KR20110039688A

KR20110039688A - 표면증강 라만산란을 이용한 생화학 물질의 검출 방법

Info

Publication number: KR20110039688A
Application number: KR1020090096643A
Authority: KR
Inventors: 김봉수; 강태준; 윤일선; 이상엽; 유승민
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2009-10-12
Filing date: 2009-10-12
Publication date: 2011-04-20
Also published as: US20110165586A1; JP2011081001A; EP2320216A2; KR101059896B1

Abstract

본 발명은 분석대상이 포함하는 생화학 물질의 존재 또는 함량을 검출하기 위한 표면 증강 라만 산란을 이용한 생화학 물질 검출 방법에 관한 것으로, 상세하게 단결정체의 나노와이어 표면에 물리적으로 서로 분리된 다수개의 나노 입자가 결합하여 형성된 다수개의 핫 스팟에 의해 고감도, 고재현성, 고신뢰도, 고정밀도를 가지며, 멀티플렉스 검출이 가능한 생화학 물질 검출 방법에 관한 것이다.

표면 증강 라만 산란, 귀금속, 나노와이어, 나노입자, DNA, 멀티플렉스

Description

표면증강 라만산란을 이용한 생화학 물질의 검출 방법{Detection Method of Bio-Chemical Material Using Surface-Enhanced Raman Scattering}

유전자와 단백질에 대한 연구는 병의 진단을 예측할 수 있는 새로운 생물학적표지(biomarker) 유추에 기회를 제공하였다. 특히 암과 같은 질병은 발병 초기에 정확한 진단을 통해서 병의 완치가 가능하며, 재발을 막을 수 있는 가능성을 보여준다. 그래서 이와 같은 항원 항체 반응에 의한 생물학적표지물의 조기 검출을 위한 진단용 센서개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 센서는 의료진단 이외에도 보건, 환경, 군사, 식품 등의 다양한 분야에 적용이 가능하여 매우 다양한 형태의 연구가 진행 중이다.

미량 항원의 검출을 위해서는 광학적인 장치를 사용하여 항원의 유무를 알아보는 방법들이 있는데, 시간과 비용 및 노력의 소요가 비교적 많은 어려움을 소유하였음에도 불구하고 현재까지 가장 널리 사용되는 방법이다. 최근에는, 항원의 유무에 따라서 흡수되는 빛의 파장이 달라지는 것을 이용한 방법(Chou et al., (2004) Biosens. Bioelectron. 19, 999-1005)과 측정하고자 하는 항원의 유무에 따라서 항원과 상보 결합을 할 수 있는 표면을 가진 나노 입자들의 변화를 통해서 흡수되는 빛의 파장이 달라지는 방법(Alivisatos et al., (2004) Nat. Biotechnol. 22, 47-52, Nam et al., (2003) Science. 301, 1884-1886; 미국특허 제 6,974,669) 등이 보고되었다.

SERS(Surface-Enhanced Raman Scattering, 이하 SERS) 분광법은 금, 은 등의 금속 나노구조 표면에 분자가 흡착될 때 라만산란의 세기가 급격히 10⁶ ~ 10⁸ 배 이상 증가되는 현상을 이용한 분광법이다. 현재 아주 빠른 속도로 발전하고 있는 나노 기술과 결합하여 단 하나의 분자를 직접 측정할 수 있는 고감도의 기술로 발전가능하며, 특히 메디컬 센서로서 긴요하게 쓰일 수 있을 것으로 많은 기대를 받고 있다.

이러한 SERS 센서는 분자가 흡착했을 때 저항이 변하는 전기적 나노센서에 비하여 커다란 기술적 우위에 있는데 그 까닭은 저항센서는 측정값이 스칼라인데 비해 SERS 센서는 벡터량의 데이터인 전체의 스펙트럼을 얻으므로 한 번의 측정으로 획득하는 정보량이 훨씬 크기 때문이다.

Kneipp과 Nie 등은 응집된 나노입자를 이용하여 나노입자에 붙어있는 분자들을 단분자 수준에서 SERS 측정이 가능하다는 것을 처음으로 보고하였다. 이후 다양한 나노 구조(나노입자, 나노 껍질, 나노선)들을 이용한 SERS 증강 현상에 대한 연구들이 보고되었다. 이러한 고감도의 SERS 현상을 바이오 센서 개발에 이용하기 위하여 Mirkin 연구팀은 최근 DNA와 결합된 나노입자를 이용한 고감도 DNA 분석에 성공하였다.

고감도 DNA 분석과 더불어 현재 SERS 센서를 이용하여 알쯔하이머 병 혹은 당뇨병 등을 비롯한 다양한 질병의 초기 진단을 수행하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

즉, SERS 현상은 라만 분광법이 제공하였던 분자의 진동 상태, 혹은 분자 구조에 대한 정보를 직접 제공한다는 면에서 레이저 형광 분석법과 같은 기존의 측정 기술에 비하여 고선택성 및 고정보성을 갖는 측정 기술이라고 할 수 있으며, 초고감도의 화학적/생물학적/생화학적 분석을 위한 강력한 분석방법으로 인정받고 있다.

이러한 장점에도 불구하고 SERS 현상은 ①메커니즘이 완벽하게 이해되지 않았을 뿐 아니라 ②정확하게 구조적으로 정의되어 있는 나노 물질 합성 및 제어의 어려움과 ③스펙트럼을 측정할 때 사용되는 빛의 파장, 편광 방향에 따른 증강효율의 변화 등으로 인해 재현성 및 신뢰성 측면에서 해결해야할 문제가 많으며, 이는 나노-바이오센서의 개발 및 상용화를 비롯한 SERS 현상의 응용에 커다란 숙제로 남겨져 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 구조적으로 정확하게 정의되어 있는 나노 물질(well-defined nanostructure)의 광학적 성질에 대한 이해와 이를 이용하여 SERS 현상을 정확하게 제어하기 위한 연구의 필요성이 몹시 커지고 있는 상황이다.

Moskovits, Halas, van Duyne의 연구팀은 최근 정확하게 정의된 다양한 나노 구조를 이용하여 SERS 증강을 제어 및 최적화 할 수 있음을 보고하였고, Moskovits 팀과 Yang 팀은 금속 나노선의 군집체를 이용하여 SERS 증강을 조절할 수 있음을 보고하였으며, 2006년에는 Moerner의 연구팀이 전자빔 리소그라피를 이용하여 인공적인 SERS 증강 구조인 나노 나비넥타이를 만드는데 성공하였다.

현재 나노 입자를 이용한 SERS 센서가 가장 일반적으로 연구되고 있으며, Binger, Bauer등에 의해 기 제안된 SERS 기반 구조는 평탄한 금속 표면 상의 금속 섬 필름(이하, MIF)으로 이루어진 옵티컬 구조이다. MIF는 랜덤 2차원 어레이의 금속 입자로 이루어지고, 최대 크기 치수는 각각 수 nm이다. 상기의 구조에서는 금속 입자의 형상이 다양하고, 그 배열이 확률에 의한 랜덤 구조를 가지므로 규정된 구조를 가질 수 없어 SERS 센서의 재현성 및 정확성을 획득하기 어려우며 금속 입자의 형상의 다양함에 기인하여 균질한 산란 강도를 얻을 수 없는 단점이 있다.

상기의 MIF 구조를 일 예로 SERS 센서의 문제점을 기술하였으나, 이는 금속 나노 입자를 이용한 SERS 센서의 일반적인 문제로, 금속 입자의 형상 및 금속 표면의 파라미터의 제어 불능, 5nm 미만으로의 금속 입자 크기의 본질적인 제한에 의한 규정되고 확립된 구조(well-defined structure)의 어려움이 난제로 남아있는 현실이다.

금속 입자가 아닌 금속 나노와이어, 특히 Ag 나노와이어를 이용하여 SERS 센서를 제조하고자 하는 연구 또한 진행되고 있다.

Tao 등(Nano. Lett. 2003, 3, 1229)은 Ag 나노와이어를 Langmuir-Blodgett법을 이용하여 Si 웨이퍼 상 다량의 Ag 나노와이어로 이루어진 단층(monolayer)을 제작하고 이를 이용하여 SERS 측정을 하였다. 비록 Tao등이 제안한 센서의 구조 및 제작 방법이 Ag 나노와이어를 이용하고, 단층을 구성하는 Ag 나노와이어의 장축이 어느 정도 정렬된 방향을 가졌음에도 재현성있는 SERS 결과를 얻을 수 없는 한계가 있었다.

Jeong 등(J. Phys. Chem. B 2004, 108, 12724)은 주형체(template)를 이용하여 Ag 나노와이어의 플랫 어레이(flat array, rafts)를 합성하였다. 한 방향으로 정렬되어 있는 Ag 나노와이어 rafts를 이용하여 SERS 현상을 관찰하였으며 나노와이어의 길이 방향과 레이저의 편광 방향의 차이에 따라 SERS 신호가 변하는 것을 보여 주고 있다. Jeong 등은 실험적으로 레이저의 편광 방향 및 두 나노와이어 사이의 작용에 의한 SERS 현상을 측정하였으나, 플랫 어레이 구조로 다량의 Ag 나노와이어가 SERS에 참여하고, 상기 Ag 나노와이어의 제조방법 상 고형상, 고품질의 Ag 나노와이어를 얻을 수 없으며, 상기 레이저 편광 방향 및 두 나노와이어 사이의 작용에 의한 SERS 현상이 정밀히 제어되기 어려운 단점이 있다.

Aroca 등(Anal. Chem. 2005, 77, 378)은 액상에서 합성한 Ag 나노와이어를 유리 기판에 다량으로 올려서 SERS 기판으로 활용하여 측정하였으나, 나노와이어 외에 다량의 입자들이 존재하며 일정한 배열을 가지고 있지 않다.

Schneider 등(J. Appl. Phys. 2005, 97, 024308)과 Lee 등 (J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2200)은 주형체를 이용하여 Ag 나노와이어 어레이(array)를 제작하고, 주형체를 제거하지 않은 상태와 에칭을 통해 주형체를 제거하면서 SERS 측정을 수행하였고 주형체를 제거함에 따라서 SERS 신호가 늘어나는 것을 보여 주고 있다.

Proke 등(Appl. Phys. Lett., 2007, 90, 093105)은 ZnO와 Ga₂O₃ 나노와이어를 합성한 후 Ag를 코팅 하여 SERS 측정 하였다. 이때 SERS가 발생하는 부분의 구조는 합성된 ZnO와 Ga₂O₃ 나노와이어의 형상에 의해 결정되는데, Ga₂O₃ 나노와이어의 경우 합성 자체가 매우 엉켜 있는 상태로 생기고, ZnO는 비교적 엉켜 있지 않은 상태로 합성되며, 엉켜 있는 구조의 Ga₂O₃ 나노와이어를 이용했을 때 더 큰 SERS 신호를 얻을 수 있음을 보여 준다.

Jeong, Proke, Schneider, Lee 및 금속 입자의 dimer를 통해 보고된 바 있는 SERS 신호의 증강은 Brus와 Kall에 의해 제안된 고립된 금속입자가 아닌 근접해 (1-5 nm) 있는 두 개 이상의 나노 입자 간에 형성되는 매우 강한 전자기장 (hot spot or interstitial field)에 의한 SERS 증강 이론을 지지하는 결과들이며, 전자기적인 이론계산에 따르면 상기 핫 스팟(hot spot)에 의해 10¹² 정도의 SERS 증강이 예측된다.

그러나, 상기와 같은 나노와이어를 이용한 SERS 용 광센서의 구조 또한 금속 나노입자를 이용한 광센서와 마찬가지로 나노와이어의 형상과 품질의 제어에 어려 움이 있으며, 제조된 나노와이어의 물리적인 구조 또한 정확하게 규정되지 않고, SERS 현상에 필수적인 핫 스팟의 발생이 정확하게 제어되지 않는다는 점에서 재현성, 신뢰성이 낮고 제어 가능한 측정이 어려운 단점이 있으며, 이를 이용한 센서 개발에 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 특히 나노입자 응집체의 경우 응집되는 정도에 따라 핫 스팟이 생성되는 위치와 핫 스팟의 세기가 변할 수 있으며, 이는 측정되는 SERS 신호 재현성 및 제어에 큰 문제가 됨이 알려져 있다.

앞서 상술한 바와 같이 van Duyne, Halas등 같은 선두 연구팀은 고유한 나노 시스템(nanopattern, nanoshell)을 개발하고 시스템의 표면 플라즈몬(surface plasmon) 특성을 이용하여 SERS 현상의 재현성을 향상하고 제어하는 연구를 진행하였으며, 이를 이용하여 현재 바이오 센서 개발을 위한 연구를 진행 중에 있으나, 실질적으로 제조가 간편하며, 고순도/고품질/고형상의 나노와이어를 이용하고, 기판상의 나노와이어의 개별 위치 및 구조가 조절되고 핫 스팟의 발생이 정확히 제어되는 SERS 광센서의 개발은 본 출원인이 제안한 기술(대한민국 등록특허 제0892629)을 제외하고 아직까지 전무한 실정이다.

본 출원인은 표면 및 결정 상태가 정확하게 정의되어 있는 기상 합성된 나노와이어와 나노 파티클의 하이브리드 구조를 이용하여 생체 추출물 및 단백질, DNA와 같은 바이오분자의 SERS 신호의 증강과 측정의 재현성, 민감도 및 신뢰도 향상을 위한 연구를 진행한 결과 본 특허를 출원하기에 이르렀다.

하이브리드 금속-금속 나노구조는 광학적 신호를 이용한 효율적인 바이오/화학 센서 개발에 있어서 중요한 역할을 할 수 있는데, 왜냐하면 그들이 나노구조들 틈 안에서 국소 표면 플라스몬 공명(LSPR; Localized Surface Plasmon Resonance) 커플링에 의하여 집중된 전자기장 영역인 "핫 스팟"(hot spot)을 제공하기 때문이다. 다양한 광학적 검출 방법 중에서, 표면 증강 라만 산란(SERS; Surface-Enhanced Raman Scattering, 이하 SERS)은 단 분자 검출의 고 감도를 갖는 매력적인 기술이다. 더욱이, SERS는 다른 검출 방법에 비하여 고 선택성을 제공하는데 이는 라만 스펙트럼이 분석물의 검출에 사용될 수 있는 특정 화학 작용기에 대한 신호를 제공하기 때문이다. 이러한 SERS의 장점으로 인하여, 이 현상의 발견 이후부터 다양한 화학물질의 검출과 DNA와 단백질 같은 생 분자의 확인을 위한 분석 도구로 널리 연구되어왔다.

귀금속 나노파티클(나노입자; Nano Particles,)과 나노선(나노와이어; Na나노입자 Wire)은 간단하게 합성할 수 있기 때문에, SERS-활성 구조(SERS-Active Structure)로써 큰 관심을 끄는 두 가지 중요한 기본 나노구조이다.

나노파티클(나노입자) 이합체, 집합체, 어셈블리, 그리고 나노쉘을 포함한 나노파티클을 기반으로 한 많은 나노구조가 제시되었다. 또한, SNOF(SNOF; Single-Nanowire-On-a-Film), 나노와이어 쌍, 정렬된 나노와이어 묶음, 나노와이어의 랭뮤어-브로짓 필름(Langmuir-Blodgett film), 그리고 석판법으로 제작된 나노와이어 정렬과 같은 고증강성과 방향 탐지성(directional response)을 모두 갖는 1 차원 SERS-활성 구조도 연구되었다.

두 가지 다른 나노구조를 결합시킨 하이브리드 나노구조는 나노와이어와 나노파티클의 장점을 함께 갖는 효과적인 SERS-활성 구조가 될 수 있다. 많은 연구 그룹은 나노와이어-나노파티클 구조가 라만 신호의 고 증강성, 편광 의존성, 그리고 원격 여기성을 가짐을 보고 하였다. 그러므로, 단일 하이브리드 나노구조는 장래의 SERS 검출/이미징 도구로 응용될 수 있을 것이다.

하지만, 잘 정의된 하이브리드 나노구조를 손쉽게 제작하는 것과 생물학적 연구로의 응용이 실제 SERS-활성 구조의 개발에 있어 과제로 남아 있으며, 나노와이어-나노파티클의 SERS-활성 구조에서 생화학 물질을 검출한 결과는 전무한 실정이다.

한편, 낮은 가격에 적은 샘플양으로부터 최대의 정보를 얻을 수 있는 멀티플렉스(Multiplex)하고 민감하면서 특정한 DNA만을 검출하는 기술은 유전자 프로파일링(gene profiling), 약물 스크리닝(drug screening), 질병 진단과 같은 바이오메디컬 연구분야에서 그 필요성이 크게 대두되고 있다.

그러므로, 간단하고 믿을 수 있으며 빠르게 다수의 DNAs를 한 번의 분석으로 검출하는 방법이 형광, SPR, 전기적 신호, 그리고 질량 변화의 측정과 같은 다양한 검출 방법을 이용해 개발되어 왔다.

다양한 DNA 검출 방법 중에서도, 형광은 멀티플렉스 DNA 검출을 위해 일반적으로 선호되는 기술이다. 하지만, SERS 또한 무표지 멀티플렉스 DNA 검출을 위한 매력적인 방법으로 생각되어 왔는데, 이는 단 분자 수준의 감도, SERS 스펙트라의 분자 특이성, 단일 여기 소스(excitation source)의 유효성, 그리고 습도, 산소, 또는 다른 물질에 의한 quenching이 없는 점 때문이다.

이러한 주목할 만한 장점들 때문에 많은 독창적인 SERS 센싱 플랫폼(sensing platforms)이 개발되고 있다. 하지만, 나노구조에 의존하는 SERS 신호 재현성 및 한 번에 적은 양의 샘플양으로 다양한 타겟 DNA를 검출하는 것이 실제 멀티플렉스 DNA 검출을 위한 SERS 센서의 개발에 있어서 여전히 넘어야 할 과제로 남아 있다.

본 발명은 나노와이어 및 나노와이어에 자기조립된 나노입자를 포함하여 구성된 표면 증강 라만 산란(SERS)-활성 구조를 이용한 생화학 물질 검출 방법을 제공하며, 단일한 측정을 통해 다양한 생화학 물질의 검출이 가능한 멀티플렉스(multiplex) 방법을 제공하는 것이며, 잘 정의된(well-defined) 물리적 구조 및 잘 정의된(well-defined) 핫스팟 구조를 가져 재현성 있고 신뢰도 높은 결과를 얻을 수 있는 생화학 물질 검출 방법을 제공하는 것이며, 측정시 잘 정의된 다수개의 핫 스팟에 의해 증강된 표면 증강 라만 산란 스펙트럼을 얻을 수 있어 매우 민감도가 높은 생화학 물질 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 생화학 물질 검출 방법은 표면 증강 라만 산란(SERS; Surface-Enhanced Raman Scattering)을 이용하여 분석대상이 포함하는 생화학 물질의 존재 또는 함량을 검출하기 위한 방법으로, a) 제1수용체가 형성된 단결정체 귀 금속 나노와이어 및 제2수용체가 형성된 귀금속 나노입자를 분석대상 물질과 접촉시켜, 상기 분석대상 물질과 상기 제1수용체의 결합; 및 상기 분석대상 물질과 상기 제2수용체의 결합;에 의해 상기 분석대상 물질을 중심으로 상기 귀금속 나노와이어에 상기 귀금속 나노입자를 결합시키는 단계 및 b) 상기 귀금속 나노와이어를 초점으로 상기 귀금속 나노입자가 결합된 귀금속 나노와이어에 편광된 레이저 빔을 조사하여 표면 증강 라만 산란 스펙트럼을 얻는 단계를 포함하여 수행되는 특징이 있다.

상기 검출 대상인 상기 생화학 물질은 세포 구성물질, 유전물질, 탄소화합물, 생물체의 대사, 물질 합성, 물질 수송 또는 신호전달 과정에 영향을 미치는 유기물을 포함한다.

상세하게, 상기 생화학 물질은 고분자 유기물, 유기금속화합물, 펩타이드, 탄수화물, 단백질, 단백질 복합체, 지질, 대사체, 항원, 항체, 효소, 기질, 아미노산, 압타머(Aptamer), 당, 핵산, 핵산 단편, PNA(Peptide Nucleic Acid), 세포 추출물, 또는 이들의 조합을 포함한다.

상기 귀금속 나노와이어 또는 귀금속 나노입자와 상기 분석대상 물질간의 결합, 상세하게 상기 귀금속 나노와이어 또는 귀금속 나노입자와 상기 분석대상 물질에 함유된 생화학 물질간의 결합은 효소-기질, 항원-항체, 단백질-단백질, DNA간의 상보적 결합, 또는 비오틴(biotin)-아비딘(avidin) 결합에 의한 특징이 있다.

특징적으로, 상기 귀금속 나노와이어의 장축 길이는 1㎛이상인 특징이 있으며, 상기 귀금속 나노와이어의 장단축비(aspect ratio, 나노와이어 장축길이/단축 길이)는 5 내지 5000인 특징이 있으며, 상기 귀금속 나노 입자의 평균 입자크기는 5nm 내지 20nm 인 특징이 있다.

상기 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 상기 귀금속 나노와이어 표면에 결합된 상기 귀금속 나노입자의 수인 결합 밀도는 상기 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 존재하는 핫 스팟(hot spot)의 수인 핫 스팟 밀도와 동일한 특징이 있다.

상세하게, 상기 효소-기질, 항원-항체, 단백질-단백질, DNA간의 상보적 결합, 또는 비오틴(biotin)-아비딘(avidin) 결합에 의해 검출대상인 생화학물질을 중심으로 귀금속 나노와이어 표면에 단일한 귀금속 나노 입자가 각각 물리적으로 서로 분리되어 귀금속 나노와이어에 자기조립되는 특징이 있으며, 이에 따라 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 결합된 귀금속 나노입자의 수가 곧 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 존재하는 핫 스팟(hot spot)의 수인 핫 스팟 밀도가 되는 특징이 있다.

상기 분석대상 물질은 아비딘(avidin)을 포함하며, 상기 제1수용체 및 상기 제2수용체는 각각 비오틴(biotin)을 포함하며, 상기 귀금속 나노입자는 상기 귀금속 나노와이어 및 상기 귀금속 나노입자 각각에 형성된 비오틴(biotin)이 아비딘(avidin)을 중심으로 결합한 비오틴-아비딘-비오틴의 결합에 의해 상기 귀금속 나노와이어 표면에 자기조립(self-assembled)된 특징이 있으며, 상기 아비딘은 검출대상인 생화학 물질과 특이적으로 결합한 아비딘을 포함한다.

바람직하게, 상기 제1수용체 및 상기 제2수용체가 각각 비오틴(biotin)을 포함하는 경우, 상기 귀금속 나노와이어 또는 상기 귀금속 나노입자가 N-(6-(비오틴 아미도)헥실)-3'-(2'-피리딜디티오)-프로피노아마이드 (N-(6-(Biotinamido)hexyl)-3'-(2'-pyridyldithio)-propionamide, 이하, EZ-Link Biotin-HPDP)로 개질되어 귀금속 나노와이어 또는 귀금속 나노입자에 비오틴이 형성된 특징이 있다.

상기 분석대상 물질은 타겟 DNA(target DNA)를 포함하며, 상기 제1수용체는 프루브 DNA(prove DNA)를 포함하며, 상기 제2수용체는 라만 다이(Raman dye)가 부착된 리포터 DNA(reporter DNA)를 포함하며, 상기 타겟 DNA와 상기 프루브 DNA의 상보적 결합 및 상기 타겟 DNA와 상기 리포터 DNA의 상보적결합에 의해 상기 귀금속 나노입자가 상기 귀금속 나노와이어 표면에 자기조립(self-assembled)된 특징이 있다.

특징적으로, 상기 타겟 DNA는 병원균의 DNA 및 병원균에 감염된 생체로부터 추출 분리된 병원균의 DNA를 포함한다.

상세하게, 상기 타겟 DNA는 상기 귀금속 나노와이어 표면에 형성된 프루브 DNA와 상보적으로 결합함과 동시에 상기 귀금속 나노입자 표면에 형성된 리포터 DNA와 상보적으로 결합하며, 상기 리포터 DNA에 부착되어 라만 신호의 민감도를 증가시키는 상기 라만 다이는 사용하는 레이저의 파장을 고려하여 선택하며, 일 예로, 633 nm He-Ne 레이저의 경우 라만 다이는 Cy5를 사용한다.

본 발명에 따른 생화학 물질 검출 방법은 물리적으로 분리되어 있으며 서로 다른 제1수용체가 형성된 둘 이상의 단결정체 귀금속 나노와이어 및 서로 다른 제2수용체가 형성된 귀금속 나노입자를 분석대상 물질과 접촉시켜, 귀금속 나노와이어 별로 서로 다른 생화학물질이 검출되는 특징이 있다.

특징적으로, 물리적으로 분리되어 있으며 서로 다른 프루브 DNA가 형성된 둘 이상의 단결정체 귀금속 나노와이어 및 서로 다른 리포터 DNA가 형성된 귀금속 나노입자를 분석대상 물질과 접촉시켜, 귀금속 나노와이어별로 서로 다른 타겟 DNA가 검출된다.

특징적으로, 물리적으로 분리되어 있으며 서로 다른 프루브 DNA가 형성된 N(N>1인 자연수)개 이상의 단결정체 귀금속 나노와이어 및 라만 다이가 부착된 리포터 DNA가 형성된 단일한 종류의 귀금속 나노입자를 1 내지 N개의 타겟 DNA를 함유하는 분석 대상 물질과 접촉시켜 귀금속 나노와이어 별로 서로 다른 타겟 DNA가 검출된다.

상술한 멀티플렉싱 검출에 있어, 상기 하나 이상의 귀금속 나노와이어는 기판상 위치 어드레싱에 의해 분별되는 특징이 있다.

상기 귀금속 나노와이어는 Au, Ag, Pt 또는 Pd 나노와이어이며, 상기 귀금속 나노입자는 귀금속 나노와이어와 동일 물질인 Au, Ag, Pt 또는 Pd 나노입자인 특징이 있다.

상기 표면 증강 라만 산란은 귀금속 나노와이어를 초점으로 갖는 편광된 레이저 빔이 단일한 귀금속 나노와이어의 장축 방향 중심에 조사되어 발생되는 특징이 있으며, 상기 귀금속 나노와이어의 장축과 상기 편광된 레이저 빔의 편광 방향이 이루는 각도 θ가 30 내지 150도 또는 210 내지 330도인 조건에서 발생되는 특징이 있다.

본 발명의 생화학 물질 검출 방법은 검출 자체를 위한 생화학 물질의 전처리가 필요하지 않으며, 생화학 물질 자체를 직접적으로 검출 가능한 특징이 있으며, 검출하려는 생화학 물질에 다른 표지를 인위적으로 붙이지 않아도 선택적으로 검출되는 무표지 선택 검출의 특징이 있으며, 검출하고자 하는 생화학 물질이 핫-스팟 영역에 고정되어 있어 극 미량의 물질 또한 검출 가능한 고감도 검출인 특징이 있으며, 단결정체이며 매우 큰 종횡비를 갖는 단일한 귀금속 나노와이어에 물리적으로 서로 분리된 나노입자가 균일하고 고 밀도로 귀금속 나노와이어에 자기조립된 나노와이어-나노입자 구조에 의해 매우 안정적이고 재현성 있는 SERS 스펙트럼을 얻을 수 있는 특징이 있으며, 단일한 귀금속나노와이어 및 귀금속 나노와이어에 자기조립된 나노입자가 단일한 센서로 작용하므로, 센서의 매우 높은 민감도, 안정성, 재현성을 가짐과 동시에 센서의 초소형화가 가능한 특징이 있으며, 핫스팟의 위치 및 밀도가 제어 가능한 특징이 있으며, 조절된 다수개의 핫 스팟에 의해 획기적으로 증진된 생화학 물질의 SERS 스펙트럼을 얻을 수 있는 특징이 있으며, 다수개의 귀금속나노와이어 각각에 서로 다른 생화학 물질과 결합하도록 수용체를 형성시켜 단시간 및 단일한 측정을 통해 높은 정확도 및 민감도로 다양한 검출대상 물질의 검출(multiplex platform)이 가능한 장점이 있다.

이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 생화학 물질 검출 방법을 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 또한 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

도 1은 본 발명에 따른 생화학 물질 검출 방법을 도시한 일 예로, 상세하게, 귀금속 단결정 나노와이어(100) 표면에 제1수용체(110)가 구비되며, 귀금속 나노입자(200) 표면에도 제2수용체(210)가 구비된 특징이 있으며, 상기 귀금속 단결정 나노와이어(100) 및 귀금속 나노입자(200)와 검출대상물질인 생화학물질(300)을 함유하는 분석대상과 접하여 상기 생화학물질(300)을 사이에 두고 상기 귀금속 나노입자(200)가 상기 귀금속 단결정 나노와이어(100)에 결합하게 된다.

상세하게, 상기 귀금속 단결정 나노와이어(100)의 표면에 구비된 제1수용체(110) 및 귀금속 나노입자(200) 표면에 구비된 제2수용체(210)가 분석대상에 함유된 검출대상물질인 생화학물질(300)과 각각 결합하여, 상기 귀금속 나노와이어(100) 표면에 귀금속 나노입자(200)가 자기조립(self-assembled)되며, 상기 귀금속 나노와이어(100)과 귀금속 나노입자(200)사이에 검출대상물질인 생화학물 질(300)이 고정되는 특징이 있다.

나노구조에 붙어 있는 분자(생화학물질)의 라만 신호 증강을 최대화하는 방법은 분자(생화학물질)를 본 발명과 같이 귀금속 나노와이어 및 귀금속 나노입자와 같은 정렬된 나노구조의 사이에 위치시켜, 크게 증가한 SERS 신호를 얻을 수 있으며, 이러한 정렬된 나노구조는 생화학물질과 나노와이어 및 나노 입자의 결합에 의하여 생성(turn on)되는 SERS-활성(SERS-active) 나노구조인 특징이 있다.

상기 귀금속 단결정 나노와이어(100)는 장단축비(aspect ratio, 나노와이어의 장축 길이/단축 지름)가 5 내지 5000인 특징이 있으며, 장축의 길이가 1㎛이상인 특징이 있으며, 상기 귀금속 단결정 나노와이어(100)는 둘 이상의 나노와이어가 서로 물리적으로 응집해 있는 나노와이어 응집체, 둘 이상의 나노와이어가 서로 물리적으로 결합해 있는 나노와이어의 결합체, 나노와이어가 동종 또는 이종의 물질에 부착된 복합체가 아닌 단일한 나노와이어(free standing single nanowire)인 특징이 있다.

이후, 상기 귀금속 나노와이어(100)를 초점으로 하고 상기 귀금속 나노입자(200)가 결합된 귀금속 나노와이어(100)에 편광된 레이저 빔을 조사하여 표면 증강 라만 산란 스펙트럼을 얻게 된다. 이때, 레이저빔이 조사되어 얻어지는 표면증강라만산란 스펙트럼은 단일한 귀금속나노와이어 및 다수개의 귀금속 나노입자에 의해 형성된 국소전자기장에 의해 증강된 결과인 특징이 있다.

상기 귀금속 나노입자(200)는 평균 입자크기가 5nm 내지 20nm인 특징이 있다. 이는, 상기 귀금속 나노입자(200)가 귀금속 나노와이어(100)에 결합하여 국소 표면 플라스몬 공명(LSPR; Localized Surface Plasmon Resonance) 커플링에 의하여 집중된 전자기장 영역인 핫 스팟(hot spot)을 형성함과 동시에 귀금속 나노와이어(100)에 고밀도의 핫스팟을 형성하기 위함이다.

도 1을 기반으로 상술한 본 발명의 검출 방법은 귀금속 나노와이어 표면에 구비된 제1수용체-검출대상물질-귀금속 나노입자 표면에 구비된 제2수용체의 결합에 의해 귀금속 나노와이어에 귀금속 나노입자가 자기조립되며, 귀금속 나노와이어가 고순도 고 결정성의 단결정체이며, 균일한 두께(단축 길이)와 큰 종횡비를 갖는 편평한 표면(거칠기가 매우 작은 표면)을 갖는 단일한 나노와이어임에 따라, 귀금속 나노와이어 표면에 고르게 귀금속 나노입자가 결합되며, 단일한 귀금속 나노입자와 귀금속 나노와이어에 의해 단일한 핫스팟이 형성되며, 귀금속 나노입자의 결합 밀도가 매우 높은 특징이 있다.

일 예로, 상기 제1수용체 및 제2수용체가 각각 비오틴을 포함하며, 상기 검출대상물질이 아비딘을 포함하는 경우, 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 결합된 귀금속 나노입자의 수인 결합밀도는 1500 내지 3500 (개/㎛²)이며, 상술한 본 발명의 특징에 의해 상기 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 결합된 귀금속 나노입자의 수인 결합 밀도는 상기 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 존재하는 핫 스팟(hot spot)의 수인 핫 스팟 밀도와 동일함에 따라 1500 내지 3500 (개/㎛²)의 핫 스팟 밀도를 갖게 된다.

상기 귀금속 나노와이어는 Au, Ag, Pt 또는 Pd 나노와이어인 특징이 있으며, 상기 귀금속 나노입자는 Au, Ag, Pt 또는 Pd 나노입자인 특징이 있으며, 바람직하게, 상기 귀금속 나노와이어와 상기 귀금속 나노입자는 동일한 귀금속 물질이다.

상세하게, SERS 불활성 기판에 상기 제1수용체가 형성된 귀금속 나노와이어를 위치시키고, 분석대상을 함유한 액상을 이용하여 상기 귀금속 나노와이어와 상기 분석대상을 접촉시킨 후, 제2수용체가 형성된 귀금속 나노입자 분산액을 분석대상과 접촉한 귀금속 나노와이어에 도포하거나 제2수용체가 형성된 귀금속 나노입자 분산액에 분석대상과 접촉한 귀금속 나노와이어(기판 포함)를 함침시킬 수 있다.

상세하게, 상기 제1수용체가 형성된 귀금속 나노와이어가 위치한 SERS 불활성 기판 자체가 상기 제2수용체가 형성된 귀금속 나노입자 분산액에 함침된 상태에서 분석대상이 상기 분산액에 첨가되어 분석대상과 귀금속나노와이어 및 귀금속 나노입자를 접촉시킬 수 있다.

상세하게, 상기 제1수용체가 형성된 귀금속 나노와이어가 위치한 SERS 불활성 기판 자체를 액상에 함침시킨 후, 분석대상 및 귀금속 나노입자 분산액을 상기 귀금속 나노와이어가 함침된 액상에 첨가(분석대상의 첨가 후 귀금속 나노입자 분산액의 첨가 또는 귀금속 나노입자 분산액의 첨가 후 분석대상의 첨가를 포함함)하여 분석대상과 귀금속나노와이어 및 귀금속 나노입자를 접촉시킬 수 있다.

이때, 상기 귀금속 나노와이어, 귀금속 나노입자 및 분석 대상과의 접촉은 미세유체관(micro fluidic capillary tube)을 포함하는 유체 이송을 위한 장치 내에서 수행될 수 있음은 물론이다.

상기 액상(귀금속 나노와이어 함침액, 귀금속 나노입자 분산액 또는 분석대 상을 함유하는 검출용액의 액상)은 상기 귀금속 나노와이어(100) 및 귀금속 나노입자(200)에 구비된 수용체 및 생화학 물질과 화학적으로 반응하지 않으며, 상기 귀금속 나노입자(200)를 용이하게 분산시키며, 귀금속 나노입자 및 생화학 물질의 유동을 가능하게 하는 유체이다.

이때, 생화학물질이 존재하지 않는 것을 제외하고 실제 측정시 사용된 액상과 동일한 액 및 측정 조건을 이용하여 얻어진 SERS 스펙트럼을 레퍼런스(reference)로 하여, 검출 대상과 접촉한 후 얻어진 SERS 스펙트럼을 분석할 수 있음은 물론이다.

나아가, 분석대상에 함유된 검출대상물질에 의해 귀금속 나노입자가 귀금속 나노와이어에 결합한 후, 다수개의 귀금속 나노입자가 결합된 귀금속 나노와이어를 액상과 분리하거나 세척한 후 편광된 레이저 빔을 조사하여 표면 증강 라만 산란 스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다.

이때, 상기 귀금속 나노입자(200)가 자기조립되는 귀금속 나노와이어(100)의 표면에 비특이적 결합으로 인한 단백질 등의 흡착 방지를 위한 단백질 흡착방지층이 구비될 수 있으며, 일 예로, 흡착방지층은 글리콜(glycol)계 화합물 등의 친수성 분자를 사용할 수 있다.

분석대상에 함유된 검출대상물질인 상기 생화학 물질은 귀금속 나노와이어(100)에 구비된 제1수용체(110)에 특이적으로 결합함과 동시에 상기 귀금속 나노입자(200)에 구비된 제2수용체(210)에 특이적으로 결합하는 물질, 즉 적어도 둘 이상의 결합능을 갖는 물질이다.

상기 생화학 물질과 상기 수용체(110, 또는 210)의 결합은 이온 결합, 공유 결합, 수소 결합, 배위 결합 또는 비공유 결합을 포함하며, 특징적으로 효소-기질, 항원-항체, 단백질-단백질, DNA간의 상보적 결합, 또는 비오틴-아비딘 결합이다.

특징적으로, 상기 제1수용체 및 제2수용체는 각각 비오틴을 포함하며, 상기 생화학 물질은 아비딘을 포함한다.

특징적으로 상기 제1수용체 및 제2수용체의 적어도 한 수용체는 라만 다이(Raman Dye) 부착된 DNA이다. 보다 특징적으로 생화학 물질은 타겟 DNA(target DNA)를 포함하며, 상기 제1수용체는 프루브 DNA(prove DNA)를 포함하며, 귀금속 나노입자에 형성되는 상기 제2수용체는 라만 다이(Raman dye)가 부착된 리포터 DNA(reporter DNA)를 포함한다.

특징적으로, 검출 대상인 상기 생화학 물질은 DNA이며, DNA 농도(M) 10^-11 내지 10^-8 에서 DNA 농도와 b) 단계의 상기 표면 증강 라만 산란 스펙트럼의 강도는 선형적으로 비례한다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 생화학 물질 검출 방법은 검출 대상인 생화학 물질(300)을 중심으로 귀금속 나노와이어(100)와 귀금속 나노입자(200)가 결합된 특징을 가지며, 검출 대상인 생화학 물질(300)에 의해 귀금속 나노입자(200)가 귀금속 나노와이어(100)에 자기조립되게 된다.

따라서, 검출 대상인 생화학 물질(300)의 유/무에 의해 귀금속 나노입자(200)와 귀금속 나노와이어(100)의 결합에 따른 핫 스팟의 생성 유/무가 결정되 며, 생화학 물질(300)의 농도에 따라 상기 핫 스팟의 표면 밀도가 결정되게 된다.

귀금속 나노입자(200)와 귀금속 나노와이어(100)의 결합 영역에 검출 대상인 생화학 물질(300)이 고정되며, 생화학 물질(300)의 농도에 의해 핫 스팟의 표면 밀도가 결정되므로, 귀금속 나노와이어(100)의 중심에 편광된 레이저 빔을 조사하고 표면 증강 라만 산란 스펙트럼을 얻어 이를 기반으로 검출 대상인 생화학 물질의 유/무, 생화학 물질의 종류 또는 생화학 물질의 농도를 분석한다.

상기 귀금속 나노와이어(100)에 구비된 제1수용체(110)는 상기 생화학 물질(300)의 결합능에 따라, 상기 귀금속 나노입자(200)에 구비된 수용체(210)와 동종 또는 이종의 수용체일 수 있다.

특징적으로, 도 2에 도시한 일 예와 같이 상기 귀금속 나노와이어(100)에 구비된 제1수용체(120) 및 상기 귀금속 나노입자(200)에 구비된 제2수용체(220)는 각각 비오틴을 포함하는 특징이 있으며, 상기 검출대상인 생화학 물질은 아비딘(400)과 생화학 물질(300)이 결합한 생화학 물질 복합체(500)인 특징이 있다.

상기 아비딘(400)과 제1수용체(120)의 비오틴이 결합하고, 동일한 아비딘(400)과 제2수용체(220)의 비오틴이 결합하여, 상기 생화학 물질 복합체(500)를 사이에 두고 상기 귀금속 나노입자(200)가 귀금속 나노와이어(100)에 결합하여 핫 스팟을 형성한다.

이때, 상술한 바와 같이 생화학 물질(500)의 유/무에 의해 귀금속 나노와이어 상 핫-스팟의 생성 유/무가 결정되며, 생화학 물질의 농도에 의해 귀금속 나노와이어 표면에 형성된 핫-스팟의 수가 결정되게 된다.

상세하게, 도 2는 도 1을 기반으로 상술한 본 발명에 따른 생화학 물질의 검출을 도시한 다른 예로, 제1수용체(120) 및 제2수용체(220)가 각각 비오틴(biotin)을 포함하며, 검출대상물질이 아비딘(avidin)(400) 또는 생화학물질(300)과 결합한 아비딘(avidin)인 생화학 물질 복합체(500)인 경우를 도시한 것이다.

단결정체의 단일한 귀금속 나노와이어(100) 및 귀금속 나노입자(200) 각각에 형성된 비오틴(biotin)이 아비딘(avidin)을 중심으로 결합한 비오틴-아비딘-비오틴의 결합에 의해 상기 귀금속 나노입자(200)가 생화학 물질 복합체(500)를 중심으로 핫 스팟이 생성되며, 이후, 상기 귀금속 나노와이어(100)를 초점으로 편광된 레이저 빔을 조사하여 SERS 스펙트럼을 얻어 이를 기반으로 생화학 물질의 유/무, 생화학 물질의 종류 또는 생화학 물질의 농도를 분석한다.

이때, 생화학 물질 복합체(500)를 중심으로 상기 귀금속 나노입자(200)가 귀금속 나노와이어(100)에 결합된 나노 구조체( 및 귀금속 나노와이어)는 물리적 지지를 위한 기판 상에 위치할 수 있으며, 나노 구조체( 및 귀금속 나노와이어)와 기판의 반-데어 발스 힘 또는 중력에 의해 기판상 고정될 수 있다.

상기 나노 구조체에 레이저 빔을 조사하게 되면, 상기 나노 구조체의 핫스팟에 의해 증강된 상기 생화학 물질(500)의 SERS 신호를 얻게 된다.

상기 귀금속 나노입자( 또는 귀금속 나노와이어) 표면에 구비되는 비오틴은 귀금속 나노입자( 또는 귀금속 나노와이어)의 표면 개질을 통해 형성될 수 있으며, 일 예로, 상기 귀금속 나노입자( 또는 귀금속 나노와이어)가 EZ-Link Biotin-HPDP로 개질되어 형성되는 것이 바람직하다.

도 3은 본 발명에 따른 생화학 물질 검출 방법에서, 물리적으로 분리되어 있으며 서로 다른 제1수용체(110(A), 110(B))가 형성된 둘 이상의 단결정체 귀금속 나노와이어(100(A), 100(B)) 및 서로 다른 제2수용체(210(A), 210(B))가 형성된 귀금속 나노입자(200(A), 200(B))를 분석대상 물질과 접촉시켜, 물리적으로 분리되어 SERS 기판상 위치하는 귀금속 나노와이어별로 서로 다른 생화학물질(310, 320)이 검출되는 멀티플렉스(multiplex) 검출의 일 예를 도시한 것이다.

도 3에 도시한 바와 같이, 상기 멀티플렉스 검출을 위해, 제1생화학물질(310)과 특이적으로 결합하는 제1수용체(110(A)가 형성된 귀금속 나노와이어 및 제1생화학물질(310)과 특이적으로 결합하는 제2수용체(210(A))가 형성된 귀금속 나노입자를 이용하여 제1생화학물질을 검출하고, 제2생화학물질(320)과 특이적으로 결합하는 제1수용체(110(B)가 형성된 귀금속 나노와이어 및 제2생화학물질(320)과 특이적으로 결합하는 제2수용체(210(B))가 형성된 귀금속 나노입자를 이용하여 제2생화학물질을 각각 검출한다. 이때, 도 3에는 2종류의 생화학물질을 한번에 서로 독립적으로 검출할 수 있는 예를 도시하였으나, N(N>1인 자연수)개의 서로 상이한 생화학물질을 단일한 테스트로 검출하기 위해, SERS 불활성 기판상 각각의 생화학물질과 특이적으로 결합하는 제1수용체가 형성된 N개의 귀금속 나노와이어 및 각각의 생화학물질과 특이적으로 결합하는 제2수용체가 형성된 N 종류(동일한 수용체가 형성된 귀금속 나노입자를 1 종류로 함)의 귀금속 나노입자를 이용하여 N개의 생화학물질에 대해 멀티플렉스 검출이 가능하다.

보다 중요하게, 무표지 DNA 멀티플렉스 검출을 위해, 상기 물리적으로 분리 된 둘 이상의 단결정체 귀금속 나노와이어의 제1수용체(110(A), 110(B))는 각각 서로 다른 프루브 DNA이며, 상기 귀금속 나노입자의 제2수용체(210(A), 210(B))는 서로 다른 리포터 DNA이며, 분석대상 물질은 서로 다른 타겟 DNA를 함유하며, 이를 통해 귀금속 나노와이어별로 서로 다른 타겟 DNA가 검출된다.

귀금속 나노와이어-귀금속 나노입자의 결합을 이용한 무표지 생화학 물질 검출

이하 제시되는 예는 단결정의 단일한 귀금속 나노와이어-귀금속 나노입자의 결합을 이용한 무표지 생화학 물질 검출로는 최초의 결과이다. 측정시 SERS 활성 금속으로 Au 나노와이어 및 Au 나노입자를 사용하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 귀금속 나노와이어는 본 출원인의 특허출원 10-2007-0065030, 10-2008-0036360, 10-2009-0035522에 공지된 방법을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.

상세하게, 상기 귀금속 나노와이어는 반응로의 전단부에 위치시킨 귀금속산화물, 귀금속물질 또는 할로겐화귀금속(noble metal halide)을 포함하는 선구물질과 반응로의 후단부에 위치시킨 반도체 또는 부도체 단결정 기판을 불활성 기체가 흐르는 분위기에서 열처리하여 상기 단결정 기판 상에 제조된 귀금속 단결정 나노와이어인 특징이 있다.

상기 제조방법에 따른 귀금속 단결정 나노와이어는 촉매를 사용하지 않고 단 순히 금속산화물, 귀금속물질 또는 할로겐화귀금속을 선구물질로 사용하여 단결정 기판상에 귀금속 나노와이어가 형성되며, 기상의 물질이동경로를 통해 귀금속 단결정 나노와이어가 형성되므로, 불순물을 포함하지 않는 고순도, 고품질의 나노와이어인 장점이 있다.

또한 상기 반응로 전단부 및 반응로 후단부의 온도를 각각 조절하고, 상기 불활성 기체의 흐름 정도와 상기 열처리 시 이용되는 열처리 관내 압력을 조절하여 최종적으로 단결정 기판상부에서 금속물질의 핵생성 구동력, 성장 구동력, 핵생성 속도 및 성장 속도를 조절하는 방법이므로, 귀금속 단결정 나노와이어의 크기 및 기판상의 밀도등이 제어 가능하고 재현가능하며, 결함이 없고 결정성이 좋은 고품질의 귀금속 단결정 나노와이어를 제조할 수 있게 된다.

상술한 기상 이송법을 이용하여 제조되어 본 발명의 바이오센서에 구비되는 상기 귀금속 단결정 나노와이어는 트윈, 적층결함등의 면결함이 없는 단결정체인 특징이 있으며, 장단축비(aspect ratio, 나노와이어의 장축 길이/단축 지름)가 5 내지 5000인 특징이 있으며, 장축의 길이가 1㎛이상인 특징이 있으며, 상기 귀금속 단결정 나노와이어는 둘 이상의 나노와이어가 서로 물리적으로 응집해 있는 나노와이어 응집체, 둘 이상의 나노와이어가 서로 물리적으로 결합해 있는 나노와이어의 결합체, 나노와이어가 동종 또는 이종의 물질에 부착된 복합체가 아닌 단일한 귀금속 나노와이어(free standing single nanowire)인 특징이 있으며, 두께가 균일하고 원자수준에서 매끈한 표면을 갖는 고형상의 나노와이어인 특징이 있다.

Au 나노와이어

반응로에서 기상이송법을 이용하여 Au 단결정 나노와이어를 합성하였다.

상기 반응로는 전단부와 후단부로 구별이 되고 독립적으로 가열체(heating element) 및 온도 조절 장치를 구비하고 있다. 반응로내의 관은 직경 1인치, 길이 60cm 크기의 석영 (Quzrtz) 재질로 된 것을 사용하였다.

반응로 전단부의 가운데에 선구물질인 Au₂O₃(Sigma-Aldrich, 334057) 0.05g을 담은 고순도 알루미나 재질의 보트형 용기를 위치시키고, 반응로 후단부의 가운데에는 표면이 (0001)면인 사파이어 단결정 기판을 위치시켰다. 아르곤 기체는 반응로 전단부로 투입되어 반응로 후단부로 배기되며 반응로 후단부에는 진공펌프가 구비되어 있다. 상기 진공펌프를 이용하여 석영 관내 압력을 15 torr로 유지하였으며, MFC(Mass Flow Controller)를 이용하여 500 sccm의 Ar이 흐르도록 하였다.

반응로 전단부(선구물질이 담긴 알루미나 보트)의 온도는 1100℃ 유지하고, 반응로 후단부(사파이어 기판)의 온도는 900℃로 유지한 상태에서 30분 동안 열처리 하여 Au 단결정 나노와이어를 제조하였다.

Au 단결정 나노와이어의 단축의 지름이 50 내지 150 nm이며 장축의 길이는 50 ㎛ 이상이었으며, 표면이 원자적으로 매끈한 단결정체의 Au 나노와이어가 제조되었다.

아비딘 검출

표면개질을 통해 제조된 Au 단결정 나노와이어의 표면에 비오틴을 형성시켰다. 상세하게, 제조된 Au 단결정 나노와이어를 1mL의 0.4 mM EZ-Link Biotin-HPDP(Pierce, 21341) Dimethylformamide (DMF) 용액에 함침시켜 비오틴이 구비되도록 표면개질한 후, DMF 용매를 이용하여 세척한 후 1 mL 인산완충식염수(PBS; Phosphate Buffered Saline solution, 이하 PBS) 수용액에 보관하였다. 유사하게, 평균 입경이 10nm인 Au 나노입자(Sigma-Aldrich, G1527)를 2 μl의 0.4 mM EZ-Link Biotin-HPDP(Pierce, 21341) DMF 용액에 함침시켜 비오틴이 구비되도록 표면개질 하였다.

이후, 비오틴이 구비된 Au 나노와이어에 아비딘(Sigma-Aldrich, A9275) PBS용액 5 mL를 첨가하고, PBS 용액으로 세척한 후, 1 mL 비오틴이 구비된 Au 나노입자 수용액 1 mL를 첨가하였다.

위 과정을 상온에서 180 분동안 유지한 후, 비 특이적으로 결합된 Au 나노입자를 제거하기 위해 PBS 용액을 이용하여 세척한 후, Au 나노와이어를 분리하여 물리적 광학적 특성을 조사하였다.

도 4(a)는 Au 나노와이어에 Au 나노입자 및 아비딘을 첨가한 후 얻어진 Au 나노와이어의 주사전자현미경(SEM; Scanning Electron Microscopy) 사진으로, Au 나노와이어에 구비된 비오틴 및 Au 나노입자에 구비된 비오틴이 아비딘과 결합한, 비오틴-아비딘-비오틴 결합에 의해, 아비딘을 사이에 두고 단일한 Au 나노와이어에 Au 나노입자가 자기조립되었음을 확인 할 수 있다.

Au 나노와이어에 자기조립된 Au 나노입자는 명확하게 식별할 수 있었으며, Au 나노입자가 응집체를 형성하지 않고, 각각이 물리적으로 서로 분리되어 단일한 Au 나노입자가 Au 나노와이어에 자기조립됨을 알 수 있으며, 또한, Au 나노입자가 Au 나노와이어 표면에 전체적으로 균일하게 고밀도로 자기조립되어 있음을 알 수 있다.

이러한 생화학 물질에 의해 단일한 귀금속 나노와이어에 귀금속 나노입자가 자기조립되어 귀금속 나노입자와 귀금속 나노와이어 결합 영역(hot spot)에 생화학 물질이 존재함에 따라, 생화학 물질의 라만 신호는 크게 증가하게 되고 이 현상을 이용하여 생화학 물질을 용이하게 검출하는 것이 가능하다.

이러한 검출대상인 생화학 물질에 의한 나노와이어-나노입자 구조는 단일 구조가 생화학 물질을 검출할 수 있는 하나의 센서로 작용 할 수 있기 때문에 여러 나노와이어의 표면을 다양한 물질로 개질하고 한 기판에 옮겨 놓음으로써 다양한 생화학 물질을 동시에 검출 할 수 있는 멀티플렉스 검출 방법으로의 응용이 매우 용이하다.

반면에, 도 4(b)에서 관찰한 바와 같이 Au 나노와이어 및 Au 나노입자 분산액에 아비딘을 첨가하지 않고 순수한 PBS 용액만 가지고 금 나노입자와 나노와이어의 자기 조립을 수행하였을 때는 Au 나노입자가 Au 나노와이어에 자기조립되지 않음을 확인할 수 있었다.

아비딘이 첨가된 경우 얻어진 Au 나노와이어 및 아비딘이 첨가되지 않은 경우 얻어진 Au 나노와이어(비교예)를 Si 단결정 기판 상부에 위치시킨 후, SERS 스펙트럼을 측정하였다. SERS 스펙트럼을 측정하기 위해, 귀금속 나노와이어를 초점 으로 633 nm파장을 갖는 레이저 빔을 조사하고 공초점 라만분광검출기로 검출하였으며, 레이저 빔의 세기를 0.5 mW 로 60초 동안 측정된 결과들이다.

도 5(a)는 비오틴-아비딘 결합에 의해 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어의 SERS 스펙트럼(이하, 나노구조체 SERS 스펙트럼)이다. 아비딘이 존재하여 하이브리드 나노구조이 형성된 후에는 강한 SERS 신호가 관찰됨을 알 수 있으며(도 5a의 파란색 스펙트럼), 아비딘 없이 아비딘이 첨가되지 않고 비오틴이 구비된 Au 나노입자와 접촉한 Au 나노와이어의 경우 Si 신호 외에는 특색 없는 스펙트럼이 얻어짐을 알 수 있다(도 5a의 자주색 스펙트럼).

이는 도 4의 광학적 결과와 일치하는 것으로, 귀금속 나노와이어와 귀금속 나노입자가 결합함에 따라 핫스팟이 생성되었음을 입증하는 결과이며, 이러한 핫 스팟에 의해 매우 높은 강도의 SERS 스펙트럼이 얻어짐을 알 수 있다. 그러나?? 핫 스팟에 의해 매우지 않은 단일한 귀금속 나노와이어만의 경우 표면 플라즈몬의 여기가 매우 작아 Si 스펙트럼이 얻어질 뿐이다.

Au 나노와이어-Au 나노입자 구조 형성에 의한 SERS 강도 증가율(EF)은 하기의 수식 1로 계산할 수 있다.

(수식 1)

EF = (I_sers x N_bulk)/(I_bulk x N_sers)

I_sers 와 I_bulk 는 나노구조체 SERS 스펙트럼과 고체 상태의 EZ-Link Biotin HPDP의 벌크 스펙트럼에서 같은 피크의 크기(특정 밴드에서 각각의 강도)이고, N_bulk 는 벌크 스펙트럼에 기여한 분자 수이며, N_sers는 나노구조체 SERS 스펙트럼에 기여한 분자 수이다.

도 5(a)의 푸른색으로 도시한 나노구조체 SERS 스펙트럼에서 알 수 있듯이 1005 cm^-1 밴드의 크기가 스펙트럼에서 가장 크기 때문에 이것을 I_sers와 I_bulk로 선택하였다. N_bulk는 고체 상태의 EZ-Link Biotin HPDP(0.5 g/cm³) 라만 스펙트럼과 라만 시스템의 초점 부피(0.5 femtoL)에 기반하여 결정된다.

핫 스팟 영역에서의 N_sers를 구할 때, EZ-Link Biotin HPDP가 Au 나노와이어와 Au 나노입자에 0.4 nm² 의 분자당 면적을 가지고 단층으로 흡착될 것이라고 가정하였고 3 nm 사이의 분자들만 선택하였다. 레이저 빔이 조사되는 Au 나노입자의 수(즉, SERS 신호 증강에 기여하는 핫 스팟의 수)가 약 250개임이 도 4(a)의 주사전자현미경사진으로부터 알 수 있으므로, N_trap은 약 2.2 x 10⁵이 된다.

도 5(a)의 나노구조체 SERS 스펙트럼에서 분자들이 633 nm 주변에 흡수 밴드를 보이지 않기 때문에 공명 라만 효과가 제외된 것에 주목해야 한다. 공명 효과를 갖는 탐침 분자를 사용하고 레이저의 파장을 최적화하면 더욱 증가된 SERS 효과를 얻을 수 있음을 예상할 수 있다.

도 5(b) 및 도 5(c)에 도시한 바와 같이 비오틴-아비딘 결합에 의해 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어의 나노구조체에 조사되는 레이저 빔의 편광 특성 및 레이저 빔이 조사되는 위치에 따라 나노구조체 SERS 스펙트럼의 강도가 달라짐을 알 수 있다. 도 5(b)는 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어의 장축 중심(도 5(a)에 도시된 나노와이어의 (b)위치)에 레이저 빔이 조사되는 경우이고, 도 5(c)는 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어의 장축 팁(tip)(도 5(a)에 도시된 나노와이어의 (c)위치)에 레이저 빔이 조사되는 경우이며, 나노와이어의 장축 방향과 레이저 빔의 편광 방향이 이루는 각도 θ에 따른 1120 cm^-1 라만 밴드 적분값에 대한 극선을 도시한 것이다.

Au 나노와이어 장축 중심영역에 레이저 빔이 조사된 경우, 레이저 빔의 편광이 나노와이어의 장축과 수직할 경우 SERS 강도는 최고가 되고 편광이 수평할 경우 최소로 떨어진다. 이러한 편광 의존성은 광반응에 의한 감소를 보정한 cos²θ 함수로 피팅(fitting)된다.

반면에, Au 나노와이어 팁에서의 SERS 신호 편광 비등방성은 중심영역에서보다 훨씬 작아진다. 팁에서의 극선은 지수 감소 함수로 피팅(fitting)된다.

이러한 결과는 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어의 팁과 중심에서의 표면 플라즈몬 여기의 차이에 의해 설명될 수 있다. 단일한 나노입자가 나노와이어의 중간(나노와이어 장축방향의 중심)에 붙어있으면, 강한 편광 비등방성이 보인다. 본 발명에 따른 귀금속 나노와이어에는 다수개의 물리적으로 분리된 귀금속 나노입자가 자기 조립되어 있으므로, 그러므로 관찰된 편광 의존성은 여러 핫 스팟에서 생성된 전자기장의 집합에 의하여 설명된다.

반면에 나노와이어의 팁에서는 부분적 구조가 원기둥을 덥고 있는 반구와 가깝다. 작은 나노입자가 균일하게 덥혀 있는 큰 구에서, 편광 비등방성이 사라지는 것이 명백하다. 따라서, 신뢰성있고, 재현성있으며, 고 민감도로 생화학 물질을 검출하기 위해 나노와이어 장축 방향의 중심에 레이저 빔이 조사되는 것이 바람직함을 알 수 있다.

도 6(a)는 비오틴이 형성된 Au 나노입자와 비오틴이 형성된 Au 나노와이어가 분산된 PBS 용액에 첨가된 아비딘의 농도에 따른 나노구조체 SERS 스펙트럼 변화를 도시한 것이다. Au 나노입자 및 Au 나노와이어가 분산된 PBS 용액내 아비딘의 농도가 10^-13 M 내지 10^-5 M 농도가 되도록 아비딘을 첨가한 후, Au-나노와이어를 분리 회수하여 SERS 스펙트럼을 얻었다.

도 6(a)에 도시한 바와 같이 10^-8 M 이상의 아비딘 농도에서는 매우 뚜렷한 SERS 스펙트럼이 관찰되었다. 10^-9 M에서는 SERS 강도가 줄어들었는데 이는 Au 나노와이어에 붙은 Au 나노입자의 수가 감소하였기 때문이다. 10^-10 M 이하에서는, 라만 신호를 관찰하기 어려웠다. 비오틴-아비딘 결합은 열역학적 친화 상수가 매우 큰 비가역적 반응이므로, 도 6(a)에 도시된 각 스펙트럼은 서로 다른 샘플로부터 독립적으로 측정한 결과이다. 이는 비오틴-아비딘 결합에 의해 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어인 나노구조체로부터의 SERS 신호가 Au 나노와이어 표면을 따라 균일하게 형성된 핫 스팟에 의하여 재현성있게 구현 및 관찰됨을 의미한다.

SERS 활성인 구조로부터의 SERS 신호의 재현성과 안정성은 좋은 센서를 위해 매우 중요한 성질이다. Au 나노와이어는 매우 균일한 표면을 가지고 있고 Au 나노입자도 뭉침 없이 나노와이어 전체에 균일하게 분포되어 있으므로, 본 발명의 나노구조체는 신뢰성 있는 SERS 신호의 재현성을 보여준다.

SERS 증강이 아비딘만의 특정한 인지에 의존한 것인지 확인하기 위하여 비오틴이 형성된 Au 나노입자와 비오틴이 형성된 Au 나노와이어가 분산된 PBS 용액에 아비딘이 아닌 비특정 결합 단백질인 보바인 세룸 알부민(Bovine Serum Albumin, 이하 BSA)을 첨가하였다.

도 6(b)는 주사전자현미경 사진을 기반으로 BSA와 아비딘 각각의 농도에 따라 Au 나노와이어에 부착된 Au 나노입자의 수를 도시한 것이며, 이때, 관찰한 Au 나노와이어의 면적은 1 x 10⁴ nm²이다.

도 6(b)의 BSA로 도시한 그래프에서 알 수 있듯이 비오틴이 결합된 Au 나노와이어 및 비오틴이 결합된 Au 나노입자 분산 PBS 용액에 BSA 농도를 높이면서 반응시켜도, 자기 조립된 Au 나노입자- Au 나노와이어 구조를 관찰하지 못하였다. 이는 귀금속 나노입자-귀금속 나노와이어의 나노구조체의 형성이 비오틴-아비딘 결합에 매우 선택적임을 의미한다.

도 6(b)의 Avidin으로 도시한 그래프에 도시한 바와 같이, 귀금속 나노입자의 자기조립 구조에 의한 핫 스팟의 밀도가 아비딘 농도에 의해 제어됨을 알 수 있다.

타겟 DNA 검출

아비딘 검출과 유사한 Au 나노와이어 및 Au 나노입자, 아비딘 검출과 유사한 SERS 측정 조건을 이용하여 DNA를 검출한 일 예를 상술한다.

표 1은 DNA 검출에 사용된 프루브 DNA(Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20, Vvul02-20), 타겟 DNA(T1 ~ T6), 및 리포터 DNA(R1 ~R3)의 서열(sequence)을 정리한 것이다.

표 1에 도시한 바와 같이 감도 증진을 위해 리포터 DNA의 5'-termini에 Cy5 또는 TAMRA 라만 다이를 부착했다.

(표 1) 사용된 DNA 서열(Genotech, Daejeon, Korea)

Name	Length (-mer)	Sequence (5'→3')
Efm003-20	20	SH-(CH₂)₆-ACATAGCACATTCGAGGTAG
Sau001-20	20	SH-(CH₂)₆-CAAAGGACGACATTAGACGA
Smal03-20	20	SH-(CH₂)₆-GCCATTCCAGTGAAGACGAG
Vvul02-20	20	SH-(CH₂)₆-GTAGTTGACGATGCATGTTC
T1	40	agtaccgtgagggaaaggcgctacctcgaatgtgctatgt
T2	40	tgttacgattgtgtgaatactcgtctaatgtcgtcctttg
T3	35	ttccctcacggtactctacctcgaatgtgctatgt
T4	35	ttccctcacggtacttcgtctaatgtcgtcctttg
T5	35	ttccctcacggtactctcgtcttcactggaatggc
T6	35	ttccctcacggtactgaacatgcatcgtcaactac
R1	20	Cy5-CGCCTTTCCCTCACGGTACT-(CH₂)₃-SH
R2	20	TAMRA-gtattcacacaatcgtaaca-(CH₂)₃-SH
R3	15	Cy5-AGTACCGTGAGGGAA-(CH₂)₃-SH

실험에 사용한 DNA (프루브, 타겟, 리포터 DNA)는 1M DTT(dithiothreitol) 및 NAP-5 column (GE healthcare Co.)을 이용하여 정제 한 후 사용하였다. Au 나노 와이어는 5 μM 프루브 DNA를 함유한 1 M KH₂PO₄ 버퍼(pH 6.75)에 상온에서 24시간동안 인큐베이션(incubation)시킨 후 0.2% (w/v)의 SDS(soldium dodecyl sulfate) 용액으로 세척하고 N₂가 흐르는 분위기에서 건조하였다.

프루브 DNA가 형성된 Au 나노와이어는 나노매니퓰레이터(nanomanipulator)를 이용하여 M-PEG 실렌(methoxy-polyethylene glycol Silane)이 형성된 Si 단결정 기판으로 옮겨졌다.

Au 나노입자는 라만 다이가 형성된 리포터 DNA로 개질하였으며, 상세하게, 5 μM 리포터 DNA 및 0.01 %(w/v) SDS(soldium dodecyl sulfate)를 함유한 0.01M PB(phosphate buffer) 용액과 Au 나노입자를 혼합하고 상온에서 12시간동안 인큐베이션 시키고, 이후, PB 용액의 NaCl의 농도가 점차적으로 0.7 M이 되도록 2M NaCl 용액을 첨가하였다(salt aging 방법). salt aging 이후 원심분리를 이용하여 Au 나노입자를 회수하고 0.01% (w/v) SDS으로 2회 세척 한 후, PBS(phosphate buffered saline) 용액에 분산시켰다.

타겟 DNA는 혼성화 버퍼에 첨가되었으며, 상기 혼성화 버퍼로 6 x SSPE (0.9 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄H₂O, 1 mM EDTA, pH 7.4), 20% (v/v) 포름아마이드용액(formamide solution, Sigma-Aldrich), 및 0.1% (w/v) SDS(soldium dodecyl sulfate)의 혼합용액을 사용하였다.

프루브 DNA가 형성된 Au 나노와이어는 타겟 DNA를 함유하는 혼성화 버퍼에 함침되어 30 ℃, 6시간동안 혼성화 된 후, 2 x SSPE로 세척되었다.

프루브 DNA가 형성된 Au 나노와이어와 타겟 DNA의 혼성화 후, 혼성화된 Au 나노와이어는 0.1 % (w/v) SDS를 함유하며 리포터 DNA가 형성된 Au 나노입자가 분산된 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 함침되어 6시간 동안 혼성화 되었다.

혼성화된 Au 나노와이어와 Au 나노입자의 혼성화 후, 0.1 % (w/v) SDS를 함유하는 PBS(phosphate buffered saline) 용액 및 탈이온수로 각각 세척하고 N₂가 흐르는 분위기에서 건조하여 타겟 DNA를 사이에 두고 Au 나노입자가 Au 나노와이어에 자기조립된 DNA 검출 샘플을 제조하였다.

도 7(a)는 타겟 DNA, 리포터 DNA, 프루브 DNA를 이용한 DNA 검출 샘플의 일 예를 도시한 개념도이며, 도 7(a)에 도시한 바와 같이 핫 스팟 및 SERS 신호는 DNA 상보적 결합의 분자 인식 사건이 일어나야지만 얻어진다.

도 7(b) 및 도 7(c)의 결과는 Efm003-20 프루브 DNA, T1 타겟 DNA, T2 비특이적 타겟 DNA, R1 리포터 DNA를 이용한 DNA 검출 샘플의 측정 결과이다.

도 7(b)의 푸른색 라만 스펙트럼은 상보적 결합하는 타겟 DNA를 이용하여 혼성화 시킨 경우의 DNA 검출 샘플 측정 결과를 도시한 것이며, 도 7(b)의 자주색 라만 스펙트럼은 타겟 DNA 대신 비 상보적 DNA로 유사하게 혼성화한 경우 측정된 결과를 도시한 것이다. 도 7(b)에서 알 수 있듯이 타겟 DNA가 존재할 경우에만 Cy5의 강한 SERS 신호가 얻어지고 비 상보적 DNA를 사용했을 때는 약한 Si 밴드만이 관찰됨을 보여주고 있다.

비록 단일한 나노와이어 그 자체가 SERS-활성화 물질이 될 수도 있지만, 표면에 붙은 나노입자가 있을 때 훨씬 강한 SERS 신호를 얻을 수 있다. 단일 나노와이어에 비하여, 타겟을 사이에 두고 형성된 Au 나노입자-Au 나노와이어 구조의 실험적 SERS 증강 팩터(SERS enhancement factor)는 2.6 x 10³이었다.

도 7(c)는 이러한 DNA 상보적 결합에 의한 Au 나노입자-Au 나노와이어 구조 형성의 직접적인 관찰을 위한 SEM 사진으로, 상보적 타겟 DNA와의 혼성화에 의해서는 아비딘과 유사하게 전형적인 Au 나노입자-Au 나노와이어 구조를 보여주고(도 7(c) 위), 비특이적 DNA에 대해서는 나노입자가 형성되지 않고 나노와이어 만이 존재함을 알 수 있다(도 7(c)의 아래).

도 7(c)는 도 7(b)의 SERS 스펙트럼과 상응하는 SEM 사진으로, 나노입자-나노와이어 간의 갭 형성 및 이러한 갭에 검출대상인 생화학물질이 고정된 구조가 SERS 증강에 매우 중요함을 확실하게 증명해주고 있다. 또한, 아비딘과 마찬가지로 나노입자가 뭉치지 않고 나노와이어에 균일하게 분포되어 있는 것을 주목해야 한다. 이러한 균일한 나노입자-나노와이어 구조는 극도로 잘 정의된 나노구조이므로 재현성 있는 SERS 신호를 제공해 줄 수 있다.

멀티플렉스 DNA 검출을 위해, 서로 다른 프루브 DNAs (Efm003-20과 Sau001-20)로 개질된 두 개의 Au 나노와이어를 이용하였다. Efm003-20과 Sau001-20으로 개질된 두 개의 Au 나노와이어는 같은 Si 기판에 위치하였다.

도 8(a)에 도시한 바와 같이 프루브 DNA로 개질된 Au 나노와이어를 포함한 이 기판은 타겟 DNAs (T1과 T2)의 혼합물과 리포터 DNAs (R1과 R2)로 개질한 Au 나노입자의 혼합물 용액과 순차적으로 반응시켜주었다.

그 결과로 얻은 두 개의 Au 나노입자-Au 나노와이어 구조들은 각각의 SERS 스펙트럼이 측정되는데, 이는 하나의 타겟 DNA (T1)는 Efm003-20과 Cy5 리포터 분자 (R1)에 상보적이고, 다른 하나 타겟 DNA (T2)는 Sau001-20과 TAMRA 리포터 분자 (R2)에 대해 상보적으로 디자인하였기 때문이다.

도 8(b)는 각각의 Au 나노입자-Au 나노와이어 구조로부터 측정한 SERS 스펙트럼을 도시한 것으로, 위의 Au 나노입자-Au 나노와이어 구조로부터, Cy5의 라만 밴드를 볼 수 있었고 이것은 오직 T1과 R1 만이 이 시스템에 존재함을 증명해준다. 마찬가지로, 아래의 Au 나노입자-Au 나노와이어 구조로부턴 TAMRA의 SERS 신호가 얻어졌고, T2와 R2만이 잡혀있음을 보여준다.

이러한 결과는 다른 타겟 DNAs 사이의 크로스 혼성화(cross hybridization)가 발생하지 않음을 보여주는 것으로, 하나의 나노와이어를 하나의 타겟 DNA 검출 시스템으로 사용하여, 멀티플렉스 DNA 검출이 가능함을 증명하는 결과이다.

도 9는 멀티플렉스 DNA 검출의 다른 예로, 4개의 Au 나노와이어를 이용한 일 예이다. 도 9(a)에 도시한 바와 같이, 서로 다른 프루브 DNAs (Efm003-20, Saul001-20, Smal03-20, 그리고 Vvul02-20)를 붙인 4개의 Au 나노와이어를 하나의 Si 기판의 특정한 위치 M자 형상으로 위치시켰으며, M자 형상을 기반한 위치 주 소(address)에 의해 각 나노와이어를 구분하였다.

나노와이어를 개별적으로 정확한 위치에 놓는 것은 나노와이어 기반 멀티플렉스 검출에 있어서 중요하다. 본 발명에 따른 단일 Au 나노와이어는 나노메니퓰레이터로 이동시킬 수 있고 또한 광학현미경으로 간편하게 관찰할 수 있으므로, 용이하게 위치가 제어되며 이에 따라 나노와이어별 구분을 위해 어떤 패터닝 과정도 필요하지 않게 된다.

기판 위의 4 종류의 나노와이어는 여러 타겟 DNAs (T3, T4, T5, 그리고 T6)의 혼합물과 결합시킨 후, 5'-termin에는 Cy5를 3'-termini에는 Au 나노입자를 가지고 있는 리포터 DNA (R3)와 인큐베이션시켰다.

이 실험에서, 검사의 정밀성을 높이기 위해 리포터 DNA의 길이를 15-mer로 줄였다. 짧은 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)가 다른 DNA와의 교차 반응을 없앨 수 있고 차별화(discriminatory power)를 키울 수 있음이 잘 알려져 있다.

도 9(b) 내지 9(d)는 4개의 Au 나노와이어로 구성된 4 플랫폼 샘플의 SERS 를 이용한 멀티플렉스 DNA 검출을 보여주고 있다. 4 개의 서로 다른 프루브 DNA를 붙인 Au 나노와이어는 Si 기판상 도 9(b)의 광학 현미경사진에 보이는 것처럼 알파벳 문자 M을 형성하고 있다. Au 나노와이어의 고정된 위치로부터 우리는 나노와이어를 구분 할 수 있고 한 번의 분석으로 여러 타겟 DNA를 검출 할 수 있다.

2 개의 타겟 DNA(T3와 T5) 혼합물로 실험한 후, 4 개의 나노와이어로부터 얻은 SERS 스펙트럼(spectra)를 도 9(b)에서 보여주고 있다. 오직 Efm003-20과 Smal03-20이 붙은 나노와이어만 Cy5의 SERS 스펙트럼(spectra)을 보여주었다.

이 방법의 자세한 평가가 도 9(c) 및 도 9(d)에 나타나 있다. 이것들은 다양한 타겟 DNA의 혼합물로 실험을 마친 후 기판 위의 각 Au 나노와이어로부터 얻은 1580 cm^-1 라만 밴드의 크기를 보여주고 있다. 도 9(c)에서, 4 개의 타겟 DNA 중 하나만 사용하였으므로 타겟 DNA와 상보적인 프루브 DNA를 가지고 있는 한 종류의 Au 나노와이어에서만 SERS 신호가 관찰되었다. 도 9(d)에서는, 멀티플렉스 DNA 검출을 위한 센싱 능력이 명확하게 검증되었다. T3와 T6의 혼합물이 기판에 적용되었을 때, SERS 신호는 Efm003-20과 Vvul02-20이 붙은 Au 나노와이어에서만 얻어졌다. T4와 T5의 혼합물을 사용했을 때는, Sau001-20과 Smal03-20이 붙은 나노와이어만 강한 Cy5의 SERS 스펙트럼(spectra)을 보여주었으며, T3, T4, 그리고 T5의 혼합물과 반응시킨 후에는 Vvul02-20으로 개질된 나노와이어를 제외한 모든 나노와이어가 강한 SERS 신호를 제공하였다. 마지막으로, 4 가지 타겟 DNAs 혼합물을 사용해서, 우리는 칩 위의 모든 Au 나노와이어가 비슷한 SERS 스펙트럼(spectra)을 보임을 관찰하였다. 이 결과는 Au 나노와이어-나노입자 시스템이 sequence-specific DNA 결합을 검출할 수 있음을 명백하게 보여주고 있다.

상술한 플랫폼의 멀티플렉싱 능력이 다른 라만 다이(Raman dyes)에 의한 결과가 아닌 것에 주목할 필요가 있다. 이 실험에서, 다른 나노입자 기반 검출 방법과 비교하여 멀티플렉스 DNA 검출을 위해 하나의 리포터 DNA만을 사용하였다.

비록 분자의 좁은 라만 밴드로 인하여 서로 다른 다이(dye)의 SERS 스펙트럼(spectra)은 구분 할 수 있다고 하여도, 정량적인 멀티플렉스 검출을 위해선 같 은 라만 다이(Raman dye)를 사용하는 것이 더 유리하다. 멀티플렉스 DNA 검출을 위해 여러 다이(dyes)를 사용 할 경우, 다이별로 SERS 증강은 달라질 수 있다.

또한, 단일 나노와이어의 쉬운 이동 및 관찰이 가능하기 때문에 우리는 바코드 패턴 같은 물리적으로 표시된 라벨이 없는 단결정 Au 나노와이어를 사용 할 수 있었다. 광학적으로 서로 구분되지 않는 Au 나노와이어는 기판에서의 특정한 위치에 의하여 구분 할 수 있다. 더군다나, 매우 깨끗한 표면을 가지고 있는 단결정 Au 나노와이어를 멀티플렉스 검출 가능한 SERS 플랫폼의 빌딩 블록(building block)으로 사용함으로써, SERS를 이용한 검출시 가장 중요한 성질 중 하나인 재현성 있는SERS 스펙트럼(spectra)을 얻을 수 있을 것으로 기대하였다.

도 10은 다양한 타겟 DNA 농도(몰 농도)에서의 Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조의 감도 및 농도와의 관계를 측정한 결과로, 도 10(a)는 타겟 DNA의 농도를 변화시킴에 따른 Cy5의 1580 cm^-1 Raman 밴드 크기 변화를 보여주고 있다. SERS 신호는 타겟 DNA의 농도에 비례하여 감소하고 10 pM의 낮은 농도에서도 관찰된다.

SERS 크기와 DNA 농도의 더 자세한 결과를 도 10(b)에 도시하였다. 도 10(b)의 파란 선이 보여주듯이, Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조의 SERS 크기는 타겟 DNA의 농도와 관련이 있다. 이 방법의 검출 한계(limit of detection)을 일반적인 어세이(assay) 부피인 30 μl에서 300 amol (1.8 x 10⁸ molecules)과 동일한, 10 pM로 추정하였다. 또한, SERS 신호는 10 nM에서 포화(saturation)되고, 3 오더의 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가짐을 알 수 있다.

또한 10^-11 내지 10^-8의 3 오더의 다이나믹 레인지 범위에서 SERS 크기와 농도가 직선 관계(correlation coefficient: 0.987)를 가짐을 알 수 있으며, 이 결과는 Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조를 이용해 타겟 DNA의 정량적 검출이 가능함을 제안하고 있다. 비 특이적 DNA를 이용해 수행한 비교 실험에서는 구분 할 수 있는 SERS 신호를 볼 수 없었다(도 10(b)의 자주색 선).

병원균 DNA 검출

병원균을 검출하는 것은 의학적으로 중요하다. 왜냐하면 이것들이 상당한 질병률과 높은 사망률을 가진 많은 전염병을 유발하기 때문이다. Enterococcus faecium (E. faecium)와 Staphylococcus aureus (S. aureus)는 높은 발생률과 사망률을 가진 혈류 질환의 가장 유력한 병원균이다. Stenotrophomonas maltophilia (S. maltophilia)는 면역체계가 제대로 작용하지 못하는 환자, 장기 이식자, 낭포성 섬유증(CF)을 가진 사람들에게 중요한 병원균이다. Vibrio vulnificus (V. vulnificus)는 며칠 안에 빠르게 진행되어 50 % 이상의 높은 사망률을 보여주는 패혈증과 위장염의 원인이 된다.

표 2는 DNA 검출에 사용된 균의 종류를 정리한 것이다.

(표 2)

Species	Source
E. faecium	KCCM^a 12118
S. aureus	KCTC^b 1621
S. maltophilia	ATCC^c 13637
V. vulnificus	KCTC^b 2962

^aKCCM(Korea Culture Center of Microorganisms, Seoul, Korea), ^bKCTC(Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Korea), ^cATCC(American Type Culture Collection , Rockville, MD, USA)

레퍼런스균의 DNA는 표 2의 균으로부터 DNA mini kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 키트 공급사의 프로토콜(protocol)에 따라 분리되었다.

실제 클리닉 샘플로, 클리닉균의 DNA는 균에 감염된 환자의 뇌척수액, 변, 농, 그리고 가래를 포함한 여러 가지 임상 표본으로부터 QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 키트 공급사의 프로토콜(protocol)에 따라 분리되었다.

분리된 DNA로부터 PCR(Polymerase chain reaction) 증폭을 이용하여 종특이적 DNA만을 선택적으로 증폭하여 타겟 DNAs로 사용하였다. 상세하게 PCR 증폭은 1 x Taq buffer, 0.2 mM dNTPs, 2 units of Taq polymerase(Takara Shuzo Co., Shiga, Japan), 5 ng genomic DNA, 5 pmol forward primer, 및 25 pmol reverse prime를 함유한 반응액을 이용하여 수행되었다.

PCR 증폭시, 종특이적인 프라이머는 Efm003-20(for E. faecium), Sau001-20( S. aureus), Smal03-20(S. maltophilia) 또는 Vvul02-20(V. vulnificus)를 사용하였으며, 유니버샬 프라이머는 23BR(5'-TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT-3')를 사용하였다.

증폭된 PCR 반응물은 PCR purification kit (iNtRON Co., Ltd, Gyeongido, Korea)를 이용하여 키트 공급사의 프로토콜(protocol)에 따라 정제 분리되었다.

도 11은 Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조를 이용한 멀티플렉스 병원균 박 테리아 DNA(레퍼런스균의 DNA)의 SERS 검출결과이다.

SERS 신호는 박테리아 DNA와 상보적인 프루브 DNA를 가지고 있는 Au 나노와이어에서만 증폭되었다. 비록 이 타겟 DNA는 모델 시스템에 사용한 합성된 35-mer 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)보다 훨씬 길지만(S. maltophilia는 119 bp, V. vulnificus는 131 bp, S. aureus는 194 bp, 그리고 E. faecium는 347 bp), 모델 시스템과 비슷한 SERS 결과를 얻을 수 있었다. Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조를 이용한 라벨-프리 DNA 검출은 타겟 DNA의 길이에 관계없는데, 그 이유는 건조한 상황에서 DNA가 무너져 나노와이어와 나노입자 사이의 거리를 SERS 증폭을 위해 충분히 작게 줄여주기 때문이다.

도 12는 클리닉균의 DNA을 PCR 증폭하여 타겟 DNA로 사용하고, 이를 Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조를 이용한 SERS 검출결과이다. 도 12의 클리닉균 DNA 검출결과와 도 11의 레퍼런스균 DNA의 검출결과가 유사함을 알 수 있으며, 이는 감염된 환자의 병원균을 SERS 신호로부터 검출 가능함을 제안하고 있다.

Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조를 이용하여, 7 개의 임상 검체로부터 4 가지의 병원균을 성공적으로 검출하였으며(E. faecium : 2, S. aureus : 2, S. maltophilia : 2, 그리고 V. vulnificus : 1), SERS를 이용한 검출 결과는 전통적인 배양기반 어세이 (culture-based assays) 결과와 잘 일치하였다.

이상과 같이 본 발명에서는 구체적인 검출 대상 물질과 같이 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니 며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 생화학물질 검출방법을 도시한 일 예이며,

도 2는 본 발명에 따른 생화학물질 검출방법을 도시한 다른 예이며,

도 3은 본 발명에 따른 생화학물질 멀티플렉스 검출방법을 도시한 일 예이며,

도 4는 비오틴-아비딘-비오틴의 결합에 의해 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어의 주사전자현미경 사진(도 12(a)) 및 아비딘이 첨가되지 않은 경우 Au 나노와이어의 주사전자현미경 사진(도 12(b))이며,

도 5는 비오틴-아비딘-비오틴의 결합에 의해 Au 나노입자가 자기조립된 Au 나노와이어의 SERS 스펙트럼(도 5(a) 푸른색), 아비딘이 첨가되지 않은 경우 Au 나노와이어의 SERS 스펙트럼(도 5(a) 자주색), 도 5(a)에 도시된 나노와이어의 (b)영역에서 측정된 나노와이어의 장축 방향과 레이저 빔의 편광 방향이 이루는 각도 θ에 따른 1120 cm^-1 라만 밴드 적분값(도 5(b)), 및 도 5(a)에 도시된 나노와이어의 (c)영역에서 측정된 나노와이어의 장축 방향과 레이저 빔의 편광 방향이 이루는 각도 θ에 따른 1120 cm^-1 라만 밴드 적분값(도 5(c))이며,

도 6은 비오틴이 형성된 Au 나노입자와 비오틴이 형성된 Au 나노와이어가 분산된 PBS 용액에 첨가된 아비딘의 농도에 따른 SERS 스펙트럼(도 6(a)), 아비딘의 농도에 따른 Au 나노와이어 1x10⁴ nm² 면적에서 Au 나노와이어에 부착된 Au 나노입자의 수(도 6(b)의 푸른색), 및 비특정결합단백질의 농도에 따른 Au 나노와이어 1x10⁴ nm² 면적에서 Au 나노와이어에 부착된 Au 나노입자의 수(도 6의 자주색)이며,

도 7은 DNA를 검출 대상으로 한 검출 방법을 도시한 일 모식도(도 7(a)), 특이적 DNA와의 접촉(푸른색)과 비 특이적 DNA와의 접촉(자주색)에 의한 SERS 스펙트럼 결과(도 7(b)), 및 특이적 DNA 및 비 특이적 DNA와의 접촉시의 주사전자 현미경 사진(도 7(c))이며,

도 8은 서로 다른 프루브 DNA가 각각 형성된 2개의 나노와이어를 포함한 멀티플렉스 플랫폼을 이용한 검출방법을 도시한 일 모식도(도 8(a)), 및 멀티플렉스 검출에 의한 SERS 스펙트럼 결과(도 8(b))이며,

도 9는 서로 다른 프루브 DNA가 각각 형성된 4개의 나노와이어를 포함한 멀티플렉스 플랫폼을 이용한 검출방법을 도시한 일 모식도(도 9(a)), 멀티플렉스 검출에 의한 SERS 스펙트럼 결과(도 9(b)), 접촉하는 타겟 DNA의 종류별 검출 결과를 도시한 SERS 스펙트럼 결과(도 9(c)), 및 순차적 멀티플렉스 검출 결과를 도시한 SERS 스펙트럼 결과(도 9(d))이며,

도 10은 검출대상인 DNA 몰 농도에 따른 SERS 스펙트럼의 변화(도 10(a)), 및 검출 대상인 DNA의 몰 농도와 SERS 스펙트럼의 강도와의 관계를 정리 도시한 것(도 10(b))이다.

도 11은 Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조를 이용한 멀티플렉스 병원균 박테리아 DNA(레퍼런스균의 DNA)의 SERS 검출결과이며,

도 12는 Au 나노와이어 - Au 나노입자 구조를 이용한 클리닉균 DNA의 SERS 검출결과이다.

*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*

100 : 귀금속 나노와이어 200 : 귀금속 나노입자

110 : 제1수용체 210 : 제2수용체

300 : 생화학물질

Claims

표면 증강 라만 산란(SERS; Surface-Enhanced Raman Scattering)을 이용하여 분석대상이 포함하는 생화학 물질의 존재 또는 함량을 검출하기 위한 방법으로,

a) 제1수용체가 형성된 단결정체 귀금속 나노와이어 및 제2수용체가 형성된 귀금속 나노입자를 분석대상 물질과 접촉시켜, 상기 분석대상 물질과 상기 제1수용체의 결합; 및 상기 분석대상 물질과 상기 제2수용체의 결합;에 의해 상기 분석대상 물질을 중심으로 상기 귀금속 나노와이어에 상기 귀금속 나노입자를 결합시키는 단계와,

b) 상기 귀금속 나노와이어를 초점으로 상기 귀금속 나노입자가 결합된 귀금속 나노와이어에 편광된 레이저 빔을 조사하여 표면 증강 라만 산란 스펙트럼을 얻는 단계

를 포함하여 수행되는 생화학 물질 검출 방법.
제 1항에 있어서,

상기 귀금속 나노와이어 또는 귀금속 나노입자와 상기 분석대상 물질간의 결합은 효소-기질, 항원-항체, 단백질-단백질, DNA간의 상보적 결합, 또는 비오틴(biotin)-아비딘(avidin) 결합에 의한 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 1항에 있어서,

상기 귀금속 나노와이어의 장축 길이는 1㎛이상이며, 상기 귀금속 나노와이어의 장단축비(aspect ratio, 나노와이어 장축길이/단축길이)는 5 내지 150인 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 3항에 있어서,

상기 귀금속 나노 입자의 평균 입자크기는 5nm 내지 20nm 인 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 1항에 있어서,

상기 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 상기 귀금속 나노와이어 표면에 결합된 상기 귀금속 나노입자의 수인 결합 밀도 상기 귀금속 나노와이어의 단위 표면적당 존재하는 핫 스팟(hot spot)의 수인 핫 스팟 밀도와 동일한 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 2항에 있어서,

상기 분석대상 물질은 아비딘(avidin)을 포함하며, 상기 제1수용체 및 상기 제2수용체는 각각 비오틴(biotin)을 포함하며, 상기 귀금속 나노입자는 상기 귀금속 나노와이어 및 상기 귀금속 나노입자 각각에 형성된 비오틴(biotin)이 아비딘(avidin)을 중심으로 결합한 비오틴-아비딘-비오틴의 결합에 의해 상기 귀금속 나노와이어 표면에 자기조립(self-assembled)된 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 6항에 있어서,

상기 아비딘은 검출대상인 생화학 물질과 특이적으로 결합한 아비딘인 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 2항에 있어서,

상기 분석대상 물질은 타겟 DNA(target DNA)를 포함하며, 상기 제1수용체는 프루브 DNA(prove DNA)를 포함하며, 상기 제2수용체는 라만 다이(Raman dye)가 부착된 리포터 DNA(reporter DNA)를 포함하며,

상기 타겟 DNA와 상기 프루브 DNA의 상보적 결합 및 상기 타겟 DNA와 상기 리포터 DNA의 상보적결합에 의해 상기 귀금속 나노입자가 상기 귀금속 나노와이어 표면에 자기조립(self-assembled)된 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 1항에 있어서,

상기 생화학 물질 검출 방법은 물리적으로 분리되어 있으며 서로 다른 제1수용체가 형성된 둘 이상의 단결정체 귀금속 나노와이어 및 서로 다른 제2수용체가 형성된 귀금속 나노입자를 분석대상 물질과 접촉시켜, 귀금속 나노와이어별로 서로 다른 생화학물질이 검출되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 1항에 있어서,

상기 생화학 물질 검출 방법은 물리적으로 분리되어 있으며 서로 다른 프루브 DNA가 형성된 N(N>1인 자연수)개 이상의 단결정체 귀금속 나노와이어 및 라만 다이가 부착된 리포터 DNA가 형성된 단일한 종류의 귀금속 나노입자를 1 내지 N개의 타겟 DNA를 함유하는 분석 대상 물질과 접촉시켜 귀금속 나노와이어 별로 서로 다른 타겟 DNA가 검출되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출방법.
제 9항 또는 제10항에 있어서,

상기 하나 이상의 귀금속 나노와이어는 기판상 위치 어드레싱에 의해 분별되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출방법.
제 1항에 있어서,

검출 대상인 상기 생화학 물질은 DNA이며, 검출대상인 DNA의 농도(M) 10^-11 내지 10^-8에서 DNA 농도와 b) 단계의 상기 표면 증강 라만 산란 스펙트럼의 강도가 선형적으로 비례하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 3항에 있어서,

상기 귀금속 나노와이어는 Au, Ag, Pt 또는 Pd 나노와이어이며, 상기 귀금속 나노입자는 귀금속 나노와이어와 동일 물질인 Au, Ag, Pt 또는 Pd 나노입자인 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.
제 1항에 있어서,

상기 표면 증강 라만 산란은 귀금속 나노와이어를 초점으로 갖는 편광된 레이저 빔이 단일한 귀금속 나노와이어의 장축 방향 중심에 조사되어 발생되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 방법.