CN108201636B - 一种孔径可控的天然高分子基3d多孔复合支架的制备方法 - Google Patents

一种孔径可控的天然高分子基3d多孔复合支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法。该方法首先制备氨基化明胶，结合两次去溶剂法制得氨基化明胶纳米颗粒，并以该颗粒作为Pickering高内相乳液的稳定剂，将氨基化明胶、双醛淀粉溶于去离子水中构成乳液的连续相，有机溶剂为分散相，经均质乳化处理形成水包油型的Pickering高内相乳液，再通过分子间的共价交联反应，使得乳液连续相得以固定，最后通过溶剂挥发去除分散相而获得一种孔径可控的3D多孔复合支架。本发明采用Pickering乳液模板法，以氨基化明胶纳米颗粒为稳定剂，以天然高分子为基材，解决了目前多孔支架孔径不可控、材料难降解以及降解产物毒害组织细胞的问题。本发明制备的多孔支架在组织工程领域具有良好的应用前景。

Description

一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程复合材料领域，具体是一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法。
背景技术
再生医学和组织工程学的提出与发展，在临床上为人体受损组织的修复和治疗带来新的希望。受损组织细胞本身由于不具备在三维空间独立生长的能力，难以形成特定的组织。因此，需借助组织工程支架在人体受损部位作为一种临时的支撑框架体系，来维持细胞的粘附、迁移与分化。在实际临床应用中，理想的细胞支架材料应具有良好的生物相容性，对生物体没有毒性，不会引起炎症或致畸反应。材料还应具备适当的生物降解性，使得材料能够随着细胞的生长逐渐降解、消失，同时降解产生的小分子也应是对生物体无毒无害的。为了能给细胞提供获取营养、气体交换、废物排出的环境，同时也要让细胞增殖分化为某种特定的组织，支架材料应该具有一定的孔隙率和力学强度，并且利于加工成型。
支架材料的孔隙大小会影响组织或器官的生成：过大的孔不利于细胞的粘附，过小的孔不利于细胞的迁移和繁殖，而且不同细胞生长所需的最适孔径大小也不同，例如支架孔径在20 µm左右有利于成纤维细胞的生长，20~150 µm利于皮肤组织细胞的生长，而100~250 µm的孔径利于骨和软骨细胞的生长，其中骨细胞正常生长的孔径范围为100~135 µm，因此应对支架材料的孔径进行严格控制。然而，目前制备多孔材料的方法，如溶剂浇铸法、发泡法、相分离法、致孔剂法等，虽然可以制备出高度多孔的支架材料，但材料孔径难以控制、相邻孔间连通性差以及材料在组织内降解缓慢，限制了材料在组织工程学领域的应用。
近来，以高内相乳液（high internal phase emulsions, HIPE）为模板来制备具有优良性能的多孔支架材料成为一种独特的制备技术。高内相乳液是一类内相体积分数高于74%的乳液，通过以内相为模板，引发外相聚合固化，通过简单的溶剂蒸发去除模板，即可制备出具有相互连通的孔道结构、孔隙率高以及密度低的大孔支架材料。传统的高内相乳液的稳定剂多为小分子的表面活性剂，在制备乳液时不仅用量大、毒副作用高，而且不可重复利用以及稳定性差，非常不利于在生物医学材料领域的应用。因此，近年以两亲性的固体纳米粒子和微米粒子取代表面活性剂来稳定乳液引起关注，这类以固体粒子稳定的高内相乳液称为Pickering乳液。与传统稳定高内相乳液的表面活性剂相比，固体粒子作为乳液稳定剂不仅用量少、可避免表面活性剂的细胞毒性，且具有不可逆的界面粒子自组装性能、稳定性高以及优异的力学性能等优点。因此，使用无毒安全的固体粒子作为稳定剂来稳定乳液，不仅可赋予支架材料良好的生物相容性和极低的细胞毒性等特性，也可增强多孔支架的机械性能，非常适用于生物医学材料领域。
目前，用于医药级Pickering乳液的稳定剂多是以天然高分子为基材，通过疏水改性而获得的固体颗粒，主要有：多糖类固体粒子、蛋白质类固体粒子、脂肪类固体粒子以及复合固体粒子。其中多糖类固体粒子主要包括：纤维素纳米晶体、甲壳素纳米晶体、淀粉纳米晶体以及壳聚糖纳米晶体等；蛋白质类固体粒子主要包括牛血清蛋白纳米粒子和明胶纳米粒子等。在制备多孔材料方面，上述提到的几类粒子一般仅仅作为Pickering乳液的稳定剂，而未参与到连续相的固定反应中，在材料处理后期可能被水洗而除去，既造成原料的浪费，又不能对材料的机械性能起到辅助作用，使得该类固体颗粒的应用价值受限。
此外，利用医药级固体颗粒稳定的Pickering高内相乳液，通常是水包油（O/W）型的高内相乳液，通过在乳液水相中添加亲水性单体，借助自由基聚合反应来制备亲水性的多孔材料。已报道的用于高内相乳液中的亲水性单体多为丙烯酰胺类单体，以这类单体制备的多孔支架材料，虽然生物相容性好，且具有优异的力学性能，但聚丙烯酰胺本身难降解，基于聚丙烯酰胺的多孔支架材料在引入人体后需通过二次手术来去除，会造成人体的二次损伤，此外，聚丙烯酰胺部分降解后的产物丙烯酰胺具有毒性，会伤害人和动物的周围神经系统（谭欢, 魏涛, 林炜,等. 一种以Pickering高内相乳液为模板制备的3D多孔支架材料:, CN 105968402 A[P]. 2016；Liu S, Jin M, Chen Y, et al. High internalphase emulsions stabilised by supramolecular cellulose nanocrystals and theapplication for cell-adhesive macroporous hydrogel monoliths[J]. Journal ofMaterials Chemistry B, 2017, 5(14).）。因此，选用生物相容性好、易降解且降解后产物对人体无毒无害的绿色基材成为关键。
明胶是一种由动物结缔组织（骨、皮肤、肌腱等）中的胶原蛋白部分水解的产物，具有良好的生物相容性和可生物降解性以及优良的物理性质（如胶冻力、亲水性、高分散性、低粘度特性、持水性等）和化学性质（两性聚电解质特性、侧链基团反应活性高等），在生物医学领域有较大的应用潜力。但明胶不溶于冷水，温度至35 °C以下时形成热可逆性凝胶，且明胶可反应的活性基团氨基含量有限。氨基化明胶是明胶的改性产物，是在EDC活化羧基的条件下，利用乙二胺取代明胶自身的羧基来制备的，改性后的明胶侧链基团氨基的数量显著增多且在常温下的溶解性能得到明显改善。淀粉是自然界中广泛存在的一种可再生的多糖类物质。淀粉在常温下不溶于水，且自身可反应的活性基团较少。双醛淀粉（DAS）是淀粉的衍生物，具有碱溶性、易交联接枝、容易糊化和不易发霉等特点，广泛用于食品、医药等领域。
本发明采用明胶为基材，通过对明胶进行氨基化改性，获得一种具有优良特性的氨基化明胶，进一步地通过两步去溶剂法制备出一种具有较好单分散性、表面光滑以及具有一定刚性结构的氨基化明胶纳米颗粒，并以其作为唯一的稳定剂来构建Pickering高内相乳液模板，通过在连续相中分别添加氨基化明胶和双醛淀粉，利用双醛淀粉上的醛基与氨基化明胶以及氨基化明胶纳米颗粒的氨基共价交联反应，制备氨基化明胶/双醛淀粉3D多孔复合支架材料，其中氨基化明胶纳米颗粒既充当高内相乳液的稳定剂来稳定乳液，又充当部分基材通过共价交联反应被包埋在多孔材料的内部来提高3D多孔支架材料的机械性能。通过改变乳液中氨基化明胶纳米颗粒的含量，可有效控制多孔支架材料的孔径大小；通过调控氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶以及双醛淀粉的含量，可有效改善复合支架的力学性能，进而实现其在组织工程学领域的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法。此方法是以氨基化明胶纳米颗粒稳定的Pickering乳液为模板，以氨基化明胶和双醛淀粉为基材，通过共价交联反应实现的。通过改变氨基化明胶纳米颗粒的用量来调控多孔材料的孔径大小；通过调控氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶以及双醛淀粉的配比来控制多孔材料的力学性能。为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
（1）氨基化明胶的制备：称取一定量B型明胶加入到0.1 M的磷酸缓冲液中（pH5.0），配制成2~5 wt%的B型明胶溶液；按改性剂乙二胺、羧基活化剂碳化二亚胺盐酸盐（EDC）与B型明胶的质量比为（2.4~4.0）:（0.25~0.75）:1，将乙二胺和EDC分别先后加入到B型明胶溶液中，盐酸调节pH至5.0，37℃搅拌反应1~3 h，透析2~4 d，经低温预冷冻-冷冻干燥得到氨基化明胶；
（2）氨基化明胶纳米颗粒的制备：配制2.5~5 wt%氨基化明胶水溶液；第一次加入去溶剂化试剂丙酮，取上层白色悬浮液复溶于蒸馏水中，并用盐酸调节溶液酸碱度为酸性，随后将上述溶液于37℃恒温搅拌，同时第二次滴加去溶剂化试剂丙酮。滴加结束后，加入交联剂戊二醛，戊二醛用量为氨基化明胶固体质量的6~12 wt%，于37℃下搅拌反应3~14 h。在12500 g离心力条件下离心30 min，得到氨基化明胶纳米颗粒粗产品，并将该粗产品复溶于30 vol%丙酮溶液中继续离心纯化2~4次，最后将氨基化明胶纳米颗粒溶于蒸馏水中，用旋转蒸发仪于37℃缓慢去除残余丙酮，得到改性明胶纳米颗粒；
（3）双醛淀粉的制备：配制5~10 wt%的可溶性玉米淀粉水溶液，在温度60~90 ℃条件下搅拌糊化30~60 min；按高碘酸钠与玉米淀粉的质量比为（1~2）:1，将高碘酸钠溶于上述玉米淀粉溶液中，并用硫酸调其pH为 2~4，30℃条件下反应4~6 h，然后用蒸馏水和丙酮交替抽提、过滤，最后干燥、粉碎得白色固体粉末即为双醛淀粉；
（4）3D多孔复合支架材料的制备：将氨基化明胶和经糊化处理的双醛淀粉加入到蒸馏水中，超声震荡，使其充分溶解，然后加入稳定剂氨基化明胶纳米颗粒，混合均匀，其中氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶、双醛淀粉、水的质量比为（0.0025~0.03）:（0.01~0.1）:（0.01~0.05）:1；接着在8000~15000 rpm的搅拌条件下将水相与油相按体积比为1:（4~9）混合，高速乳化0.5~5 min，得到O/W型的Pickering乳液；然后将上述乳液于室温下反应3~5d，37℃缓慢挥发1~2 d去除油相，最后经低温预冷冻后冷冻干燥，即得3D多孔复合支架材料。
在本发明中，所述步骤（2）中第一次加入去溶剂化试剂丙酮的体积与配制氨基化明胶溶液所需蒸馏水体积相同；白色悬浮液复溶于蒸馏水中所需蒸馏水的体积与第一次加入去溶剂化试剂丙酮的体积相同；第二次加入去溶剂化试剂丙酮的体积为第一次去溶剂化试剂丙酮的3~6倍。
在本发明中，所述步骤（2）中氨基化明胶纳米颗粒是通过两步去溶剂法制得；盐酸调节溶液的酸碱度为酸性，其对应的pH值为2.5~6.5。
在本发明中，所述步骤（4）中的双醛淀粉的处理条件为：糊化时间30~120 min，糊化温度60~90℃。
在本发明中，所述步骤（4）中油相为正己烷、甲苯、对二甲苯和苯乙烯中的任一种。
在本发明中，所述步骤（4）中的3D多孔复合支架具有连通的孔道结构，孔径尺寸分布为20~200 µm，并具有良好的亲水性、生物相容性以及可生物降解性能。
上述制备方法中，不引入小分子的表面活性剂及引发剂，且在连续相中加入无细胞毒性的氨基化明胶和双醛淀粉，通过双醛淀粉中的醛基与氨基化明胶以及氨基化明胶纳米颗粒上的氨基共价交联反应（希夫碱反应），获得一种无潜在细胞毒性、亲水性好、孔隙率高以及可生物降解的3D多孔复合支架，为其在组织工程领域的应用奠定了基础。
采用本发明制备的材料具备以下优点：
（1）本发明采用B型明胶的改性产物氨基化明胶为原料，通过二次去溶剂法制备得到Pickering高内相乳液的稳定剂氨基化明胶纳米颗粒，与已有明胶纳米颗粒相比，它不仅保留了其良好的亲水性和低免疫原性等优良物理特性，而且它具备更好的高浓度储存稳定性和单分散性，且氨基化明胶纳米颗粒的疏水性明显增强，三相接触角增大，以这种颗粒制备的Pickering高内相乳液稳定性更高；与已有明胶纳米颗粒相比，氨基化明胶纳米颗粒的成乳浓度范围扩大，在乳液制备上这不仅节约了原料，而且在一定程度上扩大其功能化应用；与已有明胶纳米颗粒相比，氨基化明胶纳米颗粒的刚性结构显著增强，颗粒表面更为光滑，未观察到明显的裂缝或褶皱且不再呈现出明显的柔软性和铺展性，进一步提高乳液的稳定性；
（2）本发明采用具有一定刚性结构的氨基化明胶纳米颗粒稳定的Pickering高内相乳液为模板来制备3D多孔复合支架材料，这里的氨基化明胶纳米颗粒既作为乳液的稳定剂来稳定乳液，又充当基材参与共价交联反应包埋在材料内部，增强多孔材料的机械性能；
（3）本发明采用较为廉价的B型明胶为原料来制备氨基化明胶，氨基化明胶与明胶相比，室温下水溶性明显增强，且可反应的目标官能团数量增大，这不仅节约成本，而且利于明胶在室温条件下的应用；
（4）本发明首次把氨基化明胶和双醛淀粉应用到Pickering高内相乳液体系中，并通过分子间的共价交联反应获得一种多孔支架，扩大了明胶和淀粉的功能化应用；
（5）本发明采用纯天然生物高分子来制备3D多孔支架材料，有效降低了材料的毒性风险，且材料易降解，降解产物无毒无害，利于在组织工程领域的应用；
（6）本发明制备的3D多孔复合支架材料，其孔道尺寸、结构以及机械性能可通过调节稳定剂氨基化明胶纳米颗粒的含量和氨基化明胶、双醛淀粉的含量灵活变化，便于满足各种应用的需求；
（7）本发明使用的原料来源广泛且价格低廉，制备工艺简单易行，生产周期短，具有较大的应用推广价值。
附图说明
图1是氨基化明胶纳米颗粒的扫描电镜(SEM)图，其中，图1A是颗粒SEM的照片，图1B为图1A圆圈中的放大图。
图2是分别是明胶纳米颗粒(A)和氨基化明胶纳米颗粒(B)的粒径分布图；
图3是在正己烷介质中，水滴分别在明胶纳米颗粒膜(A)和氨基化明胶纳米颗粒膜(B)表面的三相接触角测量图；
图4是利用氨基化明胶纳米颗粒稳定的Pickering高内相乳液为模板制备的3D多孔复合支架材料的扫描电镜(SEM)形貌图，其中图4A是多孔材料SEM照片；图4B是图4A圆圈中的放大图.
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步说明：
实施例1
（1）氨基化明胶的制备：取2 g B型明胶充分溶于50 ml，pH5.0，0.1 M的磷酸缓冲溶液中，接着分别加入6.4 g乙二胺和1.222 g EDC，盐酸调pH至5.0并用磷酸缓冲溶液定容至100 ml，37℃搅拌反应1 h，然后灌入透析袋透析3 d，每天换水2~3次,最后低温冰箱预冻后冷冻干燥得白色产物；
（2）氨基化明胶纳米颗粒的制备：取1.25 g改性明胶溶于25 ml蒸馏水中，然后加入25 ml去溶剂化试剂丙酮，取上层白色悬浊液复溶于25 ml蒸馏水中并调pH值为3，滴加丙酮至白色沉淀产生，随后加入150 µl戊二醛交联反应3 h。最后使用离心机将反应后的混合液于12500 g离心30 min，将离心下层固体复溶于水中并缓慢蒸发掉残余丙酮；
（3）双醛淀粉的制备：取5 g可溶性玉米淀粉加入烧瓶中，接着加入50 ml蒸馏水，80℃条件下搅拌糊化30 min，然后加入7.27 g高碘酸钠固体，并用硫酸调pH值为2, 30 °C条件下反应4 h，最后用蒸馏水和丙酮交替抽提、过滤，干燥、粉碎得白色固体粉末；
（4）3D多孔复合支架材料的制备：按氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶、双醛淀粉、水的配比为5 mg：40 mg：40 mg：2 ml，将氨基化明胶和双醛淀粉加入到蒸馏水中，超声震荡，使其充分溶解，然后加入氨基化明胶纳米颗粒混合均匀即得乳液的水相；将8 ml的油相加入到水相中，在10000 rpm下高速剪切乳化1 min，得到O/W型的Pickering乳液；将制备的上述乳液于室温下反应3 d，然后37℃，缓慢挥发1~2 d去除油相，低温冰箱预冻-冷冻干燥，即得3D多孔支架材料。
实施例2
（1）氨基化明胶的制备：取5 g B型明胶充分溶于125 ml，pH5.0，0.1 M的磷酸缓冲溶液中，接着分别加入16 g乙二胺和3.055 g EDC，盐酸调pH至5.0并用磷酸缓冲溶液定容至250 ml，37℃搅拌反应1 h，然后灌入透析袋透析3 d，每天换水2~3次,最后低温冰箱预冻后冷冻干燥得白色产物；
（2）氨基化明胶纳米颗粒的制备：取2.5 g氨基化明胶溶于50 ml蒸馏水中，然后加入50 ml去溶剂化试剂丙酮，取上层白色悬浊液复溶于50 ml蒸馏水中并调pH值为3，滴加丙酮至白色沉淀产生，随后加入300 µl戊二醛交联反应3 h。最后使用离心机将反应后的混合液于12500 g离心30 min，将离心下层固体复溶于水中并缓慢蒸发掉残余丙酮；
（3）双醛淀粉的制备：取10 g可溶性玉米淀粉加入烧瓶中，接着加入100 ml蒸馏水，80℃条件下搅拌糊化30 min，然后加入14.54 g高碘酸钠固体，并用硫酸调pH值为2, 30℃条件下反应4 h，最后用蒸馏水和丙酮交替抽提、过滤，干燥、粉碎得白色固体粉末；
（4） 3D多孔复合支架材料的制备：按氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶、改性淀粉、水的配比为25 mg：40 mg：40 mg：2 ml，将氨基化明胶和双醛淀粉加入到蒸馏水中，超声震荡，使其充分溶解，然后加入氨基化明胶纳米颗粒混合均匀即得乳液的水相；将8 ml的油相加入到水相中，在10000 rpm下高速剪切乳化1 min，得到O/W型的Pickering乳液；将制备的上述乳液于室温下反应3 d，然后37℃缓慢挥发1~2 d去除油相，低温冰箱预冻-冷冻干燥，即得3D多孔支架材料。
实施例3
（1）氨基化明胶的制备：取10 g B型明胶充分溶于250 ml，pH5.0，0.1 M的磷酸缓冲溶液中，接着分别加入32 g乙二胺和6.11 g EDC，盐酸调pH至5.0并用磷酸缓冲溶液定容至500 ml，37℃搅拌反应1 h，然后灌入透析袋透析3 d，每天换水2~3次,最后低温冰箱预冻后冷冻干燥得白色产物；
（2）氨基化明胶纳米颗粒的制备：取2.5 g氨基化明胶溶于50 ml蒸馏水中，然后加入50 ml去溶剂化试剂丙酮，取上层白色悬浊液复溶于50 ml蒸馏水中并调pH值为3，滴加丙酮至白色沉淀产生，随后加入300 µl戊二醛交联反应3 h。最后使用离心机将反应后的混合液于12500 g离心30 min，将离心下层固体复溶于水中并缓慢蒸发掉残余丙酮；
（3）双醛淀粉的制备：取10 g可溶性玉米淀粉加入烧瓶中，接着加入100 ml蒸馏水，80℃条件下搅拌糊化30 min，然后加入14.54 g高碘酸钠固体，并用硫酸调pH值为2, 30°C条件下反应4 h，最后用蒸馏水和丙酮交替抽提、过滤，干燥、粉碎得白色固体粉末；
（4）3D多孔复合支架材料的制备：按氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶、双醛淀粉、水的配比为50 mg：40 mg：80 mg：2 ml，将氨基化明胶和双醛淀粉加入到蒸馏水中，超声震荡，使其充分溶解，然后加入氨基化明胶纳米颗粒混合均匀即得乳液的水相；将8 ml的油相加入到水相中，在10000 rpm下高速剪切乳化1 min，得到O/W型的Pickering乳液；将制备的上述乳液于室温下反应3 d，然后37℃缓慢挥发1~2 d去除油相，低温冰箱预冻-冷冻干燥，即得3D多孔支架材料。
实施例4
（1）氨基化明胶的制备：取2 g B型明胶充分溶于50 ml，pH5.0，0.1 M的磷酸缓冲溶液中，接着分别加入6.4 g乙二胺和1.222 g EDC，盐酸调pH至5.0并用磷酸缓冲溶液定容至100 ml，37℃搅拌反应1 h，然后灌入透析袋透析3 d，每天换水2~3次,最后低温冰箱预冻后冷冻干燥得白色产物；
（2）氨基化明胶纳米颗粒的制备：取1.25 g改性明胶溶于25 ml蒸馏水中，然后加入25 ml去溶剂化试剂丙酮，取上层白色悬浊液复溶于25 ml蒸馏水中并调pH值为3，滴加丙酮至白色沉淀产生，随后加入150 µl戊二醛交联反应3 h。最后使用离心机将反应后的混合液于12500 g离心30 min，将离心下层固体复溶于水中并缓慢蒸发掉残余丙酮；
（3）双醛淀粉的制备：取5 g可溶性玉米淀粉加入烧瓶中，接着加入50 ml蒸馏水，80℃条件下搅拌糊化30 min，然后加入7.27 g高碘酸钠固体，并用硫酸调pH值为2, 30 °C条件下反应4 h，最后用蒸馏水和丙酮交替抽提、过滤，干燥、粉碎得白色固体粉末；
（4） 3D多孔复合支架材料的制备：按氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶、双醛淀粉、水的配比为50 mg：40 mg：40 mg：2 ml，将氨基化明胶和双醛淀粉加入到蒸馏水中，超声震荡，使其充分溶解，然后加入氨基化明胶纳米颗粒混合均匀即得乳液的水相；将18 ml的油相加入到水相中，在10000 rpm下高速剪切乳化3 min，得到O/W型的Pickering乳液；将制备的上述乳液于室温下反应3 d，然后37℃缓慢挥发1~2 d去除油相，低温冰箱预冻-冷冻干燥，即得3D多孔支架材料。
实施例5
（1）氨基化明胶的制备：取2 g B型明胶充分溶于50 ml，pH5.0，0.1 M的磷酸缓冲溶液中，接着分别加入6.4 g乙二胺和1.222 g EDC，盐酸调pH至5.0并用磷酸缓冲溶液定容至100 ml，37℃搅拌反应1 h，然后灌入透析袋透析3 d，每天换水2~3次,最后低温冰箱预冻后冷冻干燥得白色产物；
（2）氨基化明胶纳米颗粒的制备：取1.25 g改性明胶溶于25 ml蒸馏水中，然后加入25 ml去溶剂化试剂丙酮，取上层白色悬浊液复溶于25 ml蒸馏水中并调pH值为3，滴加丙酮至白色沉淀产生，随后加入150 µl戊二醛交联反应3 h。最后使用离心机将反应后的混合液于12500 g离心30 min，将离心下层固体复溶于水中并缓慢蒸发掉残余丙酮；
（3）双醛淀粉的制备：取5 g可溶性玉米淀粉加入烧瓶中，接着加入50 ml蒸馏水，80 °C条件下搅拌糊化30 min，然后加入7.27 g高碘酸钠固体，并用硫酸调pH值为2, 30℃条件下反应4 h，最后用蒸馏水和丙酮交替抽提、过滤，干燥、粉碎得白色固体粉末；
（4） 3D多孔复合支架材料的制备：按氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶、双醛淀粉、水的配比为50 mg：80 mg：80 mg：2 ml，将氨基化明胶和双醛淀粉加入到蒸馏水中，超声震荡，使其充分溶解，然后加入氨基化明胶纳米颗粒混合均匀即得乳液的水相；将18 ml的油相加入到水相中，在10000 rpm下高速剪切乳化3 min，得到O/W型的Pickering乳液；将制备的上述乳液于室温下反应3 d，然后37 ℃缓慢挥发1~2 d去除油相，低温冰箱预冻-冷冻干燥，即得3D多孔支架材料。
对本实例中制得的氨基化明胶纳米颗粒进行形貌表征。附图1为本实例制备的氨基化明胶纳米颗粒的扫描电镜图，如图1所示，制备的氨基化明胶纳米颗粒单分散性较好，平均粒径为230 nm，并且在颗粒表面未观察到明显的裂缝或褶皱。
图2(B)为本实施例制备的氨基化明胶纳米颗粒的粒径分布图，其中(A)为明胶纳米颗粒的粒径分布图。对比两幅图可以明显发现氨基化明胶纳米颗粒的粒径分布更窄，单分散性更好。
图3(B)为本实施例制备的氨基化明胶纳米颗粒的三相接触角测量图，其中(A)为明胶纳米颗粒的三相接触角测量图。对比两幅图可以明显发现氨基化明胶纳米颗粒的三相接触角明显增大，说明其疏水性增强，以这种颗粒稳定的Pickering高内相乳液稳定性更高。
图4为本实施例制备的3D多孔复合支架材料。从图中可以看出该3D多孔复合支架材料具有相互连通的孔道和丰富的孔道层次结构，孔径平均尺寸约为20 µm，同时孔壁面积较大，利于细胞的粘附和迁移，并且从(B)中可以明显观察到氨基化明胶纳米颗粒在材料壁上的铺展面，说明氨基化明胶纳米颗粒具有一定的刚性结构在多孔材料中发挥支撑作用。

Claims (8)

1.一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）氨基化明胶的制备：称取一定量B型明胶加入到浓度为0.1 M、 pH为5.0的磷酸缓冲液中，配制成2~5 wt%的B型明胶溶液；按改性剂乙二胺、羧基活化剂碳化二亚胺盐酸盐（EDC）与B型明胶的质量比为（2.4~4.0）:（0.25~0.75）:1，将乙二胺和EDC分别先后加入到B型明胶溶液中，盐酸调节pH至5.0，37℃搅拌反应1~3 h，透析2~4 d，经低温预冷冻-冷冻干燥得到氨基化明胶；
（2）氨基化明胶纳米颗粒的制备：配制2.5~5 wt%氨基化明胶水溶液；第一次加入去溶剂化试剂丙酮，取上层白色悬浮液复溶于蒸馏水中，并用盐酸调节溶液酸碱度为酸性，随后将上述溶液于37 ℃恒温搅拌，同时第二次滴加去溶剂化试剂丙酮；滴加结束后，加入交联剂戊二醛，戊二醛用量为氨基化明胶固体质量的6~12 wt%，于37 ℃下搅拌反应3~14 h，在12500 g离心力条件下离心30 min，得到氨基化明胶纳米颗粒粗产品，并将该粗产品复溶于30 vol%丙酮溶液中继续离心纯化2~4次，最后将氨基化明胶纳米颗粒溶于蒸馏水中，用旋转蒸发仪于37 °C缓慢去除残余丙酮，得到改性明胶纳米颗粒；
（3）双醛淀粉的制备：配制5~10 wt%的可溶性玉米淀粉水溶液，在温度60~90℃条件下搅拌糊化30~60 min；按高碘酸钠与玉米淀粉的质量比为（1~2）:1，将高碘酸钠溶于上述玉米淀粉溶液中，并用硫酸调节其pH为 2~4，30 ℃条件下反应4~6 h，然后用蒸馏水和丙酮交替抽提、过滤，最后干燥、粉碎得白色固体粉末即为双醛淀粉；
（4）3D多孔复合支架材料的制备：将氨基化明胶和经糊化处理的双醛淀粉加入到蒸馏水中，超声震荡，使其充分溶解，然后加入稳定剂氨基化明胶纳米颗粒，混合均匀，其中氨基化明胶纳米颗粒、氨基化明胶、双醛淀粉、水的质量比为（0.0025~0.03）:（0.01~0.1）:（0.01~0.05）:1；接着在8000~15000 rpm的搅拌条件下将水相与油相按体积比为1:（4~9）混合，高速乳化0.5~5 min，得到O/W型的Pickering乳液；然后将上述乳液于室温下反应3~5 d，37℃缓慢挥发1~2 d去除油相，最后经低温预冷冻后冷冻干燥，即得3D多孔复合支架材料。
2.根据权利要求1所述的一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中所制备的氨基化明胶的氨基含量为0.413~0.840 mmol/g。
3.根据权利要求1所述的一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中第一次加入去溶剂化试剂丙酮的体积与配制氨基化明胶溶液所需蒸馏水体积相同；白色悬浮液复溶于蒸馏水中所需蒸馏水的体积与第一次加入去溶剂化试剂丙酮的体积相同；第二次加入去溶剂化试剂丙酮的体积为第一次去溶剂化试剂丙酮的3~6倍。
4.根据权利要求1所述的一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中氨基化明胶纳米颗粒是通过两步去溶剂法制得；盐酸调节溶液酸碱度为酸性，其对应的pH值为2.5~6.5。
5.根据权利要求1所述的一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中所制备的双醛淀粉的醛基含量为39~91%。
6.根据权利要求1所述的一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中双醛淀粉的糊化处理条件为：糊化时间30~120 min，糊化温度60~90℃。
7.根据权利要求1所述的一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的油相为正己烷、甲苯、对二甲苯和苯乙烯中的任一种。
8.根据权利要求1所述的一种孔径可控的天然高分子基3D多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的3D多孔复合支架材料具有连通的孔道结构，孔径尺寸分布为20~200 µm，并具有良好的亲水性、生物相容性以及可生物降解性能。
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