JP5560039B2 - ハイスループット分析のための多機能のコード化された粒子 - Google Patents

Description

本願は、２００６年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６０／８４９，６５１号に対する優先権を主張し、この出願の内容は本明細書中に参考として援用される。

（発明の背景）
本発明は、ハイスループットの生体分子分析、より詳しくは多機能のコード化された粒子を利用したシステムに関する。

多数のタンパク質、サイトカイン、または核酸配列を、単一の試料を用いて並行に定量化する能力は、研究者や臨床医が最小限の試験時間、試料体積、およびコストで高密度の情報を獲得することを可能にする。かかる多重化分析は、分子的なコード化、および複雑な混合物を用いて試験感度、特異性、並びに再現性を維持する必要性を含むいくつかの課題を伴う。多重化に利用される、広く分類して２つの技術がある：平面アレイ（１〜３）およびサスペンション（粒子ベース）アレイ（４〜２１）、これらはともにアプリケーション特有の利点がある。括弧内の数字は付記する参考文献を参照し、それらのすべての内容は参照によりここに取り込まれる。ＤＮＡおよびタンパク質マイクロアレイのような平面アレイは、超高密度分析を必要とするアプリケーションに最適である。これと比較してサスペンションアレイは、溶液の反応速度、試験変更の容易さ、高い試料スループット、およびバッチ合成による良好な品質管理から恩恵を受ける（２２）。粒子ベースアレイは、遺伝子型を高密度で決定するアプリケーションに利用されてきたが（２３）、マイクロアレイと比較して、適度な数のターゲットを大集団にわたって検出するとき或いはプローブ一式を迅速に変更したいときに最も有利になる。平面アレイが位置のコード化に厳密に依存するのに対して、サスペンションアレイは多くのコード化の仕組みが用いられており、それらは分光法的（４〜１１）、図式的（１２〜１６）、電子的（１７〜１９）、または物理的（２０、２１）として分類することができる。

分光法的コード化は、種を同定するために［フルオロフォア（４〜７）、発色団（８）、フォトニック構造（９）、およびラマンタグ（１０、１１）を含む］特定波長の光または放射を用いる。蛍光性コード化マイクロビーズ（４〜７）は、従来のフローサイトメトリーを用いて［または光ファイバーアレイ上で（２４）］容易に処理でき、多重化のプラットフォームとして評判がよい。しかし、多数の蛍光信号をバーコード法の手段として利用するには、（ｉ）スペクトルが重複するため達成可能なバーコードが制限される（典型的には約１００）、（ｉｉ）フローサイトメーターが嵩張り可搬性に欠ける、（ｉｉｉ）各々必要な蛍光励起源および検出機器によりコストが付加される、および（ｉｖ）コード化用蛍光と検体検出用蛍光とが干渉する可能性があるなど、いくつかの不利な点がある。これらの理由から、マイクロキャリア上にバーコードを空間的に埋め込む、図式的技術を用いた単一蛍光法が存在する。

図式的バーコードは、マイクロキャリア上において光学的要素をパターニングすることに依存し、いくつかの例は、縞状ロッド（１２、１３）、リッジ状粒子（１４）、およびドットパターンをもつ粒子（１４、１５）を含む。かかる粒子（金属またはフォトレジスト）の作製に用いる化学反応は、表面に生体分子を接合するために付加的なカップリング化学反応を必要とし、縞状ロッドの場合、各金属パターンを一度につき１バッチ形成する必要がある。通常、これらの粒子上パターンは、ターゲット信号の蛍光が十分強いときだけ識別できる。マイクロキャリアをコード化するまた別の図式的方法は、蛍光ビーズをコードで選択的に光退色させる（１６）。この方法は、粒子合成および復号化の両方に時間がかかり、ハイスループット分析の候補にはなりそうにない。蛍光を完全に排除する方法は、無線周波数のメモリータグを用いる（１７〜１９）。このやり方は、ほぼ無制限のバーコード（＞１０^１２）が可能なために非常に強力であり、バーコードの仕組みを検体の定量化（蛍光）から切り離すが、しかしこれらの電子マイクロチップベースのキャリアを相当数（数千または数百万）合成するにはコストと時間がかかることになりかねない。多重化分析のために開発された、これらおよびいくつかの他の方法は、別のところで十分にレビューされている（２５、２６（非特許文献１、非特許文献２））。

Ｎ．Ｈ．Ｆｉｎｋｅｌ，Ｘ．Ｌｏｕ，Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｈｅ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６，３５２Ａ（２００４） Ｋ．Ｂｒａｅｃｋｍａｎｓ，Ｓ．Ｃ．Ｄ：Ｓｍｅｄｔ，Ｍ．Ｌｅｂｌａｎｓ，Ｒ．Ｐａｕｗｅｌｓ，Ｊ．Ｄｅｍｅｅｓｔｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１，４４７（２００２）

（発明の要旨）
一様態において、本発明は、蛍光性の実体を加えた第１のモノマー流をマイクロ流体チャンネルに沿って流すことを含む、多機能粒子を作製するための方法である。プローブを加えた第２のモノマー流は、該マイクロ流体チャンネルに沿って、該第１のモノマー流に近接して流れる。該２つのモノマー流は、蛍光性グラフィックコード化領域およびプローブ担持領域を有する粒子を合成するために重合される。望ましければ、２つ以上のモノマー流があってもよい。好ましい実施形態において、該重合ステップは、コード化領域をつくるために、フォトマスクを通した紫外光に該第１および第２のモノマー流をさらすことを含む。該コード化領域は、複数の開いたおよび閉じたコーディング要素を含んでもよい。該コード化された要素は、２次元格子に配置されることが好ましい。例となる格子は、２０のコーディング要素を含む。該格子は、少なくとも１つの方位標識を含むこともできる。また別の好ましい実施形態において、該重合ステップは、プローブを担持した１つより多くの領域をつくり出す。

好ましい実施形態において、該紫外光は、顕微鏡の対物レンズで集光される。該第１および第２のモノマー流に適した材料は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートである。該第１および第２のモノマー流は、好ましくは光開始剤を含む。

さらにまた別の様態において、本発明は、第１のグラフィックコード化領域および第２のプローブ担持領域を含む多機能粒子である。

さらにまた別の様態において、本発明は、グラフィックコード化領域およびプローブ担持領域を有する多機能粒子を含む、ハイスループットのスクリーニングシステムである。フローフォーカシング・マイクロ流体デバイスが粒子を整列させて読み取るために提供される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
蛍光性の実体を加えた第１のモノマー流をマイクロ流体チャンネルに沿って流すこと、
プローブを加えた第２のモノマー流を前記マイクロ流体チャンネルに沿って前記第１のモノマー流に近接して流すこと、および
蛍光グラフィックコード化領域およびプローブ担持領域を有する粒子を合成するために前記モノマー流を重合すること、
を備える多機能粒子を作製するための方法。
（項目２）
前記プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プローブは、タンパク質を含む項目１に記載の方法。
（項目４）
前記プローブは、細胞を含む項目１に記載の方法。
（項目５）
前記プローブは、ウイルスを含む項目１に記載の方法。
（項目６）
前記プローブは、カーボンナノチューブを含む項目１に記載の方法。
（項目７）
前記プローブは、細胞小器官を含む項目１に記載の方法。
（項目８）
前記プローブは、陰性対照として機能するための不活性種を含む項目１に記載の方法。
（項目９）
前記重合ステップは、コード化領域をもつ粒子をつくるために、フォトマスクを通した紫外光に前記モノマー流をさらすことを含む項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記コード化領域は、複数の開いたおよび閉じたコーディング要素を含む項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記コーディング要素は、２次元格子に配置される項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記格子は、２０のコーディング要素を含む項目１１に記載の方法。
（項目１３）
少なくとも１つの方位指標をさらに含む項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記コーディング要素は、不均一な形状またはサイズをもつ項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記重合ステップは、１つより多くのプローブ担持領域をつくり出す項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記重合ステップは、１つより多くのコーティング領域をつくり出す項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記紫外光は、顕微鏡対物レンズで集光される項目９に記載の方法。
（項目１８）
前記第１および第２のモノマー流は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含む項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第１および第２のモノマー流は、光開始剤を含む項目１８に記載の方法。
（項目２０）
プローブを担持した少なくとも１つの領域に
共有結合的に連結した少なくとも１つのグラフィックコード化領域、
を備える多機能粒子。
（項目２１）
グラフィックコード化領域およびプローブ担持領域を有する多機能粒子、並びに
前記粒子を整列させて読み取ることに適合したフローフォーカッシング・マイクロ流体デバイス、
を備えるハイスループットのスクリーニングシステム。
（項目２２）
プローブの接近性を向上させることをさらに含む項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記粒子の前記プローブ担持領域における表面積を増加させることによりプローブの接近性が向上される項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記粒子の前記プローブ担持領域において、リッジまたはくぼみを形成することにより表面積が増加される項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記粒子の前記プローブ担持領域において、細孔サイズを拡大することによりプローブの接近性が向上される項目２２に記載の方法。

単一プローブ、半分が蛍光性の粒子を作製するための２つの隣接する層流に跨る重合を示す、ドット状にコード化された粒子合成に関する概略斜視図である。 単一プローブ、半分が蛍光性の粒子の説明図である。 コード化および検体検出のための粒子の特徴に関する略図である。 図１Ａに示す技術により形成された粒子の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）像である。 単一プローブ粒子の顕微鏡写真である。 多プローブ粒子を示す顕微鏡写真である。 プローブが勾配をもつ、コード化された粒子を示す顕微鏡写真である。 勾配をもつ粒子の中心線に沿った蛍光強度のプロットである。 単一プローブ粒子を用いた多重化分析を示す。 単一プローブ粒子を用いた多重化分析を示す。 単一プローブ粒子を用いた多重化分析を示す。 多プローブのコード化された粒子を用いた多重化分析を示す。 多プローブのコード化された粒子を用いた多重化分析を示す。 多プローブのコード化された粒子を用いた多重化分析を示す。 ハイブリダイゼーション後に、粒子を整列させて読み取るために用いるフローフォーカシング・マイクロ流体素子を図式的に示す斜視図である。 図３Ａに示すフロースルーデバイスで撮影された粒子の典型的な像である。 コードを顕現させてオリゴマーターゲットを検出するために、粒子の５つの筋に沿って取得した蛍光強度のスキャンを示すグラフである。 図４Ａは、一次元コード化の仕組みを含む粒子の概略図である。図４Ｂは、スリット照明を示す概略図である。図４Ｃは、取得した蛍光信号における、異なる深さの一連の谷を備える信号対時間のグラフである。 異なるプローブ濃度をもつ粒子の蛍光強度を示すグラフである。 ターゲットのハイブリダイゼーション後における、粒子部分を横切る蛍光強度のプロットである。粒子像上の白線は、スキャン領域を示す。 異なるターゲット濃度でインキュベートした粒子のハイブリダイゼーション信号（蛍光強度）のプロットである。

（好ましい実施形態の説明）
これら多重化の限界の多くを克服する技術を紹介する。マイクロ流体の層流特性を有効に用いることにより、検体のコード化とターゲットの捕獲のための別個の領域をもつ多機能粒子を形成する能力を実証する（図１）。典型的な実験において、（一方は蛍光色素を加え、他方はアクリラート修飾したプローブを加えた）２つのモノマー流をマイクロ流体チャンネルに沿って近接して流し、一種の連続流リソグラフィー（２７）を用いて、［紫外（ＵＶ）光の３０ｍｓバースト（ｂｕｒｓｔ）により］流れに跨って粒子を重合させた（２８）。このようにして、蛍光性グラフィックコード化領域およびプローブ担持領域をもつ粒子を単一ステップで合成することができる。各々の粒子は、押し出された２次元（２Ｄ）の形状（図１Ｂ）であり、形態は顕微鏡の視野絞り位置に挿入したフォトマスクによって決まり、化学反応は並行モノマー流の組成によって決まる。架橋したポリマー粒子は、次に［チャンネル表面付近の酸素阻害（２７）のために付着せずに］チャンネルに沿って流れ、溶液溜に収集される。粒子は、過剰モノマーをすすいだ後に生物学的試験に用いることができる。

プローブの接合後に表面を「ブロック」する必要のない基礎部分として、かつ蛍光信号を粒子の両面から透過できる透明材料として、（生体不活性ポリマーとしてよく知られる）ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いた。これらの特性は、検体検出の特異性および感度の両方を向上させるものである。検体検出信号を増加させることは、粒子のプローブ領域の表面積を増加させてプローブに接近しやすくすることにより達成できる。表面積は、例えば、リッジまたはくぼみを加えることにより増加させることができる。信号は、細孔サイズの増加によっても増加できる。百万（２^２０）を越えるコードを担い得る粒子を形成するために、単純なドットコード化の仕組みを用いた（図１Ｃ）。粒子は、方位に関わらずコード位置および読み出し「方向」を識別するための配列標識を用いて、長さ方向の５つの筋に沿って「読み出される」ように設計した（図１Ｃ）。粒子の平坦で長い形状は、フロースルーデバイスでスキャンするためにそれらを整列させるのに役立つ。様々な化学反応を粒子上で空間的に分離することにより、単一のフルオロフォアを用いて、復号化およびターゲット検出を達成することが可能になる。

粒子合成の多用途性を実証するために、複数のモノマー流をひとつのフルオロフォアで選択的に標識し、様々なチャンネルデザインを用いて単一プローブ領域、多数プローブ領域、およびプローブ領域勾配を担う粒子を形成した（図１、ＥからＧ）。いくつかの注入流をもつチャンネルを用いて作られる多プローブ粒子（図１Ｆ）は、いくつかのターゲットを単一粒子で直接比較することを可能にする。さらに、プローブ勾配（図１Ｇ）は、ただ長いチャンネル中で流れに跨ってプローブを拡散させるだけで作られるが、固定化した検出感度を用いるときに（信号が飽和してもよいときに）、検体の検出範囲は広げるのに役立つ。勾配に磁性ナノ粒子を取り込めば、振動磁場で刺激したときに粒子に沿って温度変化をつくり出すこともできる（２９）。

本方法の重要な特徴は、コード化された粒子中にプローブを直接に取り込むことである。これは、アクリラート修飾した生体分子をモノマー溶液に単に加えることにより達成される。重合した後、プローブはポリマーネットワークに共有結合的に連結される。このプロセスは、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質プローブの両方に適用できる（３０〜３２）。プローブ接合粒子を合成するために用いるＵＶの短いバーストが、取り込まれるオリゴヌクレオチドの機能性を損なわないことを実証する。発明者は、これまでに、ほぼ同じモノマー成分から作ったポリマー構造に取り込まれたビーズ結合抗体について同様の結果を示している（２８、３３）。

多重化の能力を実証するために、ＤＮＡ配列検出用のアクリラート修飾したオリゴヌクレオチドプローブ（これらは市販されている）を用いた（図２、ＡからＣ）。３バッチの粒子を合成した：それらの１つは２０塩基対（ｂｐ）オリゴヌクレオチドプローブ１（５’−ＡＴＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＡ−３’）を、また別の１つはプローブ２（５’−ＣＡＣ ＴＡＴ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＴ−３’）を載せ、３番目はプローブがなく対照として用いた。ターゲットは、これら２つのプローブに対する相補的配列をもつ蛍光標識したオリゴヌクレオチドであった。粒子を混合してターゲット１（１μＭ）、ターゲット２（１μＭ）、両ターゲット（共に０．５μＭ）、またはターゲットなしのいずれかを含むマイクロウェル中で室温において１０分間インキュベートした（２８）。プローブ領域の蛍光は、陽性のターゲット検出を示し、粒子端部でより顕著であった。この結果は、ターゲットが粒子本体中に数μｍ拡散してハイブリダイズできたことを示唆した（２８）。粒子は、各々の事例において、均一性とともにオリゴマーに対する高い特異性を示し（２８）、ターゲットが存在するときだけ蛍光を呈した（図２Ｃ）。

本多重化の仕組みの効力をさらに実証するために、多数の近接する機能性をもつ粒子を用いて、同じ配列の検出試験を行った（図２、ＤからＦ）。このように、同じ単一粒子上で、２つのターゲット配列に対して（陰性対照とともに）同時に試験を行うことができた。かさねて、この試験は特異性が高く（図２Ｆ）、粒子−粒子間で非常に均一であった（図２Ｄ）（２８）。粒子上のプローブ間界面は非常に急峻であり、さらに高い多重化能力のために、より薄いストライプを用いることもできよう。

多重化分析に関する本方法がハイスループット応用に対して実用的なことを証明するために、フロースルーデバイス中で粒子をスキャンする簡単な仕組みを開発した（図３）。前述のハイブリダイゼーション実験に用いた多プローブ粒子（図２、ＤからＦ）をマイクロ流体チャンネルを通して流し、倒立蛍光顕微鏡で観察した（２８）。粒子は、フローフォーカシングにより整列されて、粒子幅よりわずかに広いだけのチャンネルを通過した（図３Ａ）。粒子が付着することなく順調にチャンネルに沿って確実に流れるように、生体に適した界面活性剤（２８）を用いた。像は、チャンネルの指定された検出領域で、粒子が視野を通過したときに（２０倍対物レンズを用いて）１／１２５の露出で撮影した。像シーケンスを後で解析し、粒子コードの決定およびターゲットの定量化を行った。

代表的な粒子像（図３Ｂ）とこれに対応する５つの粒子「読み取り筋」に沿った強度プロットを示す。各々の筋に沿ったコードは、強度プロットの急峻なくぼみおよび平坦部を解析することにより決定できる。対照領域の蛍光を用いることにより、各粒子について、陽性のターゲット検出を対照の平均強度プラス３標準偏差として定義した。短い１０分ばかりのインキュベーション後に、両方のオリゴヌクレオチドターゲットの存在を正しく確認することができた。

上述の２次元ドットパターンの仕組みは、たいへん強力であるがかなり精巧な空間的検出が必要になる。図４に示す潜在的により実用的な「１次元」コード化の仕組みは、より控え目なおよそ２５００コードを提供することができる。２次元配列と同様に、コードは蛍光バックグラウンド中の一連の孔であるが１次元であり、図４Ｃに示すように幅全体を横切ってスキャンしたときには一連のピークと谷を与える。図４の実施形態は、復号化の精度が確保されるように（好ましくは内蔵の「キャリブレーション」により）再現性を有し、粒子の完全性および要求サイズは大きな影響を受けることがない。

この実施形態では、粒子を正確かつ迅速にスキャンするために、極めて高感度の光検出を用いた高速サンプリングを提供する検出の仕組みを用いる。伝統的なマイクロアレイスキャナーおよびフローサイトメーター（およびそれらのマイクロ流体対応物）は、この目的のために光電子増倍管（ＰＭＴ）を利用する（３７、４２、４３）。これらのシステムは、極めて高いサンプリング速度（ＭＨｚ程度）および並外れた感度を提供し、この応用に理想的である。これらのモジュールは、顕微鏡のカメラポートに直接搭載でき、然るべき光源を所与として標準のデータ収集ソフトウェアとともに用いれば、上述のフローフォーカシング・デバイスとシームレスに使用することができる。

本発明のこの実施形態の簡単なセットアップにおいて、ＰＭＴモジュールは、顕微鏡ポートを通して中継されるすべての光を収集する。従って、粒子を復号化するために用いる空間的な情報を得るためには、粒子が動く方向に直角な薄いスリット領域だけに光を当てることが好ましい。このスリットのサイズは、コード化およびプローブの形状により設定され、１０μｍオーダーになると思われる。この分解能は、単にマスクを本投影露光のセットアップで用いるだけで達成できる（２７）。線状に集光したレーザービームのような、より複雑な照明光源を用いてもよい（４４、４５）。本発明のまた別の実施形態では、広い照明をＰＭＴ検出器の前に置いたスリット状フィルターとともに用いてもよい。

本システムのスループットは、主として検出の仕組みと粒子サイズとで決まる。本研究のために合成した粒子は、他のフロースルー法と比較して相対的に大きく、幅９０μｍ、厚さ約３０μｍ、および長さ１８０から２７０μｍの寸法である。サイズが大きいとシステムのスループットが制限されるだけでなく試料体積も増加する。しかし、本発明者が実証した高い粒子−粒子間の再現性（２８）の故に、典型的なフロースルーシステムに比べて、冗長度はずっと低くてもよく、効率は向上する。控え目な見積りを用いて、一見粒子サイズが大きいにも関わらず、本システムが処理しやすい試料体積（２８）を用いる高速、高密度分析を提供可能であるべきことを見出した。

非常に再現性があるのに加えて、本システムは非常に高感度であることも示した。ビオチン−アビジン添加による信号増幅なしに、３０分のインキュベーションで５００ａｔｔｏｍｏｌのＤＮＡオリゴマーを順当に検出することができる（２８）。このことは、本システムが現在市販されている多重化技術と少なくとも同じくらい感度があり、加えて一体化された粒子合成、多数プローブの組み込み、低コスト（２８）、実質的に無制限のコード、および標準に過ぎない蛍光顕微鏡を用いた実施といった利点があることを信じさせる。

材料および方法
材料
本実施例の粒子合成は、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノン光開始剤（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むポリ（エチレングリコール）ジアクリラート（ＰＥＧ ＤＡ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ_ｎ＝７００）に基づくモノマー溶液から作製した。ハイブリダイゼーション実験のために、１〜２．５％開始剤および濃度５０μＭのＤＮＡオリゴマープローブを含む２：１ ＰＥＧ−ＤＡ：ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（Ｒｏｃｋｌａｎｄ），１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＯｍｎｉＰｕｒ））のモノマー溶液を用いた。オリゴマープローブ（ＩＤＴ）は、反応性アクリダイト（Ａｃｒｙｄｉｔｅ）基および１８炭素スペーサーで修飾した（プローブ＃１：５’−アクリダイト−Ｃ１８−ＡＴＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＡ−３’，プローブ＃２：５’−アクリダイト−Ｃ１８−ＣＡＣ−ＴＡＴ−ＧＣＧ−ＣＡＧ−ＧＴＴ−ＣＴＣ ＡＴ−３’）。コード化領域の蛍光は、並行流を明視野顕微鏡で容易に視覚化するための１％青色食品着色料を含む、それぞれのモノマー溶液に０．００５重量パーセントのメタクリロイルオキシエチルチオカルバモイルローダミンＢ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を取り込むことにより得られた。

マイクロ流体素子
マイクロチャンネルは、ソフトリソグラフィーの標準的な手順を用いて形成した。ＳＵ−８フォトレジスト（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）を用いて作製したチャンネル起伏をもつシリコンウェーハ上で、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を硬化させた。多数（２〜７）の１００μｍ幅の注入チャンネルが一つのより広い共通チャンネル（２００〜５００μｍ幅）に合流するようにチャンネルを設計した。外科用メスでチャンネル（および溶液溜）を切り取り、各注入口に孔を開け、ＰＤＭＳ被覆したガラススライドに封止した。（圧力弁（Ｃｏｎｔｒｏｌａｉｒ Ｉｎｃ．）で調整した）共通の圧力源にゴム管（Ｔｙｇｏｎ）を用いて接続したピペットの先端（１０μｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）に各々約５μｌのポリマーを満たしてチャンネルの注入ポートに挿入した。加圧（約１ｐｓｉ、高速）と周囲圧力（流れなし）間を三方電磁弁（Ｂｕｒｋｅｒｔ、手動操作）で変動させることができた。

光重合のセットアップ
ＡＵＴＯＣＡＤを用いて設計したフォトマスクをＣＡＤ／Ａｒｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ（Ｂｒａｎｄｏｎ，オレゴン州）において２００００ｄｐｉの解像度で印刷した。１００Ｗ ＨＢＯ水銀ランプおよび広帯域励起紫外（ＵＶ）フィルターセット（１１０００ｖ２：ＵＶ，Ｃｈｒｏｍａ）を装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００顕微鏡の視野絞り位置にマスクを挿入した。所望のＵＶ励起パルスを供給するために、コンピューター駆動のシャッターシステム（ＵｎｉＢｌｉｔｚ）を所定の位置に置いた。ＵＶ励起の３０〜５０ｍｓバーストを用いて、マイクロ流体チャンネルの隣接流に跨って粒子を重合した。三方弁を用いて流速を制御し、粒子は、流れのない状態で重合した後、直ちに加圧状態でチャンネルに沿ってフラッシュし−隣接流間に粒子の特徴である高解像度の清浄界面をもたらした。ＣＣＤカメラ（ＫＰＭ １Ａ，Ｈｉｔａｃｈｉ）をＮＩＨイメージソフトウェアとともに用いて、重合のための視覚的な位置合わせを行った。

粒子の回収
重合した後に粒子を容器溜に収集し、そこで未反応のモノマーを取り除いた。粒子は、ＴＥ緩衝液で数回、次にＰＥＧ−ＤＡモノマーで、そして再びＴＥ緩衝液ですべての残留した蛍光が無くなるまですすいだ。各すすぎの後に粒子を容器溜の底に沈め、過剰のすすぎ液を上部からピペットに取った。粒子は、通常直ちにハイブリダイゼーション実験に用いた。時には、暗い環境中で数日間保存した後に使用したが、機能性の喪失は見られなかった。

オリゴマーのハイブリダイゼーション
各ハイブリダイゼーション実験のために、粒子をピペットで別々のＰＤＭＳ容器溜に入れた。Ｃｙ３フルオロフォアで修飾した相補性のターゲットＤＮＡオリゴマー（ＩＤＴ）を、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）および０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に１μＭ濃度で懸濁させた。ターゲットオリゴマー溶液を然るべき溶液溜にピペットで入れ、粒子を室温で１０分間インキュベートした。次に、粒子をＴＥ緩衝液ですすぎ、ローダミンＢおよびＣｙ３フルオロフォアの両方と適合するオレンジ・ロングパスフィルターセット（ＸＦ １０１−２，Ｏｍｅｇａ）を用いて視覚化した。Ｎｉｋｏｎ Ｄ２００デジタルカメラを用いて静止画を記録した。

粒子の読み取り
ＰＤＭＳ被覆したガラススライド上で、フローフォーカシング・マイクロ流体チャンネルの流入口をプラズマシールした。粒子の読み取りに先立って、チャンネルを「読み取り緩衝液（２５％ ＰＥＧ−ＤＡおよび０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＥ）」で５分間フラッシュした。ハイブリダイゼーション実験に用いる多プローブ粒子を読み取り緩衝液で再懸濁し、チャンネルの容器溜にピペットで注入した。前述の圧力システムを水柱とともに用いて、チャンネルを真空に引いて流体の流れを誘起した。粒子が１００μｍのチャンネル狭窄部の通って流れるのをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００顕微鏡で観察し、ＣＣＤカメラ（Ｈｉｔａｃｈｉ ＫＰＭ１Ａ）により蛍光のもと１／２５０秒の露出で撮像した。動画は、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅを用いて１秒当り１０フレームで撮影した−粒子速度を計算し、強度プロフィルを各粒子の５つの「筋」に沿って取得した。粒子の対照領域に沿った強度の平均値および標準偏差を取得した。オリゴマーターゲットからの陽性の読み取りは、陰性対照信号の平均値プラス３標準偏差として定義した。

粒子組成の検討
プローブ濃度
信号検出に対する濃度の効果を測定するために、モノマー中におけるオリゴマープローブの一連の希釈を利用した。プローブ濃度が１５０、７５、３７．５および１８．７５μＭの粒子を合成した。対照粒子（０μＭ プローブ）を用いて、バックグラウンド強度（Ｉ_ｂ）を測定した。蛍光標識したターゲット１μＭとともに粒子を３０分間インキュベートしてからすすぎ、撮像して蛍光強度（Ｉ_ｐ）を測定した。差Ｉ_ｐ−Ｉ_ｂとして得た蛍光信号を任意単位（ＡＵ）で報告する。図５に結果を示す。グラフ上のエラーバーは、各測定における標準偏差を表し、平均の変動係数（ＣＯＶ）は９％である。

図から明らかなように、強度はプローブ濃度とともに線形に増加する。この発見は、２つの相補的なオリゴマーの結合を考慮するときに予測される、平衡状態において、この関係は、以下のように与えられる。

Ｔ＝ターゲット、Ｐ＝プローブ、およびＴＰ＝二本鎖の複合体である。平衡状態において、種の濃度は、解離定数Ｋ_ｄにより次のように特性を表すことができる：

もし、本実験のように［Ｔ］_ｏ＞＞［Ｐ］_ｏであれば、そのときには

である。これと関係式［Ｐ］＝［Ｐ］_ｏ−［ＰＴ］を用いて、以下の式が得られる：

それ故、所与の初期ターゲット濃度に対して、信号（これは［ＰＴ］に比例する）はプローブ濃度に対して線形と予測できる。プローブ濃度の増加により一層大きい信号が得られるであろうが、原理実験を立証するために５０μＭのプローブを取り込むことにした。この濃度は、オリゴマーの使用が最小限であっても、ターゲット検出に十分な信号を生じた。

モノマー
架橋剤として、３つの鎖長（Ｍ_ｎ＝２００，４００，７００）のポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、およびアクリルアミドのＰＥＧ−ＤＡとのブレンドも含めて、いくつかのポリマーのバーコード粒子への使用について調べた。ポリマーブレンドを選択するときに調べた特性は、（１）速い重合反応速度、（２）ハイブリダイゼーション前の低いバックグラウンド蛍光、（３）ハイブリダイゼーション後の強い蛍光であった。作製したすべてに溶液は、モノマー（純粋またはＴＥ緩衝液と２：１）、２．５％光開始剤、およびＤＮＡオリゴマー５０μＭからなる。粒子は、３０ｍｓＵＶ露光を２０倍対物レンズとともに用いて作製した。

ハイブリダイゼーションの信号は、モノマーブレンドがＴＥ緩衝液を含むときに著しく高いことを見出した。これは、重合ＰＥＧのヒドロゲルに取り込まれたビーズ結合タンパク質が、緩衝液がない場合に機能性を失うことを見出した発明者の以前の研究（３３）と一致する。ＰＥＧ−ＤＡ（Ｍ_ｎ＝７００）はその他のモノマーより著しく高い反応速度をもち、かつ著しく低いバックグラウンド信号を示すことを見出した。ハイブリダイゼーション実験のために最終的に選択したモノマー溶液は、光開始剤１〜２．５％を含む、ＰＥＧ−ＤＡ：ＴＥが２：１のブレンドであった。

粒子の特性解析
多様性（ｐｏｌｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）
生体分子の定量分析に用いる粒子は、モーフォロジーおよび機能が双方とも両立することがたいへん重要である。連続流リソグラフィーを用いて合成した粒子の物理的サイズは変動係数が非常に小さい（＜２％）ことをすでに示した（２７）。ハイブリダイゼーションの研究に用いた粒子に対して、蛍光信号の変動を調べるための実験も行った。

ハイブリダイゼーションの研究に用いた粒子の蛍光強度は、粒子の「機能的」多様性の証拠を与える。しかし、この評価基準は、粒子だけでなく、ハイブリダイゼーション実験そのものにも依存する−ここに示す数値は、控えめな見積りのはずである。蛍光信号のＣＯＶの範囲は、ターゲットを１μＭ〜１０ｎＭの濃度でインキュベートしたときの６〜１０％から、（１０ｐＭまで下がった）より低い濃度に対する約１５〜３０％まで増加することを見出した。

活性プローブ濃度
粒子表面におけるプローブの濃度を計算するために、本モノマー溶液に取り込まれたプローブの濃度（５０μＭ）、およびオリゴマーが粒子中に拡散して反応し得る深さの見積りを用いた。ハイブリダイゼーションの研究に用いた典型的な粒子および検出領域を横切る蛍光強度のスキャンを図６に示す。

図から明らかなように、粒子は、検出領域の端部で著しく強い信号を示す−コード化された領域は、取り込まれた蛍光色素が至るところ均一に分散しているために、このような特性は示さない。この「端部」信号は、粒子の３０μｍ厚の端部に結合したオリゴマーの量に比例すると仮定した。粒子の内側における強度は、調べたいくつかの粒子についてほぼ正確に端部の１／２であった。すべての表面は同じであると仮定して、粒子の内側における活性な結合の厚さを

、または面当り約７．５μｍと推定した。その検証として、各々の粒子端部における高強度領域の幅は、約２０画素＝８μｍであることがわかる。物理的に、これを細孔サイズで説明することができる。粒子の重合は、（酸素がもっとも遠くまで拡散しなければならず、フリーラジカル濃度がもっとも高い）中心部でもっとも速く生じ、粒子表面ではより遅く生じる。それ故、粒子は、表面付近に比べて中心部でよりしっかり架橋し、短いオリゴマーが拡散して相補的なプローブと反応できるより大きい細孔を提供すると仮定できる。他の研究者によれば、本発明者が用いたＰＥＧポリマーは、完全に架橋したとき約１０Åの細孔サイズをもつ筈である（３４、３５）。

（モノマー状態で）５０μＭのプローブ濃度を面当り７．５μｍの活性な厚さおよび５０％の取り込み効率とともに用いて、有効な表面濃度を以下のように見積もった：

粒子が透明なため、見積りプローブ濃度

は両面からの蛍光により与えられる筈である。この「表面」濃度は、他の研究者の報告と同様である（３６）。先述のように、実質的により多量のプローブを粒子に取り込んで表面濃度をずっと高め、そのようにして本システムの感度を向上させることができる。

スループットの見積り
最近になって、光電子増倍管を一体化したマイクロ流体ベースのフローサイトメーターが開発され、非常に高いスループットが達成されている。これらのシステムにおける流体速度は、（従来のフローサイトメーターと同様に）１０ｍ／ｓオーダーにできる一方で、検出は５ＭＨｚの高サンプル・レートで行われ、粒子読み出し速度１７０００／秒が可能である（３７）。より高度な検出の仕組みを組み込んだときに本発明のシステムが達成できるスループットを見積もるための基礎としてこれを至る所で用いる。控えめに、流速は１ｍ／ｓ、粒子（長さは各々２００μｍ）間の間隔は１０粒子長と見積もった。このようにして、以下のスループットが計算できる。

この「粒子／秒」のスループットは、フローサイトメトリーで一般的に見られるより低いのに、なぜ「ターゲット／秒」の観点から本技術が高密度分析に対して十分なスループットを提供するかについて論じる。

本システムが（上述のように）優れた粒子−粒子間の再現性を提示することを示した。検出の理想的な判断基準と考えられる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、本技術と同様の精度を示すが（３８）、典型的には２重化して行われるだけである。このレベルの冗長度は、フローサイトメトリーベースの試験に見られるものより著しく低い。見積りのために、本発明の試験は３重化して行い、正確な情報が得られると仮定する。本「ターゲット／秒」のスループットは、冗長度３を用いて以下のようになる。

さらに高いスループットを提供する二つの変更に、（１）粒子サイズの低減、および（２）単一粒子上へのいくつかのプローブの導入がある。本発明者は、研究室において約１μｍオーダーの形状をもつ粒子をつくり出す能力を実証済であり、従って各寸法が半分サイズのコード化された粒子の生成について考えることは十分理に適うことである。これは、粒子／体積の数値を８倍増加させることになる。さらに、粒子が３つの機能（図６のように２つのプローブと１つの対照）を持てば、スループットはさらに２倍増加する。これらの議論を用いて、いくつかの予測スループットを計算することができる。

表１：３重化して行う試験に対するスループットおよび試料体積の見積り（各プローブは３つの粒子上に現れる）。「標準」粒子サイズは約１００×２００×３０μｍ、一方で「半分」サイズは約５０×１００×１５μｍである。粒子体積は、試験した１０^６ターゲットに基づいており、１および２プローブ粒子はそれぞれ３×１０^６および１．６７×１０^６の合計粒子に対応する。

この簡単な解析から、小型化および／または多プローブ粒子を用いたとき、１時間以内に１００万ターゲットを分析することは妥当と思われる。この解析は、体積から見た粒子サイズの重要性を強調している−高密度分析には小型化した粒子が必要になると思われる。

検出限界
適切な検出範囲を決定するために、粒子を数桁に及ぶ濃度の蛍光ターゲットとハイブリダイズした。（５０μＭのプローブを取り込んだ）共通バッチからの粒子試料を、ターゲット溶液５０μｌとともにボルテックス・ミキサー上において室温で３０分間インキュベートした−ターゲット濃度は、オリゴマー５００ｆｍｏｌ〜５００ａｍｏｌ（１０^−１８ｍｏｌ）に対応して１０ｎＭ〜１０ｐＭに及んだ。ハイブリダイゼーションの後、粒子をすすぎ、顕微鏡を取り付けたＥＢ−ＣＣＢカメラ（Ｃ７ １９０−２０，Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて検出するために蛍光のもとで撮像した。本システムのダイナミックレンジが８ビットに限られたため、広範囲の蛍光信号に適応するように３つの異なる感度設定を用いる必要があった。そのように、信号を正規化して同じ目盛りでプロットできるように、粒子バッチのうち２つを３つの感度設定のうち２つで撮像した。検出に関する研究の結果を図７に示す。

図から明らかなように、このプロットは、プローブ濃度を変えた場合のように線形ではない（図５）。これは、より低いターゲット濃度では、ターゲット量がプローブ量よりずっと多く（［Ｔ］_ｏ＞＞［Ｐ］_ｏ）はなくなり、［Ｔ］＝［Ｔ］_ｏという近似がもはや使えないためである。加えて、平衡に達する時間は、ターゲットの減少とともに増加することが知られている（３９）−この実験に用いたインキュベーション時間（３０分）は、これが生じるのにおそらく十分でなかった。

本試験は、非常に感度がよく、最低試験量（５００ａｍｏｌｅ）のオリゴマーをビオチン／アビジンで信号増幅することなしに容易に検出できることを見出した。この発見は、本システムがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（４０）およびＬｕｍｉｎｅｘ（４１）を含めて現在最先端の多重化システムに匹敵する感度を有することを示唆する。さらに、より高いプローブ濃度を粒子中に取り込むことにより、試験感度が向上できることをこれまでに示した。

材料のコスト
標準の非バルク価格で、本原稿に提示したのと同様の単一プローブ粒子１００万個を製造するための原材料コストは、以下に概要を示すように、たった４．２８ドル（ＤＮＡプローブなしで０．１４ドル）である。

表２：５０μＭの濃度で取り込んだＤＮＡオリゴマープローブを含む、１０^６粒子（約１００×２００×３００μｍ）を製造するための原材料コストの見積り。

先述したように、粒子の各寸法を半分サイズにすることは理に適っており、それにより粒子体積およびコストは８分の１（１０^６粒子当りたったの０．５４ドル）に低減されるであろう。小容積のマイクロ流体処理のためにごく僅かの試料しか無駄にならないことを注記することも重要である。

粒子合成およびフロースルー読み取りに用いるマイクロチャンネルは、簡単な設計であり、ごく低いコストで形成できる。標準のＳＵ−８リソグラフィーで形成した１つの４”ウェーハ（＜１００ドル）は、１０チャンネル以上を容易にもつことができ、多数回モールドできる（次の計算では１０回を仮定する）。加えて、各々のデバイスは、数回使ってもよい（以下では５を用いる）。従って、非常に控え目に見積って、デバイスコストは以下のようになるであろう：

表３：粒子合成およびフロースルー読み取りに用いるマイクロデバイスの見積りコスト。マスターウェーハは１０チャンネルをもち１０回モールドできること、および各デバイスは廃棄する前に５回使えることを仮定した。

１００万粒子を用いる１回の多重化実験の材料コストは＜５．００ドル（粒子に４．２８ドル、および１回の「合成」および１つの「読み取り」チャンネルに０．６０ドル）となるであろう。この見積もりは、低価格材料からなり全コスト中では無視できる、粒子読み取り用緩衝液は含まない。

参考文献

Claims (24)

1. 蛍光性の実体を加えた第１のモノマー流をマイクロ流体チャンネルに沿って流すステップ、
   プローブを加えた第２のモノマー流を前記マイクロ流体チャンネルに沿って前記第１のモノマー流に近接して流すステップ、および
   蛍光グラフィックコード化領域およびプローブ担持領域を有する粒子を合成するために前記モノマー流を重合するステップ、
   を備える多機能粒子を作製するための方法であって、
   前記重合するステップは、コード化領域を前記粒子上につくるためのフォトマスクを通した紫外光に前記モノマー流をさらすステップを含む
   方法。
2. 前記プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
3. 前記プローブは、タンパク質を含む請求項１に記載の方法。
4. 前記プローブは、細胞を含む請求項１に記載の方法。
5. 前記プローブは、ウイルスを含む請求項１に記載の方法。
6. 前記プローブは、カーボンナノチューブを含む請求項１に記載の方法。
7. 前記プローブは、細胞小器官を含む請求項１に記載の方法。
8. 前記プローブは、陰性対照として機能するための不活性種を含む請求項１に記載の方法。
9. 前記コード化領域は、複数の開いたおよび閉じたコーディング要素を含む請求項１に記載の方法。
10. 前記コーディング要素は、２次元格子に配置される請求項９に記載の方法。
11. 前記格子は、２０のコーディング要素を含む請求項１０に記載の方法。
12. 前記粒子は、少なくとも１つの方位指標をさらに含む請求項９に記載の方法。
13. 前記コーディング要素は、不均一な形状またはサイズをもつ請求項９に記載の方法。
14. 前記重合するステップは、１つより多くのプローブ担持領域をつくり出す請求項１に記載の方法。
15. 前記重合するステップは、１つより多くのコーティング領域をつくり出す請求項１に記載の方法。
16. 前記紫外光は、顕微鏡対物レンズで集光される請求項１に記載の方法。
17. 前記第１および第２のモノマー流は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを含む請求項１に記載の方法。
18. 前記第１および第２のモノマー流は、光開始剤を含む請求項１７に記載の方法。
19. 少なくとも１つのグラフィックコード化領域および１つのプローブ担持領域を含む多機能粒子であって、前記プローブ担持領域は、前記多機能粒子中に取り込まれたプローブを含む、多機能粒子であって、該多機能粒子は、請求項１に記載の方法によって作製され得る、多機能粒子。
20. 多機能粒子であって、各多機能粒子がグラフィックコード化領域およびプローブ担持領域を有する多機能粒子、並びに
    前記粒子を整列させて読み取ることに適合したマイクロ流体デバイス、
    を備えるハイスループットのスクリーニングシステムであって、前記プローブ担持領域は、前記各多機能粒子中に取り込まれたプローブを含む、システムであって、該多機能粒子は、請求項１に記載の方法によって作製され得る、システム。
21. プローブの接近性が向上される請求項１に記載の方法であって、該向上は、前記粒子のプローブ担持領域における表面積を増加させるか、または該粒子のプローブ担持領域において細孔サイズを拡大させることによる、方法。
22. 前記粒子の前記プローブ担持領域における表面積を増加させることによりプローブの接近性が向上される請求項２１に記載の方法。
23. 前記粒子の前記プローブ担持領域において、リッジまたはくぼみを形成することにより表面積が増加される請求項２２に記載の方法。
24. 前記粒子の前記プローブ担持領域において、細孔サイズを拡大することによりプローブの接近性が向上される請求項２１に記載の方法。

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