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eue Oligonucleotide und Verfahren zu ihrer
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Herstellung Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Oligonucleotidf
der Formeln 5' dTCCTTA, 5' dCATCTTTA, 5' dCAGATCACA, 5' dAGCTTAAACC, 5' dAGCTTAAAGATG
und 5' dTGTGATCTGCCTCA, welche wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung der Ribosomenbindungssequenz
der Formel
und der Linkersequenz der Formel
darstellen. Diese beiden Sequenzen eignen sich zum Einbau in ein Expressions- oder
Produktionsplasmid, z.B. in das Plasmid pER 103 und pER 33 (siehe Deutsche Patentanmeldung
von Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim, vom gleichen Tage).
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Erfindungsgemäß erhält man die neuen Oligonucleotide durch Kettenwachstumssynthese
an dem ersten über die 3'-OH-Gruppe kovalent an einen polymeren Träger gebundenen
in 5'-Stellúng geschützten Nucleosid der allgemeinen Formel
in der R1 eine Schutzgruppe für eine HO-CH2-Gruppe, 4 B eine Thymin-1-yl-, N6-Acyl-adenin-9-yl-,
N -Acyl-cytosin-1-yl- oder N² -Acyl-guanin-9-ylgruppe und P einen polymeren Träger
darstellen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß nach Abspaltung der 5'-OH-Schutzgruppe
an dem ersten 3'-seitigen Nucleosid dieses mit einem entsprechenden Nucleosid-Derivat
der allgemeinen Formel
in der R1 und B wie oben definiert sind und X eine in der Nucleotidchemie übliche
Austrittsgruppe darstellt, umgesetzt und anschließend das so erhaltene Nucleosid
phosphorigsäure-Derivat oxidiert wird, nach Beendigung des 5- bis 13-maligen Oligonucleotidkettenaufbaus
die verwendete 5'-OH-Schutzgruppe, anschließend das so hergestellte Oligonucleotid
vom Träger und die verwendeten Methoxygruppen und N-Acyl-Schutzgruppen abgespalten
werden.
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Als Schutz gruppe für die HOCH2-Gruppe kommt beispielsweise die Triphenylmethyl-,
p,p'-Dimethoxy-triphenylmethyl-, p-Monomethoxy-triphenylmethyl-, 1-Ethoxyethyl-,
1-Butoxyethyl-, 2-Methoxy-2-propyl- oder 4-Methoxy-tetrahydropyran-4-yl-gruppe,
als polymerer Träger Silicagel, wobei die Verknüpfung beispielsweise über eine -O-Si(OC2H5)2-(CH2)3-NH-CO-CH2CH2-CO-Brücke
erfolgt, als N-Acylgruppe die Isobutyryl-, Benzoyl-, 4-Methoxybenzoyl-oder Isobutoxycarbonyl-Gruppe
und als Aüstrittsgruppe ein Chloratom, eine sekundäre oder heterocyclische Aminogruppe
wie die Dimethylamino-, Diethylamino-, Piperidino-, Morpholino- oder 1-Tetrazolylgruppe
in Betracht.
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Die einzelnen Reaktionsschritte werden hierbei zweckmäßigerweise wie
folgt durchgeführt: Die Abspaltung einer Schutzgruppe in 5'-Stellung erfolgt vorzugsweise
hydrolytisch in Gegenwart einer Säure, z.B. mit Zinkbromid in einem Lösungsmittel
wie Nitronmethan/Wasser, mit Trichloressigsäure in einem Lösungsmittel wie Nitromethan/Methanol
oder mit einer Sulfonsäure wie Benzol- oder Toluolsulfonsäure in einem Lösungsmittel
wie Acetonitril und bei Temperaturen zwischen 0 und 300C, vorzugsweise jedoch bei
Raumtemperatur.
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Die Ankondensation des nächsten Nucleotid-Bausteins erfolgt zweckmäßigerweise
unter Schutzgas, z.B. unter Argon, ig einem Lösungsmittel wie Pyridin oder Acetonitril,
gegebenenfalls in Gegenwart eines Protonendonators wie 1H-Tetrazol, und vorzugsweise
bei Temperaturen zwischen 0 und 300C, vorzugsweise jedoch bei Raumtemperatur.
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Die Oxidation des so erhaltenen Phosphorigsäuretriesters erfolgt mit
einem Oxidationsmittel wie Jod in einem Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran/Lutidin/t.Vasser
oder mit 3-Chlorperbenzoesäure in einem Lösungsmittel wie Dichlormethan und bei
Temperaturen zwischen 0 und 300C, vorzugsweise jedoch bei Raumtemperatur.
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Bevor die oben aufgeführten Reaktionsschritte jeweils bis zur Herstellung
des gewünschten Oligonucleotids wiederholt werden, wird vorzugsweise nach jedem
Reaktionszyklus eine im vorhergehenden Reaktionsschritt nicht umgesetzte 5'-OH-Gruppe
mittels Acylierung desaktiviert. Diese Desaktivierung wird vorzugsweise mit Acetanhydrid
in 4-Dimethylaminopyridin/Collidin/Tetrahydrofuran bei Raumtemperatur durchgeführt.
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Nach Beendigung des Kettenaufbaus werden vom so hergestellten Oligonucleotid
nach an sich bekannten Methoden sämtliche ver wendeten Schutzreste abgespalten,
beispielsweise werden die Methylgruppen von den Phosphatgruppen mittels eines starken
Nucleophils wie Thiophenol und die N-Acylgruppen mittels Ammoniak abgespalten. Außerdem
wird das Oligonucleotid hydrolytisch vom Träger abgespalten, beispielsweise mittels
Ammoniak.
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Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Legende
DMTr = p, p' -Dimethoxy-triphenylmethyl ibu = Isobutyryl bz = Benzoyl (am Basenstickstoff)
P = polymeres Trägermaterial B = Thymin oder N² -Isobutyrylguanin oder - N4-Benzoylcytosin
oder N6 N -Benzoyladenin THF = Tetrahydrofuran Herstellung der Ausganassrodukte:
Beispiel A Funktionalisierung des polymeren Trägermaterials Die Funktionalisierung
des polymeren Trägermatials erfolgte nach literaturbekannten Verfahren. Als Trägermaterial
diente HPLC-Silicagel (Macherey + Nagel, Korngröße 20 um, Porengröße 200 Es wurde
derivatisiert wie bei Mateucci und Caruthers beschrieben, mit der Ausnahme, daß
der Succinylierungsschritt mit Bernsteinsäureanhydrid in wasserfreiem Pyridin durchgeführt
wurde (siehe MD. Matteucci, Mtl. Caruthers, Tetrahedron Letters 21, 719 (1981),
J. Am. chem. Soc. 103, 3185 (1981) und auch T. Tanaka, R.L. Letsinger, Nucleic Acids
Research 101 3249 (1982)). Die geschützten Nucleoside wurden so entsprechend folgendem
Formelbild kovalent mit dem Silicagel verknüpft:
Die Beladungsdichte betrug zwischen 68 und 104 1uMol Nucleosid
pro g Trägermaterial.
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Beispiel B 5'-Dimethoxaytritvl-desoxythymidin-3'-chlormethOxyphosphit
Die voll geschützten Nucleosid-3'-chlormethoxyphosphit2 wurden nach literaturbekannten
Verfahren synthetisiert (.D. Matteucci, M.II. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103,
3185 (1981) und T. Tanaka. R.L. Letsinger, Nucleic Acids Research 10, 3249 (1982)).
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544,6 mg (1,0 mMol) 5'-Dimethoxytrityl-thymidin (DMTrdT) wurden in
1,0 ml absolutem THF gelöst und diese Lösung bei -78°C innerhalb 15 Minuten unter
Argon tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 0,9 mMol Methyl-dichlorphosphit
in 0,5 ml absolutem Pyridin und 2,0 ml absolutem THF gegeben. Nach weiteren 10 Minuten
wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur erwärmt und zentrifugiert. Der Uberstand
wurde mit einer Pipette in einen trockenen, mit Argon gefüllten Schliffkolben (25
ml) überführt.
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Bei Raumtemperatur wurde unter Vakuum das Lösungsmittel abgezogen,
danach je 0,5 ml Toluol und THF' hinzugegeben und erneut eingedampft, wobei als
Produkt ein farbloser schaumiger Feststoff zurückblieb. Dieses Produkt wurde nicht
auf seine Reinheit hin analysiert, sondern in 10,0 ml absolutem Pyridin gelöst und
diese Lösung unter Argon bei -200C bis zur weiteren Verwendung, maximal jedoch eine
Woche lang, aufbewahrt.
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Beispiel C 2 5'-Dimethoxytrityl-N -isobutyryl-desoxyguanosin-3'-chlormethoxyphosphit
Analog Beispiel B wurde eine Lösung dieses Nucleqsidphosphorochloridits in 10,0
ml Pyridin aus 640,0 mg (1,0 mNol) 5'-Di-2 methoxytrityl-N -isobutyryl-desoxyguanosin
hergestellt.
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Beispiel D 4 5' -Dimethoxytrityl-N -benzoyl-desoxycytidin-3 -chlormethoxyphosphit
Analog Beispiel B wurde eine Lösung dieses Nucleosidphosphorochloridits in 10,0
ml Pyridin aus 633,7 mg (1,0 mMol) 5'-Di-4 methoxy-trityl-N -benzoyl-desoxycytidin
hergestellt.
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Beispiel E 5'-Dimethoxytrityl-N6-benzoyl-desoxyadenosin-3'-chlormethoxyphosphit
Analog Beispiel B wurde eine Lösung dieses Nucleosidphosphorochloridits in 10,0
ml Pyridin aus 657,7 mg (1,0 mMol" 5'-Di-6 methoxytrityl-N -benzoyl-desoxyadenosin
hergestellt.
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Beispiel F 5' -Dimethoxytrityl-desoxythymidin-3'-N,N-dimethylamino-methoxyphosphit
Dieses Nuclessid-N,N-dimethylamino-methoxyphosphit wurde unter Abwandlung einer
Vorschrift von Beaucage und Caruthers synthetisiert (S.L. Beaucage, M.H. Caruthers,
Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)). 544,6 mg (1,0 mEtol) 5'-Dimethoxytrityl-desoxythymidin
wurden in eine Lösung von 5 mMol Diisopropylethylamin in 3,0 ml Chloroform gegeben.
Die Lösung wurde gerührt und unter Argon wurden bei Raumtemperatur 1,2 mMol Chlor-N,N-dimethylamino-methoxy-phosphin
innerhalb von 2 Minuten zugetropft. Nach weiteren 10 Minuten wurde die Lösung mit
35 ml Essigester in einen 150 ml-Scheidetrichter überführt und viermal mit je 20
ml gesättigter S.ochsalz-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde dann über
wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet und im Wasserstrahlvakuum
bis zur Trockne eingedampft.
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Der Rückstand wurde in 10 ml Toluol gelöst und das Produkt durch Einrühren
in gekühltes n-Hexan (-78°C) ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit kalten
n-Hexan gewaschen, im Vakuum getrocknet und unter Argon aufbewahrt Beispiel G 5'-Dimethoxytrityl-N²
-isobutyryl-desoxyguanosin-3'-N ! N-dimethylamino-methoxypho sphit Hergestellt analog
Beispiel F aus 640,0 mg (1,0 mP4ol) 5'-Dimethoxytrityl-N2-isobutyryl-desoxyguanosin.
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Beispiel H 5'-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-desoxycytidin-3"-N,N-dimethylamino-methoxyphosphit
Hergestellt analog Beispiel F aus 633,7 mg (1,0 mbnol) 5'-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-desoxycytidin.
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Beispiel I 6 5'-DimethOxytrityl-N6-benzoyl-desoxyadenosin-3'-N,N-dimethylamino-methoxypho
sphit Hergestellt analog Beispiel F aus 657,7 mg (1,0 mMol) 5'-Dimethoxytrityl-N6-benzoyl-desoxyadenosin.
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Beispiel 1 Synthese von d-TCCTTA bz 50 mg (#5µMol) des mit DMTrdAbz
beladenen polymeren Trägers (siehe Beispiel A) wurden in eine Glasfritte gefüllt.
Entsprechend der folgenden Auflistung wurden dann verschiedene Lösungsmittel und
Reagenzienlösungen hinzugefügt, der Träger darein kurz aufgeschüttelt, und die Lösung
nach der gewünschten Umsetzung wieder entfernt, indem sie mit Hilfe eines Argon-Gasstromes
von oben durch die Fritte hindurchgepreßt wurde.
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a) Abspaltung der DMTr-Gruppe mit 3 ml einer Lösung aus 70 g Zinkbromid,
500 ml Nitromethan und 5 ml Wasser.
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Reaktionszeit: 10 Minuten.
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b) 4 x Waschen mit je 3 ml einer Mischung aus n-Butanol-Lutidin-THF
(4:1:5).
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c) 4 x Waschen mit je 4 ml absolutem Pyridin.
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d) Ankondensation des nächsten Nucleotid-Bausteines: 1 ml der Pyridin-Lösung
von 5'-Dimethoxytrityl-desoxythymidin-3'-chlormethoxyphosphit (Beispiel B) (ca.
100 pMol) wurden unter Argon in die Fritte zu dem polymeren Träger gegeben und dieser
in der Lösung aufgeschüttelt.
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Reaktionszeit: 10 Minuten.
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e) 3 x Waschen mit je 3 ml absolutem Pyridin.
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f) Oxidation des Phosphorigsäure-Triesters mit 100 mg Jod, gelöst
in 3 ml eines Gemisches aus THF, Lutidin und Wasser (2:2:1).
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Reaktionszeit: 7 Minuten.
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g) 3 x Waschen mit je 4 ml THF.
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h) Acetylierung der nicht umgesetzten 5'-OH-Gruppen mit einer Lösung
aus 150 mg 4-Dimethylaminopyridin, 0,3 ml Collidin, 0,25 ml Acetanhydrid und 2,5
ml THF.
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Reaktionszeit: 5 Minuten.
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i) 4 x Waschen mit je 3 ml Nitromethan.
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Dieser Zyklus von a) bis i) wurde nun vier weitere Male wiederholt,
wobei bei Schritt d) der für die Sequenz jeweils benötigte Nucleotid-Baustein eingesetzt
wurde.
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Ausbeute-Bestimmung: Nach Ankondensieren des letzten Nucleotid-Bausteines
wurde das Trägermaterial im Olpumpenvakuum getrocknet, eine Probe von ca.
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1 mg genau abgewogen und mit ,o,0 ml einer 0,1 m Lösung von Toluolsulfonsäure
in Acetonitril versetzt. Durch die dabei eintretende Abspaltung des Dimethoxytrityl-Kations
erhält man eine orange-rot gefärbte Lösung, deren Absorbtion bei 498 nm gemessen
wurde. Nach der Formel 498 Beladung/uMol/g7 = <Abs. ) . (Verdünnungsfaktor) 14,3
Gewicht des Trägers /eng/ läßt sich die Beladung des Träger-Materials mit Dimethoxytrityl-Schutzgruppen
berechnen. Man erhielt: 43 rol/g. Dies entspricht einer durchschnittlichen Ausbeute
von 85 % pro Kondensationsschritt.
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Abspaltung der Methyl-Reste von den Phosphorsäuretriester-Gruppen:
Das Trägermatial wurde 45 Minuten lang in 4 ml einer Lösung von Thiophenol, Triethylamin
und Dioxan (1:1:2) geschüttelt, anschließend mit Methanol, dann mit Ether gewaschen.
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Abspaltung der Basen-Schutzgruppen und gleichzeitige Abspaltung der
Hexanucleotid-Kette vom polymeren Träger. Das Trägermaterial wurde 14 Stunden lang
mit 10 ml konz. Ammoniak auf 50°C erwärmt, die wäßrige Lösung dann abgesaugt und
das Filtrat auf ca. 2 ml eingeengt.
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Reinigung des Produkts: Sas so erhaltene Rohprodukt, das am 5'-Ende
noch eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe trug, wurde der Reversed-Phase-HPLC unterworfen.
Säule: »-Bondapak C18 Fa. Waters; Eluans: 0,1 m Triethylammoniumacetatpuffer pH
7 mit 25 % Acetonitril; Fluß 2 ml/min.; Retentionszeit: 14 Minuten. Die gesammelten
Elutionsfraktionen wurden auf ca. 1 ml eingeengt, mit 10 ml 80 % Essigsäure versetzt
und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurde bei 500 c im Vakuum
zur Trockne eingeengt, der Rückstand in 25 ml Wasser gelöst und das abgespaltene
Dimethoxytritanol mit 3 x 15 ml Ether extrahiert. Die wäßrige Phase wurde erneut
bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand in 2,5 ml Wasser gelöst, über Biogel P
2 (Säule: 60 x 1,7 cm) entsalzen und lyophilisiert.
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Analyse des Produkts: Als Reinheitskontrolle diente ausschließlich
das analytische HPLC-Diagramm (Säule: 300 x 3,9 mm, p-Bondapak C18, Fa. Waters;
Eluans: 0,1 m Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 12 % Acetonitril; Fluß: 1,5
ml/min.; Retentionszeit: 3,7 Minuten).
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Variation des Syntheseweges: Das gleiche Hexadeoxynucleotid d-TCCTTA
wurde unter Verwendung der geschützten Nucleosid-3'-N,N-dimethylamino-methoxyphosphite
(Beispiel F und Beispiel H) synthetisiert. Dazu wurde der Reaktionszyklus in folgender
Weise geringfügig abgewandelt:
Ansatz: 100 mg (10 nMol) DMTrdA
# XJ wurden unter Argon in eine Fritte gefüllt.
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a) Abspaltung der DMTr-Gruppe mit 3 ml einer Lösung aus 70 g Zinkbromid,
500 ml Nitromethan und 5 ml Wasser.
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Reaktionszeit: 10 Minuten.
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b) 4 x Waschen mit je 3 ml einer Mischung aus n-Butanol-Lutidin-THF
THF (4:1:5).
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c) 4 x Waschen mit je 4 ml absolutem Acetonitril.
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d) Ankondensation des nächsten Nucleotid-Bausteines: Lösung aus 65
mg (100 µMol) 5'-Dimethoxytrityl-desoxythymidin-3'-N,N-dimethylamino-methoxy-phosphit
und 35 mg (500 Mol) 1H-Tetrazol in 4 ml absolutem Acetonitril.
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Reaktionszeit: 45 Minuten.
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e) 3 x Waschen mit je 4 ml Acetonitril.
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f) Oxidation des Phosphorigsäure-Triesters mit 250 mg Jod, gelöst
in 5 ml eines Gemisches aus THF, Lutidin und Wasser (2:2:1).
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Reaktionszeit: 7 Minuten.
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g) 3 x Waschen mit je 4 ml THF.
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h) Acetylierung der nicht umgesetzten 5'-OH-Gruppen mit einer Lösung
aus 150 mg 4-Dimethylaminopyridin, 0,3 ml Collidin, 0,25 ml Acetanhydrid und 2,5
ml THF.
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Reaktionszeit: 5 Minuten.
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i) 4 x Waschen mit je 3 ml Nitromethan.
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Nach Beendigung des Kettenaufbaus wurde wie oben die Ausbeute bestimmt:
Man erhielt eine Beladungsdichte von 37 pol/g. Dies entspricht einer durchschnittlichen
Ausbeute von 82 % pro Kondensationsschritt.
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Aufarbeitung, Reinigung und Charakterisierung des Produktes wurden
wie oben beschrieben durchgeführt.
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Beispiel 2 Synthese von d-AGCTTAAACC Hergestellt analog Beispiel 1
ausgehend von 200 mg DroTrdCbzX (16 pMol).
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HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 3,9 mm, p-Bondapak C18, Fa.
Waters; Eluans: 0,1 m Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 12 % Acetonitril: Fluß:
1,5 ml/min; Retentionszeit: 3,4 Minuten.
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Beispiel 3 Synthese von d-CATCTTTA Hergestellt analog Beispiel 1 ausgehend
von 150 mg (13,2 MMol) DMTrdAbZ HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 7,8 mm,
ji-Bondapak C18, Fa. Waters: Eluans: 0,1 m Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit
20 % Acetonitril; Fluß: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 7,7 Minuten.
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Beispiel 4 Synthese von d-AC-CTTAAAGATG Hergestellt analog Beispiel
1 ausgehend von 200 mg (16,2 rol)
DMTrdGibU P HPLC-Diagramm des
Produkts: Säule: 300 x 7,8 mm, p-Bondapak C18, Fa. Waters; Eluans: 0,1 m Triethylammoniumacetatpuffer
pH 7 mit 26 % Acetonitril; Fluß: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 5,2 Minuten.
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Beispiel 5 Synthese von d-TGTG.TCTGCCTCA Hergestellt analog Beispiel
1 ausgehend von 250 mg (22 juMol) DMTrdAbz P HPLC-Diagramm des Produkts: Säule:
300 x 7,8 mm; µ-Bondapak C C18; Fa. Waters; Eluans: 0,1 m Triethylammoniumacetatpuffer
pH 7 mit 25 % Äcetonitril; Fluß: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 6,t Minuten.
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Beispiel 6 Synthese von d-CAGATCACA Hergestellt analog Beispiel 1
ausgehend von 150 mg (13,2 uMol) DMTrdAbZ P .
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HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 7,8 mm; p-Bondapak C18; Fa.
Waters; Eluans: 0,1 m Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 20 % Acetonitril; Fluß:
2,0 ml/min; Retentionszeit: 5,2 Minuten.
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Analyse der Oligodeoxynucleotide Die Sequenzanalyse der sechs synthetischen
Oligodeoxynucleotide (Beispiele1 bis 6) wurde durchgeführt, nachdem sie mit Hilfe
von DNA-Ligase zu einer Ribosomenbindungsseguenz und zu einer Linkersequenz zusammengefügt
und diese so erhaltenen doppelsträngigen DNA-Seauenzen in das Interferonproduktionsplasmid
pER
33 eingebaut worden waren (siehe Deutsche Patentanmeldung von Boehringer Ingelheim
International GmbH, 6507 Ingelheim, vom gleichen Tage).
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Dazu wurde das Plasmid pER 33 von der Promotor/Operator-Region weg
bis ins Interferongen hinein sequenziert. Die Sequenzanalyse wurde nach der literaturbekannten
Methode von Maxam und Gilbert (siehe Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977))
durchgeführt und erfolgte von der am 3'-Ende radioaktiv markierten Eco RI-Spaltstelle
ausgehend in Richtung Interferongen.
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In der folgenden Figur sind alle zur Konstruktion von pER 33 verwendeten
Oligodeoxynucleotid-Fragmente zu sehen. Damit ist die Richtigkeit der Basenabfolge
in den Oligodeoxynucleotiden aus den Beispielen 1 bis 6 belegt:
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