CN107855080B

CN107855080B - 高分子凝胶颗粒、其制备方法、包含其的复合凝胶颗粒及用途

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Publication number: CN107855080B
Application number: CN201711036550.9A
Authority: CN
Inventors: 马光辉; 岳华; 吴颉; 吴楠; 苗春宇; 周炜清
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2037-10-30
Also published as: CN107855080A

Abstract

本发明提供了一种高分子凝胶颗粒、其制备方法、包含其的复合凝胶颗粒及用途。所述高分子凝胶颗粒的杨氏模量为5‑5000pa，平均粒径为100nm‑100μm，多分散指数<0.5，且不含有有机溶剂。所述高分子凝胶颗粒是通过先将高分子水溶液交联形成杨氏模量为5‑5000pa的水凝胶，然后将该水凝胶初步破碎细化，再用流体剪切的方法制备得到。所述复合凝胶颗粒包括上述高分子凝胶颗粒，和负载在高分子凝胶颗粒上的功能物质。本发明制备高分子凝胶颗粒的过程不使用任何有机溶剂或表面活性剂，得到的高分子凝胶颗粒安全可靠，且粒径从纳米到微米范围内可控，粒径均一，由其制备的复合凝胶颗粒可用于生物医药等领域。

Description

高分子凝胶颗粒、其制备方法、包含其的复合凝胶颗粒及用途

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料技术领域，具体涉及一种高分子凝胶颗粒、其制备方法、包含其的复合凝胶颗粒及用途。

背景技术

纳微米颗粒借助小尺度效应、表面/界面效应以及量子尺寸效应等，在生物医药领域(如药物递送、疫苗佐剂、组织工程、分子成像)、化工和环保领域(如日化品、仿生材料、微载体、酶催化、生物分离、污水处理)展现出广阔的应用前景。用于制备纳微米颗粒的诸多材料中，最常用的是高分子材料，包含天然高分子(如多糖、多肽)和合成高分子(如高分子醇、丙烯酸及其衍生物类)。天然多糖，如壳聚糖、淀粉、明胶、琼脂、海藻酸和葡聚糖，因其优越的生物相容性和可降解性，近年来备受关注。特别地，天然多糖壳聚糖来源广泛，具有良好的生物黏附性和生物降解性，而且其降解产物几乎无毒、无致癌性，成为生物医药载体和食品领域的研究热点(Polysaccharides as nanocarriers for therapeuticapplications.Journal of Biomedical Nanotechnology,2014,10(9):2149-2172)。进一步将壳聚糖进行季铵化、羧甲基化、羟基化、烷基化、酰基化、磺化、硝化或卤化等衍生反应后，还可以拓展其作为纳微颗粒材料的优良属性，解决溶解性、机械强度不理想的问题，以应对不同的需求。例如，将壳聚糖修饰季铵化后，比壳聚糖具有更好的水溶性、亲水性和阳离子性，对应更高的吸湿保湿型和金属离子螯合性能，因此除用于医药领域外，还有望在化妆品、环境保护等领域发挥独特的应用价值。

虽然高分子纳微米颗粒在生物医药领域或者化工领域的研究较多，但进入产业化阶段的产品却非常少。目前制备颗粒最常用的方法有聚合物分散法，如溶剂挥发法和溶剂扩散法等。例如，将高分子多糖溶解于醋酸中作为水相(W)，液体石蜡和石油醚作为油相(O)，在聚山梨酯-80等表面活性剂的作用下，通过超声或搅拌等方法先制得含有功能物质的油包水(W/O)型乳液，然后加入化学交联剂(如戊二醛)固化(Cross-linked chitosanmicrospheres for oral delivery of insulin:Taguchi design and in vivo testing,Colloids Surf.B Biointerfaces.2012,92:175–179)，最后使用大量有机溶剂(石油醚、丙酮、乙醇)和水离心洗涤得到纳微米颗粒(原理示意图如图1所示)。对于水溶性的功能物质(如胰岛素)，则采用W/O/W型复乳技术制备纳微颗粒。此外，可以将多糖水相溶液(W)在乳化剂(如泊洛沙姆)存在下分散在含有功能物质的亲水性油相(氯仿)中，借助扩散作用，两相之间的界面产生湍流，使多糖发生沉降析出，从而形成尺寸更小的纳米颗粒。

上述聚合物分散法制备颗粒虽然可以制备具有不同粒径的颗粒，但是制备过程需要同时使用水相和油相，不可避免地引入大量的有机试剂或者表面活性剂，且反应条件不够温和，容易造成功能物质活性损失，降低生物利用度。更重要的是，这些溶剂多数具有挥发性、可燃性或者对人体皮肤、器官和组织等具有潜在毒性，是药典规定需要严格限制残留量的一类试剂。为了规避残留试剂可能会对环境或者人体造成的不利影响，需要对所制备颗粒进行多次离心或者回旋蒸发和洗涤，过程费时费力，能耗高。上述方法制备颗粒不仅对洗涤工艺和后续残留试剂的检测提出很高的标准，而且对生产环境、厂房和设备也提出更高要求(需防爆耐腐蚀等)，增加了产品的成本。

除了聚合物分散法外，其他的制备方法还有沉淀法、单体聚合法、离子交联法、喷雾干燥法等(Advances in chitosan-based drug delivery vehicles.Nanoscale,2013,5(8):3103-11.)。例如，将硫酸钠溶液中逐滴滴入含有吐温-80作分散剂的壳聚糖溶液，经超声后得到多糖沉淀颗粒。此外，可以将壳聚糖溶解于丙烯酸单体溶液中，再加入引发剂进行模板聚合制得颗粒，制备出5-400nm的壳聚糖聚丙烯纳米载体。将聚阴离子作为物理交联剂(如三聚磷酸钠等)，加入壳聚糖水溶液，使多糖大分子链间联结起来形成网状结构，在合适的pH和搅拌下，生成多糖纳米颗粒。

虽然该类方法限制了油相的使用，但是颗粒的制备程序较为繁杂或制备条件较苛刻，且产量不高，耗能较大，不利于产业化。更重要的是，上述方法无法调控颗粒尺寸，所制备的颗粒粒径比较小，通常处于纳米级别(＜500nm)，而较大粒径的微米级颗粒难以获得。纳米级颗粒虽然有其独特的优势，然而也有不足之处。例如，相比于微米级颗粒，纳米颗粒载药量低(通常小于5％)，而且载药时容易发生突释，使得药物到达靶向部位的有效浓度大幅度下降，因而也极大地减弱了纳米载体的递送效果，限制了其商品化应用(Nanoparticles in drug delivery:Past,present and future.Advanced DrugDelivery Reviews 65(2013)21–23)。

因此，如何获得一种反应条件温和、对环境友好无污染、制备程序简单、方便规模化放大而且粒径从纳米到微米可控的高分子纳微米颗粒，是本领域期望解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高分子凝胶颗粒、其制备方法、包含其的复合凝胶颗粒及用途。本发明制备高分子凝胶颗粒的过程不使用任何有机溶剂或表面活性剂，得到的高分子凝胶颗粒安全可靠，且粒径从纳米到微米范围内可控，粒径均一；由其制备的复合凝胶颗粒可用于药物递送、疫苗佐剂、医学成像材料、仿生材料、化妆品、日化用品、微载体、酶催化、生物分离和组织工程等领域。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种高分子凝胶颗粒，所述高分子凝胶颗粒的杨氏模量为5-5000pa(例如5pa、10pa、20pa、30pa、40pa、50pa、80pa、100pa、200pa、300pa、500pa、800pa、1000pa、1500pa、2000pa、2500pa、3000pa、3500pa、4000pa、4500pa或5000pa等)，平均粒径为100nm-100μm(例如100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、2.5μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm等)，多分散指数(PDI)<0.5(例如0.050、0.100、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350、0.400或0.450等)，且所述高分子凝胶颗粒不含有有机溶剂。

作为本发明的优选技术方案，所述高分子凝胶颗粒所用高分子为亲水性高分子。

优选地，所述高分子选自高分子多糖、高分子多糖衍生物、高分子多肽、高分子多肽衍生物、高分子醇或丙烯酸类高分子中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：高分子多糖与高分子多糖衍生物的组合、高分子多糖与高分子多肽的组合、高分子多糖与高分子醇的组合、高分子多糖与丙烯酸类高分子的组合、高分子多肽与高分子多肽衍生物的组合、高分子多肽与高分子醇的组合或高分子醇与丙烯酸类高分子的组合等。

本发明中“衍生物”是指对材料进行季铵化、羧甲基化、羟基化、烷基化、酰基化、磺化、硝化或卤化等衍生反应后所得的产物。

需要说明的是，本发明对凝胶材料的选择并不仅限于上述高分子材料，理论上所有能形成水凝胶的高分子材料均可。但考虑到本发明是应用于生物医学领域，因此以上述高分子材料为最优选择，其共同特点是生物相容性好，降解产物几乎无毒。

优选地，所述高分子多糖选自壳聚糖、淀粉、纤维素、琼脂、海藻酸钠或葡聚糖中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：壳聚糖与淀粉的组合、壳聚糖与淀粉的组合、壳聚糖与纤维素的组合、壳聚糖与琼脂的组合、壳聚糖与海藻酸钠的组合、、壳聚糖与葡聚糖的组合、淀粉与纤维素的组合、淀粉与海藻酸钠的组合、淀粉与葡聚糖的组合、纤维素与琼脂的组合、纤维素与葡聚糖的组合或琼脂与葡聚糖的组合等。

优选地，所述天然高分子多肽选自明胶、胶原、聚赖氨酸或聚L-谷胺酸中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：明胶与聚赖氨酸的组合、明胶与聚L-谷胺酸的组合、聚赖氨酸与聚L-谷胺酸的组合、胶原与聚赖氨酸的组合或胶原与聚L-谷胺酸的组合等。

优选地，所述高分子醇为聚乙二醇(PEG)和/或聚乙烯醇(PVA)。

优选地，所述丙烯酸类高分子为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和/或聚丙烯腈(PAN)。

优选地，所述高分子为壳聚糖和/或壳聚糖衍生物，进一步优选为羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖谷氨酸盐或壳聚糖乳酸盐中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：羧甲基壳聚糖与壳聚糖季铵盐的组合、壳聚糖盐酸盐与壳聚糖季铵盐的组合、壳聚糖盐酸盐与壳聚糖谷氨酸盐的组合、壳聚糖盐酸盐与壳聚糖乳酸盐的组合或羧甲基壳聚糖与壳聚糖乳酸盐的组合等。

优选地，所述壳聚糖及其衍生物的分子量为50-900kDa，例如可以是50kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa、800kDa、850kDa或900kDa等；进一步优选为100-600kDa。本发明中，可以根据不同的用途来选择高分子的分子量，但过高或者过低的分子量将影响高分子的胶凝特性，从而导致颗粒的成球性不好或者应用受限。例如壳聚糖分子量低至50kDa以下时，凝胶形成的时间过长甚至不凝胶，导致凝胶颗粒成球困难；而分子量高于900KDa时，分子链将过长，形成的水凝胶网络和结构虽然更加致密，但不容易在水中分散成纳米级颗粒，而且形成的颗粒会紧实不柔软，黏膜组织渗透性变差。因此，本发明中，壳聚糖及其衍生物的分子量优选为50-900kDa。

第二方面，本发明提供一种上述高分子凝胶颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将高分子溶于第一水相中，通过交联使其形成杨氏模量为5-5000pa(例如5pa、10pa、20pa、30pa、40pa、50pa、80pa、100pa、200pa、300pa、500pa、800pa、1000pa、1500pa、2000pa、2500pa、3000pa、3500pa、4000pa、4500pa或5000pa等)的水凝胶；

(2)向步骤(1)得到的水凝胶中添加第二水相，将所述水凝胶经过或不经过初步破碎细化，然后通过流体剪切形成所述高分子凝胶颗粒。

上述步骤(1)中形成的水凝胶为半流动或不流动状态，本发明引入杨氏模量(硬度指标)来定量指示凝胶的流动状态。需要说明的是，由于将水凝胶破碎、剪切形成高分子凝胶颗粒的过程并不影响其物理性质，因此本发明中均以水凝胶的杨氏模量作为高分子凝胶颗粒的杨氏模量。

所述杨氏模量采用安东帕MCR302流变仪进行测定，具体的步骤如下：

首先将仪器设置到恒温振幅扫描模式，选择合适直径(如25mm)的平板转子及加样台高度h(如1mm)，固定频率(如1Hz)，然后设置剪切应变γ从0.01％至10％按对数变化。具体检测步骤为：将胶凝完全的凝胶样本放置于加样台中心，转子下降至测量位置，刮样后开始测定，周围加盖密封装置以减少测量过程中的水分损失，得到储能模量G'及损耗模量G"随剪切应变变化的曲线图。根据下列公式计算出杨氏模量E；

E＝2G(1+v)，

其中v为泊松比，对于本发明(不可压缩材料)v＝0.5。

杨氏模量是用以检测水凝胶硬度的指标，可反映出不同材料配方采用不同交联方式的制得凝胶的物理特性，与后续成球性直接相关。水凝胶的硬度随着高分子分子量、溶液浓度和交联度的增加而增加。高分子溶液未形成凝胶时，具有最佳流动性，其杨氏模量为0。本领域技术人员可通过控制高分子分子量、溶液浓度和交联度来对水凝胶的硬度进行调节，但需要注意的是，当步骤(1)中所形成的水凝胶硬度过低或者过高时，都无法形成均一的凝胶颗粒。例如，当水凝胶杨氏模量高于5000Pa时，凝胶的机械强度高，网络结构致密，经初步分散和流体剪切仍难以破碎成均匀的小颗粒。而当水凝胶杨氏模量低于5Pa时，凝胶流动性相对较高，胶凝网络疏松，即使能形成凝胶颗粒，但该体系不稳定，其中的颗粒容易发生聚并，造成颗粒粒径不可控，颗粒分布宽。因此，只有当水凝胶杨氏模量为5-5000Pa时，才具备形成均一可控凝胶颗粒的条件。

上述步骤(2)中所述初步破碎的目的是将块状的水凝胶细化成小颗粒，使其均匀分散于水相中，方便后续的流体剪切操作。对于硬度较低的水凝胶，也可以不进行初步破碎，而直接进行流体剪切。本发明中制备初步破碎细化的凝胶颗粒的操作原理如图2所示。所述初步破碎的方式可以选择微流控、均质、超声、注射器双推乳化、喷雾、微射流、膜乳化、搅拌、振荡、移液枪吹打、倒转或手摇混合等多种方式，只要能实现水凝胶破碎成颗粒，并在水相中良好分散即可。作为本发明的优选技术方案，所述初步破碎的方法选自机械搅拌、磁力搅拌、均质乳化或超声破碎中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：机械搅拌与磁力搅拌的组合、机械搅拌与超声破碎的组合、均质乳化与超声破碎的组合或磁力搅拌、均质乳化和超声破碎三者的组合等。

优选地，所述流体剪切的方法为微孔膜乳化法和/或高压均质法。

本发明中，所述高压均质法是将水凝胶初步破碎后加入至高压均质机的物料杯中，然后在压力条件下使初步破碎的水凝胶颗粒通过高压均质阀，在剪切、撞击和空穴作用下形成高分子凝胶颗粒(如图3所示)。采用高压均质法制备高分子凝胶颗粒时，可通过选择不同压力来控制产品的粒径大小。优选地，所述压力为500-30000psi，例如可以是500psi、800psi、1000psi、1500psi、2000psi、2500psi、3000psi、3500psi、4000psi、5000psi、6000psi、7000psi、8000psi、9000psi、10000psi、15000psi、20000psi、25000psi或30000psi等。

本发明中，所述微孔膜乳化法是将水凝胶初步破碎后加入至微孔膜的膜管，然后在压力条件下使初步破碎的水凝胶颗粒通过微孔膜，在膜孔的挤压和剪切作用下形成高分子凝胶颗粒(如图4所示)。采用微孔膜乳化法时可通过选择不同膜孔径的微孔膜来控制产品的粒径大小。常用的微孔膜的孔径为0.1-200μm，在制备微米级的高分子凝胶颗粒时，通常选择微孔膜的孔径为1-200μm(例如1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、120μm、150μm、180μm或200μm等)，进一步优选为1-100μm；在制备纳米级的高分子凝胶颗粒时，通常选择微孔膜的孔径为0.1-20μm(例如0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.5μm、0.6μm、0.8μm、1μm、2μm、2.5μm、3μm、5μm、8μm、10μm、12μm、15μm、18μm或20μm等)，进一步优选为0.5-10μm。

本发明中，流体剪切力度直接影响颗粒粒径大小。对于微孔膜乳化法，可以使初步破碎的水凝胶颗粒连续通过两个或更多个孔径相同或者孔径逐渐减小的均一微孔膜。由于微孔膜的孔径都是非常均一的，因此得到的高分子凝胶颗粒粒径也将相对均一；当微孔膜孔径越小时，得到的高分子凝胶颗粒粒径就越小，反之亦然。对于高压均质法，可以使初步破碎的水凝胶颗粒循环通过物料杯和高压均质阀，每次循环可在相同或不同的压力条件下进行。通常而言，要想获得更小的颗粒，可以增加高压均质的压力和循环次数。而想获得更均一的颗粒，可在较低压力下，提前进行一次或多次初步的均质(预均质)。除此之外，颗粒粒径大小还与高分子分子量、高分子修饰类别和交联剂用量有关，因此，要根据不同的高分子及衍生物种类、制备条件和用途来选择适合的微孔膜和均质压力。

作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述高分子在水相中的浓度为1mg/mL-1g/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、300mg/mL、400mg/mL、500mg/mL、600mg/mL、800mg/mL或1g/ml等；进一步优选为5-500mg/mL。

优选地，所述第一水相和第二水相各自独立地为可代谢水。

优选地，所述可代谢水为纯化水、酸溶液、缓冲盐水溶液、碱溶液或生理盐水。

优选地，所述酸溶液的pH为5.0-7.0，例如可以是5.0、5.2、5.4、5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5或6.8等。

优选地，所述酸溶液选自醋酸、盐酸、柠檬酸、乳酸或抗坏血酸的水溶液中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：醋酸与盐酸的组合、醋酸与柠檬酸的组合、醋酸与乳酸的组合、醋酸与抗坏血酸的组合、盐酸与柠檬酸的组合、盐酸与乳酸的组合、柠檬酸与乳酸的组合、柠檬酸与抗坏血酸的组合或乳酸与抗坏血酸的组合等。

优选地，所述缓冲盐水溶液的pH为5.0-9.0，例如可以是5.0、5.2、5.4、5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0等；进一步优选为6.0-8.0。

优选地，所述缓冲盐水溶液选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或Tris(三羟甲基氨基甲烷)-盐酸缓冲液中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：磷酸盐缓冲液与柠檬酸盐缓冲液的组合、磷酸盐缓冲液与Tris-盐酸缓冲液的组合或柠檬酸盐缓冲液与Tris-盐酸缓冲液的组合等。

优选地，所述碱溶液的pH为8.0-10.0；例如可以是8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8或10.0等。

优选地，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。

作为本发明的优选技术方案，所述交联的方法为化学交联、物理交联或离子交联，优选为离子交联。物理交联是指分子间通过物理纠缠、非共价自组装、螯合/离子相互作用以及静电作用等机制形成水凝胶。例如，琼脂糖溶液可通过加热熔融发生热聚合，使高分子链段间生成共价键、氢键形成水凝胶；胶原分子以及其他富含脯氨酸和羟脯胺酸的肽类分子可借助有规律的排列结构，通过非共价自组装的方式形成三螺旋，进而形成凝胶；海藻酸钠和钙盐在溶液中会自发形成离子键发生交联形成水凝胶；溶液中含有两种相反电荷聚电解质时(如带正电的聚赖氨酸与带负电的聚丙烯酰胺)，其高分子链在静电屏蔽作用下会形成凝胶网络。化学交联方式是指利用交联剂与高分子链上的某些官能团(如氨基)发生加成、缩合之类的化学反应，将高分子连接成水凝胶网络。

优选地，所述化学交联中所用的交联剂选自甲醛、戊二醛、京尼平、环氧氯丙烷、二乙烯基苯、异氰酸酯、二缩水甘油基乙醚或乙酸酐中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：甲醛与戊二醛的组合、甲醛与京尼平的组合、甲醛与环氧氯丙烷的组合、甲醛与二乙烯基苯的组合、京尼平与环氧氯丙烷的组合、京尼平与异氰酸酯的组合、京尼平与二缩水甘油基乙醚的组合、京尼平与乙酸酐的组合、环氧氯丙烷与异氰酸酯的组合、异氰酸酯与二缩水甘油基乙醚的组合或二缩水甘油基乙醚与乙酸酐的组合等。

优选地，所述离子交联的固化温度为30-80℃；例如可以是30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75℃、78℃或80℃等。

优选地，所述离子交联中所用的离子交联剂选自氯化钙、碳酸钙、硫酸钙、乳酸钙、磷酸钙、三聚磷酸钠、柠檬酸钠或甘油磷酸盐中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：氯化钙与碳酸钙的组合、氯化钙与硫酸钙的组合、氯化钙与乳酸钙的组合、氯化钙与三聚磷酸钠的组合、氯化钙与柠檬酸钠的组合、氯化钙与甘油磷酸盐的组合、磷酸钙与三聚磷酸钠的组合、磷酸钙与柠檬酸钠的组合或磷酸钙与甘油磷酸盐的组合等。

优选地，所述离子交联剂为β-甘油磷酸钠和/或α,β-甘油磷酸钠。

优选地，所述离子交联剂的添加量为10-250mg/mL；例如可以是10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、150mg/mL、180mg/mL、200mg/mL、220mg/mL或250mg/mL等。

本发明中采用离子交联方式形成的高分子水凝胶(如壳聚糖多糖及其衍生物水凝胶)可具有温度敏感特性，主要是借助甘油磷酸盐与高分子之间的交联而成的三维网络结构而形成。优选的甘油磷酸盐为分子量小且带负电性的多羟基(-OH)化合物，可借助电荷效应吸附于含有可质子化的氨基(阳离子)的多糖上，形成离子键。同时，甘油磷酸盐的-OH借助氢键作用可以吸附大量水分子，在高分子表面形成水化层，低温下保持流动的液体状态，而升高温度时，水化层遭到破坏，从而使多糖完成从溶液向凝胶的转变。因此，本发明中可以通过调整离子交联剂在水相中的浓度和固化温度控制多糖由液体向胶体的转化时间和程度。例如，在一定范围内，甘油磷酸盐的含量越高，离子键作用越明显，体系的胶凝时间会越快。但是多糖的可质子化的氨基被饱和电荷中和后，过高的浓度(如甘油磷酸盐添加量为1.0g/mL)对体系的胶凝时间改变不大。在相同离子交联剂浓度的情况下，提升固化温度，可以加速水凝胶的形成。例如70℃下，胶凝时间显著快于40℃，然而温度过高会导致分子间运动极度加剧，胶凝程度不均一，影响后续凝胶颗粒的成球性和均一性；温度低于30℃(如25℃)时，水化层保持稳定，凝胶难以形成。因此，本发明中离子交联剂的添加量优选为10-250mg/mL，固化温度优选为30-80℃。除了上述因素以外，水凝胶的形成还受多种因素影响，所以为了满足不同应用需求，需要综合考虑多糖分子量、交联剂使用温度/浓度和固化升温温度等因素以获得具有特定胶凝时间和胶凝程度的水凝胶。

与化学交联中由共价键形成的牢固网络不同，由物理作用形成的连接点结合能力较弱，网络结构会随着外界条件(如温度、pH、外界应力)的改变而发生变化。因此，该类方法形成的水凝胶，为后续步骤中水凝胶进一步细化形成微小的凝胶颗粒提供了条件。

第三方面，本发明提供一种复合凝胶颗粒，包括上述高分子凝胶颗粒和负载在所述高分子凝胶颗粒上的功能物质。

作为本发明的优选技术方案，所述功能物质选自靶向物质、抗原、药物、微生物、细胞、蛋白质、多肽、酶、荧光标记物、同位素标记物、环境响应物质、细胞因子、抗体、免疫调节剂或冷冻保护剂中的一种或至少两种的组合。所述组合典型但非限制性实例有：靶向物质和抗原的组合、靶向物质和药物的组合、靶向物质和蛋白质/多肽的组合、抗原和药物的组合、药物和环境响应物质的组合、抗原和细胞因子的组合、药物和抗体的组合、微生物和酶的组合、靶向物质、药物和荧光标志物的组合、靶向物质、药物和同位素标记物的组合，或抗原、细胞因子和免疫调节剂三者的组合等。

作为本发明的优选技术方案，所述负载的方法选自包埋、共混、表面吸附或偶联中的一种或至少两种的组合；进一步优选为包埋或表面吸附。

本发明所述高分子凝胶颗粒可根据实际应用的需要以多种方式负载功能物质。而表面吸附方式因其简易灵活，是负载功能物质方案中的较优选择。

在本发明中，采用包埋负载功能物质的方法为：

(1)将高分子和功能物质溶于第一水相中，通过交联使其形成杨氏模量为5-5000pa的水凝胶；

(2)向步骤(1)得到的水凝胶中添加第二水相，将所述水凝胶经过或不经过初步破碎细化，然后通过流体剪切形成复合凝胶颗粒。

采用表面吸附负载功能物质的方法为：直接将功能物质与高分子凝胶颗粒的溶液混合，或者按照下述方法制备：

(1)将高分子溶于第一水相中，通过交联使其形成杨氏模量为5-5000pa的水凝胶；

(2)向步骤(1)得到的水凝胶中添加功能物质和第二水相，将所述水凝胶经过或不经过初步破碎细化，然后通过流体剪切形成复合凝胶颗粒。

第四方面，本发明提供一种上述复合凝胶颗粒在药物递送、疫苗佐剂、医学成像材料、仿生材料、化妆品、日化用品、微载体、酶催化、生物分离和组织工程领域的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的高分子凝胶颗粒具有水凝胶和纳微米颗粒的双重优势，可适应不同的需求：不仅可以保持水凝胶良好的亲水性、生物粘附性、促渗透吸收功能，而且借助纳微米颗粒的尺寸效应、界面效应和量子效应等，可以发挥高效负载并靶向递送抗原、多肽、药物分子及其他功能物质并保持相关物质活性，激活动物或者人体免疫系统的作用，并实现分子成像、生物大分子分离、固定化酶和微生物/细胞等载体的功能。

(2)本发明提供的高分子凝胶颗粒的制备方法，只使用可代谢水作为溶剂，不需要使用任何表面活性剂或者有机溶剂，极大地规避了残留试剂对环境或者人体可能造成的不利影响，尤其可以满足生物医药领域对所制备纳微米颗粒生物安全性的需求。

(3)本发明通过使用流体剪切法处理初步破碎的凝胶和水的混合体系，获得的高分子凝胶颗粒的粒径在100nm-100μm范围内可控，粒径均一，多分散指数<0.5，且分散性良好。利用该高分子凝胶颗粒颗粒，不仅可以开展粒径大小和其应用效果的关系研究，减少实验结果的波动性并保证结果的可靠性和可重现性，而且还避免了颗粒聚并从而导致功能物质的稳定性和活性降低问题。

(4)本发明提供的制备方法涉及到的原料或者辅料种类非常少，主要是来源广泛的高分子、交联剂和可代谢水，因此极大地降低了成本，并减小了原辅料种类较多带来的生物安全性问题以及原辅料配伍及相容性的问题；简易的操作程序和温和的制备条件使得制备高分子颗粒时耗能小，原辅料损失少，颗粒产量高，功能物质活性得以有效保持，从而易于工业化生产。

附图说明

图1是W/O两相法制备高分子纳微米颗粒的操作原理示意图；

图2是本发明中制备初步破碎细化的凝胶颗粒的原理示意图；

图3是本发明中高压均质法的操作原理示意图；

图4是本发明中微孔膜乳化法的操作原理示意图；

图5是实施例1提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒的扫描电镜照片；

图6a是抗原提呈细胞活化测试中空白对照组抗原提呈细胞的光学显微照片；

图6b是抗原提呈细胞活化测试中实验组抗原提呈细胞的光学显微照片；

图7是动物急毒测试中小鼠的体重变化曲线图；

图8是实施例12提供的壳聚糖季铵盐凝胶颗粒的扫描电镜照片；

图9是实施例13和对比例6提供的壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒的细胞毒性测试结果图；

图10是对比例5提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒的光学显微照片。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明中水凝胶杨氏模量和高分子凝胶颗粒的表征方法如下：

1、水凝胶杨氏模量

采用安东帕MCR302流变仪进行测定。首先将仪器设置到恒温振幅扫描模式，选择合适直径(25mm)的平板转子及加样台高度h(1mm)，固定频率(1Hz)，然后设置剪切应变γ从0.01％至10％按对数变化。具体检测步骤为：将胶凝完全的凝胶样本放置于加样台中心，转子下降至测量位置，刮样后开始测定，周围加盖密封装置以减少测量过程中的水分损失，得到储能模量G'及损耗模量G"随剪切应变变化的曲线图。根据下列公式计算出杨氏模量E；

E＝2G(1+v)，v＝0.5，

2、高分子凝胶颗粒的粒径和分布

将高分子凝胶颗粒分散于水中制备成2mg/ml的颗粒悬浮液，然后将该悬浮液加入到样品池中，采用动态光散射粒度仪(Malvern)进行测定，得到平均粒径和PDI。PDI的计算方法如下：

PDI＝μ₂/Г²，μ₂＝(D²*-D*²)q⁴，Г＝Dq²，q＝4πn/λ₀sin(θ/2)；

其中θ为散射角，λ₀为激光波长，n为悬浮液的折光率，D为扩散系数，D*为平均扩散系数，D²*为D²的平均值。PDI越小，表明颗粒粒径分布越窄。

实施例1-3

实施例1-3提供壳聚糖衍生物凝胶颗粒，采用高压均质法制备，具体步骤如下：

将壳聚糖衍生物溶于8mL水相中，在室温、500rpm转速下磁力搅拌3h至完全溶解。在冰浴条件下，将2mL离子交联剂溶液滴加到上述壳聚糖衍生物溶液中，在500rpm转速下磁力搅拌5min，然后在油浴下固化一段时间，形成水凝胶。向上述水凝胶中添加水至25mL，初步破碎细化。然后将初步破碎的水凝胶混合液加入高压均质机的储液杯中，调节压力和循环次数，由高压均质机剪切得到壳聚糖衍生物凝胶颗粒。

上述实施例1-3中壳聚糖衍生物的种类和浓度、水相的种类、离子交联剂的种类和添加量(终浓度)如下表1所示；固化参数、初步分散的方法和参数，以及高压均质的参数如下表2所示。

对上述实施例1-3提供的壳聚糖衍生物凝胶颗粒进行表征，杨氏模量、平均粒径和PDI的测试结果如下表3所示。其中实施例1提供的壳聚糖衍生物凝胶颗粒的扫描电镜照片如图5所示。

抗原提呈细胞活化测试

将实施例3提供的壳聚糖季铵盐凝胶颗粒以1mg/mL的终浓度与抗原提呈细胞(DCs)共同孵育培养24h，空白对照组不加任何药物。经流式检测CD11c+细胞的比例发现，实验组成熟抗原提呈细胞的比例在85％以上。用光学显微镜观察对照组和实验组的抗原提呈细胞形态，结果分别如图6a和图6b所示。结果发现，壳聚糖季铵盐凝胶颗粒刺激后的抗原提呈细胞产生了大量的集落(图6b)，表明抗原提呈细胞在所制备的凝胶颗粒的刺激下可以得到有效地活化。

动物急毒测试

将实施例3提供的壳聚糖季铵盐凝胶颗粒以0、0.1、0.3、1.0和5.0mg/只的剂量，分别对21～28d龄雌雄Balb/c小鼠股部肌肉单次注射给药0.1mL(浓度分别为0、1、3、10和50mg/mL)，连续观察2周。结果表明在临床拟给药剂量(100μg)50倍的情况下，雌雄小鼠的摄食、运动能力、反射、排粪、排尿等都正常，实验结束后没有体重减轻(如图7所示)和死亡，大体解剖无肉眼可见的病变。表明用本发明制备的高分子凝胶颗粒在当前浓度下不具有急性毒性，在动物水平上具有良好的生物安全性。

实施例4-11

实施例4-11提供复合壳聚糖衍生物凝胶颗粒，采用高压均质法制备，具体步骤如下：

将壳聚糖衍生物溶于8mL水相中，在室温、500rpm转速下磁力搅拌3h至完全溶解。在冰浴条件下，将2mL离子交联剂溶液滴加到上述壳聚糖衍生物溶液中，在500rpm转速下磁力搅拌5min，然后在油浴下固化一段时间，形成水凝胶。向上述水凝胶中添加功能物质和水至25mL，初步破碎细化。然后将初步破碎的水凝胶混合液加入高压均质机的储液杯中，调节压力和循环次数，由高压均质机剪切得到复合壳聚糖衍生物凝胶颗粒。

上述实施例4-11中壳聚糖衍生物的种类和浓度、水相的种类、离子交联剂的种类和添加量、功能物质的种类如下表1所示；固化参数、初步分散的方法和参数，以及高压均质的参数如下表2所示。

对上述实施例4-11提供的复合壳聚糖衍生物凝胶颗粒进行表征，杨氏模量、平均粒径和PDI的测试结果如下表3所示。

表1

表2

表3

实施例12-14

实施例12-14提供壳聚糖衍生物凝胶颗粒，采用微孔膜乳化法制备，具体步骤如下：

将壳聚糖衍生物溶于8mL水相中，在室温、500rpm转速下磁力搅拌3h至完全溶解。在冰浴条件下，将2mL离子交联剂溶液滴加到上述壳聚糖衍生物溶液中，在150rpm转速下磁力搅拌10min，然后在油浴下固化一段时间，形成水凝胶。向上述水凝胶中添加水相至25mL，初步破碎细化。然后将初步破碎的水凝胶混合液加入快速膜乳化器的储液瓶中，用氮气在一定压力下压过微孔聚四氟乙烯膜，重复过膜后得到壳聚糖衍生物凝胶颗粒。

上述实施例12-14中壳聚糖衍生物的种类和浓度、水相的种类、离子交联剂的种类和添加量(终浓度)如下表4所示；固化参数、初步分散的方法和参数，以及微孔膜乳化的参数如下表5所示。

对上述实施例12-14提供的壳聚糖衍生物凝胶颗粒进行表征，杨氏模量、平均粒径和PDI的测试结果如下表6所示。其中实施例12提供的壳聚糖衍生物凝胶颗粒的扫描电镜照片如图8所示。

细胞毒性测试

将实施例13提供的壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒以0、0.001、0.01、0.1、1和10mg/mL的终浓度与巨噬细胞共同孵育24h，采用CCK8试剂盒检测细胞活性情况，结果如图9所示。发现当凝胶颗粒浓度高达10mg/mL时，巨噬细胞仍未表现出任何的毒性，表明本发明提供的高分子凝胶颗粒对细胞具有良好的安全性。

实施例15-22

实施例15-22提供复合壳聚糖衍生物凝胶颗粒，采用微孔膜乳化法制备，具体步骤如下：

将壳聚糖衍生物溶于8mL水相中，在室温、500rpm转速下磁力搅拌3h至完全溶解。在冰浴条件下，将2mL离子交联剂溶液滴加到上述壳聚糖衍生物溶液中，在150rpm转速下磁力搅拌10min，然后在油浴下固化一段时间，形成水凝胶。向上述水凝胶中添加功能物质和水相至25mL，初步破碎细化。然后将初步破碎的水凝胶混合液加入快速膜乳化器的储液瓶中，用氮气在一定压力下压过微孔聚四氟乙烯膜，重复过膜后得到壳聚糖衍生物凝胶颗粒。

上述实施例15-22中壳聚糖衍生物的种类和浓度、水相的种类、离子交联剂的种类和添加量、功能物质的种类如下表4所示；固化参数、初步分散的方法和参数，以及微孔膜乳化的参数如下表5所示。

对上述实施例15-22提供的复合壳聚糖衍生物凝胶颗粒进行表征，杨氏模量、平均粒径和PDI的测试结果如下表6所示。

表4

表5

表6

实施例	杨氏模量(Pa)	平均粒径	PDI
				12	420.0	430nm	0.441
13	374.4	1.57μm	0.441
				14	571.2	6.21μm	0.396
15	87.6	1.12μm	0.196
				16	170.4	4.25μm	0.293
17	274.8	11.9μm	0.272
				18	304.8	80.7μm	0.326
19	564.0	151nm	0.279
				20	680.4	720nm	0.311
21	2310.0	1.67μm	0.391
				22	369.6	2.75μm	0.329

实施例23

本实施例提供一种海藻酸钠凝胶颗粒，采用微孔膜乳化法制备，具体步骤如下：

取0.2g海藻酸钠粉末加入10ml，pH＝7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)中，过夜搅拌制得海藻酸钠溶液。称取0.0028g CaCO₃与0.0070g葡萄糖内脂，加入到0.5mL上述海藻酸钠溶液中，再加入0.5mL，pH＝7.4的PBS，混匀后放入37℃恒温箱中交联1h形成水凝胶(杨氏模量为810Pa)。向上述水凝胶中加水至25mL，在100w功率下超声60s，然后将初步破碎的水凝胶混合液加入快速膜乳化器的储液瓶中，在1500kPa的氮气压力下压过膜孔径为2.8μm的微孔聚四氟乙烯膜，得到上述海藻酸钠凝胶颗粒。

本实施例提供的海藻酸钠凝胶颗粒分散良好，平均粒径为850nm，PDI为0.325。

实施例24

本实施例提供一种复合海藻酸钠凝胶颗粒，包括海藻酸钠凝胶颗粒和包埋在该海藻酸钠凝胶颗粒内的胶原。

上述复合海藻酸钠凝胶颗粒的制备方法如下：

取0.5g海藻酸钠粉末溶于100mL，pH＝7.4的PBS中，过夜搅拌，配制成0.5％(w/v)的海藻酸钠溶液。取300μL上述海藻酸钠溶液与300μL，0.5％(w/v)的胶原蛋白溶液(0.5g胶原蛋白溶于100mL，pH＝7.4的PBS中)，用移液器上下吹打30-60下，使其混合均匀。然后将上述海藻酸钠与胶原的混合液转移至含1M氯化钙的1％的琼脂糖凝胶的孔洞(直径23mm)中，放于37℃恒温箱中交联2h，得到海藻酸钠水凝胶(杨氏模量为3500Pa)。向上述水凝胶中加水至25mL，漩涡振荡10min，然后将初步破碎的水凝胶混合液加入高压均质机的储液杯中，调节压力至3000psi，经过4个循环，得到上述复合海藻酸钠凝胶颗粒。

本实施例提供的复合海藻酸钠凝胶颗粒分散良好，平均粒径为4.62μm，PDI为0.425。

实施例25

本实施例提供一种复合壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒，包括实施例1提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒，和吸附在该壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒上的H5N1禽流感裂解疫苗。

上述复合壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒的制备方法如下：

取1mL实施例1提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒溶液(6.4mg/mL)，加入1mL，30μg/mL的H5N1禽流感裂解疫苗溶液，在4℃，120rpm转速下振荡24h，得到上述复合壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒。

实施例26

本实施例提供一种复合壳聚糖季铵盐凝胶颗粒，包括实施例3提供的壳聚糖季铵盐凝胶颗粒，和吸附在该壳聚糖季铵盐凝胶颗粒上的艾赛那肽。

上述复合壳聚糖季铵盐凝胶颗粒其制备方法如下：

称取16mg艾赛那肽冻干粉，加入1ml实施例12提供的壳聚糖季铵盐凝胶颗粒溶液中，在4℃、200rpm转速下振荡12h，然后在10000rpm转速下离心分离，用去离子水洗涤固体颗粒三次，得到上述复合壳聚糖季铵盐凝胶颗粒。艾赛那肽的吸附率为30％，颗粒上的艾赛那肽负载量为300μg/mg颗粒。

其中，吸附率＝(药物总量-离心后上清液中药物含量)/药物总量×100％；

负载量＝实测复合凝胶颗粒上药物含量/复合凝胶颗粒总质量。

实施例27

本实施例提供一种复合壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒，包括实施例13提供的壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒，和吸附在该壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒上的Cy5染料。

上述复合壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒的制备方法如下：

取1mL实施例13提供的壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒溶液(8mg/mL)，加入1mL含有Cy5(浓度10μg/mL)的pH＝7.4的PBS，室温200rpm下振荡2h，得到上述复合壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒。

将上述复合壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒与巨噬细胞共孵育，在共聚焦显微镜下使用633nm激光激发，在700nm波长左右收取到了摄取了上述复合壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒的细胞信号(显示为红色)。

实施例28

本实施例提供一种复合壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒，包括实施例14提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒，和固定在该壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒上的脂肪酶。

上述复合壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒的制备方法如下：

取实施例14提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒溶液20mL，使用碳二亚胺盐酸盐活化羟基，然后加入脂肪酶溶液20mL，室温下搅拌2h，得到上述复合壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒。

采用国家标准方法对上述复合壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒的脂肪酶活力进行测试。当酶量为20mg时，重复测试5次后，复合凝胶颗粒仍能保持60％的酶活力。

实施例29

本实施例提供一种复合海藻酸钠凝胶颗粒，包括实施例23提供的海藻酸钠凝胶颗粒和包埋在该海藻酸钠凝胶颗粒内的磁流体。

上述复合海藻酸钠凝胶颗粒的制备方法与实施例23中海藻酸纳凝胶颗粒制备方法的区别仅在于，在交联固化前，向海藻酸钠溶液中加入磁流体(终浓度2mg/mL)，其他原料及操作条件均与实施例23相同。

本实施例提供的复合海藻酸钠凝胶颗粒为椭球状，表面光滑，平均粒径为925nm，PDI为0.425。

向10mL含10mg/L As³⁺的溶液中加入上述复合海藻酸钠凝胶颗粒(终浓度为50mg/mL)，在200rpm转速下震荡吸附1h后，用磁铁分离颗粒，取样检测吸附前后溶液中的As³⁺浓度。结果表明本实施例提供的复合海藻酸钠凝胶颗粒对污水中As³⁺的清除率可达到90％。

对比例1

与实施例1的区别在于离子交联剂α,β-甘油磷酸钠的终浓度为2mg/mL，其他原料用量和制备步骤与实施例1相同。

结果表明本对比例中壳聚糖盐酸盐无法形成水凝胶，从而无法获得壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒。

对比例2

与实施例23的区别在于交联剂CaCO₃的用量为0.0018g，其他原料用量和制备步骤与实施例23相同。

本对比例得到的海藻酸钠水凝胶杨氏模量为3Pa，海藻酸钠凝胶颗粒的平均粒径为1.35μm，PDI为0.78。由于交联剂的使用剂量较低，因此得到的海藻酸钠水凝胶网络疏松，流动性大，硬度较低。虽然最终形成了凝胶颗粒，但是该颗粒容易发生黏连聚并，与实施例23相比，其粒径变大，均一性也变差。

对比例3

与实施例24的区别在于海藻酸钠溶液的浓度为5％(w/v)，其他原料用量和制备步骤与实施例24相同。

本对比例制得的海藻酸钠水凝胶杨氏模量为9000Pa，海藻酸钠凝胶颗粒的平均粒径2.95μm，PDI为1。由于海藻酸钠的浓度过高，因此得到的凝胶网络过于紧实致密，硬度较高。虽然最终获得了凝胶颗粒，但是该凝胶颗粒的成球性和均一性很差。

对比例4

与实施例3的区别在于高压均质压力为50000psi，其他原料用量和制备步骤与实施例3相同。

本对比例制得的壳聚糖季铵盐凝胶颗粒为椭球状，平均粒径为419nm，PDI为0.810。表明流体剪切程度对凝胶颗粒的性质有影响。当均质压力过高时，虽然水凝胶可以被剪切成较细小颗粒，但是形成的颗粒粒径不均一，容易发生聚并现象，从而导致颗粒的分散性变差。

对比例5

本对比例提供一种壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒，制备方法如下：

按照实施例1的方法配制壳聚糖盐酸盐和离子交联剂的混合溶液，作为内水相，以7％的十三烷基醚聚氧代乙烯去离子水溶液作为外水相，在500rpm磁力搅拌下将内水相加入外水相中(内水相与外水相体积比1:10)，搅拌5min后在60℃油浴下固化3h，离心分离，用去离子水洗涤颗粒3-5次，得到壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒。

本对比例提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒接近圆球型，平均粒径5.3μm，PDI为1。图10为本对比例提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒的光学显微照片。

由图10可以看出，本对比例提供的壳聚糖盐酸盐凝胶颗粒因表面仍残留有表面活性剂十三烷基醚聚氧代乙烯，使得颗粒容易粘连，在水中无法分散，难以收集。说明本发明不使用表面活性剂的方法在颗粒制备和收集方面，不仅操作简易，制得的颗粒性能更优。

对比例6

本对比例提供一种壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒，采用油包水法制备，具体步骤如下：

按实施例13的方法配制壳聚糖谷氨酸盐和离子交联剂的混合溶液，作为水相。取60mL石油醚和液体石蜡(石油醚与液体石蜡的体积比为2:1)的混合液，加入乳化剂司盘83(终浓度5wt％)，搅拌均匀，作为油相。将配制好的油相倒入高压均质机中，再将上述水相缓慢加入至油相中，3500psi的压力下均质乳化，3个循环后，收集乳液，在70℃下固化1h。然后使用石油醚洗涤3次，再用10mL，20wt％的异丙醇将石油醚置换。在37℃水浴条件下抽真空，去除异丙醇，然后将剩余的凝胶颗粒溶液用去离子水洗涤3次后重悬于去离子水中，得到壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒的水溶液。

将上述壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒以0、0.001、0.01、0.1、1和10mg/mL的终浓度与巨噬细胞共同孵育24h，采用CCK8试剂盒检测细胞活性情况，结果如图9所示。发现当凝胶颗粒的浓度为10mg/mL时，细胞活性下降了70％。进一步通过气相检测发现，本对比例提供的壳聚糖谷氨酸盐凝胶颗粒表面仍残留有液体石蜡(残留量为0.4％)、异丙醇(残留量为0.6％)等有机溶剂。由此说明，本发明中不使用任何油相的方法可有效提升高分子凝胶颗粒的生物相容性。

综合本发明实施例1-29和对比例1-4的结果可以看出，本发明通过使用合适的原料用量和交联条件控制胶凝程度(硬度)，再结合合适的初步破碎及流体剪切过程，制得粒径可控且较为均一、分散性良好的高分子凝胶颗粒。基于上述高分子凝胶颗粒可以负载活性物质或者作为功能载体，从而满足生物、化工等不同领域的需求。特别地，结合实施例13以及对比例5-6的结果可以看出，使用本发明提供的方法制备高分子凝胶纳微米颗粒，不使用任何表面活性剂和油相，对环境绿色友好无污染，不仅工艺简单，省略了繁琐的洗涤步骤，易于放大生产，而且所制备的凝胶颗粒由于不含有毒有害物质，可以最大程度维持细胞生物活性，尤其满足医药领域对纳微米载体安全性的需求。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种高分子凝胶颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(2)向步骤(1)得到的水凝胶中添加第二水相，将所述水凝胶经过或不经过初步破碎细化，然后通过流体剪切形成所述高分子凝胶颗粒；

所述高分子凝胶颗粒的杨氏模量为5-5000Pa，平均粒径为100nm-100μm，多分散指数<0.5，且所述高分子凝胶颗粒不含有有机溶剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高分子凝胶颗粒所用高分子为亲水性高分子。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述高分子选自高分子多糖、高分子多糖衍生物、高分子多肽、高分子多肽衍生物、高分子醇或丙烯酸类高分子中的一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高分子多糖选自壳聚糖、淀粉、纤维素、琼脂、海藻酸钠或葡聚糖中的一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高分子多肽选自明胶、胶原、聚赖氨酸或聚L-谷胺酸中的一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高分子醇为聚乙二醇和/或聚乙烯醇。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸类高分子为聚甲基丙烯酸甲酯和/或聚丙烯腈。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述高分子为壳聚糖和/或壳聚糖衍生物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述高分子为羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖谷氨酸盐或壳聚糖乳酸盐中的一种或至少两种的组合。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖及其衍生物的分子量为50-900kDa。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖及其衍生物的分子量为100-600kDa。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述初步破碎的方法选自机械搅拌、磁力搅拌、均质乳化或超声破碎中的一种或至少两种的组合。

13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述流体剪切的方法为微孔膜乳化法和/或高压均质法。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述微孔膜乳化法所用的微孔膜孔径为0.1-200μm。

15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述高压均质法的压力为500-30000psi。

16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述高分子在水相中的浓度为1mg/mL-1g/mL。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述高分子在水相中的浓度为5-500mg/mL。

18.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一水相和第二水相各自独立地为可代谢水。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述可代谢水为纯化水、酸溶液、缓冲盐水溶液、碱溶液或生理盐水。

20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述酸溶液的pH为5.0-7.0。

21.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述酸溶液选自醋酸、盐酸、柠檬酸、乳酸或抗坏血酸的水溶液中的一种或至少两种的组合。

22.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲盐水溶液的pH为5.0-9.0。

23.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲盐水溶液的pH为6.0-8.0。

24.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲盐水溶液选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或Tris-盐酸缓冲液中的一种或至少两种的组合。

25.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述碱溶液的pH为8.0-10.0。

26.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。

27.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联的方法为化学交联、物理交联或离子交联。

28.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述交联的方法为离子交联。

29.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述化学交联中所用的交联剂选自甲醛、戊二醛、京尼平、环氧氯丙烷、二乙烯基苯、异氰酸酯、二缩水甘油基乙醚或乙酸酐中的一种或至少两种的组合。

30.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述离子交联的固化温度为30-80℃。

31.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述离子交联中所用的离子交联剂选自氯化钙、碳酸钙、硫酸钙、乳酸钙、磷酸钙、三聚磷酸钠、柠檬酸钠或甘油磷酸盐中的一种或至少两种的组合。

32.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述离子交联剂为β-甘油磷酸钠和/或α,β-甘油磷酸钠。

33.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述离子交联剂的添加量为10-250mg/mL。