JP2002526755A - 生検査技術 - Google Patents

生検査技術

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、並行生検査を実行するための系に関する。各生化学試験を行うために微小製作された標識体を作成し、多種類の標識体を分析試料と混合する。各標識体を読み取る装置により、各試験の結果を分離する。本微小標識体は、陽極酸化された金属の表面層を有するものであり、陽極酸化、リソグラフィーによるパターン付け、そしてエッチング過程により製造される。アルミニウムが好ましい金属である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、特に、しかし限定ではなく、並行に行われる生検査技術として用い
るために、微小機械製作された又は微小製作された符号化基板の分野に関する。
【０００２】背景 大量且つ並行に行われる生検査は、遺伝学、スクリーニング及び薬物探索にお
ける最近の大部分の進展に貢献する機能的な技術である。従来１つずつ行われて
いた無数の検査が、現在では、無数の結果を生じる単一実験に集約され得る。こ
の方法の重要な点は、多数の異なる検査の結果を相互に分離する技術の開発であ
る。
【０００３】 現存するいくつかの技術を以下に記す。当技術は、実験終了後に読み取ること
ができる様に、構成実験の各々を標識することから成る。現在使用されている標
識体は、試験チップ表面上の実験位置と、実験に結びつく粒子の蛍光スペクトル
とを含んでいる。
【０００４】 AffymetrixのGeneChipのプローブアレイは、DNA配列を検査するチップであり
、その大きな二次元アレイ上の既定の点に、非常に多数の異なるDNAプローブが
配置されている。これの製作方法が、例えばUS 5,744,305又はUS 5,143,854に記
載されている。前記チップ上のチャンバー内で標準的なDNAハイブリダイゼーシ
ョン技術が用いられ、そしてその検査結果が、アレイ上の蛍光点の位置により光
学的に読み取られる(例えばUS 5,578,832参照)。検査の組合せは、当チップの製
造中に予め決定される。
【０００５】 Luminex CorporationのFlowMetrix系は、直径6.5μmの符号化された微小球を
使用する。各ビーズは、符号を形成するために赤色及びオレンジ色の蛍光団を組
み込んでいる。８種類の強度が可能であり、従って64種類のビーズ型が可能にな
る。プローブのために、緑色蛍光マーカーが用いられる。この系はUS 5,736,330
に記載されている。この系は、比較的に少数の符号を有し、そしてその符号及び
検査体の蛍光を読み取るために、フローサイトメーター上で複雑な多波長光学素
子を必要とする。
【０００６】 NanoGenには、半導体ベースのマイクロチップアレイAPEXがあり、これは特にD
NA結合及び配列決定実験を対象にする。DNAプローブの種々のアレイを有するNan
oGenチップは、最終使用者によりプログラムされ得る(例えばUS 5,605,662及びU
S 5,929,208参照)。
【０００７】 一般的なコンビナトリアル化学において、その他の粒子又は基板ベースの多数
の検査技術が存在する。例えばWO 96/24061には、無線周波数による同定用タグ
を用いた試験体ライブラリーが記載されている。WO 97/32892には、コンビナト
リアル化学用の基板に使用される複合支持体が記載されている。GB 2306484には
、コンビナトリアル化学用の二部性支持体粒子が記載されている。
【０００８】発明の要旨 本発明は、大量且つ並行に行われる多数生検査試験を、低コスト、迅速且つ簡
便に行うための系に関する。本系は、異なる非常に多数の型の微小製作された符
号化された標識体（微小標識体）を含有する縣濁液（検査液）を作成することに
関係する。各符号化標識体は、異なる生化学試薬又はプローブを保持している。
【０００９】 検査液は、活性な微小標識体の選択された組の縣濁液を互いに混合することに
よって作成される。検査液は、微小標識体の元々の製作とは関係なく、特定の利
用に合わせて作られる。
【００１０】 試験する試料を蛍光標識体によって印付けして、それを検査液とインキュベー
ションする。蛍光試料分子と結合するプローブを有する微小標識体のみが蛍光を
発する。
【００１１】 微小標識体は、陽極酸化され得る物質、例えばアルミニウムから製作される。
先ずそれを可溶性剥離層を有する平基板上に沈着する。パターン付けする前に、
その金属表面を陽極酸化する。これにより、高度に選択的なプローブとして用い
られる広範な生化学的活性作用剤の接着が可能となる。
【００１２】 標準的な光学的リソグラフィー及び乾式エッチングを用いて前記アルミニウム
にパターン付けすることによって、個別の微小標識体を得る。バーコードの方法
に類似する符号化方法により、符号を一連の穴(a series of holes)として微小
標識体上に保存する。生化学的プローブを、リソグラフィー過程の前又は後のい
ずれかで当表面に接着させ得る。次にこの微小標識体を、水性縣濁液内に剥離さ
せる。100000種類までの型の微小標識体が実証されている。
【００１３】 フローサイトメーターに類似するフローベースの読み取り系は、１秒間あたり
何千もの微小標識体を通過させて、そのバーコード及び試験結果の両方を読み取
る。試験結果は、蛍光強度(degree of fluorescence)によって測定される。もう
１つの平板読み取り系は、試験結果を読み取るために、蛍光顕微鏡及び画像処理
を用いる。この系では、微小標識体が平坦な基板上に配置されている。 図面を参照して、実施例により本発明の態様を説明する。
【００１４】詳細な説明 微小標識体 図１は、アルミニウムから作られた、微小製作された小型光学バーコードの形
の微小標識体１を示す。このバーコードは、アルミニウム中の一連の穴２によっ
て形成される。
【００１５】 このタイプの各微小標識体は、ほぼ長さ100μm（３）、幅10μm（４）、厚さ
１μm（５）であり、100000種類までの符号を貯えることができる。単一の直径1
5.24cm(6 inch)の基板上で、約一千万個の前記微小標識体を製作することができ
る。十進法で２〜５桁数のデータを有する40〜100μmの異なる長さの微小標識体
が製作される。異なる各符号毎に、唯一の生化学的プローブが連結される。その
符号を読み取る際に強力なエラー検定を行うために、EAN及びUPCバーコードに用
いられる方法などの符号化方法が用いられる。
【００１６】プローブ及び検査液 図２を参照して、微小標識体の検査液６を、活性な微小標識体の選択された組
の縣濁液を一緒に混合することによって、作成する。異なる各符号は、それに連
結される唯一の生化学的プローブを有し、それが特定の種類の分子と結合する。
結合反応は、抗体−抗原、酵素−基質、酵素−受容体、毒素−受容体、タンパク
質−タンパク質、及びアビジン−ビオチンから成る群から選択される。
【００１７】 試験試料８を蛍光標識体によって印付けして、それを前記検査液とインキュベ
ーションする。この蛍光試料分子と結合するプローブを有する微小標識体７のみ
が蛍光を発する１０。異なる型の微小標識体の蛍光強度の測定により、試験結果
を得る。
【００１８】 本発明の利用の一例は、特定の抗体を選択するために、並行生検査により血清
をスクリーニングすることである。その抗体に対する抗原をプローブとして、そ
の抗原を同定する印を付けた微小標識体に結合させる。この微小標識体を試料と
インキュベーションし、次に抗体特異的な蛍光標識体とインキュベーションする
。次にその微小標識体を、その標識体の蛍光強度を測定し且つその標識体の同定
を行う読み取り機に通す。その微小標識体の同定とその蛍光強度の相関から、試
料中の抗体と表面結合抗原との結合が表示される。
【００１９】微小標識体の製作 微小標識体の製作方法を、図３を参照して説明する。 基板物質１１、例えばシリコンウエハー、を先ず可溶性剥離層１２によってコ
ーティングする。好ましい態様では、これは、溶剤を除くために150℃で焼かれ
たスピンコーティングされたポリメチルメタクリレートレジストの層である。
【００２０】 厚さ１μmのアルミニウム層１３を前記基板に沈着させる。これは、一般に半
導体装置の製作に用いられる標準的な真空スパッターコーティング法により行わ
れる。
【００２１】 このアルミニウム層１３を、4%リン酸浴中30Vの電圧で30秒間、10mA/cm2の電
流密度で、純粋アルミニウム陰極を用いて陽極酸化１４する。これによって、サ
イズ約40nmの孔(pore)を有する100nmの陽極酸化された層１５が形成される。
【００２２】 この段階で（利用法に応じて）、このアルミニウム表面をプローブ分子１６に
よって、その分子の水性溶液／縣濁液中にその表面を浸けることを介してコーテ
ィングしてもよい。
【００２３】 この基板に、通常の光学的レジスト１７、Shipley S1813をスピンコーティン
グする。標識パターン１８を、ハード−コンタクト光学的マスクを用いて露光し
、そして水性アルカリ現像液(MF319)によって現像する。SiCl4による反応性イオ
ンエッチング法により、そのパターンをアルミニウム層に転写する。
【００２４】 リソグラフィー過程の後にプローブ接着を行う場合、この段階で、光学的レジ
スト１７を溶剤、例えばイソプロピルアルコールによって除去してよい。これに
より、前記剥離層１３と、その上のパターン付けされた前記アルミニウム層２０
とが共に完全なまま残る。次にプローブ分子１６を前記通りに接着させることが
でき、一方当微小標識体は依然として基板に接着している。
【００２５】 プローブが接着された微小標識体を、溶剤、例えばアセトンにより基板から剥
離する。希釈及び濾過により、微小標識体２２を、検査液に直ぐに混合される水
性縣濁液の形にする。
【００２６】 この製作方法は、穴を有する多種類の形の微小標識体に適し、例えば図１の実
質的に線形のもの、並びに正方形、長方形及び円形の微小標識体にも適している
。
【００２７】陽極酸化及び表面化学 水性溶液中でインキュベーションする場合、タンパク質は、未処理のアルミニ
ウム表面に弱くしか結合しない。その表面を修飾することによって、この結合が
起きる時期を調節することができ、そしてこの結合を選択的に強化し得る。この
ことは重要である。なぜならこのことにより、製造時には、当表面にプローブ分
子が強く結合されるが、試験中には、蛍光標的分子の非特異的結合が弱く維持さ
れるからである。この様にして、試験体の識別を最大限にする。
【００２８】 電気化学的な方法によるアルミニウム成分の表面保護に関して、今世紀の初め
の半分において得られた非常に広範な情報が存在する。多孔性表面を成長させる
方法が周知であり、前記表面を封止するための方法も同様に周知である。本発明
者はこの情報を用いて、十分に制御された多孔性及び深さを有する吸着性表面を
成長させる比較的簡単な方法を開発した。この表面は、処理後間もなくは、選択
されたタンパク質を十分に結合するが、時間と共に回復して更なる結合を抑制す
る。
【００２９】 適当な陽極酸化された表面形態を形成するために、プローブとして用いられる
生分子の典型的な構造を理解する必要がある。極低温原子間力顕微鏡により、そ
の様な生分子を直接画像化することができる。例えば、免疫グロブリンＧ(IgG)
はＹ形構造を有する。IgG分子のサイズは約40nmにわたり、これは典型的なサイ
ズと考え得る。
【００３０】 図４に示す通り、陽極酸化中に、アルミニウム酸化物層２３が、前記アルミニ
ウム表面上に成長する。この酸化物層は、二次元六角形セルの構造２４で成長す
る。各セルのサイズは、電気化学的形成電圧に依存する。各セルの中央に、各セ
ルの幅よりも小さい口径を有する孔(pore)２５が形成される。陽極酸化行程が進
行するに連れて、この酸化物層の厚さ２７及び孔の深さ２８は増加するが、セル
の幅２６及び孔の口径２８は一定のままである。
【００３１】読み取り系 二系統の読み取り系が開発されている。これらはフローサイトメトリーに基づ
くもの、及び平板化した微小標識体の平面画像化に基づくものである。
【００３２】 フローサイトメトリー式の読み取り機は、図５で図解する通り、微小標識体１
が、管２９の中央で下方向に、定められた読み取りゾーン３０まで流される様に
設計されている。通常、流動中の細長い粒子は転げ回る傾向にある。しかし加速
中の外装流体３１を用いて、微小標識体をその流れの中央３２に注入することに
よって、流体力学的な集束効果が得られ、その結果微小標識体が整列し、そして
注入点３２の下流に存在する明確に定められた焦点３０を通過する。
【００３３】 流体力学的な焦点３０において、488nmのアルゴンイオンレーザーからの２つ
の直交する集束されたレーザー光ビーム３３、３４が微小標識体に照射される。
このことを図６に詳しく示す。２つの直交する照射ビームの使用により、流動管
の参照フレームに対する回転に関係なく、微小標識体への照射が可能になる。図
６では、微小標識１は、両方の入射ビームに対して45度の角度を示す。これは、
可能な最悪の事例である。それでも図１に示した微小標識体の外形から、依然と
して前記の光が当標識体の穴(holes)２を透過することが分かる。当標識体が通
過する際に、この穴により透過強度が変調され、その結果一連の連続情報が発生
し、これが検出器３５において通常のバーコードの場合と同じ様に分析される。
同時に、外側(epi-)蛍光検出器３６によって蛍光強度が測定される。これを当標
識体上の符号と相関させる。望ましい解像度を達成するために、口径数の高い光
学素子（顕微鏡対物レンズ）を用いる。最適のフローサイトメトリー式設計体は
平坦な壁を有するので、特注の円筒状画像化要素を使用しなくて済む。
【００３４】 十分な数の微小標識体を読み取った後、その読み取り機は全ての試験結果を計
算する。統計分析を行うために必要な数は、典型的には、各型の微小標識体あた
り10〜100コピーである。試験結果は、各型のプローブ毎に蛍光の平均値及び標
準偏差を示す。
【００３５】 平板読み取り系では、微小標識体を平坦な基板上に配置する。この基板はフィ
ルター基板又は透過性基板のいずれかである。この配置基板を系統的に分析する
ために、通常の蛍光顕微鏡を用いる。画像処理系によって基板上の各視野像が捕
捉される。透過光は、蛍光とは別に分析される。各微小標識体がその透過光プロ
ファイルにより同定され、一方その標識体の表面上で統合された蛍光シグナルが
記録される。良好な統計分析を行うために、もう一度10〜100コピーの各型の微
小標識体が必要になる。
【００３６】利用 典型的な利用では、多数の異なる抗体（例えば肝炎、HIV）のためのプローブ
の縣濁液を用いる。読み取り系において、患者から一滴の血液を採取し、それを
蛍光マーカーで標識し、そしてそれを前記プローブ縣濁液と数分間インキュベー
ションする。この縣濁液を、微小液体検出器系に供給する。
【００３７】その他の態様 平板読み取り系のための微小標識体の設計は、主に流動通過式読み取り系に用
いられる前記の線形設計に限定されない。平板系は、線形よりもむしろ正方形又
は長方形により近い標識体上に製作された二次元パターンを用いることができる
。通常の二次元バーコードに類似する符号化方法が用いられる。当標識体の外形
により、特に方向に関する情報も与えられる。
【００３８】 磁気物質を組み込んだ標識体では、磁気的な分離方法を行い得る。これは、検
査される試料に、当標識体に近いサイズの固体物質が含まれる場合、それが結果
を混乱させることがあるので、有用である。
【００３９】 陽極酸化され得る金属、例えばアルミニウムによってコーティングすることが
できる任意の基板を用いて、微小標識体を製作することができる。微小標識体を
製作するために、例えばアルミニウムをコーティングしたプラスティックを型押
するなどの大量製造方法を用いる場合、このことは特に魅力的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、透過式光学的バーコードを組み込んでいる単一の微小標識体を示す。
【図２】 図２は、２つの結合実験過程を含んで成る並行生検査を示す。
【図３】 図３は、ウエハー規模での微小標識体の製作方法を示す。
【図４】 図４は、アルミニウム表面の陽極酸化により形成された多孔性構造を示す。
【図５】 図５は、微小標識体の読み取り機内の流れを示す。
【図６】 図６は、回転に関わらずに標識体を読み取るために、直交する照射ビームを用
いることを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月２９日（２００１．３．２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ２５Ｄ 11/04 ３０３ Ｃ２５Ｄ 11/04 ３０３ ３１１ ３１１ Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｇ０６Ｋ 7/00 Ｕ Ｇ０６Ｋ 7/00 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ // Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ １０３ １０３ ＺＣＣ ＺＣＣ 1/28 Ｎ (72)発明者 イングランド，ジェイムズ イギリス国，ケンブリッジシャー シービ ー４ ６ディージー，ケンブリッジ，ミル トン，バット レーン 44エー (72)発明者 コルビー，エドワード イギリス国，ケンブリッジシャー シービ ー１ ３エルアール，ケンブリッジ，アー ジル ロード 45 Ｆターム(参考） 2G052 AA28 AD26 DA01 DA21 EC14 EC16 FD00 FD06 FD09 HB03 JA05 4G075 AA24 BC02 BC06 BD14 CA36 FB02 FC20 5B072 BB00 CC01 CC24 DD03 MM11

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 陽極酸化された金属表面層を有する、生化学（結合実験）検
    査のための固体支持体。
  2. 【請求項２】 前記金属表面層がアルミニウムである、請求項１に記載の支
    持体。
  3. 【請求項３】 前記結合実験の試薬の親和性を強化するために修飾された、
    請求項１に記載の支持体。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の支持体を製作する方法であって、前記支持
    体を構成する前記金属による平坦表面のスパッターコーティング、その金属のリ
    ソグラフィー法によるパターン付け、及び各支持体を残すためのその金属のエッ
    チング、を含んで成る前記方法。
  5. 【請求項５】 前記表面が、硬い支持体上の可溶性物質の層から成り、従っ
    て前記支持体が、その可溶性物質の溶媒和作用により剥離される、請求項４に記
    載の方法。
  6. 【請求項６】 前記可溶性物質がレジストである、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記修飾により多孔性表面が形成される、請求項２に記載の
    支持体。
  8. 【請求項８】 前記の孔のサイズが、結合される生化学的活性分子のサイズ
    にほぼ等しい、請求項７に記載の支持体。
  9. 【請求項９】 前記修飾が電気化学的方法による、請求項３に記載の支持体
    を製作する方法。
  10. 【請求項１０】 前記修飾が、前記支持体表面の陽極酸化による、請求項９
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記陽極酸化が150 Vまでの電圧で行われる、請求項１０
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記陽極酸化が4V〜30Vの電圧で行われる、請求項１１に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記支持体が、好ましくは長さ100μm、幅100μm及び厚さ
    100μmよりも小さい、請求項１に記載の支持体。
  14. 【請求項１４】 同定のために、空間的に変化するパターンを組み込んでい
    る、請求項１に記載の支持体。
  15. 【請求項１５】 前記パターンを読み取り、そして請求項１４に記載の支持
    体を同定するための光学的読み取り機。
  16. 【請求項１６】 前記パターンがバーコードである、請求項１４に記載の支
    持体。
  17. 【請求項１７】 前記バーコードが線状バーコードである、請求項１６に記
    載の支持体。
  18. 【請求項１８】 透過式光学素子により作動する、請求項１５に記載の読み
    取り機。
  19. 【請求項１９】 前記支持体を、流動系により光学的読み取り機内に輸送す
    る、請求項１８に記載の読み取り機。
  20. 【請求項２０】 請求項１５に記載の読み取り機によって測定される通りに
    、結合対の一方の成員が接着されている請求項１４に記載の基板の同定に従って
    、多数の結合実験の結果を相互に分離する方法。
  21. 【請求項２１】 前記結合対が、抗体−抗原、酵素−基質、酵素−受容体、
    毒素−受容体、タンパク質−タンパク質、及びアビジン−ビオチンから成る群か
    ら選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記結合対の接着される成員が蛍光標識される、請求項２
    ０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記パターンが、前記支持体中の一連の穴を含んで成る、
    請求項１４に記載の支持体。
  24. 【請求項２４】 ２つの実質的に直交する光透過経路を有する、請求項１８
    に記載の読み取り機。
  25. 【請求項２５】 １又は複数の蛍光検出器を組み込んでいる、請求項２４に
    記載の読み取り機。
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