NO315003B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid samt DNA-sekvens som koder fordette - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid samt DNA-sekvens som koder fordette Download PDF

Info

Publication number
NO315003B1
NO315003B1 NO19940495A NO940495A NO315003B1 NO 315003 B1 NO315003 B1 NO 315003B1 NO 19940495 A NO19940495 A NO 19940495A NO 940495 A NO940495 A NO 940495A NO 315003 B1 NO315003 B1 NO 315003B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
dna
csf
fragment
added
units
Prior art date
Application number
NO19940495A
Other languages
English (en)
Other versions
NO940495D0 (no
NO940495L (no
Inventor
Tetsuro Kuga
Yoshinori Komatsu
Hiromasa Miyaji
Moriyuki Sato
Masami Okabe
Makoto Morimoto
Seiga Itoh
Motoo Yamasaki
Yoshiharu Yokoo
Kazuo Yamaguchi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from NO875378A external-priority patent/NO176799C/no
Publication of NO940495L publication Critical patent/NO940495L/no
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Kk filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority to NO19940495A priority Critical patent/NO315003B1/no
Publication of NO940495D0 publication Critical patent/NO940495D0/no
Publication of NO315003B1 publication Critical patent/NO315003B1/no

Links

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører ifølge kravinnledningen en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid avledet fra hG-CSF-polypeptidet ved delesjon, samt DNA-sekvens som koder for dette polypeptid.
Den humane granulocytt-koloniststimulerende faktor (hG-CSF)
er en type polypeptid som er essensiell ved dannelse av forskjellige blodceller som et resultat av formering og differensiering av hemåtopoetiske stamceller. Dens vesentlige effekt er å fremme økningen i antallet granulocytter, særlig nøytrofiler. Nøytrofiler spiller en viktig rolle ved beskyttelse av den levende kropp mot infeksjon.
Deres levetid er imidlertid kort og det kreves derfor
konstant supplering ved formering og differensiering av forløperceller. De terapier som i stor utstrekning har vært anvendt i de senere år for formerende tumorer inhiberer samtidig veksten av nøytrofil-forløpere og bevirker følgelig en alvorlig bivirkning, nemlig en reduksjon i den nøytrofile beskyttelse i kreftangrepne pasienter som gjør dem mer utsatt for infeksjon. hG-CSF ventes å være effektiv i å avhjelpe denne uønskede bivirkning ved å fremme økningen i antallet av nøytrofiler på den ene side og på den annen side ved fore-bygging og behandling av infeksiøse sykdommer. Videre er hG-CSF polypeptidderivatene som fremstilles ved den foreliggende oppfinnelse overlegne med hensyn til hG-CSF-aktivitet i forhold til de kjente hG-CSF og er ventet å være nyttig på
det medisinske område.
Med den senere tids hurtige fremskritt i rekombinant DNA-tekhologi er i rekkefølge gener for proteiner involvert ved formering og differensiering av blodceller isolert. Slike faktorer er i produksjon ved hjelp av genetiske metoder under anvendelse av mikroorganismer eller dyreceller.
Et cDNA for hG-CSF ble isolert fra den humane skvamøs celle-karsinom-cellelinje CHU-II, dets basesekvens ble bestemt og dets ekspresjon i COS-celler ble rapportert av Nagata et al.
(Nagata et al.: Nature, 319, 415 (1986)}. Også Souza et al.
isolerte et cDNA fra den humane urinblære-kreftcellelinje 5 637, bestemte dets basesekvens og rapporterte dets ekspresjon i Escherichia coli (E. coli) (Souza et al.: Science 232, 61 (1986)).
Aminosyresekvensen av det protein som kodes for av de ovennevnte to cDNA'er er i samsvar med aminosyre-sekvensen (tabell 1) av det protein som kodes for av det cDNA som isoleres fra normale makrofager fra humant perifert blod av oppfinnerne i foreliggende søknad.
Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for, med lave omkostninger og i store mengder, å fremstille et polypeptid avledet fra hG-CSF-polypeptidet som har høy spesifikk aktivitet og høy stabilitet i blod.
I oppfinnelsens sammenheng ble det funnet at hG-CSF polypeptidderivater med høy spesifikk aktivitet kan fremstilles ved å modifisere det cDNA for hG-CSF som er .vist i tabell 1 og dyrke en stamme av.E. coli som rommer et plasmid med det modifiserte cDNA innskutt deri eller ved-hjelp av begrenset polypeptidspaltning under anvendelse av en protease, og dette førte til fullføring av den foreliggende, oppfinnelse.
De fordeler som er beskrevet over oppnås med fremgangsmåten og DNA-sekvensen slik de er definert med de i kravene anførte trekk.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Fig. 1 viser et konstruksjonsskjerna for plasmidet pCfTAl. Fig. 2 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pCfTB20. Fig. 3 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTL23, 38, 35 og 41. Fig. 4 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTM14, 17 og 113. Fig. 5 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pCfWDl. Fig. 6 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene
pCfT95K19, pCfAAl og.pCfAB5.
Fig. 7 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfBA3,
pCfBBlOl, pCfBC52, 59, 42B1, 45, 76, 77, 93, 95, 97, pCfBD28, 56 og 82.
Fig. 8 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfCBlOl,
pCfCC52, 59, pCfCD28 og 56.
Fig. 9 (l) og (2) viser skjematisk de prosesser som er involvert i Okayama-Bergmetoden for cDNA-syntese og konstruksjon av et rekombinant plasmid inneholdende det syntetiserte DNA. Fig. 10 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pLAl. ■ Fig. 11 viser et konstruksjonsskjerna for plasmidet pCfTNSSOl. Fig. 13 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pTrS20. Fig. 14 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTNS7
og pCfTAArg4S.
Fig. 15 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTN2 05
og pCfTAArg4.
Fig. 16 viser konstruksjonsskjemaer for.plasmidene pCfTNS3 01
og pCfTNS401.
Fig. 17 (1) og (2) viser konstruksjonsskjemaer for
plasmidene pCfBD2 8A17 og pCfBD2 8T17.
hG-CSF-polypeptidderivatene som fremstilles i samsvar med oppfinnelsen er forskjellige med hensyn til aminosyre-sekvensen fra hG-CSF-polypeptidet med aminosyresekvensen vist i tabell 1 som et resultat av substitusjon og/eller delesjon. Aminosyren som substitueres er den syttende aminosyren cystein fra den N-terminale ende. De aminosyrer som utelates er aminosyrene ved eller i nærheten av den N-terminale ende. Foretrukket bør minst en aminosyre blant den 1. til den 11. aminosyre fra den N-terminale ende utelates.
De rekombihante plasmider oppnås ved å innskyte et DNA-fragment som koder for hvilke som helst av de ovennevnte hG-CSF-polypeptidderivater i et passende plasmid med en DNA ekspresjonsfunksjon.
Foretrukket som de DNA-fragmenter som koder for de ved oppfinnelsen fremstillbare hG-CSF-polypeptider er dem som skriver seg fra substitusjon av i.det minste en base valgt blant 1. til 51. basene av basesekvensen vist i tabell 1 i det DNA som koder for hG-CSF.
Et cDNA {hG-CSF cDNA) oppnådd ved revers transkripsjon av et hG-CSF-kodende m-RNA ved rekombinant DNA-teknologi eller et hG-CSF-kodende DNA oppnådd fra kromosomalt DNA, f.eks., kan anvendes som det hG-CSF-kodende DNA vist i fig. l.
Hvilket som helst hG-CSF cDNA kan anvendes forutsatt at det koder for hG-CSF. Som spesifikt eksempel kan pCSFl-2, et plasmid fremstilt av de foreliggende oppfinnere, anvendes. Fremgangsmåten for fremstilling av pCSFl-2 er beskrevet i undereksempel 1.
Det hG-CSF cDNA som inneholdes i pCSFl-2 har basesekvensen vist i tabell 1 som bestemt ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av Ml3 fagen (J. Messing et al.. Gene, 19, 269 (1982)).
pCSFl-2 er et plasmid med restriksjonsenzymkartet vist i fig. l og en E. coli-stamme inneholdende dette, E. coli ECSF 1t2, er blitt deponert i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI) siden 27. november, 1986 under deponeringsnr. FERM BP-1220 i samsvar med Budapest-konvensjonen.
Et hvilket som helst plasmid kan anvendes for insersjon av et hG-CSF-polypeptidderivat-kodende DNA deri på betingelse av at det nevnte DNA kan uttrykkes i E. coli.
Et plasmid som tillater fremmed DNA insersjon deri ved et punkt nedstrøms fra en passende promoter kan med fordel anvendes, f.eks. en trp eller lac promoter, og har avstanden mellom Shine-Dalgarono-sekvensen (i det følgende SD-sekvensen) og initieringskodonet (ATG) innstilt til en passende avstand, f.eks. 6-18 basepar.
Som passende eksempler på slikt plasmid, kan nevnes pKYPlO (US patent nr. 4.686.191), Videre pLSAl (undereksempel 3), pGELl (Sekine et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 43 0 6
(1985)), pKY26 (Japansk patentansøknad (OPI) 48699/87
(betegnelsen "OPI" betyr en ikke-gransket patentsøknad) og pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95 (1977)).
Rekombinasjon mellom et DNA som koder for hG-CSF polypeptidet eller et derivat derav og en vektor DNA kan gjennomføres ved hjelp av rekombinante DNA-metoder i generell bruk og som omfatter kutting av begge DNA med et restriksjonsenzym eller enzymer og etterfølgende ligering under anvendelse av T4 DNA ligase. For ligering kan DNA-fragmentterminiene som resulterer fra restriksjonsenzymkuttingen behandles, ora ønsket, ved å gjøre bruk av "filling-in" under anvendelse av DNA polymerase I Klenow-fragmentet eller "trimming"-reaksjonen under anvendelse av T4 DNA polymerase. DNA-linkerteknikken kan også anvendes.
Eksempler på konstruksjon av rekombinante plasmider inneholdende et hG-CSF polypeptidderivat-kodende DNA innskutt deri ved anvendelse av pCSFl-2 som hG-CSF cDNA, pGELl, pKYPlO, pKYP2 6, pBR322 eller pLSAl som plasmidet for innlemmelse av DNA deri og, etter behov, en kjemisk syntetisert DNA-linker eller en teknikk med setespesifikk mutagenese er gitt i det følgende.
DETALJERT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
(Rekombinas-1 onsprosedvrer)
Som vist i fig. 1, kuttes pCSFl-2 (omtrent 4,5 kilobaser (i det følgende kb)) med Apal og BamHI og et DNA-fragment med omtrent 1,5 kb renses ved hjelp av lav geltemperatur-agarosegelelektroforese (LGT-metoden) (L. Wieslander: Analytical Biochemistry, 98, 305 (1979)).
Deretter kuttes pLSAl med Banlll og BamHI, og et DNAfragment på omtrent 2,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Begge fragmentene oppnådd på denne måte og det syntetiske DNA vist i fig. 1 ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTAl.
Deretter, som vist i fig. 2, kuttes pCfTAl med BamHI, idet de utstående ender omdannes til buttender ved behandling med Klenow-fragmentet og etter ytterligere kutting med EcoRI renses et DNA-fragment på omtrent 2,5 kb ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfTAl med EcoRI og Dral og et DNA-fragment på omtrent 1,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De således oppnådde DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA-ligase til å gi pCfTB20.
Videre, som vist i fig. 3, kuttes pCSFl-2 med Apal og BamHI og et DNA-fragment på omtrent 1,5 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pGELl med Hindlll, BamHI og Pstl og et DNA-fragment på omtrent 1,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden.' Videre kuttes pKYPlO med Pstl og Banlll og et DNA- ■ fragment på omtrent 1,1 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av disse tre DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i fig. 3 gir pCfTL23, pCfTL3 8, pCfTL35 og pCfTL41, mens ligering av disse tre DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i fig. 4 gir pCfTM14, pCfTM17 og pCfTM113.
Videre, som vist i fig. 5, spaltes pCfTAl med Banlll
og Stul og et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent- 1,3 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pKY2 6 med BamHI, de utstående ender omdannes til buttender ved behandling med DNA polymerase I Klenow fragment og etter ytterligere kutting med Pstl, renses et DNA på omtrent 1,8 kb ved hjelp av LGT-metoden. Videre kuttes pGELl separat med Banlll og Pstl og et DNA-fragment på omtrent 1,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De tre således oppnådde DNA-fragment er ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfWDl.
Videre, som vist i fig. 6, kuttes pCFTL3 8 med HindiII og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,6 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfTL3 8 med Hindlll, BamHI og Dpnl og et DNA-fragment på omtrent 3 00 bp (basepar) renses ved hjelp av LGT-metoden. Videre kuttes pCfTB20 separat med Aval, de utstående ender omdannes til buttender ved behandling med Klenow-fragmentet og etter ytterligere kutting med Bglll, renses et DNA-fragment på omtrent 480 bp ved hjelp avLGT-metoden. De tre således oppnådde DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA-ligase til å gi pCfT95K19.
Videre, som. også vist i fig. 6, kuttes pCfT95K19 med Banlll og Bgll og en DNA på omtrent 1,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden og separat kuttes pCfT95Ki9 med Bgll alene og et DNA-fragment på omtrent 1,8 kb renses ved hjelp av den nevnte metode. Videre kuttes separat pCfT95K19 med Bgll og Sau3A og et DNA-fragment på omtrent 3 50 bp renses ved hjelp av LGT-metoden. De tre således oppnådde DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i midten av fig. 6 (omtrent halvveis nede) ligeres sammen til å gi pCfAAl. Deretter, som også vist i fig. 6, kuttes pCfAAl med Xhol og Bgll og et DNA-fragment på 3,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Dette fragment, det ovennevnte Bgll Sau3A-fragment (omtrent 350 bp) av pCfT95K19 og det syntetiske DNA vist nederst på fig. 6 ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfABS og pcfAB14. Videre, som vist i fig. 7, kuttes pCfABS med Aval og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfWDl med Bglll og Aval og DNA på omtrent 1,3 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De to således oppnådde fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfBA8. På den annen side kuttes pCfAB14 med Aval og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden og dette fragment ligeres med det ovennevnte 1,3 kb DNA-fragment avledet fra pCfWDl ved kutting med Bglll og Aval under anvendelse av T4 DNA ligase, til å gi pCfDA32. Videre, som det også fremgår av fig. 7, kuttes pCfBAS med Banlll, Bglll og Xhol og et DNA-fragment på omtrent 1,4 kb og et DNA-fragment på omtrent 2,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av de to således oppnådde DNA-fragmenter og den syntetiske DNA-linker vist i fig. 7 under anvendelse av T4 DNA ligase gir pCfBBlOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28, pCfBDSS, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCFBC97 og pCfBD82.
Som vist i fig. 8 kuttes pBR322 med Pstl, de utstående ender gjøres om til buttender med T4 DNA polymerase, Bglll linkeren innføres under anvendelse av T4 DNA ligase og etter ytterligere kutting med EcoRI og Bglll renses et DNA-fragment på omtrent 3,6 kb ved hjelp av LGT-metoden.
Plasmidene pCfBBlOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 og pCfBD56 oppnådd på den ovennevnte måte kuttes hver med EcoRI og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 1,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Hvert 1,8 kb DNA-fragment ligeres med det pBR322-avledede 3,6 kb DNA-fragment under anvendelse av T4 DNA ligase. Det oppnås således pCfCBlOl, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 og pCfCD56 tilsvarende de respektive plasmider nevnt i det foregående.
På den annen side kuttes pCfBA8 med Banlll, Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBA8 med Xhol og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 1,4 kb- renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av de to således oppnådde fragmenter og den syntetiske DNA-linker vist i fig. 14 gir pCfTNS7 og pCfTAArg4S. I tillegg, som vist i fig. - 15, kuttes pCfTNS7 med Pvul og Xhol og et DNA-fragment på omtrent l kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBA32 med Pvul og Xhol og et DNA-fragment på omtrent 3 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De to fragmenter oppnådd på denne måte ligeres sammen- under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTN205. På lignende måte kuttes pCfTAArg4S med Pvul og Xhol, et fragment på omtrent 1 kb renses ved hjelp av LGT-metoden og dette fragment, ligeres med et DNA-fragment på omtrent 3 kb avledet fra det ovennevnte plasmid pCfBA32 ved kutting med Pvul og Xhol, under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTAArg4. Videre kuttes pCfBA8 med Banlll og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBAS med Xhol og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 1,4 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De to således oppnådde fragmenter og den syntetiske linker vist i fig. 16 ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase .til å gi pCfTNS3 01 og pCfTNS401. Videre, som vist i fig. 12, kuttes pCfBA8 med Xhol, de utstående ender omdannes til buttender ved hjelp av Klenow-fragmentbehandling og etter ytterligere kutting med Pvul, renses et DNA-fragment på omtrent 3 kb ved hjelp av LGT-metoden. Separat blir ATG-vektoren pTrS2 0 (undereksempel 4) kuttet med SacI, etterfulgt av omdannelse av de utstående ender til buttender ved hjelp av Klenow-fragmentbehandling. Etter ytterligere kutting med Pvul, renses et DNA-fragment på omtrent 1 kb ved hjelp av LGT- . metoden. De således oppnådde to fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTNS501.
I et- eksempel hvor setespesifikk mutagenese anvendes, kuttes pCfBD28 med Banlll og Pstl, som vist i fig. 17, og et DNA-fragment på omtrent 210 bp renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes M13 fag-vektoren M13mpl9RF DNA med AccI og Pstl og.et DNA-fragment på omtrent 7,24 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De således oppnådde to DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi ptl9BD2 8N. Deretter anvendes dette ptl9BD28N for transfeksjon av E. coli JM105, og enkelttrådet ptl9BD28N utvinnes fra den oppnådde fag. Tilsvarende, som også vist i fig. 17, spaltes Ml3mpl9RF DNA med Hindlll og EcoRI og et DNA-fragment på omtrent 7,2 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Etter at dette 7,2 kb DNA-fragment er blandet med det enkelttrådede ptl9BD28N oppnådd på den nevnte måte, bevirkes åpnet dupleks DNA-dannelse ved denatureringsbehandling etterfulgt av basepartilpasning og det resulterende åpnede dupleks-DNA renses ved hjelp av LGT-metoden. Deretter anneales dette DNA med det syntetiske DNA vist i fig. 17 og blir deretter ringsluttet under anvendelse av Klenow-fragmentet og T4 DNA ligase. Dette ringsluttede DNA anvendes for transfeksjon av E. coli JM105, hvorved ptl9BD28NA17 og ptl9BD28NT17 med sete-spesifikk mutagenese innført deri oppnås. Videre, som også vist i fig. 17, kuttes ptl9BD2 8NA17 og ptl9BD27NT17 med Aval og Xhol og hvert DNA-fragment på omtrent 110 bp renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBD28 med Xhol og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,74 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Videre kuttes pCfBD28 separat med Bglll og Aval og et DNA-fragment på omtrent 1,29 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av de således oppnådde DNA-fragmenter på omtrent 110 bp, omtrent 2,74 kb og 1,2 9 kb under anvendelse av T4 DNA ligase gir henholdsvis pCfBD28Al7 og pCfBD28T17.
Reaksjonsbetingelsene for de ovennevnte rekombinasjons-prosedyrer er generelt som følger: DNA-kuttingsreaksjonen i nærvær av et restriksjonsenzym eller enzymer gjennomføres generelt under anvendelse av 0,1 til 20 fig DNA i et reaksjonsmedium som inneholder 2 til 2 00 mM (foretrukket 10 til 40 mM) Tris-HCl (pH 6,0-9,5, foretrukket 7,8-8,0), 0-200 mM NaCl og 2-20 mM (foretrukket 5-10 mM) MgCl2 ved 20-70°C (den optimale temperatur varierer i avhengighet av det eller de restriksjonsenzymer som anvendes) 1 15 min. til 24 timer. Hvert restriksjonsenzym anvendes i en mengde på 0,1-100 enheter (foretrukket 1-3 enheter) pr. mikrogram DNA. Avslutning av reaksjonen oppnås generelt ved oppvarming ved 55-75°C i 5-30 min. Det er også mulig å inaktivere restriksjonsenzymene med et reagens som f.eks. fenol eller dietylpyrokarbonat.
DNA-fragmentene dannet ved restriksjonsenzym-kuttingen eller de åpnede dupleks DNA<1>er kan renses ved hjelp av LGT-metoden eller ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese (A.M. Maxam et al., Proe- Nati. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)), og flere.
DNA-fragmentligeringsreaksjonen gjennomføres i et reaksjonsmedium inneholdende 2-200 mM (foretrukket 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,1-9,5, foretrukket 7,8-8., 0) , 20-20 mM (foretrukket 5-10 mM) MgCl2, 0,1-10 mM (foretrukket 0,5-2,0 mM) ATP og 1-50 mM (foretrukket 5-10 mM) ditiotreitol ved 1-37°C (foretrukket 3-2 0°C) i 15 min. til 72 timer (foretrukket 2-20 timer) under anvendelse av 0,3-10 enheter T4 DNA ligase.
Det rekombinante plasmid DNA oppnådd ved ligeringsreaksjonen kan innføres i E. coli i samsvar med transformasjonsmetoden til Cohen et al. (S.M. Cohen et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)), om ønsket.
De rekombinante M13 fag RF DNA'er dannet ved ligerings-reaksjonen innføres i E. coli JM105 (J. Messing et al., Gene, .33, 103 (1985)), under anvendelse av den kjente metode for transfeksjon (Yoshiyuki Kuchino et al., Tanpakush.itsu,
Kakusan, Koso (Protein Nucleic Acid and Enzyme), 29, 294
(1984)), etter behov.
De rekombinante plasmid DNA'er og rekombinante Ml3 fag RF DNA'er kan isoleres fra de respektive E. coli transformanter ved metoden til f,eks. Birnboim et al. (H.C. Birnholm et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1973)).
Isoleringen av det enkelttrådede DNA fra den rekombinante M13 fag gjennomføres ved hjelp av den kjente metode (Yoshiyuki Kuchino et al., Tanpakushitsu, Kalcusan, Koso, 29, 294
(1984)) .
Plasmid DNA'er undersøkes med hensyn til kuttingsseter ved hjelp av agarosegelelektroforese eller polyakrylamidgelelektroforese etter kutting med 1-10 restriksjonsenzymer. Videre gjennomføres DNA basesekvensbestemmelse, om nødvendig, ved dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag (J. Messing et al., Gene, 19, 269 (1982)).
De ønskede rekombinante plasmid-DNA'er-kan fremstilles under betingelser som nevnt i det foregående.
hG-CSF polypeptid-derivatene kan fremstilles på følgende måte.
Således transformeres E. coli K-12 HB101 med et passende plasmid (f.eks. pCfBD28), og en plasmid (f.eks. pCfBD28)-bærende transformant av E. coli selekteres blant ampicillin-resistente (i det følgende Ap<r>) kolonier. Dyrking av den plasmid (f.eks. pCfBD28)-bærende stamme av E. coli i et medium kan føre til dannelse av et hG-CSF polypeptidderivat i
. kulturen.
Et hvilket som helst medium, enten syntetisk eller naturlig, kan anvendes med den betingelse at det er egnet for dyrking av E. coli og for fremstilling av hG-CSF polypeptid-derivatet.
Brukbare karbonkilder inkluderer glukose, fruktose, laktose, glyserol, månnitol og sorbitol blant andre, og brukbare nitrogenkilder er NH4C1, (NH4)2S04, kasaminosyrer, gjærekstrakt, polypepton, kjøttekstrakt, baktotrypton, maisstøpvæske, etc, I^HPC^, KH2P04, NaCl, MgS04, vitamin Blf MgCl2 og så videre kan anvendes som andre næringskilder. Dyrkingen gjennomføres med lufting og omrøring ved pH 5,5-8,5 og en temperatur 18-40°C. Dyrking i 5-90 timer fører til. akkumulering av et hG-CSF polypeptid-derivat i de dyrkede celler. Cellene høstes så fra kulturen og knuses ved hjelp av ultralydbehandling. Sentrifugering gir cellerester. hG-CSF
■polypeptid-derivatet ekstraheres fra cellerestene, renses, oppløseliggjøres og regenereres ved metoden til Marston et al. {F.A.O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984)). Mus-benmargceller behandles med derivatet og hG-CSF polypeptid-derivatet analyseres ved metoden under anvendelse av antallet dannede kolonier på mykagar som en indeks.
Ved utøvelsen av oppfinnelsen bestemmes hG-CSF aktiviteten på følgende måte. Benmargceller samles aseptisk fra lårbenet til C3H/He hannmus med 8-12 ukers alder (Shizuoka Laboratory Animal Center) og suspenderes i et a-minimum essensielt medium (Flow Laboratories, i det følgende benevnt ec-MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Nylonull (0,3 g, Wako Pure Chemical Indutries' Nylon Fiber 146-04231) fylt i en kolonne impregneres med 1,5 ml av den ovennevnte cellesuspensjon (omtrent 5 x IO<7> celler) og reaksjonen får fortsette i en 5% C02 inkubator ved 37°C i 90 min.Deretter føres a-MEM oppvarmet til 37°C på forhånd gjennom kolonnen, og benmargcellene som er uadsorberte på nylonullen samles som en effluentfraksjon. Cellene vaskes en gang med a-MEM og cellekonsentrasjonen innstilles til en forutbestemt verdi. Deretter bestemmes evnen til å danne myelopoetiske stamcelle-kolonier ved hjelp av metoden til Okabe et al. (T. Okabe et al.: Cancer.Research, 44, 4503-4506 (1986)). Således blandes 0,2 ml av benmargcellesuspensjonen (2 x IO<6> celler/ml) fremstilt på den ovennevnte måte med en blanding av 0,2 ml oc-MEM, 0,4 ml FBS og 0,2 ml av hver 2-ganger fortynnet prøve. Et like stort volum {1,0 ml) av 0,6% agaroppløsning {Difco, Agar-renset 0506-01) holdt ved 42°C blandes med den ovennevnte blanding og den resulterende blanding fordeles i 0,5 ml porsjoner på en 24 brønns mikrotiterplate (Nunc<1 >Multidish nr. 143982) (5 x 10<4> celler/brønn, n=3). Etter 7 døgns inkubasjon ved 37°C i en 5% C02-inkubator, telles kolonier som omfatter minst 40 celler under et mikroskop (Olympus X40). Etter telling overføres hver koloni' på en glassplate med forsiktighet, fikseres der med en blandet acetonformalin-oppløsning i 30 min. og underkastes esterase dobbelt-farging ved metoden til Kubota et al. (K. Kubota et al.: Exp. Mematology, 8, 339-344 (1980)) for identifisering av kolonien.
Potensen av hver prøve beregnes basert på resultatet av
■telling ved kolonidannelsestesten for den 2-ganger fortynningen som følger. Den aktivitet som gir halvdelen av den maksimale kolonidannelsesverdi oppnådd med intakt G-CSF anvendt som en standard er definert som 50 enheter. Potensen (i enheter) beregnes i samsvar med denne definisjon og faktoren 2 0 anvendes for multiplikasjon for omdannelse til aktivitet pr. ml også av hensyn til fortynningsfaktoren for prøven. Den spesifikke aktivitet uttrykkes som potens
(enheter/mg) pr. vektenhet (mg) protein.
hG-CSF polypeptid-derivatene som mangler en eller flere aminosyrer på den N-terminale side av hG-CSF polypeptidet kan også fremstilles ved enzymatisk nedbrytning.
Derivatene kan selvfølgelig fremstilles ved enzymatisk nedbrytning av naturlig hG-CSF som utgangsmaterial. Ettersom naturlig hG-CSF har lav reaktivitet med enzymet (protease) er imidlertid bruken av et modifisert hG-CSF med økt reaktivitet overfor protease foretrukket for fremstilling av slike derivater med høy aktivitet i gode utbytter.
Foretrukket anvendt som slike utgangsmaterialer er de modifiserte hG-CSF (a), (b), (c) og (d) vist i tabell 2 som skriver seg fra substitusjon av en eller flere aminosyrer på den N-terminale side av hG-CSF polypeptidet. Modifikasjoner (a) , (b), (c) og (d) kan oppnås ved dyrking av bakterie-stammer som rommer plasmidene med de tilsvarende base-sekvenser, nemlig henholdsvis pCfBC59 (NC59), pCfBD28 (MD2 8), pCfBC95 (NC95) og pCfTAArg4S (Arg 4S), etterfulgt av isolering og rensing ved hjelp av kjente metoder.
Passende anvendt som enzymet er endoproteaser som f.eks. serinprotease og tiolprotease. Mer spesifikt kan f.eks. nevnes subtilisin A, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, subtilisin nove, proteinase K, nagase, termolysin, endoproteinase Arg-C, trypsin og a-chymotrypsin. Enzymet anvendes i en mengde på 3.4 x IO"<6> til 8.5 x IO"<3> enheter pr. mg utgangsmaterial.
Etter oppløsning av utgangsmaterialet i en vandig oppløsning som f.eks. Tris-saltsyrebuffer eller fosfatbuffer og tilsetning av et enzym, gjennomføres den enzymatiske reaksjon ved 10-37°C i 30 min. til 3 døgn.
Den totale proteinmengde og proteinmengden bestemmes ved hjelp av følgende metoder: Den totale proteinbestemmelse gjennomføres ved metoden til ■ M.M. Bradford (M.M. Bradford:■Anal. Biochem., 72, 248
(1976)).
Proteinmengden bestemmes ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese ved metoden til Laemmli (U.K. Laemmli: Nature, 227, 680 (1970)) etterfulgt av måling på en kromatoscanner (Shimadzu CS-93 0).
Aminosyresekvensen i den N-terminale ende av peptidet oppnådd etter enzymatisk spaltning bestemmes under anvendelse av en automatisk aminosyresekvensator "Gas-Phase Protein Sequencer Model 470A" (Applied Biosystems) i kombinasjon med en Spectra Physics høytrykksvæskekromatograf.
I det etterfølgende er det angitt en rekke eksempler, testeksempler og undereksempler.
Eksempel 1
Konstruksjon av hG- CSF ekspresjonsplasmidet pCfTAl
(jfr, fig. 1)
En 2 ( ig porsjon av pCSFl-2 DNA oppnådd i undereksempel 1 ble oppløst i en total mengde på 20 fil av en oppløsning (i det følgende omtalt som "Y-100 buffer") inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol og 100 mM NaCl, 10 enheter av hver av restriksjonsenzymene Apal (Boehringer Mannheim) og BamHI (Takara Shuzo, i det følgende med mindre annet er angitt ble alle de anvendte restriksjonsenzymer erholdt fra Takara Shuzo) tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det renset og utvunnet 0,4 fig av et 1,5 kb DNA-fragment ved hjelp av LGT-metoden.
Separat ble 2 fig av plasmidet pLSAl fremstilt ved metoden i undereksempel 3 oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og BamHI ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 4 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det renset og utvunnet 0,8 fig av et 2,8 kb DNA-fragment ved LGT-metoden.
På den annen side ble følgende DNA linker syntetisert for å tilveiebringe de kondoner som som koder for første til femte N-terminale aminosyrer i det ferdige hG-CSF polypeptid (threonin<1> (ACA eller ACT),prolin2 (CCA eller CCT), leucin<3 >(CTA), glycin<4> (GGC) og prolin5(CCC) ) og initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og for innstilling av avstanden mellom SD-sekvensen og ATG-nedstrøms fra tryptofan-promoteren (Ptrp) til en passende lengde mellom 6-18 bp:
Først ble de 26-mer og 20-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av fosfotriestermetoden (R. Crea et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 75, 5765 (1978)). 26-mer og,.!-2 0-mer (hver 2 fig) ble oppløst i 40 fil av en buffer (i det følgende benevnt som "T4 kinasebuffer") inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo, også i det følgende) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
I 25 fil av en buffer (i det følgende benevnt "T4 ligasebuffer") inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2,
10 mM ditiotreitol og l mM ATP, ble det oppløst 0,4 fig av det pCSFl-2-avledede Apal-BamHI fragment (1,5 kb) oppnådd på den ovennevnte måte og 0,2 fig av det pLSAl-avledede Banlll-BamHI fragment (2,8kb) oppnådd på den ovennevnte måte. 0,1 fig av
den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt til blandingen. Til
denne blandede oppløsning ble det ytterligere tilsatt 6 enheter T4 DNA ligase (oppnådd fra Takara Shuzo, også i det følgende) og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 (Bolivar et al., Gene, 2, 75 (1977)) ved metoden til Cohen et al. (S.N. Cohen eta al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)) (i det følgende ble denne metode anvendt ved transformering av E. coli) og en Ap<r> koloni ble oppnådd. Plasmid-DNA ble utvunnet fra de dyrkede celler i denne koloni ved den kjente metode (H.C. Birnboim et al.:Nucleic Acids Res,., 7, 1513 (1979)) (i det følgende ble denne metode anvendt for plasmid DNA sepa-rering) . Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved kutting med Banlll, Rsal, Pstl, Hindlll og Bglll etter-fulgt av agarosegelelektroforese. Dette plasmid kalles pCfTAl. Basesekvensen av pCfTAl i nærheten av Banlll og Hindlll setene ble bekreftet til å være som følger ved hjelp av dioksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag:
Eksempel '2
Konstruksjon av plasmidet pCfTB2 0 med mangel i delen med det 3'-ikke-translasjonale område av hG- CSF cDNA
I 2 0 fil Y-100 buffer ble det oppløst 2 \ iq av hG-CSF
ekspresjonsplasmidet pCfTAl (4,3 kb) oppnådd i eksempel 1, 4 enheter av restriksjonsenzymet BamHI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 4 timer. Etter ekstrak-sjon med en blanding av et like stort volum av fenol og kloroform (i det følgende benevnt fenol-kloroformekstraksjon) ble 1,8 fig av et DNA-fragment utvunnet ved utfelling med etanol. Dette DNA-fragment ble oppløst i 20 fil av en buffer (i det følgende benevnt "Klenow buffer") inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM MgCl2 og 6 mM merkaptoetanol,
deretter ble dATP, dTTP, dCTP og dGTP hver tilsatt til en konsentrasjon av 1 mM og etter ytterligere tilsetning av 4 enheter av DNA polymerase I Klenow fragment (oppnådd fra Takara Shuzo, også i det følgende) ble reaksjonen gjennomført ved romtemperatur i 1 time for å omdanne de utstående ender til buttender. Etter fenol-kloroformekstraksjon ble 1,6 fig av et DNA-fragment utvunnet ved etanolutfelling. Dette DNA-fragment ble oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 10 enheter EcoRI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Fra reaksjonsblåndingen ble det oppnådd 1 fig av et 2,5 kb DNA-fragment (BamHI(butt-ende) EcoRI-fragment) ved hjelp av LGT-metoden.
Separat ble 2 fig pCfTAl oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 10 enheter EcoRI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en NaCl-konsentrasjon på 150 mM, deretter ble 10 enheter Dral tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Etter bekreftelse av fullstendig kutting ved hjelp av agarosegelelektroforese ble 0,2 fig av et hG-CSF cDNA-holdig 1,0 kb DNA-fragment (EcoRI-Dral fragment) renset og utvunnet ved hjelp av LGT-metoden.
I 25 fil T4 ligasebuffer ble det oppløst 0,2 fig BamHI (buttende)-EcoRI fragment (2,5 kb) og 0,2 fig av EcoRI-Dral fragment (1,0 kb) hvert oppnådd på den ovenstående måte, 6 enheter T4 DNA ligase ble tilsatt til den resulterende blanding og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r> koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler avledet fra denne koloni ble et plasmid-DNA utvunnet. Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved hjelp av agarosegelelektroforese etter kutting med Hindlll og Pstl. Dette plasmid benevnes pCfTB20.
Eksempel 3
Konstruksjon av plasmidene som koder for polypeptider som resulterer fra substitusjon av den N- terminale aminosyre i hG-CSF. nemlig pCfTL23. PCfTL38-. pCfTL3 5 oa pCfTL41 H f r .
£iq- 3)
I 60 fil Y-100 buffer ble det oppløst 3 fig pCSFl-2 (4,5 kb) oppnådd ved metoden i undereksempel 1, 8 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Apal (Boehringer Mannheim) og BamHI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det oppnådd omtrent 0,4 fig av et DNA-fragment på omtrent 1,5 kb (Apal-Baml fragment) inneholdende det meste av hG-CSF-genet.
Separat ble 2 fig pGELl (Sekine et al.: Proe. Nati. Acad. Sei USA, 82, 4306 (1985)) (oppnådd fra en kultur av E. coli IGEL1 FERM BP-629 ved hjelp av den konvensjonelle metode) (3,4 kb) oppløst i 40 fil Y-100 buffer, 4 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll, BamHI og Pstl ble tilsatt og kutt ingsreaks jonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det oppnådd omtrent 0,5 jig av et DNA-fragment på omtrent 1,7 kb (Psti-BamHI-fragment) inneholdende den lipoproteinavledete terminator ved hjelp av LGT-metoden.
Separat ble 3 fig pKYPlO fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i japansk patentsøknad (OPI) nr. 110600/83 oppløst i 60 fil Y-10 0 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og Pstl ble tilsatt, og kutt ingsreaks jonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det oppnådd omtrent 0,5 fig av et DNA-fragment på omtrent 1,1 kb (Banlll-Pstl-fragment) inneholdende tryptofan-promoteren (Ptrp) ved hjelp av LGT-metoden.
På den annen side ble, av hensyn til nødvendigheten av substituering av den N-terminale aminosyre i det modne hG-CSF, nemlig Thr, med Ser, Cys, Arg eller Gly og tilveiebrin-gelse av initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og også av hensyn til å innstille avstanden mellom SD-sekvensen og ATG nedstrøms fra Ptrp til en passende lengde på 6-18 bp, og også av andre grunner, følgende DNA-linker syntetisert:
I den ovenstående formel er N en av basene G, A, T og C.
Først ble 26-mer og 20-mer enkelttrådede DNA<1>er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 26-mér og 20-mer (hver 20 pikomol) ble.oppløst i 40 [ il T4 kinasebuf f er, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,3 ( ig av pCSFl-2-avledet Apal-BamHI-fragment (omtrent 1,5 kb), 0,2 fig av pGELl-avledet Pstl-BamHI-fragment (omtrent 1,7 kb), og 0,2 fig av ekspresjonsvektor pKYlO-avledet BanIII-PstI-fragment (omtrent 1,1 kb), hvert oppnådd på den ovenstående måte, oppløst i totalt 30 ( il T4 ligasebuffer og omtrent 1 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter av T4 DNA-ligase til oppløsningen ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den rekombinante plasmidholdige reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli C600SF8 (FERM BP-1070) (Cameron et al., Proe. nati. Acad. Sei USA 72, 3416 (1975)) og Ap<r >kolonier ble oppnådd. Fra disse transformanter ble plasmid-DNA separert og renset ved hjelp av kjente metoder. Strukturen av hvert av plasmid-DNA'er ble bekreftet ved kutting med Pstl, EcoRI og Banlll, etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. Plasmidene oppnådd på denne måte benevnes pCfTL23, pCfTL38, pCfTL3 5 og pCfTL41, som vist i fig. 3. Sekvensene i nærheten av den N-terminale ende av hG-CSP derivatgenene i de nevnte plasmider ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag til å være som følger:
Substitusjonen av den N-terminale Thr i moden hG-CSF ble bekreftet i det pCfTL23-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF(Gly<1>). Tilsvarende ble N-terminal aminosyresubstitu-sjon med Ser bekreftet i det pCfTL38-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF (Ser1) , substitusjon med Cys i det pCfTL35-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF(Cys<1>), og substitusjon med Arg i det pCfTL4i-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF(Arg<1>) .
Eksempel 4
Konstruksjon av plasmider. pCfTMl4, pCfTMl7 og pCfTM113. som koder for polypeptidene som resulterer fra substitusjon av den N- terminale oa tredi e aminos yre i hG- CSF Hf r. fig. 4) .
I 60 fil Y-100 buffer ble det oppløst 3 .[ tg pCSFl-2 (4,5 kb) oppnådd ved prosedyren i undereksempel 1, 8 enheter av hver av Apal og BamHI ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det oppnådd omtrent 0,4 [ ig av et DNA-fragment på omtrent 1,5 kb (ApaI-BamHI-fragment) inneholdende det meste av hG-CSF-genet ved hjelp av LGT-metoden.
Separat ble 2 fig pGELl (3,4 kb) oppløst i 40 [ il Y-100 buffer, 4 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll, BamHI og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det oppnådd omtrent 0,5 jig av et DNA-fragment på omtrent 1,7 kb (Pstl-BamHI-fragment) inneholdende lipoproteinterminatoren ved hjelp av LGT-metoden.
Ytterligere og separat, ble 3 jig pKYPlO fremstilt ved prosedyren beskrevet i japansk patentsøknad (OPI) nr. 110600/83 oppløst i 60 ( il Y-100 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 /xg av et Ptrp-holdig DNA-fragment på omtrent 1,1 kb (Banlll-Pstl-fragment) .
På bakgrunn av nødvendigheten av å substituere den N-terminale aminosyre Thr i moden hG-CSF med Ser og den tredje aminosyre Leu i moden hG-CSF med en av Gly, Ser, Cys og Arg, og tilveiebringe initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og også av hensyn til nødvendigheten av å innstille avstanden mellom SD-sekvensen og ATG nedstrøms fra Ptrp med en passende lengde på 6-18 bp og av andre grunner, ble ±ølgende DNA-linker syntetisert.
I den ovenstående formel er N en av basene G, A, T og C.
Først ble 26-mer og 20-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved den vanlige fosfotriestermetode. 26-mer og 20-mer (hver 2 0 pikomol) ble oppløst i 40 fil T4 kinase-
buffer, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase ble
tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 60 min.
Deretter ble 0,3 tig av det pCSFl-2-avledede Apal-BamHI-fragment (omtrent 1,5 kb), 0,2 iig av det pGELl-avledede Pstl-BamHI-fragmentet (omtrent 1,7 kb) og 0,2 jig av Banlll-Pstl-fragmentet (omtrent 1,1 kb) av ekspresjonsvektoren pKYPlO, hver oppnådd på den ovennevnte måte, oppløst i.3 0 iil T4 ligasebuffer og omtrent 1 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetninger av 6 enheter T4 DNA-ligase til oppløsningen ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den rekombinante plasmidholdige reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli C600SP8 (FERM BP-1070) ved hjelp av metoden til Cohen et al. og Ap<r->kolonier ble oppnådd. Plasmid-DNA'er ble separert og renset fra disse transformanter ved hjelp av kjente metoder. Strukturen av hver av de nevnte plasmid-DNA'er ble bekreftet ved kutting med Pstl, EcoRI og Banlll, etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. Plasmidene oppnådd på den ovennevnte måte benevnes pCfTM14, pCfTM17 og pCfTM113, som vist i fig. 4. Sekvensene i nærheten av den N-terminale ende av de hG-CSF derivat-kodende gener ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag og var som følger:
Substitusjonen av den N-terminale Thr og tredje aminosyre Leu i moden hG-CSF med hhv. Ser og Cys, ble bekreftet i det pCfTM14-kodede derivat, som benevnes hG-CSF(Ser<1>, Cys<3>). På lignende måte ble substitusjonen av den N-terminale Thr og tredje aminosyre Leu med hhv. Ser og Arg, bekreftet i det pCfTMl7-kodede derivat, som benevnes hG-CSF(Ser<1>, Arg<3>), og substitusjonen av den N-terminale Thr og den tredje aminosyre Leu med'hhv. Ser og Ser ble bekreftet i det pCfTM113-kodede derivat, som benevnes hG-CSF(Ser<1>, Ser<3>).
Eksempel 5
(1) Konstruksjon av det rekombinante plasmid pCf WDl ( jfr..
fig. 5)
I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 5 fig pCfTAl oppnådd ved prosedyren i eksempel 1, 10 enheter av restriksjonsenzymet Stul og 10 enheter av restriksjonsenzymet Banlll (Toyobo) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det oppnådd omtrent 0,5 iig av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 1,3 kb (Banlll-Stul fragment) . Separat ble 3 iig pKYP2 6 fremstilt ved prosedyren i undereksempel 2 oppløst i 50 fil Y-100 buffer, 6 enheter BamHI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 3 0°C i 1 time.
Til blandingen ble det tilsatt et like stort volum av fenol mettet med 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. Etter kraftig omrøring ble det vandige lag samlet ved hjelp av sakte sentrifugering (3.300 omdr. pr. min, 10 min., i det følgende ble samme betingelser anvendt). Et like stort volum kloroform ble tilsatt og etter kraftig omrøring ble det vandige lag samlet ved hjelp av sakte sentrifugering. Et 1/10 volum av 3 M natriumacetat ble tilsatt, 2,5 volumdeler etanol ble så tilsatt, og blandingen fikk stå ved -20°C i 1 time. Bunnfallet ble samlet ved kaldsentrifugering (4°C, 11.000 omdr. pr, min., 10 min.) Dette bunnfall ble oppløst i 30 fil Klenow-buffer, dATP, dTTP, dCTP og dGTP ble hver tilsatt til en konsentrasjon på 100 iiM, 2 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 15 min. DNA-polymerase I Klenow-fragmentet ble inaktivert ved behandling ved 68°C i 10 min., deretter ble NaCl tilsatt til en konsentrasjon på 100 mM, 5 enheter av restriksjonsenzymet Pstl ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 fig av et {pp terminatorholdig DNA-fragment på omtrent 1,8 kb (BamHI (buttende)-Pstl-fragment). Separat ble 4 fig pGELl oppløst i 40 ill Y-100 buffer, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i l time, og 0,4 fig tryptofan-promoterholdig DNA-fragment på omtrent 1 kb (Banlll-Pstl-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden.
Omtrent 0,2 fig av det pCfTAl-avledede Banlll-Stul-fragment (omtrent. 1,3 kb), omtrent 0,1 fig av pKYP26-avledet BamHI(buttende)-PstI-fragment (omtrent 1,8 kb) og omtrent 0,1 fig av det pGELl - avledede BanIII-PstI-£ragment (omtrent l kb) ble oppløst i 30 fil T4 DNA-ligase-buf f er, 4 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Reaksjonsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd, og plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni ved hjelp den ovennevnte metoden til Birnboim et al. Det ble således oppnådd pCfWDl vist i fig. 5.
(2) Konstruksjon av pCfT95K19 ( jfr, fig. 6 )
I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 5 fig av pCfTL38 oppnådd ved prosedyren i eksempel 3, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll og Bgllll ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Omtrent 0,7 fig av et tryptof an promoterholdig DNA-fragment på omtrent 2,6 kb (Hindlll-Balli-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden. Separat ble 100 fig pCfTL38 oppløst i 1,5 ml Y-10 0 buffer, 80 enheter av hvert av restriksjonsenzymene BamHI og Hindlll ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 6 timer. Et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment ble utvunnet fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden og renset under anvendelse av ELUTIPTM-d (varenavn for Schleicher & Schuell). Dette DNA-fragment ble oppløst i et totalt volum på 90 ( il av en oppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 150 mM NaCl og 6 mM 2-merkaptoetanol {i det følgende benevnt "Y-150 buffer"), 3 enheter av restriksjonsenzymet Dpnl (Boehringer Mannheim) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 15 min. Omtrent l ( ig av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 300 bp (HindiII-Dpnl-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese. Separat ble 10 iig av pCfTB2 0 oppnådd ved prosedyren i eksempel 2 oppløst i 100 ( il Y-10 0 buffer, 10 enheter restriksjonsenzym Aval ble tilsatt, og kutt ingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. DNA utvunnet fra kuttingsblandingen ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutf elling ble oppløst i 3 0 ( il Klenow-buffer, 2 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 30 min. DNA-polymerase I Klenow-fragmentet ble inaktivert ved behandling ved 68°C i 10 min., NaCl ble tilsatt til 100 mM, 10 enheter av restriksjonsenzymet Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Omtrent 0,3 ( ig av et {pp terminator delholdig DNA-fragment på omtrent 480 bp (Aval(buttende)-Bglll-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden.
I 30 ill av T4 DNA-ligasebuffer ble det oppløst omtrent 0,1 iig av det pCfTL38-avledede Hindlll-Bglll-fragment (omtrent 2,6 kb), omtrent 0,2 itg av det pCfTL38-avledede Hindlll-Dpnl-fragment (omtrent 300 bp) og omtrent 0,15 fig av det pCfTB20-avledede Aval(buttende)-Bglll-fragment (omtrent 480 bp), hvert oppnådd på den ovennevnte måte, og etter tilsetting av 4 enheter av T4 DNA-ligase, ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd en Ap<r->koloni. Fra denne koloni ble det utvunnet plasmid-DNA ved hjelp av den ovennevnte metode til Birnboim et al. Det ble således oppnådd pCfT95K19 vist i fig. 6 .
(3) Konstruks- ion av pCfAAl f jfr, fig. 6)
I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 5 iig pCfT95Kl9 oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt. 7 enheter av restriksjonsenzymet Banlll (Toyobo) og 2 enheter av Bgll (Nippon Gene) ble tilsatt dertil og kuttingsreaksjonen ble. gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det'ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 iig tryptofan-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent l kb (BandiII-Bgll-fragment) og omtrent 1 fig av et {pp-terminatordel-holdig DNA-fragment på omtrent 1,8 kb (Bgll-Bgll-fragment).
Separat ble 15 iig.pCfT95K19 oppløst i 150 fil Y-100 buffer, 6 enheter av restriksjonsenzymet Bgll (Nippon Gene) og 10 enheter Sau3A ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C -i 1 time. Polyakrylamidgelelektroforese av reaksjonsblandingen ga omtrent 0,3 fig av et hG-CSF cDNA-del-holdig DNA-fragment på omtrent 350 bp (BglI-Sau3A-fragment).
Videre ble den følgende DNA-linker syntetisert separat:
Først ble 39-mer og 41-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfortriestermetode. 39-mer og 41-mer (hver 2 0 pikomol) ble oppløst i et totalt volum på 4 0 fil av T4 DNA-kinasebuffer, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 fig av det pCfT95K19 avledede Banlll-Bgll-fragment (omtrent 1 kb), 0,05 fig av Bgll-Bgll-fragmentet (omtrent 1,8 kb) og 0,1 fig av BglI-Sau3A-fragmentet (omtrent
3 50 bp), hvert oppnådd på den ovennevnte måte, oppløst i 25
/il T4 DNA-ligasebuf f er, etterfulgt av tilsetting av omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker. Etter ytterligere tilsetting av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 40°C i 18 timer.
Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101, en- Apr-koloni ble oppnådd og plasmid DNA ble utvunnet . fra denne koloni ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al metode. Det ble således oppnådd pCfAAl vist i fig. 6. Bestemmelse av basesekvensen i linkerdelen av pCfAAl ved
hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at den tredje base i kodonet som koder for den fjerde aminosyre Leu er A. I denne pCfAAl mangler den DNA-del som koder for de 14 aminosyrer fra den 10. aminosyre Pro til den 23. aminosyre Lys i hG-CSF. Videre er denne mutasjon innført for å endre
den 6. aminosyre i hG-CSF fra Ala til Asn, og der er nå et nytt Xhol-sete.
(4) Konstruksjon av pCfABS H f r. fig. 6) I 30 /il Y-100 buffer ble det oppløst 3 /ig pCfAAl oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, 5 enheter av restriksjonsenzymet Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Etter bekreftelse av fullstendig Xhol-kutting ved hjelp av agarosegelelektroforese ble en enhet av restriksj onsenzymet Bgll (Nippon Gene) ' " f tilsatt og delvis kutting ble gjennomført ved 37°C i 25 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent l fig av et tryptof an-promoter del- og Jpp-terminatordel-holdig DNA-fragment på omtrent 3 kb (Xhol-Bgll-"fragment). Separat ble følgende DNA-linker syntetisert: j
Dette linker-.DNA inneholder den DNA-del som koder for de 14 aminosyrer i hG-CSF fra den 10. aminosyre Pro til den 23. aminosyre Lys. Denne del mangler i hG-CSF cDNA av pCfAAl.
Først ble 27-mer, 25-mer (to typer) og 23-mer enkelttrådede DNA<1>er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfortriestermetode. 27-mer og 25-mer DNA'er komplementære til hverandre og 25-mer og 23-mer DNA komplementære til hverandre ble. oppløst i par, og hver i en mengde på 20 pikomol, i et totalt volum på 40 ( il T4 kiiiasebuffer. 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shyzo) ble tilsatt til hver oppløsning og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 iig av det pCfAAl-avledede Xhol-Bgll-fragment (omtrent 3 kb) oppnådd som beskrevet ovenfor og 0,1/ig av det pCfT95K19 avledede BglI-Sau3A-fragment (omtrent 350 bp) oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, oppløst i 3 0 /il T4 DNA-ligasebuffer, og 2 pikomol av hver av de ovennevnte DNA-linkerdeler ble tilsatt blandingsoppløsningen. Ytter-■ ligere ble 6 enheter T4 DNA-ligase tilsatt og ligerings-reaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd Ap<r->kolonier. Fra disse kolonier ble plasmid-DNA utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al metode. Det ble på denne måte oppnådd pCfABS og pCfAB14 vist i fig. 6. Bestemmelse av basesekvensen av DNA-linkeren av pCfABS og i pCfABi4 ved hjelp av den ovennevnte dioksysekven-seringsmetode viste at den første base i kodonet som koder for den 17. aminosyre er A i pCfABS og T i pCfAB14, og kodonet er følgelig for Ser (-AGC) i den førstnevnte og for Cys (TGC) i den sistnevnte, som fører til substitusjon av Ser for den 17. aminosyre Cys i moden hG-CSF i pCfABS, men ingen substitusjon i pCfAB14.
Eksempel 6
(1) Konstruks- ion av pCfBAS oa pCfBA32 Hfr. fia. 71.
I 40 /il Y-100 buffer ble det oppløst 3 /tg pCfABS oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Aval og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time.' Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1 fig av et tryptofan-promoterdel - og {pp-terminatordel -holdig DNA-fragment på omtrent 2,8 kb (Aval-Bglll-fragment). Separat ble 6 fig pCfWDl oppnådd som beskrevet i avsnitt 1 oppløst i 50 fil Y-100 buffer, 5 enheter restriksjonsenzym Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført, ved 37°C i 1 time. Agarosegelelektroforese bekreftet at kuttingen med Bglll var fullstendig. Deretter ble 3 enheter restriksjonsenzym Aval tilsatt og den delvise kutting ble gjennomført ved 37°C i 20 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,4 fig av et DNA-fragment (omtrent 1,3 kb) inneholdende det meste av hG-CSF (BglII-AvaI-fragment).
Deretter ble 0,1 fig av det ovennevnte pCfABS-avledede Aval-BglII-fragment (omtrent 2,8 kb) og 0,3 fig av det pCfWDl-avledede BgllI-Aval-fragment (omtrent 1,3 kb), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående og oppløst i 25 fil T4 DNA-ligase, tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra denne koloni ble plasmid-DNA utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. Det ble på denne måte oppnådd pCfBAS.
Aminosyresekvensen i hG-CSF-derivatet som kodes for av pCfBAS inneholder Asn i stedet for den 6. aminosyre Ala i moden hG-CSF og Ser i stedet for den 17. aminosyre Cys. I det følgende omtales dette derivat som hG-CSF(NA8) .' På den annen side ble 3 fig pCfAB14 oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt oppløst i 4 0 fil Y-100 buffer, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Aval og Bglll ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1 ( ig av et tryptof an-promoterdel- og {pp-terminatordel-holdig DNA-fragment på omtrent 2,8 kb (Aval-Bglll-fragment).
Separat ble 6 fig pCfWDl oppnådd som beskrevet i avsnitt
1 oppløst i 50 fil Y-100 buffer, 5 enheter av restriksj onsenzymet Bglll ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Etter bekreftet fullstendig kutting ved BgllI-kuttingen ved agarosegelelektroforese ble 3 enheter av restriksjonsenzymet Aval tilsatt og delvis kutting ble gjennomført ved 37°C i 20 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,4 iig av et DNA-fragment (omtrent 1,3 kb) inneholdende det meste av CSF cDNA (BgllI-Aval-fragment).
Deretter ble 0,1 fig av det pCfAB14-avledede Aval-Bglll-fragment (omtrent 2,8 kb) og 0,3 iig av det pCfWDl-avledede BglII-AvaI-fragment (omtrent 1,3 kb), hver oppnådd'som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer, 3 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt, og ligerings-reaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd og fra denne koloni ble plasmid-DNA utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. På denne måte ble det oppnådd pCfBA32 vist i fig. 7.
Aminosyresekvensen i hG-CSF-derivatet som kodes for av
pCfBA32 inneholder Asn i stedet for den 6. aminosyre Ala i vanlig hG-CSF.
(2) Konstruksjon av pCfBBlOl
I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 6 iig pCfBA8 oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, 10 enheter restriksjonsenzym Banlll (Toyobo), 8 enheter Bglll og 8 enheter Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 fig av et hG-CSF cDNA inneholdende DNA-fragment på omtrent 1,4 kb (Xhol-BglII-fragment) og omtrent 0,8 fig av et tryptofan-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent 2,7 kb {BanIII-BglII-fragment).
Separat ble følgende DNA-linker syntetisert:
i Først ble 31-mer og 33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfortriestermetode. 31-mer og 33-mer (hver 2 fig) ble oppløst i totalt 40 fil T4 kinasebuffer, 30 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyliseringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. Deretter ble 0,1 fig av det pCfBA8-avledete Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb fragment) og 0,1 fig av det pCfBA8-avledede XhoI-BglU-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 fil T4 DNA ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den således oppnådde rekombinante plasmid-blanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd en Ap<r->koloni. Fra dyrkede celler avledet fra denne koloni ble det utvunnet plasmid-DNA. Det ble således oppnådd pCfBBlOl vist i fig. 7. Aminosyresekvensen av det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfBBlOl inneholder Ala, Thr, Arg, Ser og Ser i stedet for hhv. l. aminosyre Thr, 3. aminosyre Leu, 4. aminosyre Gly, 5. aminosyre Pro og 17. aminosyre Cys i moden hG-CSF. I det følgende omtales dette derivat som hG-CSF (NB101) . (3) Konst ruks- i on' av PCfBC42Bl. PCfBC45! pCf BC52 , pCfBC59. pCfBC76. pCfBC77. pCf BC93. pCfBC95 oa pCfBC97 Hfr. f ia.
Først ble følgende DNA-linker syntetisert:
(N er en av G, A, T og C).
I denne syntetiske DNA-linker er de tre baser som hver representeres ved N hver uavhengig en av G, A, T og C og en base er G eller A {i tilfellet av 31-mer) eller C eller T (i tilfellet av 33-mer) og derfor oppnås denne linker som en blanding av totalt 128 DNA-linkere. Som et resultat er designen av denne linker slik at i den N-terminale hG-CSF aminosyresekvens som kodes for av denne linker, er 16 forskjellige aminosyrer mulig som aminosyren nærmest Met og 8 forskjellige aminosyrer er mulig som aminosyren nærmest Pro, og følgelig er 128 aminosyresekvenser totalt mulig. Først ble 31-mer og 33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriester-metode. 31-mer og 33-mer (hver 2 itg) ble oppløst i et totalt volum på 40/il T4 kinasebuf fer, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyliserings-reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 /tg av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb fragment) og 0,1 /ig av det pCfBAS avledede Xhol-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb fragment), hvert oppnådd i eksempel 6, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuf f er, og omtrent 2 pikomol av ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt . for transformering av E. coli HB101 og Ap<r->kolonier ble oppnådd. Fra dyrkede celler av disse kolonier ble plasmid-DNA utvunnet. Det ble således oppnådd pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 og pCfBC97. Bestemmelse av basesekvensen i hver DNA-linker-del ved hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at base-sekvensene på den N-terminale side av hG-CSF-derivatene er som følger:
Substituent-aminosyrerestene i hG-CSF-derivatene som kodes for av disse plasmider som hhv. sammenlignet med moden hG-CSF er som følger:
Posisjon av aminosyresubstitusion faminosyre av hG- CSF)
De hG-CSF-derivater som kodes for av pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC56, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 og pCfBC97 benevnes i det følgende henhv. hG-CSF(NC42B1), hG-CSF (NC45), hG-CSF{NC52), hG-CSF(NC59), hG-CSF (NC76) , hG-CSF(NC77), hG-CSF(NC93), hG-CSF(NC95) og hG-CSF(NC97). (4) Konstruksjon av pCfBD28. pCfBD56 og pCfBD82 Først ble følgende DNA-linker syntetisert: 1 denne DNA-linker er de fire baser representert ved N uavhengig G,-A, T eller C og linkeren oppnås følgelig som en blanding av totalt 256 forskjellige DNA-linkere. Som et resultat er konstruksjonen av denne DNA-linker slik at i den N-terminale hG-CSF-aminosyresekvens som kodes for av DNA-linker en, er fire aminosyrer mulige i hver av de fire posisjoner som det er tale om, og følgelig- er totalt 2 56 forskjellige aminosyresekvenser mulig.
Først ble 31-mer og.33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige f osf otriester-metode. I totalt 4 0 /il T4 kinasebuffer ble det oppløst 2 iig av hver av 31-mer og 33-mer, 3 0 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 /ig av dét pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kg fragment) og 0,1 /ig av det pCfBAS-avledede Xhol-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb fragment),, hvert oppnådd i eksempel 6, oppløst i 25 /il T4 DNA ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for' transformering av E. coli HB101 og Ap<r->kolonier ble oppnådd. Fra dyrkede celler av disse kolonier ble de respektive plasmider utvunnet. Det ble således oppnådd pCfBD28, pCfBD56 og pCfBD82. Bestemmelse av basesekvensen i DNA linkerdelen ved hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at basesekvensene på den N-terminale side av hG-CSF-derivatene er som følger:
De erstattende aminosyrerester i hG-CSF-derivatene
som disse plasmider koder for i sammenligning med moden hG-CSF er som følger:
hG-CSF-derivatene som kodes for av pCfBD28, pCfBD56 og pCfBD82 er i det følgende omtalt som henhv. hG-CSF(ND28)' hG-CSF(ND56) og hG-CSF(ND82). En E. coli stamme med pCfBD56, nemlig E. coli ECfBD56, og en E. coli stamme med pCfBD2 8, nemlig E. coli ECfBD28, er deponert ved Fermentation Research Institute under deponeringsnummere FERM BP-1221 og FERM BP-1479, i samsvar med Budapestkonvensjonen.
(5) Konstruksjon av pCfTNS7 Hfr. f ia. 14)
Følgende DNA-linker ble syntetisert.
j
I henhold' til oppbygningen av denne DNA-linker er de fire aminosyr<i>er fra den 1. aminosyre Thr til den 4. aminosyre Gly i den N-terminale ende-aminosyresekvens av hG-CSF manglende i den N-terminale aminosyresekvens som kodes for av denne linker.
Først ble 18-mer og 2 0-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 18-mer og 2 0-mer (hver 2fig) ble oppløst i totalt 4 0 fil T4 kinasebuf f er, 30 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 fig av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb fragment) og 0,i fig av det pCfBA8-avledede XhoI-BglII-fragment (omtrent 1,4 kb), hvert oppnådd i eksempel 6, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer, omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandings-oppløsningen og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den rekombinante plasmidblanding oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler av denne koloni ble plasmidet utvunnet. Det ble således oppnådd pCfTNS7. Det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTNS7 benevnes i det følgende hG-CSF(Al-4S) .
(6) Konstruksjon av pCfTAAro4S fj fr, fia. 14)
Følgende DNA-linker ble syntetisert:
I denne DNA-linker er to baser uavhengig A eller G, og følgelig oppnås denne linker som en blanding av totalt fire DNA-linkere. Følgelig er konstruksjonen av denne DNA-linker slik at fire aminosyrer er mulige som den fjerde aminosyre i den N-terminale hG-CSF aminosyresekvens som kodes for av denne linker.
Først ble 31-mer og 33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 31-mer og 33-mer (hver 2fig) ble oppløst i et totalt volum på 40 fil T4 kinasebuffér, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 fig av det pCfBAS-avledede BanIII-BfIII-fragment (omtrent 2,7 kb-fragment) og 0,1 fig av det pCfBA8-avledede XhoI-BglII-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som beskrevet i avsnitt (l) , oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den rekombinante plasmidblanding oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler fra denne koloni ble plasmidet utvunnet. Det ble således oppnådd pCfTAArg4S. Bestemmelse av basesekvensen i DNA-linkerdelen ved hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at den N-terminale basesekvéns av hG-CSF-derivatet er som følger:
Det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTAArg4S benevnes i det følgende hG-CSF (Arg4, Ser17) .
(7) ( Konstruksjon av pCfTN205 ( jfr, fig. 15)
I 4 0 fil K-150 buffer (den samme som Y-100 buffer unntatt at 150 mM KC1 erstatter 100 mM NaCl), ble det tilsatt 3 fig pCfTNS7 oppnådd i avsnitt 5, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 /ig av et tryptofan-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent 1,0 kb (Pvul-Xhol-fragment).
Separat ble 3 fig av PCfBA32 oppnådd i avsnitt (1) oppløst i 4 0 fil K-150 buffer, 5 enheter av hver av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 2 fig av et omtrent 3, 0 kb DNA-fragment (Xhol-Pvul-fragment) inneholdende det meste av hG-CSF cDNA.
Deretter ble 0,1 fig av det pCfTNS7-avledede Pvul-Xhol-fragment (omtrent 1,0 kb) og 0,3 fig av det pCfBA32-avledede Xhol-Pvul-fragment (omtrent 3,0 kb), hvert oppnådd på den ovennevnte måte, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuf f er, 3 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt, og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd en Ap<r->koloni og plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. Det ble således oppnådd pCfTB205 vist i fig. 15.
I aminosyresekvensen av det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTN205, mangler de 1. til 4. aminosyrer av moden hG-CSF. I det følgende refereres dette derivat til som hG-CSF(Al-4).
(8) Konstruks-ion av pCfTAAra4 f jfr, f ia. 15)
I 40 fil K-150 buffer ble det oppløst 3 fig pCfTAArg4S> oppnådd i avsnitt (6), 5 enheter av hver av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 /tg av et tryptof an-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent 1,0 kb (Pvul-Xhol-fragment).
Separat ble 3 fig av pCfBA32 oppnådd i avsnitt (1) oppløst i
4 0 /ti K-15 0 buffer, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 2 /tg av et omtrent 3,0 kb DNA-fragment (Xhol-Pvul-fragment) inneholdende det meste av hG-CSF cDNA.
Deretter ble 0,1 fig av det pCfTAArg4S-avledede Pvul-Xhol-fragment (omtrent 1,0 kb) og 0,3 ( ig av det pCfBA32-avledede Xhol-Pvul-fragment (omtrent 3,0 kb), hvert oppnådd på den ovenstående måte, oppløst i 2 5 /ti T4 DNA-ligasebuf f er, 3 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101, Ap<r->koloni ble oppnådd, og plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. På denne måte ble det oppnådd pCfTAArg4 vist i fig. 15.
Den 4. aminosyre i aminosyresekvensen av det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTAArg4 er Arg i stedet for Gly i moden hG-CSF. I det følgende benevnes dette derivat hG-GSF(Arg<4>).
(9) Konstruks-ion av pCfTNS301 (jf r, fig. 16)
I 50 /il Y-100 buffer ble det oppløst 6 /ig av pCfBAS oppnådd i avsnitt (1), 10 enheter av restriksjonsenzymet Hindlll og 8 enheter av Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 /tg av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 1,4 kb (Hindlll-Bglll-fragment).
Deretter ble følgende DNA-linker syntetisert:
Konstruksjonen av denne DNA-linker er slik at de 11 aminosyrer fra den første aminosyre Thr til den 11. aminosyre Gin i hG-CSF mangler i den N-terminale aminosyresekveris' som kodes for av denne linker.
Først ble 27-mer og 29-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 27-mer og 29-mer (hver 2 iig) ble oppløst i totalt 40 [ il T4 kinasebuf f er, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. Deretter ble 0,1 iig av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb-fragment) og 0,1 iig av det pCfBA8-avledede Hindlll-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som nevnt i det foregående, oppløst i 25 [ il av T4 DNA-ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppiøsningen. Etter ytterligere tilsetning' av~ S"enheter" T4 DNA-ligase ble ligerings-reaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den rekombinante plasmidblanding oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler i denne koloni ble det utvunnet plasmid-DNA. Det ble således oppnådd pCfTNS301. hG-CSF -derivat et som kodes for av pCfTNS3 0l benevnes i det følgende hG-CSF(Al-llS).
( 10) Konstruksjon av pCfTNS401 (jfr, fig. 16)
'■Følgende DNA-linker ble syntetisert:
Konstruksjonen av denne DNA-linker er slik at de 7 aminosyrer fra den første aminosyre Thr til den 7. aminosyre Ser i hG-CSF mangler i den N-terminale aminosyresekvens som kodes for av denne linker.
Først ble 39rmer og 41-mer enkelttrådede DNA' er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 39-mer og 41-mer (hver 2 itg) ble oppløst i totalt 4 0 /il T4 kinasebuf f er, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. Deretter ble 0,1 itg av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb-fragment) og. 0,1 iig av det pCfBA8-avledede Hindlll-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 /il T4 DNA-ligasebuf f er, og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt denne blandingsoppløsning. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni. På denne måte ble det oppnådd pCfTNS401.
hG-CSF-derivatet som kodes for av pCfTNS401 er i det følgende benevnt hG-CSF(Å1-7S).
(11) Konstruksjon av pCfTNS501 fjfr. fig. 12)
I 40/il Y-100 buffer ble det oppløst pCfBAS oppnådd i avsnitt
(1) , 10 enheter restriksjonsenzym Xhol ble tilsatt og
kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 30 /il Klenow-buf f er, 2 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment ble tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 30 min. DNA-polymerase I Klenow-fragmentet ble inaktivert ved 10 min. behandling ved 68°C, KC1 ble tilsatt til en konsentrasjon på 150 mM, 8 enheter av restriksjonsenzymet Pvul ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved
hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 2 fig av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 3 kb (Xhol(buttende)-Pvul).
Separat ble 5 fig av ATG-vektoren pTrS20 (3,8 kb) oppnådd ved prosedyren i undereksempel 4 oppløst i 50 til Y-0 buffer (Y-100.buffer minus 100 mM NaCl), 16 enheter av restriksjonsenzymet SacI ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 30 fil Klenow-buf f er, 2 enheter av DNA-polymerase I Klenow fragment ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 30 min. DNA-polymerase I Klenow fragmentet ble inaktivert ved behandling ved 68°C i 10 min., KCl ble tilsatt til en konsentrasjon på 150 mM, 8 enheter av restriksjonsenzymet Pvul ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 itg av et Ptrp-holdig DNA-fragment på omtrent 1 kb (SacI(buttende)-Pvul).
Deretter ble 0,1 fig av det pCfBAS-avledede Xhol(buttende)-Pvul-fragment (omtrent 3 kb) og 0,2 fig av det pTrS20-avledede SacI (butt-ende) -Pvul-fragment (omtrent 1 kb) oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer, 3 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt, og liger ingsreaks jonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Reaksjonsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli HB101, en Ap<r->koloni ble oppnådd, og plasmid-DNA ble utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. Det ble således oppnådd pCfTNSSOl vist i fig. 12.
I det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTNSSOl, mangler 1. til 6. N-terminale aminosyrer i moden hG-CSF og den 17. aminosyre er Ser i stedet for Cys. Det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTNSSOl benevnes i det følgende hG-CSF(A1-6S).
Eksempel 7
(1) Konstruk sjon avpCfBlOl. p CfCC52. pCfCC59. pCfCD28 og pCfCD56 fjfr. fig. 8) .
Først ble 3 fig pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95 (1977)) oppløst i 40 til Y-100 buffer, 5 enheter av restriksjonsenzymet Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 37°C i 1 time. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 20 til av en oppløsning inneholdende 33 mM Tris-eddiksyre (pH 7,9), 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 5 mM ditiotreitol, og dATP, dCTP, dGTP og dTTP (hver 0,4 mM) (i det følgende benevnt "T4 DNA polymerasebuffer") , l enhet av T4 DNA-polymerase (Takara Shuzo) ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 30 min. DNA utvunnet ved fenol-klorof ormekstraks jon og etanolut fell ing ble oppløst i 2 0 fil T4 DNA-ligasebuffer. Til denne blanding ble det tilsatt omtrent 8 pikomol av Bglll-linker DNA (Takara Shuzo; d(pC-A-G-A-T-C-T-G)). Etter ytterligere tilsetting av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 40 fil Y-100 buffer, 10 enheter av restriksjonsenzymet EcoRI og 8 enheter av Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,9 iig av et tetracyklinresistens-gendel-holdig DNA-fragment på omtrent 3,6 kb (EcoRI-Bglll-fragment).
Separat ble 3 .iig av pCfBBlOl oppnådd i eksempel 6-(2), pCfBC52 eller pCfBC59 oppnådd i eksempel 6-(3) eller pCfBD28 eller pCfBD56 oppnådd i eksempel 6- (4) oppløst i 10 ganger konsentrert Y-100 buffer, 5 enheter av restriksjonsenzymet EcoRI og 6 enheter Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,4 /ig av et HG-CSF cDNA-del-holdig DNA-fragment på omtrent 1,8 kb (EcoRI - Bglll-fragment) i hvert tifelle.
Fem rør som hvert inneholdt en oppløsning av omtrent 0,05 /ig av det pBR322-avledede EcoRI-BGlII-fragment (omtrent 3,6 kb) oppnådd som beskrevet ovenfor i 20 fil T4 DNA-ligasebuf fer ble fremstilt. Til rørene ble det tilsatt omtrent 0,1 fig av det pCfBBlOl-, pCfBC52-, pCfBC59-, pCfBD28-eller pCfBD56-avledede EcoRI-Bglll- fragment (omtrent 1,8 kb fragment} og etter ytterligere tilsetning av 4 enheter av T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
De rekombinante plasmidblandinger som ble oppnådd ble anvendt for å transformere E. coli HB101, og Tc<r->kolonier ble oppnådd. Fra dyrkede celler av.hver av disse kolonier ble plasmid-DNA utvunnet. Det ble således oppnådd pCfCBlOl, pCfCC52,. pCfCC59, pCfCD52 og pCfCD56, hver vist i fig. 8. Aminosyresekvensene av hG-CSF-derivatene som kodes for av disse plasmider er identiske med aminosyrene av de hG-CSF-derivater som kodes' for av henhv. pCfBBlOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD2 8 og pCfBD56.
Eksempel 8
Fremstilling og rensing av hG-CSF-derivater.
E. coli W3110 strA-avledede transformanter (benevnt ECfTL23, ECfTL3S, ECfTL38, ECfTL41, ECfTM14, ECfTM17, ECfTM113, ECfBBlOl, ECfBC42Bl, ECfBC45, ECfBC52, ECfBC59, ECfBC76, ECfBC77, ECfBC93, ECfBC95, ECfBC97, ECfBD28, ECfBD56, ECfBD82, ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301, ECfTNS401, ECfTNSSOl, ECfBD28A17 og ECfBD28T17) som inneholdt de rekombinant plasmider (oppnådd i eksemplene 3, 4, 6 og 7) hhv. pCfTL2 3, pCfTL3 5, pCfTL3 8, pCfTL41, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfBBlOl, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTNS7, pCfAArg4S, pCfTNS301, pCfTN401, pCfTNSSOl, pCfBD28Al7 og pCfBD28T17 ble hver dyrket i LG medium (fremstilt ved oppløsning av 10 g Bactotrypton, 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl og 1 g glukose i 1 liter vann og innstilling av pH til 7,0 med NaOH} ved 37°C i 18 timer. En 5 ml porsjon av dyrkingsvæsken ble inokulert i 100 ml MCG-medium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,5% NaCl, 0,5% casamino-syrer, 1 mM MgS04, 4 ptg/ml vitamin Bx, pH 7,2) inneholdende 2 5 itg/ml tryptofan og 50 itg/ml ampicillin. Etter inkubasjon ved 3 0°C i 4-8 timer ble 10 fig/ ml 3 p-indol akryl syre (i det følgende IAA) , et tryptofan-indukksjonsmiddel, tilsatt og inkubasjon ble fortsatt i ytterligere 2-12 timer. Celler ble høstet ved å underkaste dyrkingskulturen for sentrifugering ved 8000 omdr./min. i 10 min. og vasket med 3 0 mM NaCl-3 0 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5). De vaskede celler ble suspendert i 30 ml av den ovennevnte buffer og deretter knust ved ultralydbehandling ved 0°C (BRANSON SONIC POWER COMPANY'S SONIFIER CELL DISRUPTOR 200, Output Control 2, 10 min.). Sentrifugering ved 9000 omdr./min. i 30 min. ga en cellerest-masse. Under anvendelse av metoden til Marston et al. (F.A.O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2 800 (1984)), ble hG-CSF-derivatet ekstrahert fra cellerestmassen, renset, oppløselig-gjort og regenerert. Proteinmengden ble bestemt ved å anvende "Nippon Bio-Rad laboratories<1> protein assay" bestemmelsessett (standard assaymetode) (M.M. Bradford: Anal. Biochem., 72,
248 (1976)) .
G-CSF-aktiviteten ble bestemt på følgende måte. Benmargceller ble aseptisk samlet fra lårbenet fra C3H/He hannmus som var 8-12 uker gamle (Shizuoka Laboratory Animal Center)
og suspendert i a-MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Nylonull (Wako Pure Chemical Industries, Nylon Fiber 146-04231) (0,3 g) pakket i en kolonne ble impregnert med 1,5 ml av denne cellesuspensjon (omtrent 5 x IO<7> celler) , og reaksjonen fikk foregå i en 5% C02 inkubator ved 37°C i 90 min. Deretter ble a-MEM som var oppvarmet til 37°C på forhånd passert gjennom kolonnen og benmargceller som var uadsorberte på nylonullen ble oppnådd som en effluentfraksjon. Disse celler ble vasket en gang med a-MEM og innstilt til en forutbestemt konsentrasjon.
Deretter ble den myelopoetiske stamcelle-kolonidannende evne bestemt ved hjelp av metoden til Okabe et al. (Okabe, T. et al.: Cancer Research, 44 4503-4506 (1986)). Således ble 0,2 ml av margcellesuspensjonen fremstilt som ovenfor (2 x 10e celler/ml) blandet sammen med en blanding av 0,2 ml a-MEM, 0,4 ml FBS og 0,2 ml av hver 2-ganger fortynnet prøve. Et like stort volum (1,0 ml) av 0,6% agar (Difco, Agar renset nr. 0560-01) oppvarmet til 42°C ble blandet med blandingen og hele blandingen ble fordelt i 0,5 ml porsjoner i brønner på en 24-brønns plate (Munc's Multidish nr.143982) (5 x IO<4 >celler/brønn, n=3). Etter inkubasjon i en 5% C02 inkubator ved 37°C i 7 døgn ble kolonier som hver omfattet minst 4 0 celler talt under et mikroskop (Olympus x40). Etter kolonitellingen ble celler tatt ut på en glassplate med forsiktighet og fiksert med en aceton-formalin-blandet oppløsning i 30 sek. Etter esterase-dobbeltfarging av cellene ved hjelp av metoden til Kubota et al. (Kubota, K. et al.: Exp. Hematology, 8, 339-344 (1980)), ble hver koloni identifisert.
Potensen av hver prøve ble beregnet på basis av resultatet av tellingen for 2-ganger fortynningen i kolonidannelsesbestem-melsen på følgende måte. Aktiviteten som gir halvparten av den maksimale kolonidannelsesverdi for intakt G-CSF anvendt som standard ble definert som 50 enheter. Potensen' (i enheter) ble beregnet ved å multiplisere med 20, inklusive fortynningsfaktoren for hver prøve, for omdannelse til aktivitet pr.■milliliter. Den spesifikke aktivitet ble uttrykt som potens pr. vektenhet (mg) protein og følgelig i enheter/mg.
Potensene av intakt G-CSF og G-CSF derivater er vist i tabell 3 .
Eksempel 9
Måling av aktiviteter av hG- CSF- derivater i forhold
til humane benmaraceller
Benmarg ble samlet fra hoftebenet til normale mennesker med alder 20-30 år. Et like stort volum a-MEM ble tilsatt dertil og blandet med benmargen. 4 ml av benmargen ble lagt på 3 ml Ficoll-Paque-oppløsning (Pharmacia Fine Chemicals, spesifikk vekt 1,077) og etter sentrifugering ved 400 x g i 30 min. ble cellene som forekom i midtlaget separert. Cellene ble vasket to ganger med- PBS (fremstilt ved å oppløse 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na 2HP04 °9 °'2 9 KH2P04 i vann til å danne l liter oppløsning) og deretter suspendert i a-MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og cellekonsentrasjonen ble innstilt til høyst 2 x IO<6> celler/ml. En 10 ml porsjon av cellesuspensjonen ble anbragt i en plastskål (Falcon 3003) og inkubert i en 5% CO 2 inkubator ved 37°C i 90 min. Celler som var uadsorbert i plastskålen ble samlet, vasket en gang med a-MEM og etter innstilling av konsentrasjonen til et forut bestemt nivå, ble de underkastet human myelopoetisk stamcelle-vekstfremmende aktivitets- og kolonidannelses-tester. Således ble 10% FBS-supplert a-MEM fordelt i 100 [ il porsjoner i brønner i en 96-brønns.plan mikroplate (NUNC, 167 008) . Deretter ble prøver av hG-CSF og hG-CSF-derivater oppnådd ved metoden i eksempel 8 tilsatt i 100 [ Li porsjoner til brønner i den første rad. Etter grundig blanding ble 100 fil av hver blanding overført til en brønn i den andre rad for fremstilling av en 2-ganger fortynning. Dobbeltfortynning ble fortsatt på samme måte inntil den 12. rad (n=3). I en gruppe ble a-MEM alene anvendt som en negativ kontroll.
Deretter ble 100 [ il (5 x 10<4> eukaryotiske celler) av benmargscellesuspensjonen fremstilt som beskrevet i det foregående utsådd i hver brønn. Inkubasjon ble gjennomført i en 5% C02-inkubator ved 37°C i 3 døgn. Under 20 timers perioden som gikk foran de siste 18 timer, ble 20 [ il 6-<3>H-tymidin (Amersham Japan, kode TRK61, 107 mci/mg) tilsatt. Celler ble isolert på et glassfilter under anvendelse av en cellehøster (Labo-Science), tørket og målt med hensyn til radioaktivitet opptatt av cellene under anvendelse av en væskescintillasjonsteller (Packard, Tricarb 3320).
På den annen side ble den humane myeolopoetiske stamcelle-kolonidannelsesbestemmelsen og koloniidentifiseringen gjennomført som beskrevet i eksempel 8.
For å beregne potensen av hver prøve ble aktiviteten som kunne bevirke dannelse'av en koloni definert som en enhet. Således ble halv maksimal verdi (halvparten av den maksimale opptagningsverdi) bestemt basert på dose-responskurven som viste linearitet for resultatene ved tellingen i dobbelt-fortynningsrekken, og potensen av hver prøve ble beregnet.
Den spesifikke aktivitet ble uttrykt som potens pr. vektenhet (mg) protein, dvs. i enheter/mg.
Potensene for intakt hG-CSF og hG-CSF-derivater er vist i tabell 4.
Eksempel XQ
Fremstilling av hG- CSF- derivat som mangler de N- terminale 1. til 7. aminosyrer oa med serin som 17. a minosyre fi det følgende benevnt M- 7S)
Til 50 ml 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (a) vist i tabell 2 (132 fig/ ral) som oppnådd ved dyrking av E. coli-stammen (ECfBC59) som inneholdt det rekombinante plasmid pCfBC59 oppnådd i eksempel 6, etterfulgt av rensing, ble det tilsatt 0,7 iig subtilisin BPN' (8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter 3-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toypearl 650M (Toyo Soda Manufacturing) kolonne (1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i en strøm-ningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen med en strømnings-takt på 5 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et buffersystem av 10 mM Tris-HCl som viste en lineær NaCl-konsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,4 M ved den samme strømningstakt (totalt eluentvolum 50 ml). M-7S-derivåtet ble eluért ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 mM (utbytte 0,7 mg eller 10%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 11
Fremstilling av M-7S
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (b) vist i tabell 2 (132 iig/ml) som oppnådd ved dyrking av E. coli stammen (ECfBC59) som inneholdt det rekombinante plasmid pCfBC5 9 oppnådd i eksempel 6, fulgt av rensing, ble det tilsatt 0,7 iig subtilisin BPN'
(8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 2 5°C i 14 timer. Etter 3-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toyopera1 650M (Toyo Soda Manufacturing) kolonne (1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) med en strøm-ningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen med en strømningstakt på 5 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført fra 0 M til 0,4 M ved samme strømningstakt (totalt eluentvolum 50 ml). M-7S-derivatet ble eluert ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 mM (utbytte 4,2 mg éller 63%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 3.2
Fremstilling av M- 7S
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (d) vist i tabell 2 (132 iig/ml) som oppnådd ved dyrking av E.■coli-stammen (ECfTAArg4) som inneholdt det rekombinante plasmid pCfTAArg4 oppnådd i eksempel 6, etterfulgt av rensing, ble det tilsatt 0,7 fig subtilisin BPN' (8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjonen ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen med en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum på 30 ml 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl-buffer på en lineær pH-gradient fra 8,0 til 6,0 ved den samme strømningstakt. M-7S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 (utbytte 0,6 mg eller 9%) . Renheten var minst 90%.
Eksempel 13
Fremstilling av hG- CSF derivat som mangler de N- terminale
1. til 6. aminosyrer oa som har serin som 17.
aminosyre fi det følgende benevnt M-6S)
Til 50 ml av en oppløsning av derivatet (a) vist i tabell 2 (132 iig/ml) i 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl (pH 8,0), tilsettes 0,7 ttg subtilisin BPN' (8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 2 timer. Etter tre-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toyopearl 650M (Toyo Soda) kolonne (1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ved en strømningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen ved en strøm-ningstakt på 5 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 50 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) som viste en lineær NaCl-konsentrasjonsgradient fra . 0 M til 0,4 M ved den samme strømningstakten. M-6S derivatet ble eluert ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 mM (utbytte 2,6 mg eller 4 0%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 14
Fremstilling .av M-6S
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (a) vist i tabell 2 (132 iig/ml) ble det tilsatt 0,7 fig' "Epolozyme" (4120 enheter/mg protein)
(Kyowa Hakko Kogyo) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M, ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 30 ml 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl-buffer på en lineær pH-gradient på fra 0,8 til 6,0 ved den samme strømningstakt. M-6S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 (utbytte 2,5 mg eller 38%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 15
Fremstilling av M- 6S
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (b) vist i tabell 2 (132 iig/ml) ble det tilsatt 0,7 /ig subtilisin amylosacchalyticus, og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8.,0)-0,5 M NaCl passert gjennom kolonnen med en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 3 0 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0}-0,5.M NaCl-buffer på en lineær pH-gradient på fra 8,0 til 6,0 ved samme strømningshastignet. M-6S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 {utbytte 2,5 mg eller 38%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 16
Fremstilling av M-6S
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM KaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet {d) vist i tabell 2 (132 itg/ml) ble det tilsatt 0,7 itg subtilisin Carlsberg {0,034 enhet/mg protein) (NOVO), og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum på 30 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl som viste en lineær pH-gradient på fra 8,0 til 6,0 ved samme strømningstakt. M-6S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 (utbytte 3 mg eller 45%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 17
Fremstilling av M-6S
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (a) vist i tabell 2 (132 iig/ml) tilsettes 0,7 jig proteinase K (0,027 enhet/mg protein)
(Sigma), og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter 3-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl {pH 8,0)
ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toyopear1 65OM (Toyo Soda) kolonne {1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ved en strømningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 5 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum av 50 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og viste en lineær NaCl-konsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,4 M ved den samme strømningstakt. M-6S-derivatet ble eluert ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 tnM (utbytte 2,6 mg eller 39%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 18
Fremstilling av hG-CSF-derivat som mangle r de N- terminale l. til 5. aminosyrer og som har ser in som 17. amino-
syre ( i det følgende benevnt M- 5S)
Til 50 ml av en 100 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning {pH 8,0) inneholdende derivatet (b) vist i tabell 1 (132 iig/ml) tilsettes 0,5 iig trypsin {267 enheter/mg protein) {Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 10 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M, ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 30 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl som viste en lineær imidazol-konsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,3 M ved den samme strømningstakt. M-5S derivatet ble eluert ved 0,1 M imidazol (utbytte 2,7 mg eller 41%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 19
Fremstilling av hG- CSF- derivat som mangler de N- terminale 1. til 4. aminosyr er og som har serin som 17. amino-
syre ( i det følgende benevnt M- 4S)
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (d) vist i tabell 1 (132 fig/ ml) ble det tilsatt 5 fig trypsin (267 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum på 3 0 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl som viste en lineær imidazolkonsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,3.M ved den samme strømningstakt. M-4S-derivatet ble eluert ved 0,1 M imidazol {utbytte 2,7 mg eller 41%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 2 0
Fremstilling av M-4S
Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (d) vist i tabell 2 (132 /ig/ml) ble det tilsatt 5 iig a-chymotrypsin (267 enheter/mg protein)
(Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med totalt 30 ml
av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl som viste en lineær imidazolkonsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,3 M ved den samme strømningstakt. M-4S-derivatet ble eluert ved 0,1 M imidazol (utbytte 2,3 mg eller 35%). Renheten var minst 90%.
Eksempel 21
Som det fremgår fra eksemplene 10-2 0 kan det oppnås hG-CSF-derivater som har serin som en erstatning for den 17. aminosyre og som mangler 4 (M-4S), 5 (M-5S), 6 (M-6S) og 7 (M-7S) N-terminale aminosyrer. Anvendelse av rekombinant DNA-teknologi resulterer generelt i addisjon av metionin til den N-terminale ende, og dette er ett av de ufordelaktige trekk ved rekombinante produkter. I motsetning til dette er bruken av den enzymatiske spaltningsteknikk i samsvar med oppfinnelsen fordelaktig ettersom slike produkter kan fremstilles uten addisjon av metionin til den N-terminale ende. Derivatene oppnådd på denne måte ble analysert med hensyn til G-CSF-aktivitet for sammenligning. Resultatene som ble oppnådd er vist i tabell 5.
Tabell 5
Aktivitetssammenligning blant G-CSF-derivater dannet ved den enzymatiske kuttingsteknikk.
Fra resultatene vist i tabell 5 ble det funnet at ved den ovennevnte in vitro bedømmelse, har derivatene som mangler de 4-7 N-terminale aminosyrer en 2-4 ganger høyere aktivitet sammenlignet med intakt hG-CSF.
Derivatene som mangler de N-terminale aminosyrer som kan fremstilles i samsvar med den foreliggende oppfinnelse har derfor ikke noe metionin addert til den N-terminale ende og har 2- til 4 ganger høyere aktivitet enn det intakte produkt.
De følgende testeksempler illustrerer mottakelighet for spaltning med hydrolytiske enzymer som et resultat av mutasjon i den N-terminale del.
Testeksempel 1
Sammenli<g>nin<g> i reaktivitet med subtilis in Carlsberg mellom intakt hG- CSF og N-terminale mutanter av hG-CSF
Derivatene vist i tabell 2 og intakt hG-CSF ble hver inkubert i nærvær av 3,6 x 10~<4> enheter/mg G-CSF av subtilisin Carlsberg {NOVO) ved 25°C i 14 timer på samme måte som i eksempel 16. Mens derivatene vist i tabell 2 ga M-6S derivatet, forble intakt hG-CSF ureagert. Videre, selv når dette enzym ble anvendt i en 100-ganger så stor mengde (3,6 x IO"<2> enheter/mg G-CSF), frembragte det intakte produkt ikke fli-es, men undergikk foretrukket totale spaltningsreaksjoner.
Testeksempel 2
Sammenligning i reaktivitet med tr<yp>sin mellom intakt hG- CSF oa N-terminale mutanter av hG-CSF
Derivatet (a) vist i tabell 2 og intakt hG-CSF ble hver inkubert i nærvær av 0,22 enheter/mg G-CSF av trypsin (Sigma) ved 25°C i 20 timer. Mens derivatet (a) vist i tabell 2 ga M-4S derivatet, forble.det intakte hG-CSF ureagert. Videre, selv når enzymet ble anvendt i en 100-ganger så stor mengde (22 enheter/mg G-CSF) ga det intakte hG-CSF ikke M-4S, men undergikk foretrukket totale spaltningsreaksjoner.
Testeksempel 3
Varmestabilitet av hG- CSF derivater
En 2 0 /xg porsjon av hvert av de forskjellige derivater vist i tabell 6 ble oppløst i l ml fosfatbufret fysiologisk salt-løsning (PBS) (pH 7,2) eller a-MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkubasjon ble gjennomført ved 56°C og prøver ble samlet ved tidsbestemte mellomrom og analysert for CSF aktivitet ved kolonidannelsestesting under anvendelse av mus-benmargceller (den ovennevnte metode til Okabe et al.). Hver prøve ble fortynnet ved dobbelt-fortynningsmetoden fra 4 0 mg/ml til å gi 10 fortynningsnivåer. For hvert nivå ble aktivitetsbestemmeIser gjennomført og restaktiviteten ble bestemt ved å sammenligne aktiviteten ved en viss konsentrasjon med god dose-respons, med tilsvarende for oppvarming (0 min.).
Data for restaktiviteten (tilsvarende den termiske stabilitet) oppnådd i PBS og i 10% FBS supplert a-MEM er vist i hhv. tabell 6 (A) og tabell 6(B).
Eksempel 23
Konstru ksjon av pCfBD2 8A17 oa CfBD28T17 under anvendelse av setespesifikk mutagenese (jfr, f ig. 17) (a) Konstruksjon av enkelttrådet templat DNA■(enkelttrådet
ptl9BD28N).
I 50 til Y-10 0 buffer ble det oppløst 3 fig pCfBD28 oppnådd ved .prosedyren i eksempel 6-(4), 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og Pstl ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,1 /ig av et omtrent 210 bp DNA-fragment {Banlll-Pstl fragment) som kodet for den N-terminale del av hG-CSF-derivatet (ND2 8).
Separat ble l. fig av M13 fagvektor M13mpl9RF DNA (Takara Shuzo) oppløst i totalt 50 fil Y-50 buffer, 10 enheter av restriksjonsenzymet AccI (Toyobo) ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en NaCl-konsentrasjon på 100 mM, 10 enheter av restriksjonsenzymet Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,8. iig av et DNA-fragment på omtrent 7,24 kb {Accl-Pstl fragment).
I 50 fil av T4 DNA ligasebuffer ble det oppløst 0,2 itg av Banlll-Pstl fragmentet (omtrent 210 bp) og 0,05 /tg av Accl-Pstl fragmentet (omtrent 7,24 kb) , hvert oppnådd som beskrevet i det foregående. T4 DNA ligase (10 enheter) ble tilsatt til blandingsoppløsningen og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 12°C i 16 timer.
Deretter ble den ovennevnte reaksjonsblanding anvendt for transfeksjon av E. coli JM105 ved hjelp av en kjent metode.
På denne måte ble det oppnådd en rekombinant fag. Fra dyrkede celler av en E. coli JMlOS-avledet transformant infisert med den rekombinante fag, ble det utvunnet rekombinant M13 fag RF DNA. Strukturen av dette RF DNA (i det følgende benevnt ptl9BD2 8N) ble bekreftet ved kutting med Pstl, EcoRI, Aval og Xhol etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. Deretter ble det enkelttrådede ptl9BD28N utvunnet fra den rekombinante fag ved hjelp av en kjent metode og anvendt som et templat.
(b) Konstruksjon av åpnet dupleks DNA
I 30 /il Y-100 buffer ble det oppløst 3 fig av M13mpl9 RF DNA (Takara Shuzo), 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene EcoRI og Hindlll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 2,5 fig av et DNA-fragment på omtrent 7,2 kb (EcoRI-HindiII-fragment). Dette Ml3mpl9 RF DNA-avledede EcoRI-Hindlll-fragment (omtrent 7,2 kb) og 1 /tg av det enkelttrådede templat-DNA ptl9BD28N oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt ble oppløst i 27 fil Klenow buffer' og DNA-denaturer ing ble gjennomført ved koking ved 10 0°C i 6 min. Deretter fikk blandingen stå ved 65°C i 10 min., ved 37°C i. 40 min., ved 4°C i 40 min. og i is 10 min. for å bevirke at annealingreaksjonen fortsatte, hvorved et åpnet dupleks DNA ble tildannet hvori G-CSF gendelen alene i templatet var enkelttrådet. Det således dannede åpnede dupleks DNA ble gjenvunnet ved hjelp av LGT-metoden .
(c) Mutagenese (konstruksjon av ptl9BD28NA17 og ptl9BD2 8NT17)
Et enkelttrådet DNA (D-l) nødvendig for å substituere Ala for den 17. aminosyre (fra den N-terminale ende), nemlig Ser, av hG-CSF-derivatet (ND28) oppnådd i eksempel 6 og et.enkelttrådet DNA (D-2) nødvendig for å substituere Thr for Ser ble syntetisert ved hjelp av den ordinære fosfotriestermetode. Basesekvensene av D-l (33-mer) og D-2 (33-mer) er vist i det følgende:
Utforming av de ovennevnte DNA<1>er er slik at mutagenese under anvendelse av D-l kan bevirke dannelse av et nytt Stul-sete og mutagenese under anvendelse av D-2 kan gi anledning til et nytt Xbal-sete. Mutanter kan derfor identifiseres ved kutting med disse restriksjonsenzymer.
D-l og D-2 ble hver individuelt oppløst i en mengde av 1 fig, i 50 fil T4 kinasebuffer, 30 enheter T4 polynukleotidkinase ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,2 fig av det fosforylerte D-l eller D-2 og 0,1 fig av det åpnede dupleks DNA oppnådd som beskrevet i åpnings-avsnittet oppløst i 34 fil buffer inneholdende 6,5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoe'tanol og 100 mM NaCl, oppløsningen fikk stå ved 65°C i 60 min. og deretter ved romtemperatur i 30 min. hvorved D-l eller D-2 ble annealet med- det åpnede dupleks DNA.
Til oppløsningen ble det tilsatt dATP, dTTP, dCTP og dGTP hver til en konsentrasjon på 0,5 mM. Etter ytterligere tilsetning av 1,5 enheter DNA polymerase I Klenow-fragment og 10 enheter T4 DNA-ligase, ble forlengelsesreaksjonen gjennomført ved 4°C i 16 timer.
Den således oppnådde reaksjonsblanding ble anvendt for transfeksjon av E. coli JM105 og mutantfager ble oppnådd.
RF DNA'er ble utvunnet fra de mutantfag-infiserte E. coli JM105 transformanter og identifisert ved kutting med Aval, Xhol og Stul (når D-l ble anvendt) eller med Xbal (når D-2 ble anvendt), etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. RF DNA med mutasjon innført deri ved hjelp av D-l betegnes ptl9BD2 8NA17 og RF DNA med mutasjon innført deri ved hjelp av D-2 betegnes ptl9BD28NTl7. Basesekvensene i ptl9BD28NA17 og ptl9BD28NTl7 i nærheten av hhv. Stul-setet og Xbal-setet ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden ved anvendelse av M13 fag til å være som følger:
(d) Konstruksjon av pCfBD28A17 og pCfBD28T17
I 50 ul Y-100 buffer ble det oppløst 3 ug ptl9BD28NAi7 eller ptl9BD2 8NTl7 oppnådd som beskrevet ovenfor, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Aval og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,05 iig av et omtrent 110 bp DNA-fragment inneholdende mutasjonssetet innført som beskrevet i det foregående avsnitt (Aval-Xhol-fragment).
Separat ble 2 iig pCfBD28 oppnådd i eksempel 6-(4) oppløst i 50 ul Y-100 buffer,' 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Xhol og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1 ag av et tryptofan-promoter del-holdig DNA-fragment på omtrent 2,74 kb (Xhol-Bglll-fragment).
Ytterligere og separat ble 2 ug pCfBD28 oppløst i 50 ul Y-100 buffer, 10 enheter av restriksjonsenzym Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Etter bekreftelse av fullstendig Bglll-kutting ved hjelp av agarosegelelektroforese ble 5 enheter av restriksjonsenzymet Aval tilsatt og delvis kutting ble gjennomført ved 37°C i 10 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,4 ug av et omtrent 1,2 9 kb DNA-fragment (Bglll-Aval-fragment) inneholdende det meste av det modne hG-CSF cDNA med {pp-terminatordelen.
Deretter ble 0,1 iig av det pCfBD2 8-avledede Xhol-Bglll-fragment (omtrent 2,74 kb), det pCfBD28-avledede Bglll-Aval-fragment (omtrent 1,29 kb) og 0,02 ug av ptl9BD28NAl7 eller ptl9BD28NTl7 avledet Aval-Xhol-fragment (omtrent 110 bp) oppløst i 60 ul T4 DNA-ligase, 10 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt .og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 12°C i 16 timer.
Den således oppnådde reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Plasmid-DNA ble utvunnet fra dyrkede celler av denne koloni. Plasmidet konstruert ved å anvende ptl9BD28NA17 betegnes pCfBD2 8Al7 og plasmidet konstruert ved anvendelse av ptl9BD28NTl7 betegnes pCfBD28Tl7. Strukturen av pCfBD28A17 ble bekreftet ved kutting med Aval, Xhol, Bglll og Stul, etterfulgt av agarosegelelektroforese. Strukturen av pCfBD2 8T17 ble bekreftet ved spaltning med Aval, Xhol,Bglll og Xbal, etterfulgt av agarosegelelektroforese.
De erstattende aminosyrerester i hG-CSF-derivatene som kodet for av disse to plasmider sammenlignet med intakt hG-CSF er som følger:
hG-CSF-derivatene som kodes for av pCfBD28A17 og pCfBD28T17 betegnes i det følgende hhv. hG-CSF(ND2 8A17) og hG-CSF (ND28T17) .
Undereksempel 1
Isolasjon av det hG-CSF cDNA-bærende plasmid pCSFl-2
(1) Fremstilling av poly(A) RNA fra makrofag fra normalt humant periferisk blod
Makrofager, som er adherente celler, ble isolert ved dyrking av leukocytter oppnådd ved sentrifugering av normalt humant periferisk blod i en plastflaske og ved å fjerne ikke-adherente celler ved vasking. Et RNA med' poly{A) ble fremstilt fra makrofagene ved hjelp av guanidintiocyanatlitiumkloridmetoden (Cathala et al.: DNA, 2, 329 (1983)) på følgende måte.
Normalt human periferisk blod (400 ml) ble .sentrifugert
på en Hitachi RPRlO-rotor ved 1.800 omdr. pr. min. i 20 min.
Det resulterende blodcellepresipitat ble suspendert i 50 ml fosfatbufret saltløsning (8 g/liter NaCl, 0,2 g/liter KCl, 1,15 g/liter vannfritt Na2HP04, 0,2 g/liter KH2P04 (pH 7,2) i det følgende forkortet PBS). En'25 ml porsjon av denne suspensjon ble lagt som et lag på 2 5 ml lymfocyttseparasjons-væske (BIONETICS), og det hele ble sentrifugert på en Hitachi RPR10 rotor ved 1.800 omdr. pr. min. i 30 min. Leukocytter i midtlaget ble samlet, vasket med et like stort volum PBS (på en Hitachi RPR10 rotor ved 1.500 omdr. pr. min. i 10 min.), deretter suspendert i 20 ml RPMI 1640 medium (Nissui Seiyaku) inneholdende 5% føtalt bovint serum, og dyrket under anvendelse av en vevsdyrkingskolbe (Corning). Etter dyrking ved 3 7°C i 1,5 time ble dyrkingssupernatanten fjernet sammen med ikke-adherente celler. En nylaget 2 0 ml porsjon av samme medium og E. coli-avledet lipopolysakkarid (LPS) (i en mengde til å gi en konsentrasjon på 0,3 mg/ml) ble tilsatt, og dyrking ble fortsatt ved 37°C i ytterligere 4 timer. Deretter ble celler høstet fra kulturen ved sentrifugering ved 1.10 0 x g ved 4°C i 10 min., vasket med 80 ml PBS og oppløseliggjort i 10 ml av en oppløsning omfattende 5 M guanidintiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7) og 8% (volum/volum) 2-merkaptoetanol under anvendelse av en hvirveIblander. Dette oppløseliggjorte produkt ble overført til et sentrifugerør, 8 0 ml 4 M LiCl ble tilsatt og blandingen ble omrørt og fikk deretter stå ved 4°C i 20 timer og sentrifugert på en Hitachi RPR10 rotor ved 9.000 omdr. pr. min. i 90 min. Deretter ble et RNA-presipitat utvunnet. RNA-presipitatet ble suspendert i 50 ml av en oppløsning omfattende 4 M urea og 2 M litiumklorid og suspensjonen ble sentrifugert på en Hitachi RPR 10 rotor ved 9.000 omdr. pr. min. i 60 min. og et RNA-presipitat ble på nytt utvunnet.
RNA-presipitatet ble oppløst i 10 ml av en oppløsning omfattende 0,1% natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og RNA ble utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling. Det oppnådde RNA (omtrent 0,8 mg) ble oppløst i 1 ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Etter inkubasjon ved 65°C i 5 min. ble 0,1 ml 5 M NaCl tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo (dT)-cellulosekolonne (P-L Biochemicals) kromatografi (kolonnevolum 0,5 ml). Det adsorberte, poly(A)-holdige mRNA ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA til å gi omtrent 30 ug poly (A)-holdig mRNA. (2) cDNA-syntese og innføring av DNA i en vektor Okayama-Berg-metoden (Mol. Cell. Biol. 2, 161, (1982)) ble anvendt for cDNA-syntese og rekombinant plasmidkonstruksjon ved innføring av det oppnådde cDNA. Fremgangsmåtene for dette er skissert i fig. 9.
Til 3 00 ( il av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 10 mM NaCl ble det tilsatt 400 ug pCDVl (Okayama & Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)), og etter ytterligere tilsetning av 500 enheter Kpnl, ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 6 timer, hvorved plasmidet ble spaltet ved Kpnl-setet. DNA ble utvunnet ved fenol-kloroform-ekstraks jon og etanolutfelling. Omtrent 200 ug av det Kpnl-kuttede DNA ble tilsatt til 200 ( il av en oppløsning fremstilt ved å tilsette dTTP i en konsentrasjon på 0,25 mM til en buffer (i det følgende forkortet TdT-buffer) omfattende 4 0 mM natriumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl2 og 0,1 mM ditiotreitol (i det følgende forkortet som DTT) og etter ytterligere tilsetning av 81 enheter terminal deoksy-nukleotidyltransferase (i det følgende forkortet som TdT) (P-L Biochemicals), ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 11 min., hvorved en poly(dT)-kjede omfattende omtrent 67 dT-rester ble addert til hver Kpnl-kuttingssete 3<1->ende av pCDVl. Omtrent 100 ug av det poly(dT)-kjede-adderte pCDVl DNA ble utvunnet fra den ovennevnte reaksjonsblanding ved fenol-klorof ormekstraks jon og etanolutfelling. DNA ble tilsatt til 150 ul av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 100 mM NaCl, 360 enheter EcoRI ble ytterligere tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble behandlet ved hjelp av LGT-metoden og et DNA-fragment på omtrent 3,1 kb ble utvunnet. Det ble således oppnådd omtrent 60 ug av poly(dT) kjede-forlenget pCDVl. DNA ble oppløst i 100 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl CpH 8,0) og 1 mM EDTA, oppløsningen ble inkubert ved 65°C i 5 min. og deretter avkjølt med is, og 50 gl 5 M NaCl ble tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo(dA)-cellulose-kolonne-kromatografering (Collaborative Research) . Molekyler med en tilstrekkelig poly(dT) kjede-lengde ble adsorbert på kolonnen og de ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og l mM EDTA. Det ble således oppnådd 2 7 ug av det poly{dT) kjedeforlengede pCDVl (i det følgende forkortet som vektor-primer).
Deretter ble et linker-DNA syntetisert.
Til 200 ul av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl ble det tilsatt omtrent 14 fig pLl (Okayamafc Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 28 0 (1983)), 50 enheter Pstl ble ytterligere tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 4 timer, hvorved pLl DNA ble kuttet ved Pstl-setet. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon, etterfulgt av etanolutfelling, hvorved omtrent 13 fig av det Pstl-kuttede pLl DNA ble utvunnet. DNA (omtrent
13 ug) ble tilsatt til 50 ul av TdT-buffer supplert med dGTP i en sluttkonsentrasjon på 0,25 mM, 54 enheter av TdT (P-L Biochemicals) ble ytterligere tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 3 7°C i 13 min., hvorved en dG-kjede inneholdende omtrent 14 dG-rester ble addert til pLl ved hver 3'-ende ved Pstl-kuttingssetet. DNA ble utvunnet ved fenol-kloroform-ekstraks jon etterfulgt av etanolutfelling. DNA ble tilsatt til 100 ul av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM enheter av Hindlll ble ytterligere tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 3 timer, hvorved pLl DNA ble kuttet ved Hindlll-setet. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved hjelp av agarosegelelektroforese og et DNA-fragment på omtrent 0,5 kb ble utvunnet ved hjelp av DEAE-papirmetoden (Dretzen et al., Anal. Biochem., 112, 295
(1981)). Det ble således oppnådd oligo(dG) kjedeforlenget linker-DNA (i det følgende enkelt benevnt linker-DNA).
I 22,3 fil av en oppløsning omfattende 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM' MgCl2, 30 mM KCl, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP og dCTP) og 10 enheter ribonukleaseinhibitor (P-L Biochemicals), ble det oppløst omtrent 3 ug poly(A) RNA og omtrent 1,4 ug av vektor-primeren, hver fremstilt som beskrevet i det foregående, 10 enheter av revers transkriptase (Seikagaku Kogyo) ble tilsatt, og mRNA ble bragt til å syntetisere et DNA komplementært dertil ved inkubasjon av blandingen ved 4l°C i 90 min. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og vektor-primer DNA med RNA-DNA dobbelttråden addert dertil ble utvunnet ved hjelp av etanolutfelling. Dette DNA ble oppløst i 20 ul TdT-buffer inneholdende 66 um dCTP og 0,2 jag poly (A), 14 enheter av TdT (P-L Biochemicals) ble tilsatt og blandingen ble inkubert ved 37°C i 2 min. hvorved en (dC) - kjede inneholdende 20 dCrester ble addert til 3'-enden av cDNA. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og (dC)-kjedeforlenget cDNA-vektor-primer-DNA ble utvunnet ved etanolutf elling. DNA ble oppløst i 400 fil av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, 2 0 enheter Hindlll ble tilsatt og inkubasjon ble gjennomført ved 37°C i 2 timer for å bevirke kutting ved Hindlll-setet. Fenol-kloroformekstraksjon av reaksjonsblandingen og etterfølgende etanolutfelling ga 0,5 pikomol av
(dC)-kjedeforlenget cDNA vektor-primer-DNA. I 100 ul av en oppløsning omfattende i 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl
■ og 1 mM EDTA, ble det oppløst 0,2 pikomol av DNA og 0,4 pikomol av det ovennevnte linker-DNA, og inkubasjonen ble gjennomført ved 65°C, 42°C og 0°C i hhv. 10, 25 og 3 0 min. Et totalt volum på 1.00 0 ul av en reaksjonsblanding ble fremstilt med følgende sammensetning: 2 0 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 TnM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KCl og 0,1 mM fi-NAD. Til dette reaksjonsmedium ble tilsatt 25 enheter av E. coli-avledet DNA-ligase (New England Bio-Labs), og inkubasjonen
ble gjennomført ved. 11°C i 18 timer. Reaksjonsmediet ble supplert med 4 0 #M av hver av dNTP og (3-NAD til å gi en endelig konsentrasjon på 0,15 mM, 10 enheter av E. coli DNA-ligase, 20 enheter av E. coli DNA-polymerase I (P-L Biochemicals) og 10 enheter E. coli ribonuklease H (P-L Biochemicals) ble tilsatt, og inkubasjon ble gjennomført ved 12°C i 1 time og deretter ved 25°C i l time. Den ovennevnte reaksjonsprosedyre bevirket ringslutning av det cDNA-holdige rekombinante DNA og substitusjon av RNA-delen av RNA-DNA dobbelttråden med det tilsvarende DNA. Det rekombinante plasmid i den fullstendige dobbelttrådede DNA-form ble således dannet.
(3) Seleksjon av hG-CSF cDNA-holdig rekombinant DNA
Det rekombinante plasmid oppnådd som beskrevet i (2) ble anvendt for transformering av E. coli C600SF8 ved hjelp av metoden til Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)). Omtrent 9.200 oppnådde kolonier ble fiksert på et nitrocellulosefilter. En stamme som var i stand til sterk assosiering ved 60°C med en probe fremstilt ved merking med <32>p, det 27-base syntetiske DNA 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3' tilsvarende de N-terminale 9 aminosyrer i modent hG-CSF-protein ble isolert av Nagata et al. (Nagata et al., Nature, 319, 415 (1986)) ble selektert (Grunstein-Hogness-metoden, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). Hele basesekvensen av cDNA inneholdt i plasmidet pCSFl-2 som bæres av denne stamme ble bestemt ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag (tabell 1). Som et resultat ble det funnet at cDNA inneholdt i pCSFl-2 koder for hG-CSF.
Denne bakteriestamme er blitt deponert med FRI under betegnelsen E. coli ECSF1-2 (FERM BP-1220) som tidligere 'nevnt.
Undereksempel 2
Isolering og rensin<g> av plasmidet pKYP26
En pKYP26-bærende E. coli-stamrae (E. coli IKYP26 (FERM BP-863)) ble dyrket i 10 ml L-medium (1% Bacto-trypton, 0,5% gjaerekstrakt, 1% NaCl, pH 7,5) inneholdende 50 ug/ml ampicillin ved 37°C i 18 timer. Hele kulturen ble overført til l liter L-medium inneholdende 50 ag/ml ampicillin og dyrket ved 3 7°C. Etter 4 timer ble kloramfenikol tilsatt i en konsentrasjon'på 170 ug/ml og dyrking ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 16 timer. Celler ble høstet ved sentrifugering (5.000 omdr./min., 10 min.), vasket med 0,8% NaCl og suspendert i 20 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og suspensjonen ble avkjølt med is. Lysozym (10 mg/ml, 8 ml) ble tilsatt og etter henstand i is i 10 min. ble 9,6 ml 0,5 M EDTA tilsatt. Etter henstand i is i 10 min. ble 2,3 ml 2% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) tilsatt, etterfulgt av ytterligere henstand i is i l time. Ultrasentrifugering ved 50.000 x g ved 4°C i 1 time ga omtrent 40 ml av en supernatant. Denne supernatant ble innstilt til pH 12,5 ved tilsetning av 3 M NaOH og omrørt forsiktig ved romtemperatur i 10 min. pH ble bragt tilbake til 8,5 ved tilsetning av 2 M Tris-HCl (pH 7,5) etterfulgt av ytterligere omrøring i 3 min. Ved dette tidspunkt var væskevolumet omtrent 55 ml. Et 1/9 volum av 5 M NaCl ble tilsatt og deretter ble fenol-ekstraksjon gjennomført. Et 1/250 volum av 5 mg/ml RNase A (Sigma) ble tilsatt, RNA-nedbrytningsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time, et 1/5 volum av 5 M NaCl ble så tilsatt og et 1/3 volum av 3 0% PEG 60 00 (Nakarai Chemicals) ble tilsatt. Den resulterende blanding fikk stå ved -2 0°C i 2 timer. Det resulterende presipitat ble samlet ved sentrifugering og oppløst i 2 ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA, natriumdodecylsulfat (SDS) ble tilsatt i en konsentrasjon på 0,5%, proteinase K (Sigma) ble tilsatt i en konsentrasjon på 50 ug/ml og den proteolytiske reaksjon ble gjennomført ved
3 7°C i 1 time. Etter tre repetisjoner av fenolekstråksjon ble DNA utvunnet ved kloroformekstraksjon og etanolutfelling og oppløst i l ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. På denne måte kunne 800 fig pKYP26 oppnås.-Strukturen av pKYP2 6 ble bekreftet ved kutting med EcoRI, Kpnl, BamHI, Bglll og Pstl, etterfulgt av agarosegelelektrofores
Undereksempel 3
Isolasjon av human LT cDNA-bærende plasmid pLTl
(1) Fremstilling av poly(A) RNA fra Lukll-celler
Guanidintiocyanatlitiumkloridmetoden (Cathala et al.: DNA, 2, 329 (1983)) ble fulgt for fremstilling av et poly(A)-bærende RNA fra den humane lymfoblastoidcellelinje Lukll på følgende måte: Humane lymfoblastoid Lukll-celler {Berish Y. Rubin et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 6637 (1985)) ble inokulert i 1 liter RPMI 164 0 medium (Nissui SEiyaku) inneholdénde 5% fatalt bovint serum og 1 mM N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-etansulfonsyre (HEPES) i en cellekonsentrasjon på 8 x lo5 celler/ml og dyrket der. En roterende dyrkingskolbe ble anvendt for kulturen. Etter dyrking ved 3 7°C i 48 timer ble celler samlet ved sentrifugering og overført til en ny 1-liters porsjon av RPMI 1640 medium inneholdende 5% føtalt bovint serum og 1 mM HEPES, og dyrking ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 48 timer. Deretter ble celler høstet fra en del (250 ml) av denne cellesuspensjon ved sentrifugering ved 1100 x g ved 4°C i 10 min., vasket med 80 ml fosfatbuffer og solubilisert i 10 ml av en oppløsning omfattende 5 M guanidintiocyanat, 10 mM EDTA, 50- mM Tris-HCl (pH 7) og 8%
(volum/volum) 2-merkaptoetanol under anvendelse av en hvirvelblander. Solubiliseringsproduktet ble overført til et sentrifugerør, 80 ml 4 M LiCl ble tilsatt og blandingen ble omrørt og fikk deretter stå ved 4°C i 20 timer. Etter sentrifugering på en Hitachi RPR10 rotor ved 9.0 00 omdr./ min. i 90 min. ble et RNA-presipitat utvunnet. RNA-presipitatet ble suspendert i 50 ml av en oppløsning omfattende 4 M urea og 2 M litiumklorid og etter sentrifugering på en Hitachi RPR10 rotor ved 9.000 omdr./min. i 60 min. ble RNA på nytt utvunnet som et presipitat og RNA-presipitatet ble oppløst i 10 ml av en oppløsning omfattende 0,1% natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA.og 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og RNA ble isolert ved fenol-kloroformekstraksjon etterfulgt av fenol-
utfelling. Omtrent 2,5 mg av det således oppnådde RNA ble oppløst i 1 ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Etter inkubasjon ved 65°C i 5 min. ble 0,1 ml 5 M NaCl tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo(dT)-cellulosekolonne (P-L Biochemicals) kromatografi .(kolonnevolum 0,5 ml). Det adsorberte poly(A)-holdige mRNA ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. Omtrent 100 ug av poly (A)-holdig mRNA ble oppnådd. (2) cDNA-syntese og innføring av DNA i en vektor Okayama-Berg-metoden (Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)) ble fulgt for cDNA-syntese og rekombinant plasmidkonstruksjon ved innføring av det oppnådde cDNA. Prosessene for dette er skissert i fig. 9.
Til 300 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) , 6 mM MgCl2 og 10 mM NaCl ble det tilsatt 400 ug. pCDVl (Okayama & Berg, Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)) og etter ytterligere tilsetning av 500 enheter av Kpnl ble reaksjonen gjennomført ved 3 7°C i 6 timer, hvorved plasmidet ble kuttet ved Kpnl-setet. DNA ble utvunnet ved fenol-kloroform-ekstraks jon etterfulgt av etanolutfelling. Omtrent 2 00 ug av det Kpnl-kuttede DNA ble tilsatt til 200 ul av en oppløsning fremstilt ved tilsetning av dTTP i en konsentrasjon på 0,25 mM til TdT-buffer og etter ytterligere tilsetning av 81 enheter av TdT (P-L Biochemicals) ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 11 min., hvorved en poly(dT)-kjede (omtrent 67 dT-rester) ble tilsatt til hver 3<1->ende av Kpnl-kuttingssetet av pCSVl. Omtrent 100 ug av det poly-(dT) kjedeforlengede pCDVl-DNA ble utvunnet fra oppløsningen ved etanolutfelling etter-fulgt av fenol-kloroformekstraksjon. DNA ble tilsatt til 150 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 100 mM NaCl og, etter ytterligere tilsetning av 360 enheter av EcoRI, ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble behandlet ved hjelp av LGT-metoden og et DNA-fragment på omtrent 3,1 kb ble utvunnet. Omtrent 60 ug av poly(dT) kjedeforlenget pCDVl ble oppnådd på denne måte. DNA ble oppløst i 500 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA, oppløsningen ble inkubert ved 65°C i 5 min. og deretter avkjølt med is, og 50 fil av 5 M NaCl ble tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo(dA)-cellulosekolonne (Collaborative Research) kromatografi. Molekyler med en tilstrekkelig poly(dT)-kjede-lengde ble adsorbert på kolonnen og de ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA til å gi 27 ug av poly(dT) kjedeforlenget pCDVl (i det følgende omtalt som vektor-primer).
Deretter ble et linker-DNA fremstilt.
Omtrent 14 fig av pLl (Okayama & Berg; Mol. Cell. Biol. 3, 280
(1983)) ble tilsatt til 200 fil av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl og etter ytterligere'tilsetning av 50 enheter Pstl ble reaksjonen gjennomført ved .37°C i 4 timer for kutting av piil DNA ved Pstl-setet. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-klor of ormekstraks jon og omtrent 13 (tg av Ps ti-kuttet pLl DNA ble utvunnet ved etanolutf elling. Omtrent 13 fig av DNA ble tilsatt til 50 fil TdT-buffer inneholdende dGTP i en endelig konsentrasjon på 0,25 mM og. etter ytterligere tilsetning av 54 enheter TdT (P-L Biochemicals) ble inkubasjon gjennomført ved 37°C i 13 min. for å bevirke addisjon av en (dG)-kjede (omtrent 14 dGrester) til pLl ved hver Pstl-kuttingssete 3'-ende. Etter fenol-kloroformekstraksjon ble DNA utvunnet ved etanolutf elling. DNA ble tilsatt til 100 fil av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl og etter ytterligere tilsetning av 80 enheter Hindlll ble inkubasjonen gjennomført ved 3 7°C i 3 timer for å bevirke spalting av pLl DNA ved Hindlll-setet. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved hjelp av agarosegelelektroforese og et DNA-fragment på omtrent 0,5 kb ble utvunnet ved hjelp av DEAE-papirmetoden (Dretzen et al., Anal. Biochem., 112, 295
(1981)). På denne måte ble oligo(dG) kjedeforlenget linker-DNA (i det følgende omtalt enkelt som linker-DNA) oppnådd.
Omtrent 2 fig av poly (A) RNA og omtrent 1,4 ug av vekt or-primeren oppløst i 22,3 fil av en oppløsning omfattende 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, cLTTP, dGTP og dCTP) og 10 enheter ribonuklease-inhibitor (P-L Biochemicals), 10 enheter revers transkriptase (Seikagaku Kogyo) ble tilsatt og inkubasjonen ble gjennomført ved 41°C i 90 min. for å bevirke at mRNA syntetiserte et DNA komplementært dertil. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon etterfulgt av etanolutfelling hvormed vektor-primer DNA med RNA-DNA dobbelttråd addert dertil ble utvunnet. DNA ble oppløst i 20 ul TdT-buffer inneholdende 66 uM dCTP og 0,2 ug poly (A) , 14 enheter TdT (P-L Biochemicals) ble tilsatt og inkubasjon ble gjennomført ved 3 7°C i 2 min. for å bevirke addisjon av en (dC)-kjede (20 dCrester) til 3•-enden av cDNA. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og deretter ble det (dC)-kjedeforlengede cDNA-vektor-primer DNA utvunnet ved etanolutf elling. DNA ble oppløst i 400 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, 2 0 enheter Hindlll ble tilsatt og inkubasjon ble gjennomført ved 37°C i 2 timer for kutting ved Hindlll-setet. Fenol-kloroformekstraksjon av reaksjonsblandingen og etanolutfelling ga 0,5 pikomol av det (dC)-kjedeforlengede cDNA vektor-primer-DNA. DNA (0,2 pikomol) ble oppløst i 100 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (PH 7,5), 0,1 M NaCl og 1 mM EDTA og inkubasjon ble gjennomført ved 65°C, 42°C og 0°C i hhv. 10 min., 25 min. og 30 min. og i den nevnte rekkefølge. Et totalt volum på 100 ul av reaksjonsmedium ble fremstilt i henhold til følgende sammensetning: 20 mM Tris-HCl (pH 7; 5), 4 mM MgCl2, 10 mM(NH4)2S04, 0,1 M KCl og 0,1 p-NAD. Til dette reaksjonsmedium ble det tilsatt 25 enheter E. coli DNA-ligase (New England Bio-Labs), og inkubasjon ble gjennomført ved 11°C i 18 timer. Reaksjonsmediet ble supplert med 40 mM av hver av dNTP og med p-NAD i en endelig konsentrasjon på 0,15 mM og etter tilsetning av 10 enheter E. coli DNA-ligase, 20 enheter E. coli DNA-polymerase I (P-L Biochemicals) og 10 enheter E. coli ribonuklease H (P-L Biochemicals) ble inkubasjon gjennomført ved 12°C i 1 time og deretter ved 25°C i 1 time. Den ovennevnte reaksjonsprosedyre bevirket ringslutning av cDNA-holdige rekombinant DNA og substitusjon av RNA-delen av RNA-DNA-dobbelttråden med det tilsvarende DNA. Det rekombinante plasmid ble således tildannet i form av et fullstendig dobbelttrådet DNA.
(3) Seleksjon av human LT cDNA-holdig rekombinant DNA
Det rekombinante plasmid oppnådd som beskrevet i (2) ble anvendt for transformering av E. coli C600SF8 (Cameron: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3416 (1975)) ved hjelp av fremgangsmåten til Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)). Omtrent 30.000 oppnådde kolonier ble fiksert på et nitrocellulosefilter. En stamme som sterkt kunne assosiere ved 52°C med en probe fremstilt ved merking med <32>P av 17-base syntetisk DNA 5'-GATCCCCGGCCTGCCTG-3' tilsvarende basesekvensen av en del av den 5'-ikke-translasjonale region av human LT cDNA isolert av Genentech (Patrick W. Gray et al., Nature, 312, 721 (1984)) ble selektert (Grunstein Hogness-metoden: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). Hele basesekvensen av cDNA i plasmidet pLTl som bæres av denne stamme ble bestemt ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13-fag. Som et resultat ble det funnet at pLTl DNA koder for human LT.
(4) Konstruksjon av det rekombinante plasmid pLAl
I totalt 50 ml av en oppløsning (i det følgende omtalt som "Y-0 buffer") inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 6 mM 2-merkaptoetanol, ble det oppløst 5 iig pLTl (4,7 kb) oppnådd ved hjelp av prosedyren beskrevet i det foregående avsnitt, 10 enheter av restriksjonsenzymet XhoII (Boehringer Mannheim) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer.
Deretter ble NaCl tilsatt i en sluttkonsentrasjon på 150 mM, 10 enheter av restriksjonsenzymet Nsil (New England Bio-Labs) ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,3 iig av et omtrent 750 bp DNA-fragment (XhoII-Nsil-fragment) inneholdende det meste av human LT DNA.
Separat ble 20 ( iq pLTl oppløst i 200 «1 Y-50-buffer, 40 enheter av restriksjonsenzymet Haelll ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en endelig konsentrasjon på 150 mM, 40 enheter Nsil ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 3 timer. Polyakrylamid-gelelektroforese av reaksjonsblandigen ga omtrent 40 ng av et omtrent 50 bp DNA-fragment (HaeIII-NsiI-fragment)
inneholdende den N-terminale del av human LT.
Videre ble separat 3 ug pGELl (3,4 kb) oppløst i totalt 3 0 fil Y-100 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Stul og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det.ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1,0 ug av et Ap<r> gen-holdig DNA-fragment på omtrent 2,3 kb (StuI-BglII-fragment) .
Deretter ble 0,2 ug av det pLTl-avledede XholI-Nsil-fragment (omtrent 750 bp), 20 ng av pLTl-avledet Haelll-Nsil-fragment (omtrent 50 bp) og 0,6 ug av det iiGELl-avledede Stul-Bglll-fragment (omtrent 2,3 kb) oppløst i totalt 20 ul T4 ligasebuffer, 2 enheter T4 DNA-ligase (Takara Shuzo) ble videre tilsatt til denne blandingsoppløsning og reaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Det rekombinante plasmid DNA oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli KM430 ved hjelp av metoden til Cohen et al., og det ble oppnådd en Ap<r->koloni. Plasmid-DNA ble isolert og renset fra denne transformant ved hjelp av en kjent metode, og strukturen av plasmidet ble analysert ved kutting av plasmid-DNA med restriksjonsenzymer som f.eks. Stul. Som et resultat ble det bekreftet at det ønskede plasmid var blitt oppnådd. Dette rekombinante plasmid betegnes pLAl.
(5) Konstruksjon av LT ekspresjonsplasmidet pLSAl
En E. coli KM430 transformarit som inneholdt pLAl (3,1 kb) oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt ble dyrket og pLAl DNA ble fremstilt fra dyrkede celler derav på konven-sjonell måte. I 30 ul Y-100 buffer ble det oppløst 3 ug av det oppnådde pLAl DNA,--3 enheter av hver-av St-uT og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 ug av et omtrent 790 bp DNA-fragment (Stul-BgllI-fragment) inneholdende det meste av det humane LT-gen.
Separat ble 3 ug pKYLlO fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i US patentskrift nr. 4.686.191 oppløst i 3 yl Y-10 0 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll og Pstl ble tilsatt, og spaltningsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd et tryptofan-promoter (Ptrp)-holdig DNA-fragment på omtrent 1,1 kb (BanIII-PstI-fragment). Ytterligere 2 ug pGELl (3,4 kb) ble oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 4 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll, BamHI og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,7 ug av et lipoproteinavledet terminatorholdig DNA-fragment på omtrent 1,7 kb (Pstl-BamHI-fragment).
Separat, av slike grunner som nødvendigheten av å tilveiebringe sekvensen fra den N-terminale ende av det modne humane LT-polypeptid, nemlig Leu (CTA) til den andre basen (GG) av den 5. aminosyren Gly (GGC) såvel som initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og nødvendigheten av å innstille avstanden mellom SD-sekvensen nedstrøms fra Ptrp og ATG til en passende lengde på 6-18..bp, ble følgende DNA-linker syntetisert:
Først ble 27-mer og 25-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 27-mer og 25-mer (hver 20 pikomol) ble oppløst i totalt 40 ul T4 kinasebuffer, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,3 ug av det pLAl-avledede Stul-Bglll-fragment (omtrent 790 bp), 0,6 ug av BanIII-PstI-fragmentet av ekspresjons-vektoren pKYPlO og 0,6 ug av det pGELl-avledede Pstl-BamHI-fragment (omtrent 1,7 kb), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 ul T4 ligasebuffer, og omtrent 1 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt til denne blandingsoppløsning.. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter av T4 DNA-ligase til denne blanding ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den rekombinante plasmidholdige reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli KM430 og det ble oppnådd en Ap<r->kolbni. Plasmid-DNA ble utvunnet fra dyrkede celler fra denne koloni. Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved kutting med restriksjonsenzymene EcoRI, Banlll, Pstl, Hindlll og Bglll etterfulgt av agarosegelelektroforese. Dette plasmid betegnes pLSAl. Base-sekvensen av pLSAl i nærheten av Banlll og Hindlll ble bekreftet ved hjelp av Maxam-Gilbert-metoden (A.M. Maxam et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA, 74, 560 (1977)) til å være som følger:
Undereksempel 4
Konstruksjon av ATG- vektoren pTrS2 0
Ved å følge prosedyren vist i fig. 13 ble ATG-vektoren pTrS2 0 . hvori avstanden mellom SD-sekvensen og initieringskodonet ATG er 14 baser og som har et SacI-sete umiddelbart bak ATG-kodonet konstruert.
Først ble 3 fig pKYPlO fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i US patentskrift nr. 4.686.191 oppløst i 30 fil Y-10 0 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll og Nrul (New England Bio-Labs) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 fiq av et Ptrp-holdig DNA-fragment på omtrent 3,8 kb (Banlll-NruI-fragment).
Separat ble følgende DNA-linker syntetisert ved hjelp av fosfotriestermetoden for å tilveiebringe initieringskodonet ATG nedstrøms fra Ptrp:
i
19-mer og 17-mer syntetiske DNA1 er (hvert 10 pikomol) ble oppløst i totalt 2 0 fil av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP, 3 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 fig av det pKYPlO-avledede Banlll-Nrul-fragment (omtrent 3,8 kb) oppnådd som beskrevet i det foregående og omtrent 0,5 pikomol av den ovennevnte DNA-linker oppløst i 2 0 fil T4 ligasebuf f er, 2 enheter T4 DNA-ligase ble ytterligere tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer.
Den oppnådde rekombinante plasmid-blanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 (Boliver et al.. Gene, 2, 75
(1977)), og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler fra denne koloni ble plasmid-DNA utvunnet. Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved kutting med restriksjonsenzymene EcoRI, Banlll, Hindlll, SacI og Nrul, etterfulgt av agarosegelelektroforese. Dette plasmid ble betegnet pTrS2 0 (fig. 13). Base-sekvensen av pTrS20 i nærheten av Banlll og Hindlll-setene ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag til å være som følger:

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid avledet fra hG-CSF-polypeptidet ved delesjon, hvor et peptid omfattende første til fjerde, første til femte, første til sjette, første til syvende eller første til ellevte aminosyrer på den N-terminale del av. hG-CSF-polypeptidet mangler, og eventuelt i tillegg til aminosyredelesjonen, er den syttende aminosyre cystein (Cys <+17>) i hG-CSF-polypeptidet erstattet med serin (Ser), med den betingelse at de første til fjerde aminosyrer til hG-CSF-polypeptidet kun er deletert dersom Cys<+17> i hG-CSF-polypeptidet er erstattet med Ser, karakterisert ved at en DNA-sekvens som koder for nevnte polypeptid settes inn i en passende ekspresjonsvektor, uttrykkes i en passende vertscelle og hvorpå polypeptidet isoleres fra cellekulturen.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 for fremstilling av et polypeptid med en aminosyresekvens som avledet fra aminosyresekvensen til hG-CSF-polypeptidet ved substitusjon av den syttende aminosyren (cystein) med serin og delesjon av fire til syv aminosyrer på den N-terminale del derav, karakterisert ved at den omfatter å underkaste et polypeptid som avledet fra hG-CSF-polypeptidet ved substitusjon av den syttende aminosyre (cystein) med serin og av minst en aminosyre av de første til sjette aminosyrer på den N-terminale del derav med en aminosyre forskjellig derfra for innvirkningen av en protease i et vandig medium for derved å bevirke dannelse av nevnte polypeptid i reaksjonsblandingen, og hvorpå polypeptidet isoleres fra blandingen.
3 . DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for polypeptidet som fremstilt i krav 1.-
NO19940495A 1986-12-23 1994-02-14 Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid samt DNA-sekvens som koder fordette NO315003B1 (no)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO19940495A NO315003B1 (no) 1986-12-23 1994-02-14 Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid samt DNA-sekvens som koder fordette

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30679986 1986-12-23
NO875378A NO176799C (no) 1986-12-23 1987-12-22 DNA som koder for et polypeptid, rekombinant plasmid som koder for og kan uttrykke et polypeptid og fremgangsmåte for fremstilling av dette polypeptid
NO19940495A NO315003B1 (no) 1986-12-23 1994-02-14 Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid samt DNA-sekvens som koder fordette

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO940495L NO940495L (no) 1988-06-24
NO940495D0 NO940495D0 (no) 1994-02-14
NO315003B1 true NO315003B1 (no) 2003-06-23

Family

ID=27338868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19940495A NO315003B1 (no) 1986-12-23 1994-02-14 Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid samt DNA-sekvens som koder fordette

Country Status (1)

Country Link
NO (1) NO315003B1 (no)

Also Published As

Publication number Publication date
NO940495D0 (no) 1994-02-14
NO940495L (no) 1988-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK174044B1 (da) Polypeptid afledt fra human granulocytkolonistimulerende faktor, og fremgangsmåde til fremstilling deraf, DNA kodende for nævnte polypeptid, rekombinant plasmid indeholdende nævnte DNA, og mikroorganismer indeholdende nævnte rekombinante plasmid.......
AU648670B2 (en) A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
US5362853A (en) Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5028530A (en) AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques
US5994518A (en) Method of producing a polypeptide having human granulocyte colony stimulating factor activity
EP0075444A2 (en) Methods and products for facile microbial expression of DNA sequences
FI100250B (fi) Hirudiinijohdannaisten eritys
EP0104920A1 (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing swing growth hormone-like polypeptides
EP0832256A1 (en) Compositions for expression of proteins in host cells using a preprocollagen signal sequence
EP1837346A2 (en) Method for purifying granulocyte-colony stimulating factor
NO178035B (no) Ekspressjonsvektor, gjærcelle som er i stand til å utskille desulfatohirudin samt fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt desulfatohirudin
JP2001008697A (ja) Ｅ．コリでの非融合タンパク質の調製方法
CA2076320C (en) Process for producing peptide
EP0232107A2 (en) Human lymphotoxin polypeptide derivative
US5194592A (en) Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
EP0209068A1 (en) EEL growth hormone
EP0134673B1 (en) Improved plasmid vector and use thereof
CA1275953C (en) Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-iii and analogs thereof
NO315003B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptid samt DNA-sekvens som koder fordette
JP2628961B2 (ja) 新規ポリペプチド
JPH07149798A (ja) 新規ポリペプチド
JP2766798B2 (ja) 新規ポリペプチド
US5489529A (en) DNA for expression of bovine growth hormone
DK173822B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af bovint væksthormon
JPH0695938B2 (ja) 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired