WO2006126568A1 - バイオチップ用基板及びバイオチップ - Google Patents

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WO2006126568A1
WO2006126568A1 PCT/JP2006/310313 JP2006310313W WO2006126568A1 WO 2006126568 A1 WO2006126568 A1 WO 2006126568A1 JP 2006310313 W JP2006310313 W JP 2006310313W WO 2006126568 A1 WO2006126568 A1 WO 2006126568A1
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biochip
group
metal
carbon
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PCT/JP2006/310313
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Kiyoshi Nokihara
Yasuo Oka
Original Assignee
Hipep Laboratories
Nippon Light Metal Company, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a biochip on which a biological substance such as a nucleic acid, peptide, sugar or the like is immobilized, and a substrate therefor.
  • the Aflfymetrix method for synthesizing oligonucleotides on the substrate surface using photolithography and spot DNA and probe protein prepared in advance are spotted.
  • the Stanford method to immobilize on the substrate surface, and in any case, it is well known to detect fluorescence after biochemical reaction with the target and perform molecular identification and diagnosis from the patterner.
  • the Alfymetrix method is synthesized on the surface of the substrate, so that it is difficult to synthesize long oligonucleotides with stable immobilization, and the cost is high.
  • a minute spot such as probe DNA or probe protein is placed on the substrate surface, and the molecule to be recognized is immobilized by adsorption or covalent bond.
  • Epoxy groups or non-covalent polylysine is added, but the proposed substrate is highly brittle if it is an inorganic material such as glass, silicon, ceramics, glassy carbon, or special carbon.
  • the substrate is an organic resin, processing is prepared by injection molding, etc., but on the other hand, the flatness is poor and the warpage is large, so the focus is not achieved during detection and the S / N ratio is lowered by self-emission. Have. Furthermore, if the flatness changed during storage!
  • Patent Document 1 JP 2001-128683 A
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2005-510440
  • An object of the present invention is to provide Stanford probe DNA, probe protein, and probe sugar chain.
  • When spotting the surface of the substrate or fixing the microbeads it is easy to fix the microbeads and eliminates the above-mentioned drawbacks. Is to provide a good biochip substrate. Means for solving the problem
  • biochip substrate body formed of a metal and a carbon layer having an active group formed on the metal substrate body as a biochip substrate.
  • the present inventors have found that a biochip substrate can be easily fixed, can be easily processed without self-light emission, and has good flatness and surface accuracy. .
  • the present invention provides a biochip substrate comprising a metal substrate body and a carbon layer having an active group laminated on the substrate.
  • the present invention also provides a biochip on which the biochip substrate biomaterial of the present invention is immobilized.
  • the present invention provides a method for producing a nanochip, comprising the steps of preparing the biochip substrate of the present invention and a step of immobilizing a biological substance on the substrate.
  • the present invention provides use of the substrate of the present invention for manufacturing a substrate for a biochip.
  • a biochip substrate that can easily fix a biological substance, is easily processed, and has good flatness and surface accuracy without self-emission is provided for the first time.
  • the substrate for a biochip of the present invention is not only easily processed because the substrate body is made of metal, but also has excellent handleability because it does not crack or chip, and achieves high flatness and surface accuracy. Therefore, the problem that it is difficult to focus the optical system when detecting fluorescence does not occur. Furthermore, since the substrate body is made of metal, the fluorescence does not self-emit. Furthermore, since the carbon layer has an active group such as an amino group, the biological material can be easily fixed.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between calmodulin content and measured fluorescence intensity when calmodulin in a test sample was measured using a nanochip prepared in the example of the present invention. It is.
  • the substrate body of the biochip of the present invention is made of metal.
  • the metal a metal selected from the group consisting of aluminum, titanium, stainless steel, and an alloy containing at least one of these is easy to process and has rigidity, so that it has excellent flatness and high surface hardness. It is preferable for reasons such as excellent smoothness after polishing.
  • the substrate body is bent or has irregularities on the surface, irregular reflection will increase, or the focus at the time of detection will be increased, and the SZN ratio at the time of detection will be reduced.
  • the surface is preferably smooth. For this reason, pressure annealing is performed after dimensional processing such as punching to remove distortion and improve flatness, then surface grinding is performed to smoothen the surface, and then the surface is further polished to increase surface accuracy. It is preferable to manufacture the substrate body.
  • These flat z smoothing processes can be performed by a conventional metal working method. If the metal is aluminum or an aluminum alloy, it is soft and difficult to ensure surface accuracy! Therefore, it is preferable to apply a hardening treatment such as electroless NiP plating or anodization to the surface.
  • the surface roughness Ra of the surface of the substrate body is preferably less than 1 nm. There is no particular lower limit for Ra, but about 0.2 nm is usually close to the limit of processing accuracy.
  • the flatness of the surface of the substrate body is preferably less than 5 m.
  • the thickness of the substrate body is not limited at all, it is usually about 0.5 mm to 2 mm.
  • a plated layer such as NiP is formed on a substrate body made of aluminum or an aluminum alloy, or when an oxide layer is formed by anodizing the surface thereof, these plated layer or oxidized layer is formed.
  • the thickness of the soot layer is not limited at all, but is usually about 5 m to 30 ⁇ m.
  • a carbon layer having an active group is laminated on the surface of the substrate body.
  • a carbon layer is formed thereon.
  • the carbon layer is laminated directly on the surface of the substrate body or indirectly through another layer.
  • the carbon layer is a layer made of carbon, such as graphite, diamond, diamond-like carbon, and amorphous carbon. These layers can be formed by sputtering, vapor deposition, CVD (chemical vapor deposition), or the like. That is, the graphite layer is, for example, a graph It can be formed by a vacuum vapor deposition method using eye particles as a vapor deposition source.
  • the diamond layer can be formed, for example, by a low pressure vapor phase synthesis method using a hot filament CVD apparatus.
  • Diamond-like carbon can be formed by, for example, ion beam sputtering or high-frequency plasma CVD.
  • Amorphous carbon can be formed by, for example, a high frequency notch method. These can be easily performed using a commercially available apparatus.
  • the carbon layer has an active group for immobilizing biological materials.
  • the active group can be imparted by forming the carbon layer as described above and then bonding the active group to the carbon layer.
  • the active group is not particularly limited, and examples thereof include an amino group, an aldehyde group, a carboxyl group, a sulfhydryl group, and an epoxy group that are covalently bonded to carbon.
  • an amino group is particularly preferable because it can be easily combined with a biological material having high versatility.
  • These functional groups that are bonded to carbon by these covalent bonds include radical C and the functional group or the C or C bonded to carbon by cutting plasma CC or ultraviolet irradiation. It can be covalently bonded to carbon by bonding with a compound having a functional group.
  • an amino group is irradiated with ultraviolet rays in an air atmosphere to change the oxygen in the air to ozone, thereby causing the ozone to act on carbon, and then exhausting it.
  • chlorine can be activated to chlorinate carbon, and after exhaust, it can be covalently bonded to carbon by ammonia by acting ammonia gas. It can also be introduced directly by ammonia plasma irradiation.
  • radicals can be formed on the surface of an argon plasma irradiated substrate to form peroxides by air oxidation, and amino groups can be generated on the surface by reaction with arylamine or the like.
  • the aldehyde group can be obtained, for example, by reducing the carbon surface to an acid chloride.
  • the carboxyl group can be obtained, for example, by converting the amino group into a diazo-um ion, converting it to nitrile, and then hydrolyzing it. It can also be obtained by acidifying an alkyl group with potassium permanganate or the like.
  • the sulfhydryl group can be obtained, for example, by halogenating the carbon surface with light or the like and reacting the resulting halogenated alkyl with thiol.
  • Epoxy groups can be produced, for example, by treating a carbon-carbon double bond with a peracid. All of these can be performed based on organic synthetic chemistry reactions well known to those skilled in the art.
  • the active group is A compound having an active group that is not necessarily bonded to carbon by a covalent bond may be physically adsorbed to the carbon layer non-covalently.
  • an amino group can be imparted to the carbon layer by physical adsorption of polylysine obtained by polycondensation of lysine, which is an amino acid having an amino group in the side chain, onto the carbon layer.
  • the density of the active group imparted to the carbon layer is not particularly limited, but is usually about 50 pmol to 200 pmol, preferably about 100 pmol to 200 pmol per lcm 2 of the carbon layer.
  • a biochip can be obtained by immobilizing a biological substance on the biochip substrate of the present invention described above.
  • biological substances include nucleic acids such as DNA and RNA, various proteins, antibodies, enzymes, peptides such as synthetic and natural peptides, saccharides such as polysaccharides and oligosaccharides, various lipids, and complexes (sugars). Examples thereof include proteins, glycolipids, and lipoproteins. It is also possible to fix the cells themselves, and the cells themselves are also included in the “biologically related substance” referred to in the present invention.
  • low molecular compounds such as coenzymes, antigen epitopes, and haptens also specifically interact with biopolymers such as enzymes and antibodies, and thus are included in the “biologically related substances” referred to in the present invention.
  • These biological substances can be directly bonded to the carbon layer, or can be bonded to the carbon layer in a state where the biological substance is supported on another carrier such as a plastic bead.
  • Immobilization of a biological substance on the carbon layer can be performed by a known method via the above-described active group.
  • the active group is an amino group
  • the amino group is converted to the corresponding anhydride with bromoacetic acid and carpositimide and reacted with an amino group to bromoacetylate the surface, as described in detail in the Examples below.
  • a sulfidyl group in a biological substance such as a peptide
  • fixation can be achieved.
  • it can be immobilized by reacting with an amino group in a biorelevant molecule via dartaldehyde.
  • the active group When the active group is an aldehyde group, it can be covalently bonded to the amino molecule of the biomolecule to be immobilized.
  • the active group When the active group is a carboxyl group, it can form an ester with N-hydroxysuccinimide and bind to an amino group of a biological substance.
  • the active group When the active group is a sulfhydryl group, it can be immobilized by selectively promoacetylating the amino group of the biologically relevant molecule. Alternatively, it can be immobilized via the same sulfhydryl group and disulfide.
  • the sulfhydryl group selectively maleimidizes the amino group at the fixed position (for example, N-6 maleimide capro). Fixation can be achieved by condensing the acid with an amino group.
  • the active group When the active group is an epoxy group, it can be immobilized by reacting with a bio-related substance with maleimide in the same manner.
  • degreasing, etching, acid activation treatment, and zincate treatment were sequentially performed on the flat plate.
  • the sulfuric acid-phosphate etching solution AD-101F 80 ° C
  • the nitric acid active solution (20 ° C).
  • the pretreatment was performed by sequentially immersing in zincate solution AD-301F3X (20 ° C) for 1 minute for 30 seconds. After that, it was immersed in an electroless NiP solution NI-422 (90 ° C) manufactured by Meltec for 2 hours to form a 12 m thick plated film on both sides.
  • the substrate had a thickness of 1.00 mm and a surface roughness Ra of 0.35 nm.
  • the flatness, parallelism, and Ra were measured using a groove bottom flat watch FT_50LD, a rank tailor Hobson roundness measuring machine Talirond, and a rank tailor Hobson stylus roughness meter Talistep.
  • amorphous carbon was thickened to 40 nm on one side using a high-frequency sputtering apparatus CFS-8EP manufactured by Tokuda Manufacturing Co., Ltd. Specifically, sputtering was performed for 5 minutes under the conditions of an Ar atmosphere of 1.0 Pa, an input traveling wave power (Pl) lkW, and a reflected wave power (Pr) of 20 W.
  • active groups were added to the amorphous carbon layer. The provision of the active group was performed by the following method. First, after setting the substrate in a stainless steel container with a synthetic quartz window, it is 30% intensity at a wavelength of 185 at atmospheric pressure.
  • the substrate surface was treated with ozone by irradiating UV light (lamp output HOW) with a wavelength of 254 nm at a position 3 cm away with 100% intensity ratio.
  • chlorine was introduced after evacuation and chlorination (25 ° C, 5 minutes) was performed in a 13Pa chlorine atmosphere.
  • Ammonia was introduced after evacuation and 13Pa ammonia atmosphere (25 ° C, For 5 minutes).
  • the amino group content of this substrate was 4.1 ol / both.
  • the amount of amino groups was measured by a method in which the hydrochloric acid remaining after the substrate surface was treated with hydrochloric acid was back titrated with an aqueous sodium hydroxide solution (Japanese Patent Application 2005-069554).
  • FAM and TAMRA are both fluorescent dyes.
  • FAM fluorescence resonance energy transfer
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the protein binds, the helix structure of the peptide is fixed and FRET fluorescence increases.
  • FRET is a phenomenon in which fluorescence from an acceptor is observed by energy transfer from a donor molecule in an excited state (in this case, FAM) to an acceptor molecule in a ground state (in this case, TA MRA).
  • This peptide is known to bind specifically to the protein calmodulin (CaM), but when bound, the distance between FAM and TAMRA is reduced. As the amount of CaM increases, the fluorescence intensity from TAMRA measured increases and the binding can be quantified.
  • CaM protein calmodulin
  • the labeled peptide was dissolved in 60% dimethylformamide (DMF) to a concentration of 2 ⁇ .
  • DMF dimethylformamide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • the resulting mixture is diluted to about 10 mM with ultrapure water (Milli Q water (trade name)) to make a solution of about 100 ml, added to the aminated substrate, and then at room temperature for 2 hours. Soaked and occasionally lightly brominated and brominated.
  • the obtained substrate was washed with ultrapure water (Milli Q water (trade name)) and dried with nitrogen.
  • the labeled peptide solution was spotted on the substrate, and the labeled peptide was allowed to react with and bind to the promoacetylated amino group and immobilized on the substrate. Spotting was performed using a SpotBot device manufactured by TeleChem International (California, USA) and using a microspotting pin manufactured by TeleChem International.
  • a solution containing different amounts of CaM (CaM dissolved in 100M salt-calcium calcium solution) was applied to the labeled peptide-immobilized substrate thus prepared, washed, and then the fluorescence was scanned. It was measured using Ichi (CRBIO lie manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.).

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Abstract

固定化が容易であると同時に自家発光することなく加工が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板が開示されている。バイオチップの基板本体を金属で形成すると共に、該金属製基板本体上に活性基を有する炭素層を形成したものをバイオチップ用基板として用いる。バイオチップ用基板は、基板本体が金属製であるので、加工が容易であるのみならず、割れや欠けを生じないので取り扱い性に優れ、高度な平坦性と表面精度を達成することができ、このため、蛍光の検出時に光学系の焦点を合わせ難いという問題が生じない。さらに、基板本体が金属製であるので、蛍光を自家発光することがない。さらに、炭素層がアミノ基等の活性基を有しているので、生体関連物質を容易に固定化することができる。

Description

明 細 書
バイオチップ用基板及びバイオチップ
技術分野
[0001] 本発明は、核酸、ペプチド、糖等の生体関連物質を固定化したバイオチップ及び そのための基板に関する。
背景技術
[0002] 平板状の基板表面に DNA、プロテインを固定ィ匕させたバイオチップには、フォトリソ グラフィを用いて基板表面でオリゴヌクレオチドを合成する Aflfymetrix法と、予め準備 したプローブ DNA、プローブプロテインをスポットして基板表面に固定化する Stanford 法があり、いずれの場合もターゲットとの生化学反応後に蛍光を検出し、そのパター ンカゝら分子識別や診断を行うことは良く知られている。上記 2法の内、 Alfymetrix法は 基板表面で合成するため、安定的な固定ィ匕ゃ長いオリゴヌクレオチドの合成が困難 であり、コストも高いという欠点があった。また、 Stanford法はプローブ DNA、プローブ プロテインなどの微少なスポットを基板表面に載せ、吸着や共有結合で被認識分子 を固定ィ匕するために、基板表面に共有結合型のアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基 あるいは非共有結合型のポリリジンを付与しておくが、提案されている基体が、ガラス 、シリコン、セラミックス、グラッシ一炭素、特殊炭素などの無機系材質の場合はいず れも脆性が大きいために加工時に割れたり、成形に時間とコストが掛かるという欠点 があった。基体が有機物系の樹脂の場合は射出成形などで加工は用意である反面 、平坦度が悪くて反りが大きいために検出時に焦点が合わないと共に自家発光によ り S/N比を下げる欠点を有して 、た。更に保管中にその平面性が変化すると!/、う欠点 bあった。
[0003] 特許文献 1：特開 2001-128683号公報
特許文献 2：特表 2005-510440号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、 Stanford法のプローブ DNA、プローブプロテイン、プローブ糖鎖 などを基板表面にスポットする、あるいはマイクロビーズなどを固定ィ匕するにあたって 、上記の欠点を解消すベぐ固定ィ匕が容易であると同時に自家発光することなく加工 が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板を提供することである。 課題を解決するための手段
[0005] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、バイオチップの基板本体を金属で形成すると 共に、該金属製基板本体上に活性基を有する炭素層を形成したものをバイオチップ 用基板として用いることにより、生体関連物質を容易に固定ィ匕することができ、自家 発光することなぐ加工が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板が 得られることを見出し、本発明を完成した。
[0006] すなわち、本発明は、金属製の基板本体と、該基板上に積層された、活性基を有 する炭素層とを具備するバイオチップ用基板を提供する。また、本発明は、上記本発 明のバイオチップ用基板生体関連物質を固定ィ匕したバイオチップを提供する。さらに 本発明は、上記本発明のバイオチップ用基板を準備する工程と、該基板上に、生体 関連物質を固定ィ匕する工程とを含む、ノィォチップの作製方法を提供する。さらに、 本発明は、上記本発明の基板の、バイオチップ用基板製造のための使用を提供する 発明の効果
[0007] 本発明により、生体関連物質を容易に固定ィ匕することができ、自家発光することなく 、加工が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板が初めて提供された 。本発明のバイオチップ用基板は、基板本体が金属製であるので、加工が容易であ るのみならず、割れや欠けを生じないので取り扱い性に優れ、高度な平坦性と表面 精度を達成することができ、このため、蛍光の検出時に光学系の焦点を合わせ難い という問題が生じない。さらに、基板本体が金属製であるので、蛍光を自家発光する ことがない。さらに、炭素層がアミノ基等の活性基を有しているので、生体関連物質を 容易に固定ィ匕することができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]本発明の実施例にお!、て作製したノィォチップを用いて被検試料中のカルモ ジュリンを測定した際の、カルモジュリン量と測定された蛍光強度との関係を示す図 である。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 上記の通り、本発明のバイオチップ用基板は、その基板本体が金属製である。金属 としては、アルミニウム、チタン及びステンレススチール並びにこれらの少なくとも一種 を含む合金から成る群より選ばれる金属が、加工が容易で、かつ、剛性があるために 平坦性に優れ、表面硬度が高いために研磨後の平滑性に優れるなどの理由で好ま しい。
[0010] 基板本体が曲がっていたり表面に凹凸があると、乱反射が多くなつたり、検出時の 焦点が合わな力つたりして、検出時の SZN比が下がるので、基板本体は平坦でか つその表面が平滑であることが好ましい。このため、打ち抜きなどの寸法加工後に加 圧焼鈍を行い歪みを取り去ると共に平坦性を向上させ、次いで表面の研削加工を施 して平滑ィ匕した後、更に表面を研磨して表面精度を上げて基板本体を製造すること が好ましい。これらの平坦 z平滑化加工は、金属加工の常法により行うことができる。 なお、金属がアルミニウム又はアルミニウム合金である場合には、柔らかくて表面精 度を確保し難！ヽので、無電解 NiPめっきや陽極酸化などの硬質化処理を表面に施す ことが好ましい。基板本体の表面の表面粗さ Raは lnm未満であることが好ましい。 Ra の下限は特にないが、通常、 0.2nm程度が加工精度の限界に近い。また、基板本体 の表面の平坦度は、 5 m未満であることが好ましい。基板本体の厚さは何ら限定さ れないが、通常、 0.5mm〜2mm程度である。また、アルミニウム又はアルミニウム合金 カゝら成る基板本体上に NiP等のめっき層を形成したり、その表面を陽極酸ィ匕して酸ィ匕 物層を形成する場合、これらのめっき層や酸ィ匕物層の厚さも何ら限定されないが、通 常、 5 m〜30 μ m程度である。
[0011] 上記基板本体の表面上に、活性基を有する炭素層が積層される。なお、上記のよう に、めっき層や酸ィ匕物層が形成される場合にはその上に炭素層が形成される。すな わち、炭素層は、基板本体の表面上に直接又は他の層を介して間接的に積層され る。炭素層は、グラフアイト、ダイヤモンド、ダイヤモンドライク炭素、アモルファス炭素 等の、炭素から成る層であり、これらはスパッタ法、蒸着法、 CVD(chemical vapor dep osition)法等により形成することができる。すなわち、グラフアイト層は、例えば、グラフ アイト粒子を蒸着源とする真空蒸着法により、形成することができる。ダイヤモンド層 は、例えば、熱フィラメント CVD装置を用いて低圧気相合成法により、形成することが できる。ダイヤモンドライク炭素は、例えば、イオンビームスパッタ法あるいは高周波プ ラズマ CVD法により、形成することができる。アモルファス炭素は、例えば、高周波ス ノ ッタ法により、形成することができる。これらは、市販の装置を用いて容易に行うこと ができる。
炭素層は生体関連物質を固定ィ匕するための活性基を有する。活性基は、上記のよ うに炭素層を形成した後、炭素層に活性基を結合させることにより付与することができ る。活性基としては、特に限定されないが、炭素に共有結合されたアミノ基、アルデヒ ド基、カルボキシル基、スルフヒドリル基及びエポキシ基を例示することができる。これ らの中でもァミノ基は、汎用性が高ぐ生体関連物質との結合も容易であるので特に 好ましい。これらの共有結合により炭素に結合されるこれらの官能基は、プラズマある いは紫外線照射によって炭素の C C結合、 C = C結合、 C O結合を切り、ラジカ ル化した Cと、該官能基又は該官能基を有する化合物とを結合させることにより炭素 に共有結合させることができる。例えば、アミノ基は、下記実施例に詳述するように、 炭素層に大気雰囲気下で紫外線を照射することにより、大気中の酸素をオゾンに変 えてこのオゾンを炭素と作用させ、次いで、排気後、塩素ガスを作用させて炭素を塩 素化し、さらに、排気後、アンモニアガスを作用させて炭素をァミノ化することにより炭 素に共有結合させることができる。また、アンモニアプラズマ照射で直接導入する事 もできる。またアルゴンプラズマ照射基板表面にラジカルを形成させ、空気酸化でパ 一オキサイドとし、ァリルアミン等との反応によってもアミノ基を表面で生成できる。ァ ルデヒド基は、例えば、炭素表面を酸塩化物にして還元することで得られる。カルボ キシル基は、例えば、アミノ基をジァゾ -ゥムイオンとし、二トリルに変換した後、これを 加水分解することで得られる。また、アルキル基を過マンガン酸カリ等で酸ィ匕させても 得られる。スルフィヒドリル基は、例えば、炭素表面を光などでハロゲンィ匕し、生成す るハロゲンィ匕アルキルにチオールを反応させて得ることができる。エポキシ基は、例 えば、炭素 ·炭素二重結合を過酸で処理してつくることができる。これらはいずれも当 業者にとって周知の有機合成化学の反応に基づき行うことができる。また、活性基は 、必ずしも共有結合により炭素に結合させる必要はなぐ活性基を有する化合物を炭 素層に非共有結合的に物理吸着させてもよい。例えば、側鎖にアミノ基を有するアミ ノ酸であるリジンを重縮合したポリリジンを炭素層に物理吸着させることにより炭素層 にアミノ基を付与することができる。炭素層に付与する活性基の密度は、特に限定さ れないが、炭素層 lcm2当り通常 50 pmol〜200 pmol程度、好ましくは、 100 pmol〜2 00 pmol程度である。
[0013] 上記した本発明のバイオチップ用基板に生体関連物質を固定ィ匕することによりバイ ォチップを得ることができる。ここで、生体関連物質としては、 DNA、 RNA等の核酸、 各種タンパク質、抗体、酵素並びに合成及び天然ペプチド等のペプチド、多糖類、 少糖類等の糖類、各種脂質、並びにこれらの複合体 (糖タンパク質、糖脂質、リポタ ンパク質等)を例示することができる。また、細胞自体を固定ィ匕することも可能であり、 細胞自体も本願発明で言う「生体関連物質」に包含される。さらに、補酵素、抗原ェ ピトープ、ハプテンのような低分子化合物も、酵素や抗体のような生体高分子と特異 的に相互作用するので本願発明で言う「生体関連物質」に包含される。これらの生体 関連物質は、そのまま上記炭素層に結合することもできるし、生体関連物質をプラス チックビーズ等の他の担体上に担持した状態で上記炭素層に結合することもできる。
[0014] 炭素層上への生体関連物質の固定化は、上記した活性基を介して周知の方法に より行なうことができる。例えば、活性基がアミノ基である場合、下記実施例に詳述す るように、アミノ基をブロモ酢酸とカルポジイミドにより相当する無水物とし、ァミノ基と 反応させて表面をブロモアセチル化し、っ 、でペプチド等の生体関連物質中のスル フィドリル基と反応させることにより、固定ィ匕することができる。あるいは、ダルタルアル デヒドを介して生体関連分子中のアミノ基と反応させて固定ィ匕できる。活性基がアル デヒド基の場合には、固定ィ匕したい生体分子のァミノ基と共有結合で固定ィ匕できる。 活性基がカルボキシル基の場合には、 N—ヒドロキシスクシンイミドとエステルを形成 し生体関連物質のァミノ基と結合できる。活性基がスルフヒドリル基の場合には、生体 関連分子のアミノ基を選択的にプロモアセチルイ匕することにより固定ィ匕できる。あるい は同じスルフイドリル基とジスルフイドを介して固定化できる。さらに、スルフイドリル基 は固定ィ匕する位置のアミノ基を選択的にマレイミド化 (たとえば N— 6マレイミドカプロ ン酸とアミノ基とを縮合させる）して反応させることで固定ィ匕できる。活性基がエポキシ 基の場合には、同様にマレイミドのついた生体関連物質と反応することにより固定ィ匕 することができる。
[0015] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0016] ノィォチップ用基板の製造
板厚 1.2mmの高純度 A卜 Mg合金板（Mg含有量 4重量％)を 26x76mm角にプレスで 打ち抜いた後に、 340°Cの雰囲気下で複数枚を積み重ねて加圧焼鈍を行い、歪みを 取り去ると共に平坦度を 5 m以下にした。その後、端面とチャンファの加工 (具体的 には、角度 45° 、 a寸法 0.2mm)を行い、 25x75mmの平板を作製した。次いで、スポン ジ砥石を貼ったスピードファム社製の両面研削機 16Bを用いて研削加工を行 、、板 厚 0.98mm、平行度 1 μ m以下とした。続いて、この平板に順に脱脂、エッチング、酸活 性処理、ジンケート処理を施した。具体的には、上村製アルカリ脱脂液 AD-68F(50 °C)に 5分間、硫酸'リン酸系エッチング液 AD-101F (80°C)に 2分間、硝酸活性液 (20 °C)に 1分間、ジンケート液 AD-301F3X (20°C)に 30秒間、順次、浸セキ処理を行って 前処理を施した。さらにその後に、メルテック社製無電解 NiP液 NI-422 (90°C)に 2時 間、浸セキして両面に各 12 m厚のめっき膜を形成した。更に、これをスピードファム 社製の両面研磨機 16Bにコロイダルシリカ砥粒を用いて両面を各 2 m研磨し、超平 滑基板とした。基板は板厚 1.00mm、表面粗さ Raが 0.35nmであった。なお、平坦度、 平行度及び Raは、それぞれ、溝尻製平坦時計 FT_50LD、ランクテーラーホブソン製 真円度測定機タリロンド、ランクテーラーホブソン製触針式粗さ計タリステップを用い て測定した。
[0017] 次に、徳田製作所社製高周波スパッタ装置 CFS-8EPを用いて、片面にァモルファ スカーボンを 40nm厚つけた。具体的には、 Ar雰囲気 1.0Pa、投入進行波電力 (Pl)lkW 、反射波電力 (Pr)20Wの条件で 5分間スパッタした。次にこのアモルファスカーボン層 に活性基を付与した。活性基の付与は次の方法で行った。まず、合成石英の窓を持 つステンレス製容器内に基板をセットした後に大気雰囲気下で波長 185應を 30%強度 、波長 254nmを 100%強度の比率を持つ紫外線 (ランプ出力 HOW)を 3cm離れた位置 で照射して基板表面のオゾン処理を行った。次に、排気の後に塩素を導入し 13Pa塩 素雰囲気下で塩素処理 (25°C、 5分間）を行い、更に排気の後にアンモニアを導入し 13Paアンモニア雰囲気下でアミノ化処理 (25°C、 5分間）を行った。この基板のアミノ基 量は 4.1 應 ol/両面であった。なお、アミノ基量は、基板表面を塩酸で処理した後に 残存する塩酸を水酸化ナトリウム水溶液で逆滴定する方法 (特願 2005— 069554) により測定した。
実施例 2
[0018] ノィォチップの製造及びそれを用いた測定
バイオチップに固定ィ匕するペプチドとして、次の配列を有する蛍光標識ペプチドを ィ匕学合成した。 Ac— Cys— Gly— Lys(FAM)— Gly— Leu— Lys— Lys— Leu— Leu— Lys— Leu— Leu— Lys— Lys— Leu— Leu— Lys— Leu— Lys(TAMRA)— Gly— NH
2
ここで、 FAM及び TAMRAは、いずれも蛍光色素である。 FAMを光励起すると、 FAM と TAMRA間の距離に応じて、 FAMの励起エネルギーが TAMRAに移動し、 TAMRA の蛍光が発する（蛍光共鳴エネルギー移動、 FRET、蛍光という)。タンパク質が結合 するとペプチドのへリックス構造が固定され、 FRET蛍光が増大する。 FRETは励起状 態にある供与体分子 (この場合 FAM)から基底状態にある受容体分子 (この場合 TA MRA)へのエネルギー移動により受容体からの蛍光が観測される現象である。このべ プチドは、タンパク質であるカルモジュリン (CaM)と特異的に結合することが知られて いるが、結合すると FAMと TAMRAの距離が小さくなる。 CaMの量が多いほど測定され る TAMRAからの蛍光強度が大きくなり結合の定量が可能である。
[0019] 上記標識ペプチドを 60%ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解し、 2 μ Μの濃度とした。
一方、実施例 1で作製した基板上のアミノ基をプロモアセチルイ匕した。これは具体的 には次のようにして行なった。ブロモ酢酸（BrAcOH、東京化成 Mw=138.95, 2.00 m mol, 278 mg)、ジイソプロピルカルボジイミド （DIC) (Ardrich Mw=126.20, 1.00 mm ol, 126 mg)を Nメチルピロリドン（NMP) (3.33 ml)に溶解し室温で 60分間ゆっくりしんと うし、ブロモ酢酸無水物を形成させた。えられた混合物を超純水 (Milli Q水（商品名） )で約 10 mMに希釈して約 100mlの溶液とし、当該アミノ化基板に加え、室温で 2時間 浸し、時々軽くしんとうし、ブロモ化した。得られた基板を超純水 (Milli Q水（商品名）） で洗浄し、窒素で乾燥させた。次に、上記標識ペプチド溶液を基板上にスポットして 該標識ペプチドを、上記プロモアセチルイ匕したァミノ基と反応させて結合させ、基板 上に固定化した。スポットは TeleChem International社（米国カリフォルニア）製の Spo tBot装置を用い、同じく TeleChem International社のマイクロスポッティングピンを使 用して実施した。
[0020] このようにして作製した標識ペプチド固定ィ匕基板に、異なる量の CaMを含む溶液 (C aMを 100 Mの塩ィ匕カルシウム溶液に溶解した）を塗布し、洗浄後、蛍光をスキャナ 一 (日立ソフトウェアエンジニアリング社製 CRBIO lie)を用いて測定した。
[0021] 結果を図 1に示す。図 1に示されるように、測定された蛍光強度は、基板に添加した CaMの量に依存して増大しており、本発明のバイオチップにより、チップに固定化さ れた生体関連物質と特異的に反応する物質を定量できることが明らかになった。

Claims

請求の範囲
[1] 金属製の基板本体と、該基板上に積層された、活性基を有する炭素層とを具備す るバイオチップ用基板。
[2] 前記金属が、アルミニウム、チタン及びステンレススチール並びにこれらの少なくと も一種を含む合金力 成る群より選ばれる金属である請求項 1記載の基板。
[3] 前記金属がアルミニウム又はその合金であり、前記基板と前記炭素層との間にめつ き層又は該金属の酸ィ匕物層が設けられている請求項 2記載の基板。
[4] 前記活性基が、前記炭素に共有結合された、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル 基、スルフヒドリル基若しくはエポキシ基又は前記炭素層に非共有結合的に結合され たポリリジンである請求項 1な 、し 3の!、ずれか 1項に記載の基板。
[5] 前記炭素層が、グラフアイト、ダイヤモンド、ダイヤモンドライク炭素又はアモルファス 炭素から成る請求項 1な!、し 4の 、ずれか 1項に記載の基板。
[6] 請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の基板上に、生体関連物質を固定化した バイオチップ。
[7] 請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載のバイオチップ用基板を準備する工程と、 該基板上に、生体関連物質を固定化する工程とを含む、バイオチップの作製方法。
[8] 請求項 1な 、し 5の 、ずれか 1項に記載の基板の、ノィォチップ用基板製造のため の使用。
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