DE69111807T2

DE69111807T2 - Phosphoramidit derivate, ihre herstellung und ihre verwendung zum einbau der markengruppen zum oligonukleotidenaufbau.

Info

Publication number: DE69111807T2
Application number: DE69111807T
Authority: DE
Inventors: M J Medical Research Coun Gait; K Medical Research Cou Misiura
Original assignee: Amersham International PLC
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1990-05-03
Filing date: 1991-05-03
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2011-05-04
Also published as: CA2081320A1; GB9009980D0; US5864032A; EP0527184A1; DE69111807D1; WO1991017169A1; US5567811A; EP0527184B1; JPH05507074A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf bestimmte neuartige Phosphoramidit- Derivate, speziell Biotinyl- und Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit-Derivate, die sich beim Einbau einzelner oder mehrerer Markergruppen zum Oligonucleotidenaufbau als geeignet erweisen. Außerdem werden die Prozesse zur Herstellung dieser Phosphoramidit-Derivate aufgezeigt.
Chemisch markierte Oligonucleotide werden heute weit verbreitet als Hybridisierungssonden zum Nachweis spezifischer Gensequenzen eingesetzt, darunter auch solcher, die mit humangenetischen Erkrankungen in Zusammenhang stehen. Diese Sonden werden z. B. mit Biotin markiert, das infolge seiner Affinität zur Bindung an die Proteine Avidin und Streptavidin gut nachweisbar ist. Biotin stellt daher in bestimmten Fällen im Vergleich zur Verwendung radioaktiver Markierungen (z. B. 32p) die sicherere und bequemere Art der Markierung dar. Außer als Hybridisierungssonde wird biotinmarkierte synthetische DNA (vor allem 5'- biotinylierte Oligonucleotide) bei Gennachweisen mittels Ligase, in der direkten Didesoxy-Sequenzierung im Anschluß an die Polymerase-Kettenreaktion und bei nichtradioaktiver DNA-Sequenzierung verwendet. Bisher fehlte jedoch eine effektive und einfache Methode zur Herstellung dieser Materialien, so daß deren Verwendung nur eingeschränkt möglich war.
Zur Anlagerung einer einzelnen Biotin-Komponente oder anderer einzelner Markergruppen an das 5'-Ende eines synthetischen Oligodesoxyribonucleotids sind zahlreiche Verfahren bekannt. Bei der Mehrzahl dieser Verfahren wird beim apparaturgestützten Aufbau des Oligonucleotids als letztes ein Linker- Phosphoramidit oder H-Phosphonat angekoppelt¹&supmin;&sup4;. Nach der Entfernung der Schutzgruppe bildet sich am 5'-Ende des Oligonucleotids eine Amino-. Thiol- oder andere funktionelle Gruppe, die dann in einem gesonderten Schritt mit einem aktivierten Biotin-Derivat zur Reaktion gebracht werden muß.
US 4,908,453 gibt Aufschluß über Reagenzien für eine einzelne 5'- Biotinylierung von Oligonucleotiden.
Die am häufigsten eingesetzten Verfahren zur Anlagerung von mehreren Biotinen sowie anderer Markierungen beruhen auf der Herstellung eines Nucleosid- Derivats, das speziell auf die heterozyklische Base hin ausgerichtet wurde, um bei der Entfernung der Schutzgruppe eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe freizusetzen. Das ausgerichtete Nucleosid wird entweder enzymatisch5,6 oder chemisch als Phosphoramidit-Derviat7,8 eingebaut. Wiederum ist ein zusätzlicher Schritt notwendig, um die funktionellen Gruppen in die entsprechenden polybiotinylierten Formen umzuwandeln. In jüngerer Zeit haben Roget et al.&sup9; den Nachweis erbracht, daß der Einsatz von 4-N-(6-N-Biotinylaminohexyl)-2'-0- desoxycytidin (oder -5-Methyl-2'-desoxycytidin) möglich ist, das als Phosphoramidit beim apparaturgestützten Aufbau von Oligonucleotiden derivatisiert wird, um bei der Entfernung der Schutzgruppe biotinylierte Nucleotidschwänze zm 5'-Ende der Oligonucleotide zu bilden. 45-mer-Oligonucleotide, denen auf diese Art und Weise ein Schwanz angefügt wurde, sollen sich bei der In-situ-Hybridsierung mit einem streptavidin-alkalischen Phosphatase-Nachweisverfahren im Vergleich zu den gleichen 45-mer-Oligonucleotiden, denen enzymatisch am 3'-Ende durch Biotin- dUTP ein Schwanz angefügt wurde¹&sup0;, empfindlicher verhalten, obwohl keine Aussagen zu den verwendeten Mengen gemacht wurden.
Cytidin-Derivate, die am Heterozyklus mit Biotin ausgerichtet wurden, sind nicht sonderlich geeignet, da die 4-Thiodesoxynucleosid-Ausgangsstoffe teuer sind. Außerdem schränkt der Einsatz von Oligonucleotidschwänzen u. U. die stereochemische Zugänglichkeit der Biotinkomponenten ein bzw. verändert die Hybridisierungseigenschaften der Oligonucleotidsonde, an die sie angelagert werden. Daher wäre der Einsatz eines viel einfacheren, nicht-nucleosidischen Linker-Phosphoramiditreagens wünschenswert, das den Einbau von mehreren Biotinen oder anderen Markergruppen zuläßt.
In jüngster Zeit haben Nelson et al.¹¹ darüber berichtet, daß eine 3-Amino- 1,2-propandiol-Einheit so ausgerichtet werden kann, daß ein Phosphoramidit zur Verfügung steht, das beim Aufbau von Oligonucleotiden verwendet werden kann. Nach der Entfernung der Schutzgruppen besitzt das Oligonucleotid einen 5'-Schwanz aliphatischer primärer Aminogruppen an einem sich wiederholt verzweigenden 3- Carbon-Rückgrat. Fünf derartige Einheiten können zwar erfolgreich am 5'-Ende eines Oligonucleotids angelagert werden, aber die anschließende Ausrichtung mit Biotin ist nur bei 65 % der Aminogruppen möglich. Erst in allerjüngster Zeit haben Haralambidis et al.¹² über den Einbau von bis zu 10 Biotin-Resten am 3'-Ende eines Oligonucleotids durch eine Kombination präparativer Peptid- und Oligonucleotid- Chemie in Festphase berichtet. Ein Nachteil dieser Herangehensweise ist aber, daß für den Aufbau des Peptid-Oligonucleotid-Komposits zwei unterschiedliche Apparate notwendig sind. Außerdem muß das Biotin nach dem Aufbau der Polyamid-Kette konjugiert werden.
Bei Biotin oder anderen chemisch stabilen Markergruppen wäre es vorteilhaft, diese direkt in das Phosphoramidit-Derivat einzubauen, anstatt auf eine Ausrichtung nach dem Aufbau zu setzen. Es gab zwar in jüngerer Zeit zwei Berichte zu Biotinyl-Linker-Phosphoramiditen, denen zufolge diese zur Anlagerung einzelner Biotinkomponenten an das 5'-Ende synthetischer Oligonucleotide vewendet wurden13,14, unserer Kenntnis nach wurde aber kein Biotinyl-Linker-Phosphoramidit beschrieben, das einen Einbau mehrerer Biotine in ein synthetisches Oligonucleotid zuläßt.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung und die Synthese eines Biotinyl-Linker-Phosphoramidits sowie eines Linker-Phosphoramidits zu vereinfachen, das die alternative Markergruppe, Phosphotyrosin, enthält, die bisher nicht in Verbindung mit Nucleinsäuresonden verwendet wurde.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Phosphoramidit-Derivat mit folgender Formel:
X = eine Markergruppe
Y und Z = Schutzgruppen
Die Markergruppe (X) kann eine Hapten- oder eine andere nachweisbare Komponente enthalten. In Frage kommen u.a. Biotin, Dinitrophenyl, Dansyl und Fluoresceinyl. Zwischen der Markergruppe und dem Rest des Moleküls kann sich u. U. ein Linkerarm nicht festgelegter Länge befinden. Als Schutzgruppen (Y und Z) können z. B. 4,4'-Dimethoxytrityl, Trifluoracetyl oder Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) zum Einsatz kommen.
Darüber hinaus beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des oben genannten Biotinyl-Phosphoramidit-Derivats (V), das die folgenden Schritte umfaßt:
i) Reaktion von Solketal mit Acrylnitril zum Additionsprodukt 2- Cyanethylsolketal (I):
ii) Reduktion der entstandenen Verbindung (I) zu 3-Aminopropylsolketal (II):
iii) Reaktion der entstandenen Verbindung (II) mit Biotin-N-hydroxysuccinimid zu N-Biotinyl-3-aminopropylsolketal (III):
iv) Reaktion der entstandenen Verbindung (III) mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid zu 1-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-0-(N-biotinyl-3-aminopropyl)glycerol (IV):
v) Phosphorylierung der entstandenen Verbindung (IV) zum gewünschten Biotinyl-Phosphoramidit-Derivat (V):
DMTr = 4,4'-Dimethoxytrityl
Darüber hinaus beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des oben genannten Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit-Derivats (XII), das die folgenden Schritte umfaßt:
i) Reaktion des L-Tyrosinbenzylesters mit 9-Fluorenylmethylchlorformiat zu N- Fluorenylmethoxycarbonyl-L-tyrosinbenzylester (VI):
ii) Phosphorylierung der entstandenen Verbindung (VI) mit anschließender Oxidation zu N-Fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2-cyanethyl)phosphat]-L- tyrosinbenzylester (VII):
iii) Debenzylierung der entstandenen Verbindung (VII) zu N- Fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2-cyanethyl)phosphat]-L-tyrosin (VIII):
iv) Reaktion der entstandenen Verbindung (VIII) mit Pentafluorphenol zum entsprechenden Pentafluorphenyl-Derivat (IX):
v) Kopplung der entstandenen Verbindung (IX) an 3-Aminopropylsolketal (II), Entfernung der Isopropyliden-Gruppe vom entstandenen Solketal-Derivat mit anschließender Reaktion des Produkts mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid und Phosphorylierung des sich daraus ergebenden Produkts zum gewünschten Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit-Derivat (XII):
DMTr = 4,4'-Dimethoxytrityl
und
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem in einer weiteren Realisierung ein Verfahren zur Einzel- oder Mehrfachmarkierung von synthetischen Oligonucleotiden, das die Verwendung des oben genannten Biotinyl-Phosphoramidit- Derivats (V) oder Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit-Derivats (XII) einschließt. Der Einbau der Einzel- oder Mehrfachmarkierung kann dabei am 5'-Ende oder am 3'-Ende des Oligonucleotids bzw. an jedem anderen Punkt der Kette erfolgen.
Für Phosphoramidit-Derivate ist eine ganze Reihe von Einsatzmöglichkeiten denkbar. Dazu gehören die Verwendung zur Herstellung von Oligonucleotiden, die als Hybridisierungssonden eingesetzt werden sollen, die Verwendung zum Einfangen (Capture) von Nucleinsäuren auf festen Trägermatrizen, die aus Festphasen- oder Lösungsphasen-Hybridisierungsreaktionen hervorgehen, die Verwendung als Primer in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain Reaction) oder als Primer in Nucleinsäure-Sequenzierungsreaktionen, die Verwendung bei der Herstellung von Matrizen für die Affinitäts-Chromatografie zur Reinigung von DNA-bindenden Proteinen und anderen Biomolekülen, die Verwendung als Mittel zur Beobachtung von Einbaureaktionen, die Verwendung bei der Herstellung einer Zufallsauswahl markierter Sonden zum Nachweis des Gesamtgehalts an Nucleinsäure in Substanzproben durch Hybridisierung, die Verwendung in Sandwich-Hybridisierungsverfahren, in denen eine markierte Sonde als Einfänger und eine weitere Sonde mit einer anderen Markierung als Marker agiert, die Verwendung zur Gewinnung eines biotinylierten oder haptenylierten Oligonucleotids, das in allen Protokollen zur DNA- Manipulierung eingesetzt werden kann, und die Verwendung zum Klonieren von rekombinierter DNA und bei der In-vitro-Mutagenese.
Die Phosphoramidit-Derivate dieser Erfindung enthalten eine repetitive Linkereinheit. In beiden Fällen besteht diese aus einem einfachen 3-Carbon- Glyceryl-Rückgrat, das höchste Flexibilität sowie gute Löslichkeitseigenschaften in Wasser verleiht. Im folgenden wird im Reaktionsschema 1 (Biotinyl- Phosphoramidit) und Reaktionsschema 2 (Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit) die Herstellung der Verbindungen genauer beschrieben. Schema 1 Die Reaktion des leicht verfügbaren Solketals mit Acrylnitril in Gegenwart von Natriumhydrid in Tetrahydrofuran führt zum Additionsprodukt 2- Cyanethylsolketal (I) mit einer Ausbeute von 79 %. Die Reduktion des Nitrils (I) muß unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen erfolgen, da bekannt ist, daß der Einsatz von starken Reduktionsmitteln (wie z. B. Lithiumaluminiumhydrid) zu bevorzugten Eliminierungen führt. Die besten Ergebnisse wurden mit Natriumborhydrid in Anwesenheit von Cobalt(II)-chlorid in methanolischer Lösung¹&sup5; erzielt. Das dabei entstehende 3-Aminopropylsolketal wurde durch Destillation mit einer Ausbeute von 43 % gereinigt. Die Reaktion des Amins (II) mit Biotin-N- hydroxysuccinimid in DMF-Lösung ergab N-Biotinyl-3-aminopropylsolketal (III) mit einer Ausbeute von 89 %.
Das Biotin-Derivat (III) wurde mit einem Gemisch aus 1 M Salzsäure und Tetrahydrofuran (1:1) behandelt, um die Isopropylidin-Gruppe zu entfernen. Das Produkt wurde, ohne Isolierung, mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in nicht wäßrigem Pyridin zur Reaktion gebracht, um 1-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-0-(N-biotinyl-3- aminopropyl)glycerol (IV) zu erhalten, das durch Säulenchromatografie mit Siliciumdioxid mit einer Ausbeute von 63 % gereinigt wurde. Die Phosphorylierung der Verbindung (IV) erfolgte mit einem äquimolaren Anteil von 2-Cyanethyl-N,N- diisopropylaminochlorphosphit¹&sup6; in Tetrahydrofuran in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin. Unter diesen Bedingungen entsteht als Hauptprodukt das gewünschte einfach phosphorylierte Produkt 1-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-0-(N- biotinyl-3-aminopropyl)glyceryl 2-0-(N,N-diisopropylamino)phosphit (V), das sich durch Säulenchromatografie mit Siliciumdioxid mit einer Ausbeute von 58 % gut abtrennen läßt. Das ³¹P-NMR-Spektrum der Verbindung V zeigt lediglich 4 Peaks von annähernd gleicher Intensität, die den vier möglichen Diastereomeren entsprechen. In der analytischen Umkehrphasen-HPLC fanden sich 90 % der UV-Absorption in zwei eng beieinander liegenden Elutionspeaks, die vermutlich jeweils einem Diastereomeren-Paar entsprechen.
Auch die Ausgangsverbindung IV wurde als spätere eluierte Fraktion mit einer Ausbeute von 32 % aus der Siliciumdioxid-Säule gewonnen. Eine geringe Menge eines doppelt phosphorylierten Produkts wurde im Rohpräparat gefunden, dessen Bildung wesentlich durch die Verwendung eines Reagensüberschußes bei der Phosphorylierung verstärkt wurde. Die Ergebnisse der 31P-NMR-Untersuchung weisen darauf hin, daß diese Verunreinigung eine Phosphit-Komponente enthält, die am Biotinring bei N-3 angelagert ist, was den Ergebnissen von Alves et al.¹³ entspricht.

Schema 2

Bei Herstellung eines geeigneten tyrosinphosphathaltigen Phosphoramidit- Derivats muß man sich mit der Frage beschäftigen, wie die Phosphatgruppe des Tyrosin geschützt werden kann. Analog zu den Nucleosid-Phosphat-Derivaten wurde davon ausgegangen, daß bereits ein Bis(2-cyanethyl)-Schutz zu ausreichender Stabilität unter sauren Bedingungen führt. Dieser muß diesen Überlegungen zufolge aber unter den Bedingungen, unter denen Basenschutzgruppen entfernt werden, mit wäßrigem Ammoniak zu entfernen sein. Für den N-Schutz wurde die Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe gewählt¹&sup9;.
Die Reaktion des L-Tyrosinbenzylesters mit 9-Fluorenylmethylchlorformiats in Pyridin bei 0 ºC ergab nach der Auskristallisierung N-Fluorenylmethoxycarbonyl- L-tyrosinbenzylester (VI) mit einer Ausbeute von 84 %. Die Phosphorylierung der Verbindung VI mit Bis(2-cyanethyl)-N,N-diisopropylaminophosphin in Acetonitril in Gegenwart von Tetrazol ergab nach Oxidation mit 3-Chlorperbenzoesäure kristallinen N-Fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2-cyanethyl)phosphat]-L-tyrosinbenzylester (VII) mit einer Ausbeute von 86 %. Die Debenzylierung der Verbindung VII erfolgte mit Wasserstoff (Pd/C). Der gleichzeitige Verlust der Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe wurde durch Verwendung von Ethylacetat als Co-Lösungsmittel zum Ethanol so gering wie möglich gehalten. Die geringen Mengen des freigesetzten Dibenzofulven wurden durch Diethylether-Extraktion entfernt und das gewünschte N- Fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2-cyanethyl)phosphat]-L-tyrosin (VIII) wurde durch Extraktion aus saurer Lösung in Ethylacetat gereinigt und mit einer Ausbeute von 65 % isoliert.
Die Behandlung des Tyrosin-Phosphat-Derivats VIII mit einem Gemisch aus 0.1 M Salzsäure und Tetrahydrofuran (1:1) über 3 Stunden bei Raumtemperatur führte zu einem Verlust der Phosphat-Gruppe, der unter 5 % lag. Durch die Behandlung der Verbindung VIII mit konzentriertem Ammoniak in einem verschlossenen Röhrchen bei 60 ºC über 5 Stunden wurden beide 2-Cyanethyl-Gruppen vollständig entfernt, wobei nur eine Spur Phosphat verloren ging.
Die Reaktion der Verbindung VIII mit Pentafluorphenol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid in Dioxan-Lösung ergab das entsprechende Pentafluorphenyl- Derivat (IX) mit einer Ausbeute von 82 %. IX wurde dann an das 3-Aminopropylsolketal (II) in DMF-Lösung gekoppelt. Nach der anschließenden Säulenchromatografie mit Siliciumdioxid wurde N-Fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2- cyanethyl)phosphat]-L-tyrosinyl-3-aminopropylsolketal (X) mit einer Ausbeute von 86 % gewonnen. Die Isopropyliden-Gruppe des Solketal-Derivats x wurde mit Hilfe von 1 M Salzsäure/Tetrahydrofuran entfernt und das Produkt wurde ohne Isolation in Pyridin-Lösung mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid zur Reaktion gebracht. Nach der Säulenchromatografie mit Siliciumdioxid ergab das 1-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-0- (N-[N-fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2-cyanethyl)phosphat]-L-tyrosinyl]-3- aminopropyl)glycerol (XI) mit einer Ausbeute von 70 %. Die Phosphorylierung der Verbindung xI durch 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphit in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin ergab nach Säulenchromatografie mit Silciumdioxid das entsprechende 2-0-(N,N-Diisopropylamino)(2-cyanethyl)phosphit-Derivat (XII) als festen Schaum mit einer Ausbeute von 44 %. Im ³¹P-NMR-Spektrum der Verbindung xII zeigten sich entsprechend dem Tyrosyl-Phosphat ein Dublett bei δ -148.65 und -148.64 sowie drei Peaks bei δ 7,41, 7,68 und 7,96 im Verhältnis von 1:1:2. Die letztgenannten 3 Signale wurden wahrscheinlich verursacht, weil infolge der Chiralität am C-2 der Glyceryl-Komponente und am P der Phosphit-Gruppe die erwarteten 4 Diastereomere lediglich partiell aufgetrennt wurden. Schema 1 Synthese des Biotinyl-Phosphoramidits
(i) NaH, CH&sub2;=CH&sub2;CN, THF
(ii) CoCl&sub2;, NaBH&sub4;, MeOH
(iii) Biotin-NHS, DMF
(iv) Hclaq, THF
(v) DMTrCl, Py
(vi) ClPN(iPr)&sub2;OCH&sub2;CH&sub2;CN, CH&sub3;CH&sub2;N(iPr)&sub2;, THF Schema 2 Synthese des Phosphotyrosinyl-Phosphoramidits
(i) Fmoc-Cl, Py
(ii) (iPr)&sub2;NP(OCH&sub2;CH&sub2;CN)&sub2;, Tet, CH&sub3;CN
(iii) 3-Chlorperbenzoesäure, CH&sub3;CN
(iv) H&sub2;, Pd/C, EtOH, Ethylacetat
(v) PFP, DCC, Dioxan
(vi) II, DMF
(vii) wäßrige HCL, THF
(viii) DMTrCl, Py
(ix) ClPN(iPr)&sub2;OCH&sub2;CH&sub2;CN,CH&sub3;CH&sub2;N(iPr)&sub2;, THF
Das Phosphoramidit (V) wurde in den letzten Kopplungsschritten zum Oligonucleotidenaufbau in einem Phosphoramidit-Verfahren¹&sup7; mit einem Applied Biosystems-380B-3-Säulen-DNA-Synthesizer verwendet. Die 17-merd(GTAAAACGACGGCCAGT)-Sequenz wurde zeitgleich dreimal aufgebaut (entsprechend der Sequenz des universellen M13-Sequenzierungsprimers¹&sup8; mit jeweils ein, zwei oder vier zusätzlichen Kopplungszyklen mit Phosphoramidit (V) im Anschluß an den Aufbau der Kern-Oligonucleotid-17-mere). Die durchschnittliche Effizienz bei der Addition von Phosphoramidit (V) lag bei 99 %. Auf diesen Wert läßt sich durch die Freisetzung von Dimethyloxytrityl-Kationen vor den weiteren Kopplungsschritten schließen. Die letzte Dimethoxytrityl-Endgruppe des Aufbaus wurde nicht entfernt, damit die primäre Hydroxyl-Endgruppe in einer inaktivierten Konfiguration verbleibt. Dadurch wird verhindert, daß die Hydroxyl-Endgruppe der Glyceryl- Komponente während der sich anschließenden Behandlung mit Ammoniak die nächstgelegene Phosphatverbindung angreift, was zu einer Eliminierung der Glyceryl-Endgruppe führen würde.
Nach vollständiger Entfernung der Schutzgruppen wurden die drei 17-mere durch eine Umkehrphasen-Chromatografie gereinigt. Dabei erschien in allen drei Fällen eine wichtige Komponente des gewünschten Produkts (Abbildungen 1, 2 und 3). Es wird deutlich, daß das einfach biotinylierte 17-mer (bio)&sub1;-17 im Vergleich zu einer nicht-biotinylierten Vergleichsprobe in seiner Mobilität abgeschwächt wurde. Das doppelt biotinylierte 17-mer (bio)&sub2;-17 wurde noch weiter abgeschwächt und beim vierfach biotinylierten 17-mer (bio)&sub4;-17 war die Abschwächung nochmals größer. Damit erweist sich die Umkehrphasen-Chromatografie sowohl für die Reinigung als auch für die Beurteilung der Homogenität der biotinylierten Oligonucleotide als geeignet. Die vollständige Isolation ergab nach Aufbau und Reinigung für (bio)&sub1;- 17, (bio)&sub2;-17 bzw. (bio)&sub4;-17 eine Aubeute von 26 %, 25 % bzw. 19 % entsprechend der Menge des ersten an den Träger angelagerten Nucleosids.
Durch den Aufbau des gleichen 17-mer wurde auch ein 5'-Schwanz mit acht Biotinen hergestellt, an den dann nacheinander 8 Biotinyl-Linker (V) addiert wurden. Nach Entfernung der Schutzgruppen ergab sich in Folge der Umkehrphasen- Chromatografie eine vollständig isolierte Ausbeute von 19 % für das (bio)&sub8;-17. Um festzustellen, wie sich weitere Zwischenschaltungen von Biotin-Resten auswirken, wurde ein weiteres 17-mer aufgebaut, an das anschließend vier Additionen eines Biotin-Linkers erfolgten, dem drei Thymidyl-Reste zwischengeschaltet wurden. Die isolierte Ausbeute an (bio-dT)3-bio-17 betrug nach der Reinigung durch Umkehrphasen-Chromatografie 19 %.
Der Phosphotyrosyl-Linker xII wurde beim Oligonucleotidenaufbau folgender Derivate des 17-langen M13-Primers eingesetzt: (PTyr)&sub1;-17, (PTyr)&sub2;-17, (PTyr)&sub4;-17, thymidyl-zwischengeschaltetes Derivat (PTyr-dT)3-PTyr-17 und (PTyr)&sub8;-17. Die durchschnittliche Kopplungsausbeute des Phosphotyrosyl-Linkers lag der Analyse der freigesetzten Dimethoxytrityl-Gruppen zufolge bei 96 %. Für die ersten vier Oligonucleotide erfolgte die Isolation durch Ionenaustausch-HPLC (Abbildungen 4, 5, 6 und 7), wobei zur Unterstützung der Trennung die extraformalen negativen Ladungen der Phosphotyrosin-Komponenten eingesetzt wurden (isolierte Ausbeuten von 16 %, 8 %, 13 % bzw. 14 %). Im Falle des (PTyr)&sub8;-17 kam die präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Abbildung 8) zum Einsatz (isolierte Ausbeute 14 %).
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung durch weitere Beispiele beschrieben.

BEISPIEL 1

Pyridin, Acetonitril und N,N-Diisopropylethylamin wurde aus Calciumhydrid trockendestilliert. Tetrahydrofuran und Dioxan wurden aus Natrium/Benzophenon trockendestilliert. N,N-Dimethylformamid (DMF) wurde bei reduziertem Druck (18 mm Hg) trockendestilliert. Biotin-N-hydroxysuccinimid wurde aus Biotin mit Hilfe des von Becker et al.²&sup0; beschriebenen Verfahrens hergestellt. Das L- Tyrosinbenzylester-p-Toluolsulfonat-Salz wurde von Sigma und das 9- Fluorenylmethyl-chlorformiat von Fluka bezogen. Bis(2-cyanethyl)-N,N- diisopropylaminophosphin wurde nach Uhlmann und Engels²¹ aus Dichlor-N,N- diisopropylaminophosphin (Aldrich) gewonnen. Die organischen Lösungen wurden über nicht wäßrigem Natriumsulfat getrocknet. Die Säulenchromatografie erfolgte mittels des Kurzsäulenverfahrens unter Verwendung von Kieselgel 60 H (Merck).
Die Schmelzpunkte wurden mit einem Kofler-Heiztisch gemessen: sie sind unkorrigiert. Die Dünnschichtchromatografie (DC) erfolgte unter Zuhilfenahme von mit Aluminiumfolie beschichteten Kieselgel 60 F254-Platten (Merck). Zur Entwicklung wurden folgende Laufmittel eingesetzt: A, Chloroform/absoluter Ethanol (19:1); B, Chloroform/Ethanol (9:1); C, Chloroform/Ethanol (4:1); D, Acetonitril/Methanol (4:1); E, Methylenchlorid/Methanol (9:1) mit 1%igem Pyridin; F, Chloroform/Ethanol (39:1); G, Chloroform/Ethanol (9:1) mit 2%iger Essigsäure; H, Methylenchlorid/Methanol (19:1); I, Methylenchlorid/Ethylacetat (1:1) mit 1%igem 2,6-Lutidin. Die Platten wurden unter kurzwelligem UV-Licht mit Joddampf oder durch Aufsprühen von 2%iger ethanolischer Molybdatophosphorsäure visualisiert. Die dimethoxytritylhaltigen Komponenten wurden durch Bedampfen der DC-Platten mit konzentrierter Salzsäure visualisiert. Die Visualisierung der biotinhaltigen Derivate erfolgte durch Aufsprühen eines p- dimethylaminocinnamaldehydhaltigen Reagens²².
Die Protonen-NMR-Spektren wurden mit dem Spektrometer WM-250 von Bruker (250 MHz) mit chemischen Verschiebungen zum Tetramethylsilan aufgenommen. Für die Aufnahme des ³¹P-NMR-Spektrums wurde das Spektrometer AM-400 von Bruker (162 MHz) mit chemischen Verschiebungen zum Trimethylphosphit verwendet. Sofern nicht anderweitig ausgeführt, wurden alle Spektren mit Verbindungen, wie Deuteriochloroform-Lösungen, aufgenommen. Die Massenspektren wurden bei der FAB- Ionisation mit 3-Nitrobenzylalkohol als Matrix auf einem Kratos-MS-890- Spektrometer und bei der Elektronenstoßionisation (EI) auf einem Kratos-MS-902- Spektrometer aufgenommen.
Zur Umkehrphasen-HPLC wurde eine analytische bzw. semipräparative u- Bondapak-C18-Umkehrphasensäule (Waters) verwendet, wobei Gradienten des Puffers A (0.1 M Ammoniumacetat-Lösung) und des Puffers B (20 % Puffer A/80 % Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min (analytische Durchläufe) bzw. 3 ml/min (Reinigungsdurchläufe) zum Einsatz kamen. Für die Ionenaustausch-HPLC wurde eine analytische Partisphere-5-SAX-Cartridge (Whatman) verwendet, wobei mit Gradienten des Kaliumphosphat-Puffers (pH 6.3) mit einem Formamidgehalt von 60 % gearbeitet wurde.

2-Cyanethylsolketal (I)

Solketal (2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol) (26.4 g, 200 mmol) und Acrylnitril (26,4 ml, 400 mmol) wurden in trockenem Tetrahydrofuran (500 ml) gelöst. Die geschüttelte und abgekühlte (Wasserbad-) Lösung wurde mit Natriumhydrid (0,96 g, 40 mmol) in zwei Portionen versetzt und 1 Stunde lang gerührt. Danach wurde tropfenweise Wasser (100 ml) zugegeben, und die resultierende Suspension wurde eingeengt, um das Tetrahydrofuran zu entfernen. Dann wurde erneut Wasser (200 ml) zugesetzt und das Gemisch mit Methylenchlorid (2 x 300 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und zu einem Öl (44,06 g) eingeengt, das dann unter reduziertem Druck destilliert wurde und die gewünschte Verbindung (23,42 g, 79 % Ausbeute) als Öl (Siedepunkt 96-97 ºC bei 0,5 mm Hg) ergab. DC in Laufmittel A, Rf 0,76. ¹H-NMR , δ: 1,35 (s, 3 H), 1,41 (s, 3H), 2.61 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,51-3,58 (m, 2 H), 3,69-3.76 (m, 3 H), 4,05 (dd, J = 8.2 Hz, J=6,4 Hz, 1 H), 4,23 (Quintett, J = 5,5 Hz, 1 H). Massenspektrum (EI), m/z 186 (M&spplus; + 1).

3-Aminopropylsolketal (II)

2-Cyanethylsolketal (I) (27,75 g, 150 mmol) wurde in Methanol (900 ml) und Cobalt(II)-chlorid aufgelöst. 6H&sub2;0 (71,37 g, 0,3 mol) wurde zugesetzt. Die geschüttelte und abgekühlte (Wasserbad-) Lösung wurde mit Natriumborhydrid (56,76 g, 1,5 mol) in zwei Portionen versetzt (Vorsicht Schaumbildung!). Die Lösung wurde 1 Stunde lang gerührt und dann mit konzentrierter Ammoniaklösung (300 ml) versetzt. Die entstandene Suspension wurde filtriert und eingeengt, um das Methanol zu entfernen. Das Gemisch wurde mit Chloroform ( 2 x 300 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und zu einem Öl (20,82 g) eingeengt, das dann unter reduziertem Druck destilliert wurde und die gewünschte Verbindung (12,12 g, 43 % Ausbeute) als Öl (Siedepunkt 78-79 ºC bei 0,5 mm Hg) ergab. DC in Laufmittel B, Rf 0,10. ¹H-NMR , δ: 1,34 (s, 5 H), 1,40 (s, 3 H), 1,70 (Quintett, J = 6,5 Hz, 2 H), 2,77 (t, J = 6,8 Hz, 2 H), 3,38-3,57 (m, 4 H), 3,70 (dd, J = 8,2 Hz, J = 6,3 Hz, 1 H), 4,03 (dd, J = 8,2 Hz, J = 6,3 Hz, 1 H), 4,24 (Quintett, J = 5,8 Hz, 1 H). Massenspektrum (EI), m/z 190 (M&spplus; + 1).

N-Biotinyl-3-aminopropylsolketal (III)

Biotin-N-hydroxysuccinimidester (3,41 g, 10 mmol) wurde in heißem, trockenem DMF (40 ml) aufgelöst. Nach dem Abkühlen wurde unter Rühren eine Lösung aus 3-Aminopropylsolketal (II) (2,27 g, 12 mmol) in trockenem DMF (20 ml) tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wurde 1 Stunde stehengelassen und dann eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform (100 ml) gelöst und mit einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung (50 ml) gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit Chloroform (50 ml) gewaschen, und die Chloroform-Extrakte wurden gemischt, getrocknet und eingeengt. Die entstandene Trockensubstanz wurde mit Pentan (40 ml) gewaschen, abfiltriert und getrocknet, wobei die gewünschte Verbindung (3,71 g, 89 % Ausbeute) als kristalliner Stoff (Schmelzpunkt 126-127 ºC) entstand. DC in Laufmittel C. Rf 0,38. ¹H-NMR , δ: 1,35 (s, 3 H), 1,42 (s, 3 H), 1,42 (Quintett, J = 7,2 Hz, 2 H), 1,61-1,82 (m, 6 H), 2,19 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,81 (d, J = 12,8 Hz, 1 H), 2,90 (dd, J = 12,8 Hz, J = 4,8 Hz, 1 H), 3,10-3,16 (m, 1 H), 3,31- 3,36 (m, 2 H), 3,48 (d, J = 5,2 Hz, 2 H), 3,57 (t, J = 5,4 Hz, 2 H), 3,71 (dd, J = 8,2 Hz, J = 6,2 Hz, 1 H), 4,05 (dd, J = 8,1 Hz, J = 6,4 Hz, 1 H), 4,25-4,33 (m, 2 H), 4,48-4,53 (m, 1 H), 5,46 (br, s, 1 H), 6,28 (br, s, 1 H), 6,53 (br.s, 1 H). Massenspektrum (+ FAB), m/z 416,3 (M&spplus; + 1).

1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-O-(N-Biotinyl-3-aminopropyl)glycerol (IV)

N-Biotinyl-3-aminopropylsolketal (III) (2,50 g, 6 mmol) wurde in einem Gemisch von Tetrahydrofuran (12 ml) und 1 M Salzsäure (12 ml) gelöst. Die Lösung wurde 0,5 Stunden stehengelassen und dann mit absolutem Ethanol (12 ml) versetzt. Nach der Einengung der Lösung wurde der Rückstand in absolutem Ethanol (12 ml) aufgelöst und erneut eingeengt. Das entstandene Produkt wurde durch Co-Verdampfung mit Pyridin (2 x 12 ml) getrocknet, wobei ein Öl (2,46 g) entstand, das in trockenem Pyridin (24 ml) erneut gelöst wurde und unter Rühren mit 4,4'- Dimethoxytritylchlorid (2,03 g, 6 mmol), verteilt auf zwei Portionen, versetzt wurde. Nach 15 Minuten Rühren wurde die entstandene Lösung für 1 Stunde stehengelassen. Nach Zugabe von absolutem Ethanol (12 ml) wurde die Lösung eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform (60 ml) gelöst und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (30 ml) gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit Chloroform (30 ml) gewaschen, und die Chloroform-Extrakte wurden gemischt, getrocknet und zu einem Öl (5,28 g) eingedampft. Das Produkt wurde auf einer Siliciumdioxid-Säule (120 g) chromatografiert, wobei es mit Acetonitril/Methanol (9:1) und anschließend mit Acetonitril/Methanol (4:1) eluiert wurde. Fraktionen mit einer Einzelkomponente wurden aufgefangen und zur Trockne eingedampft. Das Ergebnis ist das gewünschte Produkt (2,55 g, 63 % Ausbeute) als Schaum. DC in Laufmittel D, Rf 0,39. ¹H-NMR, δ: 1,36-1,42 (m, 2 H), 1,61-1,73 (m, 6 H), 2,12- 2,20 (m, 2 H), 2,62 (d, J = 12,8 Hz), 2,79-2,86 (m, 1 H), 3,03-3,21 (m, 3 H), 3,28-3,34 (m, 2 H), 3,46-3,58 (m, 4 H), 3,77 (s, 6 H), 3,93-3,96 (m, 1 H), 4,15- 4,24 (m, 1 H), 4,35-4,41 (m, 1 H), 5,43 (br.s, 1 H), 6,61 (br.s, 1 H), 6.78 (br.s, 1 H), 6,78-6,82 (m, 4 H), 7,18-7,43 (m, 9 H). Massenspektrum (+ FAB), m/z 678,4 (M&spplus; + 1).
1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-O-(N-biotinyl-3-aminopropyl)glyceryl 2-O-(N,N- diisopropylamino)cyanethylphosphit (V)
1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-O-(N-biotinyl-3-aminopropyl)glycerol (IV) (1,36 g, 2 mmol) wurde in trockenem Tetrahydrofuran (4 ml) gelöst und mit N,N- Diisopropylethylamin (0,52 ml, 3 mmol) versetzt. Anschließend wurde unter Rühren eine Lösung aus 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphit (0,47 g, 2 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (1 ml) tropfenweise hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h stehengelassen und anschließend fiitriert. Das Filtrat wurde mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt. Die entstandene Lösung wurde mit 0,5 M Phosphat- Puffer pH 7,0 (2 x 20 ml) gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand (1,92 g) wurde auf einer Siliciumdioxid-Säule (60 g) chromatografiert, wobei er mit Methylenchlorid/Methanol (39:1) und anschließend mit Methylenchlorid/Methanol (19:1) eluiert wurde, die beide 1%iges Triethylamin enthielten. Zwei Fraktionen wurden aufgefangen. Das zuerst entstandene Elutionsprodukt wurde eingedampft und ergab einen Schaum (1,10 g), der in Toluol (10 ml) aufgelöst und in Pentan (200 ml) gefällt wurde. Der Niederschlag wurde mit Pentan (200 ml) gewaschen, durch Zentrifugieren aufgefangen und getrocknet. Das gewünschte Produkt (1,02 g, 58 % Ausbeute) lag als feines Pulver vor. DC in Laufmittel E, Rf 0,33. ¹H-NMR, δ: 1,01-1,18 (m, 12 H), 1,39 (Quintett, J = 7,2 Hz, 2 H), 1,62-1,70 (m, 6 H), 2,07-2,14 (m, 2 H), 2,45 (t, J = 6,5 Hz, 1 H), 2,63 (t, J = 6,5 Hz, 1 H), 2,65 (d, J = 13,0 Hz, 1 H), 2,87 (dd, J = 12,8 Hz, J = 4,8 Hz, 1 H), 3,07-3,34 (m, 5 H), 3,47-3,75 (m, 8 H), 3,77 (s, 3 H), 3,88 (s, 3 H), 4,07-4,13 (m, 1 H), 4,24-4,29 (m, 1 H), 4,43-4,48 (m, 1 H), 5,04 (br.s, 1 H), 5,74 (br.s, 1 H), 6,22 (br.d, J = 18,4 Hz, 1 H), 6,78-6,83 (m, 4 H), 7,18-7,45 (m, 9 H). ³¹P-NMR, δ: 6,09, 6,12, 7,61, 7,63. Massenspektrum (+ FAB), m/z 876,4 (M&spplus; -1). Elementaranalyse, gefunden: C, 63,10; H, 7,62; N, 7,84; berechnet für C&sub4;&sub6;H&sub6;&sub4;N&sub5;O&sub8;P: C, 62,92; H, 7,35; N, 7,98. Die HPLC mit isokratischer Elution bei 90%igem Puffer B ergab zwei eng beieinander liegende Elutionspeaks, die den beiden Diastereoisomeren-Paaren (Rt 4,82 und 5,16 min) entsprechen.
Die Fraktionen, die das langsamere Elutionsprodukt enthielten, wurden zur Trockne eingedampft und ergaben die nicht umgesetzte Ausgangsverbindung IV (0,44 g, 32 % Rückgewinnung).

N-Fluorenylmethoxycarbonyl-L-tyrosinbenzylester (VI)

L-Tyrosinbenzylester-p-toluolsulfonat-Salz (11,09 g, 25 mmol) wurde in trockenem Pyridin (125 ml) gelöst. Die Lösung wurde in einem Eis-/Wasserbad abgekühlt und anschließend unter Rühren mit 9-Fluorenylmethylchlorformiat (6,47 g, 25 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 0 ºC sowie 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt, in Toluol (50 ml) gelöst und erneut eingeengt, wobei ein Öl (24,0 g) entstand. Die Kristallisation aus Acetonitril (50 ml) ergab eine erste Ausbeute von 6,85 g. Das Filtrat wurde eingeengt, und das entstandene Öl wurde in Chloroform (200 ml) gelöst und mit 0,5 M Salzsäure (50 ml) gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit Chloroform (2 x 50 ml) extrahiert, und die Chloroformextrakte wurden gemischt, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der entstandene kristalline Feststoff (6,77 g) wurde mit der ersten Ausbeute vermischt und erneut aus Acetonitril (60 ml) umkristallisiert, wobei sich das gewünschte Endprodukt bildete (10,38 g, 84 % Ausbeute): Schmelzpunkt 150-151 ºC. DC in Laufmittel F, Rf 0,48. ¹H-NMR (d&sub6; DMSO), δ: 2,85- 2,93 (m, 2 H), 3,32 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 4,18-4,25 (m, 4 H), 5,09 (s, 2 H), 6,25 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,26-7,44 (m, 8 H), 7,63-7,67 (m, 2 H), 7,87-7,93 (m, 3 H), 9,25 (m, 1 H). Massenspektrum (+ FAB), m/z 494,2 (M&spplus; + 1).

N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L-tyrosinbenzylester (VII)

N-Fluorenylmethoxycarbonyl-L-tyrosinbenzylester (VI) (7,41 g, 15 mmol) und 1H-Tetrazol (1,58 g, 22,5 mmol) wurden in trockenem Acetonitril (225 ml) gelöst. Anschließend wurde unter Rühren eine Lösung aus Bis(2-cyanethyl)-N,N- (diisopropylamino)phosphin (6,10 g, 22,5 mmol) in trockenem Acetonitril (22,5 ml) tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde stehengelassen. Danach wurde ihm unter Rühren und Kühlung im Wasserbad 50%ige 3-Chlorperbenzoesäure (5,16 g, 15 mmol) zugesetzt. Nachdem die Lösung über 0,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde sie zu einem Öl eingeengt (13,50 g). Das Öl wurde in Chloroform (450 ml) gelöst und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (225 ml) gewaschen. Die Chloroform-Lösung wurde getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei ein Öl (14,80 g) entstand. Die Umkristallisation aus einem Gemisch von Methylenchlorid (60 ml) und Diethylether (120 ml) ergab das gewünschte Endprodukt (8,80 g, 86 % Ausbeute): Schmelzpunkt 103-104 ºC. DC in Laufmittel A, Rf 0,44. ¹H-NMR, δ: 2,65-2,73 (m, 2 H), 4,19 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 4,28-4,47 (m, 6 H), 4,68 (dt, J = 12,1 Hz und J = 5,7 Hz, 1 H), 5,12 (d, J = 12,1 Hz, 1 H), 5,19 (d, J = 12,1 Hz, 1 H), 5,36 (d. J = 12,1 Hz, 1 H), 6,97 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,07 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,27-7, 43 (m, 9 H), 7,57 (d, J = 7,0 Hz, 2 H), 7,76 (d, J = 7,4 Hz, 2 H). ³¹P-NMR, δ: -148,60. Massenspektrum (+ FAB), m/z 680,3 (M&spplus; + 1).

N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L-tyrosin (VIII)

N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L- tyrosinbenzylester (VII) (6,80 g, 10 mmol) wurde in einem Gemisch aus 95%igem Ethanol (200 ml) und Ethylacetat (200 ml) unter Zusatz von 10%igem Palladium auf Kohle (1,0 g) gelöst. Die Suspension wurde unter Wasserstoff gerührt, bis das Substrat fast vollständig verschwunden war (DC-Analyse). Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat anschließend eingeengt. Das entstandene Öl (6,20 g) wurde in einer 1%igen Lösung aus Natriumcarbonat (200 ml) gelöst, und die Lösung wurde mit Diethylether (100 ml) ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wurde mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 4 gebracht und die entstandene Suspension mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft, wobei das gewünschte Endprodukt (3,83 g, 65 % Ausbeute) als fester Schaum gewonnen wurde. DC in Laufmittel G, Rf 0,38. ¹H-NMR, δ: 2,71 (t, J = 6,0 Hz, 4 H), 3,13 (d, J = 5,3 Hz, 2 H), 4,20 (t, J = 6,7 Hz, 1 H), 4,30-4,51 (m, 6 H), 4,65 (dt, J = 12.0 Hz und J = 5,4 Hz, 1 H), 5,48 (d, J = 12,1 Hz, 1 H), 7,13 (s, 4H), 7,28-7,43 (m, 4H), 7,58 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 7,4 Hz, 2 H). ³¹P-NMR, δ: -148,85. Massenspektrum (+ FAB), m/z 590,2 (M&spplus; + 1).

N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L- tyrosinpentafluorphenylester (IX)

N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L-tyrosin (VIII) (2,95 g, 5 mmol) wurde in trockenem Dioxan (20 ml) gelöst und mit einer Lösung aus Pentafluorphenol (1,02 g, 5,5 mmol) in trockenem Dioxan (5 ml) versetzt. Unter Rühren wurde dann Dicyclohexylcarbodiimid (1,13 g, 5,5 mmol) hinzugefügt. Das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, und die dabei entstandene Suspension wurde anschließend filtriert. Das Filtrat wurde zu einem Öl (4,18 g) eingeengt, das in Chloroform (100 ml) gelöst und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (50 ml) gewaschen wurde. Die organische Phase wurde getrocknet und zu einem Öl (3,52 g) eingeengt. Das Produkt wurde auf einer Siliciumdioxid-Säule (60 g) chromatografiert, wobei es mit Chloroform/Ethanol (39:1) und anschließend mit Chloroform/Ethanol (19:1) eluiert wurde. Fraktionen mit Einzelkomponenten wurden aufgefangen und zur Trockne eingedampft, wobei das gewünschte Endprodukt (3.10 g, 82 % Ausbeute) als fester Schaum gewonnen wurde. DC in Laufmittel A, Rf 0,33. ¹H- NMR, δ:2,74 (t, J = 6,0 Hz, 4 H), 3,27 (d, J = 5,8 Hz, 2 H), 4,21 (t, J = 6,6 Hz, 1 H), 4,32-4,48 (m, 6 H), 4,97-5,02 (m, 1 H). 5,45 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 7,20 (s, 4 H), 7,28-7,43 (m, 4 H), 7,56-7,59 (m, 2 H), 7,77 (d, J = 7,4 Hz, 2 H). ³¹P-NMR, δ: -148,67. Massenspektrum (+ FAB), m/z 756,1 (M&spplus; + 1).
N-{N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L-tyrosinyl}-3- aminopropylsolketal (X)
N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L- tyrosinpentafluorphenylester (IX) (3,02 g, 4 mmol) wurde in trockenem DMF (20 ml) gelöst. Unter Rühren wurde dann tropfenweise eine Lösung aus 3-Aminopropylsolketal (II) (0,91 g, 4,8 mmol) in trockenem DMF (8 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 0,5 Stunden stehengelassen und dann zu einem Öl (5,61 g) eingeengt, das wiederum in Chloroform (80 ml) gelöst und mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (40 ml) gewaschen wurde. Die organische Phase wurde getrocknet und zu einem Öl (4,10 g) eingeengt. Das Produkt wurde auf einer Siliciumdioxid-Säule (100 g) chromatografiert, wobei es mit Chloroform/Ethanol (39:1) und anschließend mit Chloroform/Ethanol (19:1) eluiert wurde. Fraktionen mit Einzelkomponenten wurden zur Trockne eingedampft, wobei das gewünschte Endprodukt (2,60 g, 86 % Ausbeute) als dickes Öl gewonnen wurde. DC in Laufmittel A, Rf 0,26. ¹H-NMR, δ: 1,40 (s, 3 H), 1,65 (s, 3 H), 1,87-1,90 (m, 2 H), 2,76 (t, J = 6,1 Hz, 4 H), 2,95-3,11 (m, 2 H), 3,32-3,56 (m, 9 H), 4,16-4,20 (m, 1 H), 4,32-4,40 (m, 7 H), 5,63-5,82 (m, 1 H), 6,56-6,81 (m, 1 H). 7.11-7,16 (m. 4 H), 7,28-7,43 (m, 4 H), 7,56 (d, J = 7,4 Hz, 2 H), 7,76 (d, J = 7,4 Hz, 2 H). ³¹P-NMR, δ: -148.65, -148,49.

1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-O-(N-{N-fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)- phosphat]-L-tyrosinyl}-3-aminopropyl)glycerol (XI)

N-{N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)-phosphat]-L-tyrosinyl}-3- aminopropylsolketal (X) (2,28 g, 3 mmol) wurde in einem Gemisch aus Tetrahydrofuran (12 ml) und 1 M Salzsäure (6 ml) gelöst. Die Lösung wurde 1 Stunde stehengelassen und anschließend mit absolutem Ethanol (12 ml) versetzt. Die Lösung wurde eingeengt, der Rückstand in absolutem Ethanol (12 ml) aufgelöst und erneut eingeengt. Das entstandene Produkt wurde durch Co-Verdampfung mit Pyridin (2 x 6 ml) getrocknet, wobei ein Öl (2,20 g) entstand, das in trockenem Pyridin (12 ml) erneut gelöst und unter Rühren mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,02 g, 3 mmol) versetzt wurde. Nach 15 Minuten Rühren wurde die entstandene Lösung für 1 Stunde stehengelassen. Nach Zugabe von absolutem Ethanol (6 ml) wurde die Lösung eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform (60 ml) gelöst und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und zu einem Öl (4,32 g) eingeengt. Das Produkt wurde auf einer Siliciumdioxid- Säule (90 g) chromatografiert, wobei es mit Methylenchlorid/Methanol (39:1) und anschließend mit Methylenchlorid/Methanol (19:1) eluiert wurde. Fraktionen mit Einzelkomponenten wurden aufgefangen und zur Trockne eingedampft, wobei das gewünschte Endprodukt (2,15 g, 70 % Ausbeute) als fester Schaum gewonnen wurde. DC in Laufmittel H, Rf 0,28. ¹H-NMR, δ: 1,61-1,67 (m, 2 H), 2,66 (q, J = 5,7 Hz, 2 H), 2,76 (t, J = 6,0 Hz, 2 H), 3,03-3,14 (m, 4 H), 3,29-3,52 (m, 7 H), 3,74 (s, 3 H), 3,79 (s, 3 H), 3,88 (br.s, 1 H), 4,23-4,40 (m, 8 H), 5,56-5,82 (m, 1 H), 6,56-6,68 (m, 1 H), 6,78 (d, J = 8,9 Hz, 2 H), 6,82 (d, J = 9,0 Hz, 2 H), 7,13--
7,54 (m, 19 H), 7,72-7,78 (m, 2 H). ³¹P-NMR, δ: -148,59, -148,57. Massenspektrum (+ FAB), m/z 1022,6 (M&spplus; ).

1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-O-(N-{N-fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2-cyanethyl)- phosphat]-L-tyrosinyl}-3-aminopropyl)glyceryl-2-0-(N,N-diisopropylamino)(2- cyanethyl)phosphit (XII)

1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-O-(N-{N-fluorenylmethoxycarbonyl-O-[bis(2- cyanethyl)-phosphat]-L-tyrosinyl}-3-aminopropyl)glycerol (XI) (2,04 g, 2 mmol) wurde in trockenem Tetrahydrofuran (4 ml) gelöst und mit N,N-Diisopropylethylamin (0,70 ml, 4 mmol) versetzt. Unter Rühren wurde dann tropfenweise eine Lösung aus 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphit (0,71 g, 3 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (2 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 1 Stunde stehengelassen und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt. Die entstandene Lösung wurde mit 0,5 M Phosphat-Puffer pH 7,0 (2 x 20 ml) gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand (2,52 g) wurde auf einer Siliciumdioxid-Säule (80 g) chromatografiert, wobei er mit Methylenchlorid/Ethylacetat (3:1) und anschließend mit Methylenchlorid/Ethylacetat (1:1) eluiert wurde, die beide 1%iges 2,6-Lutidin enthielten. Fraktionen mit Einzelkomponenten wurden aufgefangen und zur Trockne eingedampft. Das entstandene Öl (1,62 g) wurde in Toluol (16 ml) aufgelöst und das Produkt mit Pentan (320 ml) gefällt. Der Niederschlag wurde mit Pentan (2 x 320 ml) gewaschen, durch Zentrifugieren aufgefangen und getrocknet. Das gewünschte Endprodukt (1,08 g, 44 % Ausbeute) wurde als feines Pulver gewonnen. DC in Laufmittel I, Rf 0,26. ¹H-NMR, δ: 1,14-1,33 (m, 12 H), 1,56-1,75 (m, 2 H), 2,54-2,79 (m, 6 H), 2,93-3,26 (m, 6 H), 3,38-3,61 (m, 7 H), 3,76 (s, 6 H), 4,05-4,42 (m, 10 H), 5,44-5,60 (m, 1 H), 6,21-6,33 (m, 1 H), 6,79-6,83 (m, 4 H), 7,27-7,57 (m, 19 H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 2 H). ³¹P-NMR, δ: -148,65, -148,64, 7,41, 7,68, 7,96. Massenspektrum (+ FAB), m/z 1223,9 (M&spplus; + 1). Elementaranalyse, gefunden: C, 64,70, H, 6,34, N, 6,92; berechnet für C&sub6;&sub6;H&sub7;&sub6;N&sub6;O&sub1;&sub3;P&sub2;: C, 64,81, H, 6,26, N, 6,87. Die Umkehrphasen-HPLC mit isokratischer Elution bei 90%igem Puffer B ergab zwei eng beieinander liegende Elutionspeaks, die den beiden Diastereomeren-Paaren (Rt 6,14 und 6,86 min) entsprechen.

Oligonucleotidenaufbau

Der Aufbau der Oligonucleotide erfolgte nach dem Cyanethylphosphoramidit- Verfahren mit Hilfe eines Applied Biosystems-380B-3-Säulen-DNA-Synthesizers unter Einhaltung der Empfehlungen des Herstellers. Es wurden durchweg 0,2 umol- Skalensäulen verwendet. Für die Kopplung mit Biotinylphosphoramidit V bzw. Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit xII wurde eine Konzentration von 0,2 M in nicht wäßrigem Acetonitril verwendet und die Kopplungszeit auf 300 s erhöht (im Vergleich zu 30 s bei normalen Nucleotid-Kopplungen). Diese Modifizierungen waren nötig, um eine hohe Kopplungsausbeute der Phosphoramiditen V und xII zu erzielen. Bei den Endkopplungszyklen wurde jeweils die Trityl ON-Konfiguration verwendet. Nach dem Aufbau wurden die Oligonucleotide bei Raumtemperatur unter Verwendung von konzentriertem Ammoniak mit Hilfe des vom Hersteller empfohlenen Zyklus für das Verfahrensende vom Träger abgespalten. Die ammoniakhaltige Lösung wurde dann in einem verschlossenen Röhrchen 5 Stunden lang auf 60 ºC erhitzt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,3 ml Essigsäure/Wasser (8:2) gelöst und nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Wasser (0,5 ml) versetzt und die entstandene Suspension filtriert. Die wäßrige Lösung enthielt nun das ungeschützte Oligonucleotid für die HPLC-Reinigung.

BEISPIEL 2

A) Synthese des Fluorescein-Phosphoramidits

Fluorescein-5-isothiocyanat-3',6'-dibenzoat

Fluorescein-5'-isothiocyanat (5 g, 12,85 mmol) wurde in trockenem Pyridin (15 ml) gelöst. Benzoylchlorid (3 ml, 3,61 g, 25,7 mmol) wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten tropfenweise ohne externe Kühlung zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht im Dunklen gerührt. Anschließend wurde die Reaktion verteilt zwischen Ethylacetat (150 ml) und 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat (150 ml). Die organische Schicht wurde in zwei weiteren Schritten mit Bicarbonat (jeweils 150 ml) und mit Kochsalzlösung (150 ml) gewaschen. Die DC über Siliciumdioxid (Ethylacetat/Pentan 2/1 v/v) ergab lediglich ein fluoresceinhaltiger Fleck bei Rf 0,75.

Aminopropylglycerol

3-Aminopropylsolketal (2,43 g, 12,8 mmol) wurde in THF (30 ml) gelöst und mit wäßriger Salzsäure (1 M, 30 ml) versetzt. Nach einstündiger Aufbewahrung bei Raumtemperatur ergab das DC (Acetonitril/Methanol/Triethylamin 80/18/2), daß die Ausgangsstoffe Rf 0,33 zum Diol Rf ca. 0,0 hydrolysiert worden sind (Nachweis mit Ninhydrin-Spray). Das THF wurde in vacuo eingedampft und der wäßrige Rückstand einer Dowex 50-Ionenaustauschsäule (100 ml, H-Form) zugeführt. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen, um alle Cl-Ionen zu entfernen, und das gewünschte Amin wurde mit wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Ammoniaklösung wurde zur Entfernung aller flüchtigen Bestandteile eingedampft und der wäßrige Rückstand ohne weitere Reinigung für die folgenden Reaktionen verwendet.

Dibenzoyl-fluoresceinaminopropyl-glycerylthioharnstoff

Fluorescein-5-isothiocyanat-3',6'-dibenzoat (0,11 mmol) wurde in Ethylacetat/Acetonitril (4/1 v/v) gelöst und unter Rühren mit einer Lösung aus Aminopropyl-glycerol in Wasser (0,11 mmol, 1 ml) versetzt. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur ergab das DC (Ethylacetat/Pentan 2/1) eine vollständige Umsetzung der Ausgangsstoffe (Rf 0,75) zu Substanzen mit einem Rf-Wert von ca. 0,0. Die DC in einem anderen System (Acetonitril/Ethanol 4/1) ergab einen fluoresceinhaltigen Fleck bei Rf 0,76. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5%igem Natriumbicarbonat (2 x 20 ml) und einer Kochsalzlösung (2 x 20 ml) gewaschen, über nicht wäßrigem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei ein gelbes Öl gewonnen wurde.

Dimethoxytrityl-dibenzoyl-fluoresceinaminopropyl-glycerylthioharnstoff

Dibenzoyl-fluoresceinaminopropyl-glycerylthioharnstoff (82 mg, 0,11 mmol) wurde mit Pyridin (2 x 20 ml) azeotrop gemischt und in Pyridin gelöst. Der gerührten Lösung wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 40 Minuten hinweg langsam in Pyridin (10 ml) gelöstes Dimethoxytritylchlorid (60 mg, 0,16 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für weitere 20 Minuten gerührt, anschließend unter Vakuum eingeengt und zwischen Ethylacetat (50 ml) und 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat (2 x 50 ml) verteilt. Die DC (Ethylacetat/Pentan 2/1 v/v) ergab eine Umsetzung des gesamten polaren Materials zu einem Fleck Rf 0,60. Der organische Extrakt wurde über nicht wäßrigem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das verbliebene Pyridin wurde durch azeotropisches Mischen mit Toluol (2 x 10 ml) entfernt. Die Substanz wurde einer Siliciumdioxidsäule zugeführt, die mit einem Gradienten aus Ethylacetat in Pentan (20 % zu 60 %) eluiert wurde. Fraktionen mit reinen Substanzen wurden aufgefangen und zur Trockne eingedampft, wobei das Produkt als blaßgelber Schaum (28 mg) gewonnen wurde. Die Umkehrphasen-HPLC (C18-Säule, 15 cm) ergab eine einzelne Peakretention von 8,58 Minuten (Detektor 254 nm). Puffer A = 0,1 M Triethylammoniumacetat; Puffer B = Acetonitril. Laufmittelprogramm 80 % B zu 95 % B für 10 Minuten, Fluß 1.0 ml/min, danach isokratisch für 5 Minuten.

Dimethoxytrityl-dibenzoyl-fluoresceinaminopropyl-glycerylthioharnstoff- diisopropylaminocyanethylphosphoramidit

Die Dimethoxytrityl-Verbindung (1,93 g, 1,85 mmol) wurde mit Acetonitril (3 x 50 ml) azeotropisch gemischt und in trockenem Dichlormethan (50 ml) gelöst. Danach wurde Cyanethyl-tetraisopropyl-phosphordiamidit (0,613 g, 2,03 mmol) gefolgt von Diisopropylammoniumtetrazol (0,158 g, 0,925 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehengelassen und anschließend durch Zusetzen von 50 ml 5%igem wäßrigen Natriumbicarbonat abgelöscht. Die organische Schicht wurde durch Addition von nicht wäßrigem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das entstandene gelbe Öl wurde in trockenem Dichlormethan ( 3 ml) gelöst und das Produkt durch Zusetzen von Pentan (25 ml) gefällt. Der Überstand wurde dekandiert und das zurückgebliebene Öl unter hohem Vakuum getrocknet, wobei ein weißlicher Schaum (i. ig.) entstand. Die HPLC-Analyse ergab, daß es sich bei dem Produkt um ein Diastereomeren-Paar mit den Retentionszeiten 3,99 und 4,44 Minuten (C18-Säule, 15 cm, 95 % Acetonitril, 5 % 1 M Triethylammoniumacetat, isokratisch, Fluß 1 ml/min.) handelte.

B) Verwendung eines Fluorescein-Phosphoramidits zur Herstellung von Oligonucleotiden als Hybridisierungssonden

Ausgangsstoffe und Verfahren

Der Aufbau der Oligonucleotide erfolgte nach dem Cyanethylphosphoramidit- Verfahren mit Hilfe eines Applied Biosystems-394-08-4-Säulen-DNA-Synthesizers unter Einhaltung der Empfehlungen des Herstellers. Es wurden durchweg 0.2 umol- Skalensäulen verwendet. Für die Kopplung mit den Fluorescein-Phosphoramiditen wurde eine Konzentration von 0,2 M in nicht wäßrigem Acetonitril verwendet und die Kopplungszeit auf 300 Sekunden erhöht. Der M13-17-mer- Vorwärtssequenzierungsprimer d(GTAAAACGACGGCCAGT) wurde dreimal parallel synthetisiert, wobei sich am 5'-Ende 1-, 7- und 8-Fluorescein-Markierungen befanden. Bei allen Endkopplungen wurde die Trityl-ON-Konfiguration verwendet.

Nach der Synthese erfolgte die Detritylation. Siehe Beispiel 1.

Die Reinigung der Oligonucleotide erfolgte mit Hilfe der Umkehrphasen-HPLC auf einer Ultrasphere-ODS-Säule (5 um, 4,6 mm x 15 cm) (Beckman Instruments) mit Gradienten des Puffers A (0,1 M Ammoniumacetat) und des Puffers B (20 % Puffer A/80 % Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min.
Die M13-mp8-Einzelstrang-DNA (1 ul) wurde auf eine Hybond-N+-Nylonmembran (Amersham-Code 2020B) in Verdünnungen von 20-0,0125ng/ul in H&sub2;O punktiert. Außerdem wurden 50 ng/ul denaturierter Heringssperma-DNA als Negativkontrolle punktiert. Die Filter wurden dann bei 80 ºC für 2 Stunden verbacken.
Die Vorhybridisierung der Filter erfolgte über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 42 ºC in einem 0,5%igen Blockreagens (ECL- Oligonucleotidenmarkierungssystem, Amersham, RPN 2111), 0.1%igem N-Lauroylsarcosin (Natriumsalz), 0,02%igem SDS und 5 x SSC. Danach wurden über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 42 ºC im gleichen Puffer Hybridisierungen mit den Sonden, die mit 1 und 7 Fluorescein-Molekülen bei 20 ng/ml markiert waren, durchgeführt. Anschließend wurden die Filter 2 x 15 Minuten in 1 x SSC und 0,1%igem SDS bei 42 ºC und anschließend 5 Minuten in 2 x SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
Zum Nachweis der mit Fluorescein markierten Sonden gehörte die Blockierung der Filter in 1%igem Blockreagenz (ECL-Oligonucleotidenmarkierungssystem, Amersham, RPN 2111). 100 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, pH 7,5 für 60 Minuten bei 42 ºC. Danach wurden die Filter für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Schaf-Anti- Fluorescein-Antikörper inkubiert, der an Meerrettichperoxidase (ECL 3'-Tailing- System. Amersham, RPN 2130) in einer Verdünnung von 1 zu 1000 mit dem Blockpuffer konjugiert ist. Nach 4 x 5minütigem Waschen in 100 mM Tris-HCL, 400 mM NaCl, ph 7,5 bei Raumtemperatur erfolgte über einen Zeitraum von 1 Stunde der Nachweis mittels der ECL (Enhanced Chemiluminescent)-Nachweisreagenzien (Amersham, RPN 2105) mit anschließender Belichtung auf einen Hyperfilm-ECL-Autoradiografiefilm (Amersham, RPN 2103).

Ergebnisse

Die Effektivität der Addition des Fluorescein-Phosphoramidits lag durchschnittlich bei 92 %. Dieser Wert ergab sich aus der Freisetzung des Dimethoxytrityl-Kations vor den sich anschließenden Kopplungsschritten.
Die Reinigung der mit Fluorescein markierten Oligonucleotide durch die Umkehrphasen-HPLC ergab, daß das Fluorescein deren Mobilität im Vergleich zu der nicht markierter Oligonucleotiden herabsetzt. Die Retentionszeiten für die 1- und 7-markierten Oligonucleotide lagen bei 17 bzw. 29 Minuten, die der nicht markierten Oligonucleotide bei 16 Minuten. Für das Oligonucleotid mit 8 Fluoresceinen wurde die gleiche Retentionszeit wie für die 7-Fluorescein-Sonde ermittelt.
Beim Nachweis der Einzelstrang-M13-DNA ergab sich für die Sonde mit 7 Fluoresceinen eine höhere Sensibilität als für die Sonde mit einem einzelnen Fluorescein. Die Nachweisgrenzen lagen nach 1 Stunde Belichtung bei 12,5 ug bzw. 100 ug für die 7-Fluorescein- bzw, die 1-Fluorescein-Sonde.

BEISPIEL 3

Ausgangsstoffe und Verfahren

Radioaktive Markierung biotinylierter Oligonucleotide: Die biotinylierten Oligonucleotide (17-mere) wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert. Die Oligonucleotide entsprachen der Sequenz des universellen M13- Sequenzierungsprimers (d(GTAAAACGACGGCCAGT)). Ansätze dieser Oligonucleotide wurden unter Zuhilfenahme eines Biotinyl-Phosphoramidit-Reagens am 5'-Ende mit 1. 2 oder 8 Biotinen markiert. Nach vollständiger Entfernung der Schutzgruppen wurden die drei 17-mere mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Ein 17-mer ohne Biotin- Markierung wurde aus einem M13-Sequenzierungssystern gewonnen (Amersham-Code N4502). Die vier 17-mere wurden auf 10 pmol/5 ul eingestellt. 5 Minuten gekocht und danach schnell auf Eis abgekühlt. Anschließend wurden sie am 3'-Ende mit 32PdCTP (Amersham-Code PB 10205) und einem 3'-Enden-Markierungs-Kit (Amersham-Code N 4020) markiert. Danach wurden die radioaktiv markierten 17-mere durch Zentrifugieren eine Sephadex-G24 Spinsäule herunter von nicht inkorporierten dNTPS gereinigt.
Einfanganalyse der radioaktiv markierten 17-mere: Die Analysen wurde mittels weißer Mikrotiterplatten (DynaTech) mit entfernbaren Näpfchen durchgeführt. Die Näpfchen waren mit Aliquoten (200 ul einer Lösung von 20 ug ml-¹) von Streptavidin (Amersham-Code RPN 1041) in TBS (pro Liter: Trisbase, 2.42 g; NaCl, 8 g; 1 M HCl, 3.8 ml; pH 7,6) oder einem monoklonalen Maus- Antikörper gegen Biotin in 0.1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9.5) beschichtet und wurden über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Anschließend wurden sie dreimal in TBS mit 0.1%igem (v/v) Tween-20 (TBST) gewaschen. Danach wurden Aliquoten (200 ul) der Blocklösung (TBS mit 0.1%igem (w/v) bovinen Serumalbumin) zugesetzt und die Platte bei 37 ºC für 1 h inkubiert. Nach dreimaligein Waschen mit TBST-Lösung wurden die Aliquoten (200 ul) der Oligonucleotiden-Lösung in die entsprechenden Näpfchen gegeben und die Platte erneut für 1 h bei 37 ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Näpfchen erneut dreimal in TBST gewaschen, und die letzte Waschlösung wurde entfernt. Die einzelnen Näpfchen wurden dann in jeweils eine Szintillationsviale eingesetzt und durch Cerenkov-Zählung analysiert. Die prozentuale Einfangquote wurde anhand der folgenden Gleichung ermittelt:
prozentuale Einfangquote = Zählung pro Näpfchen nach der Einfanganalyse/ Zählung pro Näpfchen vor der Analyse x 100 %

Ergebnisse

Ziel des Experiments war es, die Einfangquote eines mit Biotinyl- Phosphoramidit-Resten markierten Oligonucleotids zu beobachten, wobei das Biotin- Oligonucleotid mit Hilfe von Streptavidin oder eines Anti-Biotin-Antikörpers auf der Festphase eines Mikrotiter-Näpfchens eingefangen wurde. Die radioaktive Markierung des 3'-Endes der Oligonucleotide erlaubte die Bestimmung der Einfangquote mit Hilfe einer Szintillationszählung der Näpfchen.

Experiment 1

Bei diesem Experiment wurden in jedes Näpfchen etwa 2 x 10¹³ radioaktiv markierte Oligonucleotid-Moleküle gegeben. Die Ergebnisse lassen darauf schließen. daß der Einfangprozeß (Capture) erfolgte und daß beim Anti-Biotin-Antikörper ein Zusammenhang zwischen der wachsenden Länge des Biotinschwanzes und seiner Effizienz beim Einfangen bestand (Abbildung 9). Obwohl sich auch ein ähnlicher Zusammenhang beim Streptavidin als Einfang-Agens abzeichnete, fiel die Erhöhung der Einfangquote mit zunehmender Länge des Biotinschwanzes nicht so hoch aus wie beim Einfangprozeß mit dem Antikörper.

Experiment 2

ßei diesem Experiment wurden in jedes Näpfchen etwa 2.4 x 10¹² Oligonucleotid-Moleküle gegeben. Die Ergebnisse des Experiments 1 wurden bestätigt. Die biotin-markierten Oligonucleotide wurden auf einem Niveau eingefangen, der deutlich über dem Hintergrund (Oligonucleotide ohne Biotinmarkierung) lag, woraus sich schließen läßt, daß die Biotininarkierung eingefangen wurde (Abbildung 10).

BEISPIEL 4

Festphasensequenzierung von in Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugter DNA

Grundlage des Protokolls ist das Verfahren nach Hultmann T, et al. (1989) Nucleic Acids Research 17, S. 4937-4946. Die spezifische Ziel-DNA wird durch PCR mit einem biotinylierten und einem nicht-biotinylierten Primer ainplifiziert. Die amplifizierte DNA wird über Biotin mit Streptavidin eingefangen, das an eine Festphase (in diesem Fall eine magnetische Perle) gebunden ist. Der nicht biotinylierte Strang wird anschließend mit Alkali entfernt. Sowohl der gebundene Strang als auch der nicht gebundene Strang kann dann nach Standardprotokollen sequenziert werden.

Ausgangsstoffe und Verfahren

Amplifizierung durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Biotinylierte Primer-Oligonucleotide wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert. Die Matrizen-DNA (üblicherweise 1-2 pmol der Zielsequenz) wurde in 50 ul 10 mM Tris-HCl, pH 9.5, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl&sub2;. 0,01 % NP-40. 0.05 % Gelatine, jeweils 250 uM dATP, dCTP, dGTP und dHP. 5 pmol biotinylierter Primer 1. 5 pmol nicht-biotinylierter Primer 2 sowie 2 ul Tag-Polymerase (Amersham-Code T0303Y) amplifiziert. Es fanden 30 Reaktionszyklen bei 94 ºC über 45 Sekunden, bei 45 ºC über 45 Sekunden und bei 72 ºC über 2 Minuten statt.

Herstellungen der Einzelstrang-Matrize

Unmittelbar vor ihrer Verwendung wurden die mit Streptavidin überzogenen Perlen (Dynal, M-280-Streptavidin) 2 x 5 Minuten in 0.1 M NaCl gewaschen. Die Perlen wurden nach dem Waschen bei einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,1 M NaCL erneut in den Schwebezustand versetzt.
50 ul gewaschener Perlen wurden in ein neues Röhrchen gegeben, und die Perlen wurden getrennt. Mit Hilfe des fertig vorbereiteten PCR-Gemisches wurden die Perlen erneut zum Schweben gebracht. Das Röhrchen wurde anschließend unter Mischen 30-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Perlen abgetrennt und mit 200 ul Wasser gewaschen.
Die Einzelstrang-Matrize wurde hergestellt, indem die mit PCR-DNA überzogenen Perlen in 20 ul 0.15 NaOH bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert wurden. Anschließend wurden die Perlen abgetrennt und einmal mit 200 ul 0.15 NaOH sowie zweimal mit 200 ul Wasser gewaschen. Zum Abschluß wurden die Perlen in 30 ul Wasser erneut in den Schwebezustand versetzt.

Sequenzierung von Festphasen-DNA

Die festphasengebundene Matrize wurde exakt als Einzelstrang-Matrize mit Hilfe des T7-Polymerase-Multiwell-Mikrotiterplatten-Sequenzierungsverfahrens (Amersham-Code RPN 1590) sequenziert.
Die Sequenzierungsreaktionen wurden vor dem Laden auf ein Standard-6%- Sequenzierungsgel durch 5minütiges Erhitzen auf 95 ºC denaturiert. Zu diesem Zeitpunkt können die Perlen abgetrennt und der Überstand auf das Gel geladen werden.
Die Elektrophorese und die anschließende Behandlung des Sequenzierungsgels erfolgten exakt nach den Standardprotokollen.

Ergebnisse

In Abbildung 11 sind die Ergebnisse der Sequenzierung eines Abschnitts von M13mp8 mit Hilfe eines biotinylierten PCR-Primers dargestellt.

BEISPIEL 5

Verwendung von mit Biotinyl- bzw. Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit markierten Primern in Sequenzierungsreaktionen

Ausganasstoffe und Verfahren

Primer-Oligonucleotide wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Biotin bzw. Phosphotyrosin markiert. Die Primer wurden bei einer Konzentration von 0.12 OD/ml ( 0,8 uM) in Reihe 3 einer T7-Multiwell-Platte eingesetzt. Die übrigen Verfahrensschritte verliefen gemäß dem Standardprotokoll für das T7-Multiwell- System (Amersham-Code RPN 1590).

Ergebnisse

In Abbildung sind die Ergebnisse der Sequenzierung von M13mp8 mit einem Sequenzierungsprimer dargestellt, der mit einem Biotin (a), acht Biotinen (b), einem Phosphotyrosin (c) bzw, acht Phosphotyrosinen (d) markiert ist.

BEISPIEL 6

Direkter ECL (Enhanced Chemiluminescence)-Nachweis geblotteter Sequenzierungsleitern mit Hilfe markierter Primer

Ausgangsstoffe und Verfahren

Sequenzierungsreaktionen

Die Reaktionen wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt. Als Matrize wurde Einzelstrang-M13mp8 (Amersham-Code N4526) mit 3 ug pro Sequenzierungsreaktion verwendet. Zur Beurteilung der Qualität der Sequenzierungsleiter vor und nach der Übertragung wurde außerdem [³&sup5;S]dATPαS in die Sequenzierungsreaktion aufgenommen.

Blotting des Sequenzierungsgels

Das Blotting des Sequenzierungsgels erfolgte in allen Aspekten exakt nach den Standardprotokollen.
Nach der Elektrophorese wurde die Sequenzierungsleiter wie folgt geblottet: Die Glasplatten wurden voneinander getrennt, und ein Blatt Filterpapier wurde so auf die Geloberfläche gelegt, daß zwischen dem Gel und dem Papier keine Luftbläschen eingeschlossen waren. Anschließend wurde das Gel von der Glasplatte abgehoben und mit der Papierseite nach unten auf eine saubere, glatte Oberfläche gelegt.
Ein Stück Nitrocellulose-Membran (Hybond C-extra, Amersham. Code RPN3O3E) wurde erst in 50 mM Ammoniumacetat (AmAc) angefeuchtet und anschließend vorsichtig auf das Gel gelegt, wobei wiederum darauf geachtet wurde, daß keine Luftbläschen zwischen dem Gel und der Membran eingeschlossen wurden. Auf die Membran wurde ein Blatt Filterpapier gelegt; auch dabei durften keine Luftbläschen eingeschlossen werden. Die über das Gel hinausragenden Ränder der Membran und des Filterpapiers wurden abgeschnitten.
Dieses Gel-Präparat wurde anschließend umgedreht und auf einem Stapel Papiertücher abgelegt, die vorher in 500 mM AmAc getränkt und in einem Ofen bei 50 ºC getrocknet worden waren. Über das Gel wurden dann in 50 mM AmAc getränkte Tücher geschichtet. Auf diese feuchten Tücher wurden ein flaches Perspex-Blatt und Gewichte (ca. 1kg) gelegt. Die Übertragung erfolgte über Nacht.
Nach dem Blotting wurden Membran und Gel voneinander getrennt und die DNA wurde auf der Membran fixiert, indem das Blot 2 Stunden bei 80 ºC auf einen Vakuum-Geltrockner getrocknet wurde. Anschließend erfolgte eine Autoradiografie des Blots, um die Übertragungseffizienz der Sequenzierungsleiter beurteilen zu können.

Nachweis der Sequenzierungsleiter mittels Streptavidin-HRP und ECL

Die Membran mit der übertragenen Sequenzierungsleiter wurde wie folgt behandelt:
Die Membran wurde durch eine einstündige Inkubation in PBS-Tween (0.05 %), das 5 % fettfreie Milch enthielt, blockiert. Nach 6 Waschgängen 5 Minuten in PBS-Tween (0.05 %) wurde die Membran 60-90 Minuten mit einem 1:1000 in PBS-Tween (0.05 %) verdünnten streptavidin-biotinylierten HRP-Komplex (RPN1O51) inkubiert.
Nach 6 Waschgängen 5 Minuten in PBS-Tween (0.05 %) wurde die Sequenzierungsleiter mittels ECL entsprechend der Beschreibung des ECL- Gennachweisverfahrens (Amersham, Code RPN 2101) nachgewiesen.

Ergebnisse

Das Sequenzierungsergebnis aus dem Experiment im Beispiel 6 ist in Abbildung 13 dargestellt.

BEISPIEL 7

Die Verwendung von Biotinyl- und Phosphotyrosinyl-Phosphoramiditen zur Herstellung von Oligonucleotiden, die als Hybridisierungssonden einaesetzt werden sollen (nach Misiura. K, et al. (1990) Nucleic Acids Research. 18 S 4345-4354)

Ausgangsstoffe und Verfahren

Es wurden Biotin- bzw. Phosphotyrosin-markierte M13-Sequenzierungsprimer, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
M13mp19-Einzelstrang-DNA wurde auf vorgefeuchtete (Wasser, dann 1 M Ammoniumacetatlösung) Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell) in Verdünnungsserien von 10 mM Tris-HCl (pH 7.4). 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA (Mengen 0.05-50 ng) getüpfelt. Die Filter wurden 1 Stunde bei 80 ºC verbacken und in 6 x SSC. 0,2 % BSA. 0.2 % PVP 40. 0.2 % Ficoll 400. 0,2 % SDS 10 Minuten bei 60 ºC gewaschen. Nach kurzem Spülen in 6 x SSC erfolgte die Hybridisierung in Lösungen biotinylierter oder phosphotyrosinylierter Oligomere (10 nM) über 2 Stunden bei 37 ºC. Die Filter wurden in 2 x SSC, zweimal für 1 Minute in 0.1 % SDS und anschließend 1 Minute in 2 x SSC gewaschen.
Zum quantitativen Nachweis der biotinylierten Sonden gehörte die einstündige Blockierung der Filter mit 5%igem w/v rekonstituiertein Milchpulver in TBST (Tris-gepufferte Salzlösung plus 0,05 % Tween 20), die Inkubation mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen Biotin (0.1 ug/ml in TBST), das Waschen mit TBST (6 x 5 min) und die anschließende Inkubation mit an die Meerrettichperoxidase konjugiertein Schaf-Anti-Maus-IGG (Amersham. Code NA 931) in einer Verdünnung von 1/1000 in TBST. Nach Waschgängen mit TBST (6 x 5 min) und TBS (1 x 5 min) erfolgte der Nachweis mit Hilfe von ECL-Nachweisreagenzien (Amersham. Code RPN 2105). Die noch feuchten Filter wurden mit einer CCD-Kamera (600-Sekunden-Aufnahmen) fotografiert und mengenmäßig bestimmt. Das Kontrol-17-mer-Oligonucleotid, das direkt an die Meerrettichperoxidase gebunden ist, wurde mit dem ECL- Oligonucleotid-Markierungs- und Nachweisverfahren (Amersham. Code RPN 2111/2113) hergestellt.
Die phosphotyrosin-markierten Sonden wurden mit Hilfe des ECL-Verfahrens quantitativ nachgewiesen. Der Primärnachweis erfolgte mit einem monoklonalen Maus- Antikörper gegen Phosphotyrosin (0.5 ug/ml). Als zweiter Antikörper wurde an Meerettichperoxidase konjugiertes Schaf-Anti-Maus-IgG. (Amersham, Code NA 931) in einer Verdünnung von 1/1000 verwendet.

Ergebnisse

Mit steigender Anzahl von Biotin-Resten in der Sonde erhöhte sich die Signalstärke beim Nachweis von M13-DNA deutlich (Abbildung 14). Das Zwischenschalten von Thymidinyl-Resten in das Biotin hatte im Vergleich zur Sonde. bei der kein Thymidinyl zwischengeschaltet wurde, bei dieser M13-DNA-Konzentration eine 50%ige Erhöhung der Signalstärke zur Folge. Darüber hinaus lag die Nachweisempfindlichkeit der (bio)&sub8;-17-Sonde bzw, der (bio-dT)&sub3;-bio-17-Sonde mit zwischengeschaltetein Biotinyl bei einem sehr ähnlichen Wert wie die, die mit dem gleichen, jedoch direkt an Meerettichperoxidase konjugierten 17-mer erreicht wurde.
Auch die Signalstärke erhöhte sich mit steigender Anzahl von Phosphotyrosinyl-Resten entscheidend (Abbildung 15), obwohl der Effekt sich nicht so deutlich abzeichnete wie im Fall der biotinylierten Oligonucleotide. Bei Phosphotyrosin, bei dem Thymidinyl-Reste zwischengeschaltet wurden, ergab sich im Vergleich zu den Sonden ohne Zwischenschaltungen ein leichter Anstieg der Signalstärke.
Mit dem ECL-System und den biotinylierten bzw, phosphotyrosinylierten Sonden wurde zwischen der Menge des produzierten Lichts und der Menge der auf die Filter getüpfelten M13-DNA eine lineare logarithmische Beziehung beobachtet (Misiura. K, et al., (1990) Nucleic Acid Research. 18. S. 4345-4354).

Abbildungen

Abbildung 9 Auswirkung der Länge des Biotinschwanzes auf die Effektivität des Einfangens von DNA - Experiment 1
Abbildung 10 Auswirkung der Länge des Biotinschwanzes auf die Effektivität des Einfangens von DNA - Experiment 2
Abbildung 11 PCR-Sequenzierung von M13mp8 mit Hilfe eines biotinylierten PCR-Primers
Abbildung 12 Sequenzierung von M13mp8 mit Hilfe biotinylierter oder phosphotyrosinylierter Primer
15 Abbildung 13 Direkter ECL-Nachweis geblotteter Sequenzierungsleitern mit Hilfe markierter Primer
Abbildung 14 Signalstärke für den ECL-Nachweis von 5 ng M13-DNA für jede von fünf biotinylierten Sonden
A - 1 Biotin
B - 2 Biotine
C - 4 Biotine
D - 8 Biotine
E - 4 Biotine mit 3 zwischengeschalteten Thymidinen
F - direkt mit Meerrettichperoxidase markierte Sonde
Abbildung 15 Signalstärke für den ECL-Nachweis von 10 ng M13-DNA für jede von fünf phosphotyrosinylierten Sonden
A - 1 Phosphotyrosin
B - 2 Phosphotyrosine
C - 4 Phosphotyrosine
D - 8 Phosphotyrosine
E - 4 Phosphotyrosine mit 3 zwischengeschalteten Thymidinen

Literatur

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12. Haralambidis, J., Angus, K., Pownall. S., Duncan, L., Chai, M. und Tregear, G.W. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 501-505
13. Alves, A.M., Holland, D. und Edge, M.D. (1989) Tetrahedron Letters, 30, 3089-3092
14. Cocuzza, A.J. (1989) Tetrahedron Letters, 30, 6287-6290
15. Satoh, T., Suzuki, S., Suzuki, Y., Miyaji, Y, und Imai, Z. (1969) Tetrahedron Letters, 4555-4558
16. Sinha, N.D., Biernat, J., McManus, J, und Köster, H. (1984) Nucleic Acids Res., 12, 4539-4557
17. Caruthers, M.H. (1985) Science, 230, 281-285
18. Duckworth, M.L., Gait, M.J., Goelet, P., Hong, G.F., Singh, M. und Titmas, R. (1981) Nucleic Acids Res., 9, 1691-1706
19. Carpino, L.A. und Han, G.Y. (1970) J. Amer. Chem. Soc., 92, 5748-5749
20. Bayer, E.A. und Wilchek, M. (1974) Methods Enzymol., 34, 265-267
21. Uhlman, E. und Engels, J. (1986) Tetrahedron Letters, 27, 1023-1026
22. McCormick, D.D. und Ruth, J.A. (1970) Methods Enzymol., 18A, 383-385

Claims

1. Ein Phosphoramidit-Derivat mit folgender Formel: wobei x = eine Markergruppe und Y und Z = Schutzgruppen sind.

2. Ein Phosphoramidit-Derivat wie in Anspruch 1 beschrieben, mit einem Linker- Arm nicht festgelegter Länge zwischen der Markergruppe x und dem Rest des Moleküls.

3. Ein Phosphoramidit-Derivat wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beschrieben, wobei x eine Hapten- oder eine andere nachweisbare Komponente ist.

4. Ein Phosphoramidit-Derivat wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beschrieben, wobei x Biotin ist.

5. Ein Phosphoramidit-Derivat wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei Z Fluorenylmethoxycarbonyl ist.

6. Ein Phosphoramidit-Derivat wie in einem der oben genannten Ansprüche beschrieben, wobei Y 4.4' -Dimethoxytrityl ist.

7. Ein Verfahren zur Herstellung eines Phosphoramidit-Derivats mit folgender Formel:

das die folgenden Schritte umfaßt:

i) Reaktion von Solketal mit Acrylnitril zum Additionsprodukt 2-Cyanethylsolketal (I):

ii) Reduktion der entstandenen Verbindung (I) zu 3-Aminopropylsolketal (11):

iii) Reaktion der entstandenen Verbindung (II) mit Biotin-N-hydroxysuccinimid zu N-Biotinyl-3-aminopropylsolketal (III):

iv) Reaktion der entstandenen Verbindung (III) mit 4,4' -Dimethoxytritylchlorid zu 1-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3-0-(N-biotinyl-3-aminopropyl)glycerol (IV):

v) Phosphorylierung der entstandenen Verbindung (IV) zum gewünschten Biotinyl- Phosphoramidit-Derivat (V): DMTr = 4,4'-Dimethoxytrityl

8. Ein Verfahren zur Herstellung eines Phosphoramidit-Derivats mit folgender Formel:

das die folgenden Schritte umfaßt:

i) Reaktion des L-Tyrosinbenzylesters mit 9-Fluorenylmethylchlorformiat zu N- Fluorenylmethoxycarbonyl-L-tyrosinbenzylester (VI):

ii) Phosphorylierung der entstandenen Verbindung (VI) mit anschließender Oxidation zu N-Fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2-cyanethyl)phosphat]-L- tyrosinbenzylester (VII):

iii) Debenzylierung der entstandenen Verbindung (VII) zu N- Fluorenylmethoxycarbonyl-0-[bis(2-cyanethyl)phosphat]-L-tyrosin (VIII):

iv) Reaktion der entstandenen Verbindung (VIII) mit Pentafluorphenol zum entsprechenden Pentafluorphenyl-Derivat (IX):

v) Kopplung der entstandenen Verbindung (IX) zum 3-Aminopropylsolketal (II). Entfernung der Isopropyliden-Gruppe vom entstandenen Solketal-Derivat mit anschließender Reaktion des Produkts mit 4.4'-Dimethoxytritylchlorid und Phosphorylierung des sich daraus ergebenden Produkts zum gewünschten Phosphotyrosinyl-Phosphoramidit-Derivat (XII):

9. Ein Verfahren zur Einzel- bzw. Mehrfachmarkierung von synthetischen Oligonucleotiden, das den Einsatz eines Phosphoramidit-Liganden umfaßt, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beschrieben.

10. Ein Verfahren wie in Anspruch 9 beschrieben, wobei die Markierung mit dem genannten Phosphoramidit-Liganden am 5'-Ende bzw. 3'-Ende des Oligonucleotids oder an einer beliebigen internen Position entlang der Kette erfolgt.

11. Der Einsatz eines Phosphoramidit-Derivats zur Herstellung von Oligonucleotiden wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beschrieben.

12. Der Einsatz eines Phosphoramidit-Derivats wie in Anspruch 11 beschrieben, wobei die Oligonucleotide als Hybridisierungssonden verwendet werden.