NO178035B

NO178035B - Ekspressjonsvektor, gjærcelle som er i stand til å utskille desulfatohirudin samt fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt desulfatohirudin

Info

Publication number: NO178035B
Application number: NO865007A
Authority: NO
Inventors: Bernd Meyhack; Walter Marki; Jutta Heim
Original assignee: Ciba Geigy Ag; Christensen Plantorgan Werk; Ucp Gen Pharma Ag
Priority date: 1985-12-12
Filing date: 1986-12-11
Publication date: 1995-10-02
Also published as: IL80932A0; GR3006248T3; IE57859B1; DE3686399T2; HUT42523A; PT83898B; NO178035C; EP0225633A3; AU615413B2; EP0225633A2; FI94773C; JPH0650990B2; MY101203A; FI94773B; NO865007L; DE3686399D1; FI865003A; NO865007D0; IL80932A; EP0225633B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ekspressjonsvektor, en gjærcelle som er i stand til å utskille desulfatohirudin samt en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt desulfatohirudin.

Hirudin er et anti-koaguleringsmiddel som forekommer naturlig

i blodigler (Hirudo medicinalis). Hirudin er ikke et enkelt proteinspecies, men består av minst tre komponenter betegnet Hirudin-variant 1 (HVI), Hirudin-variant 2 (HV2), (kfr. europeisk patentpublikasjon nr. 158 564) og "des-(Val)2~ hirudin" (kfr. europeisk patentpublikasjon nr. 158 986). Variantene adski.ller seg fra hverandre i struktur ved antall aminosyrer (spesielt er N-terminalsekvensen av HVI Val-Val-Tyr, den for HV2 er Ile-Thr-Tyr og den for "des-(Val)2-hirudin" er Thr-Tyr) men har en akkumulering av hydrofobe aminosyrer ved N-terminalen og av polare aminosyrer ved C-terminalen, en tyrosinrest (Tyr^<3>) til stede som sulfat-monoester, tre disulfidbroer og antikoaguleringsaktiviteten til felles.

Hirudin, med en K^-verdi (kompleks dissosieringskonstant) på

6 x IO<*1> M, er den sterkeste trombininhibitoren som er kjent og er kjennetegnet ved en spesifikk affinitet for trombin. Andre enzymer av koaguleringskaskaden inhiberes ikke av hirudin. I motsetning til heparin som er det foretrukne antikoaguleringsmidlet ved konvensjonell antikoaguleringsbehandling utøver hirudin sin inhiberingsvirkning direkte på trombin, og virker ikke, som førstnevnte, ved antitrombin III. Den eneste farmakologisk detekterbare virkningen av renset hirudin er inhiberingen av blodkoagulering og profylakse av trombose. Ingen virkning på hjertehastighet, åndedrett, blodtrykk, trombocyttantall, fibrinogen og hemaglobin kunne observeres ved administreringen intravenøst til hunder, selv i høye doser. I forsøk med rotter, svin og høner, har hirudin vist seg effektiv ved eksperimentell trombose (indusert enten ved stase eller ved injeksjon av trombin, ved endotoksisk sjokk, og også ved DIC (disseminert intravaskulær koagulering). Ved direkte sammenligningsforsøk , har hirudin vist seg overlegen heparin. Videre har hirudin en meget lav toksisitet, er ikke antigenisk og viser en tilnærmet fullstendig "clearence" via nyrene i en biologisk aktiv form.

Selv om det lenge har vært kjent har hirudin fremdeles ikke oppnådd den brede terapeutiske anvendelsen som kunne ventes på basis av dets utmerkede biologiske egenskaper. Dets sterkt begrensede tilgjengelighet er en alvorlig ulempe som står i veien for bred anvendelse innen medisinen. Frem til i dag har hirudinpreparatet hovedsakelig vært oppnådd fra naturlig materiale (ekstrakt av blodigler), som er dyrt og vanskelig å oppnå, og som krever tid og dyre isolerings- og renseproses-ser. [Kfr. P. Walsmann et al., Pharmazie, 36, 653 (1981); Europeisk patentpublikasjon nr. 158 986], På grunn av den relativt lange sekvensen på 65-aminosyrer gir også konvensjonell peptidsyntese lite håp om suksess av økonomiske grunner. Nye fremgangsmåter må derfor anvendes for fremstilling av tilstrekkelige mengder hirudin for å muliggjøre detaljerte kliniske forsøk av dets terapeutiske potensiale og bred terapeutisk anvendelse innen antikoaguleringsbehandling.

Slike fremgangsmåter tilveiebringes spesielt ved rekombinant DNA-teknologi. Ved hjelp av denne teknologi er det mulig å fremstille høyst varierende fysiologisk aktive polypeptider ved å dyrke tilsvarende genetisk modifiserte vertsorganismer. I denne sammenheng skal det nevnes at hirudin sannsyn-ligvis fremstilles av blodigler via et desulfatohirudin-forstadium som sulfateres etter translasjon. Det er ventet at andre verter enn blodigler mangler det spesifikke sulfat-overførende enzymsystem og derfor vil produsere desulfatohirudinet fremfor hirudiner. Imidlertid skades den biologiske aktiviteten ikke ved fraværet av sulfatgruppen, hvilket fremgår av at desulfatohirudinproteinet oppnås ved enzymatisk fjernelse av sulfatgruppen fra den fenoliske hydroksygruppen av Tyr 63 resten for det tilsvarende hirudinproteinet (kfr. europeisk patentpublikasjon nr. 142 860).

I den nylig publiserte europeiske patentpublikasjon nr. 158 564 beskrives fremstillingen av desulfatohirudinvarianter 1 og 2 og analoger derav ved hjelp av E. coli celler transformert med plasmider inneholdende strukturgenene for de respektive desulfatohirudinene. Antikoaguleringsaktiviteten målt i celleekstrakter av kultiverte E. coli-celler, og angitt i anti-trombinenheter, ("ATU") utgjør 3 000- 4 000 ATU/ODfcøo/l kultur hvilket tilsvarer en konsentrasjon på 0,2 mg hirudin/0D/l (basert på en estimert spesifikk aktivitet på 15 000-20 000 ATU/mg rent hirudin.

Sansynligvis kan det dårlige utbyttet av hirudinaktivitet som oppnås for transformerte E. coli-celler tilskrives en akkumulering av det meste av hirudinproteinet i en inaktiv form i cytoplasma på grunn av en ukorrekt folding av molekylet. Den korrekte foldingen avhenger av dannelsen av tre disulf idbroer inne i hirudinmolekylet som er det essensielle for enzymaktiviteten. (Kfr. P. Walsmann et al., supra). Andre naturlig utskilte pattedyrproteiner, så som bovint veksthormon, menneskelig vevsplasminogenaktivator og humant •y-interferon er på samme måte i det vesentlige inaktive når,de produseres og akkumuleres i cytoplasmaet av mikroorganismer [kfr. R.A. Smith et al., Science 229, 1219,

(1985)]. Det fremgår at utskillelsesveien kan fremme dannelsen av disulfidbindingen idet de fleste proteiner som inneholder disulfidbroer er ekstracellulære. Det er andre trekk som gjør utskillelse mest fordelaktig: Utskilte proteiner er generelt lettere å detektere og å rense enn intracellulære akkumulerte produkter; utskilling av ønskede produkter i mediet gjør at man unngår nødvendigheten av å bryte opp vertsorganismen for å utvinne produktet; visse heterologe proteiner kan ha en toksisk virkning på vertsorganismen. Når de utskilles er det mindre sannsynlig at de påvirker normale cellulære funksjoner; det er mindre sannsynlig at utskilte proteiner nedbrytes av proteolytiske enzymer enn intracellulært akkumulerte proteiner som angripes av disse enzymene ved nedbrytning av cellene.

De fleste utskilte proteiner er kodet på DNA som preproteiner med et signalpeptid som en vedhengt aminoterminalutvidelse av den modne aminosyresekvensen. Signalpeptidet spiller en viktig rolle under kotranslasjonsinnføringen av proteinet i membranene av det endoplasmatiske retikulum. (ER). En signalpeptidase spalter signalpeptidet på et tidlig sted på luminalsiden av ER. Ytterligere transport til den ytre cellemembranen innbefatter Golgi og sekretoriske vesikler. Proteinet skilles enten i det periplasmiske rommet (f.eks. syrefosfatase, invertase), eller i kulturmediet (f.eks. a-faktor, dreper-toksin).

Idet alle eukaryoter synes å ha felles mekanismer for ekspresjon av genetisk informasjon og for sortering av de uttrykkede proteiner, forløper ekspresjonen av eukaryotiske gener med større effektivitet i en eukaryotisk vert enn i E. coli. Blant de eukaryotiske organismene er gjær enklest å håndtere og å dyrke. Et antall av heterologe proteiner har med hell vært uttrykket i gjær. Imidlertid har det hittil ikke vært mulig å definere viktige trekk for et protein-bortsett fra et vedhengt signal-peptid - som ville tillate effektiv utskillelse i mediet. Det er derfor ikke mulig å gjøre pålitelige forutsigelser vedrørende om et protein vil utskilles eller ikke. Mens 90# av samlet glukoamylase fremstilt av transformert gjær (inneholdende den genetiske informasjonen for pre-glukoamylase), utskilles i mediet (PCT-patentsøknad nr. 84/2921) og høye titere for epidermisk vekstfaktor (EGF) finnes i mediet for kultivert gjær inneholdende EGF-genet med det vedhengende a-faktor-signalpeptidet (europeisk patentpublikasjon nr. 116.201), er bare - mindre mengder eller spor av 3-endorfin (a-faktorsignalpeptid, PCT-patentsøknad nr. 84/4330), leukocyttinterferon A (invertase-signalpeptid, europeisk patentpublikasjon nr. 127 304 ), humant "y-interferon, humant serumalbumin, bovine interferoner, a-1 og a-2, vevsplasminogenaktivator, renin og human insulin-lignende vekstfaktor (a-faktorsignalpeptid, europeisk patentpublikasjon nr. 123.544), leukocyttinterferon D og A, 7-interferon og humant veksthormon (MGH) (interferon og MGH-signalpeptider, europeisk patentpublikasjon nr. 88 632) detekterbare i mediet, og ingen utskillelse av Pseudomonas karboksypeptidase G (CPG2) [G2 (CPG2) signalpeptid, europeisk patentpublikasjon nr. 121 352] og ved plasminogen aktivator (PH05 signalpeptid, europeisk patentpublikasjon nr. 143 081) observert i mediet ved transformert gjær.

Følgelig kan det ikke forutsies om et gitt protein som har et vedhengt signalpeptid utskilles av gjær eller ikke, og dette avhenger fremfor alt av det valgte proteinet.

Følgelig var det usikkert om et valgt protein, så som hirudin, som har et vedhengt signalpeptid ville utskilles, idet minste i en viss grad, av transformerte vertsorganismer så som gjær.

Overraskende er det nå funnet at proteiner med hirudinaktivitet utskilles i mediet av eukaryotiske vertsorganismer som inneholder DNA innbefattende en DNA-sekvens som koder et signalpeptid oppstrøm for, og i leseramme med, strukturgenet for desulfatohirudin.

Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling og utskillelse av proteiner med hirudinaktivitet i en eukaryotisk vertsorganisme. Det er et ytterligere formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe hybridvektorer innbefattende en DNA-sekvens som koder et signalpeptid oppstrøm for, og i leseramme med, strukturgenet for desulfat og hirudin, og eukaryotiske vertsorganismer transformert ved nevnte hybridvektorer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ekspressjonsvektor, kjennetegnet ved at den inneholder en gjaerpro-moter valgt fra gruppen bestående av PH05-promotoren, GAPDH-promotoren og en hybridpromotor innbefattende oppstrøms-aktiveringssekvenser av PH05-<g>enet og nedstrømspromotorele-menter innbefattende en funksjonell TATA-boks av GAPDH-genet, et DNA-segment bestående av en første sekvens som koder PH05 eller invertasesignalpeptidet oppstrøms for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for et modent desulfatohirudin, valgt fra gruppen bestående av des-(Leu^<4>, Gln^<5>)-desulfatohirudin-variant HVI av formelen

des-(Gln^5 )-desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HV2 av formelen desulfatohirudin-variant PA av formelen

og funksjonelle varianter derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre Saccharomyces cerevlsiae celle eller en annen gjærcelle som er i stand til å utskille desulfatohirudin i et kulturmedium, kjennetegnet ved at gjærcellen er transformert med en ekspressjonsvektor som omtalt ovenfor.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt desulfatohirudin valgt fra gruppen bestående av des-(Leu<64>, Gin<65>)-desulfatohirudin-variant HVI av formelen

des-(Gln<65>)-desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HV2 av formelen desulfatohirudin-variant PA av formelen

og funksjonelle varianter derav, kjennetegnet ved at den innbefatter dyrking under egnede næringsbetingelser av Saccharomvces cerevisiae celler eller andre gjærvertsceller som er i stand til å utskille desulfatohirudinet i kulturmediet, hvilke celler transformeres med ekspresjonsvektor som omtalt ovenfor, og isolering av desulfatohirudin fra kulturmediet.

Egnede eukaryotiske vertsorganismer er celler fra høyere organismer, spesielt pattedyr, spesielt etablerte humane eller animalske cellelinjer, så som VERO eller HeLa-celler, eller kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinje, og gjær, så som Saccharomvces cerevisiae. Den foretrukne vertsorganisme ifølge foreliggende oppfinnelse er gjær, spesielt stammer av Saccharomvces cerevisiae.

Den eukaryotiske vertsorganismen, spesielt gjær, som , inneholder de ovenfor nevnte DNA-sekvensene dyrkes ved å anvende fremgangsmåter som er kjente innen teknikken.

Følgelig dyrkes transformerte gjærstammer ifølge oppfinnelsen

i et flytende medium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter.

Forskjellige karbonkilder kan anvendes. Eksempler på foretrukne karbonkilder er assimilerbare karbohydrater, så som glukose, maltose, mannitol eller laktose, eller et acetat så som natriumacetat, som enten kan benyttes alene eller I egnede blandinger. Egnede nitrogenkilder innbefatter f.eks. aminosyrer, så som casaminosyrer, peptider og proteiner, og deres nedbrytningsprodukter, så som trypton, pepton eller kjøttekstrakter, videre gjærekstrakt, maltekstrakt, maisut-trekksvæske, såvel som ammoniumsalter, så som ammoniumklorid, -sulfat eller -nitrat, som kan bényttes enten alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter som kan anvendes innbefatter f.eks. sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium. I tillegg kan næringsmediet også inneholde vekstfremmende stoffer. Stoffet som fremmer vekst innbefatter f.eks. sporelementer, så som jern, sink, mangan og lignende, eller individuelle aminosyrer .

I varierende grad viser gjærceller transformert med autonomt replikerende plasmider, f.eks. plasmider inneholdende gjær 2

jj plasmid DNA (inf ra) tendens til å miste det innførte hybridplasmidet. Av den grunn må slike gjærceller dyrkes under selektive betingelser, dvs. betingelser som krever uttrykking av et plasmid-kodet gen for vekst. De fleste selektive markører som i dag anvendes og som er tilstede i vektorene ifølge oppfinnelsen (infra) er gener som koder for enzymer av aminosyre eller purin biosyntese. Dette gjør det nødvendig å anvende syntetiske minimale media som har underskudd på den tilsvarende aminosyren eller purinbase.

Imidlertid kan også gener som gir resistens til et egnet biocid anvendes [f.eks. gener som gir resistens til cykloheksimid, til aminoglykosid G 418 til et tungmetall, eller lignende]. Gjærceller transformert med vektorer inneholdende antibiotiske resistensgener dyrkes i komplekse media inneholdende det tilsvarende antibiotikumet hvorved høyere veksthastigheter og større celletettheter oppnås.

Gjærceller transformerte med DNA som integreres i et kromosom krever ikke selektive vekstbetingelser. Disse transformerte cellene er tilstrekkelig stabile til å tillate vekst uten selektivt trykk. Disse cellene dyrkes fordelaktig i komplekse media.

Gjærceller inneholdende hybridplasmider med en konstitutiv promotor (f.eks. ADHI, GAPDH), uttrykker desulfatohirudingenet kontrollert ved hjelp av promotor uten induksjon. Dersom imidlertid desulfatohirudingenet er under kontroll av en regulert promotor (f.eks. PGK eller PH05) må sammensetnin-gen av vekstmediet tilpasses for å oppnå maksimale nivåer av mRNA-transkripter, dvs. når PH05 promotoren anvendes må vekstmediet inneholde en lav konsentrasjon av uorganisk fosfat for derepresjon av denne promotoren.

Dyrkingen utføres ved å anvende konvensjonelle teknikker. Dyrkingsbetingelsene, så som temperatur, pE for mediet og fermenteringstiden velges på en slik måte at maksimale nivåer av desulfatohirudin produseres. En valgt gjærstamme dyrkes fortrinnsvis under aerobe betingelser i neddykkede kulturer under risting eller omrøring ved en temperatur på 25 °C til 35"C, fortrinnsvis ved ca. 30°C, ved en pH på 4 til 8, f.eks. ved ca. pH 7, og i 4 til 20 timer, fortrinnsvis inntil maksimale nivåer av proteiner er oppnådd.

Det er overraskende funnet at uavhengig av vertsorganismen og signalpeptidet som benyttes utskilles det meste av de produserte hirudinforbindelsene i kulturmediet mens bare en mindre del forblir celletilknyttet. Det nøyaktige forholdet , av (utskilte forbindelser/celletilknyttede forbindelser) avhenger av fermenteringsbetingelsene og utvinningsprosessen som anvendes. Generelt utgjør den 9:1 eller mer. Følgelig er utskilt hirudin alltid sterkt dominerende.

Hirudinforbindelsene kan isoleres fra kulturmediet ved konvensjonelle fremgangsmåter. For eksempel består det første trinnet vanligvis i separasjon av cellene fra kulturfluidet ved hjelp av sentrifugering. Den resulterende supernatanten kan anrikes på hirudinforbindelser ved behandling med polyetylenimin slik at det meste av det ikke-proteinholdige materialet fjernes, og utfellingen av proteinene ved metning av oppløsningen med ammoniumsulfat eller med trikloreddik-syre. Vertsproteiner kan, dersom de er tilstede, også utfelles ved hjelp av surgjørlng med eddiksyre (f.eks. 0,1#, pH 4-5). En ytterligere anrikning av hirudinforbindelsen kan oppnås ved ekstrahering av eddiksyresupernatanten med n-butanol. Andre rensetrinn innbefatter f.eks. avsaltning, kromatografiske fremgangsmåter, så som ionebytterkromatografI, gelfiltreringskromatografi, fordelingskromatografi, HPLC, reversert fase HPLC, o.l. Separasjonen av bestanddelene

i blandingen kan også bevirkes ved dialyse, på grunnlag av ladning ved hjelp av gelelektroforese eller bærerfri elektroforese, på grunnlag av molekylstørrelse ved hjelp av en egnet "Sephadex" kolonne, ved affinitetskromatografi, f.eks. med antistoffer, spesielt monoklonale antistoffer, eller med trombin koblet til en egnet bærer for affinitetskromatografi, eller ved andre fremgangsmåter, spesielt fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen.

Dersom det er ønskelig å isolere eventuelle ytterligere hirudinforbindelser som er celletilknyttede, dvs. som er akkumulert intracellulært eller i det periplasmiske rommet, er ytterligere rensetrinn påkrevet. I tilfellet hirudinpro-teiner er akkumulert inne i cellene består det første trinnet for utvinning av de ønskede proteinene i frigjøring av proteinet fra det indre av cellen. I de flesté fremgangsmåter fjernes celleveggen først ved enzymatisk nedbrytning med glykosidaser (infra). Deretter behandles de resulterende speroplastene med rensemidler, så som "Triton". Alternativt er mekaniske krefter, så som skjærkrefter, (f.eks. X-press, French-press) eller risting med glassperler, egnet for nedbrytning av cellene. I tilfelle hvor hirudinforbindelsene utskilles av vertsceller, spesielt gjær, i det periplasmiske rommet, kan en forenklet fremgangsmåte benyttes: proteinet utvinnes uten cellelysering ved enzymatisk fjernelse av celleveggen eller ved behandling med kjemiske midler, f.eks. tiolreagenser eller EDTA, som gir opphav til skader på celleveggen som tillater at det dannede proteinet kan frigjøres.

Det er overraskende funnet at bortsett fra desulfatohirudinforbindelsene svarende til "DNA-sekvensen som koder for modent desulfatohirudin" kan nå annet desulfatohirudin isoleres fra kulturbuljongen som adskiller seg fra de ventede forbindelsene ved fraværet av 1 til 4 aminosyrer ved C-terminalen. Følgelig gir dyrkning av gjærceller som bærer genet som koder for desulfatohirudin HVI denne varianten såvel som i lavere utbytter, desulfatohirudinforbindelser som mangler henholdsvis den C-terminale aminosyren Gln[Des-(Gln<65>)-desulfatohirudin], den C-terminale dipeptidresten Leu-Gln [des-(Leu<64>,Gln<65>)-desulfatohIrudin], den C-terminale tripeptidrest -Tyr-Leu-Gln[Des-(Tyr<63>, Leu<64>, Gln65)-desulfatohirudin] og den C-terminale tetrapeptidrest -Glu-Tyr-Leu-Gln[Des-(Glu62» T<y>r63» Leu^, Gln^ )-desulfatohirudin]. Disse forbindelsene kan være dannet ved (delvis) proteolytisk nedbrytning av det primære uttrykkingsprodukt desulfatohirudin og er identifisert i alle kulturbuljonger, uavhengig av gjærverten som benyttes og fermenteringsbetingelsene som anvendes.

Des-(Gln6<5>)-desulfatohirudin, Des-(Tyr<63>, Leu64, Gin65)-desulfatohirudin og Des-(GlUfc2i Tvr63» Leu64• Gln65)~ - desulfatohirudin er nye.

Forsøket med anti-hirudin eller anti-desulfatohirudinanti-stoffer (f.eks. monoklonale antistoffer som kan oppnås fra hybridomceller), trombinforsøket [M.U. Bergmeyer (red.), "Methods in Enzymatic Ånalysis", bind II, side 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (FRG), 1983] eller blodkoagulerings-forsøk [F. Markwardt et al., Tromb. Haemost. 47, 226 (1982)] kan benyttes for å detektere hirudinaktiviteten.

Hirudinforbindelser kan oppnås ifølge fremgangsmåten kan omvandles ved en fremgangsmåte som i og for seg er kjent til forskjellige hirudinforbindelser.

Det er også mulig å omvandle en desulfatohirudinforbindelse som er oppnådd, f.eks. desulfatohirudin variant HVI, til et derivat derav som mangler en til syv aminosyrer med C-terminalen, f.eks. ved virkningen av en egnet karboksypeptidase, så som karboksypeptidase Y.

De transformerte eukaryotiske vertsorganismer som anvendes ved oppfinnelsen kan fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker innbefattende trinnene

fremstilling av en DNA-konstruksjon inneholdende en eukaryotisk ekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment bestående av den første DNA-sekvens som koder et signal-peptid oppstrøm for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens med koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av den nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens som inneholder eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler,

fremstilling av en hybridvektor innbefattende nevnte DNA-konstruksjon,

transformering av en egnet eukaryotisk vertsorganisme med

den dannede hybridvektoren,

og seleksjon av transformerte vertsceller fra utransfor-merte vertsceller. 2. DNA-konstruksjon innbefattende de kodende områdene av et signalpeptid og av desulfatohirudin.

Det er beskrevet en DNA-konstruksjon inneholdende en eukaryotisk ekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment bestående av en første DNA-sekvens som koder et signalpeptid oppstrøm for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment står under transkripsjonskontroll av nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens som inneholder eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan benyttes for regulering og ekspresjon av DNA-sekvenser som koder for signalpeptidet og desulfatohirudin. Spesielt kan ekspresjonskontrollsekvenser av sterkt uttrykkede gener av verten som skal transformeres benyttes.

For anvendelse i pattedyrceller er ekspresjonskontrollsekven-sene fortrinnsvis avledet fra vira. For eksempel er egnede ekspresjonskontrollsekvenser for anvendelse i pattedyrceller tidligere og sene promotorer av apevirus 40 (SV40), vaksine-promotoren, HTLV-promotoren eller promotorer avledet fra polyoma eller Adenovirus 2.

Ekspresjonskontrollsekvenser for gjær som er de mest foretrukne vertsorganismene ifølge foreliggende oppfinnelse, er avledet fra det genomiske DNA av gjær, spesielt av Saccharomvces cerevisiae. Fortrinnsvis benyttes ekspresjonskontrollsekvensen av et sterkt uttrykket gjærgen for ekspresjon av desulfatohirudin. Følgelig kan promotoren for TRPl-genet, ADHI eller ADHII-genet, syrefosfatase (PH05) genet, icytochrome c-genet, eller en promotor av enolasen, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 3-fosfoglyse-ratklnase (PGK), heksokinase, pyruvat dekarboksylase, fosforfruktoklnase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosforglyce-ratmutase, pyruvatkina.se, triosefosfatisomerase, fosfoglu-koseisomerase og glukokinasegener, eller en promotor for gjærtilpassede feromongener som kodes for a- eller a-faktoren, benyttes. Det er også mulig å anvende hybridpromotorer innbefattende oppstrømsaktiveringssekvenser (UAS) for et gjærgen og nedstrømspromotorelementer innbefattende en funksjonell TATA-boks for et annet gjærgen, f.eks. en hybridpromotor inneholdende UAS (ene) for gjær PH05 genet og nedstrømspromotorelementer innbefattende en funksjonell TATA-boks av gjær GAPDH genet. Foretrukkede vektorer for foreliggende oppfinnelse inneholder promotorer med transkribsjons-kontroll. Promotorer av denne typen, f.eks. promotoren for PH05 genet og PH05-GAPDH hybridpromotorer, kan skrus på eller av ved variasjon av vekstbetingelsene. For eksempel kan PH05 promotoren undertrykkes eller avundertrykkes etter ønske, utelukkende ved å øke eller redusere konsentrasjonen av uønskede fosfater i mediet. En ytterligere foretrukket promotor er promotoren av GAPDH genet, spesielt et funksjo-nelt fragment derav, som starter ved nukleotid -300 til 180, spesielt ved nukleotid -263 eller -199, og som ender ved nukleotid -5 av GAPDH genet.

DNA-sekvensen som koder et signalpeptid ("signalsekvens") er fortrinnsvis avledet fra eukaryotiske, f.eks. gjær, gener som koder for polypeptider som vanligvis utskilles. Egnede signalsekvenser er f.eks. hirudinsignalsekvenser som oppnås fra genomisk blodigle DNA, gjærsignalsekvenser, så som signal- og preprosekvensene av gjærinvertase, a-f aktor, oc-faktor, feromonpeptidase, "drepertoksin" og represserbare syrefosfatase (PH05) gener og glukomylasesignalsekvensen fra Aspergillus awamori. Alternativt kan sammensmeltede signalsekvenser konstrueres ved å ligere en del av signalsekvensen (dersom der er tilstede) av genet som naturlig er forbundet med promotorer som benyttes, med en del av tiirudinsignalsek-vensen. De kombinasjonene er foretrukket som tillater en nøyaktig spaltning mellom signalsekvensen og den modne desulfatohirudinaminosyresekvensen. Ytterligere syresek-venser, så som pro- eller avstandsyresekvenser, som kan bære spesifikke bearbeidelsessignaler eller ikke også innbefattes i konstruksjonene for å lette nøyaktig bearbeidelse av forstadiumsmolekyler. Alternativt kan sammensmeltede proteiner dannes Inneholdende indre bearbeidelsessignaler som tillater riktig modning in vivo eller in vitro. For eksempel inneholder bearbeidelsessignalene en Lys-Arg-rest, som gjenkjennes av gjærendopeptidase anbragt i Golgi-membranene. De foretrukkede signalsekvenser er de for gjær PH05 genet som koder for et signalpeptid som har formelen

Met Phe Lys Ser Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala,

og av gjær invertasegenet som koder for et signalpeptid som har formelen

Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala.

DNA-sekvensen som koder for modent desulfatohirudin er spesielt valgt fra strukturgenene for desulfatohirudiner angitt ovenfor. Den foretrukkede DNA-sekvensen koder for desulfatohirudin variant 1 (HVI) og har formelen

En DNA-sekvens inneholdende eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler er fortrinnsvis den 3'-flankerende sekvensen av et eukaryotisk gen som inneholder egnede signaler for transkripsjonsterminering og polyadenylering. Egnede 3'-flankerende sekvenser er f.eks. de av genet som naturlig er forbundet med ekspresjonskontrollsekvensen som benyttes. Dersom gjær benyttes som vertsorganismer er de foretrukne flankerende sekvensene de av gjær PH05 genet. Fortrinnsvis er DNA-konstruksjonen ved begge ender utstyrt med syntetiske deoksynukleotidlinkere som tillater innføring og kloning av konstruksjonen i en kloningsvektor.

Den eukaryotiske ekspresjonskontrollsekvensen, DNA-sekvensen som koder for signalpeptidet, DNA-sekvensen som koder for modent desulfatohirudin og de eukaryotiske transkripsjonster-mineringssignalene er operabelt forbundet med hverandre, dvs. er sidestilt på en slik måte at deres normale funksjoner opprettholdes. Følgelig er rekken slik at ekspresjonskontroll sekvensen bevirker egnet ekspresjon av signalpeptid-desulfatohirudingenkomplekset, transkripsjonstermineringssig-nalene bevirker egnet terminering av transkripsjon og polyadenylering og signalsekvensen er forbundet med desulfatohirudingenet på en slik måte at utskillelse av desulfatohirudin finner sted. Dersom ekspresjonskontrollsekvensen og signalsekvensen er avledet fra forskjellige gener er følgelig ekspresjonskontrollsekvensen fortrinnsvis koblet til signal sekvensen mellom hoved mRNA starten og ATG for genet som naturlig er knyttet til ekspresjonskontrollsekvensen. Signal sekvensen bør ha sin egen ATG for translasjonsinitie-ring. Forbindelsen mellom disse sekvenser er fortrinnsvis bevirket ved hjelp av syntetiske oligodeoksynukleotid-linkere som kan bære gjenkjennelsessekvens for en endonuklease. På den annen side er det siste kodonet for signalsekvensen direkte forbundet med det første kodonet av genet for desulfatohirudin.

DNA-konstruksjonene kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken, f.eks. ved å forbinde en eukaryotisk ekspresjonskontrollsekvens, en DNA-sekvens bestående av første DNA-sekvens som koder et signalpeptid oppstrøms for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for desulfatohirudin, og en DNA-sekvens Inneholdende eukaryotiske transkripsjonstermineringsslgnaler på en slik måte at egnet ekspresjon av DNA-segmentet og utskillelse av det dannede desulfatohirudinet bevirkes i en eukaryotisk vertsorganisme.

Forbindelse av de forskjellige DNA-sekvenser slik at DNA-konstruksj onene oppnås, kan bevirkes med buttende-ligering eller ved hjelp av en egnet felles restrlksjonssete eller syntetiske linkermolekyler når det tas spesielt hensyn til korrekt forbindelse slik at normale funksjoner for disse DNA-substituentene opprettholdes. Følgelig kan signalsekvensen og desulfatohirudingenet sammensmeltes ved buttende-ligering. En annen fremgangsmåte for å danne den korrekte forbindelse mellom signalsekvensen og desulfatohirudingenet består i restriksjon, om mulig, av signalsekvensen nær dens 3'-terminal og desulfatohirudinet nær dets 5'-terminal slik at begge sekvenser mangler et på forhånd bestemt antall basepar. En syntetisk oligodeoksynukleotidlinker kan deretter konstrueres på en slik måte at ved sammenføyning av den restriksjonsunderkastede signalsekvens og det restriksjonsunderkastede desulfatohirudingenet ved hjelp av det forbin-dende oligodeoksynukleotidet gjenopprettes de manglende baseparene og desulfatohirudingenet befinner seg i den egnede leserammen relativt til signalsekvensen. DNA-sekvensen som koder for desulfatohirudin kan isoleres fra genomisk blodigle DNA eller et komplementært dobbelt-kjedet desulfatohirudin-DNA (desulfatohirudin ds cDNA) fremstilles fra desulfatohirudin mRNA, eller et gen som koder for aminosyresekvensen av desulfatohirudin fremstilles ved hjelp åv kjemiske og enzymatiske prosesser.

Genomisk desulfatohirudin DNA og desulfatohirudin ds cDNA oppnås f.eks. ved fremgangsmåter som i og for seg kjent er kjente. For eksempel oppnås genomisk desulfatohirudin DNA fra en blodiglegenbank som inneholder desulfatohirudingenet ved å klone blodigle DNA fragmentene i en mikroorganisme og identifisere kloner som inneholder desulfatohirudin DNA, f.eks. ved kolonihybridisering ved å anvende et radioaktivt merket desulfatohirudin DNA-spesifikt oligodeoksynukleotid som inneholder minst 15, og fortrinnsvis 15 til 30, deoksyn-ukleotider. De resulterende DNA-fragmentene inneholder som regel i tillegg til desulfatohirudingenet andre uønskede DNA-bestanddeler som kan fjernes ved behandling med egnede ekso-eller endonukleaser.

Dobbelt-kjedet desulfatohirudin cDNA kan fremstilles f.eks. ved å isolere mRNA fra egnede blodigleceller, som fortrinnsvis er indusert slik at hirudin dannes, anrikning av desulfatohirudin mRNA i den resulterende mRNA-blandingen på en måte som i og for seg er kjent, dette mRNA anvendes som et templat for fremstillingen av enkeltkjedet cDNA, syntetiser-ing av dette, ved hjelp av RNA-avhengig DNA-polymerase, ds cDNA, og kloning av sistnevnte i en egnet vektor. Kloner som inneholder desulfatohirudin cDNA identifiseres, f.eks. som beskrevet ovenfor, ved kolonihybridisering ved anvendelse av et radioaktivt merket, desulfatohirudin DNA-spesifikt oligodeoksynukleotid.

Desulfatohirudingenet kan også fremstilles ved kjemisk syntese.

Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at segmenter av den kodende og den komplementære kjeden for nevnte gen syntetiseres kjemisk og de resulterende segmentene omvandles enzymatisk til et strukturgen fra desulfatohirudin.

Den kjemiske syntese av DNA er velkjent innen teknikken, og gjør bruk av konvensjonelle teknikker. Egnede teknikker er sammenfattet av S.A. Narang [Tetrahedron 39, 3 (1983)]. Spesielt kan fremgangsmåtene beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 146 785 benyttes og dette er innbefattet heri som referanse.

På tilsvarende måte kan signalsekvensen fremstilles ved kjemisk syntese eller isoleres fra kromosomalt DNA fra en egnet eukaryotisk organisme. 3. Vektorer inneholdende DNA-konstruksjoner med de kodende områder av et signalpeptid og av desulfatohirudin.

Som nevnt tidligere, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor som er kjennetegnet ved at den inneholder en gjærpromotor valgt fra gruppen bestående av PH05-promotoren, GAPDH-promotoren og en hybridpromotor innbefattende oppstrøms aktiveringssekvenser av PH05-<g>enet og nedstrømspromotorelementer innbefattende en funksjonell TATA-boks av GAPDH-genet, et DNA-segment bestående av en første sekvens som koder PH05 eller invertasesignalpeptidet oppstrøm for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for et modent desulfatohirudin, valgt fra bestående av des-(Leu<64>, Gin<65>)-desulfatohirudin-variant HVI, des-(Gln<65>)-desulfatohirudin-variant HVI, desulfatohirudin-variant HVI, desulfatohirudin-variant HV2, desulfatohirudin-variant PA og funksjonelle derivater derav, hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av nevnte gjærpromotor, og en DNA-sekvens som inneholder eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler, og en selektiv markør valgt fra gruppen bestående av URA2, URA3, URA 4, LEU2, HIS3, HIS4, TRP5 og TRP1.

I fordelaktige hybridplasmider bærer de ytterligere DNA-sekvensene et gjærreplikeringsopphav, og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridplasmider inneholdende et gjærreplikeringsopphav, f.eks. et autonomt replikerende segment,

(ars), opprettholdes ekstrakromosomalt Inne 1 gjærcellene etter transformasjon, og replikeres autonomt ved mltose. Hybridplasmider inneholdende sekvenser homologe med gjær 2 ji plasmid DNA kan også benyttes. Disse hybridplasmidene som vil bli integrert ved rekombinasjon i 2 \ i plasmider som allerede er tilstede i cellen eller vil replikere autonomt.

Når det gjelder selektive genmarkører for gjær, kan en hvilken som helst genmarkør benyttes, som letter seleksjonen av transformanter forårsaket av fenotypisk ekspresjon av markøren. Egnede markører for gjær er spesielt de som uttrykker antibiotisk resistens eller, i tilfelle auksotrope gjærmutanter, gener som komplementerer vertslesjoner. Tilsvarende gener gir f.eks. resistens overfor antibiotisk cykloheksimid eller tilveiebringer prototropi i en auksotrop gjærmutant, f.eks. URA1, URA3, ARG4, LEU2, HIS4, HIS3, TRP5 eller TRPl-genet.

Fortrinnsvis innbefatter de ytterligere DNA-sekvensene som er tilstede i hybridplasmidet også et replikeringsopphav og en selektiv genetisk markør for en bakteriell vert, spesielt Escherichia coil. Det er nyttige trekk som er knyttet til nærværet av et E. coil replikeringsopphav, og en E. coil markør i et gjærhybridplasmid. For det første kan store mengder hybridplasmid DNA oppnås ved vekst og forsterkning i E. coli. og for det andre utføres konstruksjonen av hybridplasmider hensiktsmessig i E. coil ved at det gjøres bruk av hele repertoaret av kloningsteknologi basert på E. coli. E. coli-lasmider. så som pBR322 og lignende, som inneholder både E. coll-replikeringsopphav og E. coll-genetiske markører som gir resistens mot antibiotika, f.eks. tetracyklin og ampicillin, og som med fordel anvendes som del av gjærhybrid-vektorene.

De ytterligere DNA-sekvensene som f.eks. inneholder replikeringsopphav og genetiske markører for gjær og en bakteriell vert (se ovenfor), betegnes heretter som "vektor DNA" som sammen med den ovenfor nevnte DNA-konstruksjonen, inneholdende blant annet ekspresjonskontroll-sekvensen og desulfatohirudingenet, danner et hybridplasmid.

Vektorene kan inneholde et eller flere DNA-innskudd, hvert innbefattende, blant annet, ekspresjonskontrollsekvensen, DNA-sekvensen som koder signalpeptidet, og DNA-sekvensen som koder for modent desulfatohirudin. Dersom hybridvektorene inneholder flere DNA-innskudd, fortrinnsvis 2 til 4 DNA-innskudd, kan disse være tilstede I en tandemrekke eller med forskjellige posisjoner på hybridvektoren. Foretrukne hybridvektorer inneholder et DNA-innskudd eller DNA-innskuddet i en tandemrekke. DNA-innskuddene er spesielt anordnet hodet til hale.

Hybridplasmidene fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken. Fremgangsmåten for fremstillingen av vektorene innbefatter innføring av en eller flere DNA-konstruksj oner inneholdende en eukaryotisk ekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment bestående av en første DNA-sekvens som koder et signalpeptid oppstrøm for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for modent desulfatohirudin hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens inneholdende eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler, som sådanne eller ved innføring av komponentene av nevnte DNA-konstruksjoner trinnvis i den på forhånd bestemte rekkefølge i en vektor DNA.

Konstruksjonen av hybridplasmidene utføres ved å anvende konvensjonelle ligeringsteknikker. Komponentene av plasmidene forbindes ved felles restriksjonsseter og/eller ved hjelp av syntetiske linkermolekyler, og/eller ved buttende-ligering.

De lineære DNA-vektorene tilsvarer i det vesentlige DNA-konstruksjonene angitt i avsnitt 2 og fremstilles på en analog måte.

4. Transformerte eukaryotiske vertsorganismer.

Egnede eukaryotiske vertsorganismer er spesielt de som er angitt ovenfor, spesielt gjær innbefattende spesies av slektene Kluvveromvces. Candlda. Pichla. Yarrowia. Saccharomvces. Schlzosaccharomyces. Torulopsls. og beslektede slekter (kfr. J. Lodder, "The Yeastes", Amsterdam 1971), og spesielt stammer av Saccharomvces cerevisiae.

De transformerte eukaryotiske vertsorganismene er valgt fra en eukaryotisk vertsorganisme transformert med et hybrid plasmid inneholdende et eller flere DNA-innskudd, hvert innbefattende en eukaryotisk ekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment bestående av en første DNA-sekvens som koder et signalpeptid oppstrøm for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for modent desulfatohirudin hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens inneholdende eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler, og en eukaryotisk vertsorganisme med nevnte DNA-innskudd stabilt integrert I et vertskromosom.

Fremgangsmåten for fremstilling av nevnte transformerte eukaryotiske vertsceller innbefatter transformering av eukaryotiske vertsceller med en hybridvektor inneholdende et eller flere DNA-innskudd hvert innbefattende en eukaryotisk ekspresjonskontrollsekvens, en DNA-sekvens, bestående av en første DNA-sekvens, som koder et signalpeptid oppstrøm for, og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for modent desulfatohirudin hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens inneholdende eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler.

Transformasjonen av de eukaryotiske vertscellene oppnås ved fremgangsmåter som er kjente Innen teknikken. For eksempel kan transformasjonen av gjær med hybridvektorer oppnås ved fremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al., [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. Denne fremgangsmåten kan oppdeles

i tre trinn:

(1) Fjernelse av gjærcelleveggen eller deler derav ved anvendelse av forskjellige preparater av glukosidase, slik som snegletarmsafter (f.eks. "Glusulase" eller "Hel icase") eller enzymblandlnger oppnådd fra mikroorganismer, (f.eks. "Zymolase") i osmotisk stabiliserte oppløsninger (f.eks. IM sorbitol). (2) Behandling av de "nakne" gjærcellene (spheroplastene) med DNA vektoren i nærvær av PEG (polyetylenglykol) og Ca^<+->ioner. (3) Regenerering av celleveggen og seleksjon av de transformerte cellene i et fast lag av agar. Denne regenereringen utføres hensiktsmessig ved å neddykke spheroplastene i agar. For eksempel blandes smelteagar (ca. 50°C) med spheroplastene. Ved avkjøling av oppløsningen til gjærvekst-temperatur (ca. 30°C) oppnås et fast lag. Dette agarlaget hindrer raskt diffusjon og tap av viktige makromolekyler fra spheroplastene og letter derved regenereringen av celleveggen. Imidlertid kan cellevegg-regenerering oppnås (riktignok med lavere effektivitet) ved å belegge spheroplastene på overflaten av på forhånd fremstilte agarlag.

Fortrinnsvis fremstilles regenereringsagaren på en slik måte at regenerering og seleksjon av transformerte celler tillates samtidig. Siden gjærgener som koder for enzymer av aminosyre biosyntetiske veier generelt anvendes som selektive markører (supra) utføres regenereringen fortrinnsvis i gjær minimalt mediumagar. Dersom svært høye effektiviteter for regenerering er påkrevet, er følgende to-trinns fremgangsmåter fordelaktige: (1) regenerering av celleveggen i et rikt komplekst , medium, og (2) seleksjon av de transformerte celler ved replikabelegning av cellelaget på selektive agarplater.

Når den ovenfor nevnte lineære DNA-vektoren benyttes for transformasjon av de eukaryotiske vertscellene, utføres transformasjonen fortrinnsvis i nærvær av en andre vektor inneholdende en selektiv markør for gjær. Denne kotransfor-masjonen tillater anrikning av de vertsceller som har tatt opp DNA som ikke direkte kan selekteres. Idet kompetente celler tar opp en hvilken som helst type DNA, vil en høy prosentandel av cellene transformere med en selektiv vektor og vil også inneholde eventuelt ytterligere DNA (som den ovenfor nevnte lineære DNA-vektoren).

De transformerte eukaryotiske vertsorganismer, spesielt de transformerte gjærstammer, som inneholder hybridplasmidene eller som har den lineære DNA-vektoren innbefattende desulfatohirudingenet stabilt integrert i et vertskromosom, kan få forbedret produksjon av desulfatohirudin ved mutasjon og seleksjon ved å anvende fremgangsmåter som er kjente innen teknikken. Mutasjonen kan f.eks. bevirkes ved U.V.-bestråling eller egnede kjemiske reagenser. Spesielt foretrukket er fremstillingen av mutanter med proteaseunderskudd, spesielt gjærmutanter, slik at proteolytisk nedbrytning av det fremstilte desulfatohirudinet Inne i cellene unngås. Egnede mutanter kan utvelges og isoleres i konvensjonelle fremgangsmåter .

Oppfinnelsen vedrører spesielt DNA-konstruksjoner innbefattende desulfatohirudingenet, hybridvektorene, de transformerte eukaryotiske vertsorganismene og fremgangsmåtene for fremstilling derav, såvel som fremgangsmåten for fremstilling av proteiner med hirudinaktivitet som beskrevet i eksemplene.

I den følgende eksperimentelle delen beskrives forskjellige utførelsen av foreliggende oppfinnelse under henvisning til de vedlagte tegningene, hvori: Fig. 1 og 2 er skjematiske diagrammer som viser konstruksjoner av plasmidene henholdsvis pML300 og pML305. Fig. 3 viser konstruksjonen av plasmid pHRil48, inneholdende trp-promotor.

Fig. 4 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmid pML310.

Fig. 5 er et skjematisk diagram som viser isoleringen av et DNA-fragment som koder for modent desulfatohirudin. Fig. 6 viser skjematisk konstruksjonen av et ekspresjonsplasmid for utskillelse av desulfatohirudin. Fig. 7 viser skjematisk konstruksjonen av et ekspresjonsplasmid for intracellulær ekspresjon av desulfatohirudin. Fig. 8 viser DNA-sekvensen av BamHI-Sall restriksjonsfragmen-tet av PH05 innbefattende PH05 promotorområdet. Fig. 9 viser DNA-sekvensen av promotorområdet av GAPDH-genet. Fig. 10 viser et skjematisk diagram som viser konstruksjonen av plasmid pGAPDH-El. Fig. 11 viser sekvensene av GAPDH promotorfragmentene som er tilstede i plasmider pGAPDH-FL og pGAPDH-EL. Fig. 12 viser konstruksjonen av plasmid pJDB207/PHO5 (Eco)-HIR. Fig. 13 viser konstruksjonen av plasmid pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2). Fig. 14 viser konstruksjonen av plasmid pJDB207/[GAPEL-HIR]D.. Fig. 15 er et skjematisk diagram som viser konstruksjonen av plasmid pJDB207/GAPFL-I-HIR.

De følgende forkortelser er benyttet I figurene: p promotor, SS signalsekvens, t terminator, L linker.

De følgende eksemplene tjener som en illustrasjon av foreliggende oppfinnelse.

Eksperimentell del

Betydningene av forkortelsene anvendt i eksemplene er som følger: TNE oppløsning som inneholder 100 mM NaCl, 50 mM

Tris-HCl, pH 7,5 og 5 mM EDTA.

SDS natriumdodecylsulfat

EDTA etylendiamid-tetraeddiksyre

DTT 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butandiol) BSA bovint serumalbumin

EtBr etidiumbromid

tris tris-(hydroksymetyl)-aminometan

tris*HCl tris monohydroklorid

Eksempel 1

Fremstilling av beskyttet nukleosid- polvstvrenharpiks

750 mg ravsyreanhydrid og 910 mg 4-dimetylaminopyridin tilsettes 2,57 g (5 mmol) 5 *-(4-metoksytrityl)-tymidin (MMT-

0-T-OH) 1 20 ml absolutt pyrldin, og det hele får stå ved romtemperatur i 16 timer. Etter oppkonsentrering av pyridin-oppløsningen tas den opp i 200 ml etylacetat, ekstraheres to ganger med 200 ml, 0,1 M fosfatbuffer, hver gang med tilsats av 10 ml mettet natriumkloridoppløsning, vaskes igjen med mettet natriumkloridoppløsning, tørkes, konsentreres og heksan tilsettes dråpevis. Det utfelte produktet frasepareres og tritureres to ganger med eter, oppløses deretter i 300 ml etylacetat og ekstraheres ved risting ved 0°C med 180 ml 0,1 M kaliumbisulfat, med pH 2,5. Etter vasking med vann to ganger, tørkes etylacetatoppløsningen med natriumsulfat, filtreres, 0,5 ml pyrldin tilsettes og det hele konsentreres og fortynnes ved dråpevis tilsats av heksan. Det utfelte ravsyrederivatet fjernes ved filtrering.

1,0 g av denne forbindelsen oppløses sammen med 190 mg N-hydroksysuksinimid i 4 ml etylacetat og 2 ml dimetylformamid og 370 mg N,N'-dicykloheksylkarbodiimid tilsettes ved 0°C. Etter henstand over natten i et kjøleskap frafiltreres det utfelte N,N'-dicykloheksylurea, filtratet fortynnes med etylacetat, ekstraheres med kald 0,1 M natriumbikarbonat og vann, tørkes og konsentreres til tørrhet ved inndamping i vakuum. Resten kromatograferes med etylacetat på silikagel.

TLC: Rf 0,45 i diklormetan/metanol (9:1).

100 mg av denne N-suksinimidoylravsyreesteren omrøres i 20 timer med 1 g aminometylpolystyren (amininnhold 110 jjmol/g) i 2 ml diklormetan og 4 ml dimetylformamid. Polymerharpiksen frafiltreres og ekstraheres ved vasking med dimetylformamid, metanol, diklormetan og metanol. Etter tørking acetyleres de uomsatte aminogruppene ved omrøring av harpiksen i 6 ml pyrldin med 1 ml eddiksyreanhydrid og 100 mg 4-dimetylaminopyridin i 30 minutter. Polymerharpiksen ekstraheres ved vasking med diklormetan, dimetylformamid, metanol og diklormetan og tørkes til en konstant vekt er oppnådd. Den

spektroskopiske metoksytrityl (MMT)-bestemme!sen gir en verdi . på 57 >imol/g.

Eksempel 2

Den følgende beskyttede nukleosid/polystyrenharpiksen fremstilles analogt eksempel 1:

fra 5'-(4-metoksytrityl)-N-isobutyryl-deoksyguanosid, mengde 32 pmol/g.

Eksempel 3:

Syntese av trinukleotidet

a) Syntese av dinukleotidet;

7,73 g (15 mmol) 5'-(4-metoksytrityl)-tymidin (MMT-0-T-OH)

konsentreres to ganger ved fordamping med absolutt pyrldin. Resten oppløses i 20 ml absolutt tetrahydrofuran og tilsettes dråpevis til 80 ml av en 0,2M oppløsning av 2-klorfenyl-di-(1-benzotriazolyl)-fosfat i tetrahydrofuran under omrøring og

under utelukkelse av fuktighet, og reaksjonsblandingen omrøres i 1 time ved romtemperatur. Den resulterende oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-metoksytrityl )-tymidin-3*-fosfat oppdeles i 3 porsjoner. a) Hydrolyse av trietylammonium-2-klorfenyl-5'-(4-metoksytrityl )-tymidin-3'-fosfater: 100 ml av 0,5 M trietylammonium-bikarbonat tilsettes til en tredjedel av den ovenfor nevnte oppløsningen av 2-klorfenyl-1- benzotriazolyl-5'-(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfat under avkjøling. Etter 15 minutter utføres ekstraksjonen med diklormetan. Diklormetanoppløsningen vaskes med vann, oppkonsentreres og petroleumseter tilsettes dråpevis. Det resulterende bunnfallet frafiltreres under undertrykk ekstraheres ved vasking med eter/petroleumseter 1:1 og tørkes i vakuum. TLC: Rf 0,35 i diklormetan/metanol/vann (75:22:3). e) Forestring til 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-5'-(4-metoksytrityl )-tymidin-3 ' -fosfat og fjernelse av 4-metoksytrityl-beskyttelsesgruppen: 1,3 ml 2-cyanoetyl og 2 ml pyrldin tilsettes til en tredjedel av oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfater. Blandingen får stå over natten ved romtemperatur. Oppløsningsmidlene avdestilleres i vakuum, og resten oppløses i etylacetat og ekstraheres gjentatte ganger ved risting med 0,1 M fosfatbuffer ved pH 7 og vann. Den organiske fasen tørkes, konsentreres og tilsettes dråpevis til heksan. Bunnfallet frafiltreres og oppløses i 50 ml diklormetan/metanol 7:3 og tilsettes ved 0°C en oppløsning av 3,8 g p-toluensulfonylsyremonohydrat i 75 ml diklormetan/metanol 7:3. Etter 2 timer fortynnes reaksjons-oppløsningen med diklormetan og ekstraheres ved risting med en kald natriumbikarbonatoppløsning. Den organiske fasen oppkonsentreres og heksan tilsettes. Det utfelte 2-cyanoetyl-2- klorfenyl-tymidin-3'-fosfatet kromatograferes på silikagel med diklormetan/metanol 96:4. TLC: Rf 0,45 i diklormetan/- metanol (9:1). 7 ) Kondensasjon til 5 '-(4-metoksytrityl )-3~'-cyanoetyl-bis- , tymidin-dinukleotid: 2,2 g 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-tymidin-3'-fosfat dehydreres ved to ganger konsentrering ved fordampning med absolutt pyrldin, og produktet oppløses i 20 ml abs. tetrahydrofuran og tilsettes til den gjenværende tredjedelen av oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfat. Etter 18 timer ved romtemperatur tilsettes 10 ml vann og 200 ml etylacetat til reaksjonsoppløsningen under avkjøling med is. Den organiske fasen vaskes gjentatte ganger med natriumbikarbonat og vann, tørkes over natriumsulfat og konsentreres til et lite volum. Dinukleotidet, beskyttet i fosfatdelen ved 5'- og 3'-enden, utfelles ved dråpevis tilsats til eter/heksan 1:1. TKC: Rf 0,48 i diklormetan (9:1).

b) Syntese av trinukleotid:

1,17 g (1 mmol) av det ovenfor omtalte fullstendig beskyttede

dinukleotidet oppløses i 30 ml diklormetan/metanol 7:3 og under avkjøling med is tilsettes en oppløsning av 1,9 g p-toluensulfonsyremonohydrat i 20 ml diklormetan/metanol 7:3. Etter 2 timer tilsettes iskald natriumbikarbonatoppløsning og ekstraksjonen utføres med diklormetan. Den organiske fase tørkes, konsentreres og tilsettes dråpevis til heksan. Det utfelte rå dinukleotidet med en fri 5'-hydroksygruppe kromatograferes på silikagel med en gradient på 2- 8% metanol i diklormetan.

TLC: Rf 0,33 i diklormetan/metanol (9:1).

850 mg av dette 5'-hydroksy-dinukleotidet og 1,06 g trietylammonium-2-klorf enyl-5 '-(4-metoksytrityl )-tymidin-3 '-fosfat [kfr. avsnitt a), a)] konsentreres to ganger ved fordampning med pyrldin, oppløses deretter i 10 ml abs. pyrldin og 560 mg l-mesitylensulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT) tilsettes. Etter 2 timer tilsettes 2 ml iskaldt vann og etter ytterligere 1 time utføres ekstraksjon med diklormetan. Den organiske fasen vaskes med mettet natriumbikarbonatoppløsning

og vann, tørkes, konsentreres og eter tilsettes. Det utfelte trinukleotidet renses ved kromatografi på silikagel.

Rf 0,45 i diklormetan/metanol (9:1).

Eksempel 4

Analogt eksempel 3, fremstilles følgende beskyttede trinukleotider av den generelle formel

forkortet til B<1>B<2>B<3>. Følgende forkortelser benyttes for nukleosider B<1>, B2, B3:

A = N-benzoyl-deoksyadenosin

C = N-benzoyl-deoksycytidin

G = N-isobutyryl-deoksyguanosin

T = tymidin.

<a>) Tynnsjiktkromatografi på silikagel i diklormetan/metanol 9:1.

Eksempel 5

Syntese av DNA- fragment et av en lengde på 67 baser fra base nr. 96 til base nr. 162 av DNA- kleden 96/ 97

a) Fjernelse av 2-cyanoetyl-beskyttelsesgruppen fra trinukleotidene: 10 jjmol av trinukleotidene fra eksempel 3 eller 4 oppløses, under utelukkelse av fuktighet, i 60 pl pyridin/acetonitril/ trietylamln 1:1:1. Etter 1 time ved romtemperatur tilsettes dråpevis 0,7 ml peroksyd-fri eter og bunnfallet fjernes ved sentrifugering. Det rå trietylammmoniumsaltet oppløses i 50 pl pyrldin og utfelles igjen med 0,5 ml eter, fra-sentrifugeres og tørkes i høyvakuum i 15 timer. b) Kobling av de delvis beskyttede trinukleotidene med oligonukleotidkjeden bundet til polystyrenharpiks: Alle operasjoner ble utført under utelukkelse av fuktighet i en reaksjonsbeholder med volum 220 pl med mikroprosessor-kontrollert tilsats av oppløsningsmiddel og reagens. 13 mg (0,74 pmol) av tymidin/polystyrenharpiksen (eksempel 1) plasseres i reaksjonsbeholderen og underkastes følgende operasjoner:

1. Metylenklorid, 2 ml/min., 4 minutter.

2. Metylenklorid/isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2 minutter. 3. Sinkbromid IM og 1,2,4-triazol 0,02 M i metylenklorid/isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2-3,5 minutter. 4. Metylenklorid/isopropanol (85:15), 2 ml/min., 4 minutter. 5. Trietylammoniumacetat 0,5 M i DMF, 2 ml/min., 5 minutter.

6. Molekylarsikt-tørket pyrldin, 2 ml/min., 3 minutter.

7. Tetrahydrofuran (peroksydfri, molekylarsikttørket), 2 ml/min., 3 minutter.

8. Nitrogenstrøm, 10 minutter.

9. Injeksjon av 10 pmol trinukleotid GTC (trimetyl-ammoniumsalt fra avsnitt a)) og 8,9 mg (30 pmol) 1-mesitylensulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT)

oppløst i 150 pl pyrldin.

10. 45°C, 20 minutter.

11. Pyrldin, 2 ml/min., 4 minutter.

12. Eddiksyreanhydrid 5% og 4-dimetylaminopyridin 2, 5% i pyrldin, 2 ml/min., 4 minutter.

13. Pyrldin, 2 ml/min., 4 minutter.

14. Pyridin/isopropanol (1:1), 2 ml/min., 3 minutter.

Alle 14 operasjoner ble gjentatt 21 ganger, men i den 9. operasjonen ble i steden for GTC følgende trinukleotider benyttet i form av deres trietylammoniumsalter (avsnitt a)) i den angitte rekkefølge. GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA,

CGC, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG,

CCT, CAT. Det midlere koplingsutbyttet er 9756. Sluttproduktet har følgende struktur:

c) Fjernelse av DNA-fragmentet fra bæreren bg fjernelse av , beskyttelsesgruppen: 40,0 mg (ca. 0,60 pmol) av DNA-synteseharpikser 96/67 holdes ved 50°C i 3 timer og ved romtemperatur i 12 timer med 66 mg (0,40 mmol) av o-nitrobenzaldoksim og 50 pl (0,40 mmol) 1,1,3,3-tetrametylguanidin i 400 pl av 95* pyrldin. Etter avblåsning av pyrldin med nitrogen tilsettes 1,6 ml vandig ammoniakk ( 33%) til resten og det hele holdes i 24 timer ved 50°C i en lukket beholder.

Den flytende fasen som frasepareres frigjøres for ammoniakk i vakuum, og vaskes tre ganger med 3 ml peroksydfri dietyleter hver gang. Etter fjernelse av de laveremolekylære bestanddelene på en "Biogel P6"-kolonne (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 molar trimetylammoniumbikarbonat pH 7,5, 1,5 ml/min.), isoleres 285 ODs (260 nm) av DNA.

Totalt 60 ODs separeres på en HPLC-kolonne (PRP-1/Haml1ton, 250x4,6 mm). Gradient (oppløsning A; 0,05 M trietylammoniumacetat pH 7,0; oppløsning B; oppløsning A; acetonitril 1:1): 30* BIA, 60* B i A i 20 minutter ved 50°C og 2 ml/min. Den lipofile hovedtoppen (retensjonstid ca. 14 minutter) samles, konsentreres over en "DE52"-cellulose-kolonne (Whatmat), elueres og utfelles med etanol. For å fjerne 4-metoksytrityl-beskyttelsesgruppen oppløses bunnfallet i 50 pl eddiksyre/H20 (4:1) og holdes ved romtemperatur i 45 minutter. Reaksjonsproduktet lyofiliseres, utfelles med etanol og, for rensing separeres det elektroforetisk på en 8% polyakrylamidgel (7 M urea). Båndende svarende til den ønskede DNA-størrelsen skjæres ut og produktet elektroelueres, konsentreres over "DE52"-cellulose og DNA 96/97 av følgende struktur:

utfelles med etanol.

Eksempel 6:

Følgende DNA-fragmenter (5'-3') fremstilles analogt eksempel 5:

Eksempel 7:

Fosforylering av fragmentene 1/58, 46/64 og komplementær, 96/67 og 154/65 komplementær.

Fosforyleringen og den radioaktive merkingen ved 5'-endene bevirkes med [-y~<32>P] ATP og T4 polynukleotidkinase (Boehringer) som beskrevet i "Molecular Cloning, A laboratory Manual" (red. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab. 1982, side 125.

Eksempel 8

Polymer!sasjon til dupleks II (fragment F2 av desulfatohiru-dln HC1 genet)

50 pmol i hvert tilfelle av kinasert fragment 96/67 og kinasert fragment 154/64 oppløses i 24 pl vann, oppløsningen oppvarmes til 90°C i 3 minutter og avkjøles til 12°C i løpet av et tidsrom på 5 minutter. Etter tilsats av 4 pl endo-R-buffer (0,1 molar tris.HCl pH 7,5, 66 mM MgCl2, 66 mM e-merkaptoetanol, 0,6 M NaCl), 10 pl deoksynukleosidtrifos-fatblanding, (dATO, dCTP, dGTP, TTP, alle 2xl0-<3> molar, innstilt med NH3 på pH 7,0) og 2 pl (10 enheter) av DNA-polymerase I, Klenow fragment (Boehringer) utføres inkuberlng i 30 minutter ved 12°C. Reaksjonen stoppes ved oppvarming til 90"C i 3 minutter og blandingen lagres ved -80'C inntil den er påkrevet for videre bearbeidelse.

På tilsvarende måte omsettes de kinaserte fragmentene 1/58 og 46/64 slik at dupleks I dannes (fragment F^ av desulfatohirudingenet ).

Duplekser I og II har følgende strukturer:

Dupleks I Dupleks II

Fremstillingen av fragmentene F^ og F2 av desulfatohirudingenet er illustrert i følgende skjema 1:

Eksempel 9

Polymer i sas. 1 on og ligerlng av fragmentene 1/ 58. kinasert 46/ 64. kinasert 96 1bl og 154/ 64; fremstilling av desulfatohirudin EVI- genet

I hver tilfelle ble 50 pmol av fragmentet 1/58, kinasert 46/64, kinasert 96/67 og 154/64, oppløst i 48 pl vann, oppløsningen ble oppvarmet i 3 minutter ved 90* C og i løpet av 5 minutter avkjølt til 12°C. Etter tilsats av 8 pl endo-R-buffer (kfr. eksempel 8), 20 pl deoksynukleosidtrifos-fatblanding (dATP, dCTP, dGRF, TTP i hvert tilfelle 0,002 molar, regulert til pH 7,0 med NE3) og 2 pl (10 enheter) DNA polymerase I, utføres Klenow-fragment (Boehringer) inkubert i 30 minutter ved 12° C. Reaksjonen stoppes ved oppvarming i 3 minutter til 90°C, og DNA isoleres, etter ekstraksjon med fenol/kloroform, ved utfelling av etanol. Den resulterende DNA-blandingen oppløses i 100 pl ligase/buffer (66 mM tris.ECl pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 5 mM ATP), 50 enheter (2 pl), T4 DNA-ligase (Biolabs) tilsettes, og det hele inkuberes i 20 timer ved 20°C. Reaksjonen stoppes ved oppvarming i 5 minutter til 70° C og DNA isoleres, etter ekstraksjon med fenol/kloroform, ved utfelling med etanol. Etter separering av blandingen på en 8% polyakrylamidgel (denaturering) ved elektroforese, elektroelueres ligerings-produktet med 217 basepar, konsentreres på en "DE52"-cellulosekolonne, og isoleres, etter eluering, ved utfelling av etanol.

Desulfatohirudingenet har følgende struktur:

Fremstillingen av desulfatohirudingenet fra de fire fragmentene er illustrert i følgende skjema 2:

Eksempel 10 Konstruksjon av plasmidet pML 300 inneholdende Fj- DNA for desulfatohirudin HVl- genet ( flg. 1) a) Fremstilling av den lineariserte vektoren pBR322/ EcoRI/ PvuII. 5 pg av pBR322 plasmid DNA nedbrytes med 5 enheter av PvuII restriksjonsendonuklease (Biolabs) i 200 ml av en oppløsning av 100 pg/ml gelatin i 1 time ved 37°C. Deretter reguleres denne oppløsningen til 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl og DNA nedbrytes med 30 enheter av EcoRI-restriksjonsendonuklease (Biolabs) i 2 timer ved 37°C. Oppløsningen reguleres deretter til 50 mM tris-BXl pH 8, og inkuberes, ved en DNA-konsentrasjon på 10 pg/pl, med to enheter av intestinal alkalisk kalvefosfatase (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved å oppvarme oppløsningen i 60 minutter til 65°C. Oppløsningen standardiseres deretter med TNE, ekstraheres med en volumdel fenol og kloroform, og det nedbrutte DNA utfelles med to volumdeler alkohol ved -20°C over natten.

Vektoren (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 basepar) utskåret fra pBR322 DNA, separeres fra det lille DNA-fragmentet (2076 basepar) ved gelelektroforese på 1* lavtsmeltende agarose, (Biorad) i tris-acetat-EDTA-buffer pH 8. Etter farging av DNA

i agarosegelen med EtBr utskjæres arealet av gelen som inneholder DNA-båndet for pBR322/EcoRI/PvuII vektoren (= 2297 basepar) og flytendegjøres 10 minutter ved 65°C. 20 volumdeler TNE tilsettes til denne DNA-oppløsningen, DNA renses ifølge Mueller et al. [J. Mol. Biol. 124, 343, (1978)] ved "DE-52" kromatografi, ekstraheres med fenol/kloroform og DNA utfelles med alkohol ved -20"C over natten. DNA-bunnfallet oppløses i 50 pl 0,01 M tris.HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA, og lagres ved -20°C inntil det skal bearbeides videre. 1,4 pg (= 3,2 pmol av ender) av DNA oppnås.

b) Fremstilling av Fj- DNA/ EcoRI

24 ng (= 1,3 pmol av ender) av det kjemiske syntetiserte F^-DNA (se eksempel 8) nedbrytes med 5 enheter av EcoRI restriksjonsendonuklease (Biolabs) i 50 pl av 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl og 100 pg/ml gelatin i 30 minutter ved 37°C. Deretter tilsettes 0,06 g (= 0,14 pmol av endene) av den linearlserte vektoren pBR322/EcoRI/PvuII (eksempel 10a) til oppløsningen. Enzymet inaktiveres deretter etter 10 minutter ved oppvarming til 65"C, og oppløsningen standardiseres med TNE og ekstraheres med fenol/kloroform. DNA utfelles ved alkohol. Det utfelte DNA lagres under alkohol ved -20°C Inntil videre bearbeidelse.

c) Ligering av pbR322/ EcoRI/ PvuII- vektor DNA med Fj- DNA/ EcoRI og konstruksjon av plasmid pML300

DNA-bunnfallet oppnådd i eksempel 10b, som Inneholder de to nevnte DNA-f ragmenter, oppløses i 20 pl av en oppløsning av 50 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, og 100 pg/1 gelatin og behandles med 25 enheter/pl T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 3 timer. På denne måte oppnås det rekombinante plasmidet pML300, som inneholder F^-DN i oppløsning.

d) Transformasjon av E. coil HN101 med plasmid pML300

E. coli HBlOl-celler forbehandlet med kalsium som er

nødvendig for transformasjonen fremstilles som beskrevet av Mandel et al. [J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)].

Oppløsningen oppnådd i c) som inneholder det rekombinante plasmidet pML300, oppvarmes til 65"C i 10 minutter for å inaktivere T4 DNA-ligasen og avkjøles deretter til 37°C. 10 pl av denne reaksjonsblandingen tilsettes til 150 pl av kalsiumbehandlede E. coil HBlOl-celler i 10 mM MgCl2 og 10 mM tris.HCl (pH 7,5) i et samlet volum på 200 pl.

Deretter avkjøles denne blandingen i is i 30 minutter, oppvarmes i 2 minutter til 42°C og får deretter stå i 50 minutter i 1 ml L-medium (kfr. eksempel" 18) ved 37° C.. Blandingen spres deretter ut i porsjoner på 0,2 ml på 5 agarplater. (McConkey-agar, Difco), som inneholder 60 pg/ml ampicillin (Serva). Agarplatene holdes deretter ved 37°C i 16-18 timer. 484 ampicillin-resistente kolonier av den transformerte E. coil HB101 oppnås.

e) Bestemmelse av kolonier som inneholder F^- DNA

470 transformerte kolonier (eksempel 10d) presses av på

nitrocellulosefilter "B85" (Schleicher og Schull). Ifølge M. Grunstein og D.S. Hogness [Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1979)] lyseres koloniene og deres denaturerte DNA fikseres på filteret. Etterfølgende prehybridisering av filterne utføres i 20 ml (pr. filter) av 4xSET [= oppløsning av 30 mM tris.HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA], 0,1*

(vekt/volum) "Flcoll 400" (Pharmacia), 0,5* SDS, 50 pg/ml denaturert kalvetymus DNA i 4 timer ved 64°C. Deretter behandles nitrocellulosefliterne 1 20 ml (pr. filter) av 5xSET (vekt/volum) "Ficoll 400", 0,2* SDS og 50 jig/ml denaturert kalvetymus DNA i 16 timer ved 64°C med den <32->P-radioaktivt merkede proben (ca. 10<3->10<4> Cerencov cpm pr. filter). Oligonukleotidet 46/64 komplementert (kfr. eksempel 6 ) er brukt som probe ).

Deretter vaskes filterne to ganger i 2xSET, 0,2* SDS ved romtemperatur, deretter to ganger i 2xSET, 0,5* SDS ved 60°C (først i 30 minutter, deretter i 60 minutter). Filterne tørkes deretter mellom "3MM" papir (Whatman) og plasseres ved -80°C på en røntgenfilm (Fuji) med en intensiverende skjerm (Ilford) i 1-2 dager.

Det resulterende autoradiogrammet viser 71 positive kolonier (kloner) som kan benyttes for videre bearbeidelse, en av disse får betegnelsen pML300.

Eksempel 11

Konstruksjon av plasmid pML305 som Inneholder F2- DN av desulfatohirudin HVl- genet ( fig. 2)

a) Fremstilling av linearisert vektor PBR322/ BamHI/ Nrul 5pg av pBR322 plasmid DNA nedbrytes med 30 enheter BamHI

restriksjonsendonuklease i 30 minutter ved 37° C i en oppløsning av 100 mM NaCl, 6 mM tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 og 100 pg/ml gelatin. 15 enheter PvuII restriksjonsendonuklease tilsettes deretter til oppløsningen og oppløsningen nedbrytes i 2 timer ved 37°C. Reaksjonsblandingen oppvarmes til 70°C i 10 minutter for å inaktivere enzymet. Deretter separeres de to DNA-fragmentene fra hverandre ved gelelektroforese på 1* lavtsmeltende agarose i tris-acetat-EDTA-buffer, pH 8 (se eksempel 10a).

DNA-båndet av pBR322 BamHI/PvuII vektoren (= 2672 basepar) skjæres ut, flytendegjøres og renses ifølge Mueller et al.

(supra) ved "DE-52"-kromatografi. 0,74 pg (=■ 1,5 pmol av ender ) av DNA oppnås.

b) Fremstilling av Fg- DNA/ BamHI

25 pg (= 1,3 pmol av ender) av kjemisk syntetisert F2-DNA

(eksempel 8) nedbrytes med 16 enheter BamHI-restrlksjonsendonuklease (Biolabs) i 20 pl i 150 mM NaCl, 6 mM tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 og 100 pg/ml gelatin i 30 minutter ved 37°C.

60 ng (= 96 nmol av ender) av den lineariserte vektoren pBR322/BamHI/PvuII (eksempel lia) tilsettes deretter til oppløsningen, hele oppløsningen standardiseres med TNE og ekstraheres med fenol/kloroform, og DNA utfelles med to volumdeler alkohol. Det utfelte DNA lagres under alkohol ved

-20°C inntil videre bearbeidelse.

c) Llgering av pBR322/ BamHI/ PvuII vektor DNA " med Fg- DNA/ BamHI , og konstruksjon av plasmid pML305

DNA-bunnfallet oppnådd i eksempel 11b), som inneholder de to nevnte DNA-fra<g>mentene, oppløses i 20 pl av en oppløsning av 50 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, og 100 pg/ml gelatin og behandles med 15 enheter/pl T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15"C i 3 timer. På denne måten oppnås det rekombinante plasmidet pML305, som inneholder F2-DNA i oppløsning. d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmid pML305 Transformasjonen av det kalsium-behandlede E. coli HB101-cellene utføres som beskrevet i eksempel 10d), 10 pl av reaksjonsblandingen oppnådd 1 eksempel lic) benyttes. 313 amplcillin-resistente kolonier oppnås.

e) Bestemmelse av koloniene som Inneholder F2- DNA

65 transformerte kolonier (eksempel lid) undersøkes med

henblikk på F2-DNA på samme måte som beskrevet i eksempel 10e). Oligonukleotidet 154/64 komplementær (kfr. eksempel 6) benyttes som radioaktiv probe. 2 positive kolonier oppnås i autoradiogrammet, hvorav den ene betegnes pML305.

Eksempel 12

Karakterisering av kloner pML300 og pML305

DNA av rekombinantplasmider pML300 og pML305 isoleres ifølge Ish-Horowitz ["Molecular Cloning, A laboratory Manual" (red. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, side 368] . Nukleotidsekvensene av F^-DNA og F2-DNA innskuddene bekreftes ifølge Maxam og Gilbert [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977), se også Meth. Enzym. 65, 499 (1980)].

For dette formålet spaltes i hvert tilfelle 10 pg av plasmid DNA av pML300 med EcoRI-restriksjonsendonuklease og 10 pg av plasmid-DNA av pML305 spaltes med BamHI-restriksjonsendonuklease og de lineariserte DNA isoleres ved geleluering fra agarosegel [kfr. eksempel 10a)]. Deretter nedbrytes de isolerte DNA med alkalisk fosfatase og kromatograferes over "DE-52" (kfr. eksempel lia). DNA merkes deretter radioaktivt med 5'-enden med [-y-<32>P]ATP (spesifikk aktivitet 5000 ci/mmol, Amersham) og T4 polynukleotidkinase (P-L-Blochemicals).

De radioaktivt merkede DNA spaltes deretter med en andre restriksjonsendonuklease (EcoRII). De resulterende DNA-fragmentene isoleres ved geleluering fra agarose. I tilfellet pML300 bestemmes nukleotidsekvensen av F^-DNA, deretter fra EcoRI I-EcoRI*1 fragmentet (ca. 109 basepar) og i tilfellet pML300 bestemmes den av F2-DNA i EcoRII-BamHI<*> fragmentet (ca. 122 basepar).

(<*> angir den DNA-enden som er radioaktivt merket).

Nukleotidsekvensene som bestemmes for F^-DNA og F2-DNA er identiske med de som er vist i eksempel 8.

Eksempel 13

Konstruksjon av ekspres. lonsplasmld pML310

a) Konstruksjon av llnearlsert vektor pHR1148/ EcoRI/ BamHI. som Inneholder trp promotor- operator ( flg. 3 og flg. 4)

A). Konstruksjon av plasmid p! 59

10 pg av plasmid pBRHtrp [DE-OS 3 111 405] spaltes med 50 enheter EcoRI (Biolabs) i 60 minutter ved 37<*>C og nedbryt-ningsblandingen fraksjoneres, etter fenolekstraksjon, på en sakkarosetetthetsgradient (5-23*) i 50 mM tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA i en "TST41" (Kontron AG) rotor. SentrifugerIngen varer i 14 timer ved 40 000 omdreininger/minutt og ved 15° C. 0,3 ml fraksjoner samles med en "ISO"-gradientkollektor ved 1 ml/minutt. Fraksjonene som inneholder det mindre fragmentet kombineres, oppløsningen standardiseres med TNE og utfellingen bevirkes med 2 volumdeler etanol ved -20°C. Etter sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge oppløses DNA 1 100 pl på 10 mM tris.HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA. 5 pg av dette DNA-fragmentet spaltes med 5 enheter Bglll (Biolabs) 1 60 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingen ekstraheres med fenol og kloroform og DNA inkuberes med 2 volumdeler etanol ved-80"C 1 10 minutter; DNA samles ved sentrifugering og oppløses igjen i 50 pl 50 mM tris.HCl (pH 8,0). 2 pl av denne oppløsning fjernes (0,2 pg DNA) og inkuberes ved en DNA-konsentrasjon på 10 ng/pl i 50 mM tris.HCl (pH 8,0) med 1 enhet intestinal alkalisk kalvefosfatase (Boehringer) i 30 minutter ved 37"C. Enzymet inaktiveres ved oppvarming av oppløsningen i 60 minutter ved 65°C. 0,04 pg DNA fjernes og inkuberes 5'-terminalt med 10 pCi [7-<32>P]-ATP (5000 Ci/mmol, Amersham) og 5 enheter T4 polynukleotidkinase (P-L Biochemicals) i 20 pl reaksjonsvolum i 50 mM tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, og 5 mM DTT, i 30 minutter ved 37"C. Den radioaktive prøven blandes med den ikke-merkede prøven (se ovenfor) og DNA-fragmentene fraksjoneres ved en 5-23* sakkarosetetthetsgradient i 50 mM tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA i en "TST60"-rotor. Sent ri fuger ingen utføres i 5 timer ved 60 000 omdreininger/minutt og ved 15°C. 0,2 ml fraksjoner samles. Radioaktiviteten for hver fraksjon bestemmes ved å måle Cerencov-strålingen og fragmentene identifiseres deretter. De ønskede fraksjoner, som inneholder det lille DNA-fragmentet samles, DNA utfelles med 2 volumdeler etanol og oppløses, ettersentrifugeres igjen i 20 pl av 10 mM tris.HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA.

Det <32->P-merkede EcoRI-Bglll DNA fragmentet spaltes delvis med 2 enheter Taql (Biolabs) i et volum på 50 pl i 10 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingen reguleres til 0,2* SDS, 10* glyserol, 10 mM EDTA, 0,05* bromfenol-blått, og DNA-fragmentene separeres på en 6* polyakrylamidgel i tris-borat EDTA [A.C. Peacock et al., Blochemistry 6, 1818 (1967)]. Båndet som inneholder de ønskede EcoRI-Taql (det største delfragmentet) er identifisert på autoradlogrammet. Dette fragmentet (L, se fig. 3) ekstraheres fra gelen og renses [W. Muller et al. supra] og oppløses 1 10 pl 10" mM tris.HCl, pH , 7,5, 1 mM EDTA i 10 pl av 10 mM tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA.

Som akseptor benyttes plasmidet pBR322, som spaltes med Clal og EcoRI: 2 pg pBR322 nedbrytes med 4 enheter Clal (Biolabs) 1 30 pl reaksjonsvolum i 60 minutter ved 37°C. Proteinet ekstraheres med fenol og DNA utfelles deretter med 2 volumdeler etanol ved -80*C i 10 minutter. DNA samles ved sentrifugerlng og nedbrytes deretter med 10 enheter EcoRI (Biolabs) i 30 minutter ved 37'C i et reaksjonsvolum på 20 1. Deretter tilsettes 2 volumdeler 0,1 M tris.HCl (pH 8,7) til oppløsningen hvor det hele inkuberes i en enhet alkalisk kaliumfosfatase (Boehringer) ved 37°C i 30 minutter. Fosfatasen inaktiveres deretter ved inkubering ved 65°C i 60 minutter. 100 ng av akseptorplasmidet inkuberes med 5 pl av fragment LDNA 1 15 pl reaksjonsvolum i 10 mM MgClg, 20 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP med 30 enheter pr. pl av reaksjonsvolum av T4 DNA ligase (Biolabs) i 2 timer. 5 pl av denne oppløsning tilsettes til en blanding som inneholder 150 ml E. coli HBlOl-celler behandlet med kalsiumklorid (supra) i 10 mM MgCl£, 10 mM CaClg og 10 mM tris.HCl (pH 7,5) 1 et samlet volum på 200 pl. Blandingen avkjøles i 20 minutter på is, og oppvarmes i 1 minutt til 42°C og inkuberes i 10 minutter ved 20°C. 1 ml tryptonmedlum [tryptonmedium inneholder 10 g bacto-trypton (Difco); 1 g gjærekstrakt (Difco); 1 g glukose; 8 g NaCl og 294 mg CaClg. 2H2O i 1 liter destillert vann] tilsettes og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37" C under omrøring ved 300 omdreininger/minutt. Blandingen belegges på to agarplater (McConkey-agar, Difco, 0,6 ml/plater), supplert med 50 pg/ml ampicillin (Sigma). Platene inkuberes fra 12 til 17 timer ved 37°C.

Plasmid DNA fra 10 forskjellige kolonier isoleres som følger: Koloniene benyttes, som ovenfor, for inokulering av 10 ml trypton medium supplementert med 50 pg/ml ampicillin i en 25 ml Erlenmeyerkolbe. Kulturene ristes i fra 15 til 18 timer ved 37" C og 300 omdreininger/minutt. Cellene høstes ved sentrifugering (Sorval, "HS-4"-rotor, 10 minutter ved 4000 omdreininger/minutt, 4°C). Ca. 0,1 g celler oppnås, og disse resuspenderes i 1 ml 50 mM tris.HCl (pH 8,0). 0,25 ml lysozymoppløsning [10 mg/ml i 50 mM tris.HCl, (pH 8,0); lysozym markedsføres av Sigma] tilsettes, og inkubering i 10 minutter ved 0°C tilsettes 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH 7,5). Etter ytterligere 10 minutter ved 0°C tilsettes 60 pl 2* "Triton X-100" (Merck). Etter 30 minutter ved 0°C sentrifugeres prøven i 30 minutter ved 15000 omdreininger/minutt og ved 4°C i en Sorval "SA 600"-rotor, supernatanten deproteiniseres med 1 volumdel fenol (mettet med TNE). Fasene separeres ved sentrifugering (Sorval "HB-4"-rotor i 10 minutter ved 5000 omdreininger/minutt og 4°C). Den øvre fasen ekstraheres 2 ganger med 1 volumdel kloroform. Bukspyttkjertelen RNAse A

(Sigma; 10 mg/ml i TNE foroppvarmes 10 minutter til 85°C)

tilsettes inntil en endelig konsentrasjon på 25 pg/ml oppnås, og blandingen inkuberes i 40 minutter ved 37°C. Oppløsningene reguleres deretter med 1 M NaCl og 10* polyetylenglykol 6000 (Fluka, behandlet i 20 minutter ved 120°C i en autoklav) og inkuberes i 2 timer ved -10°C. Bunnfallet samles i en Sorval HB-4-rotor (20 minutter ved 10 000 omdreininger/minutt, 0°C) og oppløses igjen i 100 pl TNE. DNA-oppløsningen ekstraheres med 1 volumdel fenol og DNA utfelles med 2 volumdeler etanol i 10 minutter ved -80°C. Bunnfallet samles ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge og DNA oppløses igjen i 20 pl av 10 mM tris.HCl, (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. 8 til 10 pg av plasmid DNA oppnås fra en 10 ml kultur.

Plasmid DNA analyseres etter nedbrytning med følgende restriksjonsenzymer: I hvert tilfelle spaltes 0,5 pg av plasmid DNA med Hpal (Biolabs) og med Hpal (Biolabs) og EcoRI (Biolabs) med Clal (Biolabs) ifølge standardretningsllnjer, ifølge enzym- fabrikantens anvisninger. DNA fraksjoneres på 1* agarosegel i 40 mM tris.acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA og 0,5 pg/ml etidiumbromid. De ønskede plasmidene Inneholder et Hpal-sete og gir, etter nedbrytning I 3 timer, i tillegg til det store DNA-fragmentet to mindre fragmenter som er større enn det lille EcoRI-Clal-fragmentet av pBR322. Et av disse plasmidene betegnes pl59 (se fig. 3).

B. Konstruksjon av plasmid DHR1145

2 pg av pl59 DNA nedbrytes med 10 enheter EcoRI (Biolabs) i 30 minutter ved 37°C. DNA ekstraheres med fenol, utfelles med etanol og oppløses etter sentrifuger ing, i 10 pl av 10 mM tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. DNA nedbrutt med EcoRI behandles videre med 5 enheter DNA-polymerase (Klenow-fragment) (Boehrlnger) i 10 mM MgClg, 10 mM 3-merkaptoetanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals), i 15 minutter ved 12"C. Polymerasen Inaktiveres deretter ved inkubering ved 85 °C i 5 minutter. Reaksjonsblandingen fortynnes i 20 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) ved en faktor på 10 og Inkuberes med 30 enheter av T4 DNA-ligase pr. pl reak-sjonsblanding i 1 time ved 15°C. 50 ng av DNA transformeres i E. coil (som beskrevet ovenfor), og belegges på McConkey agarplater supplert med 50 pg/ml ampicillln.

Plasmld-DNA fra 10 forskjellige kolonier isoleres som beskrevet ovenfor. Plasmid DNA isoleres ved nedbrytning med EcoRI. De ønskede plasmidene er EcoRI-resistente. Analysen utføres som beskrevet ovenfor. Et av de ønskede plasmidene betegnes HR1145 (fig. 3).

C. Konstruksjon av plasmid pHR1148

2 pg av pHR1145-DNA behandles med 5 enheter Clal (Boehrlnger) i 60 minutter ved 37°C, og det proteiniseres deretter ved hjelp av fenolekstraksjon. DNA utfelles med etanol og

oppløses deretter 1 20 pl av 10 mM tris.HCl TpH 7,5), 0,5 mM EDTA. De utstikkende endene oppfylles, som beskrevet ovenfor, med DNA-polymerase I (Klenow-fragment), bortsett fra at dATP og dTTP erstattes av dCTP (P&L Biochemicals) og dGTP (P&L Biochemicals). Polymerasen inaktiveres ved inkubering ved 85"C i 5 minutter. 2 volumdeler 0,1 M tris.HCl (pH 8,7) tilsettes til reaksjonsblandingen som inkuberes med 0,5 enheter kalvefosfatase (Boehrlnger) i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingen deproteiniseres ved ekstraksjon med fenol. DNA utfelles ved etanol og oppløses i 8 pl 10 mM tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. En kjemisk syntetisert DNA-linker av formelen 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' fosforyleres ved 5'-enden ved inkubering av 8 pmol av linkeren med 5 Ci [-y"<32>P)-ATP (5500 Ci.mmol-<1> Amersham) i 8 pl reaksjonsvolum som inneholder 0,1 mM rATP (Sigma), 50 mM tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og 2 enheter T4 polynukleotidkinase (P&L Biochemicals) i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonen stoppes ved nedfrysning til -80°C.

Den radioaktivt merkede linkeren behandles deretter med 1 pg av Clal og fosfatase og ligeres med pHR1145-DNA (se ovenfor)

i et reaks jonsvolum på 20 pl som inneholder 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM tris.HCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2 og 800 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs). Inkuberingen utføres i 2 timer ved 15°C. Ligasen inkuberes ved inkubering ved 85°C i 10 minutter. Deretter tilsettes 2 volumdeler vann, natriumkloridkonsentrasjonen reguleres til 10 mM og 20 enheter Kpnl (Biolabs) tilsettes i løpet av 30 minutter ved 37"C. Etter ekstraksjon med fenol og kloroform, fraksjoneres blandingen gjennom 0,9* lavtsmeltende agarosegel (Biolabs) i 40 mM tris.acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA og 0,5 pg/ml etidiumbromid. Båndet, synlig ved UV-bestrål ing, som demonstrerer den samme mobiliteten som en markør DNA av den samme størrelse skjæres ut med en skalpell. Porsjonen av gelen smeltes i 5 minutter ved 65°C og avkjøles deretter til 37°C.

Et volum på ca. 20 pl oppnås. 5 pl av denne oppløsningen fjernes og inkuberes i 12 timer ved 15°C med 400 enheter T4 ligase (Biolabs) i et reaksjonsvolum på 10 mM som er regulert til 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM tris.HCl (pH 7,8). 1/10 volumdeler av en oppløsning av 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 og 100 mM MgCl2 tilsettes til ligaseblan-dingen (størknet ved 15°C) og det hele inkuberes ved 65 °C i 5 minutter. Oppløsningen benyttes deretter til å transformere kalsium-behandlede E. coil HBlOl-celler som beskrevet ovenfor. Belegging utføres på McConkey agarplater supplert med 50 pg/ml ampicillin.

Plasmid DNA fra 10 forskjellige kolonier isoleres som beskrevet ovenfor, og DNA underkastes følgende restriksjons-enzymanalyse: I hvert tilfelle spaltes 0,5 pg plasmid DNA delvis med Kpnl (Biolabs), Ncol (Biolabs) og EcoRI (Biolabs) Ifølge enzym-fabrikantens anvisninger. Spaltningsproduktene fraksjoneres på 1* agarosegeler i 40 mM tris.acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 pg/ml etidiumbromid. Alle plasmider viser, som ønsket, et av disse enzymspaltningssetene. Et betegnes HR1148.

Plasmidet HR1148 inneholder en tryptofan promotoroperator og et ribosomalt bindingssete opp til og med ATG. Hirudin og også andre heterologe gener kan kobles direkte ved hjelp av EcoRI, Ncol, Kpnl-setene som finnes en gang i plasmidet. Videre gjør denne konstruksjonen det mulig å direkte kople og uttrykke heterologe gener uten at ATG som er nødvendig for initiering av translasjon er tilstede på det tilsvarende genet. Dette kan lett oppnås ved å spalte Ncol og fylle opp de utskytende endene med DNA-polymerase I som beskrevet ovenfor, eller ved å spalte Kpnl, og fjerne de utstikkende endene med nuklease Sj. Plasmid HR1148 er følgelig et ekspresjonsplasmid med bred anvendelse.

D. Fremstilling av den lineariserte vektoren pHR1148/ EcoRI/- BamHI 5 pg av plasmid DNA av pHRil48 nedbrytes med restriksjons-endomiklease EcoRI og BamHI. Den utskårende vektoren pHRI148/EcoRI/BamHI isoleres ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering.

b) Fremstillin<g> av F1- DNA/ EcoRI/ EcoRI/ EcoRII og Fg- DNA/- BamHI/ EcoRII

I. Fremstilling av Fj- DNA/ EcoRI/ EcoRII

5 pg av plasmid DNA av pML 300 nedbrytes først med 10 enheter EcoRI restriksjonsendonuklease i 50 pl av en oppløsning av 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl og 100 pg/ml gelatin i 1 time ved 37°C. En porsjon (0,5 pg) av dette lineariserte plasmidet DNA/EcoRI isoleres ved geleluering fra en agarosegel (kfr. eksempel 10a)) og merkes radioaktivt med [-y~<32>P]ATP (kfr. eksempel 12). Hovedmengden av plasmidet DNA/EcoRI blandes deretter med dette radioaktivt merkede DNA, nedbrytes med EcoRII-restrlksjonsendonuklease og EcoRII-EcoRI<*> DNA-fragmentet (109 basepar), separeres ved gelelektroforese på 8* polyakrylamid. 200 pg av Fi-DNA/EcoRI^/EcoRII isoleres ved geleluering.

II. Fremstilling av Fg- DNA/ BamHI/ EcoRII

5 pg av plasmid DNA av pML 305 spaltes med 10 enheter av BamHI-restriksjonsendonuklease. En porsjon (0,5 pg) av dette lineariserte plasmidet DNA/BamHI isoleres ved geleluering fra en agarosegel (kfr. eksempel 10a)) og merkes radioaktivt med [-y~<32>P] (kfr. eksempel 12). Hovedmengden av plasmidet DNA/BamHI blandes deretter med dette radioaktivt merkede DNA, nedbrytes med EcoRI-restriksjonsendonuklease og EcoRII-BamHI<«>DNA-fragmentet (122 basepar) separeres ved gelelektroforese på 8% polyakrylamid. 250 pg av F2-DNA/BamHI<*>/EcoRII isoleres. c) Ligering av F^-DNA med Fg-DNA og konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pML310 10 ng (= 473 nmol av ender) av Fj^-DNA/EcoRI/EcoRII og 9 ng (-495 nmol av ender) av Fg-DNA/BamHI/EcoRII behandles i et volum på 20 pl med T4 DNA-llgase som beskrevet 1 eksempel 10c). Deretter ekstraheres blandingen med fenol/kloroform og DNA utfelles med alkohol. DNA-utfellingen oppløses deretter som beskrevet i eksempel 10c) og nedbrytes med EcoRI og BamHI-restriksjonsendonuklease. Oppløsningen standardiseres deretter med TNE og 30 ng (=■ 50 nmol av ender) av vektoren DNA pHR1148/EcoRI/BamHI (kfr. eksempel 13aD) tilsettes. Deretter ekstraheres oppløsningen Igjen med fenol/kloroform og DNA utfelles med alkohol. Den utfelte DNA-blandingen behandles som angitt i eksempel 10c) med T4~DNA-ligase (Biolabs). På denne måten fremstilles i oppløsningen et rekombinant plasmid som inneholder som innskudd F^-Fg-DNA (desulfatohlrudlngen).

d) Transformasjon av E. coil HB101 med plasmid pML310 Transformasjonen av E. coil HBlOl-celler behandlet med

kalsium utføres som beskrevet i eksempel 20d). 10 pl av reaksjonsblandingen oppnådd i eksempel 13c) benyttes. 420 amplcillln-resistente kolonier oppnås.

e) Bestemmelse av kolonier som Inneholder F^- Fg- DNA

18 transformerte kolonier (eksempel 13d) undersøkes vedrør-ende F^-Fg-DNA-lnnhold som beskrevet i 10e). En blanding av ollgodeoksynukleotidene beskrevet i eksempel 5 og 6 benyttes som radioaktiv probe. I autoradlogrammet oppnås 12 positive kolonier, 5 av disse betegnes pML310, pML311, pML312, pML313, pML314.

Eksempel 14:

Karakterisering av klonet pML310

Karakteriseringen av F^-Fg-DNA-sekvensen i rekombinantplas-midet pML310 bevirkes ved sekvensering av F^-Fg-DNA ifølge Maxam og Gilbert (supra) som beskrevet i eksempel 12. 10 pg av plasmid DNA undersøkes. Nukleotidsekvensen av F^-Fg-DNA er , identisk med den beskrevet for det syntetiske desulfatohirudingenet.

Eksempel 15:

Ekspresjon av desulfatohirudin HVI 1 g. 1ær

Det kjemisk syntetiserte genet for hirudin forsterkes som et 206 bp EcoRI-BamHI innskudd i plasmid pML310 (se eksempel 14). Genet utskjæres av den regulerbare PH05 promotoren. Konstruksjonen innbefatter den 541 bp PH05 promotorsekvensen og den fullstendige PH05 signalsekvensen (51 nukleotider som koder for 17 aminosyrer) som beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 143 081. Denne sekvensen sammensmeltes i ramme med den modne kodende sekvensen for hirudin som starter med kodonet for valin som den NHg-terminale aminosyren av naturlig modent hirudin. Hirudingenet er flankert ved dets 3'-ender med et DNA-fragment som tilveiebringer PH05 transskripsjonstermineringssignalene. Vektordelen av ekspresjonsplasmidet inneholder gjær 2 p-sekvenser, gjær LEU2-genet for seleksjon 1 gjær og det ampicilllnresistente genet og E. coil opphavet for replikerlng for seleksjon og amplifisering i E. coil. Fremgangsmåten er Illustrert i fig. 5, 6 og 7.

Regulering av nukleotidsekvensen ved 5'- enden av desul-fatohirudingenet♦

Nukleotidsekvensen som koder for desulfatohirudin starter med GTT som står for den NHg-terminale aminet i det endelige genproduktet. For hensiktsmessig underkloning og ekspresjon 1 E. coil er den kodende sekvensen utvidet ved 5'-enden med åtte nukleotider innbefattende et EcoRI-restriksjonssete og et ATG-initieringskodon. For den nøyaktige sammensmeltingen i ramme av den hirudinkodende sekvensen til sekvensen som koder for PH05 signalpeptidet må disse ytterligere nukleotidene fjernes. Dette oppnås ved å omvandle EcoRI-restriksjonssetet til et sete med glatte ener, tilsetning av et syntetisk oligonukleotid inneholdende et Hgal gjenkjenningssete i en slik posisjon at den etterfølgende spaltning" med Hgal finner , sted like oppstrøm for GTT-kodonet.

Innføring av et HgaI- restrlks. 1onssete i front av desulfatohirudingenet ( kfr, flg. 5)

8 ug av plasmid pML310 (se eksempel 13c) nedbrytes fullstendig ved restriksjonsendonuklease EcoRI. DNA (pML310/EcoRI) ekstraheres med fenol/kloroform og utfelles med etanol. 5'-overhengende ender fjernes ved hjelp av nuklease Sj. 4 pg av pML310/EcoRI DNA nedbrytes i 100 pl av 250 mM NaCl, 1 mM ZnSC<4, 30 mM natriumacetat, pH 4,6 og 20 U/ml nuklease S^

(Sigma) i 45 minutter ved 37°C.

DNA ekstraheres med fenol/kloroform og utfelles med etanol. DNA (pML310/EcoRI/S!) resuspenderes i 100 pl av 50 mM tris.HCl pH 8,0 og inkuberes med 2 enheter kalvetarmalkalisk fosfatase (CIAP, Boehrlnger) I 1 time ved 37<*>C. Enzymet inaktiveres ved 65"C i 1,5 timer.

NaCl-konsentrasjonen i inkuberingsblandingen reguleres til 150 mM. Det defosforylerte DNA (pMLSlO/EcoRI/S-jyciAP) renses ved absorpsjon på en "DE52" (Whatman) ionebytterkolonne i en lavsaltbuffer (150 mM NaCl, 10 mM tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) og elueres deretter med en bufferoppløsning med et saltinnhold (1,5 M NaCl, 10 mM tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA utfelles med etanol og resuspenderes i Hg ved en konsentrasjon på 0,8 mg/ml.

Et ollgonukleotld av formelen

5'-AGCGTCGACGCT-3'

syntetiseres ved fosfortrieterfremgangsmåten [Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)]. Sekvensen av oligonukleotidet er selv-komplementaer og inneholder gjenkjenningssetet

-GACGC- for restriksjonsendonuklease Hgal. Rekombinasjon av to enkle kjeder fører til en dobbeltkjedet DNA-linker på 12 basepar. 1,2 pg av det syntetiske enkeltkjedede oligodéoksynukleotidet fosforyleres i 10 pl av 60 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 30 pCi av [-y-<32>P]ATP (3000 Ci.mmol-<1>, Amersham) og 6 enheter av T4 polynukleotid kinase (Boehrlnger) i 30 minutter ved 37°C, etterfulgt av 15 minutter ved 37 °C i nærvær av 0,5 mM ATP. Blandingen inkuberes videre i 10 minutter ved 75'C for å inaktivere enzymet og for deretter å avkjøles til romtemperatur for rekombinasjon. 0,6 pg (170 pmol) av den <32>P-merkede linker DNA blandes med 2,4 pg (1,75 pmol ender) av pMLSlO/EcoRI/Si/CIAP og ligeres i 20 pl av 60 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2» 5 mM DTT, 3,5 mM ATP, 800 enheter av T4 DNA ligase (Biolabs) i 20 timer ved 15 °C. Ligasen inaktiveres ved 85'C i 10 minutter og overskuddet av linkermolekylet fjernes ved utfelling av DNA i nærvær av 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM natriumacetat, pH 6,0 og 0,54 volumdeler isopropanol. Etter 30 minutter ved romtemperatur pelletiseres DNA, resuspenderes i 45 pl av ligeringsblandlng (angitt ovenfor) og ligeres i 6 timer ved 15°C slik at det dannes sirkulert DNA.

Porsjoner på 1 pl og 3 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsium-behandlede, transformasjonskompetente E. coil HBlOl-celler (fremstilt ved fremgangsmåten ifølge D. Hanahan [J. Biol. Chem. 166, 557 (1983)]. Cellene får står på is i 30 minutter, inkuberes deretter i 3 minutter ved 42°C, avkjøles deretter på is i 2 minutter, og inkuberes så i 1 time ved 37°C i 400 pl av SOC-medium. Cellene konsentreres i 100 pl hver og belegges på LB agarplater inneholdende 50 pg/ml ampicillin.

12 transformerte, amp-^ kolonier dyrkes individuelt i LB medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles ved fremgangsmåten ifølge D.S. Holmes et al., [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. Nærværet av den syntetiske oligonukleotidlinkeren bekreftes ved DNA-sekvensering ved anvendelse av et enkeltkjedet DNA-fragment som primer som hybridiserer til den kodende kjeden av hirudin. Et klon som , inneholder linker DNA ved den korrekte posisjonen foran hirudingenet betegnes som pML310L.

Eksempel 16

Sammensmelting av PH05 signalsekvensen og desulfatohirudin strukturgen

a) Isolering av 0. 2 kb desulfatohirudi nf racrmentet ( fig. 5)

12 pg plasmid pML310L nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonuklease BamHI og Pvul. Etter ekstraksjon av DNA ved fenol/kloroform og etanolutfelling separeres de to restriksjonsfragmentene på en 1,2* agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. Etidiumbromid-fargede 0,84 kb PvuI-BamHI-fragmentet isoleres i et gelstykke. DNA elektroelueres I en dialysepose fyllt med 3 ml 0,2xTBE-buffer. Den lukkede posen neddykkes i TBE-buffer pH 8,3 (90 mM tris-base, 90 mM borsyre, 2,5 mM EDTA). Etter 30 minutter ved 100 mA rever-seres polariteten av strømmen i 45 sekunder for å avstøte DNA fra dialysemembranen. Bufferen som omgir gelstykket i dialyseposen utvinnes, reguleres til 150 mM NaCl og føres gjennom en "DE52" (Whatman) ionebytterkolonne. DNA elueres med en buffer med høyt saltinnhold (1,5 M NaCl, 10 mM tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), utfelles med etanol og gjen-oppløses i HgO ved en konsentrasjon på 0,1 mg/ml.

Det 84 kb Pvul-BamHI-fragmentet av pML310L nedbrytes videre ved restrlksjonsendonuklease Hgal. Denne nedbrytningen gir et 198 bp Hgal-BamHI-fragment som Inneholder hele den kodende sekvensen for modent desulfatohirudin. Ytterligere Alul-nedbrytnlng berører ikke det 198 bp Hgal-BamHI-fragmentet, men eliminerer et annet Hgal-fragment av tilsvarende størrelse.

0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet separeres fra andre fragmenter på en 1,5* agarosegel i TBE-buffer og Isoleres ved elektroeluering (som beskrevet ovenfor). DNA renses ved "DE52"-

ionebytterkromatografi og etanolutfelles. DNA" resuspenderes i , HgO ved en konsentrasjon på 30 pg/ml (0,2 pmol/pl).

b) Isolering av PH05- promotorområdet med del av PH05-slgnalsekvens ( flg. 6)

Plasmid d31/ PE05-TPA18 (kfr. europeisk patentpublikasjon nr. 143.081) har PH05 promotor og PB05 signalsekvensen smeltet i ramme til et fremmed strukturgen (t-PA). Et 584 bp BamEI-Ball-fragment inneholder PH05-romotoren og hele PH05-signalsekvensen, men 8 nukleotider ved 3'-enden. 8 pg av P31/ PH05-TPA18 DNA nedbrytes med restriksjonsendonuklease Ball (16 timer ved 37°C). DNA renses ved fenol/- kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling.

DNA resuspenderes i EgO ved en konsentrasjon på 0,7 ml/ml.

Den korrekte sammenføyningen mellom PH05 signalsekvensen og det kodende området for desulfatohirudin tilveiebringes ved hjelp av en syntetisk linker av formel

(1) 5'-CCAATGCA-3'

(2) 3'-GGTTACGTCAACA-5'

Åtte nukleotider ved 5'-enden av linkeren (5 *-CCAATGCA) representerer en del av PE05-signalsekvensen fra Ball-setet til bearbeidelsessetet. De 5'-overhengende 5 nukleotidene av ollgonukleotid (2) passer inn i Hgal-spaltnlngssetet ved 5'-enden av den desulfatohirudinkodende sekvensen.

De individuelle enkeltkjedede oligonukleotIdene (1) og (2) syntetiseres ved fosfotriesterfremgangsmåten (Itakura et al., supra). Eenholdsvis 1,1 pg og 1,8 pg av oligonukleotider (1) og (2), fosforyleres individuelt ved deres 5'-ender, blandes i ekvimolare mengder og rekombineres som beskrevet i eksempel 15.

1,3 pg (200 pmol) av det fosforylerte, dobbeltkjedede linker , DNA ligeres til 7 pg (1,8 pmol) av BalI-spaltet p31/PH05-TPA18 i 40 pl 60 mM tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 1400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 16 timer. Ligasen inaktiveres i 10 minutter ved 85'C. Overskuddet av linker fjernes ved utfelling av DNA i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6,0, og 0,54 volumdeler isopropanol. DNA resuspenderes og nedbrytes videre ved restriksjonsendonuklease BamHI. Etter ekstraksjon av DNA med fenol/kloroform og etanolutfelling separeres de to restriksjonsfragmentene på en 1,2* agarosegel i trisborat-EDTA-buffer, pH 8,3, 0,6 kb fragmentet isoleres fra gelen. DNA elektroelueres og renses videre ved hjelp av "DE52" ionebytterkromatografi og etanolutfell ing. 0,6 kb BamHI-Hgal DNA-fragmentet resuspenderes i HgO ved en konsentrasjon på 40 pg/ml.

c) Isolering av pJDB207 gjærvektorfragment ( fig. 6)

9 pg av plasmid pJDB207R/PH05-TPA (12-2) DNA (kfr. europeisk

patentpublikasjon nr. 143 081) nedbrytes med restriksjonsendonuklease BamHI. Etter fullstendig nedbrytning ekstraheres DNA med fenol/kloroform og etanol utfelles. DNA resuspenderes 1 50 mM tris.HCl pH 8,0 ved en konsentrasjon på 0,1 mg/ml og nedbrytes med 7 enheter av kalvetarmalkalisk fosfatase i 1 time ved 37°C. Fosfatasen inaktiveres i 1,5 timer ved 65°C og DNA renses "DE52" ionebytterkromatografi (se eksempel 15) og etanolutfelles. Det 6,8 kb BamHI fragmentet separeres på en 1,2* agarosegel i tris-borat-EDTA-buf fer pH 8,3. DNA elektroelueres og renses ved "DE52" IonebytterkromatografI og etanolutfelling. DNA oppløses i HgO ved en konsentrasjon på 0,4 mg/ml (0,1 pmol/pl).

d) Llgerlng av PH05 promotorfragmentet og desulfatohlrudln-strukturgenet til pJDB207 g. lærvektorfragmentet ( flg. 6)

pJDB207 gjærvektoren, PH05 promotorfragmentet med PH05 signalsekvensen og desulfatohirudinstrukturgenet isoleres

alle som DNA-fragmenter (se eksempel 16 a-c) som ligeres slik . at det dannes et ekspresjonsplasmid.

0,3 pmol av 0,6 kb BamHI-Hgal-fragmentet av p31/PH05-TPA18 og 0,3 pmol av 0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet av pML310L ligeres til 0,1 pmol av et 6,8 kb BamHI-fragment av PJDB207R/ PH05-TPA (12-2) i 10 pl 60 mM tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheter T4 DNA-ligase i 20 timer ved 15°C.

En porsjon på 1 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av transformasjonskompetente E. coil HBlOl-celler fremstilt Ifølge Hanahan (supra). Transformasjonsfrem-gangsmåten er også tilpasset fra denne publikasjonen. Cellene belegges på LB-agarplater inneholdende 50 pg/ml ampicillin. 24 amp<R> kolonier dyrkes individuelt i LB medium med 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres vedrørende størrelse og orientering av innskuddet ved spaltning med restriksjonsendonuklease Pstl. Et enkelt klon med den korrekte orienteringen av innskuddet betegnes som pJDB207/PH05-HIR.

Eksempel 17:

Transformasjon av Saccharomvces cerevisiae stamme GRF18 Plasmid pJDB207/ PH05-HIR innføres i Saccharomvces cerevisiae stamme GRF18 (a, his3-ll, his3-l-, leu2-3, leu-112, can<R>) ved anvendelse av transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen et al., (supra). 5 pg plasmid DNA tilsettes til 100 pl av en sferoplastsuspensjon og blandingen behandles med polyetylenglykol. Sferoplastene blandes med 10 ml regenere-ringsagar og belegges på plater med gjær minimalt medium uten leucin.

En enkelt transformert gjærkoloni utplukkes og dykkes i gjær minimalt medium uten leucin. Kolonien betegnes som Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/ PH05-HIR.

Eksempel 18:

Kultivering av S. cerevisiae GRF18/ pJDB207/ PH05- HIR

Celler av S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-HIR ristes i 20 ml av gjær minimalt medium ("Difco Yeast Nitrogen base" uten aminosyrer med tilsats av 2* glukose og 20 mg/l L-histidin) ved 30°C og kultiveres til en celletetthet på 3xl0<7 >celler/ml. Cellene vaskes med 0,9* NaCl og benyttes deretter for inokulering av 50 ml kulturer i lavt Pj-minimalt medium. Lavt Pj-minlmalt medium fremstilles tilsvarende som sammensetning av "Difco Yeast Nitrogen Base"-medium (uten aminosyrer), men inneholder 0,03 g/l KH2PO4, 1 g/l og 10 g/l L-asparagin i steden for (NH4)2S04, 2* glukose og 1 g/l L-histidln. Kulturene er inokulert opp til en celletetthet på 4xl0<6> celler/ml og omrøres ved 30°C 1 opp til 42 timer ved 200 omdreininger/minutt.

Eksempel 19:

Isolering av desulfatohirudinforbindelsene fra S. cerevisiae GRF18/ PJDB207/ PH05- HIR a) Isolering av desulfatohlrudlnforblndelser fra kulturmedlet

A. Anrikning av hirudinforbindelser på en " RP- C18"- kolonne

Etter en fermenteringstid på 18 timer, 26 timer og 42. timer, ble ti prøver, hver på 10 ml, tatt fra kulturmedlet og anriket på proteiner ved avsaltning og konsentrasjon på en "Bond Elut C-18" kolonne (1 ml, Analytichem International). Når prøvene er påført på kolonnen og væsken er fjernet i vakuum, vaskes kolonnen to ganger med 1,5 ml vann-acetonitril (9:1) - 0,1* trifluoreddiksyre (9:1). Hirudinforbindelser elueres fra kolonnen med vann-acetonltril-0,1* trifluoreddiksyre (6:4). 2 ml eluat konsentreres ved hjelp av en "Speed Vac" konsentrator (Sevant) til et endelig volum på 400 pl. Hirudinforblndelsene identifiseres ved hjelp av HPLC-analyse, ved sammenligning med autentisk desulfatohirudin og ved hjelp av trombininhiberingsanalyse. 0,2 til 2 pg/ml hirudinforbindelser inneholdes i prøven.

B. Ionebytterkromatografi på en DEAE- cellulosékolonne

1 1 kulturmedium høstes etter en fermenteringstid på 72 timer og sentrifugeres. Supernatanten påføres på en ionebytterkolonne med "DE52"-cellulose (Whatmat) ved pH 7,5 [betingelser: kolonne 2,5x15,5 cm (76 ml), elueringsbuffer A: 20 mM ammoniumacetat, 100 mM NaCl, pH 7,5, elueringsbuffer B: 20 mM ammoniumacetat, 4 M NaCl, pH 5,0, strømning 66 ml/time]. Kolonnen vaskes med 228 ml buffer A og elueres deretter med en lineær saltgradient på 228 ml av hver av buffer A og buffer B. Fraksjoner på 22 ml samles. Hirudinforbindelser elueres 1 fraksjoner 71 til 74 (88 ml) og Identifiseres ved hjelp av trombininhiberingsanalysen. De aktive fraksjonene dialyseres over natten ved 4°C mot 20 mM ammoniumacetat. Deretter lyofiliseres like store porsjoner to ganger. Lyofilisatet inneholder desulfatohirudinforbindelser bekreftet ved reversert fase HPLC.

C. Gelfiltrering på " Sephadex G- 50" og endelig rensing ved hlelp av HPLC

Hovedfraksjonen (80 ml av eluat) som er aktiv i trombinin-hiberingsforsøket dialyseres over natten ved 4°C mot 20 mM ammoniumacetat pH 7,5, og konsentreres deretter ved å anvende en rotasjonsfordamper ved 35°C til et endelig volum på 5 ml.

Den resulterende klare vandige oppløsningen påføres på en "Sephadex G-50"-kolonne (Pharmacia) med et sjiktvolum på 160 ml, kolonnen (2,5 x 65 cm, Biorad) er på forhånd bragt i likevekt med 5% eddiksyre. Hovedaktiviteten som finnes i 50 ml eluat (fraksjoner 5-7, strømning 50 ml/time, 25 min./fraksjon) konsentreres ved anvendelse av en rotasjonsfordamper og underkastes deretter en reversert fase HPLC-separasjon. En porsjon (500 pl) av de individuelle fraksjonene konsentreres 1:10 ved å anvende en "speed vac"-konsentrator (Savant) og undersøkes ved hjelp av reversert fase HPLC-analyse vedrør-ende innholdet av desulfatohirudlnforbindelser. Oppløsningene inneholder desulfatohirudlnforbindelser. Fraksjon 6 (18 ml) Inneholder den laveste prosentandelen sekundære komponenter og renses ytterligere ved hjelp av semipreparativ reversert fase HPLC.

Forsøksbetingelser: "Vydac 218 TP 510" RP-HPLC-kolonne, 10 x 250 mm, like store porsjoner av fraksjon 6 (200 pl kon-sentrert 1:10) pr. separasjon, AUFS 0,5 ved 220 nm; strøm-ningshastighet: 2 ml/min. Elueringsmiddel: A. 0,1* trifluoreddiksyre, B: acetonitril/vann (8:2 + 0,07* trifluoreddiksyre, 1 min. 16* B, deretter økende under forløpet på 40 minutter til 64* B. De resulterende fraksjoner fortynnes 1:1 med vann og lyofiliseres. Resten består av rene desulfatohirudin-forbindelser.

b) Isolering av desulfatohlrudinforbindelser fra celle-ekstrakt av S. cerevisiae GRF18/ pJDB207/ PH05- HIR

Cellene nedbrytes som vanlig (kfr. europeisk patentpublikasjon nr. 100.561). Supernatanten som er behandlet med 2* eddiksyre sentrifugeres (12 000 opm., 10°C). Ammoniakk tilsettes til en endelig pH på 7,5 og den svakt opake oppløsning (50 ml) behandles videre som angitt ovenfor (kfr. eksempel 19a). Hirudinforbindelser identifiseres som angitt ovenfor, dvs. trombininhiberingsanalyse og ved hjelp av reversert fase HPLC.

Eksempel 20:

Analyse av produktblandingen fra fermenteringen av S. cerevisiae GRF18/ pJDB207/ PH05- HIR a) En porsjon på 2 ml av supernatanten fremstilt som angitt ovenfor (kfr. eksempel 16b) tørkes på en "Speed Vac"-konsentrator under høyvakuum. Prøvene oppløses individuelt i 100 pl vann og underkastes HPLC-analyse (forsøksbetegnelse nr. 1, se nedenfor). Trombininhiberingen av de individuelle fraksjoner undersøkes. Fraksjonene med en retensjonstid på 16,5 minutter og 17,7 minutter viser trombininhibering. Forholdet (ekspresjonsutbyttet) for disse to fraksjonene er ca. 4:1. Ifølge aminosyresammensetningen er disse fraksjonene desulfatohlrudlner. b) Fraksjonene som er aktive i trombininhiberingsforsøket oppnådd som beskrevet i eksempel 19a) underkastes HPLC-analyse under to forskjellige sett av betingelser.

- Forsøksbetingelse nr. 1:

Nukleosid (NM) C18, 5 pm RP-HPLC-kolonne, 4,6x120 mm: 50 pl hirudinforbindelser pr. separasjon, att. 6 ved 214 nm; strømningshastighet 1,2 ml/min.; elueringsmiddel: A: 0,1* trifluoreddiksyre, B: acetonitril/vann 8:2 med 0,08* trifluoreddiksyre, 2 minutter. 16* B, deretter økning under forløpet på 50 minutter til 64* B. Mottrykk: 66 bar.

- Forsøksbetingelse nr. 2:

som ovenfor, bortsett fra: gradient 2 minutter, 20* B, deretter økning under forløpet på 40 minutter til 80* B.

Fraksjoner tas med intervaller på 1 minutt (totalt 45) og underkastes trombininhiberingsforsøket. Fraksjoner 17-19 viser seg å være aktive. Videre bestemmes aminosyresammensetningen, N-terminalen og N-terminalsekvensen for de aktive hlrudinforbindelsene fra fraksjonene 17 og 18. En fraksjon (nr. 17) sammenlignes i tillegg med autentisk desulfatohirudin som oppnås ved omsetning av naturlig hirudin fra blodigler med enzymet arylsulfatase. Resultatene er sammenfattet i den følgende tabell 1:

Forholdet 1 utbytte mellom fraksjoner 17 og "18 er Igjen ca. 4:1.

c) 200 ml porsjoner av supernatanten fremstilt som angitt ovenfor (kfr. eksempel 19a) underkastes HPLC-analyse

(betingelse nr. 3 nedenfor) og FPLC-separasjon (betingelse nr. 4). Trombininhiberingen for de individuelle fraksjonene med en retensjonstid på 8,0 minutter (topp 1), 11,1 minutter (topp 2) og 12,1 (topp 3) har en sterk trombininhibering. Forholdet (ekspresjonsutbyttet) for disse tre forbindelser er ca. 1:4:1. Ifølge HPLC-analyse er forbindelsene svarende til topp 2 og 3 identiske med hirudinforbindelsene beskrevet i eksempel 20b (fraksjoner 17 og 18). Resultatene er sammenfattet 1 tabell 2:

- Forsøksbetingelser nr. 3:

"Vydac 218 TP-B5" RP-HPLC-kolonne, 4,0x120 mm, 15 pg hirudinforbindelse pr. porsjon, att. 7 ved 214 nm, strøm-ningshastighet 1,2 ml/min.; eluerlngsmiddel Å: 0,1* trifluoreddiksyre, B: acetonitril med 0,08* trifluoreddiksyre, 2 minutter 16* B, deretter økning under forløpet på 20 minutter til 40* B; tilbaketrykk 80 bar.

- Forsøksbetingelser nr. 4:

"Pharmacia mono Q FPLC"-anionbytterkolonne, 5,0x50 mm, 15 pg hirudinforbindelse pr. separasjon, AUFS 0,01 ved 280 nm, strømningshastighet 1,0 ml/min.; gradient elueringsbuffer A: 20 mM tris.HCl pH 7,5, buffer B: buffer A og 1 M NaCl, pH 7,5, 9 minutter 15* B, deretter økning under forløpet på 21 minutter til 70* B.•

Eksempel 21:

Karakterisering av desulfatohlrudinforbindelser fra fermenteringen av stammfin S. cerevisiae GRF 18/ pJDB207/ PH05- HIR Ifølge HPLC-analyse er hirudinforbindelsene fra fraksjoner 17 (eller topp 1) og 18 (eller topp 2) isolert fra mediet (kfr. eksempel 20, tabell 1 og 2) Identiske med de tilsvarende forbindelser isolert fra celleekstraktene (intracellulære hirudinforbindelser). Disse forbindelsene, såvel som forbindelsene fra topp 3 (kfr. tabell 2) kan kjennetegnes som følger:

a. Bestemmelse av amlnosvresammensetningen

Ca. 2,5 pg av den rene hirudinforbindelsen hydrolyseres i 24 timer med 6N HC1 ved 110°C og analyseres deretter som beskrevet av Chang et al. [DABS-Cl-fremgangsmåten; Methods ln Enzymology 91, 41 (1983)]. Hydrolysatet har følgende sammensetning:

b) Partiell sekvensanalvse

18 pg (2,5 mmol) av den rene hirudinforbindelsen underkastes

en konvensjonell sekvensanalvse ifølge Edman, og de N-termlnale fenyltiohydantoin (PTH)-aminosyrene bestemmes ved hjelp av RP-HPLC.

Resultater

Topp 1 ( kfr, tabell 2)

Sekvens fra syklus 1 til syklus 29 som angitt ovenfor.

Topp 3 ( fraksjon 18. kfr, tabeller 1 og 2)

Sekvens for syklus 1 til syklus 27 som angitt ovenfor.

De N-terminale sekvensene av de biosyntetiske hirudinforbindelsene som er undersøkt er følgelig identiske med de for autentisk hirudin.

c. C- terminal analyse

Hirudinforbindelsene nedbrytes med karboksypeptidase Y og de frigitte aminosyrer bestemmes i aminosyreanalyseringsenheten (kfr. J.Y. Chang, R. Knedel, D.G. Braun, Biochem. J. 199, 547).

Resultater

Topp 1 ( kfr, tabell 2)

C-terminale aminosyrer: -Glu-Tyr.

Topp 2 ( fraksjon 17. kfr, tabeller 1 og 2)

C-terminale aminosyrer: -Glu-Tyr-Leu-Gln.

Topp 3 ( fraksjon 18. kfr, tabeller 1 og 2)

C-terminale aminosyrer: -Glu-Tyr-Leu.

d) Tilsynelatende molekylvekter Desulfatohirudinforbindelsene (30 pg) analyseres på en SDS

ureagel [SUDSgel, kfr. Kyte et al., Anal. Biochem. 133, 515

(1983)]. Før Coomassie-blåfarging utføres fiksering med 12* trifluoreddiksyre. Et enkelt bånd svarende til en tilsynelatende molekylvekt på mellom 6000 og 7000 Dalton observeres.

e) Molekylvektbestemmelse ved FAB- MS

Desulfatohirudinforbindelsene underkastes positive ionemasse-spektrometri med hurtig atombombardement (FAB-MS). Instru-ment: ZAB-HF massespektrometer av VG-Analytical Ltd., Manchester; matriks: trioglyserol: Xenon bombardement ioneenergi 10 KeV; ytre kalibrering: Cs26«J25 (molekylvekt 6887,9) og Cs2gJ27 (7147,76).

Resultater

Topp 1 ( kfr . tabell 2)

empirisk formel: C276<H>421<N>77°107<S>6

molekylvekt (beregnet): 6722,23

molekylvekt (funnet): 6719,3

Topp 2 ( fraksjon 17, kfr, tabell 1 og 2)

empirisk formel:

molekylvekt (beregnet): 6963,518

molekylvekt (funnet): 6963,44

Molekylvekten er gjennomsnittet fra to forskjellige målinger.

Topp 3 ( fraksjon 18, kfr, tabeller 1 og 2)

empirisk formel:

molekylvekt (beregnet): 6835,39

molekylvekt (funnet):' 6832,9

Basert på de angitte data er

forbindelsene i topp 1 desulfatohirudin (1-63),

forbindelsene med topp 2 er identisk med autentisk desulfatohirudin (1-65) og

forbindelsen med topp 3 er nytt desulfatohirudin (1-64).

f) Humane trombin- hirudlndissosierlngskonstanter Dissosieringskonstantene Kn for de humane trombin-desul-fatohirudinkompleksene bestemmes ved fremgangsmåten ifølge S.R. Stoen og J. Hofsteenge, [Biochemistry 25, 4622-4628

(1986)] og er også sammenfattet i den følgende tabellen.

Tabellen inneholder også de spesifikke aktivitetene (uttrykt i ATTJ/mg) for de tre desulfatohirudinspecies som er oppnådd.

g) Ytterligere desulfatohirudlnforbindelse oppnådd fra transformert g. 1ær

Blandingen av desulfatohirudinforbindelse, fermentert og renset som beskrevet i eksempel 19 separeres videre og karakteriseres i detalj.

Den semipreparative separasjonen på "Vydac 218 TP 51Q" RP-HPLC-kolonne gir i tillegg til desulfatohirudinforbindelsene som beskrevet ovenfor (kfr. eksempel 21e) desulfatohirudin-lignende forbindelser som elueres fra kolonnen med retensjonstid 8,1 minutter.

Dette materialet kan karakteriseres ved massespektrometri med hurtig atombombardement (FAB-MS) og aminosyreanalyse, partiell sekvensering og C-terminal analyse.

FAB-MS avslører at materialet er en blanding av to forbindelser som har molekylvekt på henholdsvis 6429,5 og 6556,8.

Aminosyresammeiisetningen er som følger:

Partiell sekvensanalvse ( N- termlnal) C- terminale- analyser (kfr. eksempel 21c)

Basert på disse data består denne blandingen av desulfatohirudin (1-61) og av desulfatohirudin (1-62).

Eksempel 22:

Utrykking av desulfatohirudinforbindelser 1 g. 1ær Inneholdende et desulfatohirudingen uten slgnalsekvens ( fig. 7)

a) Isolering av pJDB207 vektorfragmentet

6 pg av plasmidet pJDB207R/IF(a-3) (EP 100,561) nedbrytes

fullstendig med restriksjonsendonukleasen BamHI. De resulterende DNA-fragmentene (6,85 kb og 1,15 kb) utfelles med etanol og opptas i 400 pl av 50 mM tris.HCl pH 8,0. 4,5 enheter av kalvetarmfosfatase (Boehrlnger, Mannheim) tilsettes. Blandingen inkuberes i 1 time ved 37"C, deretter inaktiveres fosfatasen ved 65°C i 1,5 timer. Oppløsningen reguleres til 150 mM NaCl og tilføres deretter på en "DE52"

(Whatman) anionbytterkolonne (100 pl) som på forhånd er bragt til likevekt med 10 mM tris.HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM

EDTA. Etter en vaskeoperasjon med den samme bufferen elueres DNA med 400 pl av 1,5 M NaCl, 10 mM tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA og utfelles med etanol. Det store 6,85 kb BamHI - fragmentet separeres fra det lille fragmentet på en 1,2* agarosegel 1 tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3.

b) Isolering av 534 bp PH05 promotorfragmentet

6 pg av plasmidet p31/R (EP 100,561) nedbrytes med restrik-sjonsendonukleasene EcoRI og BamHI. De resulterende 3 DNA-fragmentene separeres på en 1,2* agarosegel i tris-borat-EDTA-buf fer , pH 8,3. 534 bp BamHI-EcoRI-fragmentet isoleres. Det inneholder PH05-promotoren innbefattende transkripsjons-startsetene. c) Isolering av et 206 bp DNA- fragment med sekvensen som koder for desulfatohirudin 9 pg av plasmidet pML310 (kfr. eksempel 13c) nedbrytes fullstendig med restriksjonsenzymene BamHI og EcoRI. De resulterende to DNA-fragmentene separeres på en 1,2* agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. 206 bp EcoRI-BamHI-fragmentet isoleres.

d) LigerIng av DNA- fragmentene

De tre DNA-fragmentene omtalt i avsnitt a-c (se ovenfor)

oppnås fra agarosegel-blokker ved elektroeluering, rensing over "DE52" (Whatman)-anionbyttere, utfelles med etanol og resuspenderes i HgO.

0,1 pmol (0,45 pg) av 6,85 kb BamHI-vektor f ragmentet, 0,3 pmol (0,1 pg) av 534 bp BamHI-EcoRI PH05-romotorfragmentet og 0,25 pmol (34 ng) av 206 bp EcoRI-BamHI-fragmentet av pML310 ligeres i 15 pl av 60 mM tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DDT, 1 mM ATP med 600 enheter av T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15"C i 16 timer.

24 transformerte amp<*1> kolonier kultiveres separat i LB-medium med 100 g/ml ampicillin. Plasmid DNA isoleres ved frem-

gangsmåten ifølge Holmes et al. (supra) og" analyseres ved Hindlll-EcoRI dobbelt nedbrytning. Tilsynekomsten av ca. 600 bp stort EcoRI-HindiII-fragment indikerer at i det aktuelle klonet er PH05 promotorhirudin DNÅ-fragmentet i korrekt orientering til transkripsjon stoppsignalene på vektoren. Som ventet har ca. 50* av klonene den korrekte orienteringen av innskuddet. En av disse klonene betegnes pJDB207R/ PH05-HIR. e) Transformasjon av Saccharomvces cerevisiae GRF18: Saccharomvces cerevisiae stammer GRF 18 (a, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu-112, can<R>) transformeres med plasmidet PJDB207R/ PH05-HIR ved protokollen ifølge Hinnen et al., (supra). Seleksjon av transformerte gjærceller utføres på agarplater med gjær minimalt medium uten leucin. En transformert gjærkoloni isoleres og betegnes Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-HIR. f) Kultivering av S. cerevisiae GRF18/ pJDB207R/ PH05- HIR: Celler av S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/ PH05-HIR ristes i 20 ml gjær minimalt medium ("Difco Yeast Nitrogen Base" uten aminosyrer med tilsats av 2* glukose og 20 mg/liter L-histidin) ved 30°C og kultiveres til en celletetthet på 3xl0<7 >celler/ml. Cellene vaskes med 0,9* NaCl, og benyttes deretter for inokulering av 50 ml kulturer i lavt P^-minimalt medium. Lavt P^-minimalt medium fremstilles svarende til sammenset-ningen av "Difco Yeast Nitrogen Base"-medium (uten aminosyrer), men inneholder 0,03 g/liter KH2P04, 1 g/l KC1, og 10 g/l L-asparagin i steden for (NH4)S04, 2* glukose og 1 g/l L-histidin. Kulturene inokuleres opp til en celletetthet på 4xl0<6> celler/ml og omrøres ved 30° C i 42 timer ved 200 omdreininger. g) Analvse av produktblandlnger fra fermenteringen av S.

cerevisiae GRF18/ pJDB207R/ PH05- HIR

Cellene (kfr. eksempel 22f) - nedbrytes som vanlig, (kfr. f.eks. europeisk patentpublikasjon nr. 100 561). Supernatanten behandlet med 1,5* eddiksyre sentrifugeres og hver 2 ml av den klare oppløsningen tørkes på en "Speed Vac" konsentrator og i høyvakuum. Prøvene oppløses individuelt i 100 pl vann og underkastes HPLC-analyse (betingelser som i eksempel 20). Trombininhiberingen av de individuelle fraksjoner undersøkes. Fraksjonene med en retensjonstid på 16,5 minutter har trombininhiberingsaktivitet. Ifølge aminosyresammensetningen er denne fraksjonen desulfatohirudin. Basert på HPLC-analyse er titeren ca. 10 pg/1 kulturbuljong. I mediet er ingen hirudinaktivitet detekterbar.

Utbyttene i intracellulær og ekstracellulær hirudinaktivitet som oppnås fra gjærstammer inneholdende desulfatohirudingenet uten eller med en vedhengt signalsekvens er sammenfattet i tabell 3. Hirudinaktiviteten er målt ved trombininhiberingsanalysen.

Eksempel 23:

Konstruksjon av PH05- promotorutelatelser

a) Bal31 nedbrytning

Rekombinant fag M13mp9/PH05 Bam-Sal inneholdende BamHI-SalI

fragmentet av PH05 angitt i fig. 8, benyttes som en kilde for PH05 promotoren. (Se europeisk patentpublikasjon nr. 143 081). 20 pg av fag DNA (RF: replikativ form) nedbrytes med restriksjonsendonuklease Sali, hvilket resulterer i et lineært DNA på ca. 9 kb. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform utfelles DNA med etanol. DNA resuspenderes i 10 mM tris pH 8,0 ved en konsentrasjon på 0,5 pg/ml. 16 pg av Sali spaltet DNA nedbrytes med 2 U eksonuklease Bal31 (BRL) i 100 pl av 20 mM tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2 og 1 mM EDTA. Porsjoner på 2 pg DNA fjernes etter 1, 2, 3, 4, 5 og 6 min. inkubering ved 30'C og blandes øyeblikkelig med 50 pl fenol og 60 pl TNE. Etter ekstraksjonen med fenol/kloroform og etanolutfelling resuspenderes DNA i 10 mM tris pH 8,0 ved en konsentrasjon på 100 pg/ml. For å analysere omfanget av eksonukleolytisk spaltning med Bal31 nedbrytes 0,5 pg DNA fra hvert tidspunkt med endonuklease BamHI og analyseres på en 1,5* agarosegel i tris-boratbuffer pH 8,3 (90 mM tris.HCl, pH 8,3, 90 mM borsyre, 2,5 mM EDTA). Gjennomsnittlig 100 bp fjernes fra hver ende av fragmentet pr. 1 minutt Bal31 nedbrytning.

b) Tilsats av EcoRI- llnkere til det Bal31 behandlede DNA

To A260 enheter av EcoRI-1lnkere (5'-GGAATTCC-3', BRL)

resuspenderes i 250 pl av 10 mM tris pH 8, 1 mM EDTA. 2 pg av EcoRI-linkere kinaseres i 75 pl 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 15 mM DDT, 10 pM ATP og 33 U av T4 polynukleotidkinase (Boehrlnger). Etter 1 time ved 37°C får blandingen avkjøles til romtemperatur og lagres ved -20°C.

De rekombinante, dobbeltkjedede EcoRI linkerne ligeres med de butte endene til de Bal31 behandlede DNA-fragmentene. Et halvt mikrogram av Bal31 behandlet DNA (se eksempel 23a) inkuberes i 16 timer ved romtemperatur med et 50-gangers overskudd av kinaserte EcoRI-linkere i 20 pl 60 mM tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 20 mM ATT og 600 U av T4 DNA-ligase (Biolabs). Etter inaktivering av T4 DNA-ligasen (10 minutter ved 65°C) avspaltes overskudd av EcoRI-linkere ved hjelp av 50 U EcoRI (Boehrlnger) i et volum på 50 pl. DNA ekstraheres med fenol/kloroform, utfelles med etanol og resuspenderes i 10 mM tris, 1 mM EDTA TE). Deretter , spaltes DNA med 5 enheter av BamHI (Biolabs) og blandingen påføres en 1,5* lavtsmeltende agarosegel (Sigma) tris-boratbuffer (se ovenfor). Båndene farges med etidiumbromid og synliggjøres under langbølget UV lys ved 366 nm. De brede, diffuse båndmønsterne mellom 100 bp og 600 bp utskjæres ved gelen og DNA ekstraheres som følger: Stykket av agarose frigjøres ved 65°C, reguleres til 500 mM NaCl og inkuberes ved 65°C i 20 minutter. 1 volumdel fenol (bragt i likevekt ved 10 mM tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl tilsettes. Den vandige fasen reekstraheres to ganger med fenol og en gang med kloroform. DNA utfelles med 2,5 volumdeler kald, absolutt etanol og samles ved sentrifugering. DNA-pelleten vaskes med kald 80* etanol og tørkes deretter i vakuum. DNA resuspenderes i 10 pl TE.

c) Llgerlng 1 M13mp9

3 pg av RF av M13mp9 nedbrytes med 15 enheter EcoRI (Biolabs)

og 15 enheter BamHI (Boehrlnger) i et volum på 50 pl. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling resuspenderes DNA i 50 pl TE. 5 pl av utskåret vektor DNA (ca. 200 ng) blandes med 10 pl av prøvene ovenfor (DNA-fragmentet som oppstår fra forskjellige Bal31 nedbrytninger som beskrevet i eksempel 23b) og ligeres i et samlet volum på 20 pl i nærvær av 60 mM tris.HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 200 U T4 DNA-ligase i 15 timer. Transduksjon av kompetente celler av stammen E. coli JM101 utføres ifølge manualen "M13 cloning sequencing system", publisert av New England Biolabs. Fager fra et antall plakker tørkes og analyseres vedrørende størrelsen av deres DNA innskudd ved spaltning med restriksjonsenzymer EcoRI og BamHI.

d) Bestemmelse av Bal31- utelatesesende- punkter ved Sanger sekvensering ( utelatelser fra Sall- sete)

Sekvensering utføres ved å anvende dideoksy DNA-sekvense-ringssystemet ifølge Sanger et al. [Proe. Nati. Acad. Sei.

USA 74, 5463 (1977)] som beskrevet i den" ovenfor nevnte manualen. Utelatelsesendepunkter er angitt nedenfor:

e) Bestemmelse av Bal31- utelatelsesendepunkter ved Sanger sekvensering ( utelatelse fra BamHI- setet)

En tilsvarende serie av Bal31-utelatelser utføres som beskrevet under a-c, bortsett fra at M13mp9 PH05 Bam-Sal skjæres med BamHI. De Bal31 nedbrutte molekylene skjæres ved hjelp av EcoRI og Sali, og de genererte fragmentene klones inn i M13mp9 nedbrutt med EcoRI og Sali. Utelatelsesende-punktene er angitt nedenfor:

f) Konstruksjon av interne PH05- promotorutelatelser Bal31 utelatelsesserien beskrevet under d) produserer et "venstrearm" PH05-promotorfragment som ender med et EcoRI-sete, og Bal31 utelatelsesserier beskrevet under e) produserer et "høyrearm" PH05-promotorfragment som ender med et EcoRI-sete. Ved å kombinere "venstrearm" og "høyrearm" for forskjellige posisjoner skapes indre utelatelse som inneholder et EcoRI llnkersegment ved setet for det utelatte DNA. De individuelle indre utelatelsene konstrueres ved å kutte "venstrearmen" og "høyrearmene" fra M13mp9 derivater ved hjelp av restriksjonsendonuklease EcoRI og BamHI (venstrearmer) eller EcoRI og Sali (høyrearmer) og isolere de tilsvarende fragmentene ved myk agarosegelelektroforese som beskrevet under b). Ekvlmolare mengder av "venstrearmer", "høyrearmer" og 200 ng BamHI og Sali nedbrutt M13mp9 vektor DNA ligeres som beskrevet under c). Etter transduksjon 1 Ej. coil JM101 utplukkes hvite plakker, RF~ produseres og analyseres ved hjelp av restriksjonsanalyse (BamHI, Sali, EcoRI). De følgende armer kombineres slik at det dannes spesifikke indre utelatelser (for nummerering av nukleotidene kfr. fig. 8):

g) In vlvo analyse av de Indre utelatelsene fra PH05-promotoren

De forskjellige utelatelsene beskrevet i eksempel 23 f) klones i plasmid PJDB207/ PH05 [R. Haguenauer-Tsapis og A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology, 4, 2668-2675 (1984)] ved å erstatte villtype PH05 Bam-Sal fragmentet med den utelatte versjonen. Etter transformasjon av gjærstamme S. cerevisiae AH216 (kfr. europeisk patentpublikasjon nr. 143 081) bestemmes syrefosfataseaktiviteten som beskrevet av Tohe et al. [J. Bacteriol. 113, 727 (1973)]. Utelatelser All og A12 viser en ca. 10-gangers reduksjon av PH05 aktiviteten og definerer et oppstrømsområde ("oppstrømsaktiveringssete" UAS) som er essensielt for PH05 ekspresjonen. En tilsvarende reduksjonseffekt observeres for utelatelse Al7 (ved ca. 5-gangers reduksjon) og for TATA boks utelatelsene A23-A26 (ca. 30-gangers reduksjon). Alle andre utelatelser viser akti-viteter av tilnærmet villtypenlvå. Disse resultatene tyder på at tre områder av esslenslell informasjon for PHO5-u11r<y>kk1n<g >er anbragt ved følgende posisjoner:

1. Mellom posisjoner -349 og -383 (UAS1)

2. Mellom posisjoner -225 og -263 (UAS2)

3. Mellom posisjoner - 87 og -125 (TATA boks).

DNA-fragmentet inneholdende UAS1 eller UAS 2 eller UAS1 og UAS2 av PHO5 kan produseres for rekombinant fag M13mp9) PHO5 Bam-Sal (se ovenfor) ved spaltning med egnede restriksjonsendonukleaser. UAS1 er inneholdt i et 268 bp BamHI-Clal-fragment som har formelen:

UAS2 er Inneholdt 1 100 bp Clal-BstEII-f ragment som har formel og både UAS1 og UAS2 er tilstede i det 368 bp BamHI-BstEII-fragmentet som har formelen

Eksempel 24:

Ekspresjon av desulfatohirudin under kontroll av fm sam-mensmeltnin<g> PH05- GAPDH hybrldpromotor

Eksempel 23 gjør et område rundt på ca. -365 [UAS1(PH05)] og et annet område rundt posisjonen -180 [UAS2(PH05)] av PHO5-genet til mulige kandidater for UAS med regulerende funksjoner. UAS( PHO5) er inneholdt i et 268 bp BamHI-Clal-fragment, mens både UAS1(PH05) og UAS2(PH05) er inneholdt i et 368 bp BamHI-BstEII-fragment. Disse to fragmentene er begge sammensmeltet til to forskjellige GAPDH nedstrømspromotor-elementer som innbefattet TATA boksen og transkrip-sjonsinitieringsseter av GAPDH.

a) Konstruksjon av et gjærgen- bibllotek

30 pg av gjær DNA med høy samlet molekylvekt [M.V. Olsen, et

al., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979)] fra villtype Saccharomvces cerevlsiae-stamme S288C inkuberes i 30 minutter ved 37°C med to enheter EcoRI metylase (New England Biolabs) i 250 pl EcoRI-metyleringsbuffer som anbefalt av fabrikanten. DNA utfelles med etanol, resuspenderes i 500 pl av 25 mM tris.HCl pH 8,5, 2 mM MgCl2 (EcoRI<*->buffer) (H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1979) og nedbrytes med EcoRI (Boehrlnger) inntil størrelsesfordelingen av DNA-fragmentene har et maksimum i området 30-50 kb (en Xhol nedbrytning av DNA gir

egnede 33 kb og 17 kb markører). Gjær-DNA nedbrutt under . EcoRI<*->betingelser er størrelsesfraksjonert på en sukrose-gradient (5-20* sukrose i 10 mM tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA)

i 6 timer ved 38 000 rpm i en SW 40 rotor. 30 fraksjoner av 0,4 ml hver, samles fra toppen av gradienten. Fraksjon 16 inneholder DNA-fragmentet av størrelse 30-50 kb. DNA fra denne fraksjonen (3 pg) utfelles med etanol og ligeres i 16 timer ved 15°C i et samlet volum på 15 pl til 1 pg av kosmidvektor pYcl [B. Hohn et al., i "Genetic Engineering", bind 2, side 169, New York 1980)] linearisert med EcoRI. Ligeringen utføres med 300 U T4 DNA-ligase (New England Biolabs), ved anvendelse av buffersystemet beskrevet av fabrikanten. DNA forpakkes in vitro i bakterifag X[B. Hohn I "Methods in Enzymology, bind 68, side 299, New York 1979)] og sammensatte fager benyttes til å transformere E. coli-stamme HB101 (Zk<_,> mjj", leu", ro". recA). Transformasjons-effektiviteten 3000 amp<R> kolonier utplukkes og dyrkes individuelt i brønnene av mikrotiterplater i LB-medium [10 g "Bacto-trypton" (Difco), 5 g "Bacto gjærekstrakt" (Difco), 10

g NaCl] inneholdende 100 pg/ml ampicillin.

b) Isolering av gjær GAPDH- genet

Genblblioteket beskrevet ovenfor undersøkes med et syntetisk

oligonukleotid [fremstilt ved å anvende fosfotriesterfremgangsmåten: K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327

(1975), J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)] av følgende struktur: 5'GCTCCATCTTTCCACCGCCCC-3', 10 pg av oligonukleotidet kinaseres ved anvendelse av 10 pl av -y-<3>2P-ATP (3000 Ci/mmol, 10 pCi/pl Amersham) med T4 polynukleotid kinase (Boehrlnger)

i et samlet volum på 50 pl som beskrevet av Maniatis et al.

["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, side 125]. Kolonihybridisering utføres som beskrevet av samme forfatter (side 312). Positive kloner detekteres ved autoradiografi ved anvendelse av "Kodak X-5" røntgenfilm. Plasmid-DNA isolering gir et hybridklori som Inneholder et 2100 bp Hindlll fragment som koder for GAPDH. [J.P. Holland

et al., Biol. Chem. 254 9839 (1979)]. Endelig bevis for . autentisiteten av det klonede DNA oppnås fra DNA sekvense-ringsforsøket ved anvendelse av det ovenfor nevnte oligonukleotidet i kombinasjon med dideoksysekvenseringsprotokol-len som beskrevet av G.F. Hong [Bioscience Reports 1, 243

(1981)] for dobbeltkjedet DNA. Det klonede GAPDH-genet (se fig. 9) har den samme sekvensen som pgap491 publisert av Holland et al., [J. Biochem. Chem. 255, 2596 (1980)].

c) Fremstilling av GAPDH nedstrømspromotorelementer ( kfr, fig- 10)

Det 649 bp Taql-fragmentet som innbefatter posisjon -27 til 675 fra ATG av GAPDH-<g>enet (se fig. 9) isoleres ved nedbrytning av det ovenfor nevnte hybridplasmidet med Taql (New England Biolabs), separering av DNA-fragmentene på en 1,2* myk agarosegel og ekstraksjon av DNA med varm metanol (se eksempel 23). Kloning av Taql-fragmentet utføres i Clal-setet av pBR322: 1 pg av pBR322 spaltes med 3 enheter av Clal (New England Biolabs) som beskrevet av fabrikanten. 300 ng av den fenoliserte og skårne vektoren ligeres til ca. 300 ng av innskudd DNA (649 bp Taq-fragment) ved å anvende 200 U T4 ligase i et samlet volum på 20 pl (se eksempel 23b). Transformasjon utføres i E. coil HB101 for ampicillin-resistens, plasmid DNA fremstilles og analyseres med restriksjonsanalyse [Taql, Dral]. Orienteringen av Taql-fragmentet etableres ved å anvende restriksjonsendonuklease Dral i kombinasjon med BamHI-setet av plasmidene og et plasmid utvelges som har Taql setet av posisjon -675 nær Hindlll-setet av pBR322. Plasmidet betegnet som pBR322/GAPDH lineariseres ved anvendelse av BamHI (New England Biolabs), og en nedbrytning med Bal31 utføres som beskrevet i eksempel 34, bortsett fra at Bglll linkere (5'-CAGATCTG-3 *, New England Biolabs) og det nedbrutte plasmidet sirkulariseres direkte ved en konsentrasjon på 5 pg/ml i et samlet volum på 20 pl. Størrelsen av Bal31-forkortede Taql-fragmentet bestemmes ved restriksjonsanalyse (ved anvendelse av Bglll og Hindlll). To kloner utvelges som inneholder DNA-fragmenter med utstrekning ca. 200 bp og 265 bp fra ATG oppstrøm i GAPDH-promotoren. Begge fragmentene inneholder den antatte TATA-boksen ved ca. -140 bp. Disse klonene inneholder fremdeles opphavet for replikering i den pBR322 avledede delen av DNA og betegnes henholdsvis pGAPDH-F og pGAPDH-E.

d) Kombinasjon av nedstrøms GAPDH- promotorelementet med UAS1 ( P0H5) av PH05 og det proteinkodende området av desulfatohirudin

I) GAPDH- elementet

For å utvide GAPDH-promotorelementet fra Taql-setet ved posisjon -27 til en posisjon inntil ATG av GAPDH-genet syntetiseres to syntetiske komplementære oligonukleotider av følgende struktur:

Disse oligonukleotidene tilveiebringer den genuine GAPDH-promotorsekvensen fra posisjonen -26 til posisjon -5 med genereringen av et terminalt EcoRI-sete. 2 pg av de to Bal31-isolatene fra eksempel 24c) (plasmider pGAPDH-E og -F) nedbrytes med 6 enheter Taql i 50 pl og den resulterende blandingen fenoliseres, etanolutfelles og resuspenderes i 10 pl vann. De syntetiske oligonukleotider rekombineres ved å blande 2 pl av hver enkeltkjede i 100 pl av en oppløsning inneholdende 10 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgClg, 50 mM NaCl, oppvarming i 3 minutter til 90"C og langsom avkjøling av oppløsningen ved romtemperatur (i løpet av 3 timer). Et pg 20-gangers overskudd av de rekombinerte nukleotider i et volum på 20 pl i ca. 18 timer ved anvendelse av 800 U T4 DNA-ligase. Hele blandingen nedbrytes med tre enheter Bglll (New England Biolabs), DNA-fragmentene separeres på en 1,5* myk agarosegel. Bglll-EcoRI-fragmentene på henholdsvis ca. 200 bp og 265 bp, utskjæres fra gelen, ekstraheres og etanolutfelles .

Plasmid pGAPDH-E nedbrytes med Bglll og EcoRI og det store , (ca. 3,5 kb) fragmentet isoleres. Dette fragmentet benyttes som vektor for å klone de 265 bp og 200 bp Bglll-EcoRI-fragmentene ved anvendelse av ligering, transformasjon og plasmidisoleringsbetingelser som beskrevet ovenfor. De fremstilte plasmidene betegnes pGAPDH-EL og pGAPDH-FL. DNA-sekvensene for Bglll-EcoRI-fragmentene klonet i plasmider pGAPDH-EL og pGAPDH-FL er gjengitt i fig. 11. Den nøyaktige størrelsen av fragmentene er henholdsvis 266 bp og 201 bp.

11) UAS1 ( PH05) regulerlngselementet

3 pg av plasmid p31/Y (se europeisk patentpublikasjon nr. 100 561) nedbrytes med 6 enheter Cia) (New England Biolabs). De 3' avskårne endene lnnfylles ved anvendelse av Klenow fragmentet av E. coil DNA-polymerase I. (Bethesda Res. Lab.) ifølge Maniatis (supra). Bglll-linkere (5'-CAGATCTG-3 *) tilsettes som beskrevet i eksempel 23. DNA nedbrytes med Sali og Bglll (New England Biolabs) og kjøres på en 1* myk agarosegel. 548 bp fragmentet utskjæres fra gelen, fenoliseres og etanolutfelles som beskrevet ovenfor.

III) DNA som koder for desulfatohirudin

Konstruksjon av plasmid pJDB207/PH05 (Eco)-HIR (kfr. fig. 12) . For hensiktsmessig sammenføyning av UAS ( PH05)- GAPDH hybridpromotorelementet til det kodende området av desulfatohirudin innbefattende PHO5 signalsekvensen (som i plasmid PJDB207/ PH05-HIR) innføres et EcoRI-restriksjonssete i det 5' utranslaterte området mellom mRNA-startsetet og ATG for det kodende området. 15 pg av plasmid pJDB207/PH05-HIR (se eksempel 16d) nedbrytes med restriksjonsendonuklease Dral (Boehrlnger). De resulterende 4 fragmentene separeres på en 0,8* agarosegel i tris-borat-EDTA-buf f er pH 8,3. 4,2 kb DNA-fragmentet utvinnes fra gelen, elektroelueres og utfelles med etanol. DNA resuspenderes i HgO ved en konsentrasjon på 0,6 mg/ml. To syntetiske oligonukleotider av formel (henholdsvis 2,3 pg og 2, 9 pg) kinaseres begge i 20 pl 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 20 U T4 polynukleotidkinase (Boehrlnger). Etter 45 minutter ved 37"C kombineres begge reaksjonsblandingene, oppvarmes i 10 minutter ved 75 "C og får avkjøles til romtemperatur. Den rekombinante oligonukleotidiinkeren lagres ved -20°C. 6,5 pg (2,3 mmol) av 4,2 kb Dral DNA-fragmentet inkuberes 16 timer ved 15"C med et 70-gangers overskudd av den kinaserte og rekombinerte oligonukleotidlinkeren i 50 pl av 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl3, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 800 U av T4 DNA-ligase (Biolabs). Etter inaktivering av T4 DNA-ligasen i 20 minutter ved 85 °C fjernes overskuddet av linkere ved utfelling av DNA i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat, pH 6,0, og 0,54 volumdeler isopropanol. DNA nedbrytes med EcoRI og Hindlll. De resulterende fragmenter separeres på 1* agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. 643 bp fragmentet utvinnes fra gelen ved elektroeluering og etanolutfelling. DNA resuspenderes ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. EcoRI-HindiII-fragmentet inneholder PHO5-signalsekvensen, den kodende sekvensen for desulfatohirudin og PHO5 transkripsjonsterminatoren. 534 bp PH05-promotorfragmentet isoleres fra plasmid p31/R (europeisk patentpublikasjon nr. 100.561). 10 pg av p31/R nedbrytes med restriksjonsendonuklease EcoRI og BamHI. De resulterende 3 fragmentene separeres på en 0,6* lavtsmeltende agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. Et 534 bp BamHI-EcoRI-fragment isoleres og inneholder PHO5-promotoren innbefattende mRNA-startsetene.

Vektorfragmentet isoleres fra plasmid pJDB207/PH05-HIR (se eksempel 16d), 6 pg av dette plasmidet nedbrytes med BamHI og Hindlll. Det store 6,5 kb BamHI-HindlII-fragmentet separeres fra det lille fragmentet på en 0,6* lavtsmeltende agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3.

Tre DNA-fragmenter beskrevet ovenfor med egnede klebrige ender ligeres i følgende reaksjon: 0,2 pmol (70 ng) av 534 bp BamHI-EcoRI PH05-promotorfragmentet. 0,2 pmol (85 ng) av 643 bp EcoRI-HlndIII-fragmentet hirudinkodende sekvens) og 0,1 pmol (0,4 pg) av 6,5 kb BamHI-HindiII vektorfragmentet ligeres i 10 pl av 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT,

1 mM ATP og 400 U av T4 DNA-ligase i 6 timer ved 15°C. En porsjon på 1 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalslumbehandlede transformasjonskompetente E. coil HBlOl-celler . 12 transformerte, amp<R> kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Holmes et al. [Anal. Blochem. 114 (1981) 193] og analyseres med EcoRI og BamHI-restriksjonsnedbrytninger. Et klon med de ventede restriksjonsfragmentene isoleres og betegnes som pJDB207/PH05(Eco)-HIR. IV) Ligerlng av UAS1( PH05)- GAPDH- hvbrldpromotorene til det proteinkodende området av desulfatohirudin 15 pg av plasmid pJDB207/ PH05(Eco)-HIR (se eksempel 24 dill) nedbrytes med EcoRI og Hindlll. DNA-fragmentene separeres på en 1* agarosegel 1 tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. 643 bp fragmentet isoleres fra gelen, elektroelueres og utfelles med etanol. DNA resuspenderes i H20 i en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. 6 pg plasmid pJDB207/PH05-HIR nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonuklease Hindlll og Sali. Det store 6,3 kb fragmentet (vektordel) isoleres med myk agarosegelelektroforese, fenolekstraksjon og etanolutfellirig. Vektor DNA- , fragmentet resuspenderes i HgO ved en konsentrasjon på 0,05 pmol/pl. 10 pg av plasmid pGAPDH-EL (se eksempel 24dl) nedbrytes med Bglll og EcoRI. 266 bp Bglll-EcoRI-fragmentet separeres på en 1,2* agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3, elektroelueres fra gelen og utfelles med etanol. DNA resuspenderes i HgO ved en konsentrasjon på 0,3 pmol/pl.

0,3 pmol av 548 bp SalI-Bglll-fragmentet innbefatter UAS1 (PH05) (eksempel 24dII), 0,3 pmol av 266 bp Bglll-EcoRI-fragmentet av pGAPDH-EL, 0,3 pmol av 643 bp EcoRI-Hindll-fragmentet av pJDB207/PH05(Eco)-HIR og 0,12 pmol av 6,3 kb Sal I-Hindi 11-vektorfragmentet ligeres i 20 pl 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 U av T4 DNA-llgase (Biolabs) i 6 timer ved 15°C. Porsjoner på 1 pl og 3 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsium-behandlede E. coli HBlOl-celler. Plasmidisolering fra amp<R->kolonler og restriksjonsanalyse med Sali, Bglll, EcoRI og Hindlll utføres som beskrevet ovenfor (se eksempel 24dIII). Et positivt klon utvelges og betegnes som pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1).

En analog konstruksjon utføres med 201 bp Bglll-EcoRI-fragment isolert fra pGAPDH-FL. Et utvalgt plasmid betegnes pJDB207/PAPEL-HIR(UASl).

V) Llgering av UASKPH05)- UAS2( PH05)- GAPDH hvbrldnromotorene til det proteinkodende området av desulfatohirudin ( se flg. 131

3 pg av hvert plasmid pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) og pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) nedbrytes med Bglll. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling innfylles de 3' avskårede endene av DNA med E. coil DNA polymerase (Klenow fragment, Bethesda Res. Lab.) ifølge Maniatis et al. (supra). Enzymet inaktiveres ved 70°C i 10 minutter. DNA nedbrytes videre med

Sali, og de store 7,2 kb fragmentene isoleres ved myk agarosegelelektroforese, fenolekstraksjon og etanolutfelling. Hvert fragment resuspenderes i HgO ved en konsentrasjon på 0,05 pmol/pl. Fragmentene inneholder det hirudinkodende området, det meste av vektorsekvensen og et hvilket som helst av to forskjellige GAPDH-promotorelementer isolert fra pGAPDH-EL eller pGAPDH-FL.

Plasmid p31/Y (europeisk patentpublikasjon nr. 100 561) nedbrytes med BstEII, inkuberes med E. coil DNA-polymerase (Klenow fragment) som beskrevet ovenfor og spaltes med Sali. 649 bp fragmentet separeres på en myk agarosegel og utvinnes ved fenolekstraksjon og etanolutfelling.

0,3 pmol av 649 bp fragmentet av p31/Y innbefattende UAS1-UAS2(PH05) promotorelementet og 0,15 pmol av et hvilket som helst av 7,2 kb-fragmentene ligeres og transformeres i E. coil HB101 som beskrevet ovenfor. Plasmidet prepareres fra amp<R->kolonier og analyseres ved restriksjonsnedbrytninger. Enkle kloner utvelges og deres plasmid DNA betegnes som pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1+UAS2) og

pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1+UAS2).

Eksempel 25:

GAPDH- promotorelementer smeltet til den proteinkodende sekvensen av desulfatohirudin

To GAPDH-promotorelementer av forskjellige lengder (som beskrevet 1 eksempel 24dl) ligeres til det proteinkodende området av desulfatohirudin innbefattende PHO5 signalsekvensen .

De to elementene (henholdsvis 266 bp og 201 bp) innbefatter GAPDH TATA-boksen, mRNA-startsetene og et AT rikt 5' utranslatert område. Nukleotidsekvensen for begge elementene er vist i fig. 10.

3'-endene av elementene er begge ved posisjon -5 fra ATG av GAPDH genet etterfulgt av et EcoRI-gjenkjenningssete (se ollgonukleotidlinker innført I eksempel 24dl), 5' endene er ved posisjon henholdsvis -198 og -263, fra ATG med Bglll linkere tilsatt ved disse posisjoner.

Bglll-EcoRI-promotorfragmentene ligeres til et EcoRI-Hindlll-fragment med sekvenser som koder for PH05-signalsekvensen og desulfatohirudin og til et HindiII-BamHI-vektorfragment. 6 pg av plasmid pJDB207/ PH05-HIR nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonukleaser Hindlll og BamHI. Det store 6,5 kb fragmentet (vektordel) separeres på en 0,8* agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3, elektroelueres fra gelen, fenolekstraheres og utfelles med etanol. Vektor DNA-fragmentet resuspenderes 1 H20 med en konsentrasjon på 0,05 pmol/pl.

0,3 pmol av 266 bp Bglll-EcoRI fragmentet av pGAPDH-EL (eksempel 24d IV), 0,3 pmol av 643 bp EcoRI-Hindi 11-f ragmentet av pJDB207/PH05(Eco )-HIR (eksempel 24d III) og 0,1 pmol av 6,5 kb Hindi 11-BamHI-vektorfragmentet ligeres i 10 pl av 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 U T4 DNA-ligase (Biolabs) i 6 timer ved 15<*>C. 1 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsiumbehandlede E. coli HBlOl-celler. Plasmidisolering fra amp<R> kolonier og restriksjonsanalyse med EcoRI utføres som beskrevet i eksempel 24dIII. Et positivt klon utvelges. Dets plasmid DNA betegnes som pJDB207/GAPEL-HIR.

En analog konstruksjon utføres med 201 bp Bglll-EcoRI-fragmentet isolert fra pGAPDH-FL. Plasmid DNA fra et utvalgt klon betegnes pJDB207/GAPFL-HIR.

Eksempel 26:

Konstruksjon av ekspres. lonsplasmider med tandem innskudd av den kodende sekvensen av utskilt desulfatohirudin ( se flg.

141

De følgende konstruksjoner Inneholdende et DNA-fragment duplisert i et tandem hode-til-hale arrangement. Det dupliserte fragmentet innbefatter GAPDH promotor eller en hybrid PH05- GAPDH-promotor (som beskrevet hhv. 1 eksempel 24 og 25), PH05-signalsekvensen, den kodende sekvensen for desulfatohirudin og PHO5 transkripsjonsterminatoren. 7 pg av plasmid pJDB207/GAPEL-HIR nedbrytes med restriksjonsendonuklease Hindlll. De 3' avskårede endene innfylles I en reaksjon med E. coil DNA-polymerase I. (Klenow fragment, Bethesda Res. Lab.) Ifølge Maniatis (supra). 1,8 pg av Sall-linker 5•-GGTCGACC-3' (Biolabs) kinaseres i 50 pl av 60 mM tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 50 U av T4 polynukleotidkinase (Boehrlnger). Etter 45 minutter ved 37°C oppvarmes blandingen i 10 minutter ved 75°C og får avkjøles til romtemperatur. 7 pg (1,5 pmol) av linearisert plasmid pJDB207/GAPEL-HIR med Hindlll-setene omvandlet til butte ender (se ovenfor) inkuberes i 16 timer ved 15°C med 80-gangers overskudd av kinaserte og rekombinerte Sal-linkere i 30 pl av 60 mM tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 800 U av T4 DNA-ligase (Biolabs). Etter inaktivering av T4 DNA-ligasen ved 75°C i 10 minutter, fjernes overskuddet av llnkere i utfellingen av DNA i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 volumdeler isopropanol. DNA nedbrytes med Sali. De resulterende fragmentene separeres på 1* agarosegel tris-borat-EDTA-buf fer, pH 8,3. 1,1 kb Sall-fragmentet utvinnes fra gelen ved elektroeluering, fenolekstraksjon og etanolutfelles. DNA resuspenderes ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. 5 pg av plasmid pJDB207/GAPEL-HIR nedbrytes fullstendig med Sali. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling resuspenderes DNA i 100 pl av 50 mM tris pH 8,0, 4,6 U av kalvetarmalkalisk fosfatase (Boehrlnger), tilsettes. Etter f" time ved 37°C inaktiveres fosfatasen 1 nærvær av 100 mM NaCl, 5 mM EDTA og 0,5* SDS i 15 minutter ved 68'C. DNA oppløsningen påføres på et 100 pl sjikt av "DE52" (Whatman )-anionbytter bragt til likevekt med 10 mM tris pH 7,5, 150 mM NaCl og 1 mM EDTA. Etter vasking av kolonnen med den samme buffer, elueres DNA med 400 pl av 1,5 M NaCl, 10 mM tris, pH 7,5, 1 mM EDTA og utfelles med etanol. Linearisert plasmid separeres fra uskåret DNA på en 0,6* agarosegel trisacetatbuffer. Det lineære 7,3 kb DNA-fragmentet utvinnes fra gelen, elektroelueres, fenolekstraheres, etanolutfelles og resuspenderes ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. 0,2 pmol av 1,1 kb Sali fragmentet og 0,1 pmol av den lineariserte vektoren, ligeres i 10 pl av 60 mM tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 200 U av T4 DNA-ligase i 16 timer ved 15°C. En porsjon på 1 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 600 pl av kalsiumbehandlede transformasjonskompetente E. coil EBlOl-celler. 24 transformerte Amp<R->kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/inl ampicillin. Plasmid DNA fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Eolmes et al. [Anal. Biochem. 114,

(1981) 193] og analyseres med EcoRI restriksjonsnedbrytning. Et klon med de ventede restriksjonsfragmentene isoleres og betegnes som pJDB207/[GAPEL-EIR]D.

Analoge konstruksjoner utføres med plasmider pJDB207/GAPFL-HIR og pJDB207/PAPFL/EIR(UASl+UAS2). Det resulterende plasmid DNA for et valgt klon fra hvert betegnes pJDB207/[GAPFL-HIR]D og pJDB207/[PAPFL-EIR(UASl+UAS2)]D.

Eksempel 27:

Konstruksjon av et ekspres. lonsplasmld med fire innskudd av den kodende sekvensen for utskilte desulfatohirudin Fire kopier av et DNA-fragment innbefattende en GAPDE-promotor, PE05-signalsekvensen, den kodende sekvensen av desulfatohirudin og PHO5 transkripsjonstermihatoren innføres i gjærekspresjonsvektoren 1 et tandem hode-til-hale arrangement . 10 pg av plasmid pJDB207/[GAPFL-HIR]D (se eksempel 26) nedbrytes med Sali. De klebrige endene av det resulterende lineære fragmentet innføres ved en reaksjon med E. coli DNA polymerase I, (Klenow fragment BRL), ifølge Maniatis et al., (supra). 0,94 pg av Hindlll-linker [5'-CAAGCTTG-3', Biolabs] kinaseres, selv-rekombineres og ligeres til det lineariserte plasmidet pJDB207/[GAPFL-HIR]D med Sall-setene omvandlet til butte ender (se ovenfor). Linkerligering og isopropanolutfelling er som beskrevet i eksempel 26. DNA spaltes deretter med Hindlll og det resulterende 2,2 kb fragmentet isoleres ved elektroeluerlng, fenolekstraksjon og etanolutfelling. DNA resuspenderes ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. 5 pg av plasmid pJDB207/[GAPEL-HIR]D nedbrytes fullstendig med Hindlll. DNA defosforyleres med kalvetarmalkalisk fosfatase (Boehrlnger), renses med "DE52" ionebytterkromato-graf! og isoleres fra 0,6* agarosegel med elektroeluerlng som beskrevet 1 eksempel 26. 0,2 pmol av 2,2 kb Hindi 11-f ragmentet og 0,1 pmol av den lineariserte vektoren ligeres (supra). En porsjon på 1 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl kalsiumbehandlede, transformasjonskompetente E. coli HBlOl-celler. 12 transformerte, amp<R->kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles og analyseres ved Sali, Xbal, Aval, Xbal dobbel nedbrytninger og BamHI-nedbrytning. Et 1,1 kb BamHI-nedbrytning. Et 1,1 kb BamHI-forbindelsesfragment indikerer at innskuddet er tilstede i et hode-tll-hale arrangement med hensyn på de to kopiene som allerede er på plasmidet. Et klon med denne orienteringen av innskuddet betegnes pJDB207/[GAPFL-HIR]T.

Eksempel 28;

Konstruksjon av en g. 1ær- ekspres. 1onsvektor inneholdende PH05-promotoren. invertasesignalsekvensen og det desulfatohlrudln-kodende området

A) Syntese av oligodeoksyribonukleotider for lnvertasesignal-sekvens

Fire oligodeoksyribonukleotider: I-l, 1-2, 1-3, 1-4 syntetiseres ved hjelp av DNA-syntetiserlngslnnretning (modell 380 B Applied Biosystems). Etter deblokking renses de syntetiske fragmenter på en 12* akrylamidgel inneholdende 8 M urea. Saltfrie, rene oligodeoksyribonukleotider oppnås ved anvendelse av "Sep.Pak" (Water Associates). Disse fragmentene utgjør en dupleks som koder invertasesignalsekvensen med de oftest anvendte gjærkodonene.

B) Underklonlng av Invertasesignalsekvensen

a) Fremstilling av vektor;

15 pg av p31R/SS-TPA 2 (europeisk patentpublikasjon nr. 143

081) nedbrytes med 10 TJ EcoRI (Boehrlnger) i 50 pl av 10 mM tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgClg, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol i 1 time ved 37° C. Etter tilsats av 1 pl 2,5 M NaCl, tilsettes 10 U Xhorl (Boehrlnger) og Inkuberes ved 37°C i 1

time. 4,2 kb vektoren isoleres på en 0,8* preparativ agarosegel. Gelstykket overføres til et "Mikro Colloidor"-rør (Sartorius GmbH), dekket med 200 pl TE og elektroelueres (elektroforeres ved 90 mA i 50 minutter). TE-oppløsning samles og utfelles i 2,5 volumdeler absolutt etanol etter tilsats av 0,1 volumdel lOxTNE. DNA-pelleten vaskes med kald 80* etanol og tørkes i vakuum. DNA resuspenderes i 6 pl TE (40 pmol/pl). b) Rekomblnas. lon av oligodeoksyribonukleotider ( I- l. 1- 2. I-3. 1- 4) kinasering og llgering med vektor

En oppløsning inneholdende 10 pmol av hvert av de fire deoksynukleotidene i 10 pl 0,5 M tris.HCl pH 8 inkuberes ved 95°C i 15 minutter på et vannbad. Vannbadet avkjøles langsomt til 30" C i løpet av et tidsrom på 5 timer. Til denne rekombinerte blandingen tilsettes 2 pl av hver av 0,1 M MgCl2, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ATP og 8 U (l/pl) polynukleotldkinase (Boehrlnger). Kinasering utføres ved 37°C i 1 time. De rekombinerte, kinaserte oligodeoksyribo-nukleotldene og 60 pmol av den EcoRI-XhoI skårede vektoren (1,5 pl) ligeres med 400 U (1 pl) av T4 DNA ligase (Biolabs) ved 14"C i 17 timer. Reaksjonen stoppes ved inkubering ved 65°C i 10 minutter. 10 pl av denne ligeringsblandingen benyttes for transformasjon av E. coil HB 101 Ca<++> celler [M. Dagert og S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979)]. 20 amp<R >kolonier utvelges. DNA fremstilles ved den raske isolerings-fremgangsmåten [D.S. Holmes og M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)]. DNA nedbrytes med EcoRI og Xhol, radiomerkes ved EcoRI enden og analyseres på en 6* polyakrylamidgel inneholdende 8 M urea ved anvendelse av radiomerket pB322 Haelll skåret DNA som markør. Bånd av korrekt størrelse observeres for DNA oppnådd fra alle de 20 koloniene. Et klon dyrkes 1 100 ml LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid-DNA isoleres og betegnes som p31RIT-12. C) Sammenføyning av GAPFL- promotorelementet til lnvertase-signalsekvensen: 5 pg plasmid p31RIT-12 nedbrytes fullstendig med Sali og EcoRI. Det store 3,3 kb SalI-EcoRI-fragmentet isoleres på 0,6* agarosegel i tris-acetatbuffer pH 8,2. DNA elektroelueres fra gelen, fenolekstraheres og etanolutfelles. 10 pg av plasmid pJDB207/GAPFL-HIR (se eksempel 25) nedbrytes med Sali og EcoRI. Det 477 bp SalI-EcoRI-fragmentet isoleres med 0,8* agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. DNA elektroelueres, fenolekstraheres og etanolutfelles. Begge isolerte DNA-fragmentet ligeres. En porsjon av ligeringsblandingen benyttes til å transformere kompetente E. coli HBlOl-celler. Amp<R> kolonier dyrkes og plasmid DNA analyseres ved Hindlll, Salll-dobbelt nedbrytning. Et plasmid med det korrekte innskuddet betegnes p31/GAPFL-IT.

D) Konstruksjon av plasmid PJDB207/ GAPFL- I- HIR ( se fig. 15)

25 pg av plasmid p31/GAPFL-IT nedbrytes fullstendig med Pstl og Sali. Det resulterende 676 bp fragmentet isoleres på en 10* preparativ agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. DNA elektroelueres, renses ved "DE52"-ionebytterkromatografi, etanolutfelles og resuspenderes i buffer anbefalt for Hgal-nedbrytnlnger med en konsentrasjon på 0,1 pg/pl. Sall-Pstl-DNA-fragmentet nedbrytes delvis med Hgal i nærvær av 0,5 enheter/pg DNA i 60 minutter ved 37"C. Reaksjonen stoppes ved tilsats av EDTA til en endelig konsentrasjon på 10 mM. 534 bp SalI-Hgal-fragmentet isoleres på en 1* preparativ agarosegel. DNA elektroelueres fra gelen, renses ved "DE52" kromatografi, etanolutfelles og resuspenderes i HgO ved en konsentrasjon på ca. 0,1 pmol/pl. 10 pg av plasmid pJDB207/ PH05-HIR (se eksempel 16) nedbrytes med Baml og Hindlll. Det resulterende 587 bp Ball-Hlndlll-fragmentet isoleres på en preparativ 1* agarosegel. DNA elektroelueres, etanolutfelles og nedbrytes med HinfI. 1,3 pg (160 pmol) av hvert av de følgende oligodeoksy-mikl eo tidene kinaseres og rekombineres som beskrevet i eksempel 24dIII. 0,6 pg (1,6 pmol) av det Hindi nedbrutte Ball-Hindlll-f ragmentet (se ovenfor) og 160 pmol av den kinaserte og rekombinerte linkeren ligeres i 16 timer ved 15"C I 83 pl 10 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 400 enheter T4 DNA-ligase. Etter 10 minutter ved 85'C fjernes overskudd av linkere ved isopropanolutfelling av DNA (se eksempel 24dIII). Det 584 bp Hgal-HindiII-fragmentet isoleres på en 1* preparativ agarosegel. Det elektroeluerte, rensede og etanolutskilte DNA resuspenderes i HgO ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. 5 pg av PJDB207/ PH05-HIR nedbrytes med Hindlll og Sali og det store, 6,2 kb fragmentet isoleres.

0,2 pmol av 534 bp SalI-Hagl-fragment,

0,2 pmol av 584 bp Hgal-HindiII-fragmentet og 0,1 pmol av 6,2 kb SalI-HindiII-vektorfragmentet ligeres i 5 timer ved 15'C i 10 pl 10 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheter T4 DNA-ligase. En porsjon på 1 pl av ligeringsblandlngen benyttes til å transformere kompetente E. coil HBlOl-celler. 24 transformerte, amipicillinresistente kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles og analyseres med Hindlll, Sali dobbel nedbrytning. Et enkelt klon med de korrekte restrlk-sjonsmønstre isoleres og betegnes som pJDB207/GAPFL-I-HIR.

Identiteten av invertase-signalsekvensen dg den korrekte sammensmeltningen med den hirudinkodende sekvensen bekreftes ved nukleotidsekvensering.

Eksempel 29:

a) Transformasjon av Saccharomvces cerevisiae GRF 18: Saccharomvces cerevlsiae-stammer GRF18 (a, his 3-11, his3-15,

leu2-3, leu2-112, can<R>) transformeres med plasmidene pJDB207/PAPEL-HIR(UASl),

pJDB207/PAPFL-HIR(UASl),

pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2),

pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2),

PJDB207/GAPEL-HIR,

pJDB207/GAPFL-HIR,

pJCB207/[GAPEL-HIR]D,

pJCB207/[GAPFL-HIR]/D,

pJCB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2]D,

pJDB207/[GAPFL-HIR]T,

pJB207/[GAPFL-I-HIR]

ved å anvende transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen et al., [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. Transformerte gjærceller selekteres på plater med gjær minimalt medium som mangler leucin. Enkle transformerte gjærkolonler isoleres og betegnes som

Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl), Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJCB207/PAPFL-HIR(UASl), Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl+UAS2), Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl+UAS2), Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR, Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR, Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D, Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]D, Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/[PAPFL-HIR(UAS1+-UAS2)]D,

Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T,

Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR.

b) Fermentering av transformantene

Celler av S. cerevisiae GRF18 transformanter dyrkes alle i 10

ml gjær normalt medium ("Difco Yeast Nitrogen Base" uten aminosyrer hvortil det er tilsatt 2* glukose og 20 mg/l L-histidin) i en 50 ml Erlenmeyerkolbe med risting ved 30°C i 24 timer til en tetthet på 3 x IO<7> celler/ml. Gjærtransformanter inneholder plasmider med en hybrid PH05- GÅPDH-promotor krever derepresjon av promotoren for ekspresjon av desulfatohirudin. Cellene vaskes med 0,9* NaCl og benyttes til å inokulere 50 ml av et lavt P^ minimalt medium fremstilt ifølge oppskriften av "Difco Yeast Nitrogen Base"-medium (uten aminosyrer), men inneholdende 0,03 g/l KH2PO4, 10 g/l asparagin i steden for (NH4)2S04, 2* glukose, og 1 g/l L-histidin. Kulturene inokuleres opp til en celletetthet på 4 x 10<6> celler/ml og omrøres ved 30"C i opp til 24 timer ved 200 omdreininger/minutt. Endelige tettheter på 1 x 10<8->celler/ml oppnås.

Gjærtransformanter innbefattende plasmider med GAPDH-promotorer uttrykker desulfatohirudin konstruktivt. Celler dyrkes i et kompleks medium bestående av (g/l) pepton (5), gjærekstrakt (10), glukose (20), sukrose (40), ammonlumsulfat (3), KE2P04 (2), MgS04 (0,5), NaCl (0,1), CaCl2 (0,1), biotin (10 pg/1). Ca. lxlO<9> celler/ml oppnås etter 48 timers inkubering ved 30°C og 200 omdreininger/minutt.

Mengden av desulfatohirudin (bestemt ved trombininhiberingsanalyse) utskilt av noen representative transformerte gjærstammer er sammenfattet 1 den følgende tabellen.

Videre er det fastslått at minst 90* av desulfatohirudinforbindelsene som uttrykkes av gjærtransformantene utskilles i kulturmedlet. For å bestemme fordelingene av desulfatohirudin i kulturbuljongen og inne i cellene som en funksjon av høstningstidspunktet, utføres fermentering av en 3 1 "MBR bioreaktor" (MBR Bioreaktor AG, wetzikon, Sveits). Stamme Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR inokuleres i 3 1 komplett medium (se ovenfor) og inkuberes ved 30"C ved en rørehastighet på 500 omdreininger/minutt og en luftehastighet på 200 l/time). En endelig tetthet på 5 x 10<9> celler/ml oppnås. Prøver tas etter henholdsvis 18, 24 og 42 timer, og innholdet av desulfatohirudin i kulturbuljongen og inne i cellen (etter nedbrytning, se eksempel 22) bestemmes ved trombininhiberingsanalysen og ved HPLC.

Eksempel 30:

Kultivering av transformanter på en 300 liters skala

a) Inokuleringssvklusen

Et antall skrå agarer inokuleres fra en dypfrossen ampulle

inneholdende celler av stamme Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR. En eller flere skrå agarer inkuberes i 3-5 dager ved 28-30°C. Innholdet av en enkelt skrå agar Inokuleres sterilt 1 enkle 500 ml Erlenmeyerkolber uten skjermer og inneholdende 100 ml forkulturmedium. Flaskene rystes på en rotasjonsryster med et 50 mm kast ved 250 opm med en inkuberings temperatur på 28" C. Etter 48 timer inokuleres 2% (volum/volum) av innholdet i disse kolbene (1-ste prekultur) sterilt i 2 liter Erlenmeyerkolber inneholdende 600 ml forkulturmedium. Disse flaskene (2-dre forkul-tur) ristes I 48 timer ved 28°C på en rotasjonsryster ved 120 opm med et 50 mm kast. Innholdet av en av de andre forkul-turkolbene (2* volum/volum) innføres sterilt i en 50 liters rustfri stålfermenteringsinnretning inneholdende 30 liter forkulturmedium (planteforkultur). Fermenteringsbetingelsene for planteforkulturen er som følger: 600 opm (enkel seksbla-det turbinrører, 115 mm diameter), 4 skjermer, inngangstrykk: 0,3 bar; lufting i 1 liter luft pr. liter medium pr. minutt, temperatur 28°C, varighet 48 timer.

Agarmediet og forkulturmediet er like bortsett fra nærvær eller fravær av agar. Det samme forkulturmediet benyttes for alle forkulturtrlnnene. Sammensetning av forkulturmedium (g/l):

sammensetning av agarmedium:

som forkulturmedium pluss 20 g agar/l.

b) Produksjonsfermentering ( 300 1 skala)

5% (v/v, 15 liter) av den dyrkede planteforkulturen innføres

sterilt i en 600 liters fermenteringsinnretning inneholdende 300 1 sterilt fermenteringsproduksjonsmedium. Fermenteringsbetingelsene for de 300 1 produksjonsmedium er som følger: 450 opm (enkel 6-bladet rører, diameter 320 mm); 4 skjermer; fortrykk, 0,3 bar: luftgjennomgang: 0-9 timer; 0,25 1 luft pr. liter medium pr. minutt, 9 timers høst: 1 liter luft pr. liter medium pr. minutt; temperatur: 28°C, varighet 24-28 timer, OD^qo15-20* Utbytte: 15-25 mg/l (forsøksfremgangs-måter: HPLC og trombinforsøk).

Sammensetning av produksjonsmediet (g/l):

antiskum: "UCON LB 625" om påkrevet.

Eksempel 31:

Isolering av desulfatohirudin fra de 300 liter kulturbuljong Kulturbuljongen (kfr. eksempel 30), som har en pH-verdl på 3,3, avkjøles til 17°C. Cellene separeres ved hjelp av en "Westfalia SA-14" avslammingsinnretning (400-600 l/time). Det tykke slammet kastes. Den noe uklare supernatanten filtreres gjennom en serie "Skan" filterpatroner (første: porevldde 5 pg; andre porevldde 1 pm; tredje porevldde 0,22 pm), bringes til pH 7,5 med NaOH og påføres på en "DEAE" anionbytterkolonne. Kolonnen vaskes med natriumacetat (20 mM pH 4,5) og elueres med natriumacetat (20 mM, pH 3,1). Oppløsningen (15 liter) bringes til pH 7,5 med NaOH og konsentreres til et endelig volum på 1,8 liter i en sirkulasjonsfordamper. En porsjon på en 1 liter påføres på en "Sephadex G-25" kolonne (sjiktvolum: 8 liter; kolonnen er bragt til likevekt med vann). Fraksjoner inneholdende desulfatohirudin identifiseres ved hjelp av HPLC. Desulfatohirudinfraksjonen (2,5 liter) konsentreres med en "Rotavap" i høyvakuum til et endelig volum på 200 ml og lyofiliseres.

En porsjon (2 g) av råmaterialet oppløses i 50 ml vann, bringes til pH 7,5 med NaOH og påføres på en "Q Sepharose" kolonne med rask strømning (sjiktvolum: 200 ml). Kolonnen vaskes med ammoniumformiat (100 mM, pH 3,9). 25 ml fraksjoner uttas og undersøkes vedrørende desulfatohirudin ved HPLC. Fraksjoner inneholdende desulfatohirudin (1-65) samles (125 ml) og konsentreres med en "Rotavap" i høyvakuum til et endelig volum på 10 ml. Den konsentrerte oppløsningen påføres på en "Sephadex G-25" kolonne (Amicon, kolonnen er bragt til likevekt med vann) for avsalting. Den klare oppløsningen (25 ml) lyofiliseres. Det resulterende faste stoffet består av rent desulfatohirudin.

Eksempel 32:

Konstruksjon av plasmid pJDB207/ PH05- EGL

Nukleotidsekvensen som koder for eglin C, et polypeptid på 70 aminosyrer fra blodigle er syntetisert ln vitro, underklonet og uttrykt i E. coil som beskrevet 1 europeisk patentpublikasjon nr. 146.785. Den nøyaktige sammensmeltingen i ramme for den eglinkodende sekvensen til sekvensen som koder for PHO5 signalpeptidet oppnås ved en fremgangsmåte som er fullstendig analog med fremgangsmåten beskrevet for hirudin i eksempel 15 og 16. Et enkelt klon med den korrekte orientering av innskuddet i vektoren betegnes som pJDB207/PH05-EGl. Saccharomvces cerevisiae stamme GRF18 transformeres som vanlig. Transformanter utvelges og dyrkes som beskrevet i eksempel 29. Intet eglin C er detekterbart i kulturbuljongen.

Claims

1. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder en gjær-promotor valgt fra gruppen bestående av PH05-promotoren. GAPDH-promotoren og en hybridpromotor innbefattende oppstrømsaktiveringssekvenser av PHO5-<g>enet og nedstrømspromotorelementer innbefattende en funksjonell TATA-boks av GAPDH-genet, et DNA-segment bestående av en første sekvens som koder PHO5 eller invertasesignalpeptidet oppstrøm for og i leseramme med, en andre DNA-sekvens som koder for et modent desulfatohirudin, valgt fra gruppen bestående av des-(Leu<64>,Gln<65>)-desulfatohirudin-variant HVI av formelen des-(Gln^<5>)-desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HV2 av formelen desulfatohirudin-variant PA av formelen og funksjonelle varianter derav, hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av nevnte gjærpromotor, og en DNA-sekvens som inneholder eukaryotiske transkripsjonstermineringssignaler, og en selektiv markør valgt fra gruppen bestående av URA2. URA3. URA4. LEU2. HIS3, HIS4. TRP5 og TRP1.

2. Saccharomvces cerevisiae celle eller en annen gjærcelle som er i stand til å utskille desulfatohirudin i et kulturmedium, karakterisert ved at gjærcellen er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 1.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt desulfatohirudin valgt fra gruppen bestående av des-(Leu^4,Gln^5 )-desulfatohirudinvariant HVI av formelen des-(Gln<65>)-desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HVI av formelen desulfatohirudin-variant HV2 av formelen desulfatohirudin-variant PA av formelen eller et annet protein med hirudinaktivitet som har trombin-inhiberende virkning, en positiv reaksjon med anti-hirudin antistoffer og den primære strukturen av et desulfatohirudin, karakterisert ved at den innbefatter dyrkning under egnede næringsbetingelser av Saccharomvces cerevisiae celler eller andre gjærvertsceller som er i stand til å utskille desulfatohirudinet i kulturmedlet, hvilke celler transformeres med en ekspresjonsvektor ifølge krav 1, og isolering av desulfatohirudin fra kulturmedlet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det benyttes Saccharomvces cerevisiae eller en annen gjærvert som er i stand til å utskille desulfatohirudinet i kulturmedlet, transformert med en ekspresjonsvektor som innbefatter PH05-promotoren. et segment bestående av PHO 5-signalsekvensen oppstrøm for, og i leseramme med, en DNA-sekvens som koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av PH05-promotoren, og den 3'-flankerende sekvensen av PH05-genet. eller Saccharomvces cerevisiae eller en annen gjærvert som er i stand til å utskille desulfatohirudinet i kulturmedlet transformert med en ekspresjonsvektor som innbefatter GAPDH-promotoren, et segment bestående av PH05-signalsekvensen oppstrøm for, og i leseramme med, en DNA-sekvens som koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av GAPDH-promotoren, og den 3'-flankerende sekvensen av PH05-genet eller Saccharomvces cerevisiae eller en annen gjærvert som er i stand til å utskille desulfatohirudinet i kulturmedlet, transformert med en ekspresjonsvektor som innbefatter PH05-promotoren, et segment bestående av invertasesignalsekvensen oppstrøm for, og i leseramme med, en DNA-sekvens som koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transkripsjonskontroll av PH05-promotoren, og den 3'-flankerende sekvensen av PHO5-<g>enet♦