MX2012007477A - Composicion de gel de diagnostico, metodo para hacer una composicion de gel de diagnostico. - Google Patents
Composicion de gel de diagnostico, metodo para hacer una composicion de gel de diagnostico.Info
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Abstract
La invención se refiere a una composición de gel de diagnóstico para usarse como un elemento de diagnóstico en dispositivos de diagnóstico. La composición de gel de diagnóstico es derivada de un compuesto que tiene una fórmula D-Sp-Po, en donde D es un grupo de diagnóstico; Sp es un grupo esparcidor hidrofílico; Po es un grupo polimerizable. La composición de gel de diagnóstico de la invención tiene dimensiones variando de desde alrededor de 250 nanómetros a alrededor de 1000 micrómetros, y un módulo Young variando de desde alrededor de 10 kilopascales a alrededor de 200 kilopascales. La invención también proporciona un método para hacer una composición de gel de diagnóstico. El método comprende el proporcionar una composición que comprende un porógeno como un iniciador y un compuesto teniendo una fórmula de D-Sp-Po; polimerizar la composición para formar una composición polimerizada; y lavar la composición polimerizada para formar la composición de gel de diagnóstico.
Description
COMPOSICIÓN DE GEL DE DIAGNÓSTICO, MÉTODO PARA HACER UNA
COMPOSICIÓN DE GEL DE DIAGNÓSTICO
CAMPO TÉCNICO
La invención se refiere generalmente a una composición de gel de diagnóstico para un elemento de diagnóstico que es útil en el desarrollo y fabricación de una plataforma a base de chip microfluídica para llevar a cabo una detección de enfermedad rápida y más específicamente para llevar a cabo inmunoanálisis sobre el chip.
ANTECEDENTES
La detección de análisis incluyendo proteínas,
ADN/ARN y metabolitos de los fluidos del cuerpo y otras muestras de origen biológico es esencial para una variedad de aplicaciones incluyendo la prueba médica, la detección de toxinas y el análisis forense. La mejora de la prueba en el punto de cuidado de tal análisis es un requerimiento mundial urgente. Los sistemas actuales diseñados para tales aplicaciones sufren de varias desventajas tal como los altos costos, el volumen y los resultados retrasados. Hay por tanto una necesidad muy grande no satisfecha para el desarrollo de sistemas que son de bajo costo, son portátiles, convenientes de manejar y muestran una alta eficiencia hacia la detección. Estos sistemas deben ser capaces de identificar rápidamente un alto rango de analitos de las muestras de origen biológico. Los métodos de laboratorio sobre un chip microfluídico han ganado prominencia sobre la última década como soluciones a este problema. Esta medición de las proteínas usando inmuno ensayos microfluídicos ha sido una de las áreas de enfoque importantes. Aún cuando las tecnologías microfluídicas han ganado prominencia como una solución a tales problemas, muchas de estas están obstaculizadas por la ausencia de capacidades de fabricación maduras que puedan transmitir la transición de ideas de laboratorios académicos a la industria. Estos típicamente usan técnicas de fabricación a escala de laboratorio y materiales que son incompatibles con los procesos industriales estándar, los cuales no son conductores para escalar hacia arriba la producción rápida de muchos dispositivos. (1) Todos los componentes del dispositivo requieren ser desarrollados y adaptados para hacer un dispositivo que satisface los requerimientos como se delinean aquí .
BREVE DESCRIPCIÓN
En un aspecto, la invención proporciona una composición de gel de diagnóstico. La composición de gel de diagnóstico de la invención tiene dimensiones que varían desde alrededor de 250 nanómetros a alrededor de 1000 micrómetros y un módulo Young variando de desde alrededor de 10 kilopascales a alrededor de 200 kilopascales. La composición de gel de diagnóstico está derivado de un compuesto teniendo la fórmula
D-Sp-PO;
en donde D es un grupo de diagnóstico; Sp es un grupo espaciador hidrofílico; y Po es un grupo polimerizables .
En otro aspecto, la invención proporciona un método para hacer una composición de gel de diagnóstico. El método comprende proporcionar una composición que comprende un porógeno, un iniciador y un compuesto teniendo una fórmula D-Sp-Po; la polimerización de la composición para formar una composición polimerizada ; lavar la composición polimerizada para formar la composición de gel de diagnóstico.
En aspectos adicionales, la invención proporciona un elemento de diagnóstico que comprende una composición de gel de diagnóstico de la invención.
En aún otro aspecto, la invención proporciona un dispositivo de diagnóstico que comprende el elemento de diagnóstico que comprende la composición de diagnóstico de la invención .
DIBUJOS
Estas y otras características con aspectos y ventajas de la presente invención se entenderá mejor cuando se lea la siguiente descripción detallada con referencia a los dibujos acompañantes en los cuales los caracteres representan partes iguales a través de los dibujos, en donde:
La Figura 1 es una representación esquemática de un elemento de diagnóstico de ejemplo de acuerdo al aspecto de la presente invención.
La Figura 2 es una representación esquemática de un dispositivo de diagnóstico de ejemplo de acuerdo a otro aspecto de la invención.
La Figura 3 es una representación esquemática de otro dispositivo de diagnóstico de ejemplo, uno de una lumbrera de soporte de acuerdo a un aspecto de la invención.
La Figura 4 es una representación esquemática de otro dispositivo de diagnóstico de ejemplo en donde las lumbreras de soporte están conectadas en serie.
La Figura 5 es una representación esquemática que muestra la sujeción de un analito a un extremo de diagnóstico de un gel de diagnóstico de acuerdo a un aspecto de la invención.
La Figura 6 es una representación esquemática que muestra dos extremos de diagnóstico para sostener el analito de acuerdo a otro aspecto de la invención.
La Figura 7 es una representación de un esquema de flujo de los pasos de ejemplo para un método para hacer el elemento de diagnóstico.
La Figura 8 son representaciones fotográficas de los resultados del proceso como se explicó en la Figura 7 mostrando la captura del gel de diagnóstico de la invención en la lumbrera de soporte.
La Figura 9 es una representación del esquema de flujo de los pasos de ejemplo para un método para proporcionar un canal conformado para hacer el elemento de diagnóstico.
La Figura 10 es una representación de esquema de los pasos de ejemplo para un método para usar el elemento de diagnóstico .
La Figura 11 es una representación esquemática de un elemento de diagnóstico para un inmuno ensayo multiplexado de acuerdo al aspecto de la invención.
La Figura 12 es una representación esquemática del método de diagnóstico de la Figura 10 con una pluralidad de analitos de acuerdo a un aspecto de la invención
La Figura 13 es una representación esquemática del elemento de diagnóstico de la Figura 11 con un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente de acuerdo a un aspecto de la invención.
La Figura 14 es una fotografía del gel de diagnóstico de la invención.
La Figura 15 es una imagen fluorescente del gel de diagnóstico de la invención que se ha tratado con un fluoróforo conteniendo la solución de proteína; y
La Figura 16 es una imagen fluorescente del hidromel que se ha tratado con la solución de proteína conteniendo fluoróforo .
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Como se usó aquí y en las reivindicaciones, las formas singulares de "uno" , "una" y "el" incluyen las referencias a menos que el contexto claramente indique lo contrario.
Deberá notarse que en la descripción detallada que sigue, los componentes idénticos tienen los mismos números de referencia sin importar si estos están mostrados en incorporaciones diferentes de la presente invención. Deberá ser también notado que a fin de claramente y concisamente describir la presente invención, los dibujos pueden no necesariamente estar a escala y ciertas características de la invención pueden ser mostradas en una forma algo esquemática.
En un aspecto, la invención proporciona un elemento de diagnóstico y un dispositivo de diagnóstico que comprende el elemento de diagnóstico. El dispositivo de diagnóstico de la invención también puede ser mencionado como un chip de diagnostico o simplemente como un chip para uno con una habilidad ordinaria en el arte. El elemento de diagnóstico de la invención está mostrado en la Figura 1 y esta representado con el número 10. El elemento de diagnóstico comprende un canal conformado, generalmente mostrado por el número 12 en la Figura 1. El canal conformado comprende por lo menos una lumbrera de soporte 14. La lumbrera de soporte está mostrada en una representación de dos dimensiones rectangular, pero esto puede ser de cualquier forma, tal como, pero no limitándose a la forma trapezoidal, cuadrada, cilindrica, cúbica y similares y combinaciones de las formas también. En canal conformado además comprende un conducto de entrada 16 y un conducto de salida 18. El conducto de entrada permite el flujo de los fluidos y otros materiales para la invención adentro de la lumbrera de soporte y el conducto de salida permite el flujo de los fluidos hacia fuera dentro de un depósito o recolector adecuado. La proporción de los anchos del conducto de salida y del conducto de entrada puede ser variada para contener el gel de diagnóstico seguramente dentro de la lumbrera de contención. En canal conformado de la invención es generalmente hecho de un material que es adecuado para el propósito intentado, como se describirá posteriormente.
El elemento de diagnóstico de la invención también comprende un gel de diagnóstico 20. Un gel de diagnóstico típico útil en la invención puede ser derivado de una composición que comprende un compuesto que tiene la fórmula:
D-Sp-Po;
en donde D es un grupo e diagnóstico;
Sp es un grupo espaciador hidrofílico; y
Po es un grupo polimerizable .
El compuesto usado para hacer el gel de diagnóstico de la invención comprende un grupo polimerizable. Un grupo polimerizable, como se usó aquí, significa cualquier entidad química que es capaz de reaccionar con una entidad química complementaria para formar una cadena de enlaces, conocido en el arte como una unidad de repetición. Un ejemplo de un grupo polimerizable es un grupo de vinilo, representado por un enlace doble entre átomos de carbono. Este grupo puede reaccionar con otro grupo de vinilo para formar . una cadena de carbón-carbón . Otro grupo polimerizable de ejemplo es un grupo epoxi, el cual puede reaccionar con otro grupo epoxi para formar la cadena de alcoxi. El grupo polimerizable como es usado aquí significa que incluye más de una entidad química. Por tanto, un compuesto puede tener más de un grupo de vinilo. Cuando una pluralidad de entidades químicas está presente, entonces resulta una red enlazada en forma cruzada cuando se ha polimerizado . Esto es especialmente ventajoso a la invención, En la incorporación de ejemplo, la composición usada para hacer el gel de diagnóstico de la invención puede comprender un primer compuesto teniendo sólo un grupo polimerizable y un segundo compuesto teniendo más de un grupo polimerizable, en una proporción por peso de 90:10 respectivamente; En otra incorporación de ejemplo, la proporción por peso de los compuestos primero y segundo es de 50:50, mientras que aún otra incorporación de ejemplo, la proporción por peso puede ser de 0:100 respectivamente. En otra incorporación o incorporaciones de ejemplo, un grupo polimerizable puede ser un grupo dicarboxílico . Este grupo puede reaccionar con, por ejemplo, un grupo de di-alcohol para formar un poliéster. En esta situación la entidad química que esta siendo considerada es un grupo de ácido carboxílico y la cantidad química complementaria es un alcohol. En forma similar, un ácido dicarboxílico y una diamina pueden ser usadas para formar una diamina: Otras mitades poliméricas de ejemplo incluyen poliuretanos , poliacetales , poliésteres y similares. En la situación de, por ejemplo, un ácido dicarboxílico y un dialcohol, este puede ser usado para incluir un compuesto que tiene un ácido tricarboxílico o un trialcohol o ambos en la mezcla para formar el compuesto desde el cual es derivado un gel de diagnóstico. En este caso, alrededor de 10 por ciento del peso del ácido tricarboxílico con respecto al ácido dicarboxílico puede estar presente .
El compuesto útil en la invención también comprende un grupo espaciador hidrofílico, representado en la fórmula cono Sp. Los tipos hidrofílieos típicos útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a éteres, alcoholes, glicoles, aminas, ésteres, amidas, alcoholes, ácidos carboxílieos y similares. Estos grupos deben estar presentes en la composición de gel de diagnóstico final y por tanto no deben sufrir ninguna transformación química durante el paso de formación de gel de diagnóstico, o si estos sufren una transformación química, estos deben transformarse a otro grupo hidrofílico. EL grupo hidrofílico como se usó aquí, significa cualquier grupo que es capaz de absorber agua. Otra manera de describir el grupo hidrofílico es la de aquellos grupos que cuando se exponen a una gota de agua, el ángulo de contacto entre el agua y la superficie del material tiende a ser un ángulo agudo. Un grupo espaciador particularmente útil es un grupo de éter.
El compuesto además comprende por lo menos un extremo de diagnóstico. El extremo de diagnóstico, como se usó aquí, significa cualquier mitad química que puede ser usada para la detección de ciertas otras mitades. Por ejemplo, el extremo de diagnóstico puede significar antibióticos que son usados para detectar tipos específicos de células o antígenos .
El gel de diagnóstico es formado de la composición descrita aquí. En una incorporación de ejemplo, el gel de diagnóstico es formado mediante el curar una composición de la invención teniendo 90 por ciento por peso de un compuesto teniendo un grupo polimerizable único, un grupo espaciador, y un extremo de diagnóstico y 10 por ciento por peso de un compuesto teniendo dos grupos polimerizables , mediante la exposición a la luz para formar una estructura que tiene una arquitectura tridimensional, en donde las dimensiones que están en el rango de alrededor de 100 nm a alrededor de 1000 micrones. Las dimensiones pueden incluir, longitud, ancho, altura, volumen, área, circunferencia, perímetro y similares, y la elección de la dimensión dependerá de la forma de la arquitectura. Uno de tal método para formar un gel de diagnóstico se da en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América 2007/0105972A1.
La composición útil de la invención para hacer el gel de diagnóstico también incluye un porógeno. Los porógenos son compuestos externos que son agregados a la composición para inducir poros dentro de la composición teniendo características definitivas tal como tamaño de poro, densidad de poro y similares, y combinaciones de los mismos. Un porógeno útil es un compuesto que tiene la capacidad de crear un poro con un tamaño definido que varía desde 5 nanómetros a alrededor de 1000 nanómetros. En una incorporación, el porógeno es un bicarbonato de sodio, mientras que en otra incorporación el porógeno es un cloruro de sodio, y en aún otra incorporación, es ácido cítrico.
En algunas incorporaciones, el porógeno es una composición líquida que es obtiene a través de la composición útil para hacer el gel de diagnóstico. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan al ácido acético, a el poli(etilen glicol)-200, el etilen glicol, el glicerol y similares. En aún otras incorporaciones, el porógeno es un fluido gaseoso tal como de óxido de carbono. Tales fluidos gaseosos pueden ser producidos en el lugar usando los compuestos apropiados tal como carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de calcio y similares. En otras incorporaciones, en fluido gaseoso puede ser atrapado dentro de la composición a través de medios apropiados, tal como la adsorción.
El porógeno puede ser permitido que permanezca dentro de la composición de la invención, siempre que como se conoce que el porógeno no afecte el desempeño del gel de diagnóstico comprende también el porógeno. Alternativamente, el porógeno puede ser deslavado fuera en el paso para proporcionar el gel de diagnóstico. La elección del porógeno y el compuesto, y los pasos involucrados en la producción de gel de diagnóstico determinará si el porógeno se permite que permanezca o sea removido, o sea deslavado fuera en un paso independiente para formar el gel de diagnostico de la invención.
La composición de la invención puede además incluir iniciadores para iniciar la reacción de polimerización, catalizadores, agentes de transferencia de cadena, retardadores , inhibidores, aditivos para proporcionar resistencia o mejorar capacidad de gelación, por ejemplo, y otros compuestos útiles.
El gel de diagnóstico de la invención está formado mediante el curar la composición descrita aquí. El curado como se usa aquí significa la polimerización de por lo menos un grupo polimerizables . Un experto en el arte entenderá que la polimerización de la composición puede resultar en un polímero lineal, en un polímero ramificado o en una red de polímero enlazado en forma cruzada dependiendo de la naturaleza de la composición de la invención. En una incorporación, el curado de la composición de la invención resulta en una red de polímero enlazada en forma cruzada, el cual cuando se expone a un solvente adecuado formará un gel enlazado en forma cruzada. El curado puede ser efectuado ventajosamente por un método fotolítico, el cual involucra exponer la composición a una luz de una longitud de onda adecuada. En una incorporación de ejemplo, la composición está presente en la forma líquida, y es fluida en un recipiente adecuado. En una incorporación específica, el recipiente es la lumbrera de contención del elemento de diagnóstico. En otra incorporación específica, el recipiente es una parte separada de un dispositivo de diagnóstico, tal como una lumbrera de preparación, como se describe aquí. En aún otra incorporación, el recipiente es un dispositivo de formación de gel distinto que está disponible independientemente del dispositivo de diagnóstico de la invención, y el gel de diagnóstico formado del mismo es recolectado separadamente y usado en el elemento de diagnóstico.
El curado es típicamente efectuado por la exposición de la composición a través de la máscara conformada para un periodo predeterminado de tiempo a fin de curar sólo las partes expuestas de la composición. La luz usada para efectuar el curado es típicamente radiación ultravioleta, teniendo típicamente una longitud de onda específica, una amplitud y una intensidad específicas, pero otras radiaciones tal como la radicación gamma también pueden ser usadas para curar el compuesto para formar el gel de diagnóstico. El tiempo necesario para efectuar el curado depende de la naturaleza del compuesto, la cantidad del fotoiniciador, etc., y puede variar de desde alrededor de 0.5 segundos a alrededor de 30 segundos. Subsecuente mente, el gel de diagnóstico es lavado con un solvente adecuado o una mezcla de solventes para deslavar la parte no curada de la composición desde el gel de diagnóstico.
En otra incorporación, un monómero teniendo por lo menos un grupo polimerizable es curado parcialmente mediante la exposición parcial a la luz. El curado parcial puede ser efectuado mediante la exposición del monómero a la fuente de luz por periodos más cortos de tiempo que lo necesario para completar el curado, por ejemplo, menos de 3 segundos. Alternativamente, el curado parcial también puede ser efectuado por la exposición del monómero a una luz teniendo una intensidad diferente de la luz usada para completar el curado. Además, el curado incompleto también puede ser efectuado por el uso de una concentración más baja del fotoiniciador con respecto a la concentración del monómero. Subsecuentemente, el compuesto de la invención es fluido en, a lo largo y junto con un compuesto que contiene un extremo de diagnóstico y un extremo polimerizable . El curado completo de la mezcla se efectúa mediante una composición adicional de la composición de la invención a la fuente de luz opcionalmente a través de una máscara conformada para un periodo de tiempo predeterminado. Esto resulta en un extremo de diagnóstico siendo agregado a la superficie del gel de diagnóstico. El producto curado final puede entonces ser sometido a un paso de lavado como sea necesario.
Alternativamente, una composición que comprende un extremo polimerizables y un primer grupo de activo puede ser curada para formar un material polimerizables que comprende un grupo reactivo. Este material polimerizado puede entonces ser reaccionado con una molécula de diagnóstico que comprende un extremo de diagnóstico y un grupo conjuntamente reactivo que es capaz de reaccionar con el grupo reactivo sobre el material polimerizado. La reacción entre el grupo reactivo sobre el material polimerizado y la molécula de diagnóstico resultará en el gel de diagnóstico de la invención. En una incorporación de ejemplo, el grupo reactivo sobre el material polimerizado es un grupo de maleimida y el grupo conjuntamente reactivo sobre la molécula de diagnóstico es un grupo de sulfidrilo.
La composición de la invención ya posee poros contenidos dentro de esta. Estos poros pueden también ser referidos como un volumen hueco u orificios por un experto en el arte. Estos poros son generalmente tomados como la distancia promedio entre dos puntos de enlazamiento cruzado. El paso de lavado puede también deslavar al porógeno desde el gel de diagnóstico para dejar atrás los poros dentro del gel de diagnóstico. El tamaño del poro corresponderá directamente al tamaño del porógeno que estuvo presente antes del paso de deslavado. Alternativamente, al porógeno se le puede permitir permanecer dentro del gel de diagnóstico de la invención, mientras que un aún formó poros dentro del gel de diagnóstico. En aún otra incorporación, los patrones de interferencia dentro de diferentes fuentes de luz pueden ser usados para inducir poros en la composición de diagnóstico de la invención, como se describe por Jang y otros en Angew Chem, 2007. Está técnica se obvia la necesidad de un porógeno en la composición.
El gel de diagnóstico formado tiene una dimensión que varía de desde alrededor de 250 nanómetros a alrededor de 1000 micrómetros . Las dimensiones como se usaron aquí, significan cualquiera de una medición estándar característica de una forma geométrica dada, pueden incluir pero no se limitan a la longitud, el ancho, la altura, la longitud diagonal, la circunferencia, el diámetro, el radio o combinaciones de los mismos. El gel de diagnóstico también se caracteriza por un tamaño de poro. El tamaño de poro más útil en la invención generalmente varía de desde alrededor de 5 nanómetros a alrededor de 1000 nanómetros. El gel de diagnóstico de la invención también se caracteriza por un módulo Young . Los métodos para medir los módulos Young son conocidos en el arte, y un instrumento de ejemplo usado para medir el módulo Young es la Máquina de Prueba Universal la cual utiliza el esquema entre esfuerzo-tensión para estimar el módulo Young .
Como se declaró anteriormente, el gel de diagnóstico puede ser formado en un paso previo, el cual es entonces recolectado y purificado separadamente, es modificado químicamente y después es introducido adentro del canal conformado mediante el hacerlo fluir con un fluido de flujo adecuado. En una incorporación alterna adicional, el gel de diagnóstico puede ser formado en una sección separada del canal de conformado y subsecuentemente, puede hacerse fluir adentro de la lumbrera de contención. En aún otra incorporación, la composición se hace fluir adentro de la lumbrera de contención y el gel de diagnóstico es formado en la lumbrera de contención usando los métodos descritos aquí. El flujo de la composición de la invención puede ser efectuada por métodos de hacer fluir adecuados conocidos por aquellos expertos en el arte. Alternativamente, las gotas de la composición de la invención son formadas mediante el hacer fluir la composición adentro de un líquido secundaria inmiscible que ya está fluyendo, en donde la composición se hace fluir adentro del líquido secundario a un ángulo recto en relación a la dirección de flujo del líquido secundario. Sin desear estar unido por una teoría, el tamaño y forma de la gota es generalmente conocido como que depende de la viscosidad de la composición, la tasa de corte puesta por el líquido secundario, la geometría de canal y otros factores. Estas gotas pueden entonces ser curadas en el miembro de contención o en la sección separada del canal conformado. Varios factores son tomados en cuenta para asegurar que el gel de diagnóstico de la composición de la invención esté encapsulado dentro del miembro de contención. Sin desear estar unida por ninguna teoría, la capacidad del gel de diagnóstico de la composición de la invención para hacerse fluido y encapsularse en un miembro de contención es proporcional al tamaño del gel de diagnóstico; el módulo Young del gel de diagnóstico de la composición; la viscosidad del flujo de fluido; la tasa de flujo del fluido que fluye; el módulo Young del material que forma el canal conformado; la temperatura; las dimensiones del conducto de entrada; las dimensiones del conducto de salida; el factor de comprensibilidad del gel de diagnóstico o de la composición; la presión, tal como el vacío aún en un área de superficie dada; y similares. Puede haber otros factores que afectan la capacidad del gel de diagnóstico para la composición para hacerse fluido adentro de la lumbrera de contención y ser encapsulada ahí.
Por tanto, en un incorporación, el canal conformado se hace de un material suave teniendo un módulo Young bajo y el gel de diagnóstico es muy duro. Un ejemplo de un material suave que puede ser usado para hacer el canal conformado es PDMS . Durante el flujo en esta situación, el canal conformado se deforma para permitir el flujo del gel de diagnóstico adentro de la lumbrera de contención. En otra incorporación, el canal conformado se hace de un material duro y rígido. Un ejemplo de inmaterial duro y rígido puede ser el poli (metil metacrilato) , que está comercialmente disponible bajo una variedad de nombres de comercio tal como PlexiglassMarca Registrada ^ GavriellMarca Re9istrada VitroflexMarca Re9i3trada, Limacrylarca Re9istrada, R-CastMarca de Re9isCrada Per-ClaxMarca Re9istrada, PerspexMarca Re9istrada, PlazcrylMarca Re9istrada AcrylexMarca Estrada ^ AcryliteMarca Re9istrada, AcrylplastMarca Re9istrada AltuglasMarca R*»*"™*, PolycastMarca Re9ist"da ( oroglassarca Re9i3trada OptiXMarCa Re9^trada ? ¾nd LuciteMarca Registrada _ Qtro material útil para esta aplicación es un copolímero de olefina cíclico, comercialmente disponible, como por ejemplo, Topasarca Re9lstr da de Polyplastics . En esta situación, una presión positiva o una presión negativa puede ser usada para empujar o jalar el gel de diagnóstico a través de un canal que contiene una lumbrera de contención. La presión negativa puede ser lograda mediante el aplicar vacío en una ubicación deseada. Además, en tales casos, el gel de diagnóstico es suficientemente suave de manera que esto puede ser reformado mientras que pasa a través del conducto de entrada en la lumbrera de contención y ser encapsulado dentro de esta (Figura 8) . Al gel se le evita que fluya hacia fuera de la lumbrera de contención en la dirección de flujo mediante el uso de una geometría de constricción apropiada en donde el ancho del conducto de entrada es mayor que el ancho del conducto de salida.
En una incorporación, los valores útiles del módulo de Young para el gel de diagnóstico de la invención varían de
desde alrededor de 1 kPa a alrededor de 200 kPa. Un gel de diagnóstico de ejemplo puede ser uno derivado de poli(etilen glicol) -diacrilato que tiene anticuerpos de insulina sujetados a este. En otra incorporación de ejemplo, el gel de diagnóstico puede ser un poli(etilen glicol ) diacrilato derivado de gel con antígeno para los anticuerpos que son generados por la exposición al virus de inmuno deficiencia humana.
En algunas incorporaciones, el gel de diagnóstico es mantenido dentro de una cierta ubicación para el uso apropiado de una presión positiva y una presión negativa. Una presión positiva puede ser usada para forzar el flujo a través de un canal, mientras que una presión negativa puede ser usada para retardar el flujo a través de un canal. La presión negativa puede ser lograda mediante el aplicar vacío a una ubicación deseada. Por tanto, el gel de diagnóstico puede hacerse fluido a través del canal y después ser contenido en cierta ubicación deseada mediante la aplicación de vacío en la ubicación a través de las paredes del canal. Esto también implicará que las paredes del canal sean hechas de un material adecuado a la aplicación de vació a través de éste, mientras que es simultáneamente impermeable a los fluidos que fluyen a través de este.
Volviendo de nuevo a la Figura 1, el elemento de diagnóstico de la invención además comprende un primer rebaje 22 sobre el conducto de entrada y un segundo rebaje 24 localizado sobre el conducto de salida. Los rebajes primero y segundo están localizados en una manera tal que la lumbrera de contención está situada entre los dos rebajes. Los rebajes son proporcionados de manera que estos facilitan la remoción de la lumbrera de contención sólo dejando el conducto de entrada y el conducto de salida intactos. La lumbrera de contención la cual contiene el gel de diagnóstico y se ha removido en los rebajes puede entonces ser usada para una variedad de propósitos de diagnóstico. En una incorporación de ejemplo, el gel de diagnóstico es sometido a una observación microscópica para determinar la presencia o la ausencia de ciertas partículas visibles microscópicamente. En otra incorporación de ejemplo, el gel de diagnóstico es sometido a un paso de un método de extracción predeterminado para extraer cualesquier partículas extrañas unidas al extremo de diagnóstico. En aún otra incorporación de ejemplo, el gel de diagnóstico es sometido a una radiación de una longitud de onda adecuada y una intensidad conocida y amplitud conocida para los propósitos de cuantificación.
En una incorporación, el elemento de diagnóstico de la invención puede comprender más de un gel de diagnóstico. Cada gel de diagnóstico tiene un extremo de diagnóstico distinto que es usado para un propósito específico para identificar una mitad particular. Cada gel de diagnóstico puede tener otros aspectos de la composición tal como el grupo espaciador y el grupo polimerizables siendo los mismos o diferentes. Un experto en el arte será capaz de escoger una combinación apropiada de los componentes involucrados en la composición para hacer un gel de diagnóstico sin una mayor experimentación indebida. La presencia de múltiples geles de diagnóstico permitirá múltiples exámenes y diagnósticos usando un chip único, por tanto reduciendo grandemente el tiempo y el esfuerzo involucrados. En otra incorporación, el elemento de diagnóstico de la invención puede comprender un gel de diagnóstico que comprende extremos de diagnóstico especialmente segregados en donde cada extremo de diagnóstico puede ser el mismo o diferente. Las técnicas para hacer tales geles de diagnóstico se conocen en el arte, por ejemplo, (Figura 4 en [2]) Dendukuri , D., Pregibon, D.C., Collins, J., Hatton, T.A. y Doyle, P.S. "Litrografia de Flujo Continuo para Síntesis de Micropartícula de Alta Producción" , Nat. Mater., 5, 365-369, Mayo 2006.
La Figura 2 muestra un dispositivo de diagnóstico de la invención 26. El dispositivo de diagnóstico 12m el conducto de entrada 16 y el conducto de salida 18. Para un objetivo de conveniencia, sólo está mostrada aquí la lumbrera de contención para propósitos visuales y el gel de diagnóstico 14 no está mostrado aquí. En forma similar, el primer rebaje 22 y el segundo rebaje 24 no están mostrados aquí, sin embargo estos pueden también estar presentes en el dispositivo de diagnostico de la invención. El dispositivo de diagnóstico también comprende por lo menos una lumbrera de entrada 28. La lumbrera de entrada puede ser un depósito para la introducción de fluidos adecuados dentro del dispositivo. Las orillas útiles en el dispositivo pueden incluir cualquiera de los solventes que son usados para la separación y la identificación. El fluido es algunas veces mencionado en el arte como una fase móvil. En una incorporación, el fluido introducido en el dispositivo puede ser un amortiguador de fosfato. El dispositivo también comprende una lumbrera de introducción de muestra, a través de la cual las muestras que van a ser analizadas son introducidas dentro del dispositivo. La lumbrera de entrada puede ser usada como la lumbrera de introducción de muestra o una lumbrera separada puede ser usada para el propósito basado sobre la aplicación intentada del dispositivo de diagnóstico. Las muestras que contienen entidades de interés, también conocidas como analitos en el arte, son típicamente introducidos sobre el dispositivo como una solución a la fase móvil, usualmente en donde la muestra es de una concentración desconocida. En algunas incorporaciones, una o más lumbreras de entrada también pueden servir como una lumbrera de muestra para la introducción adecuada de las muestras dentro del dispositivo de diagnóstico. El método típico para la introducción de una muestra incluye la inyección de una solución de la muestra. Como se mostró en la Figura 2, más de una de las lumbreras de entrada puede estar presente para un dispositivo dado. El dispositivo puede ser capaz de utilizar sólo el número de lumbreras necesario para una aplicación dada mientras que sella las otras lumbreras de entrada desde el resto del dispositivo para asegurar que la operación del dispositivo procede adecuadamente.
El dispositivo entonces comprende un brazo de entrada 30 que conecta la lumbrera de entrada con el resto del dispositivo. Cada lumbrera de entrada está asociada con un brazo de entrada. El dispositivo entonces comprende una lumbrera de preparación 32. La lumbrera de preparación puede tener muchas funciones que dependen de la aplicación final. En una incorporación de ejemplo, la preparación de la lumbrera agita los fluidos móviles para un mejor mezclado de los fluidos que vienen desde las lumbreras de entrada. En otra incorporación de ejemplo, la lumbrera de preparación es usada para quitar el gas a la fase móvil. En otra incorporación de ejemplo, la lumbrera de preparación puede ser usada para filtrar las células que exceden de un tamaño de umbral de 1 miera en la muestra. El dispositivo entonces comprende una lumbrera de salida 34 la cual está enlazada al conducto de salida. La lumbrera de salida puede ser un sumidero para el desecho de desperdicios. Este puede ser un depósito para recolectar todos los fluidos que han pasado a través del dispositivo.
Los fluidos se hacen generalmente fluir adentro del dispositivo través de métodos conocidos en el arte. En una incorporación típica, el fluido es bombeado adentro del dispositivo usando una bomba de dosificación con tasas de flujo controlables. En otra incorporación, una presión de succión es aplicada sobre el lado de lumbrera de salida del dispositivo, la cual permite que fluya el fluido. En otras incorporaciones, la fuerza electromagnética es aplicada en un punto particular sobre un dispositivo, lo cual hace el flujo posible. Otros métodos usados para efectuar el flujo de fluidos incluye, pero no se limitan al flujo capilar, el flujo impulsado acústicamente, el flujo impulsado centrífugamente, una bomba piezoeléctrica, y similares. En una incorporación de ejemplo, el gel de diagnóstico de la invención es forzado adentro de la lumbrera de contención a una alta presión y después se mantiene adentro de la lumbrera de contención usando presiones más bajas que la presión a la cual se hizo fluir. Esto permite al gel de diagnóstico el ser firmemente contenido dentro de la lumbrera de contención dentro de la lumbrera de contención durante la operación.
En una incorporación ilustrativa, el dispositivo está en un estado funcional, esto comprende un alumbrado de entrada a través de la cual la muestra es bombeada adentro del dispositivo a una tasa de flujo predeterminada. La muestra pasa a través del brazo de entrada y entonces es subsecuentemente filtrada en la lumbrera de preparación. La muestra entonces pasa a través de una primera lumbrera de contención que contiene el gel de diagnóstico u otro material absorbente tal como materiales de base de polisacárido conteniendo físicamente encapsulados los anticuerpos de detección etiquetados fluorescentemente dentro de esta. Estos anticuerpos se unen a un analito específico tal como unos anticuerpos inducidos por virus de inmuno deficiencia humana presentes en la muestra, formando un complejo el cual es entonces filtrado afuera del gel de diagnóstico y después es transportado hacia abajo al segundo gel de diagnóstico. El segundo gel de diagnóstico contiene especies de anticuerpo primarias unidas químicamente sobre su superficie, también específicas para el analito de interés. Un complejo terciario de anticuerpo primario-analito-anticuerpo secundario es entonces formado en la ubicación del segundo gel de diagnóstico. La parte restante del analito entonces fluye hacia fuera a través del conducto de salida dentro de la lumbrera de salida. La presencia y concentración del analito de interés puede ser inferida por el examen de la señal fluorescente emitida desde el complejo terciario. En una incorporación de ejemplo, el elemento de diagnóstico que comprende el gel de diagnóstico con las partes adsorbidas del analito es entonces cortado en el primero y en el segundo rebajes. Este elemento de diagnóstico cortado es entonces sometido a un análisis para determinar la naturaleza y la extensión de la enfermedad extendida, por ejemplo. En otra incorporación de ejemplo, un elemento de diagnóstico, tal como un microscopio, se usa para analizar el elemento de diagnóstico que está presente como parte del dispositivo de diagnóstico, en donde el elemento de diagnóstico se lleva dentro de una distancia adecuada desde el elemento de diagnóstico para efectuar un diagnóstico adecuado.
En una variación para la incorporación ilustrativa descrita arriba, la parte de diagnóstico del gel de diagnóstico de la invención que está adsorbida en el analito es ahora separada del gel de diagnóstico original mediante el hacerlo fluir hacia fuera usando una mezcla absorbente adecuada, y después hacerla fluir hacia dentro de una lumbrera de contención subsecuente que comprende un gel de diagnóstico diferente, el cual tiene un extremo de diagnóstico diferente que puede adsorber donde el primer extremo de diagnóstico el cual comprende el analito para formar un segundo elemento de diagnóstico. El segundo elemento de diagnóstico es entonces usado para el diagnóstico .
La Figura 3 muestra un dispositivo de diagnóstico de ejemplo de la invención el cual comprende más de una lumbrera de contención, cada una de estas mostrada por el número 12, cada lumbrera de contención asociada con su propio conducto de entrada 16 y su conducto de salida 18. En esta incorporación particular, las lumbreras de contención son conectadas en paralelo unas a otras. La fase móvil se hace fluir adentro de cada lumbrera de contención usando los medios apropiados, tal como mediante el usar succión o el aplicar vacío a ciertos puntos para asegurar el flujo adentro de la lumbrera de contención requerida. La Figura 4 muestra otro dispositivo de diagnóstico de ejemplo de la invención en donde el dispositivo comprende más de un elemento de contención, y en donde cada una de las lumbreras de contención está conectada a la otra en serie. Por tal objeto de conveniencia, ambas la Figura 3 y la Figura 4 no muestran el gel de diagnóstico contenido dentro de la lumbrera de contención.
La Figura 5 muestra una visualización simplística de la manera en la cual funciona el gel de diagnóstico, como se representó por el número 40. El gel de diagnóstico comprende un extremo de diagnóstico 42, el cual está unido a un analito adecuado 44. El extremo de diagnóstico es seleccionado de manera que este es selectivo y específico a un tipo de analito. Por tanto, una fase móvil comprendiendo cualquier u otro que el analito pasa a través y alrededor del extremo de diagnóstico, mientras que el analito específico es retenido por el gel de diagnóstico. La Figura 6 muestra otra visualización 46 de la manera en la cual dos geles de diagnóstico diferentes 42 son usados para contener un analito 44 en el lugar. Una situación de ejemplo típica que utiliza tal visualización es el sandwich ELISA en donde el analito es mantenido en el lugar entre dos extremos de diagnóstico complementarios diferentes. Tal forma de análisis puede ser llevada a cabo ventajosamente usando el dispositivo de diagnóstico de la invención que comprende más de una lumbreras de contención, en donde las lumbreras de contención son arregladas de una manera en serie. Otras técnicas conocidas, como se ejemplificó por la técnica ELISA, que puede llevarse a cabo usando el dispositivo de diagnóstico de la invención incluyen el ELISA competitiva, el sandwich ELISA, el inmuno ensayo quimioluminiscente , el ELISA amplificado PCR, el ELONA (ensayo de oligonucleótido enlazado de enzima) , el microarreglo ADN y similares .
La detección del gel de diagnóstico que tiene un analito enlazado a este puede lograrse a través de técnicas apropiadas conocidas en el arte. Las técnicas estándar incluyen, pero no se limitan al microscopio óptico, fluorescencia, quimioluminiscencia, electrofosforescencia , potenciometría, calorimetría, absorbencia, resonancia Plasmon de superficie y similares y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para hacer un elemento de diagnóstico. Los pasos del método involucrados en la fabricación del elemento de diagnóstico están mostrados en la Figura 7 y están generalmente designados por el número 48. El método comprende un paso de proporcionar un canal conformado 50. El método además comprende el paso de hacer fluir un gel de diagnóstico 52 a través del conducto de entrada dentro de la lumbrera de contención. El flujo puede ser afectado por el bombeo de un fluido, tal como una fase móvil, a una tasa de flujo predeterminada como para emplear una presión adecuada sobre el gel de diagnóstico de manera que esta puede ser exprimida a través del conducto de entrada y adentro de la lumbrera de contención, pero no a través del conducto de salida. Por tanto, el gel de diagnóstico es encapsulado en la lumbrera de contención como se mostró en el paso 54. En una incorporación alterna, el gel de diagnóstico es formado dentro de la lumbrera de contención y subsecuentemente como un fluido se hacer fluir adentro de la lumbrera de contención para deslavar todos los componentes extraños no asociados con el gel de diagnóstico. El paso de lavado también puede incluir el hinchado del gel de diagnóstico a su capacidad máxima para permitir un mejor funcionamiento de gel de diagnóstico. En una incorporación alterna, el gel de diagnóstico se hace fluir adentro de la lumbrera de contención y subsecuentemente, esto es mantenido en el lugar dentro de la lumbrera de contención a través del uso apropiado de un vacío aplicado en contra de las paredes de la lumbrera de contención. Después de que el elemento de diagnóstico comprendiendo el gel de diagnóstico es sometido a un analito, el elemento de diagnóstico puede ser cortado, como se muestra en el paso 56. El corte puede tener lugar en los rebajes primero y segundo. Alternativamente, el elemento de diagnóstico es cortado solo en el primer rebaje, removiendo por tanto el elemento de diagnóstico junto con el conducto de salida y en donde es aplicable, la lumbrera e salida y otras partes .
La Figura 8 muestra imágenes tomadas durante el proceso de capturar un gel de diagnóstico de la invención en la lumbrera de contención usando el método de la invención. La Figura 8 (a) muestra el gel de diagnóstico 14 en la lumbrera de preparación 32 antes de la entrada en la lumbrera de contención 12 a través del conducto de entrada 16. la figura 8(b) muestra el gel de diagnóstico 14 siendo exprimido dentro de la lumbrera de contención 12 a través de del conducto de entrada 16. En este caso particular, el gel de diagnóstico está siendo forzado dentro de la lumbrera de contención a través del uso del flujo de una fase móvil a una tasa de flujo adecuada. La Figura 8(c) muestra el gel de diagnóstico 14 que está ahora atrapado en la lumbrera de contención 12. El gel de diagnóstico no solo permite el pasar adentro de los conductos de salida 18 ya que las dimensiones de los conductos de salida son tales que no son factibles para el paso del gel de diagnóstico.
Otro método de ejemplo para proporcionar un canal conformado mostrado por el número 50 en la Figura 7, también se muestra en la Figura 9 y se muestra mediante el número 50, en donde el método comprende proporcionar una oblea de silicio 58 que comprende canales con patrón. La oblea de silicio comprendiendo los canales con patrón puede ser compradas de fuentes comerciales, tal como o puede ser creada en una manera fácil mediante el uso apropiado decapado o fotolitrografía usando técnicas de fabricación estándar conocidas en el arte. Un método de fotolitografía de ejemplo involucra el uso de material fotoresistor SU-8.
Entonces, el método comprende el verter un primer material que puede ser curado 60 sobre la oblea de silicio conteniendo características positivas para formar un canal que puede ser curado o un relieve negativo. Los materiales que pueden ser curados típicos incluyen aquellos que pueden ser curados con la exposición a altas temperaturas de o a una radiación adecuada teniendo una longitud de onda adecuada. Algunas de las características que pueden ser usadas para seleccionar los materiales curables pueden incluir el flujo de material curable, el tiempo de curado cuando se expone a condiciones de curado, la naturaleza del material curado, la transparencia, la resistencia y similares. Algunos materiales de ejemplo incluyen pero no se limitan a PDMS, poliuretano, etc. En algunas incorporaciones, la combinación de materiales puede ser usada como los primeros materiales que pueden ser curados.
El método para la formación del canal conformado entonces involucra el curar el material curable como se mostró por el número 62 en la Figura 9. El curado puede ser efectuado por cualesquier métodos adecuados conocidos en el arte. Los métodos de ejemplo incluyen el calentamiento, la exposición a la radiación ultravioleta y similares. El curado resulta de la formación de un material con patrón de material curable. Subsecuentemente, el material con patrón es pelado fuera de la oblea a de silicio, mostrada en la Figura 9 como con el número 64. El material con patrón que es pelado fuera de la oblea de silicio es sellado sobre por lo menos una superficie, mostrada con el número 72 en la Figura 9. En una incorporación de ejemplo, en donde los materiales que pueden ser curados son PDMS, el curado puede ser efectuado mediante el calentamiento de este a alrededor de 60 minutos, después del pelado de este fuera de la oblea de silicio, está sellada reversiblemente mediante el presionar sobre la platina de vidrio o es sellado reversiblemente a una platina de vidrio mediante adhesión activada con plasma.
En otra incorporación, el canal sellado se proporciona mediante un moldeado por inyección de un material moldeado por inyección térmicamente grabado, tal como un material termoplástico . Los plásticos típicos que pueden ser moldeados por inyección incluyen, poli (metil metacrilato) , poli (cloruro de vinilo) , poli (metacrilato) , policarbonato, poliésteres, poliamidas, copolímero olefina cíclico (COC) y similares. Tales plásticos están típicamente disponibles de una variedad de fuentes comerciales. En una incorporación específica, el plástico útil en la invención es un poli (metil metacrilato) . Los dispositivos de plástico duplicados son entonces sellados a una hoja plana de plástico similar usando un proceso de unión apropiado tal como una unión térmica o una unión activada con adhesivo para proporcionar un dispositivo completamente encerrado .
En otro aspecto, la invención proporciona un método para usar un elemento de diagnóstico de la invención. Este método está representado en una manera esquemática en la Figura 10, y se muestra con el número 76. El método comprende el hace fluir una muestra 78 a través del conducto de entrada dentro del elemento de diagnóstico que comprende el por lo menos un gel de diagnóstico para proporcionar un elemento de diagnóstico de analito. El elemento de diagnóstico de analito es entonces analizado para detectar los atributos 80 asociados con el analito. La naturaleza exacta de la interacción entre el extremo de diagnóstico del gel de diagnóstico contenido dentro del dispositivo de diagnóstico de la invención con un analito se muestra visualmente en las Figuras 3 y 4.
En una incorporación de ejemplo ilustrando la formación de un elemento de diagnóstico para un inmuno-ensayo multiplexado en donde el elemento de diagnóstico contiene características como sigue: El elemento de diagnóstico mostrado en la Figura 11 y designado con el número 82 conteniendo tres tiras de hidromel 84 se forma usando una metodología micro fluídica única como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América US2007/105972A1. Brevemente, el método involucra el usar el flujo laminar para formar tiras especialmente segregadas de hidromel 84, y después usar la fotopolimerización ultravioleta desde una foto-máscara conformada para formar un hidrogel sólido con una definición de forma. Cada tira de hidrogel 84 comprende un anticuerpo de captura específica 86, 88 y 90. En esta incorporación de ejemplo, cada tira de hidrogel es de alrededor de 100 µta de ancho y de 200 a 330 µp? de largo .
La Figura 12 muestra el uso de un elemento de diagnóstico para un inmuno ensayo multiplexado, mostrado con el número 92. El control fluídico automatizado es entonces usado para suministrar un fluido de cuerpo específico dentro de un chip conteniendo estas tiras de hidrogel 84 que comprende la captura específica del anticuerpo 86, 88 y 90, el cual entonces se deja incubar a un periodo de tiempo predeterminado. El periodo de tiempo requerido para la incubación dependerá de la naturaleza de los anticuerpos y los antígenos, de las características físicas tal como la temperatura, la presión y similares, y pueden ser fácilmente determinados por aquellos expertos en el arte. Después de la incubación por unos pocos minutos, los anticuerpos 86, 88 y 90 se unen a sí mismas a los anticuerpos específicos, en donde los anticuerpos específicos están mostrados por los números 92, 94 y 96 en la Figura 12. Subsecuentemente, se lleva a cabo un paso de lavado para permitir que cualquier antígeno no unido sea deslavado hacia fuera. La Figura 13 muestra la preparación del elemento de diagnóstico para un paso de ensayo, mostrado por el número 98. En este paso, un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente mostrado con el número 100 en la Figura 13 es entonces fluido a través del chip y se incuba por unos cuantos minutos antes que el anticuerpo etiquetado fluorescentemente no unido sea lavado hacia fuera. El anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente es generalmente no específico en su sujeción y es capaz de la unión a cualquier antígeno o anticuerpo del sistema dado. Alternativamente, el anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente puede ser capaz de la unión solo a grupos específicos sobre anticuerpos o antígenos específicos. La señal fluorescente es entonces leída de cada una de las líneas y la cantidad de antígeno presente en la muestra es deducida usando la señal fluorescente.
La gran ventaja que esta clase de sistema de ensayo proporciona es que sólo un volumen pequeño de suero (~1 µ?) es todo lo que se requiere para llevar a cabo en análisis. La sensibilidad de la señal fluorescente dependerá del detector usado y puede potencialmente ser leído hasta el nivel de picomolar (10-12 M) . El método se ha mostrado aquí sólo para tres tiras, pero puede fácilmente ser fácilmente extendido hasta 10 proteínas, y puede aún ser extendido a números mayores mediante el uso de un arreglo de proteínas en oposición a tiras de estos. La invención también resuelve el problema general de la encapsulación y posición de una partícula dada de interés dentro de un área particular, cuyo problema ha sido delineado por Becker y otros en Becker y otros, Anuario de Química Bioanal (2008) 390:89-111. El método de la invención puede además ser usado como una técnica para el flujo en válvulas, electrodos, y para controlar la colocación de objetos adecuados tal como células en un área particular dada.
EJEMPLOS
Formación de Hidrogel
Una composición que comprende los siguientes componentes usados para formar el gel de diagnóstico de la invención. 12.3 microlitos (µ?) de polietileno-diacrilato- 700 (PEG-DA-700) de (Signa Aldrich, 0.4 ul foto- iniciados DAR0CURarca Registrada 1173/ 5 miiigramos (mg) de NaHC03 (0.62M) y 87 µ? de Agua Salada de Motivador de Fosfato (PBS) . Condiciones de exposición: -10 segundos. Intensidades de luz 25-100 mW/centímetro cuadrado de luz. H=75 micrómetros (µp?) . W=200-400 µ??. Las máscaras rectangulares fueron usadas durante la exposición. Las dimensiones de gel de diagnóstico de la invención fueron como sigue: 300µ? de longitud, 200µ?? de ancho y 75µ, de grosor. La Figura 14 muestra la fotografía del gel de diagnóstico de la invención, como se mostró por el número 102. Los poros causados por el porógeno son claramente visibles aquí.
En un ejemplo comparativo, una composición comprendiendo los siguientes componentes fue usado para formar el hidrogel: 12.3 µ? de PEG-DA-700Sigma Aldrich, 0.4 µ? DAR0CURarca Registrada 1173 foto-iniciador, y 87 ul de PBS fueron usados para hacer un hidrogel. Las dimensiones del hidrogel hecho por el ejemplo comparativo fueron similares a aquellas del gel de diagnóstico de la invención.
El gel diagnóstico del ejemplo y el hidrogel del ejemplo comparativo descrito aquí fue entonces tratado con 100µ9/??1 de solución acuosa de un anticuerpo para la insulina etiquetada con FITC, el cual es un fluoroforo conteniendo 150 kiloDalton de proteína. La Figura 15 muestra la imagen fluorescente del gel de diagnóstico que se ha tratado con la solución de proteína conteniendo fluoroforo, mostrada con el número 104. Puede verse que la proteína conteniendo fluoroforo fue capaz de permear a través del gel de diagnóstico poroso de la invención, obscureciendo por tanto los contornos del gel de diagnóstico. La Figura 16 muestra el hidrogel del ejemplo comparativo tratado con el fluoroforo conteniendo la solución de proteína. El hidrogel mostrado por el número 106 mostró que la proteína es incapaz de permear el hidrogel, como se evidenció por el color oscuro del gel.
El hidrogel poroso del ejemplo también mostró la propiedad de ser capaz de exprimir adentro de la lumbrera de contención a valores apropiados de presión/vacío. El hidrogel como se describió en el ejemplo comparativo, el cual fue preparado sin NaHC03 fue rígido y en capas de exprimir adentro de la lumbrera de contención como se deseó.
Fabricación de dispositivo
Los dispositivos fueron fabricados mediante verter el polidimetilsiloxano (PDMS, SylgardMarca Es rada 184 ? de Dow Corning) sobre una oblea de silicio conteniendo canales de alivio positivo en el fotoresistor SU-8 (Microchem) . El grosor de los dispositivos PDMS fue siempre mantenido para ser de 5 milímetros o mayor. Los dispositivos fueron fabricados mediante el cortar el canal de PDMS usando un escalpelo, perforando un orificio en un extremo usando una perforación de biopsia para hacerlas lumbreras de entrada. Los dispositivos PDMS fueron entonces sellados con plasma a las platinas de vidrio recubiertas con girado con PDMS después de colocar las capas de sacrifico de PDMS sobre el canal sólo y/o sobre la región de la pátina de vidrio que se asienta directo debajo del calor. Esto es para asegurar que el oligómero fue expuesto solo a superficies sin plasma tratadas con PDMS, mientras que se asegura que el dispositivo está aún efectivamente sellado .
Las fotomáscaras conteniendo formas de válvula fueron diseñadas en AUTOCAD 2007 y se imprimieron usando una impresora de alta resolución de Fineline Imaging (de Boulder, Colorado, Estados Unidos de América) . Cada máscara fue insertada en el campo-tope del microscopio para ser usada para la proyección de fotolitografía. Una lámpara de mercurio de 100W HBO sirvió como la fuente de rayos ultravioleta. Un conjunto de filtro que proporciona una excitación de ultravioleta amplia (11000v2: UV, Chroma) fue usada para seleccionar la luz de longitud de onda deseada y un sistema obturador de VS25 (Uniblitz) impulsado por un impulsor de obturador VCM-D1 controlado por computadora proporcionó pulsaciones especificadas de luz ultravioleta. Los tiempos de exposición típicos usados fueron de 100-1000 milisegundos (ms) y las presiones fueron de entre 0.1 y 1 libras por pulgada cuadrada (psi) . Los dispositivos fueron montados sobre un microscopio invertido (Ti-S, Nikon) y la formación de las estructuras de gel fueron visualizadas usando una cámara CCD (Micropublisher 3.3 RTV, Qimaging) .
Diseño y fabricación de un dispositivo microfluídico :
El diseño y fabricación de un dispositivo microfluídico está mostrado en la Figura 2. El dispositivo microfluídico tiene tres entradas (para la multiplexión de proteínas) las cuales combinan para formar un canal y una salida única en el otro extremo. Las dimensiones de canal son de longitud de 5000 µ?t? 300 µ?? de ancho y 75 µp? de altura. El ancho de canal está constreñido en un extremo llamado como zona de constricción o conducto de entrada para dejar que se exprima el gel. El lado izquierdo de la constricción es llamado la zona de formación de gel o lumbrera de preparación en donde los anticuerpos son polimerizados en una forma multiplexada usando una teoría de flujo laminar para formar un hidrogel poroso. El gel es exprimido a través de la constricción y es atrapado sobre el otro lado de la constricción llamado la zona de trampa o lumbrera de contención. Tres dispositivos diferentes con una constricción de ancho diferente fueron diseñados a saber de 200 µp?, 150 µp? y 100 µ?a. El ancho del canal de salida es la mitad del ancho del canal de zona de constricción, por ejemplo., 100 µp?, 75 µp? y 50 µp? respectivamente.
El proceso de encapsulacion de reactivo requirió dos pasos - el primero fue la fabricación de hidrogel y el segundo fue el atrapamiento de hidrogel. Las estructuras de hidrogel fueron fabricadas usando la técnica previamente designada de litografía de tope de flujo. Un requerimiento importante para atrapar hidrogel fue que las estructuras fabricadas fueron suficientemente suaves para exprimirlas a través de las constricciones. A fin de lograr esto, las estructuras de hidrogel microporosos fueron fabricados usando la técnica descrita aquí anteriormente. Esta estructuras muestran las propiedades mecánicas necesarias que permiten a estas fluir a través de las constricciones de canal que son más pequeñas que sus tamaños no restringidos. Dispositivo de interfase.
El flujo de fluido a través del canal micro fluídico fue controlado usando ambos las fuentes de vacío y de presión generadas por la micro bomba D771-11 BTC-IIS serie (de Hargraves, Estados Unidos de América) . La fuente fue conectada al dispositivo microfluídico a través de un tubo Tygon y la acción fluídica fue automatizada usando las válvulas de solenoide de "Diez Milímetros" miniaturizadas (de Pneumadyne, Estados Unidos de América) controladas por el software de Labview.
Detección
La detección de la señal fluorescente que emana desde el hidrogel fue medido usando las imágenes capturadas por la cámara Coolsnap EZ CCD (de Photometrics , Singapur) . La intensidad de señal de cada tira fue promediad usando un software ImageJ antes de ser cuantificada . El filtrado de ruido fue realizado mediante el restar la señal de una tira de control de aquella que no contuvo anticuerpo primario.
Efecto de presión sobre el atrapamiento de hidrogel.
El atrapamiento e hidrogel se basa sobre la premisa de que un cierto mínimo de presión de umbral (Pmin) se requiere para exprimir una estructura a través de un canal más pequeño que en el ancho. Además, una vez atrapada, la partícula puede soportar una cierta presión máxima (Pmax) antes de ser exprimida fuera en la dirección opuesta. En el proceso de fabricación por tanto, una presión Pman es usada en donde (Pmin<Pman<Pmax) . Durante el ensayo, la presión usada (Peli) debe ser tal que la partícula no se exprima fuera en la dirección esta entró y por tanto nosotros tenemos Peli<Pmin. Las presiones de umbral descritas son funciones de las propiedades mecánicas del hidrogel y la geometría de las estructuras de calor. Una ecuación que describe la dependencia cuantitativa de la presión de umbral en estos parámetros puede derivarse con base en el conocimiento y la habilidad del usuario y los datos históricos del dispositivo.
En nuestro experimento, las presiones fueron aplicadas a las lumbreras usadas para el flujo de los reactivos lo cual hace que la estructura de hidrogel y vacío fue aplicada las lumbreras las cuales son requeridas para jalar en la estructura de hidrogel fabricada. La presión y el vacío fueron aplicadas alternativamente usando las válvulas de solenoide controladas por computadora.
Efecto de número de canales.
El esquema de encapsulación descrito puede ser extendido para fabricar un número grande de canales conteniendo hidrogel encapsulado. La empaquetadura PDMS que fue usada en un ejemplo y fue controlada mediante canales separados a los cuales fue aplicada la presión de vacío como se mostró para cerrar y abrir la empaquetadura respectivamente. La presión o el vacío fueron aplicados a través de válvulas de solenoide de tres vías de miniatura (Pneumadina) y se controlaron usando un programa escrito en Labview"3^9 de c° ci° .
Aún cuando ciertas características de la invención se han mostrado y descrito aquí, muchas modificaciones y cambios ocurrirán a aquellos que son expertos en el arte. Por tanto, deberá entenderse que las reivindicaciones anexas se intenta que cubran todas esas modificaciones y cambios que caen dentro del espíritu verdadero de la invenció.
REFERENCIAS
1. Becker, H. y C. G rtner, Tecnologías de Microfabricación de Polímero para Sistemas microfluídicos , Química Analítica y Bioanalítica, 2008. 390(1) :p. 89-111.
2. Dendukuri, D. y otros, Litografía de Flujo
Continuo para Síntesis de Micropartículas de Alta Producción, Nat Mater, 2006. 5 ( 5) :p .365-369.
Claims (19)
1. Una composición de gel de diagnóstico que tiene dimensiones variando de desde alrededor de 250 nanómetros a alrededor de 1000 micrómetros, y un módulo Young variando de desde alrededor de 10 kilopascales a alrededor de 200 kilopascales en donde la composición de gel de diagnóstico se deriva de un compuesto que tiene la fórmula: D-Sp-Po; en donde D es un grupo de diagnóstico; Sp es un grupo espaciador hidrofílico ; Po es un grupo polimerizable .
2. La composición de gel de diagnóstico, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque D es un anticuerpo producido por el cuerpo en contra de un antígeno de superficie sobre virus.
3. La composición de gel de diagnóstico, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque Sp es un grupo a base de poli(etilen glicol) .
4. La composición de gel de diagnóstico, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque Po es un grupo de vinilo.
5. La composición de gel de diagnóstico, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada además porque comprende poros teniendo un tamaño de poro variando de alrededor de 5 nanómetros a alrededor de 1000 nanómetros .
6. La composición de gel de diagnóstico, tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque Po es un grupo de vinilo y Sp es un grupo a base de poli(etilen glicol) .
7. Un elemento de diagnóstico que comprende la composición de gel de diagnóstico de la cláusula 1.
8. Un dispositivo de diagnóstico que comprende el elemento de diagnóstico de la cláusula 6.
9. Un método para hacer una composición de gel de diagnóstico, el método comprende: Proporcionar una composición que comprende un porógeno como un iniciador y un compuesto que tiene una fórmula; D-Sp-Po; polimerizar la composición para formar una composición polimerizada; lavar la composición polimerizada para formar la composición de gel de diagnóstico; en donde D es un grupo de diagnóstico; Sp es un grupo espaciador hidrofílico; y Po es un grupo polimerizables .
10. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque la polimerización es mediante fotopolimerización.
11. El método tal y como se reivindica en la cláusula 10, caracterizado porque la polimerización es efectuada a través de una fotomáscara.
12. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque el porógeno es bicarbonato de sodio.
13. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque el iniciador es un fotoiniciador .
14. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque D es un anticuerpo de Inmuno Deficiencia Humana específico a un antígeno particular.
15. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque D es un aptámero.
16. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque D es un oligonucleótido .
17 El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque Sp es un grupo a base de poli(etilen glicol) .
18. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque Po es un grupo de vinilo.
19. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque además comprende el lavar el porógeno. R E S U M E N La invención se refiere a una composición de gel de diagnóstico para usarse como un elemento de diagnóstico en dispositivos de diagnóstico. La composición de gel de diagnóstico es derivada de un compuesto que tiene una fórmula D-Sp-Po, en donde D es un grupo de diagnóstico; Sp es un grupo esparcidor hidrofílico ; Po es un grupo polimerizable . La composición de gel de diagnóstico de la invención tiene dimensiones variando de desde alrededor de 250 nanómetros a alrededor de 1000 micrómetros, y un módulo Young variando de desde alrededor de 10 kilopascales a alrededor de 200 kilopascales. La invención también proporciona un método para hacer una composición de gel de diagnóstico. El método comprende el proporcionar una composición que comprende un porógeno como un iniciador y un compuesto teniendo una fórmula de D-Sp-Po; polimerizar la composición para formar una composición polimerizada; y lavar la composición polimerizada para formar la composición de gel de diagnóstico .
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