＣ59、ｐＣｆＢＤ28、ｐＣｆＢＤ
56をＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで切断後、約1.8kbのＤＮＡ
断片を各々ＬＧＴ法により精製する。こうして得られる
約3.6kbと約1.8kbのＤＮＡ断片を各々Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで結合することにより、各々、ｐＣｆＣＢ101、ｐＣ
ｆＣＣ52、ｐＣｆＣＣ59、ｐＣｆＣＤ28、ｐＣｆＣＤ56
を得る。

【００２２】他方、ｐＣｆＢＡ８をＢａｎIII、ＢｇｌI
I、ＸｈｏＩで切断後、約1.4kbと約2.7kbのＤＮＡ断片
をＬＧＴ法により精製する。こうして得られる２つの断
片と図14に示した合成ＤＮＡリンカーをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合させ、ｐＣｆＴＮＳ７およびｐＣｆＴＡＡｒ
ｇ４Ｓを得る。加えて、図15に示すようにｐＣｆＴＮＳ
７をＰｖｕＩ、ＸｈｏＩで切断後、約１kbのＤＮＡ断片
をＬＧＴ法により精製する。またｐＣｆＢＡ32をＰｖｕ
Ｉ、ＸｈｏＩで切断後、約３kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。こうして得られる２つの断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合させ、ｐＣｆＴＮ205を得る。同様
に、ｐＣｆＴＡＡｒｇ４ＳをＰｖｕＩ、ＸｈｏＩで切断
後、ＬＧＴ法で精製して得られる約１kbの断片と、前記
ｐＣｆＢＡ32をＰｖｕＩ、ＸｈｏＩで切断して得られる
約３kbのＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ
ｐＣｆＴＡＡｒｇ４を得る。また、ｐＣｆＢＡ８をＢａ
ｎIII、ＢｇｌII、ＨｉｎｄIIIで切断後、約1.４kbと約
2.７kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうし
て得られる２つの断片と図16に示した合成ＤＮＡリンカ
ーをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、ｐＣｆＴＮＳ30
1、ｐＣｆＴＮＳ401を得る。さらに図12に示すようにｐ
ＣｆＢＡ８をＸｈｏＩで切断後、クレノー断片で処理す
ることにより突出末端を平滑末端に変換し、さらにＰｖ
ｕＩで切断後、約３kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精
製する。別に、ＡＴＧベクターｐＴｒＳ20（参考例４）
をＳａｃＩで切断後、クレノー断片で処理して突出末端
を平滑末端に変換し、さらにＰｖｕＩで切断後、ＬＧＴ
法により約１kbのＤＮＡ断片を精製する。こうして得ら
れる２つの断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、ｐＣ
ｆＴＮＳ501を得る。

【００２３】部位特異的変異を用いる例としては、図17
に示すように、ｐＣｆＢＤ28をＢａｎIIIとＰｓｔＩで
切断後、約210bpのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製す
る。また、Ｍ13ファージベクターのＭ13ｍｐ19ＲＦＤＮ
ＡをＡｃｃＩとＰｓｔＩで切断後、約7.24kbのＤＮＡ断
片をＬＧＴ法により精製する。こうして得られる２つの
ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐｔ19
ＢＤ28Ｎを得る。ついで、このｐｔ19ＢＤ28Ｎを大腸菌
ＪＭ105にトランスフェクションし、得られたファージ
より一本鎖ｐｔ19ＢＤ28Ｎを得る。同じく図17に示すよ
うにして、Ｍ13ｍｐ19ＲＦＤＮＡをＨｉｎｄIIIとＥｃ
ｏＲＩで切断後、約7.2kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法によ
り精製する。この約7.2kbのＤＮＡ断片と上記で得られ
た一本鎖ｐｔ19ＢＤ28Ｎを混合し、変性処理の後再びア
ニールさせることによりギャップト・デュプレックスＤ
ＮＡを生成させ、ＬＧＴ法によりこれを精製する。つい
でこのギャップト・デュプレックスＤＮＡに図17に示し
た合成ＤＮＡをアニールさせた後、クレノー断片とＴ４
ＤＮＡリガーゼにより環状化する。この環状化ＤＮＡを
大腸菌ＪＭ105株にトランスフェクションし、部位特異
的変異が導入されたｐｔ19ＢＤ28ＮＡ17，ｐｔ19ＢＤ28
ＮＴ17を得る。さらに同じく図17に示すようにしてｐｔ
19ＢＤ28ＮＡ17，ｐｔ19ＢＤ27ＮＴ17をＡｖａＩとＸｈ
ｏＩで切断後、約110bpのＤＮＡ断片を各々ＬＧＴ法に
より精製する。一方、ｐＣｆＢＤ28をＸｈｏＩとＢｇｌ
IIで切断後、約2.74kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精
製する。また、ｐＣｆＢＤ28をＢｇｌIIとＡｖａＩで切
断後、約1.29kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製す
る。こうして得られる約110bp，約2.74kb，約1.29kbの
ＤＮＡ断片を各々Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合することに
より、各々ｐＣｆＢＤ28 Ａ17，ｐＣｆＢＤ28Ｔ17を得
る。

【００２４】上記組換え技法における反応の条件は、一
般的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消
化反応は通常0.１〜20μｇのＤＮＡを２〜200mM（好ま
しくは10〜40mM）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH6.0〜9.5好ま
しくはpH7.0〜8.0）、０〜200mMのＮａＣｌ、２〜20mM
（好ましくは５〜10mM）のＭｇＣｌ₂ を含む反応液中
で、制限酵素0.1〜100単位（好ましくは１μｇのＤＮＡ
に対して１〜３単位）を用い、20〜70℃（至適温度は用
いる制限酵素により異なる）において、15分間〜24時間
行う。反応の停止は、通常55〜75℃で、５〜30分間加熱
することによるが、フェノールまたはジエチルピロカー
ボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も
用いることができる。

【００２５】制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片あ
るいはギャップト・デュプレックスＤＮＡの精製は、Ｌ
ＧＴ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔エイ・エ
ム・マキサム（A. M. Maxam ）ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci.）， USA 74, 560 (1977)〕
などによって行う。

【００２６】ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜200mM（好
ましくは10〜40mM) のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH6.1〜9.5、
好ましくはpH7.0〜8.0）、２〜20mM（好ましくは５〜10
mM）のＭｇＣｌ₂ 、0.1〜10mM（好ましくは0.5〜2.0m
M）のＡＴＰ、１〜50mM（好ましくは５〜10mM）のジチ
オスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
0.3〜10単位を用い、１〜37℃（好ましくは３〜20℃）
で15分間〜72時間（好ましくは２〜20時間）行う。

【００２７】結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドＤＮＡは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン（S. N. Cohen）ら：プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 69, 2110（197
2）〕によって、大腸菌に導入する。結合反応によって
生じた組み換え体Ｍ13ファージＲＦＤＮＡは、必要によ
り公知のトランスフェクション法〔口野嘉幸ら：蛋白質
・核酸・酵素 29, 294（1984) 〕によって、大腸菌ＪＭ
105株〔ジェイ・メシング（J. Messing) ら：ジーン（G
ene) 33, 103（1985）〕に導入する。

【００２８】組換え体プラスミドＤＮＡおよび組み換え
体Ｍ13ファージＲＦＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、バーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーン
ボイム (H. C. Birnboim) ら：ヌクレイック・アシッド
・リサーチ (Nucleic AcidsRes.) ７，1513 (1979) 〕
などを用いて行う。組み換え体Ｍ13ファージからの一本
鎖ＤＮＡの単離は公知の方法〔口野嘉幸ら：蛋白質・核
酸・酵素 29, 294（1984）〕に従って行う。

【００２９】プラスミドＤＮＡを１〜10種類の制限酵素
で消化後アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリル
アミドゲル電気泳動により切断部位を調べる。さらにＤ
ＮＡの塩基配列を決定する必要があるときはＭ13ファー
ジを用いたディデオキシ・シークエンス（dideoxy sequ
ence) 法〔ジェイ・メシング（J. Messing）ら: ジーン
（Gene) 19, 269（1982) 〕によって決定する。

【００３０】以上のような条件で組換え体プラスミドＤ
ＮＡを製造することができる。本発明のｈＧ−ＣＳＦポ
リペプチド誘導体は以下のとおりに製造できる。すなわ
ち、プラスミド（例えばｐＣｆＢＤ28）を用いて大腸菌
Ｋ−12ＨＢ101を形質転換させ、アンピシリン耐性（Ａ
ｐ^r 以下同じ）のコロニーの中からプラスミド（例えば
ｐＣｆＢＤ28）を有する大腸菌を選びだす。プラスミド
（例えばｐＣｆＢＤ28）を有する大腸菌を培地に培養す
ることにより培養物中にｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導
体を生成させることができる。

【００３１】ここで用いる培地としては大腸菌の生育な
らびにｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体の生産に好適な
ものならば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど
が、窒素源としては、ＮＨ₄Ｃｌ、 (ＮＨ₄ )₂ＳＯ₄、カ
ザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バク
トトリプトン、コーン・スティープ・リカーなどが、そ
の他の栄養源としてはＫ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ ₂ＰＯ₄ 、Ｎａ
Ｃｌ、ＭｇＳＯ₄ 、ビタミンＢ₁ 、ＭｇＣｌ₂ などが使
用できる。

【００３２】培養はpH5.5〜8.5、温度18〜40℃で通気攪
拌培養により行われる。培養５〜90時間で培養菌体中に
ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体が蓄積するので、培養
物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、
遠心して菌体残渣を得る。この菌体残渣からマーストン
らの方法〔F. A. O. Marstonら：BIO/TECHNOLOGY ２，8
00（1984) 〕によりｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体を
抽出・精製・可溶化・再生し、該誘導体でマウス骨髄細
胞を処理し、軟寒天中に形成されるコロニー数を指標と
したアッセイ法によりｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体
の定量を行う。

【００３３】本発明におけるＧ−ＣＳＦ活性の測定は以
下のように行う。８〜12週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス
（静岡実験動物協同組合）の大腿骨より骨髄細胞を無菌
的にとり出し、牛胎児血清（ＦＢＳ）を10％添加したα
−Minimum Essential Medium (Flow Laboratories，以
下α−ＭＥＭ培地と略す）に懸濁する。この細胞（約５
×10⁷ 個）懸濁液1.5mlを、ナイロン・ウール（Nylon w
ool) （和光純薬、NylonFiber 146-04231）をつめたカ
ラム（0.3ｇ）に浸漬し、５％ＣＯ₂ インキュベーター
内にて37℃，90分間反応させる。次いで予め37℃に加温
したα−ＭＥＭ培地をカラムに流し、溶出してくるナイ
ロン・ウール非吸着性の骨髄細胞を得る。この細胞をα
−ＭＥＭ培地で一回洗浄し、所定の濃度に調製する。

【００３４】次いで、岡部らの方法〔Okabe T. et al.,
Cancer Research 44、4503−4506（1986）〕に準じて
骨髄造血幹細胞コロニー形成能を測定する。すなわち、
α−ＭＥＭ0.2ml、ＦＢＳ0.4mlおよび２段階稀釈した各
サンプル0.2mlの混液に、上記の方法で調製した骨髄細
胞（２×10⁶ 個／ml）の0.2mlを混和する。これに42℃
に保温した0.6％寒天 (Difco, Agar purified ＃ 0560
−01) 溶液を等量（1.0ml）混和し、その0.5mlを24穴マ
ルチディッシュ（Nunc社製、＃ 143982 )に播種する
（５×10⁴ 個／dish, ｎ＝３）。５％ＣＯ₂ インキュベ
ーター中で37℃，７日間培養し、40個以上の細胞からな
るコロニーの数を顕微鏡 (Olympus 社製、Ｘ40) で計数
する。コロニー計数後、注意深くスライドグラス上にと
り出し、アセトン・ホルマリン混液で30秒間固定後、Ku
botaらの方法〔Kubota K., et al.,Exp. Hematology.
８，339 −344 （1980）〕でエステラーゼ２重染色を施
し、各コロニーの同定を行う。

【００３５】各サンプルの力価は、コロニー形成試験の
２段階稀釈に於ける計数結果から以下の様に算出する。
スタンダードとして用いたインタクトＧ−ＣＳＦのコロ
ニー形成の最大値の1/2値を与える活性を50単位と定義
し、これに各サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性
に換算するため、20を乗じて力価（単位）とする。比活
性は、単位蛋白質（mg）当りの力価（単位／mg）で表示
する。

【００３６】ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側のア
ミノ酸が欠失したｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体は酵
素的分解方法により製造することもできる。該誘導体は
天然のｈＧ−ＣＳＦを原料物質として用い酵素分解によ
り製造することもできるが、天然のｈＧ−ＣＳＦは酵素
（プロテアーゼ）に対する反応性が低いので、プロテア
ーゼに対して反応性の高められた改変ｈＧ−ＣＳＦを用
いた方が高活性を有する誘導体を収率よく製造すること
ができる。

【００３７】原料物質としては、ｈＧ−ＣＳＦポリペプ
チドのＮ末端側アミノ酸が表２のように置換した改変ｈ
Ｇ−ＣＳＦ(a)、(b)、(c)および(d)が好適に用いられる。
(a)、(b)、(c)および(d)は、対応する塩基配列を有するプ
ラスミドｐＣｆＢＣ59（ＮＣ59）、ｐＣｆＢＤ28（ＮＤ
28）、ｐＣｆＢＣ95（ＮＣ95）およびｐＣｆＴＡＡｒｇ
４Ｓ（Ａｒｇ４Ｓ）をそれぞれ保有する菌株を培養し公
知の方法で精製単離することにより得ることができる。

【００３８】酵素としては、セリンプロテアーゼ、チオ
ールプロテアーゼなどのエンドプロテアーゼが好適に用
いられる。具体的には、例えば、ズブチリシンＡ、ズブ
チリシンＢＰＮ’、ズブチリシンカールスバーグ、ズブ
チリシンノボ、プロティナーゼＫ、ナガーゼ、サーモラ
イシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、トリプシ
ン、α−キモトリプシンなどがあげられる。酵素は、原
料物質の１mgに対して3.4×10^-6〜8.5×10^-3単位の割合
で用いる。

【００３９】

【表２】

【００４０】酵素反応は、原料物質をトリス塩酸緩衝液
あるいはリン酸緩衝液などの水性溶液に溶かし、酵素を
加えて、10〜37℃で30分間〜３日間行う。本発明におけ
る総蛋白質量、蛋白質量は以下に記載する方法によって
測定する。総蛋白質量の測定はエム・エム・ブラッドフ
ォードの方法〔M. M. Bradford：アナリティカル・バイ
オケミストリィ (Anal. Biochem.) 72, 248 （1976）〕
により行う。

【００４１】蛋白質量はレムリの方法〔U. K. Laemml
i：ネイチャー (Nature) 227, 680 (1970) 〕によりＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ク
ロマトスキャナー（ＣＳ−930島津製作所）で測定す
る。酵素切断後に得られるペプチドのＮ末端アミノ酸配
列は自動アミノ酸配列測定機“ガスーフェーズ・プロテ
イン・シークエンサー・モデル470Ａ”（アプライド・
バイオシステムズ社製）とスペクトラ・フィジクス（Sp
ectra−Physics）社製高速液体クロマトグラフィーの組
み合せによって測定する。

【００４２】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。 実施例１． ｈＧ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣｆＴＡ１の造成（図１
参照）：参考例１により得られたｐＣＳＦ１−２ＤＮＡ
２μｇを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７mM Ｍｇ
Ｃｌ₂ 、６mM ２−メルカプトエタノールおよび100mMＮ
ａＣｌを含む全量20μｌの溶液（以下“Ｙ−100緩衝
液”と略す）に溶かし、制限酵素ＡｐａＩ〔ベーリンガ
ー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社製〕とＢａ
ｍＨＩ（宝酒造社製、以下制限酵素については特記しな
い限りすべて宝酒造社製）それぞれ10単位を加え、37℃
で４時間反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
1.5kbのＤＮＡ断片0.4μｇを精製、回収した。

【００４３】別に参考例３の方法で調製したプラスミド
ｐＬＳＡ12μｇをＹ−100緩衝液20μｌに溶かし、制限
酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）とＢａｍＨＩそれぞれ1
0単位を加え、37℃で４時間反応を行った。この反応液
からＬＧＴ法により2.8kbのＤＮＡ断片0.8μｇを精製、
回収した。一方、成熟ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末
端第１〜５番目までのアミノ酸〔スレオニン¹ （ＡＣＡ
またはＡＣＴ）、プロリン² （ＣＣＡまたはＣＣＴ）、
ロイシン³ （ＣＴＡ）、グリシン⁴ （ＧＧＣ）、プロリ
ン⁵ （ＣＣＣ）〕をコードするコドンと発現に必要な開
始コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、また、
トリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）の下流のＳＤ
−配列とＡＴＧとの距離を、６〜18bpの間の適当な長さ
にする必要があることなどの理由から、下記のＤＮＡリ
ンカーを合成した。

【００４４】

【化１】

【００４５】まず一本鎖ＤＮＡ、26merと20merを通常の
トリエステル法〔アール・クレア（R. Crea）ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) 、USA 75，
5765 (1978) 〕により合成した。26mer、 20merのそれぞ
れ２μｇを50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、10mMＭｇ
Ｃｌ₂ 、５mM ジチオスレイトール、0.1mM ＥＤＴＡお
よび１mM ＡＴＰを含む緩衝液（以下この緩衝液を“Ｔ
４キナーゼ緩衝液”と略記する）40μｌに溶かし、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ30単位（宝酒造社製：以下同
じ）を加えて、37℃，60分間リン酸化反応を行った。

【００４６】上記で得たｐＣＳＦ１−２由来のＡｐａＩ
−ＢａｍＨＩ断片（1.5kb）0.4μｇとｐＬＳＡ１由来の
ＢａｎIII−ＢａｍＨＩ断片（2.8kb) 0.2μｇとを20mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6）、10mM ＭｇＣｌ₂ 、10mM
ジチオスレイトールおよび１mM ＡＴＰを含む緩衝液
（以下この緩衝液を“Ｔ４リガーゼ緩衝液”と略記す
る）25μｌに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカー
を0.1μｇ加えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造社製：以下同じ）６単位を加え、４℃，
18時間結合反応を行った。

【００４７】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株〔ボリバー（Bolivar）ら：ジーン
(Gene) ２，75 (1977) 〕をコーエンらの方法〔エス・
エヌ・コーエン（S. N. Cohen）ら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス (Proc. Natl. Acad. Sci.）USA，69, 2110 (1972)〕
（以下大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる）により
形質転換し、Ａｐ^rのコロニーを得た。このコロニーの
培養菌体から公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム
（H. C. Birnboim) ら: ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.) ７, 1513 (1979)〕（以下
プラスミドＤＮＡの分離はこの方法を用いる）に従って
プラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドの構
造は、ＢａｎIII、ＲｓａＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII、 Ｂ
ｇｌIIで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。このプラスミドをｐＣｆＴＡ１とよぶ。ｐＣｆＴＡ
１のＢａｎIII、ＨｉｎｄIII付近の塩基配列は下記のと
おりであることを、Ｍ13ファージを用いたディデオキシ
・シークエンス法で確認した。

【００４８】

【化２】

【００４９】実施例２． ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの３'−非翻訳領域の１部を欠失
したプラスミドｐＣｆＴＢ20の造成（図２参照）：実施
例１で得られたｈＧ−ＣＳＦ発現プラスミミドｐＣｆＴ
Ａ１（4.3kb) ２μｇをＹ−100緩衝液20μｌに溶かし、
制限酵素ＢａｍＨＩ ４単位を加えて37℃，４時間消化
反応を行った。フェノール−クロロホルム等量混合液に
よる抽出（以下フェノール−クロロホルム抽出と略記す
る）の後、エタノール沈澱により、ＤＮＡ断片1.8μｇ
を回収した。このＤＮＡ断片を50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH7.8）、７mM ＭｇＣｌ₂ および６mM メルカプトエ
タノールを含む緩衝液（以下この緩衝液を“クレノー緩
衝液”と略記する）20μｌに溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰをそれぞれ１mMになるように加
え、さらに４単位のＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断
片（宝酒造社製：以下同じ）を加えて、室温で１時間反
応させ、突出末端を平滑末端に変換した。フェノール−
クロロホルム抽出後、エタノール沈澱により、ＤＮＡ断
片1.6μｇを回収した。該ＤＮＡ断片をＹ−100緩衝液20
μｌに溶かし、10単位のＥｃｏＲＩを加え、37℃，４時
間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により2.
5kbのＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ（Blunt）−ＥｃｏＲＩ断
片）１μｇを得た。

【００５０】別に、ｐＣｆＴＡ12μｇを20μｌのＹ−10
0緩衝液に溶かし、10単位のＥｃｏＲＩを加え、37℃４
時間切断反応を行った後、ＮａＣｌ濃度が150mMとなる
ようにＮａＣｌを添加し、10単位のＤｒａＩを加え、37
℃，４時間切断反応を行った。アガロースゲル電気泳動
にて完全な分解を確認した後、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを
含む1.0kbのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ断片）
0.2μｇを、ＬＧＴ法により精製、回収した。

【００５１】上記で得たＢａｍＨＩ（Blunt）−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（2.5kb）0.2μｇとＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ断片
（1.0kb) 0.2μｇをＴ４リガーゼ緩衝液25μｌに溶か
し、この混合液にＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４
℃，18時間結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、
Ａｐ^r のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体より
プラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドの構
造は、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動により確認した。このプラスミドをｐＣｆＴ
Ｂ20と呼ぶ。 実施例３． ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端アミノ酸を置換したポリペプチド
をコードするプラスミドｐＣｆＴＬ23，ｐＣｆＴＬ38，
ｐＣｆＴＬ35，ｐＣｆＴＬ41の造成（図３参照）：参考
例１の方法によって得たｐＣＳＦ１−２（4.5kb）３μ
ｇを60μｌＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素ＡｐａＩ
（ベーリンガー・マンハイム社製）と制限酵素ＢａｍＨ
Ｉそれぞれ８単位ずつを加え、37℃で３時間切断反応を
行った。この反応液からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦ遺
伝子の大部分を含む約1.5kbのＤＮＡ断片（ＡｐａＩ−
ＢａｍＨＩ断片）約0.4μｇを得た。

【００５２】一方、ｐＧＥＬ１〔関根ら：プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイ
エンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 82, 4306 (198
5) 〕（E. coli IGEL1 FERM BP−629の培養物から常法
により採取）（3.4kb) ２μｇをＹ−100緩衝液40μｌに
溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII，ＢａｍＨＩおよびＰｓ
ｔＩそれぞれ４単位ずつを加え37℃で３時間切断反応を
行った。この反応液からＬＧＴ法により、リポプロテイ
ン由来ターミネーターを含む約1.7kbのＤＮＡ断片（Ｐ
ｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片）約0.5μｇを得た。

【００５３】別に、特開昭58−110600号公報記載の方法
で調製したｐＫＹＰ10 ３μｇをＹ−100緩衝液60μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）と制限酵
素ＰｓｔＩをそれぞれ６単位ずつ加え37℃で３時間切断
反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりトリプト
ファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含む約1.1kbのＤＮ
Ａ断片（ＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片）約0.5μｇを得た。

【００５４】一方、成熟ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ
酸であるＴｈｒをＳｅｒ，Ｃｙｓ，ＡｒｇまたはＧｌｙ
のうちのいずれかに置換し、発現に必要な開始コドン
（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またＰｔｒｐの
下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距離は、６〜18bpの間の適
当な長さにする必要があることなどの理由から、下記の
ＤＮＡリンカーを合成した。

【００５５】

【化３】

【００５６】まず、一本鎖ＤＮＡ、26−merと20−merを
通常のトリエステル法により合成した。26−merおよび2
0−merの各々20ピコモルを40μｌのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）６単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に上記で得たｐＣＳＦ１−２由来のＡｐａＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片（約1.5kb）0.３μｇとｐＧＥＬ１由来の
ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約1.7kb）0.2μｇおよび発
現ベクターｐＫＹＰ10のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約
1.1kb）0.2μｇを全量30μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶
かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約１ピコモル
加えた。この混合液にさらに６単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを加えて４℃，18時間結合反応を行った。

【００５７】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌Ｃ600ＳＦ８株（FERM BP−1070) 〔カメロン
（Cameron）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Ac
ad. Sci.）, USA 72, 3416 (1975) 〕を形質転換し、Ａ
ｐ^r のコロニーを得た。この形質転換株よりプラスミド
ＤＮＡを公知の方法に従って分離・精製した。該プラス
ミドＤＮＡの構造はＰｓｔＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢａｎIII
で切断後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認
した。これらのプラスミドを図３に示したとおりｐＣｆ
ＴＬ23，ｐＣｆＴＬ38，ｐＣｆＴＬ35, ｐＣｆＴＬ41と
よぶ。上記プラスミド中のｈＧ−ＣＳＦ誘導体遺伝子の
Ｎ末端付近の配列はそれぞれ、

【００５８】

【化４】 であることをＭ13ファージを用いたデイデオキシ・シー
クエンス法により確認した。

【００５９】ｐＣｆＴＬ23によりコードされるｈＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体（本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔Ｇｌｙ¹ 〕とよ
ぶ）は、成熟ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のＴｈｒがＧｌｙに
置換していることが確認された。同様に、ｐＣｆＴＬ38
によりコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体（本誘導体をｈ
Ｇ−ＣＳＦ〔Ｓｅｒ¹ 〕とよぶ）はＳｅｒに、ｐＣｆＴ
Ｌ35によりコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体（本誘導体
をｈＧ−ＣＳＦ〔Ｃｙｓ¹ 〕とよぶ）はＣｙｓに、ｐＣ
ｆＴＬ41 によりコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体（本
誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔Ａｒｇ¹ 〕とよぶ）はＡｒｇに
それぞれＮ末端のアミノ酸が置換していることが確認さ
れた。

【００６０】実施例４． ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端および３番目のアミノ酸を置換し
たポリペプチドをコードするプラスミドｐＣｆＴＭ14，
ｐＣｆＴＭ17およびｐＣｆＴＭ113 の造成（図４参
照）：参考例１の方法によって得たｐＣＳＦ１−２（4.
5kb）３μｇをＹ−100緩衝液60μｌに溶かし、ＡｐａＩ
とＢａｍＨＩをそれぞれ８単位ずつ加え、37℃で３時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりｈＧ
−ＣＳＦ遺伝子の大部分を含む約1.５kbのＤＮＡ断片
（ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片）約0.４μｇを得た。

【００６１】一方、ｐＧＥＬ１（3.４kb）２μｇをＹ−
100緩衝液40μｌに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII，Ｂａ
ｍＨＩおよびＰｓｔＩそれぞれ４単位ずつを加え37℃で
３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によ
り、リポプロテイン由来ターミネーターを含む約1.７kb
のＤＮＡ断片（ＰstＩ−ＢａｍＨＩ断片）約0.５μｇを
得た。

【００６２】別に、特開昭58-110600号公報記載の方法
で調製したｐＫＹＰ10 ３μｇをＹ−100緩衝液60μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｎIIIとＰstＩそれぞれ６単位ず
つを加え37℃で３時間切断反応を行った。この反応液か
らＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約1.１kbのＤＮＡ断片
（ＢａｎIII−ＰstＩ断片）約0.５μｇを得た。一方、
成熟ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸であるＴｈｒをＳ
ｅｒに、３番目のアミノ酸であるＬｅｕをＧｌｙ，Ｓｅ
ｒ，ＣｙｓまたはＡｒｇのうちいずれかに置換し、発現
に必要な開始コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があるこ
と、またＰｔｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距離
は、６〜18bpの間の適当な長さにする必要があることな
どの理由から、下記のＤＮＡリンカーを合成した。

【００６３】

【化５】

【００６４】まず、一本鎖ＤＮＡ、26−mer と20−mer
を通常のトリエステル法により合成した。26− merおよ
び20−mer の各々20ピコモルを40μｌのＴ４キナーゼ緩
衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ６単位を
加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行った。次に上記
で得たｐＣＳＦ１−２由来のＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片
（約1.５kb）0.３μｇとｐＧＥＬ１由来のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片（約1.７kb) 0.２μｇおよび発現ベクター
ｐＫＹＰ10のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約1.１kb）0.
２μｇを30μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、この混
合液に上記ＤＮＡリンカーを約１ピコモル加えた。この
混合液にさらに６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて４
℃，18時間結合反応を行った。

【００６５】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌Ｃ600ＳＦ８（FERM BP-1070) 株をコーエン
らの方法により形質転換し、Ａｐ^r のコロニーを得た。
この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法に従
って分離・精製した。該プラスミドＤＮＡの構造はＰst
Ｉ，ＥcoＲＩ，ＢａｎIIIで切断後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により確認した。これらのプラスミド
を図４に示したとおり、ｐＣｆＴＭ14，ｐＣｆＴＭ17，
ｐＣｆＴＭ113とよぶ。上記プラスミド中のｈＧ−ＣＳ
Ｆ誘導体遺伝子のＮ末端付近の配列はそれぞれ、

【００６６】

【化６】

【００６７】であることをＭ13ファージを用いたデイデ
オキシ・シークエンス法により確認した。ｐＣｆＴＭ14
によりコードされる誘導体（本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ
〔Ｓｅｒ¹,Ｃｙｓ³〕とよぶ）は、成熟ｈＧ−ＣＳＦの
Ｎ末端のＴｈｒがＳｅｒに、３番目のアミノ酸であるＬ
ｅｕがＣｙｓに置換していることが確認された。同様に
ｐＣｆＴＭ17によりコードされる誘導体（本誘導体をｈ
Ｇ−ＣＳＦ〔Ｓｅｒ¹,Ａｒｇ ³ 〕とよぶ) は、Ｎ末端の
ＴｈｒがＳｅｒに、３番目のＬｅｕがＡｒｇに、ｐＣｆ
ＴＭ113によりコードされる誘導体（本誘導体をｈＧ−
ＣＳＦ〔Ｓｅｒ¹,Ｓｅｒ³ 〕とよぶ）は、Ｎ末端のＴｈ
ｒがＳｅｒに、３番目のＬｅｕがＳｅｒに置換している
ことが確認された。実施例５． (1) 組換え体プラスミドｐＣｆＷＤ１の造成（図５参
照）：実施例１の方法で得たｐＣｆＴＡ１ ５μｇを50
μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素ＳｔｕＩ10単
位と、制限酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）10単位を加
えて、37℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬＧ
Ｔ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約1.3kbのＤＮ
Ａ断片（ＢａｎIII−ＳｔｕＩ断片）約0.5μｇを得た。
別に、参考例２の方法で製造したｐＫＹＰ26 ３μｇを5
0μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、ＢａｍＨＩ６単位を加
えて、30℃で１時間消化反応を行った。

【００６８】これに10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.5)，１m
M ＥＤＴＡで飽和したフェノールを等量加え、激しく攪
拌した後、低速遠心分離法(3300rpm，10分間，以下同条
件）により水層を集めた。等量のクロロホルムを加え、
激しく攪拌した後、低速遠心分離法により水層を集め
た。１／10容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、2.5倍容の
エタノールを加え、−20℃，１時間静置した。冷却遠心
分離法（４℃，11000rpm, 10分間）で沈殿を集めた。こ
の沈殿を30μｌのクレノー緩衝液に溶かし、ｄＡＴＰ，
ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰをそれぞれ100μＭにな
るように加え、ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を
２単位加え17℃で15分間反応を行った。68℃で10分間処
理してＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を失活させ
た後、ＮａＣｌを100mMとなるように加え、制限酵素Ｐ
ｓｔＩを５単位加え37℃で１時間消化反応を行った。反
応液からＬＧＴ法によりｌｐｐターミネーターを含む約
1.8kbのＤＮＡ断片〔ＢａｍＨＩ（Blunt)−ＰｓｔＩ断
片〕約0.6μｇを得た。これとは別に、ｐＧＥＬ１ ４μ
ｇを40μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｎI
II（東洋紡績社製）10単位とＰｓｔＩ10単位を加え37℃
で１時間消化反応を行い、反応液から、ＬＧＴ法でトリ
プトファン系プロモーターを含む約１kbのＤＮＡ断片
（ＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片）を0.4μｇ得た。

【００６９】上記で得たｐＣｆＴＡ１由来のＢａｎIII
−ＳｔｕＩ断片（約1.3kb）約0.2μｇ，ｐＫＹＰ26由来
のＢａｍＨＩ（Blunt)−ＰｓｔＩ断片(約1.8kb）約0.1
μｇ，ｐＧＥＬ１由来のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約
１kb）約0.1μｇを30μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
に溶かし、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃，
18時間結合反応を行った。

【００７０】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質
転換し、Ａｐ^r のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収
し、図５に示したｐＣｆＷＤ１を得た。 (2) ｐＣｆＴ95Ｋ19の造成（図６参照）：実施例３の方
法で得たｐＣｆＴＬ38 ５μｇを50μｌのＹ−100緩衝液
に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢｇｌIIを10単位ず
つ加え、37℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬ
ＧＴ法によりトリプトファン・プロモーターを含む約2.
6kbのＤＮＡ断片(ＨｉｎｄIII−ＢｇｌII断片)約0.7μ
ｇを得た。別にｐＣｆＴＬ38，100μｇを1.5mlのＹ−10
0緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIを
80単位ずつ加え、37℃で６時間消化反応を行った。反応
液からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含むＤＮ
Ａ断片を回収し、ＥＬＵＴＩＰ^TM−ｄ（Schleicher & S
chuell社製）で精製した。このＤＮＡ断片を10mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5),７mM ＭｇＣｌ₂, 150mMＮａＣ
ｌ,６mM ２−メルカプトエタノール（以下、“Ｙ−150
緩衝液”と略記する）を含む全量90μｌの溶液に溶か
し、制限酵素ＤｐｎＩ（Boehringer Mannheim社製）３
単位を加え37℃で15分間消化反応を行った。反応液から
ポリアクリルアミド電気泳動法で、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮ
Ａを含む約300bpのＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−ＤｐｎＩ
断片）約１μｇを得た。

【００７１】別に実施例２の方法で得たｐＣｆＴＢ20 1
0μｇを100μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Ａ
ｖａＩ10単位を加え、37℃で１時間消化反応を行った。
フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で
ＤＮＡを回収し、30μｌのクレノー緩衝液に溶かし、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を２単位加え、17℃
で30分間反応を行った。68℃で10分間処理しＤＮＡポリ
メラーゼＩ・クレノー断片を失活させ、ＮａＣｌを100m
Mになるように加え制限酵素ＢｇｌII10単位を加え37℃
で１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法でｌｐ
ｐターミネーター部分を含む約480bpのＤＮＡ断片〔Ａ
ｖａＩ(Blunt) −ＢｇｌII〕約0.3μｇを得た。

【００７２】上記で得た、ｐＣｆＴＬ38由来のＨｉｎｄ
III −ＢｇｌII断片（約2.6kb）約0.1μｇ, ｐＣｆＴ
Ｌ38由来のＨｉｎｄIII−ＤｐｎＩ断片（約300bp）約0.
2μｇ，ｐＣｆＴＢ20由来のＡｖａＩ(Blunt)−ＢｇｌII
断片(約480bp)約0.15μｇを30μｌのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ緩衝液に溶かし、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、４℃で18時間結合反応を行った。該反応液を用いて
大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニーを
得、このコロニーより前記バーンボイムらの方法により
プラスミドＤＮＡを回収し、図６に示したｐＣｆＴ95Ｋ
19を得た。 (3) ｐＣｆＡＡ１の造成（図６参照）：前項で得たｐＣ
ｆＴ95Ｋ19 ５μｇを50μｌのＹ−100 緩衝液に溶か
し、制限酵素ＢanIII（東洋紡績社製）７単位とＢｇｌ
Ｉ（日本ジーン社製）２単位を加え、37℃で１時間消化
反応を行った。反応液からＬＧＴ法によりトリプトファ
ン・プロモーター部分を含む約１kbのＤＮＡ断片（Ｂａ
ｎIII−ＢｇｌＩ断片）約00.6μｇと、ｌｐｐターミネ
ーター部分を含む約1.8kbのＤＮＡ断片（ＢｇｌＩ−Ｂ
ｇｌＩ断片）約１μｇを得た。

【００７３】これとは別に15μｇのｐＣｆＴ95Ｋ19を15
0μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素ＢｇｌＩ（日
本ジーン社製）６単位とＳａｕ３Ａ 10単位を加え37℃
で１時間消化反応を行った。反応液からポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ部分を
含む約350 bpのＤＮＡ断片(ＢｇｌＩ−Ｓａｕ３Ａ断
片）約0.3μｇを得た。

【００７４】これとは別に、下記のＤＮＡリンカーを合
成した。

【００７５】

【化７】

【００７６】まず、一本鎖ＤＮＡ、39−mer と41−mer
を通常のトリエステル法により合成した。39−mer およ
び41−mer の各々20ピコモルを全量40μｌのＴ４キナー
ゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造社製）６単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応
を行った。次に上記で得たｐＣｆＴ95Ｋ19由来のＢａｎ
III−ＢｇｌＩ断片（約１kb）0.1μｇ，ＢｇｌＩ−Ｂｇ
ｌＩ断片（約1.8kb）0.05μｇ，ＢｇｌＩ−Ｓａｕ３Ａ
断片（約350bp）0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25
μｌに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２
ピコモル加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加
え、４℃で18時間結合反応を行った。

【００７７】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質
転換し、Ａｐ^r のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収
し、図６に示したｐＣｆＡＡ１を得た。前記デイデオキ
シ・シークエンス法でｐＣｆＡＡ１のＤＮＡリンカー部
分の塩基配列を決定したところ、４番目のアミノ酸であ
るＬｅｕをコードするコドンの３番目の塩基はＡである
ことが判明した。このｐＣｆＡＡ１ではｈＧ−ＣＳＦの
10番目のＰｒｏから23番目のＬｙｓまでの14アミノ酸を
コードするＤＮＡ部分が欠失している。また、ｈＧ−Ｃ
ＳＦの６番目のＡｌａがＡｓｎに変化する変異が導入さ
れており、新たにＸｈｏＩサイトが生じる。 (4) ｐＣｆＡＢ５の造成（図６参照）：前項で得たｐＣ
ｆＡＡ１ ３μｇを30μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、
制限酵素ＸｈｏＩを５単位加え、37℃で１時間消化反応
を行った。アガロースゲル電気泳動法でＸｈｏＩ切断が
完全に行われていることを確認したのち、制限酵素Ｂｇ
ｌＩ（日本ジーン社製）を１単位加え、37℃で25分間部
分消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法によりトリプ
トファン・プロモーター部分およびｌｐｐターミネータ
ー部分を含む約３kbのＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩ
断片）約１μｇを得た。これとは別に、下記のＤＮＡリ
ンカーを合成した。

【００７８】

【化８】

【００７９】このリンカーＤＮＡはｐＣｆＡＡ１のｈＧ
−ＣＳＦｃＤＮＡで欠失していたｈＧ−ＣＳＦの10番目
のＰｒｏから23番目のＬｙｓまでの14アミノ酸をコード
するＤＮＡ部分を含んでいる。まず、一本鎖ＤＮＡ、27
−mer と25−mer （２種）と23−mer を通常のトリエス
テル法により合成した。たがいに相補的な27−merと25
−mer および25−merと23−mer のＤＮＡ20ピコモルず
つを各々全量40μｌのＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製)６単位を加え
て、37℃で60分間リン酸化反応を行った。

【００８０】次に上記で得たｐＣｆＡＡ１由来のＸｈｏ
Ｉ−ＢｇｌＩ断片（約３kb）0.1μｇ、前項で得たｐＣ
ｆＴ95Ｋ19由来のＢｇｌＩ−Ｓａｕ３Ａ断片（約350b
p）0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液30μｌに溶か
し、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを２ピコモルずつ
加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃
で18時間結合反応を行った。

【００８１】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質
転換し、Ａｐ^r のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収
し、図６に示したｐＣｆＡＢ５とｐＣｆＡＢ14を得た。
前記デイデオキシ・シークエンス法でｐＣｆＡＢ５とｐ
ＣｆＡＢ14のＤＮＡリンカー部分の塩基配列を決定した
ところ、17番目のアミノ酸をコードするコドンの１番目
の塩基はｐＣｆＡＢ５ではＡであり、ｐＣｆＡＢ14では
Ｔであって各々Ｓｅｒのコドン（ＡＧＣ）およびＣｙｓ
のコドン（ＴＧＣ) であり成熟型ｈＧ−ＣＳＦの17番目
のＣｙｓが、ｐＣｆＡＢ５ではＳｅｒに置換し、ｐＣｆ
ＡＢ14では置換していないことが判明した。

【００８２】実施例６． (1) ｐＣｆＢＡ８およびｐＣｆＢＡ32の造成（図７参
照）：前項で得たｐＣｆＡＢ５、３μｇを40μｌのＹ−
100緩衝液に溶かし、制限酵素ＡｖａＩ５単位とＢｇｌI
I５単位を加え37℃で１時間消化反応を行った。反応液
からＬＧＴ法により、トリプトファンプロモーター部分
とｌｐｐターミネーター部分を含む約2.8kbのＤＮＡ断
片（ＡｖａＩ−ＢｇｌII断片）を約１μｇ得た。

【００８３】これとは別に、第１項で得たｐＣｆＷＤ１
６μｇを50μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂ
ｇｌIIを５単位加え、37℃で１時間消化反応を行った。
アガロースゲル電気泳動法でＢｇｌII切断が完全に行わ
れていることを確認した後に、制限酵素ＡｖａＩを３単
位加え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液か
らＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの大部分を含
む約1.3kbのＤＮＡ断片（ＢｇｌII−ＡｖａＩ断片）を
0.4μｇ得た。

【００８４】次に上記で得たｐＣｆＡＢ５由来のＡｖａ
Ｉ−ＢｇｌII断片（約2.8kb）の0.1μｇとｐＣｆＷＤ１
由来のＢｇｌII−ＡｖａＩ断片（約1.3kb）0.3μｇをＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶かし、３単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを加え、４℃18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ
^r のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイム
らの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、図７に示し
たｐＣｆＢＡ８を得た。

【００８５】ｐＣｆＢＡ８のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘
導体のアミノ酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの６番目の
ＡｌａがＡｓｎに、17番目のＣｙｓがＳｅｒに置換して
いる。以後、本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＡ８〕と呼
ぶ。他方前項で得たｐＣｆＡＢ14、３μｇを40μｌのＹ
−100 緩衝液に溶かし、制限酵素ＡｖａＩ５単位とＢｇ
ｌII５単位を加え37℃で１時間消化反応を行った。反応
液からＬＧＴ法により、トリプトファンプロモーター部
分とｌｐｐターミネーター部分を含む約2.8kbのＤＮＡ
断片（ＡｖａＩ−ＢｇｌII断片）を約１μｇ得た。

【００８６】これとは別に、第１項で得たｐＣｆＷＤ１
６μｇを50μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂ
ｇｌIIを５単位加え、37℃で１時間消化反応を行った。
アガロースゲル電気泳動法でＢｇｌII切断が完全に行わ
れていることを確認した後に、制限酵素ＡｖａＩを３単
位加え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液か
らＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの大部分を含
む約1.3kbのＤＮＡ断片（ＢｇｌII−ＡｖａＩ断片）を
0.4μｇ得た。

【００８７】次に上記で得たｐＣｆＡＢ14由来のＡｖａ
Ｉ−ＢｇｌII断片（約2.8kb）の0.1μｇとｐＣｆＷＤ１
由来のＢｇｌII−ＡｖａＩ断片（約1.3kb）0.3μｇをＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶かし、３単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを加え、４℃18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ
^r のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイム
らの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、図７に示し
たｐＣｆＢＡ32を得た。

【００８８】ｐＣｆＢＡ32のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘
導体のアミノ酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの６番目の
ＡｌａがＡｓｎに置換している。 (2) ｐＣｆＢＢ101の造成：前項で得たｐＣｆＢＡ８
６μｇを50μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Ｂ
ａｎIII（東洋紡績社製）10単位、ＢｇｌII８単位、Ｘ
ｈｏＩ８単位を加え、37℃，１時間消化反応を行った。
反応液からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む
約1.4kbのＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片）約0.6
μｇとトリプトファンプロモーター部分を含む約2.7kb
のＤＮＡ断片（ＢａｎIII−ＢｇｌII断片）約0.8μｇを
得た。これとは別に、下記のＤＮＡリンカーを合成し
た。

【００８９】

【化９】

【００９０】まず一本鎖ＤＮＡ、31−merと33−mer を
通常のトリエステル法により合成した。31−merおよび3
3−merの各々２μｇを全量40μｌのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ30単位（宝酒
造社製）を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎIII−Ｂ
ｇｌII断片（約2.7kb断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢＡ
８由来のＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片（約1.4kb断片）0.1μ
ｌをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶かし、この混
合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加えた。さら
にＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で18時間結合
反応を行った。

【００９１】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡ
を回収し、図７に示したｐＣｆＢＢ101を得た。ｐＣｆ
ＢＢ101のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ酸配
列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの１番目のＴｈｒがＡｌａ
に、３番目のＬｅｕがＴｈｒに、４番目のＧｌｙがＡｒ
ｇに、５番目のＰｒｏがＳｅｒに、17番目のＣｙｓがＳ
ｅｒに置換されている。以後、本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ
〔ＮＢ101〕と呼ぶ。 (3) ｐＣｆＢＣ42Ｂ１、ｐＣｆＢＣ45、ｐＣｆＢＣ5
2、ｐＣｆＢＣ59、ｐＣｆＢＣ76、ｐＣｆＢＣ77、ｐＣ
ｆＢＣ93、ｐＣｆＢＣ95、ｐＣｆＢＣ97の造成（図８参
照）：まず、下記のＤＮＡリンカーを合成した。

【００９２】

【化１０】

【００９３】この合成ＤＮＡリンカーは、３ケ所の塩基
がＧ，Ａ，Ｔ，Ｃのうちのいずれかであり、１ケ所の塩
基がＧかＡ（31−merの場合）、あるいはＣかＴ（33−m
erの場合)のいずれかであり、合計128種類のＤＮＡリン
カーの混合物として得られる。その結果、このＤＮＡリ
ンカーのコードするｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸配
列としてはＭｅｔの次のアミノ酸としては16種類、Ｐｒ
ｏの次のアミノ酸としては８種類の可能性があり全体と
して128種類のアミノ酸配列が可能であるようにデザイ
ンされている。

【００９４】まず一本鎖ＤＮＡ、31−merと33−merを通
常のトリエステル法により合成した。31−merおよび33
−merの各々２μｇを全量40μｌのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）30単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎIII
−ＢｇｌII断片（約2.7kb断片）0.1μｌ、同じくｐＣｆ
ＢＡ８由来のＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片（約1.4kb断片）
0.1μｌをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶かし、
この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加え
た。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で18
時間結合反応を行った。

【００９５】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡ
を回収し、ｐＣｆＢＣ42Ｂ１、ｐＣｆＢＣ45、ｐＣｆＢ
Ｃ52、ｐＣｆＢＣ59、ｐＣｆＢＣ76、ｐＣｆＢＣ77、ｐ
ＣｆＢＣ93、ｐＣｆＢＣ95、ｐＣｆＢＣ97を得た。前記
デイデオキシ・シークエンス法でＤＮＡリンカー部分の
塩基配列を決定したところ、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＮ末
端側の塩基配列は下記の通りであることが判明した。

【００９６】

【化１１】 これらのプラスミドがコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体
は、それぞれ成熟型ｈＧ−ＣＳＦに比べて次のようにア
ミノ酸残基が置換されている。

【００９７】

【表３】

【００９８】ｐＣｆＢＣ42Ｂ１、ｐＣｆＢＣ45、ｐＣｆ
ＢＣ52、ｐＣｆＢＣ59、ｐＣｆＢＣ76、ｐＣｆＢＣ77、
ｐＣｆＢＣ93、ｐＣｆＢＣ95、ｐＣｆＢＣ97にコードさ
れるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、それぞれｈＧ−ＣＳＦ
〔ＮＣ42Ｂ１〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ45〕、ｈＧ−ＣＳ
Ｆ〔ＮＣ52〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ59〕、ｈＧ−ＣＳＦ
〔ＮＣ76〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ77〕、ｈＧ−ＣＳＦ
〔ＮＣ93〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ95〕およびｈＧ−ＣＳ
Ｆ〔ＮＣ97〕と呼ぶ。 (4) ｐＣｆＢＤ28、ｐＣｆＢＤ56、ｐＣｆＢＤ82の造
成：まず、下記のＤＮＡリンカーを合成した。

【００９９】

【化１２】

【０１００】このＤＮＡリンカーは、４ケ所の塩基が
Ｇ，Ａ，Ｔ, Ｃのうちのいずれかであり、合計256種類
のＤＮＡリンカーの混合物として得られる。その結果、
このＤＮＡリンカーのコードするｈＧ−ＣＳＦのＮ末端
のアミノ酸配列としては４ヶ所に４種類のアミノ酸の可
能性があり、全体として256種類のアミノ酸配列が可能
であるようにデザインされている。

【０１０１】まず一本鎖ＤＮＡ、31−merと33−merを通
常のトリエステル法により合成した。31−merおよび33
−merの各々２μｇを全量40μｌのＴ４キナーゼ緩衝液
にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ30単位（宝酒
造社製）を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎIII
−ＢｇｌII断片（約2.7kb断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆ
ＢＡ８由来のＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片（約1.4kb断片）
0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶かし、
この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加え
た。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で18
時間結合反応を行った。

【０１０２】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、ｐＣｆＢＤ28，ｐＣｆＢＤ56, ｐＣｆＢＤ82を得
た。前記デイデオキシ・シークエンス法でＤＮＡリンカ
ー部分の塩基配列を決定したところ、ｈＧ−ＣＳＦ誘導
体のＮ末端側の塩基配列は下記の通りであることが判明
した。

【０１０３】

【化１３】 これらのプラスミドがコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体
は、それぞれ成熟型ｈＧ−ＣＳＦに比べて次のようにア
ミノ酸残基が置換されている。

【０１０４】

【表４】

【０１０５】ｐＣｆＢＤ28, ｐＣｆＢＤ56, ｐＣｆＢＤ
82にコードされるｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体を以
後、それぞれｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＤ28〕、ｈＧ−ＣＳＦ
〔ＮＤ56〕およびｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＤ82〕と呼ぶ。ｐＣ
ｆＢＤ56を含む大腸菌菌株はEscherichia coli ＥＣｆ
ＢＤ56 (FERM BP-1221) として昭和61年11月27日付で、
ｐＣｆＢＤ28を含む大腸菌菌株はEscherichia coli Ｅ
ＣｆＢＤ28 (FERM BP-1479) として昭和62年9月18日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託さ
れている。

【０１０６】

【化１４】

【０１０７】このＤＮＡリンカーのコードするｈＧ−Ｃ
ＳＦのＮ末端のアミノ酸配列としては、１番目のＴｈｒ
から４番目のＧｌｙまでの４アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖Ｄ
ＮＡ、18−mer と20−mer を通常のトリエステル法によ
り合成した。18−mer および20−mer の各々２μｇを全
量40μｌのＴ４キナーゼ緩衝液にとかし、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ30単位（宝酒造社製）を加えて、37℃
で60分間リン酸化反応を行った。

【０１０８】次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢ
anIII−ＢｇｌII断片（約2.7kb断片）0.1μｇ、同じく
ｐＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片（約1.4k
b）0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶か
し、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加
えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で
18時間結合反応を行った。

【０１０９】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、ｐＣｆＴＮＳ７を得た。ｐＣｆＴＮＳ７にコードさ
れるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ〔△１−
４Ｓ〕と呼ぶ。 (6) ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓの造成（図14）：下記のＤＮ
Ａリンカーを合成した。

【０１１０】

【化１５】

【０１１１】このＤＮＡリンカーは、２ヶ所の塩基がＡ
かＧのいづれかであり、合計４種類のＤＮＡリンカーの
混合物として得られる。その結果、このＤＮＡリンカー
のコードするｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸配列とし
ては、４番目のアミノ酸が４種類可能であるようにデザ
インされている。まず一本鎖ＤＮＡ、31−mer と33−me
r を通常のトリエステル法により合成した。31−mer お
よび33−mer の各々２μｇを全量40μｌのＴ４キナーゼ
緩衝液にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ30単位
（宝酒造社製）を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を
行った。

【０１１２】次に第１項で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢan
III−ＢｇｌII断片（約2.7kb断片）0.1μｇ、同じくｐ
ＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片（約1.4kb断
片）0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶か
し、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加
えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で
18時間結合反応を行った。

【０１１３】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓを得た。前記デイデオキシ・
シークエンス法でＤＮＡリンカー部分の塩基配列を決定
したところ、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＮ末端側の塩基配列
は下記の通りであることが判明した。

【０１１４】

【化１６】

【０１１５】ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓによりコードされる
ｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後ｈＧ−ＣＳＦ〔Ａｒｇ⁴，Ｓ
ｅｒ¹⁷ 〕と呼ぶ。 (7) ｐＣｆＴＮ205の造成（図15）：第５項で得たｐＣ
ｆＴＮＳ７、３μｇを40μｌのＫ−150緩衝液（Ｙ−100
緩衝液の100mM ＮａＣｌを150mM ＫＣｌにおきかえたも
の）に溶かし、制限酵素ＰｖｕＩ ５単位とＸｈｏＩ ５
単位を加え37℃で１時間消化反応を行った。反応液から
ＬＧＴ法により、トリプトファンプロモーター部分を含
む約1.0kbのＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ−ＸｈｏＩ断片）を
約0.5μｇ得た。

【０１１６】これとは別に、第１項で得たｐＣｆＢＡ32
3μｇを40μｌのＫ−150緩衝液に溶かし、制限酵素Ｐｖ
ｕＩ ５単位とＸｈｏＩ ５単位を加え、37℃で１時間消
化反応を行った。反応液からＬＧＴ法により、ｈＧ−Ｃ
ＳＦｃＤＮＡの大部分を含む約3.0kbのＤＮＡ断片（Ｘ
ｈｏＩ−ＰｖｕＩ断片）を２μｇ得た。次に上記で得た
ｐＣｆＴＮＳ７由来のＰｖｕＩ−ＸｈｏＩ断片（約1.0k
b) の0.1μｇとｐＣｆＢＡ32由来のＸｈｏＩ−ＰｖｕＩ
断片（約3.0kb）0.3μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25
μｌに溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４
℃，18時間結合反応を行った。

【０１１７】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質
転換し、Ａｐ^r のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収
し、図15に示したｐＣｆＴＮ205を得た。ｐＣｆＴＮ205
のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ酸配列は、成
熟型ｈＧ−ＣＳＦの１〜４番目のアミノ酸が欠失してい
る。以後本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔△１−４〕と呼ぶ。 (8) ｐＣｆＴＡＡｒｇ４の造成（図15）：第６項で得た
ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ、３μｇを40μｌのＫ−150緩衝
液に溶かし、制限酵素ＰｖｕＩ ５単位とＸｈｏＩ ５単
位を加え37℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬ
ＧＴ法により、トリプトファンプロモーター部分を含む
約1.0kbのＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ−ＸｈｏＩ断片）を約
0.5μｇ得た。

【０１１８】これとは別に、第１項で得たｐＣｆＢＡ32
3μｇを40μｌのＫ−150緩衝液に溶かし、制限酵素Ｐｖ
ｕＩ ５単位とＸｈｏＩ ５単位を加え、37℃で１時間消
化反応を行った。反応液からＬＧＴ法により、ｈＧ−Ｃ
ＳＦｃＤＮＡの大部分を含む約3.0kbのＤＮＡ断片（Ｘ
ｈｏＩ−ＰｖｕＩ断片）を２μｇ得た。次に上記で得た
ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ由来のＰｖｕＩ−ＸｈｏＩ断片
（約1.0kb）の0.1μｇとｐＣｆＢＡ32由来のＸｈｏＩ−
ＰｖｕＩ断片（約3.0kb）0.3μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液25μｌに溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
加え、４℃，18時間結合反応を行った。

【０１１９】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質
転換し、Ａｐ^r のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収
し、図15に示したｐＣｆＴＡＡｒｇ４を得た。ｐＣｆＴ
ＡＡｒｇ４のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ酸
配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの４番目のＧｌｙがＡｒｇ
に置換している。以後本誘導体をＧ−ＣＳＦ〔Ａｒｇ
４〕と呼ぶ。 (9) ｐＣｆＴＮＳ301の造成（図16）：第１項で得たｐ
ＣｆＢＡ８、６μｇを50μｌのＹ−100 緩衝液に溶か
し、制限酵素ＨｉｎｄIII 10単位、ＢｇｌII ８単位を
加え、37℃，１時間消化反応を行った。反応液からＬＧ
Ｔ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約1.4kbのＤＮ
Ａ断片（ＨｉｎｄIII−ＢｇｌII断片）約0.6μｇを得
た。

【０１２０】次に下記のＤＮＡリンカーを合成した。

【０１２１】

【化１７】

【０１２２】このＤＮＡリンカーのコードするｈＧ−Ｃ
ＳＦのＮ末端のアミノ酸配列としては、１番目のＴｈｒ
から11番目のＧｌｎまでの11アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖Ｄ
ＮＡ、27−mer と29−mer を通常のトリエステル法によ
り合成した。27−mer および29−mer の各々２μｇを全
量40μｌのＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ30単位（宝酒造社製）を加えて、37℃
で60分間リン酸化反応を行った。

【０１２３】次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎ
III−ＢｇｌII断片（約2.7kb断片）0.1μｇ、同じくｐ
ＣｆＢＡ８由来のＨｉｎｄIII−ＢｇｌII断片（約1.4kb
断片）0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶
かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル
加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃
で18時間結合反応を行った。

【０１２４】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡ
を回収し、ｐＣｆＴＮＳ301を得た。ｐＣｆＴＮＳ301に
コードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ
〔△１−11Ｓ〕と呼ぶ。 (10)ｐＣｆＴＮＳ401の造成（図16）：下記のＤＮＡリ
ンカーを合成した。

【０１２５】

【化１８】

【０１２６】このＤＮＡリンカーのコードするｈＧ−Ｃ
ＳＦのＮ端末のアミノ酸配列としては、１番目のＴｈｒ
から７番目のＳｅｒまでの７アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖Ｄ
ＮＡ、39−merと41−merを通常のトリエステル法により
合成した。39−merおよび41−merの各々２μｇを全量40
μｌのＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ30単位（宝酒造社製）を加えて、37℃で60
分間リン酸化反応を行った。

【０１２７】次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎ
III−ＢｇｌII断片（約2.7kb断片）0.1μｇ、同じくｐ
ＣｆＢＡ８由来のＨｉｎｄIII−ＢｇｌII断片（約1.4kb
断片）0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶
かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカー約２ピコモルを
加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃
で18時間結合反応を行った。

【０１２８】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ａｐ^rのコロニーを
得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを
回収し、ｐＣｆＴＮＳ401を得た。ｐＣｆＴＮＳ401にコ
ードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ
〔△１−７Ｓ〕と呼ぶ。 (11)ｐＣｆＴＮＳ501の造成（図１２）：第１項で得ら
れたｐＣｆＢＡ８、６μｇを40μｌのＹ−100緩衝液に
溶かし、制限酵素ＸｈｏＩ10単位を加え、37℃、１時間
消化反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およ
びエタノール沈澱でＤＮＡを回収し、30μｌのクレノー
緩衝液に溶かし、ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片
を２単位加え、17℃で30分間反応を行った。68℃で10分
間処理しＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を失活さ
せ、ＫＣｌを150mMになるように加え制限酵素ＰｖｕＩ
を８単位加え37℃で１時間消化反応を行った。反応液か
らＬＧＴ法でｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約３kbのＤＮ
Ａ断片〔ＸｈｏＩ（Ｂｌｕｎｔ）−ＰｖｕＩ〕約２μｇ
を得た。

【０１２９】別に、参考例４の方法によって得たＡＴＧ
ベクターｐＴｒＳ20（3.8kb）５μｇを50μｌのＹ−０
緩衝液（Ｙ−100緩衝液より100mM ＮａＣｌを除いたも
の）に溶かし、16単位の制限酵素ＳａｃＩを加え、37℃
で３時間切断反応を行った。フェノール−クロロホルム
抽出の後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、30μ
ｌのクレノー緩衝液に溶かし、ＤＮＡポリメラーゼＩ・
クレノー断片を２単位加え、17℃で30分間反応を行っ
た。68℃で10分間処理しＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノ
ー断片を失活させ、ＫＣｌを150mMになるように加え、
制限酵素ＰｖｕＩを８単位加え37℃で１時間消化反応を
行った。反応液からＬＧＴ法でＰｔｒｐを含む約１kbの
ＤＮＡ断片〔ＳａｃＩ（Blunt)−ＰｖｕＩ〕約0.5μｇ
を得た。

【０１３０】次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＸｈｏ
Ｉ(Blunt) −ＰｖｕＩ断片（約３kb）0.１μｇとｐＴｒ
Ｓ20由来のＳａｃＩ(Blunt) −ＰｖｕＩ断片（約１kb)
0.2 μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μｌに溶か
し、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃，18時間
結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株
を形質転換し、Ａｐ^r のコロニーを得、このコロニーよ
り前記バーンボイムらの方法によりプラスミドＤＮＡを
回収し、図12に示したｐＣｆＴＮＳ501を得た。

【０１３１】ｐＣｆＴＮＳ501のコードするｈＧ−ＣＳ
Ｆ誘導体は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端６番目までの
アミノ酸が欠失し、17番目のＣｙｓがＳｅｒに置換して
いる。ｐＣｆＴＮＳ501 にコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘
導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ〔△１−６Ｓ〕と呼ぶ。 実施例７． (1) ｐＣｆＣＢ101，ｐＣｆＣＣ52，ｐＣｆＣＣ59，Ｃ
ｆＣＤ28，ｐＣｆＣＤ56の造成（図８）：まず、ｐＢＲ
322〔ボリバー（Bolivar)ら：ジーン (Gene) 2, 95 (19
77)〕３μｇを40μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵
素ＰｓｔＩを５単位加え、37℃，１時間消化反応を行っ
た。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈
殿でＤＮＡを回収し、33mMトリスー酢酸（pH7.9）、66m
M酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、５mMジチオス
レイトール、および0.4mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰを含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液と略記する）20μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造社製）１単位を加え、37℃，30分間
反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿でＤＮＡを回収し、20μｌのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液に溶かした。これにＢｇｌIIリンカーＤＮ
Ａ（宝酒造社製：ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−
Ｇ）を約８ピコモル加え、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを
６単位加え、４℃，18時間結合反応を行った。フェノー
ル−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿でＤＮＡを
回収し、40μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩを10単位、ＢｇｌIIを８単位加え、37℃で１時
間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法でテトラサイ
クリン耐性遺伝子部分を含む約3.6kbのＤＮＡ断片（Ｅ
ｃｏＲＩ−ＢｇｌII断片）約0.9μｇを得た。

【０１３２】これとは別に、実施例６−(2)で得たｐＣ
ｆＢＢ101、実施例６−(3)で得たｐＣｆＢＣ52あるいは
ｐＣｆＢＣ59、実施例６−(4)で得たｐＣｆＢＤ28ある
いはｐＣｆＢＤ56をそれぞれ３μｇ別々に10倍濃度のＹ
−100緩衝液にとかし、制限酵素ＥｃｏＲＩを５単位、
ＢｇｌIIを６単位加え、37℃で１時間消化反応を行っ
た。反応液からＬＧＴ法で、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ部分
を含む約1.8kbのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII断
片）をそれぞれ約0.4μｇ得た。

【０１３３】上記で得た、ｐＢＲ322由来のＥｃｏＲＩ
−ＢｇｌII断片（約3.6kb）約0.05μｇを20μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼ緩衝液にとかしたものを５本調製した。
これに上記で得たｐＣｆＢＢ101あるいはｐＣｆＢＣ52
あるいはｐＣｆＢＣ59あるいはｐＣｆＢＤ28あるいはｐ
ＣｆＢＤ56由来のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII断片（約1.8kb
断片）約0.1μｇずつを別々に加え、さらにＴ４ＤＮＡ
リガーゼを４単位加え、４℃18時間結合反応を行った。

【０１３４】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株を形質転換し、Ｔｃ^R のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡ
を回収し図８に示したｐＣｆＣＢ101，ｐＣｆＣＣ52，
ｐＣｆＣＣ59，ｐＣｆＣＤ52，ｐＣｆＣＤ56を得た。こ
れらのプラスミドにコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体の
アミノ酸配列はそれぞれｐＣｆＢＢ101，ｐＣｆＢＣ5
2，ｐＣｆＢＣ59，ｐＣｆＢＤ28，ｐＣｆＢＤ56にコー
ドされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ酸配列と同じであ
る。 実施例８． ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の生産および精製：実施例３，４，
６および７で得た組換え体プラスミドｐＣｆＴＬ23,ｐ
ＣｆＴＬ35, ｐＣｆＴＬ38, ｐＣｆＴＬ41，ｐＣｆＴＭ
14，ｐＣｆＴＭ17，ｐＣｆＴＭ113, ｐＣｆＢＢ101, ｐ
ＣｆＢＣ42Ｂ１，ｐＣｆＢＣ45, ｐＣｆＢＣ52, ｐＣｆ
ＢＣ59, ｐＣｆＢＣ76, ｐＣｆＢＣ77, ｐＣｆＢＣ93，
ｐＣｆＢＣ95，ｐＣｆＢＣ97, ｐＣｆＢＤ28, ｐＣｆＢ
Ｄ56，ｐＣｆＢＤ82，ｐＣｆＴＮＳ７，ｐＣｆＡＡｒｇ
４Ｓ, ｐＣｆＴＮＳ301 ，ｐＣｆＴＮＳ401 , ｐＣｆＴ
ＮＳ501,ｐＣｆＢＤ28Ａ17, ｐＣｆＢＤ28Ｔ17をもつ大
腸菌Ｗ3110 ｓｔｒＡ株（それぞれＥＣｆＴＬ23, ＥＣ
ｆＴＬ35, ＥＣｆＴＬ38，ＥＣｆＴＬ41, ＥＣｆＴＭ1
4, ＥＣｆＴＭ17, ＥＣｆＴＭ113，ＥＣｆＢＢ101，Ｅ
ＣｆＢＣ42Ｂ１，ＥＣｆＢＣ45, ＥＣｆＢＣ52, ＥＣｆ
ＢＣ59，ＥＣｆＢＣ76，ＥＣｆＢＣ77, ＥＣｆＢＣ93,
ＥＣｆＢＣ95, ＥＣｆＢＣ97，ＥＣｆＢＤ28, ＥＣｆＢ
Ｄ56, ＥＣｆＢＤ82, ＥＣｆＴＮＳ７，ＥＣｆＴＡＡｒ
ｇ４Ｓ，ＥＣｆＴＮＳ301 ，ＥＣｆＴＮＳ401 , ＥＣｆ
ＴＮＳ501，ＥＣｆＢＤ28Ａ17, ＥＣｆＢＤ28Ｔ17とよ
ぶ）をＬＧ培地〔バクトトリプトン10ｇ、酵母エキス５
ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース１ｇを水１ｌに溶かし、
ＮａＯＨにてpHを7.0とする。〕で37℃、18時間培養
し、この培養液５mlを25μｇ／mlのトリプトファンと50
μｇ／mlのアンピシリンを含むＭＣＧ培地〔Ｎａ₂ＨＰ
Ｏ₄ 0.6％、ＫＨ₂ＰＯ₄ 0.3％、ＮａＣｌ 0.5％、カザ
ミノ酸 0.5％、ＭｇＳＯ₄ １mM、ビタミンＢ₁ ４μｇ／
ml、pH7.2〕100mlに接種し、30℃で４〜８時間培養後、
トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアク
リル酸（３β−indoleacrylic acid, 以下ＩＡＡと略
す）を10μｇ／ml加え、さらに２〜12時間培養を続け
た。培養液を8000rpm 、10分間遠心して集菌し、30mM
ＮａＣｌ、30mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）緩衝液で洗
浄した。洗浄菌体を上記緩衝液30mlに懸濁し、０℃で超
音波破砕 (BRANSON SONIC POWER COMPANY 社 SONIFIERC
ELL DISRUPTOR200 、OUTPUT CONTROL2、10分間処理) し
た。これを9000rpm 、30分間遠心して菌体残渣を得た。
この菌体残渣からマーストンらの方法〔F. A. O. Marst
onら: BIO/TECHNOLOGY２，800（1984) 〕によりｈＧ
−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。蛋白
量の測定は、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社プ
ロティン・アッセイキット（スタンダードアッセイ法）
〔M. M. Bradford：Anal. Biochem., 72 ,248 (1976)〕
により行った。Ｇ−ＣＳＦ活性の測定は以下のように行
った。８〜12週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（静岡実験動
物協同組合）の大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出
し、牛胎児血清（ＦＢＳ）を10％添加したα−Minimum
Essential Medium (Flow Laboratories,以下α−ＭＥＭ
培地と略す）に懸濁した。この細胞 (約５×10⁷ 個）懸
濁液1.5mlを、ナイロン・ウール（Nylon wool) （和光
純薬、Nylon Fiber 146-04231)をつめたカラム（0.3
ｇ）に浸漬し、５％ＣＯ₂インキュベーター内にて37
℃，90分間反応させた。次いで予め37℃に加温したα−
ＭＥＭ培地をカラムに流し、溶出してくるナイロン・ウ
ール非吸着性の骨髄細胞を得た。この細胞をα−ＭＥＭ
培地で一回洗浄し、所定の濃度に調整した。

【０１３５】次いで、岡部らの方法〔Okabe T. et al.,
CancerResearch 44 ,4503-4506 (1986)〕に準じて骨
髄造血幹細胞コロニー形成能を測定した。すなわち、α
−ＭＥＭ0.2ml、ＦＢＳ0.4mlおよび２段階稀釈した各サ
ンプル0.2mlの混液に、上記の方法で調製した骨髄細胞
（２×10⁶ 個／ml）の0.2mlを混和した。これに42℃に
保温した0.6％寒天（Difco, Agar purified # 0560-01)
溶液を等量（1.0ml）混和し、その0.5mlを24穴マルチ
ディッシュ（Nunc社製、# 143982) に播種した（５×10
⁴ 個／dish ,ｎ＝３）。５％ＣＯ₂ インキュベーター中
で37℃, ７日間培養し、40個以上の細胞からなるコロニ
ーの数を顕微鏡(Olympus社製、X40)で計数した。コロニ
ー計数後、注意深くスライドグラス上にとり出し、アセ
トン・ホルマリン混液で30秒間固定後、Kubotaらの方法
〔Kubota K.,et al., Exp.Hematology. ８，339-344 (1
980)〕でエステラーゼ２重染色を施し、各コロニーの同
定を行った。

【０１３６】各サンプルの力価は、コロニー形成試験の
２段階稀釈に於ける計数結果から以下の様に算出した。
スタンダードとして用いたインタクトＧ−ＣＳＦのコロ
ニー形成の最大値の1／2値を与える活性を50単位と定義
し、これに各サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性
に換算するため、20を乗じて力価（単位）とした。比活
性は、単位蛋白質（mg）当りの力価（単位／mg）で表示
した。

【０１３７】インタクトのＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ
誘導体の力価を表５に示す。

【０１３８】

【表５】

【０１３９】実施例９． ヒト骨髄細胞に対するｈＧ−ＣＳＦ誘導体の活性測定：
20〜30才の健常人の腸骨より骨髄液をとりだし、これに
等量のα−ＭＥＭ培地を加え混和した。フィコール−パ
ーク(Ficoll−Paque)液（ファルマシア・ファイン・ケ
ミカル社、比重1.077)３mlの上に上記骨髄液４mlを重層
し、400×ｇ、30分間遠心分離し、中間層にくる細胞を
分離した。細胞をＰＢＳ（ＮａＣｌ ８ｇ，ＫＣｌ 0.2
ｇ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 1.15ｇおよびＫＨ₂ＰＯ₄ 0.2ｇを水
に溶かして１ｌとしたもの）で２回洗浄後、10％ウシ胎
児血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＭ培地に懸濁し、
２×10⁶／ml以下の細胞濃度に調整した。プラスチック
・ディッシュ〔ファルコン (Falcon)3003 〕に10ml播種
し、５％ＣＯ₂ インキュベーターにて37℃，90分間培養
し、プラスチック・ディッシュに非付着性の細胞を回収
した。細胞をα−ＭＥＭ培地で一回洗浄し、所定の濃度
に調整して以下のヒト骨髄幹細胞増殖促進活性およびコ
ロニー形成試験に供した。すなわち、96穴平型マイクロ
プレート(NUNC, 167008)の各ウエルに10％ＦＢＳ添加α
−ＭＥＭ培地を100 μｌ注入し、次いで実施例８の方法
で得たｈＧ−ＣＳＦおよびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の各サン
プル100μｌを第一列に添加した。よく混和した液100μ
ｌを第２列目に移し２倍稀釈とし、以下12列まで同様に
２段階稀釈した（ｎ＝３）。陰性対照として、α−ＭＥ
Ｍ培地だけの群を設けた。

【０１４０】次に、各ウエルに上述のごとく調製した骨
髄細胞懸濁液100μｌ（有核細胞数、５×10⁴ 個）を播
種し、５％ＣＯ₂ インキュベーターにて、37℃、３日間
培養した。最後の18〜20時間に６−³Ｈ−チミジン〔ア
マーシャム日本(Amersham Japan), CodeTRK61, 107mci/
mg〕10μｌを添加して培養した。セル・ハーベスター(C
ell harvester) （ラボサイエンス社）にて各細胞をガ
ラスフィルター上に回収し乾燥後、細胞にとり込まれた
放射能を液体シンチレーションカウンター〔パッカード
社(Packard), Tricarb 3320)〕で計測した。

【０１４１】一方、ヒト骨髄造血幹細胞コロニー形成試
験および各コロニーの同定は実施例８の方法に従って行
った。各サンプルの力価は、コロニー形成試験におい
て、１個のコロニーを形成しうる活性を１単位と定義し
た。すなわち、２段階稀釈に於ける計数結果の直線性を
与える投与量応答直線(Dose-response-curve)よりＨａ
ｌｆ Ｍａｘ値（最大取り込み値の1／2の値）を求め、
各サンプルの力価を算出した。

【０１４２】比活性は単位蛋白質（mg）当りの力価(uni
t／mg）で表示した。インタクトのｈＧ−ＣＳＦおよび
ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の力価を表６に示す。

【０１４３】

【表６】

【０１４４】実施例１０． Ｎ末端第１〜７番目欠失、17番セリンｈＧ−ＣＳＦ誘導
体（以後Ｍ−７Ｓと略す）の製造：実施例６で得た組換
え体プラスミドｐＣｆＢＣ59をもつ大腸菌（ＥＣｆＢＣ
59）を実施例８に記したように培養、精製して得た表２
の誘導体(ａ)（132μｇ／ml）を含む10mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ−100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.0）50mlに対して、ズ
ブチリンＢＰＮ' （8.5単位／mg蛋白質）（シグマ社
製）を0.7μｇ添加し、25℃，40時間インキュベートし
た。10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）で３倍稀釈のの
ち、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）で充たされたＤＥ
ＡＥ−トヨパール650Ｍ（東洋曹達工業社製）（1.7cm×
4.4cm）に10ml／時の流速で通塔した。次いで10mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）20mlを５ml／時の流速で通塔
後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）の緩衝液系に直線
勾配でＮａＣｌを０Ｍから0.4Ｍまで総容量50mlかけて
加え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−７Ｓ誘導体はＮａ
Ｃｌ濃度100〜150mMで溶出された（収量0.7mg、収率10
％）。純度は90％以上であった。 実施例１１． Ｍ−７Ｓの製造：実施例６で得た組換え体プラスミドｐ
ＣｆＢＣ59をもつ大腸菌（ＥＣｆＢＣ59）を実施例８に
記したように培養、精製して得た表２の誘導体(b)（132
μｇ／ml）を含む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM Ｎａ
Ｃｌ溶液（pH8.0）50mlに対して、ズブチリンＢＰＮ'
（8.5単位／mg蛋白質)(シグマ社製）を0.7μｇ添加し、
25℃, 14時間インキュベートした。10mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH8.0）で３倍稀釈したのち、10mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH8.0）で充たされたＤＥＡＥ−トヨパール650Ｍ
（東洋曹達工業社製）（1.7cm×4.4cm）に10ml／時の流
速で通塔した。次いで10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）
20mlを５ml／時の流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH8.0）の緩衝液系に直線勾配でＮａＣｌを０Ｍか
ら0.4Ｍまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶出を行
った。Ｍ−７Ｓ誘導体はＮａＣｌ濃度100〜150mMで溶出
された（収量4.2mg、収率63％）。純度は90％以上であ
った。 実施例１２． Ｍ−７Ｓの製造：実施例６で得た組換え体プラスミドｐ
ＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓを持つ大腸菌（ＥＣｆＴＡＡｒｇ４
Ｓ）を実施例８に記したように培養、精製して得た表２
の誘導体(d)（132μｇ／ml）を含む10mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ−100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.0）50mlに対してズブ
チリシンＢＰＮ’（8.5単位／mg−蛋白質）（シグマ社
製）を0.7μｇ添加し、25℃，40時間インキュベートし
た。ＮａＣｌ濃度を0.5Ｍにした後、10mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌで充されたＺｎキレー
ト セファロース（ファルマシア・ファインケミカル社
製）（1.7cm×2.6cm）に６ml／時の流速で通塔した。次
いで、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5ＭＮａＣ
ｌ12mlを３ml／時の流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ−0.5mM ＮａＣｌの緩衝液を直線勾配でpH8.0からp
H6.0まで総容量30mlかけて、同流速で溶出を行った。Ｍ
−７Ｓ誘導体はpH7.0付近で溶出された（収量0.6mg、収
率９％）。純度は90％であった。 実施例１３． Ｎ末端第１〜６番目欠失、17番セリンｈＧ−ＣＳＦ誘導
体（以後Ｍ−６Ｓと略す）の製造：表２の誘導体(a)（1
32μｇ／ml）を含む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM Ｎ
ａＣｌ溶液（pH8.0）50mlに対して、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′（8.5単位／mg蛋白質）（シグマ社製）を0.7μｇ添
加し、25℃, ２時間インキュベートした。10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH8.0）で３倍稀釈したのち、10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH8.0）で充たされたＤＥＡＥ−トヨパー
ル650Ｍ（東洋曹達工業社製）（1.7cm×4.4cmに10ml／
時の流速で通塔した。次いで10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（p
H8.0）20mlを５ml／時の流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH8.0) の緩衝液系に直線匂配でＮａＣｌを
０Ｍから0.4Ｍまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶
出を行った。Ｍ−６Ｓ誘導体はＮａＣｌ濃度100〜150mM
で溶出された（収量2.6mg，収率40％）。純度は90％以
上であった。

【０１４５】実施例１４． Ｍ−６Ｓ製造：表２の誘導体(a) (132 μｇ／ml）を含
む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.
0）50mlに対して、エポルザイム（4120単位／mg蛋白
質） 協和発酵工業社製）を0.7μｇ添加し、25℃, 20時
間インキュベートした。ＮａＣｌ濃度を0.5Ｍにした
後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌ
で充たされたＺｎキレート セファロース（ファルマシ
ア・ファイン・ケミカル社製) (1.7cm×2.6cm）に６ml
／時の流速で通塔した。次いで、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH8.0) −0.5Ｍ ＮａＣｌ 12mlを３ml／時の流速で
通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−0.5Ｍ ＮａＣｌの緩
衝液を直線勾配でpH8.0からpH6.0まで総容量30mlかけて
同流速で溶出を行った。Ｍ−６Ｓ誘導体はpH7.0付近で
溶出された（収量2.5mg、収率38％）。純度は90％以上
であった。

【０１４６】実施例１５． Ｍ−６Ｓの製造：表２の誘導体(b)（132μｇ／ml）を含
む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.0）
50mlに対してズブチリシンアミロサッカリティカスを0.
7μｇ添加し、25℃，20時間インキュベートした。Ｎａ
Ｃｌ濃度を0.5Ｍにした後、10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
8.0)−0.5Ｍ ＮａＣｌで充たされたＺｎキレート セフ
ァロース（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製)(1.
7cm×2.6cm）に６ml／時の流速で通塔した。次いで、10
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌ 12ml
を３ml／時の流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH
8.0)−0.5Ｍ ＮａＣｌの緩衝液系に直線勾配でpH8.0か
らpH6.0まで容 量30mlかけて同流速で溶出を行なっ
た。Ｍ−６Ｓ誘導体はpH7.0付近で溶出された（収量2.5
mg、収率38％）。純度は90％以上であった。 実施例１６． Ｍ−６Ｓの製造：表２の誘導体(d)（132μｇ／ml）を含
む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.
0）50mlに対してズブチリシン・カールスバーグ(0.034
単位／mg蛋白質)(ＮＯＶＯ社）を0.7μｇ添加し、25
℃，20時間インキュベートし た。ＮａＣｌ濃度を0.5
Ｍにした後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5Ｍ
ＮａＣｌで充たされたＺｎキレート セファロース（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカル社製）(1.7cm×2.6c
m）に６ml／時の流速で通塔した。次いで、10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌ 12mlを３ml／時
の流速で通塔後、10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ−0.5Ｍ ＮａＣ
ｌの緩衝液系に直線勾配でpH8.0からpH6.0まで総容量30
mlかけて同流速で溶出を行なった。Ｍ−６Ｓ誘導体はpH
7.0付近で溶出された（収量３mg、収率45％）。純度は9
0％以上であった。 実施例１７． Ｍ−６Ｓの製造：表２の誘導体(a)（132μｇ／ml）を含
む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.
0）50mlに対して、プロテイナーゼＫ(0.027単位／mg−
蛋白質）（シグマ社製）を0.7μｇ添加し、25℃，40時
間インキュベートした。10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.
0）で３倍稀釈ののち、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.
0）で充たされたＤＥＡＥ−トヨパール650Ｍ（東洋曹達
工業社製）（1.7cm×4.4cm）に10ml／時の流速で通塔し
た。次いで10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0)20mlを５ml
／時の流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）
の緩衝液系に直線勾配で０Ｍ ＮａＣｌから0.4Ｍ Ｎａ
Ｃｌまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶出を行なっ
た。Ｍ−６Ｓ誘導体はＮａＣｌ濃度100〜150mMで溶出さ
れた（収量2.6mg、収率39％）。純度は90％以上であっ
た。 実施例１８． Ｎ末端第１〜５番欠失、17番セリンｈＧ−ＣＳＦ誘導体
（以後Ｍ−５Ｓと略す）の製造：表２の誘導体(b)（132
μｇ／ml）を含む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM Ｎａ
Ｃｌ溶液（pH8.0) 50mlに対して、トリプシン(267単位
／mg−蛋白質）（シグマ社製）を0.5μｇ添加し、25
℃，10時間インキュベートした。ＮａＣｌ濃度を0.5Ｍ
にした後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0) −0.5Ｍ Ｎ
ａＣｌで充たされたＺｎキレート セファロース（ファ
ルマシア・ファイン・ケミカル社製）（1.7cm×2.6cm）
に６ml／時の流速で通塔した。次いで、10mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌ 12mlを３ml／時の
流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5
Ｍ ＮａＣｌの緩衝液系に直線勾配で０Ｍ から0.3Ｍま
でのイミダゾールを総容量30mlかけて加え、同流速で溶
出を行なった。Ｍ−５Ｓ誘導体は0.1Ｍ イミダゾールで
溶出された（収量2.7mg、収率41％）。純度は90％以上
であった。 実施例１９． Ｍ−４Ｓの製造：表２の誘導体(d)（132μｇ／ml）を含
む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.
0) 50mlに対して、トリプシン 267単位／mg−蛋白質
（シグマ社製）を５μｇ添加し、25℃, 20時間インキュ
ベートした。ＮａＣｌ濃度を0.5Ｍにした後、10mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌで充たされた
Ｚｎキレート セファロース（ファルマシア・ファイン
・ケミカル社製）（1.7cm×2.6cm）に６ml／時の流速で
通塔した。次いで、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0)−
0.5Ｍ ＮａＣｌ 12ml を３ml／時の流速で通塔後、10mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌの緩衝液
系に直線勾配で０Ｍ から0.3Ｍ までのイミダゾールを
総容量30mlかけて加え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−
４Ｓ誘導体は0.1Ｍ イミダゾールで溶出された（収量2.
7mg、収率41％）。純度は90％以上であった。 実施例２０． Ｍ−４Ｓの製造：表２の誘導体(d)（132μｇ／ml）を含
む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−100mM ＮａＣｌ溶液（pH8.
0) 50mlに対してα−キモトリプシン267単位／mg−蛋白
質（シグマ社製）を５μｇ添加し、25℃，20時間インキ
ュベートした。ＮａＣｌ濃度を0.5Ｍにした後、10mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣｌで充たされ
たＺｎキレート セファロース（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカル社製）（1.7cm×2.6cm）に６ml／時の流速
で通塔した。次いで、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0)
−0.5Ｍ ＮａＣｌ 12ml を３ml／時の流速で通塔後、10
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0) −0.5Ｍ ＮａＣｌの緩衝
液系に直線勾配で０Ｍ から0.3Ｍ までのイミダゾール
を総容量30mlかけて加え、同流速で溶出を行なった。Ｍ
−４Ｓ誘導体は0.1Ｍ イミダゾールで溶出された（収量
2.3mg、収率35％）。純度は90％以上であった。

【０１４７】実施例２１．実施例10−20に認められたよ
うに、17番目がセリンに置換し、しかもＮ末端アミノ酸
が、４個欠失（Ｍ−４Ｓ）、５個欠失（Ｍ−５Ｓ）、６
個欠失（Ｍ−６Ｓ）、そして７個欠失（Ｍ−７Ｓ）され
たｈＧ−ＣＳＦ誘導体が得られる。一般に組換えＤＮＡ
技術を用いる場合、Ｎ末端にメチオニンが付加される。
これが、組換え型産物の１つの欠点である。しかし、本
発明の酵素切断法を用いれば、Ｎ末端にメチオニンが付
加されずに製造できるので有利である。

【０１４８】このように取得された誘導体のＧ−ＣＳＦ
活性を測定し比較した。結果を表７に示す。

【０１４９】

【表７】

【０１５０】表７の結果より、Ｎ末端側アミノ酸４〜７
欠失体については、すべて、インタクトｈＧ−ＣＳＦに
比べ、in vitroの評価において２〜４倍の高活性が見い
出された。したがって、本発明より製造できるＮ末端側
アミノ酸欠失体はＮ末端側にメチオニンが付加されず、
しかもインタクトより２〜４倍高活性を有するものであ
る。

【０１５１】Ｎ末端部の変異による加水分解酵素に対す
る切断反応性（感受性）の獲得について以下の例で示
す。 実験例１． インタクトのｈＧ−ＣＳＦとＮ末端変異ｈＧ−ＣＳＦと
のズブチリシン・カールスバーグに対する反応性の比較 実施例16と同様にして、表２の誘導体とインタクトのｈ
Ｇ−ＣＳＦをズブチリシン・カールスバーグ（ＮＯＶＯ
社）3.6×10^-4単位／mg−Ｇ−ＣＳＦ存在下に14時間、2
5℃でインキュベートしたところ、表２の誘導体からは
Ｍ−６Ｓ誘導体が得られたが、インタクトｈＧ−ＣＳＦ
は未反応であった。さらに、酵素量100倍（3.6×10^-2単
位／mg−Ｇ−ＣＳＦ）にしても、インタクトでは、Ｍ−
６Ｓの生成はなく全体的な分解反応が優先した。 実験例２． インタクトのｈＧ−ＣＳＦとＮ末端変異ｈＧ−ＣＳＦと
のトリプシンに対する反応性の比較 実施例19と同様にして、表２の誘導体(a)とインタクト
ｈＧ−ＣＳＦをトリプシン（シグマ社）0.22単位／mg−
Ｇ−ＣＳＦの存在下に20時間，25℃でインキュベートし
たところ、表２の誘導体(a)からはＭ−４Ｓ誘導体が得
られたが、インタクトｈＧ−ＣＳＦは未反応であった。
さらに、酵素量100倍（22単位／mg−Ｇ−ＣＳＦ）にし
ても、インタクトｈＧ−ＣＳＦではＭ−４Ｓの生成はな
く全体的な分解反応が優先した。 実験例３． ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の熱安定性：表８に示した本発明の
各種誘導体20μｇをリン酸緩衝液−生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）（pH7.2）または10％牛胎児血清（ＦＢＳ）添加α
−ＭＥＭ培地１mlに溶解させた。56℃でインキュベート
し、経時的にサンプル採取を行い、そのＣＳＦ活性を、
マウス骨髄細胞を用いたコロニー形成試験（前記岡部ら
の方法）で測定した。

【０１５２】各サンプルは40ng／mlより２段階稀釈法で
10段階の稀釈を行い、各段階の測定を行い、良好な用量
反応(Dose response) を与える任意の濃度での活性を加
熱前（０分）と比較することにより残存活性を求めた。
ＰＢＳ中または10％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭ培地中での残
存活性（熱安定性に対応する）をそれぞれ表８（Ａ）お
よび（Ｂ）に示す。

【０１５３】

【表８】

【０１５４】実施例２２． 部位特異的変異を用いたｐＣｆＢＤ28Ａ17，ｐＣｆＢＤ
28Ｔ17の造成（図17参照）： (a) 鋳型一本鎖ＤＮＡ（一本鎖ｐｔ19ＢＤ28Ｎ）の造
成：実施例６(4) の方法で得たｐＣｆＢＤ28 ３μｇを5
0μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｎIII
（東洋紡績社製）とＰｓｔＩをそれぞれ10単位ずつ加
え、37℃で２時間切断反応を行った。この反応液からＬ
ＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（ＮＤ28）のＮ末部
分をコードする約210bpのＤＮＡ断片（ＢａｎIII−Ｐｓ
ｔＩ断片）約0.1μｇを得た。

【０１５５】一方、Ｍ13ファージベクターであるＭ13ｍ
ｐ19ＲＦＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇを全量50μｌのＹ
−50緩衝液に溶かし、制限酵素ＡｃｃＩ（東洋紡績社
製）を10単位加え、37℃，２時間切断反応を行った。そ
の後、ＮａＣｌ濃度が100mMになるようにＮａＣｌを添
加し、制限酵素ＰｓｔＩを10単位加え37℃，２時間切断
反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により約7.24kb
のＤＮＡ断片（ＡｃｃＩ−ＰｓｔＩ断片）約0.8μｇを
得た。

【０１５６】上記で得たＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約2
10bp）0.2μｇと、ＡｃｃＩ−ＰｓｔＩ断片（約7.24k
b）0.05μｇをＴ４リガーゼ緩衝液50μｌに溶かし、こ
の混合液にＴ４ＤＮＡリガーゼ10単位を加え12℃，16時
間結合反応を行った。次に、公知の方法に従い、上記反
応液を用いて大腸菌ＪＭ105株をトランスフェクション
し、組換え体ファージを得た。この組換え体ファージの
感染した大腸菌ＪＭ105株の培養菌体より、プラスミド
ＤＮＡ回収法に準じて、組換え体Ｍ13ファージＲＦＤＮ
Ａを回収した。このＲＦＤＮＡ（これをｐｔ19ＢＤ28Ｎ
と呼ぶ）の構造は、ＰｓｔＩ，ＥｃｏＲＩ，ＡｖａＩ，
ＸｈｏＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より確認した。そこでこの組換え体ファージより、公知
の方法に従って一本鎖ｐｔ19ＢＤ28Ｎを回収し鋳型とし
た。 (b) ギャップト・デュプレックスＤＮＡ（Gapped Duple
x ＤＮＡ）の造成：Ｍ13ｍｐ19ＲＦＤＮＡ（宝酒造社
製）３μｇを30μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIをそれぞれ10単位ずつ加
え、37℃で２時間切断反応を行った。この反応液からＬ
ＧＴ法により約7.2kbのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄIII断片）約2.5μｇを得た。

【０１５７】このｍｐ19ＲＦＤＮＡ由来のＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄIII断片（約7.2kb）と前項で得た鋳型一本鎖Ｄ
ＮＡ，ｐｔ19ＢＤ28Ｎ１μｇをクレノー緩衝液27μｌに
溶かし、100℃で６分間煮沸することによりＤＮＡを変
性させた。その後、65℃で10分間、37℃で40分間，４℃
で40分間、氷中で10分間放置し、アニール反応を行い鋳
型中のＧ−ＳＣＦ遺伝子部分だけが一本鎖となったギャ
ップト・デュプレックスＤＮＡを生成させた。生成した
ギャップト・デュプレックスＤＮＡはＬＧＴ法により回
収した。 (c) 突然変異誘発（ｐｔ19ＢＤ28ＮＡ17，ｐｔ19ＢＤ28
ＮＴ17の造成）：実施例６で得たｈＧ−ＣＳＦ誘導体
〔ＮＤ28〕のＮ末端から17番目のアミノ酸であるＳｅｒ
をＡｌａに置換するために必要な一本鎖ＤＮＡ（これを
Ｄ−１と呼ぶ）および同ＳｅｒをＴｈｒに置換するため
に必要な一本鎖ＤＮＡ（これをＤ−２と呼ぶ）を通常の
トリエステル法により合成した。Ｄ−１（33−mer)およ
びＤ−２（33−mer)の塩基配列を下に示す。

【０１５８】

【化１９】

【０１５９】Ｄ−１を用いた突然変異誘発によりＳｔｕ
Ｉサイトが、Ｄ−２を用いた突然変異誘発によりＸｂａ
Ｉサイトが新たに生じるようにデザインされているた
め、突然変異が導入されたものをこれらの制限酵素によ
る切断で確認することができる。Ｄ−１，Ｄ−２それぞ
れ１μｇを別個に50μｌのＴ４キナーゼ緩衝液に溶か
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ30単位を加えて37℃
で60分間リン酸化反応を行った。

【０１６０】次に、このリン酸化したＤ−１あるいはＤ
−２の0.2μｇと前項で得たギャップト・デュプレック
スＤＮＡ0.1μｇを6.5mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），
８mMＭｇＣｌ₂,１mM ２−メルカプトエタノールおよび1
00mM ＮａＣｌを含む緩衝液34μｌに溶かし、65℃で60
分間、室温で30分間放置し、Ｄ−１あるいはＤ−２をギ
ャップト・デュプレックスＤＮＡにアニールさせた。

【０１６１】この溶液にｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰをそれぞれ0.5mMになるように加えた後、
1.5単位のＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片と10単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃，16時間の伸長反
応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＪＭ105をトラン
スフェクションし、変異導入ファージを得た。変異導入
ファージの感染した大腸菌ＪＭ105よりＲＦＤＮＡを回
収し、ＡｖａＩ，ＸｈｏＩ，ＳｔｕＩ（Ｄ−１を用いた
場合）あるいはＸｂａＩ（Ｄ−２を用いた場合）で切断
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
Ｄ−１により変異を導入したＲＦＤＮＡをｐｔ19ＢＤ28
ＮＡ17，Ｄ−２により変異を導入したＲＦＤＮＡをｐｔ
19ＢＤ28ＮＴ17とよぶ。ｐｔ19ＢＤ28ＮＡ17のＳｔｕＩ
サイト付近およびｐｔ19ＢＤ28ＮＴ17のＸｂａＩサイト
付近の塩基配列は下記のとおりであることを、Ｍ13ファ
ージを用いたデイデオキシ・シークエンス法で確認し
た。

【０１６２】

【化２０】

【０１６３】(d) ｐＣｆＢＤ28Ａ17およびｐＣｆＢＤ28
Ｔ17の造成： 前項で得たｐｔ19ＢＤ28ＮＡ17あるい
はｐｔ19ＢＤ28ＮＴ17 3 μgを50μlのＹ−100緩衝液に
溶かし、制限酵素ＡｖａＩおよびＸｈｏＩをそれぞれ10
単位加え37℃で2 時間切断反応を行った。反応液からＬ
ＧＴ法により、前項で導入した変異部位を含む約110bp
のＤＮＡ断片（ＡｖａＩ−ＸｈｏＩ断片）を0.05μg 得
た。

【０１６４】一方、実施例６の(4)で得たｐＣｆＢＤ28
２μｇを50μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Ｘ
ｈｏＩとＢｇｌIIをそれぞれ10単位ずつ加え37℃で２時
間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、
トリプトファンプロモーター部分を含む約2.74kbのＤＮ
Ａ断片（ＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片）を約１μｇ得た。ま
た、ｐＣｆＢＤ282μｇを50μｌのＹ−100緩衝液に溶か
し、制限酵素ＢｇｌIIを10単位加え37℃で２時間切断反
応を行った。アガロースゲル電気泳動でＢｇｌII切断が
完全に行われていることを確認した後に、制限酵素Ａｖ
ａＩを５単位加え37℃で10分間部分切断反応を行った。
この反応液からＬＧＴ法により、成熟型ｈＧ−ＣＳＦｃ
ＤＮＡの大部分とｌｐｐターミネーター部分を含む約1.
29kbのＤＮＡ断片（ＢｇｌII−ＡｖａＩ断片）を0.4μ
ｇ得た。

【０１６５】次に上記で得たｐＣｆＢＤ28由来のＸｈｏ
Ｉ−ＢｇｌII断片(約2.74kb）0.1μｇおよびＢｇｌII−
ＡｖａＩ断片(約1.29kb）とｐｔ19ＢＤ28ＮＡ17あるい
はｐｔ19ＢＤ28ＮＴ17のＡｖａＩ−ＸｈｏＩ断片（約11
0bp）0.02μｇをＴ４リガーゼ緩衝液60μｌに溶かし、1
0単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、12℃で16時間結合
反応を行った。

【０１６６】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ101株を形質
転換し、Ａｐ^r のコロニーを得た。このコロニーの培養
菌体よりプラスミドＤＮＡを回収した。ｐｔ19ＢＤ28Ｎ
Ａ17を用いて造成したプラスミドをｐＣｆＢＤ28Ａ17，
ｐｔ19ＢＤ28ＮＴ17を用いて造成したプラスミドをｐＣ
ｆＢＤ28Ｔ17と呼ぶ。ｐＣｆＢＤ28Ａ17の構造は、Ａｖ
ａＩ，ＸｈｏＩ，ＢｇｌII，ＳｔｕＩで切断後、アガロ
ースゲル電気泳動により確認した。また、ｐＣｆＢＤ28
Ｔ17の構造はＡｖａＩ，ＸｈｏＩ，ＢｇｌII，ＸｂａＩ
で切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。

【０１６７】これら２つのプラスミドがコードするｈＧ
−ＣＳＦ誘導体は、それぞれ成熟型ｈＧ−ＣＳＦに比べ
て以下のようにアミノ酸残基が置換されている。

【０１６８】

【表９】

【０１６９】ｐＣｆＢＤ28Ａ17およびｐＣｆＢＤ28Ｔ17
にコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、それぞれｈ
Ｇ−ＣＳＦ〔ＮＤ28Ａ17〕，ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＤ28Ｔ1
7〕と呼ぶ。 参考例１． ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＣＳＦ１−２
の単離 (1) 正常人末梢血マクロファージからのポリ（Ａ）ＲＮ
Ａの調製：正常人の末梢血より遠心分離して得た白血球
をプラスチックボトルで培養し、非接着性の細胞を洗浄
・除去することにより、接着性の細胞であるマクロファ
ージを単離した。このマクロファージより、チオシアン
酸グアニジン−塩化リチウム法〔カサラ(Cathala) ら:
ディーエヌエイ（ＤＮＡ）2, 329 (1983) 〕に従い、ポ
リ（Ａ）を有するＲＮＡを下記のごとく調製した。

【０１７０】正常人の末梢血400mlをHitachi RPR10 ロ
ーターにて1800rpm 、20分間遠心して血球を沈殿させ、
これを50mlリン酸緩衝食塩水〔ＮａＣｌ ８ｇ／ｌ、Ｋ
Ｃｌ0.2ｇ／ｌ、無水Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 1.15ｇ／ｌ、ＫＨ₂
ＰＯ₄ 0.2ｇ／ｌ（pH7.2）；以下ＰＢＳと略記する〕に
懸濁した。この懸濁液25mlをリンパ球分離液〔ビオネテ
ィクス（BIONETICS)社製〕25mlに重層し、Hitachi RPR1
0 ローターにて1800rpm 、30分間遠心した。中間層の白
血球を分取し、等量のＰＢＳで洗浄（HitachiRPR10 ロ
ーターにて1500rpm 、10分間）した後、５％の仔牛胎児
血清を含む20mlのＲＰＭＩ1640培地 (日水製薬社製)
に、懸濁し培養した。培養には組織培養用フラスコ（コ
ーニング社製）を用いた。37℃で1.5時間培養した後、
培養上清を非接着性の細胞とともに除去した。新たに20
mlの同培地と大腸菌リポ多糖（LPS)を0.3mg／mlとなる
ように加え、さらに37℃で４時間培養した。次いで、培
養液より 1100×ｇ、４℃、10分間の遠心によって細胞
を集め、80mlのＰＢＳで洗浄した後、５Ｍチオシアン酸
グアニジン、10mM ＥＤＴＡ、50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH7.0）および８％（v／v)２−メルカプトエタノール
からなる溶液10ml中でボルテックス・ミキサーを用い可
溶化した。この可溶化物を遠心管に移し４Ｍ ＬｉＣｌ
溶液80mlを加えて攪拌した後、４℃、20時間静置した。
Hitach- i RPR10ローターにて9000rpm 、90分間遠心
後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ
尿素および２Ｍ塩化リチウムからなる溶液50mlに懸濁
し、Hitachi RPR10 ローターにて9000rpm、60分間遠心
後、再びＲＮＡを沈殿として回収した。

【０１７１】ＲＮＡの沈殿を0.1％ラウリル硫酸ナトリ
ウム、１mM ＥＤＴＡ、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.
5）からなる溶液10mlに溶解し、フェノール−クロロホ
ルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得られ
たＲＮＡ約0.8mgを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）お
よび１mM ＥＤＴＡからなる溶液１mlに溶かした。65
℃，５分間インキュベートし、0.1mlの５Ｍ ＮａＣｌを
加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース・カラム
〔ピー・エル・バイオケミカル（Ｐ−Ｌ Biochemical)
社製〕クロマトグラフィー（カラム体積0.5ml）にかけ
た。吸着したポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを10mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）および１mM ＥＤＴＡからなる溶
液で溶出し、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約30μｇを得
た。 (2) ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入：オカ
ヤマ−バーグ（Okayama-Berg）の方法〔モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ（Mol.Cell.Biol.),
２，161 (1982)〕に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み
込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の
概略を図９に示す。

【０１７２】ｐＣＤＶ１〔オカヤマ・アンド・バーグ(O
kayama & Berg)：モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジィ（Mol.Cell.Biol.),３，280 (1983)〕400μ
ｇを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5),６mM ＭｇＣｌ₂
および10mM ＮａＣｌからなる溶液300μｌに加え、さら
に500単位のＫｐｎＩを加えて、37℃，６時間反応さ
せ、プラスミド中のＫｐｎＩ部位で切断した。フェノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡ
を回収した。ＫｐｎＩ切断した該ＤＮＡ約200μｇを40m
M カコジル酸ナトリウム，30mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
6.8) ，１mM ＣａＣｌ₂ および0.1mM ジチオスレイトー
ル（以下ＤＴＴと略記する）からなる緩衝液（以下Ｔｄ
Ｔ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを0.25mM となるよう
加えた溶液200μｌに加え、さらに81単位のターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下Ｔｄ
Ｔと略記する) (P-L Bioche-micals社製）を加えて、3
7℃，11分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶ１のＫｐｎ
Ｉ切断部位の３'末端にポリ（ｄＴ）鎖が約67個付加さ
れた。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿により、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶ
１ＤＮＡ約100μｇを回収した。該ＤＮＡを10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH7.5），６mM ＭｇＣｌ₂，100mM ＮａＣ
ｌからなる緩衝液150μｌに加え、さらに360単位のＥｃ
ｏＲＩを加え、37℃, ２時間反応させた。該反応物をＬ
ＧＴ法で処理後、約3.1kb のＤＮＡ断片を回収し、約60
μｇのポリ（ｄＴ）鎖付加ｐＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡ
を10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）および１mM ＥＤＴ
Ａからなる溶液500μｌに溶解し、65℃, ５分間インキ
ュベート後、氷冷して50μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え
た。混合物をオリゴ（ｄＡ）セルロースカラム（コラボ
ラティブリサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。
ポリ（ｄＴ）鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これ
を10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）および１mM ＥＤＴ
Ａからなる溶液で溶出し、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐ
ＣＤ１（以下ベクタープライマーと略記する）27μｇを
得た。

【０１７３】次にリンカーＤＮＡの調製を行った。ｐＬ
１〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama ＆ Berg）：
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol.
Cell. Biol.), 3, 280 (1983)〕約14μｇを10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH7.5),６mM ＭｇＣｌ₂ および50mM Ｎａ
Ｃｌからなる緩衝液200μｌに加え、さらに50単位のＰ
ｓｔＩを加え、37℃, ４時間反応させ、ｐＬ１ＤＮＡ中
のＰｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノール−
クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、ＰｓｔＩ
で切断したｐＬ１ＤＮＡ約13μｇを回収した。該ＤＮＡ
約13μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度0.25mM のｄＧＴＰを
含む溶液50μｌに加え、さらにＴｄＴ（P-L Biochemica
ls社製）54単位を加えて37℃13分間インキュベートし、
ｐＬ１のＰｓｔＩ切断部位３’末端に（ｄＧ）鎖を約14
個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタノー
ル沈殿にてＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ(pH7.5），６mM Ｍ ｇＣｌ₂および60mM Ｎ
ａＣｌからなる緩衝液100μｌに加え、さらに80単位の
ＨｉｎｄIIIを加えて37℃, ３時間インキュベートし、
ｐＬ１ＤＮＡのＨｉｎｄIII部位で切断した。該反応物
をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.5kb のＤＮ
Ａ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツェン(Dretzen)
ら：アナリティカル・バイオケミストリィ（Anal.Bioch
em.)，112, 295 (1981) 〕にて回収し、オリゴ（ｄＧ)
鎖付きのリンカーＤＮＡ（以下単にリンカーＤＮＡと略
記する）を得た。

【０１７４】上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約３μ
ｇ，ベクタープライマー約1.4μｇを50mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ(pH8.3)，８mM ＭｇＣｌ₂, 30mM ＫＣｌ，0.3mM Ｄ
ＴＴ，２mM ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ
およびｄＣＴＰ）および10単位のリボヌクレアーゼイン
ヒビター（P-L Biochemicals社製）からなる溶液22.3μ
ｌに溶解し、10単位の逆転写酵素（生化学工業社製）を
加え、41℃90分間インキュベートし、ｍＲＮＡに相補的
なＤＮＡを合成させた。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二
重鎖の付加したベクタープライマーＤＮＡを回収した。
該ＤＮＡを66μＭ ｄＣＴＰおよび0.2μｇポリ（Ａ）を
含むＴｄＴ緩衝液20μｌに溶かし、14単位のＴｄＴ（P-
L Bio-chemicals 社製）を加えて37℃２分間インキュベ
ートし、ｃＤＮＡ３’末端に20個の（ｄＣ）鎖を付加し
た。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタ
ノール沈殿により（ｄＣ）鎖の付加したｃＤＮＡ−ベク
タープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを10mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），６mM ＭｇＣｌ₂ および60mM
ＮａＣｌからなる液400μｌに溶かし、20単位のＨｉｎ
ｄIIIを加え、37℃, ２時間インキュベートし、Ｈｉｎ
ｄIII部位で切断した。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿して0.5ピコモルの（ｄＣ)
鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。
該ＤＮＡ0.2ピコモルおよび前記のリンカーＤＮＡ 0.4
ピコモルを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.5), 0.1Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび１mM ＥＤＴＡからなる溶液100μｌに溶か
し、65℃，42℃，０℃でそれぞれ10分，25分，30分間イ
ンキュベートした。20mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），
４mMＭｇＣｌ₂，10mM （ＮＨ₄)₂ＳＯ₄，0.1Ｍ ＫＣｌお
よび0.1mM β−ＮＡＤの組成で、全量1000μｌとなるよ
う反応液を調製した。該反応液に25単位の大腸菌ＤＮＡ
リガーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ社製）を
加え、11℃, 18時間インキュベートした。該反応液を各
40μＭのｄＮＴＰ，0.15mM β−ＮＡＤとなるよう成分
を追加調製し、10単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ，20単位
の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（P-L Biochemicals社
製）および10単位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（P-L Bi
ochemicals社製）を加え、12℃，25℃で順次１時間ずつ
インキュベートした。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換
えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部
分がＤＮＡに置換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体
プラスミドが生成した。 (3) ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの選択： (2)で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ600
ＳＦ８株をスコット(Scott) らの方法〔重定勝哉：細胞
工学 2 ,616(1983)〕に従い形質転換した。得られた約9
200個のコロニーをニトロセルロース・フィルター上に
固定した。長田ら〔長田(Nagata)ら: ネイチャー(Natur
e) 319 , 415(1986)〕が単離したｈＧ−ＣＳＦの成熟タ
ンパク質のＮ末端９アミノ酸に相当する27塩基の合成Ｄ
ＮＡ５’−ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG −３’を³²Ｐ
で標識したプローブに60℃で強く会合した１菌株を選ん
だ〔グルンステイン・ホグネス（Grunstein-Hogness)の
方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.)
USA 72, 3961(1975)〕。この菌株がもつプラスミドｐＣ
ＳＦ１−２が有するｃＤＮＡの全塩基配列を、Ｍ13ファ
ージを用いたディデオキシ・シークエンス法により決定
した（配列番号１）。その結果、ｐＣＳＦ１−２が有す
るｃＤＮＡは、ｈＧ−ＣＳＦをコードしていることが判
明した。

【０１７５】この菌株は、前記のようにEscherichia co
li ＥＣＳＦ１−２(FERM BP-1220)として、工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されている。 参考例２． プラスミドｐＫＹＰ26の分離精製 ｐＫＹＰ26を含む大腸菌〔Escherichia coli IKYP26 (F
ERM BP- 863)〕を50μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ培
地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％Ｎ
ａＣｌ，pH7.5）10mlで37℃、18時間培養した。この培
養液全量を50μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ培地１ｌ
に植菌し、37℃で培養した。４時間後に、クロラムフェ
ニコールを170μｇ／mlとなるように加え、さらに37
℃、16時間培養した。遠心分離法（5000rpm 10分間）に
より集菌を行い、0.8％ＮａＣｌで菌体を洗浄した後、5
0mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）20mlに懸濁し、氷冷し
た。10mg／mlのリゾチームを８ml加え氷中に10分間静置
した後、0.5Ｍ ＥＤＴＡを9.6ml加え、氷中に10分間静
置し、２％トリトンＸ−100（和光純薬工業社製）を2.3
ml 加え氷中にさらに１時間静置した。50000×ｇで４
℃、１時間超遠心分離を行い、上清約40mlを得た。次に
この上清に３ＭＮａＯＨを加えpHを12.5として、室温で
10分間静かに攪拌した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.
5）を加え、pHを8.5にもどし、さらに３分間攪拌した。
この時点で液の容量は約55mlであった。１／９容の５Ｍ
ＮａＣｌを加えた後、フェノール抽出をを行った。１
／250容の５mg／mlＲＮａｓｅ Ａ（シグマ社製）を加
え、37℃、１時間ＲＮＡ分解反応を行った後、１／５容
の５Ｍ ＮａＣｌを加え、１／３容の30％ＰＥＧ6000
（半井化学薬品社製）を加え−20℃に２時間静置した。
遠心分離法で沈殿を集め、10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.
5）および１mM ＥＤＴＡからなる液２mlに溶かし、ソジ
ウム・ドデシル・サルフェイト（ＳＤＳ）を0.5％とな
るように加え、プロティナーゼＫ（シグマ社製）を50μ
ｇ／mlとなるように加えて、37℃、１時間蛋白質分解反
応を行った。フェノール抽出を３回繰り返し行った後、
クロロホルム抽出およびエタノール沈澱でＤＮＡを回収
し、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）および１mM ＥＤ
ＴＡからなる液１mlに溶かした。このようにしてｐＫＹ
Ｐ26を800μｇ得ることができた。ｐＫＹＰ26の構造
は、ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII，Ｐ
ｓｔＩで切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。 参考例３． １) ヒトＬＴｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＬＴ１の単
離： (1) ＬｕｋII細胞よりのポリ（Ａ）ＲＮＡの調製： ヒトリンパ芽球様細胞株ＬｕｋIIより、チオシアン酸グ
アニジン−塩化リチウム法〔カサラ（Cathala)ら：ディ
ーエヌエイ（ＤＮＡ）２，329 (1983)〕に従い、ポリ
（Ａ）を有するＲＮＡを下記のごとく調製した。

【０１７６】ヒトリンパ芽球様細胞株ＬｕｋII〔ベリッ
シュ・ワイ・ルビン（Berish Y.Rubin) ら：プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サ
イエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 82, 6637 (19
85) 〕を、５％の仔牛胎児血清と１mM Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ' −２−エタンスルフォン酸
（ＨＥＰＥＳ）を含む１ｌのＲＰＭＩ1640培地（日水製
薬社製）に、８×10⁵／mlとなるように接種し、増殖さ
せた。培養にはスピンナー・カルチャー・ボトルを用い
た。37℃で48時間培養した後、遠心によって細胞を集
め、10ng／mlのフォルボール・ミリステート・アセテー
ト（ＰＭＡ；Phorbol myristate acetate)と５％の仔牛
胎児血清と１mM ＨＥＰＥＳを含む、新しい１ｌのＲＰ
ＭＩ1640培地に移し、さらに37℃で48時間培養した。続
いて、この細胞懸濁液の一部（250ml）から1100×ｇ，
４℃，10分間の遠心によって細胞を集め、80mlのリン酸
塩バッファーで洗浄した後、５Ｍチオシアン酸グアニジ
ン，10mM ＥＤＴＡ，50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.0）
および８％(V／V) ２−メルカプトエタノールからなる
溶液10ml中でボルテックス・ミキサーを用い可溶化し
た。この可溶化物を遠心管に移し、４Ｍ ＬｉＣｌ溶液8
0mlを加えて攪拌した後、４℃，20時間静置した。Hitac
hi ＲＰＲ10ローターにて9000rpm, 90分間遠心後、ＲＮ
Ａを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素およ
び２Ｍ塩化リチウムからなる溶液50mlに懸濁し、Hitach
i ＲＰＲ10ローターにて9000rpm，60分間遠心後、再び
ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈殿を0.1％ラ
ウリル硫酸ナトリウム，１mM ＥＤＴＡ，10mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH7.5）からなる溶液10mlに溶解し、フェノ
ール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回
収した。得られたＲＮＡ約2.5mgを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH8.0）および１mM ＥＤＴＡからなる溶液１mlに溶
かした。65℃，５分間インキュベートし、0.1ml の５Ｍ
ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース
・カラム〔ピー・エル・バイオケミカル（P-L Biochemi
cal) 社製〕クロマトグラフィー (カラム体積0.5ml）に
かけた。吸着したポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを10mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）および１mM ＥＤＴＡからな
る溶液で溶出し、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約100μ
ｇを得た。 (2) ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入：オカ
ヤマ−バーグ（Okayama-Berg）の方法〔モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ（Mol. Cell. Biol.),
2, 161 (1982) 〕に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組
み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程
の概略を図９に示す。

【０１７７】ｐＣＤＶ１〔オカヤマ・アンド・バーグ
(Okayama & Berg) ：モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジィ（Mol. Cell. Biol.),３，280 (1983)〕
400μｇを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），６mM Ｍｇ
Ｃｌ₂ および10mM ＮａＣｌからなる溶液300μｌに加
え、さらに500単位のＫｐｎＩを加えて、37℃，６時間
反応させ、プラスミド中のＫｐｎＩ部位で切断した。フ
ェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により
ＤＮＡを回収した。ＫｐｎＩ切断した該ＤＮＡ約200μ
ｇをＴｄＴ緩衝液にｄＴＴＰを0.25mM となるよう加え
た溶液200μｌに加え、さらに81単位のＴｄＴ(P-L Bioc
hemicals 社製) を加えて、37℃、11分間反応させた。
ここで、ｐＣＤＶ１のＫｐｎＩ切断部位の３' 末端にポ
リ（ｄＴ）鎖が約67個付加された。該溶液からフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、ポリ
（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶ１ＤＮＡ約100μｇを回
収した。該ＤＮＡを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.5），
６mM ＭｇＣｌ₂，100mM ＮａＣｌからなる緩衝液150μ
ｌに加え、さらに360単位のＥｃｏＲＩを加え、37℃,
２時間反応させた。該反応物をＬＧＴ法で処理後、約3.
1kb のＤＮＡ断片を回収し、約60μｇのポリ（ｄＴ）鎖
付加ｐＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡを10mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH8.0）および１mM ＥＤＴＡからなる溶液500μ
ｌに溶解し、65℃, ５分間インキュベート後、氷冷して
50μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ（ｄ
Ａ）セルロースカラム（コラボラティブリサーチ社製）
クロマトグラフィーにかけた。ポリ（ｄＴ）鎖長が充分
なものはカラムに吸着し、これを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH8.0）および１mM ＥＤＴＡからなる溶液で溶出
し、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶ１（以下ベクタ
ープライマーと略記する）27μｇを得た。

【０１７８】次にリンカーＤＮＡの調製を行った。ｐＬ
１〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama & Berg）：モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ（Mol. C
ell. Biol.),３，280 (1983)〕約14μｇを10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH7.5），６mM ＭｇＣｌ₂ および50mM Ｎ
ａＣｌからなる緩衝液200μｌに加え、さらに50単位の
ＰｓｔＩを加え、37℃, ４時間反応させ、ｐＬ１ＤＮＡ
中のＰｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Ｐｓｔ
Ｉで切断したｐＬ１ＤＮＡ約13μｇを回収した。該ＤＮ
Ａ約13μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度0.25mM のｄＧＴＰ
を含む溶液50μｌに加え、さらにＴｄＴ（P-L Biochemi
cals社製）54単位を加えて37℃, 13分間インキュベート
し、ｐＬ１のＰｓｔＩ切断部位３’末端に（ｄＧ）鎖を
約14個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタ
ノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを10mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），６mM ＭｇＣｌ₂ および60mM
ＮａＣｌからなる緩衝液100μｌに加え、さらに80単位
のＨｉｎｄIIIを加えて37℃, ３時間インキュベート
し、ｐＬ１ＤＮＡのＨｉｎｄIII部位で切断した。該反
応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.5kb の
ＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツェン（Dretze
n)ら：アナリティカル・バイオケミストリィ（Anal. Bi
ochem.),112, 295 (1981) 〕にて回収し、オリゴ（ｄ
Ｇ）鎖付きのリンカーＤＮＡ（以下単にリンカーＤＮＡ
と略記する）を得た。

【０１７９】上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約２μ
ｇ，ベクタープライマー約1.4μｇを50mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH8.3），８mM ＭｇＣｌ₂，30mM ＫＣｌ，0.3mM
ＤＴＴ，２mM ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴ
ＰおよびｄＣＴＰ）および10単位のリボヌクレアーゼイ
ンヒビター（P-L Biochemicals社製）からなる溶液22.3
μｌに溶解し、10単位の逆転写酵素（生化学工業社製）
を加え、41℃，90分間インキュベートし、ｍＲＮＡに相
補的なＤＮＡを合成させた。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡ−ＤＮ
Ａ二重鎖の付加したベクタープライマーＤＮＡを回収し
た。該ＤＮＡを66μＭｄＣＴＰおよび0.2μｇポリ
（Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液20μｌに溶かし、14単位のＴ
ｄＴ（P-L Biochemicals社製）を加えて37℃，２分間イ
ンキュベートし、ｃＤＮＡ３’末端に20個の（ｄＣ）鎖
を付加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿により（ｄＣ）鎖の付加したｃＤＮ
Ａ−ベクタープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを
10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），６mM ＭｇＣｌ₂ お
よび60mM ＮａＣｌからなる液400μｌに溶かし、20単位
のＨｉｎｄIIIを加え、37℃, ２時間インキュベート
し、ＨｉｎｄIII部位で切断した。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.5ピコモ
ルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮ
Ａを得た。該ＤＮＡ0.2ピコモルおよび前記のリンカー
ＤＮＡ0.4ピコモルを10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.
5），0.1Ｍ ＮａＣｌおよび１mM ＥＤＴＡからなる溶液
100μｌに溶かし、65℃，42℃，０℃でそれぞれ10分，2
5分, 30分間インキュベートした。20mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH7.5），４mM ＭｇＣｌ₂，10mM（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄，
0.1Ｍ ＫＣｌおよび0.1mM β−ＮＡＤの組成で、全量10
0μｌとなるよう反応液を調製した。該反応液に25単位
の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオ
ラブズ社製）を加え、11℃，18時間インキュベートし
た。該反応液を各40μＭのｄＮＴＰ，0.15mM β−ＮＡ
Ｄとなるよう成分を追加調製し、10単位の大腸菌ＤＮＡ
リガーゼ，20単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（P-L
Biochemicals社製）および10単位の大腸菌リボヌクレア
ーゼＨ（P-L Biochemicals社製）を加え、12℃，25℃で
順次１時間ずつインキュベートした。上記反応で、ｃＤ
ＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二
重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され、完全な二重鎖Ｄ
ＮＡの組換え体プラスミドが生成した。 (3) ヒトＬＴｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの選択：(2)
で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ600ＳＦ８
株〔カメロン（Cameron）：プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Pro
c. Natl. Acad.Sci.) USA 72, 3416 (1975) 〕を Scot
tらの方法〔重定勝哉：細胞工学２，616 (1983)〕に従
い形質転換した。得られた約30000個のコロニーをニト
ロセルロース・フィルター上に固定した。ジェネンテク
(Genentech）社が単離したヒトＬＴｃＤＮＡ〔パトリッ
ク・ダブリュー・グレイ（PatrickW.Gray）ら：ネイチ
ャー（Nature）312, 721 (1984) 〕の５' 非翻訳領域の
一部の塩基配列と一致する17塩基の合成ＤＮＡ５'−Ｇ
ＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧ−３'を³²Ｐで標識
したプローブに52℃で強く会合した１菌株を選んだ〔グ
ルンステイン・ホグネス(Grunstein−Hogness）の方
法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad.Sci.) USA
72, 3961 (1975)〕。この菌株が持つプラスミドｐＬＴ
１のｃＤＮＡの全塩基配列を、Ｍ13ファージを用いたデ
ィデオキシ・シークエンス法により決定した。その結
果、ｐＬＴ１のｃＤＮＡはヒトＬＴをコードしているこ
とが判明した。 ２) 組換え体プラスミドｐＬＡ１の造成：前項の方法に
よって得たｐＬＴ１(4.7kb）５μｇを10mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ(pH7.5),７mM ＭｇＣｌ₂，６mM ２−メルカプト
エタノールを含む全量50μｌの溶液（以下“Ｙ−０緩衝
液”と略記する）に溶かし、制限酵素 ＸｈｏII（ベー
リンガーマンハイム社製）10単位を加えて、37℃で２時
間切断反応を行った。次いで、ＮａＣｌを終濃度150mM
となるように加え、制限酵素ＮｓｉＩ（ニューイングラ
ンド・バイオラブズ社製）10単位を加え、37℃でさらに
３時間切断反応を行った。反応液からＬＧＴ法によりヒ
トＬＴＤＮＡの大部分を含む約750bpのＤＮＡ断片（Ｘ
ｈｏII−ＮｓｉＩ断片）約0.3μｇを得た。

【０１８０】別に、ｐＬＴ１20μｇを200μｌのＹ−50
緩衝液に溶かし、制限酵素ＨａｅIII40単位を加えて、3
7℃で２時間切断反応を行った。次いで、ＮａＣｌを終
濃度150mMとなるように加え、ＮｓｉＩ40単位を加え、3
7℃でさらに３時間切断反応を行った。反応液からポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により、ヒトＬＴのＮ末
端部分を含む約50bpのＤＮＡ断片（ＨａｅIII−Ｎｓｉ
Ｉ断片）約40ngを得た。

【０１８１】一方、ｐＧＥＬ１（3.4kb）３μｇを全量3
0μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素ＳｔｕＩと制
限酵素ＢｇｌIIそれぞれ６単位ずつを加え37℃で３時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりＡｐ
^r 遺伝子を含む約2.3kbのＤＮＡ断片（ＳｔｕＩ−Ｂｇ
ｌII断片）約1.0μｇを得た。

【０１８２】次に上記で得たｐＬＴ１由来のＸｈｏII−
ＮｓｉＩ断片（約750bp）0.2 μｇおよびＨａｅIII−Ｎ
ｓｉＩ断片（約50bp）20ngとｐＧＥＬ１由来のＳｔｕＩ
−ＢｇｌII断片（約2.3kb）0.6μｇを全量20μｌのＴ４
リガーゼ緩衝液に溶かし、この混合溶液にさらに２単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え４℃,18時
間反応を行った。

【０１８３】このようにして得た組換え体プラスミドＤ
ＮＡを用い、Escherichia coli ＫＭ430株をコーエンら
の方法により形質転換し、Ａｐ^r のコロニーを得た。こ
の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法に従っ
て分離精製し、該プラスミドＤＮＡをＳｔｕＩ等の制限
酵素で切断することによりプラスミドの構造解析を行っ
た。その結果、目的のプラスミドが得られたことを確認
した。この組換え体プラスミドをｐＬＡ１と呼ぶ。 ３) ＬＴ発現プラスミドｐＬＳＡ１の造成：前項により
得られたｐＬＡ１（3.1kb）をもつ大腸菌ＫＭ430株を培
養し、培養菌体から常法によりｐＬＡ１ＤＮＡを調製し
た。得られたｐＬＡ１ＤＮＡ３μｇをＹ−100緩衝液30
μｌに溶かし、ＳｔｕＩとＢｇｌIIそれぞれ３単位ずつ
を加え37℃で３時間切断反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法によりヒトＬＴ遺伝子の大部分を含む約790bp
のＤＮＡ断片（ＳｔｕＩ−ＢｇｌII断片）約0.5μｇを
得た。

【０１８４】別に、特開昭58-110600号公報記載の方法
で調製したｐＫＹＰ10 ３μｇをＹ−100緩衝液30μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｎIIIと制限酵素ＰｓｔＩをそれ
ぞれ６単位ずつを加え37℃で３時間切断反応を行った。
この反応液からＬＧＴ法によりトリプトファンプロモー
ター（Ｐｔｒｐ）を含む約1.1kbのＤＮＡ断片（ＢａｎI
II−ＰｓｔＩ断片）約0.6μｇを得た。また、ｐＧＥＬ
１（3.4kb）２μｇをＹ−100緩衝液20μｌに溶かし、制
限酵素ＨｉｎｄIII，ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩそれぞ
れ４単位ずつを加え37℃で３時間切断反応を行った。こ
の反応液からＬＧＴ法によりリポプロテイン由来ターミ
ネーターを含む約1.7kbのＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片）約0.7μｇを得た。

【０１８５】一方、成熟ヒトＬＴポリペプチドのＮ末端
であるＬｅｕ（ＣＴＡ）から、５番目のアミノ酸である
Ｇｌｙ（ＧＧＣ）の２番目の塩基（ＧＧ）までと、発現
に必要な開始コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があるこ
と、またＰｔｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距離
は、６〜18bpの間の適当な長さにする必要があることな
どの理由から、下記のＤＮＡリンカーを合成した。

【０１８６】

【化２１】

【０１８７】まず、一本鎖ＤＮＡ、27−merと25−merを
通常のトリエステル法により合成した。27−merおよび2
5−mer の各々20ピコモルを全量40μｌのＴ４キナーゼ
緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）６単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を
行った。次に上記で得たｐＬＡ１由来のＳｔｕＩ−Ｂｇ
ｌII断片（約790bp）0.3μｇと発現ベクターｐＫＹＰ10
のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約1.1kb）0.4μｇおよび
ｐＧＥＬ１由来のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約1.7k
b）0.6μｇをＴ４リガーゼ緩衝液25μｌ溶かし、この混
合液に上記ＤＮＡリンカーを約１ピコモル加えた。この
混合溶液にさらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４
℃で18時間結合反応を行った。

【０１８８】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌ＫＭ430株を形質転換し、Ａｐ^r のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡ
を回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ，ＢａｎIII，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄIII，ＢｇｌII
で切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。こ
のプラスミドをｐＬＳＡ１とよぶ。ｐＬＳＡ１のＢａｎ
III，ＨｉｎｄIII付近の塩基配列は下記のとおりである
ことをマキサム・ギルバートの方法〔エイ・エム・マキ
サム(A. M. Maxam）ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc. Na
tl. Acad. Sci.), USA 74，560(1977)〕で確認した。

【０１８９】

【化２２】

【０１９０】参考例４． ＡＴＧベクターｐＴｒＳ20の造成：図13に示した手順に
従い、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンの間の距離が14塩基
で、かつＡＴＧコドンの直後にＳａｃＩサイトを有する
ＡＴＧベクターｐＴｒＳ20を造成した。

【０１９１】まず、特開昭58−110600号公報記載の方法
で調製したｐＫＹＰ10 ３μｇをＹ−100緩衝液30μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｎIIIと制限酵素ＮｒｕＩ（ニュ
ーイングランド・バイオラブズ社製）をそれぞれ６単位
ずつ加え、37℃で３時間切断反応を行った。この反応液
からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約3.8kbのＤＮＡ断
片（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）約0.5 μｇを得た。

【０１９２】一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コドン
を付与するために下記のＤＮＡリンカーをトリエステル
法により合成した。

【０１９３】

【化２３】

【０１９４】19−merと17−merの合成ＤＮＡ（各々10ピ
コモルずつ）を50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），10mM
ＭｇＣｌ₂ ，５mM ジチオスレイトール，0.1 mM ＥＤ
ＴＡおよび１mM ＡＴＰを含む全量20μｌの溶液に溶か
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３単位（宝酒造社
製）を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行った。次
に上記で得たｐＫＹＰ10由来のＢａｎIII−ＮｒｕＩ断
片（約3.8kb) 0.1μｇと上記のＤＮＡリンカー約0.5ピ
コモルをＴ４リガーゼ緩衝液20μｌに溶かし、さらにＴ
４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４℃で18時間結合反応
を行った。

【０１９５】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＨＢ101株〔ボリバー(Boliver) ら：ジーン
(Gene) 2, 75 (1977)〕を形質転換し、Ａｐ^r のコロニ
ーを得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮ
Ａを回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＢａｎIII，ＨｉｎｄIII, ＳａｃＩ，Ｎｒｕ
Ｉで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。
このプラスミドをｐＴｒＳ20と名付けた（図13）。ｐＴ
ｒＳ20のＢａｎIII，ＨｉｎｄIII サイト付近の塩基配
列は下記のとおりであることをＭ13ファージを用いたデ
ィデオキシ・シークエンス法を用い確認した。

【０１９６】

【化２４】

【０１９７】

【発明の効果】本発明によればＣＳＦ活性の高いポリペ
プチドを大量に安価に供給することができる。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：末梢血マクロファージ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..525 特徴を決定した方法：E 配列 ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC 45 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG 90 Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala 20 25 30 CTC CAG GAG AAG CTG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG 135 Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu 35 40 45 GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC 180 Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro 50 55 60 CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG 225 Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu 65 70 75 AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG 270 Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln 80 85 90 GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA 315 Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr 95 100 105 CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG 360 Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln 110 115 120 ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT 405 Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly 125 130 135 GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG 450 Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly 140 145 150 GTC CTA GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC 495 Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr 155 160 165 CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC TGA 525 Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro *** 170 175

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＣｆＴＡ１の造成工程を示す。

【図２】プラスミドｐＣｆＴＢ20の造成工程を示す。

【図３】プラスミドｐＣｆＴＬ23，38，35，41の造成工
程を示す。

【図４】プラスミドｐＣｆＴＭ14，17，113の造成工程
を示す。

【図５】プラスミドｐＣｆＷＤ１の造成工程を示す。

【図６】プラスミドｐＣｆＴ95Ｋ19，ｐＣｆＡＡ１およ
びｐＣｆＡＢ５の造成工程を示す。

【図７】プラスミドｐＣｆＢＡ８，ｐＣｆＢＢ101，ｐ
ＣｆＢＣ52，59, 42Ｂ１，45，76，77, 93, 95, 97およ
びｐＣｆＢＤ28, 56，82の造成工程を示す。

【図８】プラスミドｐＣｆＣＢ101，ｐＣｆＣＣ52，5
9，ｐＣｆＣＤ28，56の造成工程を示す。

【図９】(1) および(2)は、オカヤマ・バーグ法による
ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造
成過程の概略を示す。

【図１０】プラスミドｐＬＡ１の造成工程を示す。

【図１１】プラスミドｐＬＳＡ１の造成工程を示す。

【図１２】プラスミドｐＣｆＴＮＳ501の造成工程を示
す。

【図１３】プラスミドｐＴｒＳ20の造成工程を示す。

【図１４】プラスミドｐＣｆＴＮＳ７およびｐＣｆＴＡ
Ａｒｇ４Ｓの造成工程を示す。

【図１５】プラスミドｐＣｆＴＮ205およびｐＣｆＴＡ
Ａｒｇ４の造成工程を示す。

【図１６】プラスミドｐＣｆＴＮＳ301およびｐＣｆＴ
ＮＳ401の造成工を示す。

【図１７】(1)および(2)はプラスミドｐＣｆＢＤ28Ａ1
7，ｐＣｆＢＤ28Ｔ17の造成工程を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 森本 真 静岡県駿東郡長泉町下土狩203−５ (72)発明者 伊藤 菁莪 神奈川県相模原市相原字八幡西218−14 (72)発明者 山崎 基生 東京都町田市旭町３−６−６ (72)発明者 横尾 義春 神奈川県相模原市横山３−４−17 (72)発明者 山口 和夫 神奈川県相模原市磯部2121−８ (56)参考文献 特開 昭63−299（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−500636（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−500483（ＪＰ，Ａ) ＮＡＴＵＲＥ，319，415−418（1986) ＳＣＩＥＮＣＥ，232，61−65（1986) ＥＭＢＯ Ｊ．，５，575−581 （1986)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
   するポリペプチドの、第１番目のアミノ酸残基がチロシ
   ン（Ｔｙｒ）に、第３番目のアミノ酸残基がイソロイシ
   ン（Ｉｌｅ）に、第４番目のアミノ酸残基がアルギニン
   （Ａｒｇ）に、第５番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓｅ
   ｒ）に、および第１７番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓ
   ｅｒ）に置換されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
   するポリペプチドの、第１番目のアミノ酸残基がチロシ
   ン（Ｔｙｒ）に、第３番目のアミノ酸残基がイソロイシ
   ン（Ｉｌｅ）に、第４番目のアミノ酸残基がアルギニン
   （Ａｒｇ）に、第５番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓｅ
   ｒ）に、および第１７番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓ
   ｅｒ）に置換されたポリペプチドをコードするＤＮＡが
   プラスミドＤＮＡに組み込まれた組換え体プラスミドを
   含む細菌を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチドを
   生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取する
   ことを特徴とするポリペプチドの製造法。
3. 【請求項３】 該細菌がEschrichia coli EcfBC59であ
   る請求項２記載の製造法。