NO173742B - Fremgangsmaate for fremstilling av et ifn-alfa-ekspresjonsplasmid og et polypeptid med ifn-aktivitet - Google Patents

Description

En forutsetning for ekspresjon av gener i bakterier er tilstedeværelsen av en såkalt promoter, en gjenkjenningssekvens for bindingen av den bakterielle RNA-polymerase. En promotor mulig-

gjør således transkripsjonen av en etterfølgende sekvens. Gener for produkter som til enhver tid syntetiseres, har promotorer som bare er i stand til å bindes til RNA-polymerase-molekyler. Andre gener som f.eks. operoner hos bakterier er regulerte, dvs. at deres promotor kan gjøres tilgjengelig eller ikke-tilgjengelig gjennom bestemte mekanismer.

En ytterligere forutsetning for syntese av det ønskede gen-

produkt er en effektiv translasjon av RNA-transkriptet ved hjelp av de bakterielle ribosomer. Således ble det av Shine og Dalgarno (se Nature 254, 34-38 (1975)) påvist at hos bakterier er nukleotidsekvensen ved 5'-enden i mRNA ansvarlig for dennes binding til ribosom.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er derfor med hjelp av

en kjent promotor, som over en ny ribosombindings-/linker-sekvens er bundet til et strukturgen, å forbedre den genteknologiske produksjon av heterologe proteiner.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av et ekspresjonsplasmid inneholdende en 90 bp lang promotor/operator-sekvens av tryptofan-operonet av Serratia marcescens og ligeres med en ribosombindingssekvens med

formel

Den således oppnådde DNA-sekvens

blir eventuelt tilføyd en

< DNA-sekvens som koder for et modent IFN-a og som inneholdes i Pstl-innskuddet i klonet 1F7 (DMS nr. 2 3 62) >

i en slik form at DNA-sekvensen til strukturgenet er koblet til DNA-linkersekvensen via 3', 5<1->fosfodiesterbinding.

Ovennevnte sekvens utgjør en ny kombinasjon av en promotorsekvens som er kjent fra litteraturen, og en ribosom-bindings-sekvens som er kjent fra litteraturen.

En foretrukken DNA-sekvens har følgende formel:

så vel som den nye linkersekvensen med formel

En ytterligere gjenstand ved den foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmider som inneholder disse sekvensene, hvori sammenbindingen til de øvrige sekvensene følger etter det eneste Hindlll-spaltingssted i plasmidet, idet i hvert enkelt tilfelle det ønskede genet kan innsettes for fremstilling av ekspresjonsplasmidet, samt anvendelsen av det således fremstilte produksjonsplasmid til fremstilling av eukaryote genprodukter i prokaryoter, særlig for fremstilling av leukocytt-interferon.

Utførelse av oppfinnelsen kan eksempelvis foretas slik:

Utvelgelse av en egnet bakteriell promotorsekvens

Til dette blir det fortrinnsvis anvendt en promotor som,

i kombinasjon med en operatorsekvens, er induserbar henholdsvis undertrykkbar. En slik promotor har den fordel at syntesen av de ønskede, bakteriefremmede proteiner først kan kobles inn i en senere fase av den bakterielle vekstsyklus, f.eks. i tilfelle med tryptofanoperonet (se Hallewell og Eratage i Gene 9. 27-47 (1980)) gjennom fjerning av tryptofan fra kulturmediet og gjennom tilsats av indol-(3)-akrylsyre som induktor for tryptofanoperonet til kulturmediet, og derved ikke påvirke formeringen til bakteriene. Hensiktsmessig anvendes det til konstruksjonen av ekspresjonsplasmid det fra litteraturen kjen-te sterke og regulerbare promotor/operator-systemet til tryptofanoperonet til Serratia marcescens (se Miozzari og Yanofsky i Nature 276, 684-689 (1978)) med formel

Dette oppnås ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent fra 1itteraturen.

Konstruksjon av ribosombindinassekvens:

Til dette blir det anvendt den som svært virksom beskrevne sekvens med formel

5<1>TAAGGAGGTTTA

(se von Jay et al. i Proe. Nat. Acad. Sei., USA IB, 5543-5548

[1981]) .

Konstruksjonen av ribosombindingssekvensen med formel

skjer fortrinnsvis gjennom sammenbygning av de tre syntetiske oligonukleotidene med formlene

etter fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen, hvorved det 6-mere oligonekleotid hensiktsmessig merkes radioaktivt på forhånd.

Den tilsluttende sammenbinding av promotor/operator med ribosombindingssekvensen skjer etter en fremgangsmåte som er kjent fra litteraturen.

Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet;

Fra et plasmid, f.eks. plasmidet pBP 101, som inneholder en del av tryptofanoperonet til Serratia marcescens, blir den 90 bp lange promotor-/operator-sekvensen skåret ut ved hjelp av restriksjonsenzymene EcoRI og Haelll. Dette fragmentet blir deretter bundet sammen med det syntetisk fremstilte RBS ved hjelp av enzymet DNA-ligase, og det således fremstilte promotor-/operator-RBS-fragment, som inneholder en EcoRI-ende foran promotoren/ operatoren og en Hindlll-ende etter RBS-en, blir innført i plasmidet pBR322 ved siden av det 29 bp lange EcoRI-Hindlll-fragmentet i plasmidet. Effektiviteten til det således konstruerte ekspresjonsplasmid (pER103) med hensyn på ekspresjon av det i Hindlll-spaltingsstedet innbygde gen blir påvist ved hjelp av eksemplet med leukocyttinterferon, undertype A (IFN-aA).

Ekspresjon av IFN- aA i PER103:

Interferon syntetiseres i menneskeceller, på samme måte

som andre proteiner som skal utskilles, som forløperprotein,

dvs. som protein med en leader-sekvens. Denne leadersekvens avspaltes først ved proteinmolekylets uttreden av cellen ved hjelp av et dertil spesialisert enzym, hvorved den fullt utviklede form av proteinet frembringes. En mulighet for å la fullt utviklet interferon fremstilles av bakterier, er ved en fjerning av leadersekvensen på DNA-nivået, dvs. konstruksjonen av et gen som kun koder for sekvensen til det fullt utviklede proteinet.

Konstruksjon av interferonproduksjonsplasmidet for IFN- aA:

Eksempelvis har leukocyttinterferon en forløpersekvens på

23 aminosyrer, deretter følger en cysteinrest som etter spalt-ning av forløperinterferonet, utgjør den første aminosyre i "det fullt utviklede" interferonpolypeptidet. For å konstru-

ere plasmider som skal muliggjøre syntesen av fullt utviklet interferon i bakterier, er det nødvendig å isolere et fragment av interferongenet som begynner nøyaktig med kodonet for dette cysteinet. Foran dette cysteinkodon må det så innsettes et ATG-metioninkodon for å muliggjøre oppstartingen av protein-syntesen. Denne konstruksjonen innføres så på en passende måte i f.eks. ekspresjonsplasmidet pER103 slik at avstanden mellom ATG-startkodon og RBS er optimal for translasjonen. Interferon, som fremstilles ved hjelp av et slikt plasmid i bakterier,

har aminosyresekvensen til det fullt utviklede polypeptidet pluss et tilleggs-metionin i Nr^-enden til polypeptidet.

Interferonproduksjonsplasmidet pER33 som koder for IFN-aA konstrueres ifølge oppfinnelsen etter følgende prinsipp (frem-stillingen er skjematisk gjengitt i fig. 4): a) Konstruksjon av genet som koder for fullt utviklet interferon, med unntak av kodonet for cysteinet i Nl^-enden: Som utgangsmateriale for interferoninformasjon tjener eksempelvis den for IFN-aA kodende cDNA-klon 1 F7, som 17. mai 1982 ble deponert under DNS-nummeret 2362 ved deponerings-institusjonen "Deutsche Sammlung von Mikro-Organismen, Griesebachstrasse 8, D 3400 Gottingen (BRD)" (se også BRD-pa-tentsøknad P 32 20 116.8 av 28. mai 1982). Den inneholder interferongenet innført i Pst I-spaltingsstedet til pBR 322. IFN-aA (som også andre leukocyttinterferon-undertyper) har et spaltingssted for Sau 3A like etter det for NH2-ende-cysteinet kodende TGT. Tilstedeværelsen av dette spaltingsstedet utgjør grunnlaget for den anvendte fremgangsmåten for konstruksjon av et "fullt utviklet" interferongen fra egnede restriksjonsfrag-menter, f.eks. fra det interferonspesifikke Ava II-fragment med 646 bp og Sau- 3A-Ava II-fragmentet med 34 bp fra plasmidet 1 F7.

b) Fremstilling av oligonukleotid-komplekset:

Til det således konstruerte genet må nå det ved 5'-enden manglende cysteinkodonet og, utenfor det, et ATG-metioninkodon tilføyes; videre er det nødvendig med et forbindelsesstykke som muliggjør ligeringen av denne konstruksjonen i Hindlll-spaltingsstedet til ekspresjonsplasmidet pERl03I For dette formål syntetiseres 4 oligonukleotider: en 14-mer 5' TGTGATCTGCCTCA, en 12-mer 5' AGCTTAAAGATG, en 9-mer 5' CAGATCACA og en 8-mer 5' CATCTTTA. Disse oligonukleotider skal, etter ligering og en derpå følgende spalting med Sau 3A, gi det ønskede fragment som kan forbinde interferongen-delen (Sau 3A-ende) med pERl03 (Hindlll-ende) : Hindlll

Ifølge oppfinnelsen konstrueres oligonukleotidene slik at startkodon ATG og cysteinkodon TGT befinner seg på forskjellige fragmenter. Dette muliggjør en generell anvendelse av 12-mer (og 8-mer) ved innføringen av genet i pERl03. Oligonukleotidet med cysteinkodonet må derfor være minst 9 nukleotider langt. Eksempelvis kan følgende nukleotider anvendes:

Således spaltes f.eks. det ligerte oligonukleotidet som inneholder 14-meren, med Sau 3A for å frembringe Sau 3A-enden som passer i interferongenet.

Den tilføyende sammenbinding av interferongen og oligonukleotid-kompleks, ligeringen i et plasmid og dettes transformasjon i en bakteriell vert, f.eks. Escherichia coli HB 101, følger deretter ved fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen .

For å oppnå en ytterligere utbytteøkning ved fremstilling-en av eukaryote genprodukter kan det videre være en fordel at det hertil hørende ekspresjonsplasmidet inneholder den for ekspresjon nødvendige DNA-sekvensen i flere eksemplarer, f.eks. to, eksempelvis to komplette gener for fullt utviklet interferon aA inkludert den bakterielle, regulerende sekvensen. For dette formål isoleres det med en bakteriell promotor, et pro-karyotisk, ribosomalt bindingssted og et ATG-startkodon forsynt gen for fullt utviklet interferon fra et ifølge oppfinnelsen fremstilt produksjonsplasmid, f.eks. fra <p>ER3<3>r Qg innfelles etter endring av en av endene i dette DNA-stykket, i et med et restriksjonsenzym, f.eks. EcoRI, ifølge oppfinnelsen fremstilt rettkjedet, fullstendig likt plasmid.

Videre er det en fordel når et slikt ifølge oppfinnelsen fremstilt plasmid som bærer tryptofanoperon, som f.eks. plasmidet pER33, inneholder et "par"-lokus, dvs. en DNA-sekvens som ved fravær av et seleksjonstrykk, f.eks. gjennom et anti-biotikum som ampicillin, er ansvarlig for den ensartede over-føringen av plasmidet til datterceller under bakteriedyrkingen

(se P,M. Meacock, S.N. Cohen i Cell 20, 529-542 [1980] ) .." :For dette formål isoleres deretter "par"-lokuset fra plasmidet pPM31, som er beskrevet i det ovenfor nevnte litteratursted,

og bringes inn i et interferonproduksjonsplasmid fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Ved foreliggende oppfinnelse har det således lyktes å kon-struere et ekspresjonsplasmid som inneholder promotor-/operator-området til tryptofanoperonet fra Serratia marcescens,

samt en syntetisk RBS. Denne konstruksjonens effektivitet ved genteknologisk produksjon av bakteriefremmede proteiner vises ved et eksempel på leukocyttinterferon.

De etterfølgende eksempler skal forklare oppfinnelsen nærmere: A. Beskrivelse av den generelle fremgangsmåte;

1. Restriks j onsenzymspalting

Restriksjonsendonukleaser ble anvendt under de følgende betingelser:

EcoRI-, Hindlll-, Pstl- og Avall-spaltinger ble gjennom-

ført i TA-b>uffer (33 mM Tris-acetat, pH 7,9, 66 mM K-acetat,

10 mM Mg-acetat, 100 Mg/ml BSA):

Hae III-spaltinger ble gjennomført i TM-buffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2);

Sau 3A-spaltinger ble gjennomført i 10 mM Tris-HCl, pH

7,4, 10 mM MgCl2, 75 mM NaCl.

2. Plasmidbehandling, gelelektroforese

Plasmider ble behandlet med 1,5 ml, eller med 100-300 ml, L-næringsvæske + 25 Mg/ml tetracyklin eller + lOO Mg/ml ampicillin ved dyrking over natten etter forskriftene til Birnboim og Doly (se Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 [1979]). Videre rensing av plasmidene fulgte gjennom isopropanolutfellinger (se nedenunder) og (ved større utfellinger)

gjennom kromatografi på Sepharose 4B. Større

mengder plasmider (med 1-6 liter kultur) ble opparbeidet etter "cleared lysate"-fremgangsmåten til Clewell og Helsinki (se Biochemistry 9, 4428-4440 [1970]), idet det i tilslutning til denne ble gjennomført en ethidiumbromid-CsCl-gradient-sentrifugering.

Deretter fulgte elektroforese av plasmider henholdsvis

deres restriksjonsspaltingsprodukter i 0,8-1,4 % agarosegel eller i 6 % polyakrylamidgel, i 40 mM Tris-acetat, pH 7,8, 20 mM Na-acetat, 2 mM EDTA. Behandling av restriksjonsfragmen-ter fulgte ved utskjæring av de gelstykkene som inneholdt det ønskede fragmentet, og elektroforetisk eluering av DNA fra gelen i en dialysator. 3. Kinase- og fosfatasereaksjoner, ligasereaksjoner 5'-fosforyleringsreaksjoner (endemerkinger) ble gjennom-

ført i TM-buffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2) + 5 mM

DTT + 0,2-0,5 mM ATP (10-20 MCi <32>p-ATP) med 5 enheter T4-polynukleotidkinase, i løpet av 60 minutter ved 37°C.

Deretter ble det inkubert i 10 minutter ved 70°C for å

inaktivere enzymet.

Ligasereaksjoner ble gjennomført i TM-buffer + 5 mM DTT

+ 0,25 mM ATP med 0,1 enhet T4-DNA-ligase (ved "butt-ende"-ligeringer), henholdsvis 0,005 enhet ligase (ligeringer av kohesive ender) over natten ved 14 °C. Deretter ble enzymet denaturert i 10 minutter ved 70°C.

På hverandre følgende kinase- og ligasereaksjoner ble gjennomført i samme reaksjonsblanding. Etter varmedenaturer-

ing av det første enzymet ble på nytt 5 mM DTT og 0,25-0,5 mM

ATP tilsatt og den andre reaksjonen tilføyd.

Fosfatasereaksjoner ble gjennomført i restriksjonsspalt-ingsbuffer (vanligvis TA-buffer) ved tilsetning av 1 enhet alkalisk fosfatase (fremstilt av kalvetarm) til en restriksjonsspalting og inkubering i 15 minutter ved 37°C. Deretter ble 1-2 fenolekstraksjoner, en eterekstraksjon og en alkoholutfelling tilføyd. Ofte ble DNA-fragmentet nok en gang adskilt elektroforetisk og gel-eluert før videre manipuleringer ble gjennomført.

For å adskille store DNA-fragmenter (500 bp og større) fra mindre fragmenter (linker-fragmenter, som ikke er blitt ligert, eller små restriksjonsspaltingsprodukter), ble det gjennomført isopropanolutfellinger: reaksjonsblandingen ble tilsatt 2N NH^-acetat (sluttkonsentrasjon) og utfelt med 0,6 volumdel. iso-propanol i 10-20 minutter ved værelsetemperatur. Etter sentrifugering i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge ble supernatanten fjernet, utfellingen ble vasket med kald 70 % etanol, nok en gang sentrifugert og den derav resulterende pellet ble tørket og var klar for videre manipuleringer.

B. Fremstilling av oligonukleotider:

Tegnforklaring:

DMTr = p,p'-dimetoksy-trifenylmetyl

ibu = isobutyryl

= benzoyl (på base-nitrogen)

= polymert bærermateriale

= thymin eller

N 2-isobutyrylguanin eller

N^-benzoylcytosin eller

N^-benzoyladenin

THF = tetrahydrofuran

Eksempel I

Funksjonalisering av de polymere bærermaterialer

Funksjonaliseringen av de polymere bærermaterialene fulgte fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen. Som bærermateriale tjente HPLC-silisiumdioksydgel ("Macherey 5 Nagel",<®> korn-størrelse 20 nm, porestørrelse 200 Å). Det ble derivatisert slik som beskrevet av Mateucci og Caruthers med unntak av at suksinyleringstrinnet ble gjennomført med ravsyreanhydrid i vannfri pyridin (se M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21, 719 [1901],J. Am. chem. Soc. 103, 3185 [1981] og også T. Tanaka, R.L. Letsinger, Nucleic Acids Research, 10,

3249 [1982]). De beskyttede nukleosider ble så bundet kovalent til silisiumdioksydgelen i overensstemmelse med

den følgende formel:

Belastningstettheten utgjorde mellom 68 og 104 Mmol nukleosid pr. gram bærermateriale.

Eksempel II

5'- dimetoksytrityl- deoksythymidin- 3'- klormetoksvfosfitt

Det fullstendig beskyttede nukleosid-3'-klormetoksyfosfitt ble syntetisert etter fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen (M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, J.Am. Chem., 103, 3185 11981] og T. Tanaka, R.L. Letzinger, Nucleic Acids Research, 10, 3249 [1982]).

544,6 mg (1,0 mmol) 5'-dimetoksytrityl-thymidin (DMTrdT) ble oppløst i 1,0 ml absolutt THF og denne oppløsning ble ved -78°C i løpet av 15 minutter under argon overført dråpevis til en omrørt oppløsning av 0,9 mmol metyldiklorfosfitt i 0,5 ml absolutt pyridin og 2,0 ml absolutt THF. Etter ytterligere 10 minutter ble reaksjonsoppløsningen varmet opp til værelsetemperatur og sentrifugert. Supernatanten ble overført med en pipette til en tørr, med argon fylt slip-kolbe (25 ml). Oppløsningsmidlet ble avsugd ved værelsetemperatur under vakuum, deretter ble 0,5 ml tolueri og THF tilsatt og på nytt avdampet hvorved det ble tilbake et farveløst skumaktig fast stoff som produkt. Dette produktet ble ikke analysert med hensyn på sin renhet, men oppløst i 10,0 ml absolutt pyridin og denne oppløs-ningen ble oppbevart under argon ved -20°C inntil videre anvendelse, dog maksimalt 1 uke.

Eksempel III

5'-dimetoksytrityl-N<2->isobutyryl-deoksyguanosin-3<1->klor-metoksy- f osf itt

Analogt med eksempel II ble det fremstilt en oppløsning av dette nuk]eosid-fosfor-kloridit i 10,0 ml pyridin fra 640,0 mg (1,0 mmol) 5'-dimetoksytrityl-N 2-isobutyl-desoksyguanosin.

Eksempel IV

5'dimetoksytrityl-N<6->benzoyl-deoksycytidin-3'-klor-metoksy- f osf itt

Analogt med eksempel II ble det fremstilt en oppløsning av dette nukleosid-fosfor-kloridit i 10,0 ml pyridin fra 633,7 mg (1,0 mmol) 5'-dimetoksy-trityl-N<4->benzoyl-deoksy-cytidin.

Eksempel V

5'-dimetoksytrityl-N<6->benzoyl-deoksyadenosin-3'-klor metoksy- fosfitt

Analogt med eksempel II ble det fremstilt en oppløsning av dette nukleosidfosfor-kloridit i 10,0 ml pyridin fra 657,7 mg (1,0 mmol) 5'-dimetoksytrityl-N<6->benzoyl-desoksy-adenosin.

Eksempel VI

Syntese av d- TCCTTA

50 mg (= 5 /xmol) av den med DMTdA<bz> ladede polymere bærer (se eksempel I) ble fylt i en glasskolonne. I overensstemmelse med den følgende oppstilling ble så forskjellige oppløsnings-midler og reagensoppløsninger tilsatt, bæreren rystet en kort tid deri og oppløsningen på nytt fjernet etter den ønskede om-setning, idet den ble presset gjennom kolonnen ved hjelp av en ovenfra tilført argon-gasstrøm. a) Avspalting av DMTr-gruppen-med 3 ml av en oppløsning av 70 g sinkbromid, 500 ml nitrometan og 5 ml vann.

Reaksjonstid: 10 minutter.

b) 4 ganger vasking hver gang med 3 ml av en blanding av n-butanol-lutidin-THF (4:1:5).

c) 4 ganger vasking hver gang med 4 ml absolutt pyridin.

d) Påkondensering av de neste nukleotid-byggestenene:

1 ml av pyridinoppløsningen av 5 *-dimetoksytrityl-des-oksy-thymidin-3'-klormetoksyfosfitt (eksempel B) (ca.

100 Mmol) ble under argon tilsatt den polymere bæreren i fritten og denne ble opprystet i oppløsningen. Reaksjonstid: 10 minutter.

e) 3 ganger vasking.hver gang med 3 ml absolutt pyridin.

f) Oksydasjon av underfosforsyre-triesterne med 100 mg jod oppløst i 3 ml av en blanding av THF, lutidin og vann

(2:2:1).

Reaksjonstid: 7 minutter.

g) 3 ganger vasking,hver gang med 4 ml THF.

h) Acetylering av de ikke omsatte 5'-OH-gruppene med en opp-løsning av 150 mg 4-metylaminopyridin, 0,3 ml collidin,

0,25 ml acetanhydrid og 2,5 ml THF.

Reaksjonstid: 5 minutter.

i) 4 ganger vasking, hver gang med 3 ml nitrometan.

Denne syklusen fra a) til i) ble så gjentatt fire ytterligere ganger, idet ved trinn d) den for sekvensen hver gang nødvendige nukleotid-byggesten ble tilsatt.

Utbytte-bestemmelse:

Etter påkondenseringen av den siste nukleotid-byggestenen ble bærermaterialet tørket i oljepumpevakuum, en prøve på ca. 1 mg ble nøyaktig oppveid og tilsatt 10,0 ml av en 0,1 M opp-løsning av toluensulfonsyre i acetonitril. Ved den derved inntrådte avspalting av dimetoksytrityl-kationene fikk man en oransje-rød farvet oppløsning, hvis absorpsjon ved 498 nm ble målt. Ladningen av bærermaterialene med dimetoksytrityl-beskyttelsesgrupper lot seg beregne etter formelen:

Man fikk: 43 Mmol/g. Dette utgjør et gjennomsnittlig utbytte på 85 % pr. kondensasjonstrinn.

Avspalting av metylrestene fra fosforsyretriester-gruppene: Bærermaterialet ble rystet i 45 minutter i 4 ml av en opp-løsning av tiofenol, trietylamin og dioksan (1:1:2), deretter vasket med metanol og så med eter.

Avspalting av base-beskyttelsesgruppene og samtidig avspalting av heksanukleotid-kjedene fra polymere bærere: Bærermaterialet ble oppvarmet i 14 timer med 10 ml konsentrert ammoniakk ved 50°C, den vandige oppløsningen ble så avsuget og filtratet inndampet til ca. 2 ml.

Rensing av produktene:

Det således oppnådde råproduktet som i 5'-enden ennå

bar en dimetoksytrityl-beskyttelsesgruppe, ble underkastet omvendt-fase-HPLC. Kolonne: "/Lt-Bondapak C18<®>" eluerings-

middel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7, med 25 % acetonitril; strømningshastighet 2 ml/min.; retensjonstid: 14 minutter. De samlede elueringsfraksjoner ble oppkonsentrert til ca. 1 ml, tilsatt 10 ml 80 % eddiksyre og hensatt ved rom-temperatur i 30 minutter. Deretter ble det inndampet til tørr-het ved 50°C under vakuum, resten ble oppløst i 25 ml vann og den avspaltede dimetoksytritanol ble ekstrahert med 3 ganger 15 ml eter. Den vandige fase ble på nytt inndampet til tørr-het, resten ble oppløst i 2,5 ml vann, avsaltet over "Biogel P 2" (kolonne: 60 x 1,7 cm) og lyofilisert.

Analyse av produktet:

Som renhetskontroll tjente det analytiske HPLC-diagrammet (kolonne: 300 x 3,9 mm, "ju-Bondapak C18<®>": elueringsmiddel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7, med 12 % acetonitril; strømningshastighet: 1,5 ml/min.; retensjonstid: 3,7 minutter), retensjonstid: 3,7 minutter).

Eksempel VII

Syntese av d- TAAGGAGGTTTA

Fremstilt analogt med eksempel VI idet man gikk ut fra

bz

300 mg (30 umol) DMTrdA

HPLC-diagram for produktet:

Kolonne: 300 x 3,9 mm, "/x-Bondapak C18<®>"; elueringsmiddel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7 med 12 % acetonitril; strømningshastighet; 1,5 ml/min.; retensjonstid 4,4 minutter.

Eksempel VIII

Syntese av d- AGCTTAAACC

Fremstilt analogt med eksempel VI idet man gikk ut fra bz

200 mg (16 Mmol) DMTrdC

HPLC-diagram for produktet:

Kolonne: 3 00 x 3,9 mm, "/i-Bondapak C18<®>"; elueringsmiddel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7 med 12 % acetonitril; strømningshastighet; 1,5 ml/min.; retensjonstid 3,4 minutter.

Eksempel IX

Syntese av d- CATCTTTA

Fremstilt analogt med eksempel VI idet man gikk ut fra

150 mg (1,32 Mmol) DMTrdA

HPLC-diagram for produktet:

Kolonne: 3 00 x 7,8 mm, "/n-Bondapak C18<®>"; elueringsmiddel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7 med 20 % acetonitril; strømningshastighet; 1,5 ml/min.; retensjonstid 7,7 minutter.

Eksempel X

Syntese av d- AGCTTAAAGATG

Fremstilt analogt med eksempel VI idet man gikk ut fra

200 mg (16,2 Mmol) DMTrdG

HPLC-diagram for produktet:

Kolonne: 300 x 7,8 mm, "/z-Bondapak C18<®>"; elueringsmiddel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7 med 26 % acetonitril; strømningshastighet; 1,5 ml/min.; retensjonstid 5,2 minutter.

Eksempel XI

Syntese av d- TGTGATCTGCCTCA

Fremstilt analogt med eksempel VI idet man gikk ut fra

250 mg (22 Mmol) DMTrdA<bz>

HPLC-diagram for produktet:

Kolonne: 3 00 x 7,8 mm, "/x-Bondapak C18<®>"; elueringsmiddel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7 med 25 % acetonitril; strømningshastighet; 1,5 ml/min.; retensjonstid 6,1 minutter.

Eksempel XII

Syntese av d- CAGATCACA

Fremstilt analogt med eksempel VI idet man gikk ut fra 150 mg (13,2 Mmol) DMTrdA

HPLC-diagram for produktet:

Kolonne: 3 00 x 7,8 mm, "ju-Bondapak C18<®>"; elueringsmiddel: 0,1 M trietylammoniumacetatbuffer, pH 7 med 20 % acetonitril; strømningshastighet; 0,2 ml/min.; retensjonstid 5,2 minutter.

Analyse av oligodeoksynukleotidene

Sekvensanalysen av de syntetisk fremstilte oligodeoksy-nukleotider ble gjennomført, hvoretter disse ble innbygget i interferonproduksjonsplasmidet pER3 3 (se eksempel 2: sekvensanalyse av interferonplasmidet pER33). Med denne analyse blir samtidig riktigheten av baserekkefølgen i oligooksynukleo-tidene bevist (se fig. 5).

Eksempel 1

Konstruksjons av ekspresjonsplasmidet PER103

Konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pER103 er vist skjematisk i fig. 1.

a) Isolering av promotor/ operator- fragmentet

Plasmidet pER 101, som inneholdt ca. 1000 bp av tryptofan-operonet til Serratia marcescens, utgjorde utgangsmateri-alet for isoleringen av promotor/operator-området. Dette regulerende området ligger innenfor et 90 bp langt Eco RI - HaeIII-fragment hvori promotoren er orientert i retningen EcoRI > Haelll.

Ca. 25 Mg av plasmidet pBP 101 ble spaltet med restriksjonsenzymet Eco RI, de to dannede fragmentene ble skilt fra hverandre ved gelelektroforese (1,4 % agarose) og det 200 bp lange fragmentet ble eluert elektroforetisk fra gelen. Dette fragmentet ble så spaltet med Haelll, de to spaltingsproduktene ble adskilt på en 6 % polyakrylamidgel og det 90 bp lange fragmentet (promotor/operator) ble på nytt isolert fra gelen.

b) Konstruksjon av ribosombindingssekvensen ( RBS)

RBS-en ble satt sammen av 3 syntetiske oligonukleotider;

den 6-mere 5'-TCCTTA, den 10-mere 5'-AGCTTAAACC og den 12-mere

5'-TAAGGAGGTTTA, 500 pmol ble 6-mer ble fosforylert med hjelp av enzymet polynukleotidkinase og dessuten merket radioaktivt (se del A). Reaksjonsblandingen ble varmet opp i 10 minutter ved 70°C for å inaktivere kinasen, deretter ble ekvimolare mengder av (ikke fosforylerte) 10-mer og 12-mer tilsatt, oligonukleotidblandingen ble oppvarmet til 95°C og deretter avkjølt langsomt (i løpet av ca. 3 timer) til 30-35°C, hvor-

ved oligonukleotidene hybridiserer med hverandre:

Ved tilsetning av 0,25 mM ATP og 5 mM DTT ble 6-mer og 10-mer kovalent bundet til hverandre ved hjelp av enzymet DNA-ligase (se del A). Mangelen på fosfatrester i 5'-endene til 12-meren og 10-meren forhindret fremkomsten av multimere lige-ringsprodukter. Etter omsetningen ble det oppvarmet i 10 minutter ved 70°C for å inaktivere ligasen, deretter ble også 5'-endene til 12- meren og 10-meren kinasebehandlet ved en ytterligere kinasereaksjon etter tilsetning av 0,5 mM ATP og 5 mM DTT (se del A), hvorved RBS-en var ferdigfremstilt.

c) Sammenbinding av promotor og RBS

12 pmol av det 90 bp lange Eco RI-Hae III promotor/operator-fragmentet ble under standardbetingelser (se del A) ligert med 60 pmol RBS. Etter som bare den gjennom Hae III-kutting frembragte butte ende ("blunt end") hos det 90 bp lange fragmentet kan ligeres med den butte enden hos RBS, oppstår det bare molekyler som inneholder RBS-en i den korrekte orientering nedstrøms for promotor. Etter omsetningen ble ligasen inaktivert ved 70°C i 10 minutter, det ble innstilt på TA-buffer-konsentrasjon (se del A) og etterspaltet med 200 enheter Hind III og 10 enheter Eco RI. Dette var fordelaktig for å omdanne de ved ligasereaksjonen oppståtte multimerer (etter som ved siden av den ønskede reaksjonen så vel Eco-RI-ender som også Hindlll-ender kunne ligeres med hverandre) videre til monomerer.

Deretter ble prøven adskilt på en 6 % polyakrylamidgel og

det ca. 100 bp lange promotor/operator-RBS-fragmentet (som har en EcoRI- og en Hindlll-ende) ble skåret ut av gelen og eluert elektroforetisk for å fraskille overskuddet av den ikke ligerte RBS. Derved var den for ekspresjonen ansvarlige del av ekspresjonsplasmidet ferdig fremstilt (se fig. 3) .

Den i fig. 3 viste nukleotidsekvens lar seg etterutføres gjennom fremgangsmåter for polynukleotidsyntese som er kjent fra litteraturen.

d) Innføring av promotor/ operator- RBS- fraoment i plasmidet PBR322

Ca. 2 fj. g av plasmidet pBR322 ble oppkuttet med restrik-sjonsensymene EcoRI og Hindlll, hvorved det fremkom to fragmenter: et stort med 4332 bp og et lite med 29 bp. Det store fragmentet ble separert i små fragmenter gjennom elektroforese på en 0,8 % agarosegel, skåret ut av gelen og eluert.

Ca. 0,4 pmol av disse fragmentene ble så ligert med ca. 10 pmol av promotor/operator-RBS-fragmentet (se del A side 8). pBR322-fragmentet kunne på grunn av sine to ikke sammenpassende utstikkende ender ikke ligeres med seg selv; etter som promotor/ operator-RBS-fragmentet bare kunne ligeres i én orientering i plasmidet, oppstod en avlesning fra retning Hindlll-spaltingsstedet mot tetracyklinresistens-gen hos pBR322.

e) Transformasjon av Escherichia coli med ekspresjonsplasmidet PER103

Escherichia coli HB 101 ble transformert med reaksjonsblandingen fra den sistnevnte ligering på en måte som er kjent fra litteraturen (se Dworkin og Dawid, Dev. Biol. 76,

435-448 [1980]) og transformantene ble selektert på ampicillin-holdige agarplater. For dette-formål ble E. coli HB 101 celler oppdyrket til en tetthet på ca. 2 x 10 o celler/ml. Cellene ble pelletert og suspendert i 100 mM CaC^-oppløs-

ning (20 minutter ved 0°C). Deretter ble cellene inkubert med reaksjonsblandingen fra ligasereaksjonen i 5 minutter ved 0°-4°C og i 5 minutter ved 37°C. Etter tilsetning av 0,5-1 ml 1-næringsmedium, ble de videreinkubert i 15-30 minutter ved 37°C. Det ble utvalgt 19 transformanter og ved hjelp av Hae III-restriksjonsspaltinger ble deres mulige innhold av

promotor/operator-RBS-fragmentet undersøkt. Det 192 bp lange

pBR322/HaelII-fragmentet manglet og var blitt erstattet med

et 2 64 bp langt fragment (16 bp fra Haelll-spaltingsstedet i pBR322 "til venstre" for EcoRI-spaltingsstedet + 103 bp promotor/ operator-RBS-fragment + 145 bp fra Hindlll-spaltingsstedet mot det neste Haelll-spaltingsstedet "til høyre for dette i pBR322). Av de 19 utvalgte transformantene oppviste 18 det forventede spaltingsmønster (se fig. 2).

f) Sekvensanalyse av promotor/ operator- RBS- området til ekspresjonsplasmidet <p>ER103

For med sikkerhet å fastslå riktigheten av de konstruerte ekspresjonsplasmidene ble ett av disse plasmidene (pBR103) sekvensert i promotor/operator-RBS-området og dettes posisjon i pBR322 fastslått. Sekvensanalysen ble gjennomført med fremgangsmåten til Maxam og Gilbert som er kjent fra litteraturen (se Proe. Nat. Acad. Sei. 74., 560-564 [1977]), og gikk fra spaltingsstedet for EcoRI i retning Hindlll-spaltingsstedet (og forbi dette), men også fra Hindlll-spaltingsstedet i retning spaltingsstedet for EcoRI (og forbi dette). Det gav som resultat nekleotid-sekvensen, som er vist i fig. 3.

pBR103 er følgelig et ekspresjonsplasmid som inneholder promotor/operator-området for tryptofanoperonet til Serratia marcescens i kombinasjon med en syntetisk RBS. Dette nye ekspresjonsplasmidet gir transkripsjon av gener som er innebygd i dets Hindlll-spaltingssted, og muliggjør en effektiv translasjon av dette transkripsjonsproduktet. At dette er tilfelle, er vist i eksempel 2.

Eksempel 2

Konstruksjon av interferonproduksjonsplasmidet pER33

a. Konstruksjon av genet som koder for fullt utviklet interferon, med unntak av kodonet for cysteinet i NH2~ enden Ca. 1 fj, q av Pst I-innskuddet fra 1 F7 ble spaltet med restriksjonsenzymet Sau3A og det 177 bp lange fragmentet som strekker seg fra Sau3A-spaltingsstedet til kodonet for cystein i NH2-enden mot det neste Sau3A-spaltingsstedet, og som inneholder et Avall-spaltingssted, ble isolert fra en 6% polyakrylamidgel. Det ble behandlet med 1 enhet alkalisk fosfatase

(se del A) og etter fjerning av fosfatasen ved fenol- og eterekstraksjon, utfelt med etanol. Fragmentet ble deretter kuttet med Ava II hvorved det ønskede 34 bp Sau 3A-Ava II-fragmentet og 14 3 bp langt fragment ble erholdt.

Parallelt med dette ble det interferonspesifikke 646 bp Ava II-fragmentet, som strekker seg fra Ava II-spaltingsstedet innenfor det 177 bp lange Sau 3A-fragmentet til bakenfor av-slutningskodonet, fra plasmidet 1 F7 behandlet. Ca. 0,5 Mg av dette 646 bp lange Ava II-fragmentet ble så inkubert sammen med blandingen av 34 bp og 143 bp Sau3A-AvaII-fragmentene med enzym-DNA-ligasen (ligering av kohesive ender, se del A side 9). Derved oppstod Ava II-fragmenter som, kovalent bundet, er flankert av Ava II-Sau 3A-fragmenter. Så snart et Ava II-Sau 3A-fragment har ligert seg med et Ava II-fragment, kan på dette stedet ingen ytterligere ligering mer finne sted etter som Sau 3A-endene er blitt defosforylert. Etter ligaseomsetningen ble det varmet opp i 10 minutter ved 70°C for å inaktivere enzymet, deretter ble 5 mM DTT og 0,25 mM ATP tilsatt og de de-fosforylerte Sau3A-endene ble igjen kinase-behandlet (se del A). Reaksjonsblandingen ble separert på en 6 % polyakrylamidgel og molekyler i området fra 700-800 bp (et 646 bp Ava II-fragment flankert med to Ava II-Sau 3A-f ragmenter) og i området fra 1300-1500 bp (to med hverandre ligerte 646 bp Ava II-fragmenter flankert med Ava II-Sau 3A-fragmenter) ble eluert.

b. Fremstilling av oligonukleotid- komplekset med formelen

4 syntetisk fremstilt oligonukleotider, nemlig en 14-mer 5 *-TGTGATCTGCCTCA, en 12-mer 5' AGCTTAAAGATG, en 9-mer 5' CAGATCACA og en 8-mer 5' CATCTTTA, ble på følgende måte om-satt: 250 pmol av henholdsvis 8-mer, 9-mer og 14-mer ble fosforylert (se del A), etter omsetningen ble kinasen inaktivert gjennom oppvarmning til 95°C, det ble tilsatt 250 pmol ikke-kinasebehandlet 12-mer og oligonukleotidblandingen ble sakte (i løpet av ca. 3 timer) avkjølt til 35°C for å mulig-gjøre hybridisering av oligonukleotidene. Deretter ble oligonukleotidene ligert med hverandre etter tilsetning av 5 mM DTT

og 0,25 mM ATP ("butt"-ende-ligering, se del A). Fraværet av en fosfatrest ved 5<*->enden til 12-meren forhindret dannelsen av dimerer; den utstikkende enden til 14-meren er ikke selv komplementær, den kan ikke føre til dimerisering.

En alikvot (25 pmol) av det ligerte oligonukleotidkomplek-

r set ble spaltet med 80 enheter Sau 3A for å gi den i interferongenet passende Sau 3A-ende. Deretter ble prøven oppvar-

met i 10 minutter ved 75°C, ekstrahert med fenol og utfelt med etanol. Derved var linker-fragmentet som ifølge oppfinnelsen forbinder interferongenet med det Hindlll-kuttede pER103, ferdigstilt.

c. Sammenbinding av interferonaen og oligonukleotid-

kompleks, ligering i pER103

De isolerte interferonfragmentene (se eksempel 2a) som utgjør ca. 1 pmol molekyler, ble forbundet med det Sau3A-kuttede oligonukleotidkomplekset (ca. 25 pmol) ved ligering av de kohesive Sau3A-endene (se del A). Igjen forhindret mangelen på en fosfatrest ved Hindlll-enden til oligonukleotid-komplekset (12-mer) oppbyggingen av multimerer. Det fremkom interferongen-molekyler som på begge sider av et oligonukleotidkompleks var flankert med frie Hindlll-ender. Etter varmedenaturering av ligasen og tilsats av 5 mM DTT og 0,25 mM ATP, ble disse endene fosforylert (se del A), deretter ble det gjennomført en isopropanolutfelling (se del A) for å fraskille de eventuelt i ligasereaksjonen oppståtte oligonukleotidkompleks-dimerer. Deretter ble konstruksjonen ligert med 0,05 Mg HindiII-kuttet, fosfatasebehandlet pER103 (ligering av kohesive ender, se del A). Fosfatasebehandlingen (se del A) av det Hindlll-kuttede plasmidet nedsatte ringslutningen av dette i ligasereaksjonen. Derved var det fremstilt en blanding av plasmider som inneholdt opp til 50 % interferonproduksjonsplasmid, (nemlig det samme plasmidet som hadde inneholdt et 34 bp Sau3A-AvaII-fragment ved ligeringen med det 646 bp lange Avall-fragmentet ved begynnelsen av genet, se eksempel 2a). d. Transformasjon av Escherichia coli HB 101 og analyse av transformasjonen med hensyn på interferonproduksjon Den ifølge eksempel 2c fremstilte plasmidblanding ble analogt med eksempel le anvendt til transformasjon av Escherichia coli HB 101 (se Dworkin og Dawid, Dev. Biol. 76, 435-448 [1980]). Ca. 20 % av de oppnådde transformantene hadde innskudd (resten var på nytt ringsluttede pER103-plasmider) hvorav flere ble undersøkt med hensyn på interferonekspresjon. Til dette ble 100 ml bakteriekultur i M9 minimum medium som var tilsatt alle aminosyrene med unntak av tryptofan (20 ug/ml pr. aminosyre), samt thiamin (1 ag/ml), glukose (0,2 %) og induktoren av tryptofanoperonet indol-(3)-akrylsyre (IAA, 20 ug/ml; se Hallewell og Emtage i Gene 9, 27-47 [1980]), oppdyrket til en optisk tetthet på 0,6-0,8. Bakteriene ble pelletert ved sentrifugering i 10 minutter ved 7000 omdreininger pr. minutt, vasket 1 gang i 50 nM TrisHCl, pH 8, 30 nM NaCl og til slutt suspendert i 1,5 ml av den samme buffer. Etter inkubasjon med 1 mg/ml lysozym i 30 minutter på is, ble bakteriene frosset ned 5 ganger og drept, og deretter ble brudd-stykkene av cellene fjernet ved sentrifugering i 1 time ved 40 000 omdreininger pr. minutt (opm). Supernatanten ble sterilfiltrert og undersøkt med hensyn på interferonaktivitet ved plakkreduksjonsprøve med V3-celler og vesikulært stomatitis-virus. Omtrent halvparten av alle klonene (med innskudd) oppviste betraktelig interferonekspresjon; 2 x 10 Q enheter (inter-nasjonale referanseenheter) pr. liter kultur.

e« Sekvensanalvse av interferonproduksjonsplasmidet pER33

En av disse interferonproduserende klonene (pER33)

ble valgt ut og sekvensert fra promotor/operator-området til dens interferongen for å fastslå riktigheten av det konstruerte plasmidet. Sekvensanalysen ble på nytt gjennomført etter Maxam og Gilbert (se Proe. Nat. Acad. Sei. USA 74_, 560-564

[1977]) og gikk fra det ved 3'-enden radioaktivt merkede

Eco RI-spaltingsstedet i retning av interferongenet. Man fant den forventede sekvens hvorav et utsnitt er vist i fig. 5. I dette utsnittet kan alle de anvendte oligonukleotidfragmentene ved konstruksjonen av pER33 sees.

De ovenfor nevnte egenskapene beviser at det ifølge oppfinnelsen fremstilte ekspresjonsplasmid pERl03 inneholder promotor/operator-sekvensen til tryptofanoperonet fra Serratia marcescens i kombinasjon med en syntetisk ribosombindingssekvens. I eksemplet med leukocyttinterferonet kunne det påvises at gener som på passende måte er innebygget i ekspresjonsplasmidet pERl03, oppviser høye ekspresjonsverdier.

Ekspresjonsplasmidet pERl03 ble i Escherichia coli K 12,

HB 101 deponert ved Deutschen Sammlung von Mikroorganismen Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, under deponeringsbeteg-nelsen DSM-nr. 2773 den 27. oktober 1983 i overensstemmelse med Budapest-konvensjonen.

Eksempel 3

Konstruksjon av interferon<p>lasmidet pER21/ l

Konstruksjonen av plasmidet pER 21/1 er vist skjematisk

1 fig. 6.

a) Behandling av IFNaA- aen^t fra pER3 3

2 Mg PER33 ble kuttet opp med restriksjonsenzymene

EcoRI og BamHI, hvorved det oppstod to fragmenter med lengder

ca. 1300 bp og ca. 4000 bp. Disse fragmentene ble adskilt elektroforetisk på en 1,2 % agarosegel. Det korteste fragmentet ble isolert fra gelen ved elektroeluering. Endene til disse DNA-er ble overført til butte ender ved tilsetning av 1,25 mmol av henholdsvis dATP, dGTP, dCTP og dTTP, samt av 2 enheter Klenow-fragment fra DNA-polymerase I.": .".DNA-ene -ble renset ved fenolekstraksjon og utfelling fra etanolholdig opp-løsning og til slutt tatt opp i 15 ul H2O.

Ca. 15 pmol EcoRI-linker ble

32

fosforylert i 5<*->endene ved tilsetning av y- p-ATP og T4-polynukleotidkinase i 5 ul reaksjonsoppløsning. Etter innakti-vering av kinasen ved oppvarmning, ble DNA *en , 5 nmol ATP og 0,1 enheter T4-ligase tilsatt og inkubert 16 timer ved 14°C. Reaksjonsproduktet ble renset for lavmolekylære stoffer ved isopropanolutfelling.

DNA-en ble tilslutt kuttet opp med 20 enheter restriksjonsenzym EcoRI, nok en gang renset ved isopropanolutfelling

og oppløst i IO |il H2°*

b) Linearisering av plasmidet pER 33

Ca. 2 Mg pER 33 ble behandlet med restriksjonsenzymet

EcoRI. Deretter ble det tilsatt alkalisk fosfatase for å

fjerne 51 fosfatrestene. Den ca. 5300 bp lange, rettkjedede DNA ble renset for det resterende,ikke-oppkuttede pER33 ved elektroforese i en 1,2 % agarosegel og elektroeluering. DNA-

en ble ekstrahert med fenol og eter, utfelt fra etanolholdig oppløsning og oppløst i 10 ul 1^0.

c) Binding av det rettkjedede pER 33 til tilleggsgenet for iFNaA 4 m1 av detmed EcoRI-linker forsynte DNA-stykket, som inneholdt IFNaA-genet pluss regulatordeler, og 0,5 m1 EcoRI-linearisert og defosforylert pER 33 ble ligert med hverandre i 20 ml reaksjonsoppløsning ved hjelp av 0,1 enhet T4-ligase. Etter 16 timers inkubasjon ved 14°C, ble enzymet ødelagt ved oppvarmning til 68°C.

d) Transformasjon av E. coli HB101 og analyse av transformasjonen med hensyn på interferonproduksjon

E.coli HB101 ble analogt med eksempel le transformert med DNA-en fra eksempel 3c. To av de således fremstilte klonene ble analogt med eksempel 2d undersøkt med hensyn på interferonekspresjon ved hjelp av plakkreduksjonsprøver. Mens klonen pER33 oppviste inntil 200 x IO<6> enheter IFN pr. liter kulturoppløsning, fikk man overraskende mer enn 300 x IO<6> enheter pr. liter kulturoppløsning med en av de nye klonene betegnet pER 21/1.

e) Restriksjonsenzymanalyse av pER 21/ 1

Plasmidet pER 21/1 ble isolert i større mengder og

analysert ved hjelp av restriksjonsenzymspaltning med Hindlll. Etter som den i EcoRI-stedet i <p>ER33 innsatte DNA oppviste

to identiske EcoRI-ender, var to orienteringer for denne DNA mulig i pER 21/1. Restriksjonsenzymspalting med Hindlll. av pER 21/1 med parallelt rettede interferongener skulle gi fragmenter med omtrentlig størrelse på 4100, 950 (2 fragmenter) og 450 bp. Når imidlertid de to genene var motsatt orientert,

var det 'forventet fragmenter med omtrentlig størrelse på 4350, 950 (2 fragmenter) og 200 bp. Spaltingen av ca. 2 Mg pER 21/1

med restriksjonsenzymet Hindlll og deretter elektroforese i en 1,4 % agarosegel gav fragmenter med omtrentlig størrelse 4100, 950 og 4 50 bp. Av denne grunn er de to IFNaA-genene parallelt orientert i forhold til hverandre (se fig. 6).

Eksempel 4

Konstruksjon av interferonproduksjonsplasmidet parpER 33

Konstruksjonen av plasmidet parpER 33 er vist skjematisk

i figur 7.

a) Behandling av par- lokuset

Ca. 200 pmol EcoRI-linker

ble i 20 ul reaksjonsoppløsning med 9 enheter T4-polynukleotidkinase og 10 nmol ATP fosforylert i endene, og enzymet ble deretter inaktivert ved oppvarmning.

8 ug av plasmidet pPM 31 ble kuttet opp med restriksjonsenzymet Aval. Endene til det lineariserte plasmidet ble over-ført til butte ender ved tilsetningen av 5 nmol av henholdsvis dATP, dGTP, dTTP samt 4 enheter av enzymet K1enow-fragment fra polymerase I. DNA-en ble renset ved fenolekstraksjon og utfelling fra etanolholdig oppløsning, og tatt opp i 40 m1 H2°*

EcoRI-linkeren ble behandlet sammen med den lineariserte DNA med butte ender i 70 ul reaksjonsoppløsning med 6 nmol ATP og 1 enhet T4-ligase i 16 timer ved 14°C. Etter aktivering av enzymet ved oppvarming, ble oppløsningen innstilt på pH = 7,6 med 50 mM NaCl og 50 mM Tris-HCl, og DNA-en ble behandlet med 300 enheter EcoRI. Etter 2 timer inkubasjon ble restriksjonsenzymet denaturert ved oppvarming og DNA-en separert elektroforetisk i en 1,4 % agarosegel. DNA-stykket med en lengde på ca. 400 bp som inneholdt par-lokuset, ble elektro-eluert fra gelen, renset ved fenolekstraksjon og utfelling fra etanolholdig oppløsning, og oppløst i 50 pl H2°* Dette DNA-stykket oppviste nå i sine ender EcoRI-spesifikke frem-spring.

b) Linearisering av plasmidet pER 33

Ca. 2 ug pER 33 ble behandlet med restriksjonsenzymet

EcoRI. Deretter ble det tilsatt alkalisk fosfatase for å fjerne 5'-restene. Den ca. 5300 bp lange, rettkjedede DNA

ble renset for resterende, ikke-oppkuttet pER 33 ved elektro-

forese i en 1,2 % agarosegel og elektroeluering. DNA-oppløs-ningen ble ekstrahert med fenol og eter, utfelt fra etanolholdig oppløsning og oppløst i 50 ul J^O.

c) Binding av det rettkjedede pER 33 til par- lokus-

DNA- en

1 m1 rettkjedet pER 33-DNA ble ligert med 1 ul par-lokus-DNA i 20 ul reaksjonsoppløsning ved help av 0,1 enheter T4-ligase. Etter 16 timers inkubasjon ved 14°C ble enzymet inaktivert ved opppvarming. d) Transformasjon av E. coli HB101 og analyse av plasmidene fra de transformerte bakteriene E.coli HB101 ble analogt med eksempel le transformert med DNA-en fra eksempel 4c. Det ble oppnådd ca. 50 kolonier Fra 10 av disse koloniene ble en liten mengde plasmid-DNA isolert ;(Birnboim og Doly, Nucleic Acid Research 7, 1513-1523 [1979]) og kuttet opp med restriksjonsenzymet Pstl. Analyse ved agarosegelelektroforese viste at alle disse plasmidene inneholdt det ca. 400 bp lange par-lokuset. Et av disse plasmidene ble valgt ut betegnet parpER 33. e) Analyse av parpER33 med hensyn på interferonproduksjon og stabilitet

Analogt med eksempel 2d ble bakterier som enten inneholdt pER 33 eller parpER 33, dyrket opp og deretter undersøkt med hensyn på interferoninnhold ved plakk-reduksjonsprøve. Begge stammene oppviste omtrent det samme nivå for interferonekspresjon.

I et langtidsforsøk som strakk seg over 120 bakterie-generasjoner, ble stabiliteten til plasmidene pER 33 og parpER 33 i E.coli HB101 under&økt i fravær av seleksjonstryk-ket fra antibiotikumet ampicillin. Med jevne mellomrom ble det tatt prøver av kulturene, og bakteriene ble undersøkt med hensyn på interferoninnhold. Det viste seg at bakterier som inneholdt pER3 3 innstilte interferonproduksjonen etter ca. 60 generasjoner. Bakterier som inneholdt parpER3 3 produserte imidlertid fremdeles etter 120 generasjoner interferon aA i uforminsket mengde.

Ved dette ble det vist at innsettingen av par-lokuset i pER 33 ("parpER 33") økte stabiliteten til plasmidet i E.Coli HB101.

Anvendte begrep og forkortelser

ATP Adenosintrifosfat.

Basepar: 2 komplementære nukleotider, f.

eks. A-T, G-C.

Butt-ende: Fullstendig baseparret ende

til et DNA-dobbeltkjedemolekyl, til forskjell fra fremstikkende

enkeltkjedeender.

bp: Basepar

BSA: Okseserumalbumin

cDNA: En DNA som er komplementær til

mRNA.

Kode for: Å bære informasjon for et eller annet; DNA bærer i nukleotidsekvensen informasjonen for aminosyresekvensen til et protein. Kodon: Gruppe på 3 nukleotider som koder for en bestemt aminosyre eller for avbrytningen av polypeptid-syntesen.

Defosforyleret Fjerne en fosfatgruppe.

DNA: Deoksyribonukleinsyre.

DTT: Ditiothreitol.

Elektroforese: Separering av (DNA-) molekyler

i elektrisk felt.

Ekspresjon: Overføring av informasjon hos

et gen i mRNA ved transkripsjon og deretter i polypeptid ved

translasjon.

Ekspresjonsplasmid: Plasmid, som muliggjør ekspresjonen av gener som er innført

deri.

Gen: Del av den DNA som bærer informasjonen av et bestemt transkript (RNA-molekyl), som deretter kan overføres i et protein.

Genprodukt: RNA (transkript), protein

(translasjonsprodukt). Hybridisering (av

nukleinsyrer): Utvikling av stabile komplekser mellom DNA-kjeder som er komplementære til hverandre. Hybridplasmid: Plasmid som inneholder et DNA-utsnitt av fremmed opprinnelse. IFN-aA: Leukocyttinterferon undertype A. Startkodon: Kodonet ATG som koder for methio-nin og kan signalisere oppstartingen av translasjonen.

Innskudd: Det stykket med fremmed DNA som befinner seg i et hybridplasmid. Kinase: Enzym som kan fosforylere 5'-0H-gruppen på DNA- og RNA-molekyler. Kinasebehandle: Forsyne med 5'-fosfatgrupper.

Klon: Bakteriekoloni som stammer fra

en enkelt bakterie.

Kohesive ender: Fremstikkende enkeltkjeder hos et DNA-molekyl som kan hybridisere med hverandre.

Komplementær: Passende til hverandre (nukleotid i DNA: A er komplementær til T, G er komplementær til C).

Ligase: Enzym som kan forbinde forskjellige DNA-molekyler kovalent med hverandre.

Ligere: Bindes kovalent til hverandre

(DNA-molekyler).

mRNA: Budbringer-RNA, er en RNA som

koder for et polypeptid.

Nukleotid: Byggesten for DNA eller RNA

(A = adenosin, C = cytidin, G = guanosin, T = thymidin, U = uracil).

Nukleotidsekvens: Nukleotidrekkefølge i et DNA-eller RNA-molekyl.

Oligonukleotid: Noen få nukleotider som er forbundet med hverandre gjennom fosfodiesterbindinger (kortere

enkeltkjedede DNA-utsnitt). Operator: Del av det regulerende område i et operon som repressoren bindes til, hvorved transkripsjon for-hindres .

Operon: Gruppe av (bakterielle) gener

som reguleres av et operator-område. Fosfatase: Enzym som kan fjerne 5'-fosfat-gruppene fra DNA-molekyler. Plasmid: Et ekstrakromosomalt, ringformet

DNA-molekyl.

Promotor: DNA-sekvens egnet for binding til

enzymet RNA-polymerase.

RBS: Se ribosombindingssekvens. Restriksjonsendonuklease

(Restriksjonsenzym): Enzym som kan spalte DNA-dobbelt-kjeden ved en bestemt symmetrisk

DNA-sekvens.

Restriksjonsfragment: Bruddstykke av DNA som oppstår ved spalting med en restriksjonsendonuklease .

Ribosombindingssekvens: Del av mRNA som kan bindes til

ribosomet.

RNA: Ribonukleinsyre.

RNA-polymerase: Enzym som kan syntetisere en

til DNA komplementær RNA-kjede. Sekvens: Se nukleotidsekvens.

Stoppkodon: Kodon som signaliserer slutten

på translasjonen.

Transformant: Bakterie som har fått tilført fremmed-DNA (et plasmid) ved

transformasjon.

Transformasjon: Inneslutting av fremmed-(plasmid)-DNA i bakterier.

Transkripsjon: Syntese av RNA som er komplementær til en DNA-matriks.

Translasjon: Overføring av informasjon fra

mRNA i et polypeptid.

Tris: Trihydroksymetylaminoetan.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1

viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av

ekspresjonsplasmidet pER 103. Størrelsen på fragmentene er

ikke vist i riktig målestokk.

Figur 2

viser Hae III-spaltingsmønstrene for plasmidene pBR 322 og pER 103. Fragmentet med 192 bp fra pBR 322 er i pER 103 erstattet med et fragment med ca. 270 bp.

Figur 3

viser nukleotidsekvensen til pER 103 mellom Eco RI- og Hin dlll-spaltingsstedet. Resten av plasmidet utgjøres av det store Hindlll-EcoRI-fragmentet til pER322.

Figur 4

er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av interferonproduksjonsplasmidet pER 33. + :Pst I-spaltingssted: *f : Sau 3A-spaltingssted, + : Ava II-spaltningssted. Med unntak for restriksjonskartet for 1 F7-innskuddet er fragmentene ikke fremstilt i riktig målestokk.

Figur 5

viser et utsnitt av en sekvensgel, hvor forbindelsen promotor-RBS-interferongen kan sees. Alle de ved konstruksjonen av

pER 33 anvendte oligonukleotidfragmenter er til stede. For bedre forståelse er den samme sekvensen angitt på nytt nedenunder som dobbeltkjede; de enkelte oligonukleotidbyggestenene er inntegnet.

Figur 6

er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av interferonproduksjonsplasmidet pER 21/1. Fragmentene henholdsvis plasmidet er ikke målestokktro avbildet.

Figur 7 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av interferonproduksjonsplasmidet parpER 33. Fragmentene og plasmidene er ikke målestokktro gjengitt.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et ekspresjonsplasmid, karakterisert ved at ekspresjonsplasmidet inneholder en 90 bp lang promotor/operator-sekvens av tryptofan-operonet av Serratia marcescens og ligeres med en ribosombindingssekvens med formel og at eventuelt til den således oppnådde DNA-sekvens tilføyes en < DNA-sekvens som koder for et modent IFN-a og som inneholdes i Pstl-innskuddet i klonet 1F7 (DMS nr. 2362) > i en slik form at DNA-sekvensen til strukturgenet er koblet til DNA-linkersekvensen via 3', 5<1->fosfodiesterbinding.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmid i følge krav 1, karakterisert ved at det er pER103 som har den i fig. 1 angitte struktur og er deponert som DSM nr. 2773, og i plasmid pBR322 istedenfor det 29 bp lange EcoRI-Hindlll-fragment tilføyes en DNA-sekvens med formel og eventuelt deretter, for fremstilling av plasmid pER33, som har den i fig. 4 angitte struktur, tilføyes i Hindlll-stedet i plasmidet pER103 DNA-sekvensen med formel <—DNA-sekvens som koder for et modent IFN-a og som inneholdes i Pstl-innsatsen i klonet 1F7 (DMS nr. 2362) > og eventuelt deretter, for fremstilling av plasmid pER21/l som har den i fig. 6 angitte struktur, blir det i EcoRI-kuttstedet til plasmidet pER33 ved hjelp av en EcoRI/BamHI-linker tilføyd et ved behandling av plasmidet pER3 3 med EcoRI og BamHI oppnådd, ca. 1300 bp langt DNA-fragment, og eventuelt deretter, for fremstilling av plasmid parpER3 3 som har den i fig. 7 angitte struktur, tilføyes i EcoRI-kuttstedet i plasmidet pER33 et 400 bp langt par-lokus som er isolert fra plasmidet pPM31.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av den sekvens som følger etter ribosombindingssekvensen i krav 1, karakterisert ved at den har formel: <—DNA-sekvens som koder for et modent IFN-a og som inneholdes i Pstl-innsatsen i klonet 1F7 (DMS nr. 2362) > det 646 bp lange Avall-fragment i Pstl-innsatsen til klon 1F7 ligeres med et 34 bp langt fragment oppnådd ved å behandle det 177 bp lange Sau3A-fragment av Pstl-innskuddet til klon 1F7 med Avall, og det resulterende fragment ligeres med et oligonukleotid med formel

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et modent polypeptid med IFN-a-aktivitet, karakterisert ved at en bakterievert transformeres med plasmidet pER33, pER21/l eller parpER33 for regulert produksjon av polypeptidet, hvoretter det således uttrykte polypeptid isoleres. N