JPS59162888A - Ｄｎａ配列、その調製法、該配列を含むプラスミドおよび原核細胞における真核細胞遺伝子生産物の合成のためのそれらの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バクテリア中での遺伝子発現の前提条件として、バクテ
リアＲＮＡポリメラーゼの結合認識配列、いわゆるプロ
モーターの存在がある。その結果、プロモーターはその
下流域に位置する配列の転写を０ＴｆＤにする。その＃
Ｅ産物がいつでも合成されるような遺伝子は、ＲＮＡポ
リメラーセ゛分子の結合が常に可能であるようなプロモ
ーターを有する。バクテリアのある遺伝子またはオペロ
ンは調節すれており、それらのプロモーターは特許の機
構により結合できたり、できなかったりする。

目的遺伝子産物の合成のための前提条件とじてさらに、
バクテリアのりボゾームでのＲＮＡ転写物の効率よい翻
訳がある。従って１．バクテリアに於いて、卑ＲＮＡの
５′末端のヌクレオチド配列かりポゾームへの結合を担
っていることが５ｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏによ
り明かにされている（　Ｎａｔ、ｕｒｅ　２５４巻、３
４−３８頁：１９７５年参照）。

そこで、本発明、の目的は、新規のりボゾーム結合／リ
ンカー配列を介して既知のプロモーターヲ構造遺伝子に
結合することにより、バクテリアにとり異種たん白質の
遺伝的生産を改良することにある。

従って、本発明の対象は、リボゾーム結合配列の次に任
意にリンカ−配列を含む、下記の式で表わされるＤＮＡ
配列である。本紀タリは文献上知られているプロモータ
ー配列と、文献上知られているリボゾーム結合配列との
新規な組み合せを表わす。

Ｋ−一一一プロモータ□ ＱＣ −プロモータ／オペレーター米−圧返一〉Ｈｉｎ酊１工 しかしながら、本発明の望ましい対象は、次に式で衣わ
されるＤＮＡ配列と、 袂−プロモータ ープロモータ／オペレーター＊圧迫−倒リンカー ３′　　λＪχ−虻。

さらに本発明の対象は、これらの配列を含み、その配列
の後ろにプラスきド中で一つのＨｉｎｄ　１間隔を有す
る発現プラスミドであり、それに望む特別の遺伝子を挿
入して主座ノラースミドを作成し、得られる生産プラス
ミドを、ＪＪｊＬ核細胞中で真核細胞遺伝子の産物を生
産するため、特に白血球インタフエロン生産のために使
用することである。

本発明に係る目的を達成するため、以下の手法が例とし
て用いられる。

適当なバクテリアプロモーター配列の選択二本目的のた
めにはオペレーター配列と組み合わせて誘発されたり抑
制されたりするようなプロモーターが好んで使用される
。この種のプロモーターはバクテリアにとって異種の目
的たん白質の合成をバクテリアの生育サイクル後期にの
み翔始されるというオＵ点がある。たとえはトリットフ
ァンオペｏｙの場合（ＨａｌｌｅｗｅｌｌおよびＥｎｎ
ｔａｇｅ、　（）ｅｎｅ６巻、２７−４７貞：１９８０
年参照）培養液からトリプトファンを抽出除去し、培養
培地にトリットファンオペロンの誘発創としてインドー
ル−（３〕−アクリル酸を加えることＫより、バクテリ
アの増殖を影響しないでできる。好ましくは、発現プラ
スミドを構成するのに用いられるプロモーター／オペレ
ーター系は文献で知られる非常に強く、調部可能なもの
であり、下記の式で表わされる５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓ　（セラチア−マルセツセンス）のト
リットファンオペロンの系（ＭｉｏｚｚａｒｉおよびＹ
ａｎｏｆｓｋｙ　；　Ｎａｔｕｒｅ　２７６巻、６８４
−６８９頁＝１９７８年）である。これは文献で知られ
る方法により調製される。

ぐ−一一一プロモータ ーゾロモータ／オペレータ 本発明の目的のために１特に有効であることカζ糺載さ
れている式、 ５’　ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡなる配列（ｖｏｎ　Ｊ
ａｙら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７８巻
、５５４３−５５４８頁：１９８１年）が使用される。

下記の式で水冷れるリボゾーム結合配列の榊成は、５’
ＴＣＣＴＴＡ　（６員体）　、５　’ＡＧＣＴ’［’Ａ
ＡＡＣＣ（１０貞体）および５’ＴＡＡＧＧＡＧＣ）Ｔ
ＴＴＡ　（１２員体）の６つの合成オリゴヌクレオチド
を文献で知られる方法により組立て“ることにより、好
ましく行な、する。６員体オリゴヌクレオチドは前もっ
て適当に放射標識しておく。

絖〈プロモーター／オペレーターとりボゾーム結合配列
との結合は、文献で知られる方法により行う。

発現プラスミドの構成： ９０　ｂｐの長さのプロモーター／オペレーター配列を
、制限酵素Ｅｃｃ＋ＲＩおよびＨａｓ　ｆを用いて、例
えばシラスミドｐＢＰ　’１０１のようなＳｅｒｒａｔ
ｉａｍａ、ｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトファンオペロン
を含むシラスミドより切り出す。次にこの断片を酵素Ｄ
ＮＡりが−ゼを用いて、合成したＲＢＳと結合させ、こ
のようにして侍られ、プロモーター／オペレーターの前
部にＥｃｏ　ＲＩ末端を有し、ＲＢＳの後にＨ１ｎｄ良
末端を有するプロモーター／オペレーターＲＥＳ断片を
プラスミドｐＢＲ３２２の２９ｂｐ、の長さのｇｃｏ　
ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ＰＡ断片の代りに挿入する。このよ
うにして得られる発現ベクター（ｐＥＲ１０３）のＨｉ
ｎｄ　ＩＩＩ間隔に挿入された遺伝子の発現に関する有
効性を、白血球インタフエロン、サブタイプＡ（ＩＦＮ
−αＡ）の例で示す。

ｐＥＲ１０３中でのＩＦ’Ｎ−αＡの発現：、＃ｌ紀外
に搬出しようとする他のたん白質と同様、インタフエロ
ンはヒト細胞内でゾしたん白として、即ち、リーダー配
列をもったたん白として合成される。たん自分子が細胞
から出る時にのみ、このリーダー配列はそこに存在する
特有の酵素により切〜［され、その結末、成熟したたん
白質が生産される。バクテリア内で成熟インタフエロン
を合成する一つの可能性は、ＤＮＡの段階でリーダー配
列を除くことであり、それは、成熟だ、ん白の配列のみ
をコードする遺伝子を作製することです。

ＩＦＮ−αＡのためのインタ７エロン生並シラスミドの
作製： たとえば、白血球インタフエロンは２６個のアミノ酸か
ら成るプレ配列を有し、それにシスティンが続キ、プレ
インタフエロンが切断した後、成熟インタフエロンのポ
リペプチドの第一番目のアミノ酸となる。バクテリア中
で成熟インタフエロンの合成を行なうことのできるプラ
スミ団を作製するためには、このシスティンの暗号から
正確に開始するようなインタフエロン遺伝子断片を単離
する必要がある。たん白金酸を開始するのに、このシス
ティンのコドンの前にＡＴＧのメチオニノコ１ンをつけ
なければならない。このようにして作製したものを適当
な方法で、例えは発現シラスミドｐＥＲ１，０３に挿入
し、ＡＴＧ開始コドンとＲＢＳとの距離が翻訳に最適に
なるようにする。バクテリア中でこのようなプラスミド
により製造されたインタフエロンは、成熟ポリペプチド
のアミノ酸配列にさらにアミン末端にメチオニンを有す
る。

本発明によると、ＩＦＮ−αＡをコードするインタ７エ
ロン生並シラスミドｐＥＲ３３は、例えば、以下の基本
に基づいて作製される。（その作製方法を第４図に図示
する。） インタフエロンの情報として用いる出発材料は、例えば
、ＩＦＮ−αＡをコードするｃＤＮＡクローンＩＦ’７
であり、本クローンは１９８２年５月１７日付けで寄託
機関’　Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ−ｎｉｓｍｓ、　Ｇｒｉｅｓｅｂａ
ｃｈｓｔｒａｓｓｅ　８．　Ｄ３４００　Ｇ６ｔｔｉｎ
ｇｅｎ（ドイツ連邦共和国）にＤＮＳ査号２６６２とし
て寄託されている。又ドイツ特許出願Ｐ　３２’　２０
１１６．８（１９８２年５月２８日）参照。本クローン
はｐＢＲ５２２のＰｓｔＩ間にインタフエロン遺伝子を
挿入したものである。ＩＦＮ−αＡは（他の白血球イン
タフエロンサブタイプと同様）アミン末端システィンを
コードするＴＧＴのすぐ後、ろにＳａｕ　５　Ａのギャ
ップを有する。このギャップが存在することにより適当
な制限＃素断片、例えばプラスミドＩＦ７のインタフエ
ロン特有の６４６　ｂｐのＡＶ＆　Ｉｆ断片および３４
　ｂｐのＳａｎ　３　Ａ　−Ａｖａ　ＩＩ断片、から成
熟インタフエロン遺伝子を作製する方法の基本が成る。

ｂ）オリゴヌクレオチド被合体の調製 法に、この、シラにして作製した遺伝子の欠けているシ
スティンコドンの５′末端に、その前に、ＡＴＧメチオ
ニンコドンをつけなければならない。

また、発現シラスミドｐＥＲ１０３のＨｉｎｄ　］［ギ
ャップに結合するよう結合断片が必要である。このため
に、４つのオリゴヌクレオチドを合成する；１４塩基体
の５’ＴＧＴＧＡＴＣＴ（）Ｃ’ＣＴＣＡ、　　１２塩
基体の！５’ＡＣ）ＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ、　９塩基体
の５　’　ＣＡＧＡＴＣ’ＡＣＡ　、および８塩基体の
５°ＣＡＴＣＴＴＴＡである。結合し、５ａＸＸ３　Ａ
で再切断すると、これらのオリゴヌクレオチドはインタ
フエロン遺伝子のＳａυδＡ末端をｐＥＲ１０３Ｈｉｎ
ｄ　Ｍ末端に結合する望ましい断片となる。

１２ｍｅｒ　　　　　　’、１４ｍｅｒＨｉｎ　ｄＩＩ
Ｉ　　　　　８ｍｅｒ　　　　９ｍｅｒ　’。

ψ Ｍｅｔ　　Ｃｙｓ 本発明によると、オリゴヌクレオチドの合成に際し、開
始コドンＡＴＧとシスティンコドンＴＧＴは別の断片に
くるようにしである。そのため、１２塩基体（および８
塩基体）はｐＥＲ１０３に遺伝子を押入する際一般に使
用できる。従って、システィンコドンを有するオリゴヌ
クレオチドは少なくとも９塩基の長さが必要である。例
えば次のようなヌクレオチドか使用できる。

５’　ＴＧＴｏＡＴａｒＧ、、 ５　’ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣ。

５　’ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣ１ ５’ＴＧＴＧλ’ｒＣＴＧＣＣＴ嘔弐 ５　ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣ。

そこで、例えば、１４塩基体により得られる結合オリゴ
ヌクレオチドをＳａｕ　６Ａ、で消、イヒして、インタ
フエロンに適合するＳａｕ　３　Ａをつくる。

続くインタフエロン遺伝子とオリゴヌクレオチド被合体
の結合、そのプラスミドへの挿入およびバクテリア宿主
、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏ
ｌ、の形質転換は文献で知られる方法により行う。

真核細胞遺伝子の生産物の製造収量をさらに増加するた
めには、その生産プラスミドが発現に必要なりＮＡ配列
を複数、例えば２倍、含んでいることが有利である。例
えばバクテリアの―節制列を含む、成熟インタフエロン
αＡの全遺伝子の２倍である。この目的のために、バク
テリアのプロモーター、原核細胞のりボゾーム結合部位
およびＡＴＧ開始コドンを伴なう成熟インタフエロンの
遺伝子を、本発明により作製した生産シラスミド、例え
ばｐＥＲ３３から単離し、このＤＮＡの一方の端を変え
てから、本発明により作製した完全に同一のプラスミド
をたとえば）ｉ：ｃｏ　ＲＩなどの制限酵素により線状
にしたものに挿入する。

本発明によりこのように作製したプラスミドでトリプト
ファンオペロンを有するもの、例えばプラスミドｐＥＲ
３３がｐａｒ部位を含んでいると又有利である。即ち、
アンピシリンのような抗生物質など、選択指標の非存在
下で、バクテリアの生育中プラスミドを孫ａ胞に均一に
輸送する役割のＤＮＡ配列です（Ｐ、Ｍ、　Ｍｅａｃｏ
　ｃｋ、　Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ　：Ｃｅ１ｌ　２’
０巻、５２９−５４．２（１９８０年）参照）。この目
的のため、ｐａｒ部位を先ず上記引用の文献記載のプラ
スミドｐｐＭ３１から単離し、本発明により作製したイ
ンタフエロン生産プラスミドに押入した。

このように、本発明によれば、’　Ｓｅｒｒａｔｉａｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎ１９のトリプトファン　プロモーター
／オペレータ一部分および合成ＲＢＳを含む発現プラス
ミドを作製することが可能となった。たん白質の遺伝的
生産のための本プラスミドの有効性は、Ａ、一般的方法
の説明 制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入のも
のは、以下の条件で使用した：　Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｈｉｎ
ｄ　Ｉ　Ｐｓｔ　ＩおよびＡｖａ　ｆｆ消化はＴＡ緩衛
液（３３ｍＭ　）り酢酸、ｐＨ７，９，６６ｍＭａＥｌ
Ｗ力１ハ　１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｍ７７
ｍｌ　　ＢＡＡ　）中で行った。Ｈａｓ　１消化はＴＭ
緩衝液（７０ｍＭ　）リスー塩絵、−７，へ７　ｍＭ塩
化マ、グ不シウム）中で行すい、５ａｕ３Ａ消化は１０
　ｍＭ　）リス−塩酸、ｐＨ７，４，１０ｍＭ塩化マグ
ネシウム％　　７５　ｍＭ　ＮａＣ１中で行なった。

２、プラスミドの調製とゲル電気泳動 シラスミドの＝Ｓは、ＢｉｒｎｂｏｉｎｎおよびＤｏｌ
ｙ（、ｍｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７巻、１
５１３−１５２３頁（１９７９年））の指示に従い、２
５　ｔｔｆｌ／ｍｌのテトラティクリン又は１００μに
筆のアンピシリン含有のＬ−ブロス°中の一晩培養物１
．５コまたは１００−３００ｍ７より行なった。さらに
プラスミρの麹ｍ　Ｌ−に−スリぜ−ｉ千ノーＬ詠べ？
ｌ脅１↓−１−よび（大蓋な場合には）ファルマシアの
セファロース４Ｂクロマトグラフイーにより実施した。

より多量のシラスミドはＣｌｅｗｅｌｌおよびＨｅ１ｓ
ｉｎｋｉ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　９巻、４４２８
−４４４０頁：１９７０年）の１クリヤーライゼート１
法により調製し、続いて臭化エチジウムＣｓＣ１密度勾
配遠心分離を行なった。

プラスミドおよびその制限酵素消化産物の電気ｈｌｌＪ
Ｈ４０ｍＭ　トリ酢酸ＰＨ７，８，２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ中の０．８−１．４％アガロ
ースゲルまたは６％ポリアクリルアミドデルで行なった
。制限酵素断片の調製は、目的断片を含むデル区分を切
り出し、ゲルよりＤＮＡを電気泳動溶出により透析チュ
ーブへ浴出することで行なった。

５′−りん酸化反応（末端標識）は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ’　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入
手したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を用い、Ｔ
Ｍ緩衝液（７０ｍＭ　　ト　リ　ス　一塩＃　１　ＰＨ
７，５、７ｍＭ　ＭｇＣＪ２　　）＋５ｍＭ　ＤＴＴ　
＋０．２−０．５’ｍＭ　ＡＴＰ　（１０−２０μＯｒ
、”　Ｐ　−ＡＴＰ　）中、３７°Ｃ６０分間行なった
。

続いて酵素不活化のため７０℃で１０分間インキュベー
トした。

リガーゼ反応はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できるＴ　４　ＤＮ
Ａ　０．１単位（平滑末端の結合）、又は０．００５単
位のりガーゼ（末端の結合）を用い、７Ｍ緩衝液＋５　
ｍＭ　ＤＴＴ　＋　０．２５　ｍＭ　ＡＴＰ中で１４°
Ｃ−晩で行なった。酵素はその後７０°０１０分の加熱
で失活させた。

キナ７ゼおよびリガーゼ反応の連続反応は同一の反応赦
中で行なった。第一の酵素を熱失活させた後、５　ｍＭ
　ＤＴＴおよび０．２５−０．５　ｍＭ　ＡＴＰを再び
添加し、第二の反応を行なった。

フオスファターセ゛反応は制限消化用緩衝Ｑ　（ＴＡ緩
衝液）中、１単位のア′ルカリフオスファターセ゛（仔
牛の腸よりｉｍ製したシグマ製）を制限酵素消化物に添
加し、６７°Ｃ１１５分間のインキュベーションで行な
った。続いて、１〜２回のフェノール抽出、エーテル抽
出およびアルコール沈でんを行なった。ＤＮＡ断片は多
くの場合電気泳動で分離し、デルより浴出してから次の
操作に用いた。

ＤＮＡの大きい断片（５００ｂｐ以上）を小さい断片（
結合していないリンカ−断片または小さい制限消化産物
）から分離するにはインプロパツール沈澱を用いた。反
応は２Ｎの酢酸アンモニウム（終濃度）で開始し、沈で
んは０．６容量のイソプロパツールを用いて室温１０〜
２０分で行なった。

エツペンドルフ型遠心分離機で５分間遠心分離した後、
上澄を除去し、沈でんを冷７０％エタノールで洗滌後書
び遠心分離した。得られるペレットを乾煉し、次の操作
に用いた。

略称二 ＤＭＴｒ　””　ｐ、ｐ’−ジメトキシ−トリフェニル
メチルｉｂｕ　　＝インブチリル ｂｚ　　＝ベンゾイル（塩基窒素上の）αｍ＝高分子担
体物質 Ｂ　　＝チミン、又は Ｎ２−インブチリル−グアニン、又は Ｎ４−ベンゾイルシトシン、又は Ｎ６−ベンゾイルアデニン ＴＨＦ　＝テトラヒドロフラン く夾迦例　Ｉ〉 高分子担体物質の官馳基尋入 高分子担体物質は文献上知られでいる方法に従って官能
′ｌ基導入した。ＨＰＬＣシリカゲル（Ｍａｃｈｅｒｅ
ｙ５Ｎａｇｅｌ、粒子の大きさ２０ｍｘ、孔径２０ＯＡ
）を担体として用いた。コノ・り酸化のステップを無水
ピリジン中無水コノ・り酸で行なう他は、Ｍａｔｔｅ″
ｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒＳ　ｍｂ載の方法（Ｍ
、Ｄ。

Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　、　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
、　ＴｅｔｒａｈｙｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２１巻、
７１９頁：　　１９８１年、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　１０３巻、６１８５頁二１９Ｂ１年およびＴ
、　Ｔａｎａｋａ。

Ｒ，Ｌ、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、　ｐｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
：ｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１０巻、３２４９負：　
１９８２年）に従って誘導体化を行なった。

保護したヌクレオサイドを次の式に従ってシリカゾルに
共役結合した。

１グラムの担体に対して６８〜１０４μｍｏｌのヌクレ
オサイドの繊度を用いた。

〈実施例　■〉 完全保−したヌクレオシド−６′−クロロメトキシ亜り
ん酸は文献に記載される方法（Ｍ、Ｄ。

Ｍａ’ｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　１０３巻、６１８５頁：　１９８１年および
Ｔ　、Ｔａｎａｋａ　ｒＲ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
、　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
１０巻、６２４９負：（１９８２年）により合成した。

５４、４．６　ｍｙ　（１，０ｍ　ｕｏｔ）の５′−ジ
メトキシトリチルチミジン（ＤＭＴｒ　ｄＴ　）を１．
０Ｍの純粋ＴＨＦに浴解し、この浴液を一７８℃、１５
分間、アルゴン下でＱ、５ｍＡの純粋ピリジンおよび２
．Ｑｍ／ｌの純粋テトラヒドロフランにＱ、９ｍ　ｒｎ
ｏ、ｌのメチル−ジクロロ亜りん酸を溶解した溶液に攪
拌下で滴下する。さらに１０分攪拌後、反応液を室温に
温め、遠心分離する。上澄液をアルゴン充填し、乾燥し
た２５ｄの先細共栓フラスコにピペットを用いて移す。

本浴液を室温で真空下蒸発させ、トルエンおよびテトラ
ヒドロフラン各０．５ＴｒＬｌを加え、蒸発を再び行な
い、無色の発泡性固体を生成物として得る。この生成物
の純度は分析しなかったが、１ｏ、ｏｍｚの純粋ピリジ
ンに溶解し、この溶液をアルゴン下−２０℃で保存して
使用したが、保存期間は一週間以内とした。

く実施例　曹〉 ん酸 実施例Ｈと同様に、　６４０．０ｍ９　（１，Ｏｍ　ｍ
ｏ、ｉ’　）の５′−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イン
ブチル−デオキシグアノシンより、１０．ＯＩ／Ｌｌの
ピリジン中で本ヌクレオシドフオスフオロクロリダイト
を調製した。

〈実施例　ＩＶ　＞ 実施例Ｈと同様に、６３５．７　ｍ１ｉｉ’　（１，０
ｍｍｏＪ　）の５゛−ジメトキシ−トリチル−Ｎ４．−
ベンゾイル−デオキシシチジンより、ｉｏ、ｏｍのピリ
ジン中で本ヌクレオシドフオスフオロクロリダイトを調
製した。

〈実施例　■〉 実施例■と同様に、１０．０ｍｌのビリジ／中６５７．
７１ｎ９　（１，０ｍ　ｍｏＬ）の５′−ジメトキシト
リチル−Ｎ６−ベンゾイル−デオキシアデノシンより本
ヌクレオシドフオスフオロクロリダイトと調製した。

ＤＭＴｒｄＡ　　をつけた高分子担体（実施例Ｉ）をガ
ラスフリットに注ぐ。下記のリストに従って種棒の溶媒
および航薬溶液を添加し、目的の反応を”終了後、フリ
ント上部よりアルゴンガス蒸気により押し通すことによ
り溶液を再び除去する。

ａ）５００ｍｌのニトロメタンと５ｄの水に７０Ｉの臭
化亜鉛を溶解した溶液６−によりＤＭＴ　ｒ基を切断す
る。反応時間は１０分。

ｂ）　　ｎ−ブタノール−ルチジン−’ｌｌＨＦの４＝
１：５混合液３　ｍｌで４回洗滌。

ｃ）純粋１　＋）ジン４ｄで４回洗滌。

ｄ）次のヌクレオチドモジュールの縮合：５′−ジメト
キクトリチルーデオキシチミジンー３′−クロロメトキ
シ亜りん酸（例Ｂ）（およそ１’ＯＯμｍｏｔ、）のピ
リジン溶液１　ｍｌをアルゴン下でフリット中、高分子
担体に添加し、振って溶液とする。反応時間１０分。

ｅ）絶対ピリジン６−で６回洗滌。

ｆ）テトラヒドロフラン、ルチジンおよび水の２＝２：
１混合液３　ｍｌ　Ｋ溶解した１００ｒＲ９の沃素で三
亜りん酸を酸化する。反応時間、７分。

ｇ）テトラヒドロンラン４ｄで３回洗滌。

ｈ）未反応の５’−ＯＨ基を１５０〜のジメチルアミノ
ピリジン、Ｑ、３ｎｃｌのコリジン、０．２５ｍ１無水
酢酸および２．５−のテトラヒドロフランでアセチル化
する。反応時間、５分。

ｉ）ニトロメタン５　ｍｌで４回洗滌。

ａ）から１）までのサイクルをあと４回くり返えし、配
列に必要なヌクレオチドモジュールなｄ）のステップに
入れる。

収量の測定： 最後のヌクレオチドモジュールを縮合した後、担体物質
をオイルボンゾ真空下で乾燥し、およそ１〜のサンプル
索正確に秤量して［１，１Ｍ’）ルエンスルフオン酸ア
セトニトリル溶液１０ｍ１と混合する。ジメトキシトリ
チル陽イオンの開裂の結果、橙赤色溶液が得られ、その
４９８ｎｍＫおける吸収を測定する。下記の式に従って
担体のジメトキシトリチル保護基による荷重を計算でき
る。

担体重量〔■〕 ４３μｍｏｌ／ｇが得られる。こねは縮合の各ステップ
の平均収量８５％に鞘当する。

三りん酸基からのメチルラジカルの開裂：担体物質をチ
オフェノール、トリエチルアミンおよびジオキサンの１
’：１：２混合溶液４　ｍｌ中で４５分間振り、続いて
エタノール、さらにエーテルで洗う。

塩基保論基の開裂および高分子担体からのベキサヌクレ
オチド鎖の同時開裂；担体を濃アンモニア水１０１ｄ中
５０℃に１４時間加熱し、水溶液を吸引濾過して得られ
る濾液をおよそ２ゴまで蒸発させる。

生産物の精製： このようにして得られ、５′末端にジメトキシトリチル
保護基をまだつけている粗生産物を逆相ＨＰＬＣにかけ
る。カラム二μボンダパックＣｌ８（Ｗａｚｅｒｓ　）
；溶出液：２５％のアセトニトリル含有０．１Ｍのトリ
エチルアンモニウム酢酸緩衝液、ｐｉ−１７；流ｉ　’
ｌ　ｍｌ　／　ｍｉｎ　；溶出時間１４分Ｏ集めた溶出
画分を約１罰に濃縮し、８０％酢酸１０ｍＪを加え、室
温で３０分放置する。それを真空下、５０℃で濃縮乾固
し、残留物を２５ＷＬｌの水に溶解し、開裂したジメト
キシトリタノールを１５１１ｎｌのエーテルで３・回抽
出する。水層を再び乾固し、残渣を２；５〃ｕの水に溶
かし、Ｂｉｏｇｅ、ｌ　ｐ２　（カラム＝６０×１．７
ｃｍ）で脱イオン化し、凍結乾燥する。

生成物の分析； 純度検定としては分析用ＨＰＬＣ図を用いた（カラム：
３０Ｑｘ５．９ｉｔ、μボンダバック０１Ｂ、Ｗａｔｅ
ｒＳ　ｐ　　溶出液：１２％アセト、ニトリル９０．１
Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液、ｐＨ７；流速：
　１．５ｍｌ／　ｍｉｎ　；溶出時間：６６７分）。

実施例■と同様な方法を用い、３００１ｎ９（３０μＢ
ｏｔ）のＤＭＴｒｄＡ　　−［Ｆ］より合成される。

目成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム；３００Ｘ３．９＋ｎｍ、μボンダバックＣｌ８
（Ｗａｔｅｒｓ）　； 浴出液：１２％アセトニトリル中、０．１Ｍ）リエチル
アンモニウム酢酸緩衝液、ＰＩ″Ｉ７流速　：　１．５
　ｍｌ；　／　ｍｉｎ溶出時間＝４．４分 〈実施例　■〉 ｄ−ＡＧＣＴＴＡＡＡＣＣの合成 実施例■と同様に、２００■（１６μｍｏｔ）のＤＭＴ
ｒ　ｄ　Ｃ−［Ｆ］より合成される。

生成物のＨＰＬＣダイアグラム： 、／Ｊ　７　ム：　３’００　×３．９ｍｍ、μボンダ
バックＣ工。

、　　　　（ｗａｚｅｒｓ） 溶出液：１２％アセトニトリル中、０．１　Ｍ　トリエ
チルアンモニウム酢酸緩衝液、ｐＨ７流速　：　１．５
　ｗｔｌ　／　ｍｉｎ溶出時間：３．４分 〈実施例　■〉 実施例■と同様に、１５０■（１，３２μｍｏｔ）のＤ
ＭＴｒｄＡ　　〜［Ｆ］より合成した。

生成物のＨＰＬＣのダイアグラム： カラム：　３００　ｘ　７．８＋ｍ、μボンダパンクＣ
工。

（Ｗａｔｅｒｓ） 溶出液：２０％アセトニトリル中、０．１Ｍｒｎ酸トリ
ニトリエチルアンモニウム緩衝液１７流速　：　１．５
　ｍｌ　／　ｍｉｎ 溶出時間＝７．７分 〈実施例　Ｘ〉 ａ−ＡＧＣＴＴＡＡＡ（）ＡＴＧの合成実施例■と同様
に、２００■（１６，２μｍｏｚ　）のＤＭＴｒｄＧ１
ｂｕ〜［Ｆ］から合成した。

生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：６００×７．８１ｎｒ／Ｌ１μボンダパンクＣ
ｌ８（Ｗａｒ、ｅｒｓ） 溶出液＝２６％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝ｅ、ｐＨ７ｍ　速：　１．５　ｍ
ｌ　／　ｍｉｎ 溶出時間：５．２分 〈実施例　ＸＩ　＞ 実施例■と同様に、２５０■（２２μｍｏｔ）のＤＭＴ
ｒｄＡｂ″〜［Ｆ］より合成した。

生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：　３００　Ｘ　７．８關、μｍボンダバック、
Ｃｚ　Ｂ　（Ｗａ　Ｚ　ｅ　ｒ　８　）溶出液：２５％
アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウ
ム緩衝液、ＰＨ７流速　：１．５酩／−工ｎ 溶出時間＝６．１分 〈実施例　ｘｎ’＞ ｄ−ＣＡＧＡＴＣＡＣＡの合成 実施例■と同様に、１５０１ｎ９（１３，２μｍｏｔ）
のＤＭＴｒｄＡ　−［Ｆ］から合成した。

生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：　３００　Ｘ　７．Ｂｘｍ、μｍボンダパンク
ＣＡＢ　（Ｗａｉｅｒｓ、） 溶出液：２０％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、ＰＨ７流速　：　０．２　Ｔ
ｒＬｌ　／　ｍｉｎ溶出時間：５．２分 オリゴデオキシヌクレオチドの分析 合成的に生成したオリゴデオキシヌクレオチドの配列分
析は、インタフエロン生産シラスミドｐＥＲ′５３に組
み込んでから後に行なった（実施例２：インタ７エロン
ゾラスミドｐＥＲ，３３の配列分析の項参照）。この分
析でオリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列の正しさも
同時に証明される（第５図参照）。

〈実施例　１〉 発現プラスミドｐＥＲ１０３の作製は第１図に図示する
。

５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリノトフ
ァ／オペロ／のおよそ１０００　ｂｐ　　を含むシラス
ミドｐＢＲ１０１を出発原料としてプロモータ／オペレ
ータ部位を単離した。この調節部位は９０　ｂｐ　　の
長さのＥｃｏＲＩ−Ｈａｅ　ｍ内に位置し、その中でプ
ロモータはＥｃｏＲＩ→Ｈａｅ　ｍの方向に指向してい
る。

およそ２５μｇ　のシラスミドｐＢＰ　１０１を制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化し、得られる２つの断片をゲル電気
泳動（１，４％アがロース）を用いて分離し、２００　
ｂｐ　　の長さの断片をデルより電気泳動的に溶出する
。この断片なＨａｓ　ｍで消化し、２つの消化産物を６
％のポリアクリルアミドゲルで分離し９０　ｂｐ　　の
長さの断片（プロモータ／オペレータ）を再びゲルから
単離する。

ＲＢＳは６つの合成オリゴヌクレオチドより成る：６量
体５’　−ＴＣＣＴＴＡ　、　１０量体５’　−ＡＧＣ
ＴＴＡＡＡＣＣおよび１２量体５’　−ＴＡＡＧＧＡＧ
ＧＴＴＴＡである。５００ｐｍｏｌｅの６量体を酵素ポ
リヌクレオチドキナーゼによりりん酸化し、放射活性標
識を行なう（ＰａｒｚＡ参照）。反応液はキナーゼを失
活させるため７０℃１０分間加熱し、等モル量の１０量
体および１２量体（りん酸化していない）を添加後、オ
リゴヌクレオチド混合物を９５°Ｃに加熱してから徐々
に（約６時間以上）３０−３５°Ｃに冷却してオリゴヌ
クレオチドを互いに７・イブリダイズする：６量体　　
１０量体 ０−２５ｍＭのＡＴＰ　＃よび５　ｍＭ　ＤＴＴを添加
することにより、６童体と１０量体を酵素ＤＮＡりが−
ゼにより共役結合する（　Ｐａｒｉ　Ａ参照）。　１２
量体と１０量体の５′末端にりん酸基がないため重合体
の合成は阻止される。反応後リガーゼを失活するため７
０℃に１０分間加熱し、次に０．５ｍＭのＡＴＰおよび
５　ｍＭのＤＴＴを添加後、１２量体および１０量体の
５′末端も続くキナープ反応（Ｐａｒｚ　Ａ参照）によ
りりん酸化してその結果ＲＢＳが生成した。

９０　ｂｐの長さのＥｃｏＲＩ−Ｈａｅ　ｍプロモータ
／オペレータ断片１５　ｐｍｏｌｅを標準条件下（Ｐａ
ｒｔ　Ａ参照）下で６Ｑ　ｐｍｏｌｅのＲＢＳと結合す
る。Ｈａｅｍ切断で生成した９０ｂｐ　断片の平滑末端
のみがＲＢＳの平滑末端とのみ結合できるので、ＲＢＳ
をプロモータの下流域に正しい方向で持つ分子のみが得
られる。反応後、りが−ゼを７０’０１０分間で失活さ
せた後、ＴＡＭ衝液濃液濃度Ｐａｒｔ　Ａ参照）に調整
し、さらに２００単位のＨｉｎｄ　ｍ　および１０単位
のＥＣＯＲＩで消化する。これはりガーゼ反応で得られ
た多重体（目的の反応に加えて’Ｂｃ。

ＲＩ末端およびＨｉｎｄ　ｍ末端はいずれも互いに結合
するから）を単量体に再び変換するのに有利である。次
にサンプルを６％ポリアクリルアミドデルで分離し、１
００ｂｐ　　の長さのゾロモータ／オペレータＲＢＳ断
片（ＥｃｏＲＩ末端とＨｉｎｄ　ｍ末端を有する）をデ
ルより切り出し、電気泳動的に溶出して未結合の過剰Ｒ
ＢＳと分離する。その結果、発現シラスミドの発現に関
与する部分が作製された（第６図参照）。

第３図に示すヌクレオチド配列は文献に知られるポリヌ
クレオチド合成法により完成できる。

への挿入 約２μｇ　のプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素・Ｅｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄ　ｍにより切断して２つの断片を
得る：　４３３２　ｂｐ　　の大断片と２９　ｂｐ　　
の小断片である。０．８％アガロースデル寛気気泳動よ
り、大断片を小断片から分離し、ゲルより切り出して溶
出する。次にこの一片約０．４　ｐ、ｍｏｌｅを１０ｐ
　ｍｏｌｅのプロモータ／オペレータＲＢＳ断片（Ｐａ
ｒｔＡ参照）と結合する。１）ＢＲ３２２断片の両端に
お互いに合わない一重鎖が出ているため、この断片間で
結合することは不可能である。プロモータ／オペレータ
ＲＢ８断片はシラスミド中で一方向にのみ結合されるた
め、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ　ｍ部位からテトラサイク
リン耐性遺伝子の方向に展開する。

質転換 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１を文献（Ｄｗｏｒｋｉｎお
よびＤａｗｌｄ、　Ｄｅｕ　、　Ｂｉｏｌ、　７７５巻
、４３５−４４８頁；１９８０年）に知られる方法に従
い、最後のりが一ゼ反応液を用いて形質転換し、転換株
はアンピクリン含有の寒天培地で選択する。この目的の
ため、Ｌｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１を２よそ２Ｘ　１０８
ｃｅｌｌｓ／１１Ｌｌの濃度まで培養する。細胞を集め
、１００ｍＭの塩化カルシウム溶液にけん濁する（０°
Ｇで２０分間）。次に菌体をリガーゼ反応液とｏ−４０
０で５分間、さらに３７°Ｃ５分間インキュベートする
。０．５−１７１１１のＬ培地を添〃口後、さらに６７
０Ｃで１５−３．０分間インキュベーションを行なう。

１９の形質転換株を選択し、制限酵素Ｈａｅｍを用いて
プロモータ／オペレータＲＢＳ断片の有無を確認した。

１９２　ｂｐの長さのｐＢＲ３２２／　Ｈａｅ　ｍ断片
が欠失し、２６４　ｂｐ断片と置き代っていた（ｐ、Ｂ
Ｒ３２２中のＥｃｏ　Ｒｎ部位の左側のＨａｅ　ｍ部位
からの１６ｂｐ＋１０３＋ｂｐプロモ一タ／オペレータ
ＲＢ８断片＋ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ　ｍ部位から右側
に次のＨａｅ部位までの１４５　ｂｐ　）。調べた１９
の形質転換株中、１８株が予想どおりの消火パターンを
示したＣ第２図参照）。

作製した発現プラスミドが疑いもなく正しいことを証明
するために、この中の一つのプラスミド（ｐＥＲ１０３
）を分析してそのプロモニタ／オペレータＲＢＳ部分の
配列およびｐＢＲろ２２中での位置を確立した。塩基配
列の分析はｍａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒ−ｃ　（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　　７４巻、５６０
−５６４頁：　１９７７年）による文献に知られる方法
で行ない、ＥｃｏＲｌ：部位からＨｉｎｄ　ｍ部位の方
向に（それ以上）行ない、また、Ｈｉｎｄ　ｍ部位がら
Ｅｃｏ　ＲＩの方向に（その先きまで）行なった。第６
図に示す塩基配列が得られた。

従って、ｐＥＲ１０ろは８ｅｒｒａｔ、ｉａ　ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓのトリプトファンオペロンのプロモータ／
オペレータ部分と合だＲＢｓを有する発現プラスミドで
ある。

この新規な発現プラスミドは、そのＢｉｎｄ　ｍ部位に
挿入した遺伝子の転写な促進し、この転写生成物の翻訳
を効率よく可能にする。以下の実施例２にそれを示す。

〈実施例　２〉 ＩＦ７のＰｓｔ　１断片の約１μＪｉ＋　を制限酵素５
ａｕ６Ａで消化し、アミン末端のシスティンの次のＳａ
ｕ　３　Ａ部位からＡｖａ　ｎ部位を含んで次のＳａｕ
　’　３Ａまでの、１７７　ｂｐの長さの断片を６チポ
リアクリルアミドデルから単離した。それを１単位のア
ルカリフォスファターゼで処理しくＰａｒｔＡ参照）フ
ェノールおよびエーテル抽出でフォスファターゼを除去
後エタノール沈でんを行なう。断片を続いてＡｖａ　ｎ
で切断し、目的の３４　ｂｐの８ａｕ３Ａ−Ａｖａ　Ｉ
Ｉｎ断片よび１４３　ｂｐの断片が得られた。

こ名と平行に、１７７　ｂｐのＳａｕ　３　Ａ断片中の
Ａｖａ　ｎ部位から終了コドンの後までの゛、インタフ
エロン特有の６４６　ｂｐ　Ａｖａ　ｎ断片を、プラス
ミドＩＦ７より調製する。この６４６　ｂｐのＡｖａ　
ｎ断片約０．５μ９゛と、５４　ｂｐおよび１４３　ｂ
ｐのＳａｕ　３　Ａ　−Ａｖａ　ｎ断片混合物とを酵素
ＤＮＡ−リガーゼ（Ｐａｒｔ　Ａ参照）で接着末端結合
を行なう。

その結果、共有結合し、Ａｖａ　ｎ　−８ａｕ　３　Ａ
断片がくっついたＡｖａ　ｎ断片が得られる。Ａｖａ　
ｎ　−５ａｕ６Ａ断片がＡｖａ　ｎ断片と結合すると、
もはやそれ以上のりケゞ−ジョンは起らない。ソｔ１は
８ａｕ　３　Ａ末端が脱りん酸されているからです。結
合反応の後、酵素を失活させるために７０℃、１０分間
加熱し、次に５ｍＭのＤＴＴおよび０．２５　ｍＭのＡ
ＴＰを添加し、脱りん酸している３ａｕ３　Ａ末端をり
ん酸化する（　Ｐａｒｔ、　Ａ　）。反応液を６％ポリ
アクリルアミドデルで分離して７００〜ｓ　ｏ　ｏ　’
ｂｐ区分（２このＡｖａ　ＩＩ　−Ｓａｕ　３　Ａ断片
のついた６４６ｂｐのＡｖａ　ＩＩｎ断片と１３００〜
１５００ｂｐ区分（２この２４６　ｂｐのＡｖａ　ＩＩ
ｎ断片互いに結合し、Ａｖａ　ＩＩ　−Ｓａｕ　３　Ａ
断片がついたもの）の分子を溶出する。

Ｈｉ′ｎｄＩＩＩ　　　　　’　　＋ ８ｍｅｒ　　　９ｍｅｒ　１ 畷 ４個の合成オリゴヌクレオチド、即ち、１４塩基体５’
　ＴＧＴＣ）ＡＴＣＴＣ）ＯＣＴＣＡ　、　１２塩基体
５′ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ　、　９塩基体５′ＣＡ
ＧＡＴＣＡＣＡおよび８塩基体５’　ＣＡＴＣＴＴＴＡ
　、を以下のように反応させる。

８塩基体、９塩基体および１４塩基体の各２５０ｐ　ｍ
ｏｌｅをりん酸化しく　Ｐａｒｉ’、Ａ参照）、反跳後
キナーゼを９５°Ｃに加熱して失活させた後、非りん酸
化１２塩基体２５０　ｐ　ｍｏｌｅを添加してオリゴヌ
クレオチド混合物を徐々に３５℃に冷却しくおよそ３時
間余りかげて）、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションを行なう。次に、５ｍＭのＤＴＴおよび０．２
５　ｍＭのＡＴＰを添加後、オリゴヌクレオチドを互い
に結合させる（平滑末端結合、Ｐａｒｔ　Ａ参照）。１
２塩基体の５′末端にりん酸基がないため、２量体の形
成が阻害される。１４塩基体の突出末端は相補性がない
ため二針体形成を起さない。

結合オリゴヌクレオチド複合体の一部分（２５ｐ　ｍｏ
ｌｅ　）を８ａｕ　３　Ａ　８０単位で消化し、インタ
７エロン遺伝子したＳａｕ　３　Ａ末端を作製する。サ
ンプルを７５°Ｃ１１０分間加熱し、フェノールで抽出
してからエタノール沈でんを行なう。このようにしてイ
ンタ７エロン遺伝子を本発明によるｐＥＲ１０６のＨｉ
ｎｄ　Ｉ１１部位と結合するリッカー断片を作製する。

およそ１ｐｍｏｌｅの分子に相当する単離したインタフ
ェロ／活性をＳａｕ　３　Ａの接着末端結合により５ａ
ｕ３Ａ切断オリゴヌクレオヂド複合体（およそ２５１）
　ｍｏｌｅ　）と連結する。こ＼でも、オリゴヌクレオ
チド複合体（１２塩基体）のＨｉｎｄ　ｍ末端にりん酸
基がないため、重合体の生成が阻害される。遊離したＨ
ｉｎｃｌ　ｍ末端を有するオリゴヌクレオチド複合体を
両端につげたインタフェロ／活性が得られる。リガーゼ
を熱変性させ、５　ｍＭのＤＴＴ−ｇよびＣ１，２５ｍ
Ｍ　ｏ′）ＡＴＰを添加後、これらの末端をりん酸化し
く　Ｐａｒｔ　Ａ参照）、続いてインゾロパノール沈で
んを行なって（Ｐａｒｔ　Ａ参照）、リガーゼ反応で生
成したオリゴヌクレオチド複合体の二量体を分離する。

ここで生成物をフォスファターゼ処理しｐＥＲ１０’３
のＨｉｎｄ　ｍ切断物０．０５μ９と結合する（接着末
端結合についてはＰａｒｔ　Ａ参照）。シラスミドのＢ
ｉｎｄ　ｍ切断物をフォスファターゼ処理（ｐａｒｚ、
Ａ　）することにより、りが−ゼ反応中の閉環な阻止で
きる。このようにしてインタフエロン生産プラスミド（
遺伝子の開始点に６４６　ｂｐのＡｖａ　ｎ断片を結合
した３　４　ｂｐ　５ａｕ３　Ａ　−Ａｖａ　ｎ断片を
獲得したプラスミド）を５０チ含むプラスミド混合物が
得らねる一実施例２ａ参照０ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　　
（Ｄｗｏｒｋｉｎ　ａｎｄＤａｗｉｄ　、　Ｄｅｖ、Ｂ
ｉｏｌ、　７６巻、４３５−４４８頁＝１９８０年）の
形質転換に、実施例１ｅと同じように、実施例２Ｃによ
り作製したプラスミド混合物を用いた。得られた形質転
換株の約２０％力玉挿入部分を有し、（残りは環状のｐ
ＥＲ１０３プラスミドである）そのいくつかにつ０てイ
ンタフェロ／活性を分析した。そのために、１００Ｔｆ
Ｌｌの７ぐクチリア培養をＭ９最少培地にトリゾトファ
／以外の全てのアミノ酸（各アミソ酸轟り２０μ９／ｒ
ｌＬｌ）、チアミン（１μｇ／−）、グルコース（０，
２％）およびトリプトファンオペロンの誘発剤インドー
ル−（３）−’７りＩＪ　＃酸（ＩＡＡ、　２０　ｔｔ
！ｌ／ｒｒｔｌ　：　ＨａｌＬｅｗｅｌｌおよびＥｍｚ
ａｇｅ　、　Ｇｅｎｅ　、　　９巻、２４−４７頁：　
１９８０年）を添〃口し、ＯＤが０．６−０．８となる
まで培養する。バクテリアを７，０００ｒｐｍ１０分間
遠心分離して集菌し、トリス−塩酸緩衝液、ＰＨ８，３
Ｑ　ｍＭ　ＮａＣＪにて１回流Ｌ−１同緩衝液１，５ｒ
ｒＬｌにけん濁する。氷の中で１１ｎ９／Ｔｎｌの１ノ
ゾチームと３０分間インキュベート後、菌体を５回凍結
、融ＳＬ、ｉ％１体区分を４（３，ＯＣＩＯｒｐｍ１時
間の遠１ｃ？分離で除去する。上澄液を濾過滅菌し、■
３細胞と■Ｓｖを用いたプラーク阻止試験によりインタ
フェロ／活性をテストする。全てのクローン（挿入を有
する）の約半分がかなりのインタフ二ロン発現を示した
。培養物１リットル当り２ｘｉｏ”単位（国際対照単位
）。

ｅ、インタフエロン生産プラスミドｐＥＲ３３の塩基配
列分析 インタフエロン生韮クロー／の一つ（ｐＥＲ３３）を選
んで作製したプラスミドの正しさを確立するため、プロ
モータ／オペレータ部分７１）ムら挿入遺伝子への配列
に関して分析した。配夕１」の分析シエ、またｍａＸａ
ｍ　ａｎｄ　Ｃ）ｉｌｂｅｒｔ　（Ｐｒｏｃ、ＮａｔＡ
ｃａｄ　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７４巻、５６０−５６４頁：１９７７
年）によって行ない、３′末端を放射標識したＥｃｏ　
ＲＩ部位からインタフエロン遺伝子の方向に実施した。

予想どおりの配列が得られ、その切り出し部分を第５図
に示す。この部分にｐｇ：Ｒ３３を作製するために使用
した全てのヌクレオチド断片が見られる。

以上の性質より、本発明により作製した発現プラスミド
ｐＥＲ１０３は、５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓのトリシトファンオペロンの配列と合成リポソーム
結合配列を有することが示される。白血球インタフエロ
ンの例から、発現シラスミドｐＥＲ１０３に適当な形で
とり込まれた遺伝子が高度な発現率を示すことが明かと
なった。

発現プラスミドｐＥＲ１０３はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　、　ＨＢ　１０１に入れて、１９
８３年１０月２７日にＤＳＭ　２　’７７３として”　
ＧｅｒｍａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　；　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒａ
’Ｂｅ８　、　Ｄ　−５４００Ｇｏｔｔ、ｉｎｇｅｎ　
（Ｆｅｄｒａｌ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃｏｆ　Ｃ）ｅｒｍａ
ｎｙ　）　”にブタペスト条約に基づいて寄託した。

〈実施例　３〉 インタフエロンプラスミド））ＥＲ２１／　２０作製シ
ラスミドｐＥＲ２１／１の作製、は第６図に図示しであ
る。

２μ９のｐＥＲ３３を用い、制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩおよ
びＢａｍ　ＨＩで切断して、およそ１３００　ｂｐおよ
び４０００　ｂｐの長さの２つの断片を得る。これらの
断片を１．２％アガロースｒデル電気泳動的に分離する
。短い断片はデルから電気溶出にて単離しこのＤＮＡの
両端をｄＡＴＰ　、　ｄ（）ＴＩＰ、　ｄＣＴＰ　Ｎよ
びｄＴＴＰの各１．２５　ｎ　ｍｏｔと２単位のＤＮＡ
ポリメラーゼＩのフレナラ断片とを添加することにより
平滑末端とする。ＤＮＡはフェノール抽出およびエタノ
ール溶液からの沈でんにて精製し、１５μｌ　の水に溶
解する。

およそ１５　ｐ　ｍｏＺのＥｃＯＢ■リンカ−（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂａ　Ｉｎｃ、　）の５′
末端を５　ａｌの反応液中γ−３２Ｐ　−ＡＴＰおよび
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼの添加により、りん酸
化を行なう。キナーゼを熱失活させた後、ＤＮＡ、５　
ｎ　ｍｏＡのＡＴＰおよび０．１単位のＴ　４１Ｊガー
ゼを加え、１４℃１６時間インキュベートする。反応生
成物をイソゾロパノール沈でんにより低分子物質から精
製する。

ＤＮＡを２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩにて切断し再び
インゾロバノーノυ沈でんにて精製して１０μノの水に
溶解する。

ｂ）プラスミド゛ｐＥＲ３３の線状化 約２μ９　のプラスミドｐＥＲ３３を制限酵素Ｅｃ。

ＲＩで処理する。続いて、アルカリフォスファターゼを
加えて５′のりん酸を取り除く。約５６００ｂｐ　　の
長さの線状ＤＮＡを１．２％アがロースデル電気泳動に
て精製し、残る未切断ｐＥＲ３３を電気溶出する。ＤＮ
Ａはフェノールおよびエーテルで抽出し、エタノール溶
液から沈でんし、１０μノ　の水に溶解する。

ＥｃｏＲＩＩＪンカーを有し、ＨＦＮａＡ遺伝子および
調節要素を含有するＤＮＡ部分４μノ　を相互に、およ
び０．５μｊ　のＥｃｏＲＩで線状化し、脱りん酪した
１）ＥＲ３３と、０．１単位のＴ４りが−ゼを用い２０
μノ　の反応液中で結合させる。１４℃で１６時間の反
応後、酵素を６８℃に加熱して失活させる。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１を実施例３ｃで得られるＤ
Ｎ、Ａを用い、実施例１ｅと同様な方法で形質転換する
。

このようにして得られた２つのクローンを実施例２ｄと
同様にインタフエロン発現につき、プラーク阻止試験で
調べた。クローンｐＥＲ６３が１リツトルの培養液当り
２００Ｘ１０６単位以下のインタフエロンを示したのに
対し、ｐＥＲ２１／１と命名した新しいクローンの一つ
は３００ｘ１０ａ　　単位以上得られた。

ｅ）　　ｐＰＲ２，１／１の制限酵素分析シラスミドｐ
ＥＲ２１／　１を比較的多量に単離しＨｉｎｄ　ｍの制
限酵素消化により分析した。ｐＲＲ３３のＥｃｏＲＩ部
位に挿入されたＤＮＡは２つの同じＥｃｏＲＩ　　末端
を有することから、ｐｇＲ２１／　１中で２つの方向で
の挿入が考えられる。ｐＥＲ２１／１中でインタ７エロ
ン含量子が同一方向であるならば、Ｈｉｎｄ　ｍで制限
消化すると約４１００゜９５０（２つの断片）および４
５０　ｂｐ　　の大きさの断片が得られる筈である。し
かし、もし２個の遺伝子が逆方向にあるならば、約４３
５０　、９５０（２つの断片）、および２００　ｂｐ　
　の大きさの断片が予想される。約２μ９　のｐＥＲ２
１／　１を制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍで消化し、続いて１．
４％アがロースデル電気泳動を行なうと、約４１００．
９５０および４５０　ｂｐ　　の断片が得られた。従っ
て、２つのＩＦＮａＡ遺伝子は互いに並行に結合してい
る（第６図参照）。

〈実施例　４〉 町。

プラスミドｐａｒ　ｐＥＲ３５の作製は第７図に図示す
る。

ａ）　　ｐａｒ一部位の調製 およそ２０　Ｑ　ｐ　ｎｏｔのＥｃｏＲＩ　リフカー（
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、　）
を９単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１０　
ｎ　ｍｏｔのＡＴＰを含む２０μｌ　の反応液中で、そ
の末端をりん酸化し反応後酵素を熱失活させる。

シラスミドｐＰＭ　３１の８μｙ　を制限酵素Ａｖａ　
１とポリメラーゼｌのフレナラ断片４単位を加えて平滑
末端に変換する。ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノ
ール溶液からの沈でんにより精製し、４０μｌ　の水に
溶解する。

ＥｃｏＲＩ　　リンカ−を、線状化して平滑末端にした
ＤＮＡと共に、酵素を熱失活させた後、６ｎ　ｍｏ４の
ＡＴＰを含む７０μΔ　の反応液中で１４°０１６時間
処理し、溶液を５０　ｍＭ　ＮａＣＪ、および５０　ｍ
Ｍ　）リス−塩酸、ｐＨ７，６、に調整し、ＤＮＡを３
００年位（ｒ）　Ｅｃｏ　ＲＩで処理する。インキュベ
ーション２時間後、制限酵素を熱変性し、ＤＮＡを１．
４％のアがロースデルの電気泳動で分離する。およそ４
００ｂｐ　　の長さの、ｐａｒ部位を含むＤＮＡ画分を
デルより電気溶出し、フェノール抽出およびエタノール
溶液からの沈でんで精製し、５０μｌ　の水に溶解する
。このＤＮＡ画分はその両端にＥｐｏ　ＲＩ　％有の突
出を有する１、 ｂ）プラスミドｐＥＲ’　３３０線状化約２μｇのｐＥ
Ｒ３３を制限酵素ＥｃｏＲＩ　　で処理する。続いてア
ルカリフォスファターゼを添加して５′−りん酸基を除
去する。およ−ｔ５３００ｂｐの長さの線状ＤＮＡを１
．２％アがロースデル電気泳動および電気溶出により、
未切断のｐＥＲ３３と分ｉｆる。ＤＮＡをフェノールお
よびエーテルで抽出し、エタノール溶゛液から沈でんし
、５０μノ　の水に溶解する。

Ｃ）線状ｐＥＲ３３とｐａｒ部位ＤＮＡとの結合線状ｐ
ＥＲ３３１μノとｐａｒ部位ＤＮＡ１／！ＡＪとを２０
μｌ反応液中で０．１単位のＴ４りが一ゼにより結合す
る。１４°０１６時間インキュベーション後、酵素を熱
失活させる。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１を実施例１ｅと同様に、実
施例４ｃで得られるＤＮＡを用いて髪質転換する。約５
０のコロニーを得る。これらのコロニー０１０個より少
量のＤＮＡを単離しく　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｄ
ｏｌｙ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｌｒ　７
巻、１５１３−１５２６頁：　１９７９年）、制限酵素
Ｐｓｔｌにより切断する。アがロース電気泳動による分
析の結果、これらのシラスミド全てがおよそ４００　ｂ
ｐの長さのｐａｒ部位を有することがわかった。これら
のシラスミドの一つを選んでｐａｒ　ｐＥＲ３３と命名
した。

定性の分析 実施例２ｄと同様に、ｐＥＲ３３またはｐａｒ　ｐＥＲ
３６を有するバクテリアを培養し、インタ７エロン含量
をプラーク阻止試験によりテストした。両株ともはソ同
等のインタフェロン発現ケ示した。

１２０世代を越える長、期のテストで、選択標識のアン
ピシリンの非存在下、Ｅ、ｃ’ｏｌｉ　ＨＢ　１０１中
のプラスミドｐＥＲ３３およびｐａｒ　ｐＥＲ３３の安
定性を調べた。培養液より一定時間毎にサンプルを取り
出し、インタフ二ロン含量を測定した。ｐＥＲ３３を有
するバクテリアでは約６０世代後にインタフエロン生産
は止まった。しかしｐａｒ　ｐＥＲ３３を含有するバク
テリアでは１２０世代後でもインタフエロンαＡの生産
は低下しなかった。

従って、ｐＥＲ−３３にｐａｒ部位を導入することによ
りＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１中のプラスミドの安定性
が増加することが明かとなった。

４、用いた用語および略語 ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三りん酸塩基対　　　：
Ａ−Ｔ％Ｇ−Ｃのような二つの相補的ヌクレオチド 平滑末端　　：突出する一重鎖末端と区別して、完全に
塩基対を成すＤＮＡ二重鎖分 子末端 ｂｐ：塩基対 ＢＳＡ　　　　　：分生血清アルブミンＣＤＮＡ　　　
　　：　ｍ　ＲＮＡに相補的なりＮＡコニー　　　：何
かの情報を有する；　ＤＮＡはそのヌクレオチド配列に
たん白質のア ミノ酸配列のための情報を有する コドン　　　：３コのヌクレオチドのグループで各コー
ドが特定のアミノ酸または ポリペゾチド合成の中止を示す。

脱りん酸　　：りん酸基の除去 ＤＮＡ　　　　　：デオキシリポ核酸 ＤＴＴ　　　　　：ブチオスライト−ルミ気泳動　　：
を湯中での（ＤＮＡ）分子の分離発現　　　　：遺伝子
の情報を転写によりｍＲＡＮに、さらに翻訳によりポリ
ペゾチ ドの配列に変換すること 発現プラスミド　：その中に挿入された遺伝子の発現を
可能とするプラスミド 遺伝子　　　：特定の転写物（ＲＮＡ分子）へ、さら゛
にたん白へ変換する情報を有する ＤＮＡの部分 遺伝子産物　：　ＲＮＡ　（転写物）、たん白（翻訳産
物） 核酸のハイブリダイゼーション： 互いに相補的なりＮＡ鎖間で安定な 複合体を形成すること 混成プラスミド°：異種ＤＮＡ断片を含むシラスミドＩ
ＦＮ−αＡ　　　：白血球インタフエロン亜タイプＡ開
始コドン　：メチオニンをコードし、翻訳開始を指令す
るＡＴＧコドン 挿入物　　　：混成プラスミドに挿入された異種由来Ｄ
ＮＡ部分 キナーゼ　　：　ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の５’　−Ｏ
Ｈ基をりん酸化する酵素 キナーゼする　：５′−りん酸基を供給するクローン　
　ニー個のバ２テリアから発生したコ接着末端　　：互
いにハイブリダイズできる、−重鎖の突出したＤＮＡ分
子末端 相補的　　　：互いに適合している（　ＤＮＡ中のヌク
レオチド二ＡはＴに相補的であ り、ＧはＣに相補的） リガーゼ　　二種々のＤＮＡ分子を共有結合させる酵素 リガーゼする：　ＤＮＡ分子を互いに共有的に結合する ｍＲＮＡ　　　　：伝令ＲＮＡ　、ポリペプチドをコー
ドするＲＮＡ ヌクレオチド：　ＤＮＡまたはＲＮＡの構成単位（Ａ＝
アデノシン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝ グアノゾン、Ｔ−チミジン、Ｕ− ウラシル） ヌクレオチド配列：　ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中のヌク
レオチドの配列 オリゴヌクレオチド：フォスフオシエステル結合により
互いに結合しているいくつかのヌ クレオチド（短い−：ｉ＠ＤＮＡ断片）オペレータ　：
オペロンの制御部分の一部で、レゾレッサーが結合して
転写が抑制 される部分 オペロン　　：オペレータを形成し、調節を受ける遺伝
子グループ フォスファターゼ：　ＤＮＡ分子から５′−りん酸基を
除去する酵素 プラスミド　：クロモデーム外の環状ＤＮＡ分子プロモ
ータ　：酵素ＲＮＡポリメラーゼと結合できるＤＮＡ配
列 ＲＢＳ　　　　　：　ＩＪボゾーム結合配列の項参照制
限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）：ＤＮＡ二重鎖の特
有の対称配列で切 断できる酵素 制限断片　　：制限エンドヌクレアーゼによる消化の結
果得られろＤＮＡ区分 リポソーム結合配列：リポソームＲＮＡと結合できるｍ
　ＲＮＡの部分 可Ａ　　　　　：リボ核酸 ＲＮＡポリメラーゼ：　ＤＮＡに相補的ＲＮＡ鎖を合成
する酵素 配列　　　　：ヌクレオチド配列の項参照形質転換株　
：形質転換の結果、外来ＤＮＡ　（シラスミド）を取り
込んだバクテリア 形質転換　　：バクテリアで外来（プラスミド）ＤＮＡ
をとりこむこと 転写：ＤＮＡマトリックスに相補的なＲＮＡの合成 翻訳　　　　：　ｍＲＮＡの情報を哄すペプチドに変換
すること Ｔｒｉｓ　　　　　：　）リヒドロキシメチルアミンエ
タン 第１図は発現プラスミドＩ）ＥＲ１０ｉの作製図示した
ものである。断片の大きさは実際の値を縮少したもので
ない。

第２図はシラスミド１）ＥＲ３２２およびｐＥＲ１Ｑ　
３のＨａｅｍ消化パターンを示す。ｐＢＲ３２２の１９
２ｂｐ　　断片がｐ）ｉ；Ｒ１０３では約２７０　ｂｐ
　　の断片で置き代わっている。

第６図はｐＥＲ１０３のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ　ｍ部位
の間のヌクレオチド配列を示す。シラスミドの残りの部
分は、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ　ｍとＲｃｏＲ工断片工
大片い部分に対応する。

第４図はインタフエロン生産プラスミドｐＥＲ３３の作
製を図示したものである。↓し″ｒＰｓｔ１部位、↑は
Ｓａｕ　３　Ａ部位、↑はＡｖａ　ｎ部位を示す。ＩＦ
７挿入部分の制限図を除いて、断片の大きさは実際の縮
少で示してない。

第５図はプロモータＲＢＳ−インタフェロ／遺伝子の結
合を示すデルの配列を表わす。ｐＥＲ３３０作製に用い
たオリゴヌクレオチド断片全てが存在する。わかり易い
ように、同じ配列を二重鎖として下部に示した。個々の
オリゴヌクレオチド構成部分も示しである。

第６図し丁インタフエロン生産シラスミドｐＥＲ２１／
１の作製を図示したものである。プラスミド断片は実際
の大きさの縮少ではない。

第７図はインタフ二ロン生産人ラスミドｐａｒ　ｐＥＲ
６３０作製を図示したものである。断片およびプラスミ
ドは実際の大きさを縮少したものではない。

代理人　浅　村　　　晧 第３図 εｃｏＲ１ ７＃σ七−タ　□ 第４図 牙５図 ｃｏ　ＲＥ ンーーーフリ毛−７□ ７Ｄ口七−？／にイレー２□ 惨１←ＲＢＳ→１−ノン１１−中１←ＩＬ央→１７図　
　　　　　　ＥＨ 第１頁の続き ０発　明　者　エバ・ドウオーキン−ラスドルアメリカ
合衆国ニューヨーク州 ニューヨーク・アブト６−ジエ イ・モーニング・サイド・ドラ イブ（５） ０発　　明　者　ギュンター・アドルフオーストリア国
ウィーン・ヨハ ナガツセ２Ｏ−７ ｏ発　明　者　ノルベルト・ハウニル ドイツ連邦共和国ビベラツハ１ ハンデルストラーセ１２ ０発　明　者　ベーター・マインドル オーストリア国ウィーン・ホラ ケガッセ６３−１ ０発　明　者　ベーター・スウェットリイオーストリア
国ウィーン・ヒエ トジンガー・ハウプストラーセ ４０ビー−９ ０発　明　者　ルドルフ・ハウブトマンオーストリア国
ウィーン・ビク トルガッセ２５−８ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８　　年特許願第　２４３６２６　　　号事件と
の関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和５９年　３月２７日 ６、補正により増加する発明の数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　下記の式で表わされるＤＮＡ配列配列ジ−プ
   ロモー ターロモータ／オペレーター□＊−刊（−例ａｔｎ　ａ
   エエエ （２、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド配列で
   、さらにリボゾーム結合配列の次にリンカ−配列を含む
   ことを特徴とするＤＮＡ配列。 （３）下記の式で表わされる特許請求の範囲第２項記載
   のＤＮＡ配列。 ５１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　ごｈ−プロモーター　□ Ｈｌｎ　ｄ工ＩＩ ←リンカー （４）特許請求の範囲第２項または第６項記載の配列が
   、さらにポリペプチドの構造遺伝子がバクテリアにより
   発現し、ＤＮＡ配列の組み合せが後者のＤＮＡ配クリが
   ＤＮＡ　！Ｊンカー配列と、１５’、５’−りん酸ジエ
   ステル結合により“連結するように起っているような形
   で含有することを特徴とするＤＮＡ配列。 （５）構造遺伝子がインターフェロンをコードスルこと
   を特徴とする特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ　配列
   。 （６）構造遺伝子がヒトインターフェロンαＡをコード
   することを特徴とする特許請求の範囲第４項記載のＤＮ
   Ａ配列。 （７）下記の式を有することを特徴とする第４項記載の
   ＤＮＡ配列。 一一一一一プロモータ□ −プロモータ／オペレータ□　＊−ＲＢＳ　−−・＋曝
   ・参〇 α私σ阿Ｔ、、、、、、　　　　　　　Ｈｌｎ　ｄＩＩ
   Ｉ←リンカ−枳−ＩＦＮ−ａＡ−姻υ１を一矢→（８１
   下記の式で表わされる、ＤＮＡリボゾーム結合／リンカ
   −自己夕１」。 ５′・・・・・・・・・・・・・・・　　　　　　　　
   　　　・・・・・・３’、、、、、、、、、、、、、、
   、彪πｍ墓品岨π虚鯉■口に０１０６．。 （９）下記の式で表わされるＤＮＡ　ＩＪンカー配列。 ５　’　ＡＧＣＴＩ’ＡＡＡＧＡＴＧ ３”　　　ＡＴＩ’Ｉ’ＣＴＡＣ ＱＯ）　　％許請求の範囲第１１項〜第９項記載のＤＮ
   Ａ配列を含むプラスミドおよびそれ自体公知の方法で得
   られるその変異シラスミド。 Ｑｌ）　　％許請求の範囲第１項、２Ｊ、、３項或いは
   ８項記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする第１０項
   記載の発現プラスミド、およびそれ自体公知の方法で得
   られるその変異プラスミド。 α２、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含むこ
   とを特徴とする発現プラスミドｐＥＲＩ　Ｄ　３、およ
   びそれ自体公知の方法で得られるその変異プラスミド。 α■　特許請求の範囲第４項、５項、６項または°７項
   記載のＤＮＡ配列の一つまたは二つ、およびｐａｒ部位
   を任意に含むことを特徴とする第１０項記載の生産プラ
   スミドおよびそれ自体公知の方法で得られるそれらの変
   異プラスミド。 α４）ｔ￥ｆ許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列の一
   つ又は二つおよび１：ｌＰＭ　３１より単離したｐａｒ
   部位を任意に含むことを特徴とする特許請求の範囲第１
   ３項記載のイ゛ンタフエーロン生産プラスミドおよび、
   それ自体公知の方法で得られるそれらの変異プラスミ　
   ド。 （１！１９　　特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列
   を含有することを特徴とする、インタフエロン生産プラ
   スミドｐＥＲ３５、およびそれ自体公知の方法で得られ
   るその変異プラスミド。 （１６）特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列の２倍
   を含有することを特徴とするインタフエロン生産ノラス
   ミドｐＥＲ２１／１　、およびそれ自体公知の方法で得
   られるそのプラスミドの変異プラスミド。 α７）特許請求の範囲第７項記載のＤＮ入配列およびｐ
   ＰＭ　３１まり単離したｐａｒ部位を含有することを特
   徴とするインタフエロン生産プラスミドｐａｒｐＥＲ３
   ３、およびそれ自体公知の方法で得られるその変異プラ
   スミド。 （１ｇ＋　　セラチア　マルセツセンスのトリットファ
   ンオペロンの９０塩基対プ四モ一ター／オペレーター配
   列が下記の式で表わされるり、ボゾーム結合配列と結合
   していることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   ＤＮＡ配列の調製方法。 ５　’　ＴＡＡＧＧＡＧＧ’ＩＴｒＡ ３　’ＡＴＴＣＩＣ！ＴＣＣＡＡＡＴｒＣＧＡ。 α！１　特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列が、特
   許請求の範囲第２項または３項記載のリンカ−配列と結
   合していることを特徴とする特許請求の範囲第２項〜第
   ７項記載のＤＮＡ配列の調製方法。 （社）特許請求の範囲第２項または第３項記載のＤＮＡ
   配列がポリペプチドをコードする構造遺伝子と結合して
   いることを特徴とする特許請求の範囲第４項〜第７項記
   載のＤＮＡ配列の調製方法。 （２Ｎ）使用する構造遺伝子がヒトインタフエロンαＡ
   をコードすることを特徴とする特許請求の範囲第２０項
   記載の方法。 （ハ）　プラスミド、好ましくはプラスミドｐＢＲ″５
   ２、特許請求の範囲第１項〜第７項記載のＤＮＡ配列と
   結合していることを特徴とする特許請求の範囲第１０項
   記載のプラスミドのｙＡ製方法。 （ハ）　プラスミド］：ｌＢＲ５２２の２９塩基対の長
   さのＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｌ断片を制限酵素分解に
   より除去し、その代りにリガーゼ反応により特許請求の
   範囲第１項、第２項または第３項記載のＤＮＡ配列を挿
   入したｐＢＲ５２２がベクターであることを特徴とする
   特許請求の範囲第１１項または第１２項記載の発現ベク
   ターの調製方法。 （財）　ポリペプチドをコードする構造遺伝子がリンカ
   −配列を介して、好ましくは発現ベクターｐＥＲ１０３
   に挿入され、さらに任意に、続いて、ｐＰＭ６１から単
   離したｐａｒ部位をベクターに挿入することを特徴とす
   る特許請求の範囲第４項、第５項、第６項または第７項
   記載のＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１３項〜第１
   ７項記載の生産プラスミドの調製方法。 Ｑω　特許請求の範囲第２４項により調製した生産プラ
   スミドにさらに第７項記載のＤＮＡ配列が挿入されてい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１６項、第１４項
   および第１６項記載の生産プラスミドの調製方法。 （２６）　−ＩＦＮ−αＡを特徴とする特許請求の範囲
   第７項記載のＤＮＡ配列がリンカ−配列を介して発現ベ
   クターｐＥＲ１０３に押入されることを特徴とする、生
   産プラスミド））ＥＲ３３の調製方法。 （２７）ｐＰＭ３１より単離したｐａｒ部位が特許請求
   の範囲第２６項により調製した生産プラスミドｐＥＲ６
   ３に挿入されることを％徴とする、生産プラスミドｐａ
   ｒｐＥＲ３５の調製方法。 （２８ｊ　　％許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列−
   個またはそれ以上を特許請求の範囲第２６項により調製
   した生産プラスミドに挿入することを％徴とする、第７
   項記載の−ＤＮＡ配列をいくつか含有する生産プラスミ
   ドめ調造方法。 ＠　特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列が特許請求
   の範囲第２６項により調製した生産プラスミドｐＥＲ５
   ５に挿入されることを特徴とする、生産プラスミドｐＥ
   Ｒ２１／１　の調製方法。 （至）　ヒトインタフエロンの内筒生産のために、特許
   請求の範囲第１６項〜第１７項記載の生産プラスミドを
   用いて適当な宿主を形質転換することを特徴とする、ヒ
   トインタフェロンの製造方法。 ０υ　たとえは、バクテリアＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
   ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌを宿主として用いることを特徴と
   する特許請求の範囲第２６項記載の方法。 ０ａ時許詞求の範囲第２３項または第２４項により製造
   されるＩＦＮ−αＡ０