KR20210028988A - 표면 증강 라만 산란을 이용한 검출 대상 물질 검출 장치 및 방법 - Google Patents

표면 증강 라만 산란을 이용한 검출 대상 물질 검출 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란을 이용한 물질의 검출 방법 및 장치에 관한 것으로, 본 발명에 따른 검출 방법은 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자;를 검출 대상 물질을 함유할 수 있는 시료;와 접촉시키고, 여기광을 조사하여, 시료 내 검출 대상 물질을 검출한다.

Description

표면 증강 라만 산란을 이용한 검출 대상 물질 검출 장치 및 방법{Apparatus and Method for Detecting Analytes Using Surface Enhanced Raman Scattering}
본 발명은 표면 증강 라만 산란을 이용한 검출 대상 물질 검출 장치 및 방법에 관한 것으로, 상세하게, 우수한 신뢰성과 재현성을 가지며 단분자 수준의 검출이 가능한 검출 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
SERS(Surface-Enhanced Raman Scattering, 이하 SERS) 분광법은 금, 은 등의 금속 나노구조 표면에 분자가 흡착될 때 라만산란의 세기가 급격히 106~108 배 이상 증가되는 현상을 이용한 분광법이다. 현재 아주 빠른 속도로 발전하고 있는 나노 기술과 융합된 SERS 분광법은 특히 메디컬 센서로서 긴요하게 쓰일 수 있을 것으로 많은 기대를 받고 있다.
일 예로, SERS 분광법은 고선택성 및 고정보성을 갖는 측정 기술임과 동시에, 초고감도의 화학적/생물학적/생화학적 분석을 위한 강력한 분석방법임에 따라, 현재 SERS 분광을 이용하여, 고감도 DNA 분석과 더불어 알쯔하이머 병 혹은 당뇨병 등을 비롯한 다양한 질병의 초기 진단을 수행하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, SERS 분광법은 고선택성, 고정보성 및 고민감성을 가지나, 신호 증강이 플라즈몬 금속간의 갭이나 정션(junction) 크기나 종류, 핫 스팟과 라만 신호 발생원과의 거리등에 매우 민감하게 변화함에 따라, 측정의 신뢰성 및 재현성이 떨어지는 문제점이 있다.
이에, 질병의 조기 진단등과 같은 바이오 분야에 활용되기 위해서는, 단일 분자 수준의 검출이 가능한 고도의 민감도를 가지며, 신뢰성 및 재현성 있는 표면 증강 라만 산란이 발생하는 라만 활성 입자에 대한 개발이 선행되어야 하며, 이러한 라만 활성 입자를 단시간에 대량생산할 수 있는 기술의 개발 또한 선행되어야 한다.
대한민국 공개특허 제2011-0039688호
본 발명의 목적은 검출대상물의 재현성 및 신뢰성 있고 정량 검출이 가능한 표면 증강 라만 산란 기반 검출 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단분자 수준의 검출이 가능한 극히 우수한 민감도를 갖는 표면 증강 라만 산란 기반 검출 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 검출 장치 및 방법에 사용되어 검출대상물과 접하는 요소들이 생체적합성을 가져 생화학 물질을 포함한 바이오 물질의 검출에 적합한 표면 증강 라만 산란 기반 검출 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 검출 방법은 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자;를 검출 대상 물질을 함유할 수 있는 시료;와 접촉시키고, 여기광을 조사하여, 시료 내 검출 대상 물질을 검출한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 여기광은 근적외선일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법은 a) 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 제2수용체가 표면에 위치하는 기재와 시료를 접촉시키는 단계; b) 상기 시료와 접촉한 기재에 상기 라만 활성 입자를 접촉시키는 단계; c) 상기 라만 활성 입자와 접촉한 기재에 여기광을 조사하여 라만 스펙트럼을 얻는 단계; 및 d) 상기 라만 스펙트럼을 기반으로, 시료 내 검출 대상 물질의 존재 여부 및 검출 대상 물질의 농도를 검출하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 상기 c) 단계는 기 설정된 면적으로 라만 맵핑을 수행하여 일 라만 신호의 라만 맵을 얻는 단계;를 포함하며, 상기 d) 단계는 상기 라만 맵 상에서 상기 일 라만 신호에 대한 최대 강도를 합산한 합산 강도를 기반으로 시료 내 검출 대상 물질의 존재 여부 및 검출 대상 물질의 농도를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 상기 검출 대상 물질의 농도는 하기 식 1에 의해 산출될 수 있다.
(식 1)
MC= aIsum + b
식 1에서 MC는 검출 대상 물질의 몰 농도의 로그 값이며, Isum은 합산 강도이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법은 a) 단계 후 미반응 시료를 제거하는 단계 및 b) 단계 후 미반응 라만 활성 입자를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 검출대상물질은 병변 특이성을 갖는 병변 표지 생체물질, 병원체, 단백질, 핵산, 당, 약물 및 생화학물질에서 하나 또는 둘 이상 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 라만 맵은 기저 형광의 제거가 수행되지 않은 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 상기 플라즈모닉 금속 쉘은 금속 코어의 직경(D) 기준 0.1D 내지 0.6D의 평균 크기를 갖는 플라즈모닉 금속 미립자를 포함하며, 상기 플라즈모닉 금속 미립자에 의한 표면 요철을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 상기 플라즈몬 금속 쉘에서, 상기 자기조립단분자막과 접하는 쉘의 내면 형상은 구형일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법에 있어, 상기 자기조립단분자막의 두께는 0.5 내지 2.0nm일 수 있다.
본 발명은 질병 진단을 위한 병변 표지 물질의 검출 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 검출 방법은, 질병 진단을 위한 병변 표지 물질의 검출 방법으로, 병변 표지 물질과 특이적으로 결합하는 제2수용체가 표면에 위치하는 기재와 병변 표지 물질을 함유할 수 있는 생체 유래 시료를 접촉시키는 단계; 생체 유래 시료와 접촉한 기재와 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자를 접촉시킨 후 세척하는 단계; 상기 라만 활성 입자와 접촉한 기재에 근적외선 여기광을 조사하고 기 설정된 면적으로 라만 맵핑을 수행하여 일 라만 신호의 라만 맵을 얻는 단계; 및 상기 라만 맵 상에서 상기 일 라만 신호에 대한 최대 강도를 합산한 합산 강도를 기반으로 생체 유래 시료 내 병변 표지 물질의 존재 여부 및 병변 표지 물질의 농도를 검출하는 단계;를 포함한다.
본 발명은 표면 증강 라만 산란을 이용하여 검출대상 물질을 검출하는 검출 장치를 포함한다.
본 발명에 따른 검출 장치는 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자를 포함하는 표면증강라만산란-활성 시약; 및 검출대상물질과 특이적으로 결합하는 제2작용기가 표면에 위치하는 기재;를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 검출 방법 및 장치에 사용되는 라만 활성 입자는 구형의 플라즈몬 활성 코어 및 미립자에 의한 표면 요철을 갖는 플라즈몬 활성 쉘의 코어-쉘 구조를 갖는다. 이와 함께, 라만 활성 입자는, 코어-쉘 사이에 위치하는 라만 리포터를 포함하는 자기조립 단분자막, 구형인 코어의 형상 및 자기조립 단분자막을 감쌈에 따라 그 내측 면 또한 구형인 쉘에 의해, 엄밀하게 규정된 크기와 형상을 가지며 입자의 전 영역에서 균일하게 존재하는 핫 스팟을 갖는다. 이와 함께, 라만 활성 입자는 잘 규정되고 입자의 전 영역에 균일하고 연속적으로 존재하는 핫 스팟 영역에, 자기조립단분자막의 형태로 균일하고 밀도 높게 라만리포터가 위치한다. 이와 함께, 금속 쉘이 금속 미립자 자체가 돌출되며 금속 쉘의 표면 전 영역에 울퉁불퉁한 (bumpy) 요철을 형성함에 따라 일 입자가 균일한 라만 활성을 가지며 이와 함께 입자간 균일한 라만 활성을 가지면서도, 입자의 민감도를 크게 향상시킬 수 있다. 이러한 라만 활성 입자의 특성과 구조에 의해, 라만 활성 입자는, 입자 기준 균일한 라만 활성을 가지며, 또한, 입자간 라만 활성이 실질적으로 거의 동일하다. 이에, 이러한 라만 활성 입자를 이용한 검출 방법 및 장치는 재현성 있고 신뢰성 있게 검출대상물질을 정량 검출할 수 있으며, 단분자 수준의 우수한 검출능을 가질 수 있다.
또한, 라만 활성 입자의 전 영역에 잘 규정된 핫 스팟이 연속적으로 존재하며, 잘 규정된 핫 스팟 내에 라만 리포터가 고밀도로 균일하게 위치한다. 이에, 이러한 라만 활성 입자를 이용한 검출 방법 및 장치는 수 내지 수십 마이크로미터 크기의 생화학물질(바이오물질) 또한 재현성 있게 검출 가능한 장점이 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 검출 방법 및 장치는 750nm 이상의 근적외선 조사에 의해 물질의 검출이 가능하여, 라만 분석을 위한 여기광 조사에 의해 생체 시료가 손상되는 것을 방지할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 검출 방법 및 장치는 750nm 이상의 근적외선을 여기광으로 조사할 때, 높은 라만 신호 세기를 가짐과 동시에 실질적으로 기저 형광이 거의 발생하지 않아, 검출 신호의 후처리에 의한 라만 신호 왜곡으로부터 자유로워, 높은 검출 신뢰성을 갖는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 검출 방법 및 장치에 사용되는 라만 활성 입자는 계면활성제로부터 자유로워 생체적합성을 갖는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 검출 방법 및 장치에 사용되는 라만 활성 입자는 라만 리포터를 포함하는 유기 구성성분이 쉘에 의해 감싸여 보호되며, 작용기에 의해 코어-라만 리포터의 자기조립단분자막-금속 쉘이 강하게 결합되어 있음에 따라, 매우 우수한 내구성 및 물리적/화학적 안정성을 갖는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 검출 장치는, 라만 활성 입자가 계면활성제의 도움 없이, 상온에서 버퍼 용액, 금속 전구체 및 구형 코어 금속을 혼합하는 극히 간단한 방법으로 단시간에 대량 생산 가능함에 따라, 우수한 상업성을 갖는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 라만 활성 입자를 관찰한 저배율(도 1(a)) 및 고배율(도 1(b)) 주사전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 라만 활성 입자를 관찰한 투과전자현미경 사진이다.
도 3은 Au 코어 자체(도 3의 cpre AuNP), 자기조립단분자막이 형성된 Au 코어(도 3의 BDT-treated AuNP) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 라만 활성 입자 각각의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 라만 활성 입자 자체의 라만 스펙트럼을 측정 도시한 도면이다.
도 5는 실리콘 기판에 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 라만 활성 입자(α, β, γ)를 위치시킨 후 관찰한 주사전자현미경 사진(도 5(a)) 및 주사전자현미경으로 관찰한 영역의 라만 맵핑(780nm 레이저, 5mW)을 도시한 도면이다.
도 6은 도 5에서 라만 맵핑된 라만 활성 입자(α, β, γ) 각각의 라만 스펙트럼을 중첩 도시한 도면이다.
도 7은 타우(tau) 단백질을 검출 대상 물질로, 본 발명의 일 실시예에 따라 얻어진 라만 스펙트럼(도 7(a)) 및 라만 맵(도 7(b))을 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 타우 기판의 제2수용체에 타우 단백질이 결합하고, 기판에 결합된 타우 단백질에 타우 프로브가 결합된 구조를 도시한 일 모식도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 시료 내 타우(tau) 단백질의 농도에 따른 라만 맵핑 결과를 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, 타우 단백질 농도를 달리한 표준 시료(도 10에서 Tau in PBS)로부터 산출된 기준 그래프 및 인체에서 채취된 뇌척수액(도 10의 Tau in aCSF)이나 혈장(도 10의 Tau in plasma)을 시료로 검출된 결과를 도시한 도면이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 검출 방법 및 장치를 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다. 또한 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
본 발명에 따른 검출 방법은 라만 활성 입자를 검출 대상 물질을 함유할 수 있는 시료와 접촉시키고, 여기광을 조사하여, 시료 내 검출 대상 물질을 검출한다.
일 구체예에서, 라만 활성 입자는 표면 증강 라만 산란(SERS)용 라만 활성 입자로, 구형의 플라즈모닉 금속 코어; 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘; 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막; 및 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함한다.
코어와 쉘 사이에 위치하는 자기조립단분자막은 자기조립의 특성상 엄밀히 조절된 두께를 갖게 된다. 이에 따라 코어와 쉘 사이에는 자기조립단분자막의 두께에 해당하는 크기의 엄밀히 규정된 나노갭이 형성될 수 있다. 또한, 코어-자기조립단분자막-쉘의 구조에 의해 균일한 크기의 나노갭(핫 스팟)이 라만 활성 입자의 전 영역에 형성될 수 있다.
또한, 플라즈모닉 금속 코어의 형상이 구형임에 따라, 자기조립단분자막은 구 형상을 가지게 되며, 플라즈모닉 금속 쉘 또한, 자기조립단분자막과 접하는 금속 쉘의 내면 형상이 구 형상을 가질 수 있다. 이에, 라만 활성 입자의 전 영역에 나노갭(핫 스팟)이 위치함과 동시에, 방사 방향 기준 모든 방향에서 잘 규정된 동일한 위치에 나노갭(핫 스팟)이 위치할 수 있다.
또한, 라만 활성 입자는, 코어와 쉘 사이에 위치하는 자기조립단분자막이 라만 리포터를 함유함에 따라, 라만 활성 입자에서 잘 규정되고 방사 방향으로 동일한 위치에 라만 리포터가 위치하게 되며, 라만활성 입자 전 영역에 고밀도로 균일하게 라만 리포터가 위치하게 되고, 또한, 라만 리포터가 핫 스팟에 위치하게 된다.
이러한 라만 활성 입자는, 입자 기준 균일한 SERS 활성을 나타낼 수 있고, 또한, 입자간 라만 활성의 편차가 거의 없어 입자간 균일한 SERS 활성을 나타낼 수 있으며, 보다 큰 라만 신호의 증강이 이루어질 수 있다.
균일한 SERS 활성의 구체예로, 라만 활성 입자의 라만 스펙트럼상, 라만 신호 세기(일 라만 신호의 최대 강도, a.u.))의 표준 편차(a.u.)가 8.0 이하일 수 있다. 이때, 라만 활성 입자의 라만 스펙트럼은 근적외선 광을 조사하여 수행될 수 있으며, 공지된 종류의 라만 분광기를 이용하여 수행할 수 있다. 일 예로, 라만 분광분석은 780nm 레이저, 5mW의 레이저 파워, N.A.0.75 대물렌즈, 레이저 노출시간 1초의 조건에서 수득된 것일 수 있다. 표준 편차는 적으로 50개 이상의 라만 활성 입자의 라만 스펙트럼으로부터 산출된 것일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어, 플라즈몬 금속 코어 및 플라즈몬 금속 쉘은 각각, 광과 상호작용에 의해 표면 플라즈몬이 발생하는 금속일 수 있다. 일 예로, 플라즈몬 금속 코어 및 플라즈몬 금속 쉘은 각각, 금, 은, 백금, 팔라디움, 니켈, 알루미늄, 구리 또는 이들의 혼합물 또는 이들의 합금등을 일 수 있다. 다만, 생체 적합성을 고려하여 플라즈몬 금속 코어 및 플라즈몬 금속 쉘은 각각, 금 또는 은일 수 있다.
일 구체예에 있어, 플라즈모닉 금속 쉘은 금속 코어의 직경(D) 기준 0.1D 내지 0.6D의 평균 크기를 갖는 플라즈모닉 금속 미립자를 포함하며, 상기 플라즈모닉 금속 미립자에 의한 표면 요철을 가질 수 있다. 구체적으로, 자기조립단분자막과 결합된 상태인 금속 쉘은 금속 코어의 직경(D) 기준 0.1D 내지 0.6D의 평균 크기를 갖는 금속 미립자들로 이루어질 수 있으며, 금속 쉘은 금속 미립자의 입자 형태에 의한 불규칙한 요철을 가질 수 있다.
플라즈모닉 금속 쉘의 금속 미립자에 의한 요철 구조는, 금속 코어와 금속 쉘의 나노갭에 의한 핫 스팟과 함께, 쉘의 표면 자체에 핫 스팟을 형성할 수 있어 신호 증강에 보다 유리하다. 또한, 금속 쉘이 금속 미립자 자체가 돌출되며 금속 쉘의 표면 전 영역에 울퉁불퉁한 (bumpy) 요철을 형성함에 따라, 금속 쉘에 의해 라만 활성 입자의 민감도를 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 하나의 입자에서의 라만 활성의 균일성 및 입자간 라만 활성의 균일성을 저해하지 않을 수 있다.
플라즈몬 금속 코어의 평균 직경은 20 내지 100nm, 구체적으로 20 내지 80nm, 보다 구체적으로 30 내지 70nm 수준일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 자기조립단분자막은 라만 리포터의 자기조립단분자막일 수 있다. 라만 리포터는 라만 활성 분자를 포함하는 유기 화합물(유기 분자)을 의미할 수 있으며, 금속 코어의 금속과 결합력을 가지며 라만 활성 분자를 포함하는 유기 화합물(유기 분자)을 의미할 수 있다. 라만 리포터는 기 공지된 것이며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 무방하다.
라만 리포터(분자)가 금속 코어의 금속과 결합력을 가짐에 따라, 순수한 금속 표면이 노출되는 금속 코어에는 라만 리포터의 자기조립단분자막이 형성될 수 있다.
라만 활성 분자는 표면 강화 라만 활성 분자, 표면증강 공명 라만 활성 분자, 하이퍼 라만 활성 분자, 또는 코히런트 반 스토크스 라만 활성 분자를 포함할 수 있다. 라만 활성 분자는 라만 신호와 형광 신호를 동시에 갖거나, 라만 신호를 가질 수 있다.
구체예로, 라만 활성 분자는 시아닌 (cyanines), 플루오레세인 (fluorescein), 로다민(rhodamine), 7-니트로벤젠-2-옥사-1,3-디아졸 (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole: NBD), 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛 (cresyl fast violet), 크레실 블루 바이올렛 (cresyl blue violet), 브릴리언트 크레실 블루 (brilliant cresyl blue), 파라아미노벤조산, 에리쓰로신, 비오틴, 디옥시제닌 (digoxigenin), 프탈로시아닌, 아조메틴, 크산틴, N,N-디에틸-4-(5′-아조벤조트리아졸일)-페닐아민, 아미노아크리딘, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 시아닌의 예에는 Cy3, Cy3.5, 또는 Cy5가 포함될 수 있다. 플로오레세인의 예에는, 카복시플루오레세인 (carboxyfluorescein: FAM), 6-카복시-2',4,4′,5′,7,7′-헥사클로로플루오레세인 (6-carboxy-2′,4,4′,5′,7,7′-hexachlorofluorescein: HEX), 6-카복시-2′,4,7,7′-테트라클로로플루오레세인 (6-carboxy-2′,4,7,7′-tetrachlorofluorescein: TET), 5-카복시-4′,5′-디클로로-2′,7′-디메톡시 플루오레세인, 6-카복시-4′,5′-디클로로-2′, 7′-디메톡시플루오레세인 (6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′, 7′-dimethoxyfluorescein: Joe) 5-카복시-2′,4′,5′,7′-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 또는 석신일플루오레세인이 포함될 수 있다. 로다민의 예에는 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine: Tamra), 5-카복시로다민, 6-카복시로다민로다민, 6G (Rhodamine 6G: R6G), 테트라메틸 로다민 이소티올 (tetramethyl rhodamine isothiol: TRIT), 술포로다민 101 산 클로라이드 (sulforhodamine 101 acid chloride: Texas Red dye), 카복시-X-로다민 (carboxy-X-rhodamine: Rox), 또는 로다민 B (rhodamine B)가 포함될 수 있다.
다른 구체예로, 라만 활성 분자는 벤젠고리 형태의 라만 활성 분자일 수 있으며, 벤젠고리 형태의 라만 활성 분자는 4-Aminothiophenol(4-ATP), 4-Mercaptobenzoic acid(4-MBA), Phenyl isothiocyanate(PITC), Benzenethiol(BT), 1,4-Benzenedithiol(BDT), Biphenyl-4,4'-dithiol(BPDT), p-Terphenyl-4,4''-dithiol(TPDT), 4-Bromobenzenethiol(4-BBT), 4-Chlorobenzenethiol (4-CBT), 3,3'-Diethylthiatricarbocyanine iodoide(DTTC)등을 들 수 있다.
다만, 금속 코어에 결합되는 라만 리포터에 의해 금속 코어와 금속 쉘간 나노 갭(핫-스팟)이 형성됨에 따라, 보다 강한 신호 증강이 이루어지는 핫 스팟 형성 측면에서 라만 리포터의 길이(크기)는 3nm 이하, 구체적으로 0.5 내지 2nm인 것이 좋다. 이때, 라만 리포터의 길이(크기)가 자리조립단분자막의 두께에 상응함은 물론이다.
또한, 라만 리포터는 라만 활성 분자를 포함하되, 금속 코어와 자발적으로 결합하는 제1작용기를 갖는 것이 좋다. 더 좋게는, 금속 코어의 금속과 자발적으로 결합하는 제1작용기 및 금속 쉘의 금속과 자발적으로 결합하는 제2작용기를 갖는 것이 좋다. 이러한 경우, 자기조립단분자막은 금속 코어와 금속 쉘 각각에 화학적 결합하여, 금속 쉘과 라만 리포터가 고정된 금속 코어간의 결합력을 크게 향상시킬 수 있다.
작용기(제1작용기 또는 제2작용기)는 코어와 쉘의 금속을 고려하여 해당 금속과 자발적으로 결합하는 것으로 알려진 작용기이면 무방하다. 실질적인 일 예로, 제1금속과 제2금속이 서로 독립적으로 금 또는 은인 경우, 작용기(제1작용기 또는 제2작용기)는 티올기(-SH), 카르복실기 (-COOH) 또는 아민기(-NH2)등일 수 있으나, 본 발명이 작용기의 구체 종류에 의해 한정되는 것은 아니다.
제1작용기에 의해 금속 코어의 금속과 결합력을 갖는 라만 활성 분자가 금속 코어에 자발적으로 결합(고정)됨으로써 금속 코어에는 라만 리포터의 자기조립단분자막이 형성될 수 있으며, 균일한 두께를 갖는 라만 리포터의 막이 금속 코어의 전 표면에 균질하게 형성될 수 있다.
라만 활성 입자는 플라즈모닉 금속 쉘에 고정되어 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 포함할 수 있다. 수용체는 효소-기질, 항원-항체, 단백질-단백질 또는 DNA간의 상보적 결합과 같이, 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 어떠한 물질이든 무방하다. 이때, 수용체는 금속 쉘의 금속과 자발적으로 결합하는 작용기(일 예로, 티올기, 카르복실기 또는 아민기등)를 포함할 수 있으며, 작용기에 의해 금속 쉘에 자발적으로 및 화학적으로 결합된 상태일 수 있다. 필요시, 금속 쉘은 수용체의 작용기와 반응하여 결합하거나 후술하는 블록킹 분자와 결합할 수 있도록 표면 개질된 상태일 수 있다. 일 예로, 금속 쉘의 표면은 카르복실기, 티올기, 아민기, 히드록시기등으로 개질된 표면일 수 있다.
일 구체예에서, 라만 활성 입자는 수용체가 부착(결합)되지 않은 쉘의 표면 영역을 덮는 블록킹 분자를 더 포함할 수 있다. 블록킹 분자는 수용체가 아닌 쉘 표면 자체와 검출 대상 물질간의 원하지 않는 상호 작용을 방지하며, 쉘의 표면에 위치한 수용체의 배향을 보다 일정하게 만드는 역할을 수행할 수 있다. 블록킹 분자는 소혈청 알부민(SBA)등과 같이 바이오 센서 분야에서 금속 표면에서의 비특이적 결합을 방지하기 위해 통상적으로 사용되는 물질이면 족하다.
검출 대상 물질은 생물(바이러스를 포함함) 또는 비생물 유래 물질일 수 있다. 구체적으로, 검출 대상 물질은 병변 특이성을 갖는 병변 표지 생체물질, 병원체, 단백질, 핵산, 당, 약물, 생화학물질등을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 검출 대상 물질은 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 또는 오염물일 수 있다. 또한, 분석물이 핵산일 경우 핵산은 유전자, 바이러스 RNA 및 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 포유동물 DNA, cDNA, mRNA, RNA 및 DNA 단편, 올리고뉴 클레오티드, 합성 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산, 자연적 및 합성핵산등을 포함할 수 있다.
검출 대상 물질은 생체 내부(in-vivo)에 위치할 수 있으며, 생체 내부에서 검출될 수 있다. 즉, 상술한 라만 활성 입자는 생체 내부(in-vivo)용일 수 있으며, 생체 주입용일 수 있다.
이와 달리 검출 대상 물질은 생체 외부에 위치할 수 있으며, 생체 외부에서 검출될 수 있다. 즉, 상술한 라만 활성 자는 생체 외부(in-vitro)용일 수 있다. 이때, 검출 대상 물질은 혈액, 뇨, 점막 탈리물, 타액, 체액, 조직, 생검물 또는 이들의 조합등과 같이 생체에서 채취한 시료의 형태일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 라만 활성 입자는 750nm 이상의 파장을 갖는 근적외선 여기광 용, 구체적으로 750nm 내지 1500nm 파장 대역에 속하는 근적외선 여기광 용, 보다 구체적으로 750 내지 1000nm 파장 대역, 770nm 내지 1500nm 파장 대역 또는 780nm 내지 1000nm 파장 대역에 속하는 근적외선 여기광 용일 수 있다. 즉, 라만 활성 입자는 근적외선 대역의 광 조사에 의해 검출 대상 물질의 검출 및 분석이 이루어질 수 있다.
알려진 바와 같이 생화학물질을 포함한 바이오 물질에 가시광이 조사되는 경우 형광 현상이 발생할 수 있다. 형광의 세기는 라만 산란에 비해 매우 강하고, 형광이 라만 산란과 유사한 영역에서 발생하기 때문에 형광 피크에 가려 순수한 라만 스펙트럼을 얻기 어려운 문제점이 있다. 이에, 가시광이 아닌 근적외선 대역의 광조사에 의한 SERS 분석은 형광의 영향 없이 라만 스펙트럼을 수득할 수 있어 바이오 분야에 매우 유리하다.
실질적으로, 일 구체예에 따른 라만 활성 입자를 이용한 검출 대상 물질의 검출시, 근적외선 조사에 의해 수득되는 검출 대상 물질의 라만 스펙트럼상 실질적으로 기저 형광이 나타나지 않을 수 있다.
이에, 근적외선 조사에 의해 얻어지는 라만 스펙트럼은 형광의 제거가 수행되지 않을 수 있다. 즉, 검출대상물질의 존재 여부 및 정량 분석을 위해 사용되는 라만 스펙트럼은 라만 검출기에서 검출된 스펙트럼 및 라만 검출기에서 검출되고 후처리에 의해 변형되지 않은 스펙트럼일 수 있다.
그러나, 본 발명의 라만 활성 입자가 근적외선 용으로 한정되어 해석되어서는 안되며, 본 발명의 검출 방법에서 조사되는 여기광이 근적외선으로 한정되어 해석되어서는 안된다. 일 예로, 라만 활성 입자의 자외-가시광 흡수 스펙트럼에서 최대 흡수 피크의 중심 파장(λmax)을 기준으로, 중심 파장(λmax) ± 150nm 파장 대역에 속하는 광이 여기광으로 조사될 수 있으며, 이러한 경우 보다 큰 라만 신호의 증강이 이루어진 라만 스펙트럼을 얻을 수 있다. 일 실시예에서, 500 내지 750nm 파장 대역, 500 내지 750nm 파장 대역, 또는 550 내지 700nm 파장 대역, 또는 600 내지 680nm 파장 대역에 속하는 광이 여기광으로 조사될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 검출 방법은 라만 활성 입자와 검출 대상 물질을 함유할 수 있는 시료를 접촉시키고 여기광을 조사하여 검출 대상 물질을 검출할 수 있다. 상세하게, 본 발명에 따른 검출 방법은 라만 활성 입자와 검출 대상 물질을 함유할 수 있는 시료를 접촉시키고 여기광을 조사하여 라만 스펙트럼을 얻는 단계; 및 얻어진 라만 스펙트럼을 기반으로 시료 내 검출 대상 물질을 검출(정량 분석)하는 단계;를 포함할 수 있다.
구체예로, 여기광은 가시광 내지 근적외선 대역에 속하는 광일 수 있다. 상술한 바와 같이, 여기광이 근적외선인 경우, 여기광은 750nm 내지 1500nm 파장 대역, 750 내지 1000nm 파장 대역, 770nm 내지 1500nm 파장 대역 또는 780nm 내지 1000nm 파장 대역에 속하는 근적외선일 수 있다. 이와 달리, 여기광이 가시광 대역에 속하는 광일 경우, 라만 활성 입자의 자외-가시광 흡수 스펙트럼에서 최대 흡수 피크의 중심 파장(λmax)을 기준으로, 중심 파장(λmax) ± 150nm 파장 대역, 중심 파장(λmax) ± 100nm 파장 대역 또는 중심 파장(λmax) ± 50nm 파장 대역에 속하는 가시광일 수 있다.
구체예로, 검출 방법은, 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제2수용체가 형성된 활성 표면을 제공하는 기재의 활성 표면에 시료를 접촉시키는 제1 단계; 시료와 접촉한 활성 표면에 라만 활성 입자를 접촉시키는 제2 단계; 라만 활성 입자와 접촉한 활성 표면에 여기광을 조사하여 라만 스펙트럼을 얻는 제3 단계; 및 라만 스펙트럼을 기반으로, 시료 내 검출 대상 물질의 존재 여부 및 검출 대상 물질의 농도를 검출하는 제4 단계;를 포함할 수 있다. 제2수용체는 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있으며, 시료에 검출 대상 물질이 존재하는 경우, 제2수용체에 의해 검출 대상 물질이 활성 표면에 고정될 수 있다. 이때, 제1수용체와 제2수용체는 검출 대상 물질의 서로 다른 부위에 특이적으로 결합할 수 있음은 물론이다.
기재의 활성 표면은 금, 은, 백금, 팔라디움, 니켈, 알루미늄, 구리등의 금속 표면일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 시료가 생체 유래 시료나 바이오 시료인 경우 생체 적합성을 갖는 금, 은, 백금등일 수 있다. 제2수용체는 활성 표면과 자발적으로 결합하는 작용기(일 예로, 티올기, 카르복실기 또는 아민기등)를 포함할 수 있으며, 작용기에 의해 활성 표면에 화학적으로 결합된 상태일 수 있다. 필요시, 활성 표면은 제2수용체의 작용기와 반응하여 결합하거나 후술하는 블록킹 분자와 결합할 수 있도록 표면 개질된 상태일 수 있다. 일 예로, 활성 표면은 카르복실기, 티올기, 아민기, 히드록시기등으로 개질된 표면일 수 있다.
제1 단계의 접촉은 액상 시료(액상의 시료 또는 액상화된 시료)를 활성 표면에 도포하거나 액상 시료에 활성 표면을 담궈 수행할 수 있다. 시료에 존재할 수 있는 검출 대상 물질이 제2수용체와 안정적으로 결합하기에 충분한 시간이 흐른 후 도포된 액상 시료는 제거될 수 있다.
제2 단계의 접촉은 라만 활성 입자 분산액을 시료와 접촉한 활성 표면에 도포하거나, 라만 활성 입자 분산액에 활성 표면을 담궈 수행할 수 있다. 라만 활성 입자가 활성 표면에 고정된 검출 대상 물질에 안정적으로 결합하기에 충분한 시간이 흐른 후 미반응한 라만 활성 입자는 제거될 수 있다.
시료의 도포 및 라만 활성 입자 분산액의 도포시 각각 기 설정된 양이 도포될 수 있으며, 도포되는 라만 활성 입자 분산액은 일정한 농도로 라만 활성입자를 함유할 수 있음은 물론이다. 또한, 라만 활성 입자 분산액의 분산매 또는 시료가 액상화된 경우 액상화를 위해 사용되는 용매나 분산매는 라만 활성 입자나 시료에 화학적으로 반응하지 않으며 라만 측정에 영향을 미치지 않는 물질이면 무방하다. 생체 유래 시료나 바이오 물질의 분석시, 라만 활성 입자의 분산매나 시료의 액상화를 위해 사용되는 물질의 일 예로, HEPES 용액등과 같은 완충 용액이나 탈이온수등을 들 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
활성 표면에 도포된 미반응 액상 시료(잔류 액상 시료)의 제거 또는 미반응 라만 활성 입자(잔류 라만 활성 입자)의 제거는 분석대상물질과 라만 활성 입자에 악영향을 미치지 않는 세척액을 이용하여 활성 표면을 세척함으로써 수행될 수 있다. 생체 유래 시료나 바이오 물질의 분석시, 세척에 사용되는 세척액의 일 예로 탈이온수등을 들 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
제2 단계에 의해, 라만 활성 입자는 활성 표면에 고정된 검출 대상 물질에 특이적으로 결합하여, 활성 표면-제2수용체-검출 대상 물질-라만활성입자의 결합 구조를 형성할 수 있다.
제3 단계에서, 여기광(조사광)은 가시광 내지 근적외선 대역에 속하는 광, 유리하게, 750nm 이상의 파장을 갖는 근적외선, 구체적으로 750nm 내지 1500nm 파장을 갖는 근적외선, 보다 구체적으로, 750 내지 1000nm 파장, 770nm 내지 1500nm 파장, 또는 780nm 내지 1000nm 파장을 갖는 근적외선일 수 있다.
제 4단계에서, 얻어진 라만 스펙트럼을 기반으로, 시료 내 검출 대상물질의 존재 여부 및 검출 대상물질의 농도가 산출될 수 있다. 이때, 제 3단계의 근적외선 조사에 의해 얻어지는 라만 스펙트럼은 기저 형광의 제거가 수행되지 않은 스펙트럼일 수 있다. 즉, 검출대상물질의 존재 여부 및 정량 분석을 위해 사용되는 라만 스펙트럼은 라만 검출기에서 검출되고 후처리에 의해 가공되지 않은 스펙트럼일 수 있다.
구체예에 있어, 제3단계는 기 설정된 면적으로 라만 맵핑을 수행하여 일 라만 신호의 라만 맵을 얻는 단계;를 할 수 있으며, 제4 단계는 상기 라만 맵 상에서 상기 일 라만 신호에 대한 최대 강도를 합산한 합산 강도를 기반으로 시료 내 검출 대상 물질의 존재 여부 및 검출 대상 물질의 농도를 검출하는 단계일 수 있다.
라만 맵을 구성하는 일 라만 신호(일 라만 파장)는 검출대상물질의 라만 스펙트럼 중 가장 피크 강도가 큰 신호이거나, 또는 피크의 반치폭이 가장 좁은 신호일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
라만 맵핑은 기 설정된 크기의 영역(활성 표면의 영역)에 대한 라만 맵핑일 수 있으며, 기 설정된 크기는 1 내지 100 μm x 1 내지 100 μm일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 라만 맵핑시 팹핑 인터벌은 서로 수직하는 축 각각에 대해 0.1μm 내지 10μm 수준일 수 있고, 여기광(여기 레이저 광)의 출력은 1mW 내지 90mW, 실 예로, 1mW 내지 10mW 수준일 수 있으며, 여기광 조사 시간은 0.5 내지 10초일 수 있고, 스캔 횟수는 1 내지 5회 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
제 4단계에서, 라만 맵상 존재하는 일 라만 신호의 강도를 합산하여 검출대상물질의 농도를 정량할 수 있다. 이때, 합산되는 강도는 해당 라만 신호의 최대 강도 값(라만 피크의 최대 강도 값)일 수 있다.
즉, 등방적 SERS 활성 및 라만 활성 입자간의 고도로 균일한 SERS 활성, 실질적으로 기저 형광이 발생하지 않으며 우수한 라만 신호 강도를 나타내는 신뢰성등을 갖는 라만 활성 입자에 의해, 단지 라만 맵 상 존재하는 특정 라만 피크들(제1피크들)의 강도를 합하는 것만으로 검출대상물질의 정량 분석이 가능하며, 검출한계농도(limit of detection)가 20 aM 수준으로, 단일한 검출 대상 물질질까지도 검출할 수 있는 극히 높은 민감도를 가질 수 있다.
실질적으로, 검출 대상 물질의 몰 농도의 로그 값을 x-축으로, 특정 라만 피크들(제1피크들)의 라만 신호 강도의 합(a.u.)을 y-축으로 한 세미 로그 그래프에서, 검출 대상 물질의 몰 농도의 로그 값(MC)와 라만 신호 강도의 합(Isum)은 직선형 관계를 가질 수 있다. 즉, 세미 로그 그래프 상 MC= aIsum + b (a, b는 각각 상수)일 수 있다. 이때, 10-2 fM 내지 106 fM의 광범위한 몰 농도 영역에서 이러한 선형성이 유지될 수 있다.
이에, 검출 방법은 제1단계 전, 기 설정된 몰 농도로 검출대상물질을 함유하는 표준 시료들을 이용하여 라만 맵핑을 수행하고, 라만 맵상 해당 농도에서의 특정 라만 신호에서의 라만 신호 강도의 합을 얻는 단계를 수행함으로써, 세미 로그 그래프 상, 검출대상물질의 몰 농도와 라만 신호 강도의 합간의 관계식인 기준 그래프를 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 기준 그래프 상 제4 단계에서 산출된 강도(합산된 강도)를 대입하는 것으로, 시료 내 검출대상물질의 양을 정량 분석할 수 있다.
본 발명은 질병 진단을 위한 병변 표지 물질의 검출 방법을 포함한다. 병변 표지 물질의 검출 방법은 병변 표지 물질을 이용한 질병의 진단 방법에 상응할 수 있다. 일 구체예에서, 질병(장애를 포함함)은 감염성 질병, 증식성 질병, 신경퇴행성 질환, 암, 심리적 질환, 대사 질환, 자가면역 질환, 성매개 병, 위-장관 질환, 폐 질환, 심혈관 질환, 스트레스- 관련 장애, 피로-관련 장애, 진균병, 병원성 질환 또는 비만-관련 장애일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 병변 표지 물질의 검출 방법은 병변 표지 물질과 특이적으로 결합하는 제2수용체가 표면에 위치하는 기재와 병변 표지 물질을 함유할 수 있는 생체 유래 시료를 접촉시키는 단계; 생체 유래 시료와 접촉한 기재와 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자를 접촉시킨 후 세척하는 단계; 상기 라만 활성 입자와 접촉한 기재에 근적외선 여기광을 조사하고 기 설정된 면적으로 라만 맵핑을 수행하여 일 라만 신호의 라만 맵을 얻는 단계; 및 상기 라만 맵 상에서 상기 일 라만 신호에 대한 최대 강도를 합산한 합산 강도를 기반으로 생체 유래 시료 내 병변 표지 물질의 존재 여부 및 병변 표지 물질의 농도를 검출하는 단계;를 포함한다.
생체 유래 시료는 비제한적으로, 혈액, 혈액 생성물, 혈청, 혈장, 기타 혈액 분획물, 조직, 조직 추출물, 소변, 뇌척수액, 타액, 대변, 피부, 모발, 볼 조직, 기관 조직, 호흡, 흉수, 땀 또는 가래등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체 유래 시료는 그 자체로 액상이거나, 또는 액상이 아닌 경우 액화처리될 수 있다. 액화 처리된 생체 유래 시료는 해당 시료의 처리에 통상적으로 사용되는, 효소 또는 프로테아제, 단백질, 생체에서 채취된 시료를 처리하고 반감기를 증가시키기 위한 화합물 또는 보존제, 화학적 안정화제, 희석제, 완충제, 첨가제, 세정제, 리피드, 당, 탄수화물 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 일 예로, 뮤신, 프로테아제등과 같은 효소는 채취된 시료를 용해시킬 수 있다.
병변 표지 물질은 생체 유래 시료를 채취한 대상자의 질병 보유 유무를 판별하는데 기 사용되거나, 질병 진행 정도를 판별하는데 기 사용되는, 질병과 관련된 임의의 원자, 화학물질, 분자, 화합물, 또는 응집물일 수 있다. 일 예로, 병변 표지 물질은 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 신경전달물질, 항체등일 수 있다.
라만 스펙트럼은 통상의 라만 검출 장치를 이용하여 수득될 수 있다. 비제한적인 예로, 여기광은 공초점의 광학기 및 현미경 렌즈를 통과하여 활성 표면 상으로 초점이 모아질 수 있다. 활성 표면에 검출 대상 물질이 존재하는 경우, 검출 대상 물질로부터 방출된 라만 광은 현미경 렌즈 및 공초점 광학기에 의해 모아지고 스펙트럼 분리를 위해 단색광장치와 결합될 수 있다. 라만 신호는 신호를 카운팅하고 디지털화하는 컴퓨터와 인터페이스로 연결된 라만 검출기에 의해 검출될 수 있다.
본 발명은 상술한 라만 활성 입자를 포함하는 검출 장치를 포함한다.
본 발명에 따른 검출 장치는 표면 증강 라만 산란을 이용한 검출대상물질의 검출 장치로, 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자를 포함하는 표면증강라만산란-활성 시약; 및 검출대상물질과 특이적으로 결합하는 제2작용기가 표면(활성 표면)에 위치하는 기재;를 포함한다.
일 구체예에서, 기재의 표면(활성 표면) 또는 금속 쉘의 표면에는 수용체(제1수용체 또는 제2수용체)가 부착(결합)되지 않은 표면 영역을 덮는 블록킹 분자를 더 포함할 수 있다. 블록킹 분자는 수용체가 아닌 기재나 금속 쉘의 표면과 검출 대상 물질간의 원하지 않는 상호 작용을 방지하며, 기재나 금속 쉘의 표면에 위치한 수용체의 배향을 보다 일정하게 만드는 역할을 수행할 수 있다. 블록킹 분자는 소혈청 알부민(SBA)등과 같이 바이오 센서 분야에서 금속 표면에서의 비특이적 결합을 방지하기 위해 통상적으로 사용되는 물질이면 족하다.
본 발명은 상술한 라만 활성 입자의 제조방법을 포함한다. 이하, 본 발명에 따른 제조방법을 상술한다. 이때, 금속 코어, 라만 리포터, 자기조립단분자막, 금속 쉘, 검출 대상 물질, 수용체등은 앞서 라만 활성 입자에서 상술한 바와 유사 내지 동일하다. 이에, 본 발명에 따른 라만 활성 입자의 제조방법은 앞서 라만 활성 입자에서 상술한 모든 내용을 포함한다.
본 발명에 따른 라만 활성 입자의 제조방법은 표면 증강 라만 산란(SERS)용 라만 활성 입자의 제조방법이다. 본 발명에 따른 제조방법은 a) 구형의 플라즈모닉 금속 코어에 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막을 형성하는 단계; 및 b) 완충용액, 자기조립단분자막이 형성된 금속 코어 및 플라즈모닉 금속의 전구체가 혼합된 반응액을 이용하여, 자기조립단분자막이 형성된 금속 코어를 감싸며 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘을 형성하는 단계;를 포함한다.
본 발명에 따른 라만 활성 입자의 제조방법은 저비용으로 간단한 공정을 통해, 재현성과 신뢰성을 가지며 단분자 검출 가능한 민감도를 갖고, 별도의 후처리 없이도 생체적합성을 갖는 라만 활성 입자를 대량생산할 수다.
알려진 바와 같이 금속 나노입자화 및 설계된 형상화를 위해, 적절한 환원성을 제공하면서도 성장을 억제하거나 특정 방향으로의 성장을 유도하거나 및/또는 나노입자를 안정화시킬 수 있는 유기 계면활성제가 주지관용으로 사용되고 있으며, 이와 함께 유기산이 사용되거나 또는 계면활성제를 대체할 수 있는 유기산이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법으로 합성된 금속 나노입자에는 생체에 해롭고 생화학물질에 영향을 줄 수 있는 유기 계면활성제(또는 유기 계면활성제와 유기산 유래 유기물)이 결합되어 있다. 이에, 바이오 분야에 사용되기 위해서는, 생체적합성을 갖는 캡핑물질로 입자를 캡핑하거나 유기계면활성제등의 해로운 표면 작용기를 생체적합성을 갖는 다른 작용기로 치환시키는 등의 후처리 공정이 필수적으로 요구되고 있다.
그러나, 캡핑물질을 이용한 캡핑은 SERS 분광에 기반한 바이오센싱이나 바이오이미징의 강도를 크게 감소시킬 수 있으며, 유기계면활성제를 생체적합성 작용기로 치환하고자 하는 경우, 금속물질과 매우 강한 결합력으로 결합되는 유기계면활성를 완전한 치환하기 어려워 여전히 독성이 잔류하는 문제점이 있다.
상술한 본 발명에 따른 라만 활성 입자의 제조방법은 금속 표면(bare metal surface)을 갖는 금속 코어에 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막을 형성한 후, 이미 생체적합성을 갖는 완충용액과 금속 전구체를 함유하는 액을 이용하여 금속 쉘을 형성함에 따라, 제조된 라만 활성 입자가 생체에 유해한 유기 계면활성제로부터 자유로워 제조 직후 상태에서 생체적합성을 갖는 장점이 있다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 라만 활성 입자의 제조방법에 있어, 반응액은 계면활성제(유기계면활성제)를 함유하지 않을 수 있으며, 나아가, 반응액은 계면활성제와 유기산을 모두 함유하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 라만 활성 입자의 제조방법은, 금속 코어에의 라만 리포터 부착, 완충용액과 금속전구체를 함유하는 액을 이용한 금속 쉘 형성이라는 간단한 공정을 이용하여 라만 활성 입자를 제조함에 따라, 저비용으로 단시간에 라만 활성 입자를 대량생산할 수 있어, 우수한 상업성을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 라만 활성 입자의 제조방법은 라만 리포터를 포함한 유기물이 라만 활성 입자의 표면에 노출되어 있지 않고, 금속 쉘에 의해 감싸여 있음에 따라, 라만 리포터를 포함한 유기물이 외부 환경으로부터 안정적으로 보호될 수 있는 장점이 있다.
일 구체예에서, 금속 코어에 라만 리포터(Raman reporter)를 포함하는 자기조립단분자막을 형성하는 단계(b) 단계)는, 금속 코어와 라만 리포터를 함유하는 혼합액을 제조하고 초음파 교반하는 단계;를 포함할 수 있다.
구체적으로, a) 단계는 a1) 금속 코어와 라만 리포터의 몰농도가 0.01 내지 1nM과 10 내지 1000μM이 되도록 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; a2) 초음파 교반하며 10 내지 30분간 상온 반응시키는 단계; 및 a3) 라만 리포터가 고정된 금속 코어를 분리회수하는 단계;를 포함할 수 있다. 이때, 혼합액은 수계 혼합액일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
a) 단계가 수행된 후, b) 완충용액, 라만 리포터가 고정된 금속 코어(자기조립단분자막이 형성된 금속 코어) 및 금속 전구체가 혼합된 반응액으로부터 라만 리포터가 고정된 금속 코어를 감싸는 금속 쉘을 형성하는 단계가 수행될 수 있다. 라만 리포터가 고정된 금속 코어는 라만 리포터의 자기조립단분자막이 형성된 금속 코어일 수 있다.
b) 단계에서, 완충용액의 완충제와 금속 전구체의 몰비(완충제의 몰수를 금속 전구체의 몰수로 나눈 몰비)는 10 내지 100, 좋게는 20 내지 80일 수 있다. 몰비를 10 내지 100, 좋게는 20 내지 80으로 제어함으로써, 금속 코어에 고정된 라만 리포터를 온전하게 감싸는 얇은 금속 쉘을 형성할 수 있으며, 금속 미립자들에 의해 표면 요철을 갖는 금속 쉘을 형성할 수 있다.
완충용액은 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), PBS(Phosphated buffered saline), Tris(2-Amino-2hydroxymethyl propne-1,3-idol), PB(Phosphate buffer), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), TAPS(3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]propane-1-sulfonic acid) 및 PIPES(piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid))에서 선택되는 하나 이상을 함유할 수 있다. 이러한 완충용액의 완충제는 금속을 환원시키는 약한 환원제로 작용할 수 있고, 완충용액의 완충제에 의해 제조되는 라만 활성 입자의 안정화를 위한 계면활성제를 배재할 수 있다.
금속 전구체의 금속은 금, 은, 백금, 팔라디움, 니켈, 알루미늄, 구리 또는 이들의 혼합물 또는 이들의 합금등을 들 수 있다. 다만, 생체 안정성을 고려하여 금속 전구체의 금속은 금속 코어의 금속과 독립적으로 금 또는 은인 것이 좋다. 유리한 일 예에 따른 금속 전구체는 HAuCl4, HAuBr4, NaAuCl4, AuCl3 ·3H2O, NaAuCl4 ·2H2O, 또는 이들의 혼합물등과 같은 금 전구체일 수 있으며, 또는, AgNO3등과 같은 은 전구체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에서, b) 단계는, 완충용액, 금속 전구체 용액 및 라만 리포터가 고정된 금속 코어 분산액을 혼합하여 반응액을 제조하고, 15 내지 40℃의 온도, 구체적으로는 15 내지 35℃의 온도, 보다 구체적으로는 15 내지 25℃의 온도, 보다 더 구체적으로는 상온(21 내지 25℃)에서 반응이 수행될 수 있다. 반응액을 10분 내지 50분, 구체적으로는 20분 내지 40분동안 반응시켜 금속 쉘을 제조할 수 있으나, 본 발명이 반응액의 반응시간에 의해 한정되는 것은 아니다. 이때, 반응시 교반이 수행될 수 있으며, 반응의 종료는 반응액에 과량의 물을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
완충용액에서 완충제의 몰 농도는 10 내지 100mM일 수 있으며, 금속 전구체 용액에서 금속 전구체의 몰 농도는 1 내지 10mM일 수 있고, 라만 리포터가 고정된 금속 코어 분산액에서 금속 코어의 몰 농도는 0.01 내지 0.5nM일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
완충용액과 금속 전구체 용액은 상술한 완충제와 금속전구체간의 몰비를 만족하도록 혼합될 수 있으며, 금속 코어 분산액은 금속 전구체 : 금속 코어의 몰비가 1 : 1x10-7 내지 1x10-5이 되도록 혼합될 수 있다. 이때, 금속 코어(들)에 균일하게 금속 쉘이 형성될 수 있도록, 금속 전구체 용액과 금속 코어 분산액이 먼저 혼합된 후에 완충용액이 혼합될 수 있다.
상세하게, b) 단계는, b1) 금속 전구체 용액과 금속 코어 분산액을 혼합하여 전구체-금속 코어 혼합액을 제조하는 단계; b2) 전구체-금속 코어 혼합액에 완충용액을 혼합하여 반응액을 제조하고 15 내지 40℃의 온도, 유리하게는 상온에서 반응액을 반응시켜 라만 활성 입자를 제조하는 단계; 및 b3) 제조된 라만 활성 입자를 분리회수하고 회수된 라만 활성 입자를 완충용액(별도의 완충용액)에 투입하여, 1 내지 10℃의 온도, 구체적으로 1 내지 5℃의 온도로 보관하는 단계;를 포함할 수 있다.
b) 단계에 의해, 금속 코어, 금속 코어를 감싸는 라만 리포터의 자기조립단분자막, 자기조립단분자막을 감싸는 금속 쉘을 포함하는 라만 활성 입자가 제조될 수 있으며, 평균 150nm 이하의 크기, 구체적으로 평균 100nm이하의 크기, 실질적으로 40 내지 100nm, 보다 실질적으로 60 내지 100nm 크기의 라만 활성 입자가 제조될 수 있다.
일 구체예에 있어, 라만 활성 입자의 제조방법은 b) 단계 후, c) 금속 쉘에 검출 대상 물질과 결합(특이적으로 결합)하는 수용체를 고정하는 단계;를 더 포함할 수 있다. c) 단계는 제조된 라만 활성 입자 분산액에 수용체를 혼합하여 수행될 수 있으며, 수용체 별로 알려진 프로토콜에 따라 고정이 수행될 수 있음은 물론이다.
또한, a) 단계 전, 구형의 금속 코어가 금속 표면(bare metal surface)을 갖도록, 유기 용매등을 이용하여 금속 코어를 세척하는 단계가 더 수행될 수 있으나, 이러한 세척은 필요시 수행하는 것으로 족하다.
본 발명은 상술한 제조방법으로 제조된 라만 활성 입자를 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 라만 활성 입자를 관찰한 저배율(도 1(a)) 및 고배율(도 1(b)) 주사전자현미경 사진이다.
상세하게, 라만 활성 입자는 구형의 Au 나노 입자(직경=50nm)를 금속 코어로 1mM BSPP(Bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine dihydrate dipotassium salt) 용액 1mL와 혼합하고 10분동안 초음파처리하여 0.1nM 몰농도의 Au 코어 분산액을 제조하였다. Au 코어 분산액 1mL와 10mM 몰농도의 BDT(1,4-benzenedithiol) 용액 50μL와 혼합하고 10분동안 초음파처리한 후, 6000rpm으로 10분간 원심분리하여 라만리포터인 BDT의 자기조립단분자막이 형성된 Au 코어를 회수하였다. 회수된 자기조립단분자막이 형성된 Au 코어를 1mL의 탈이온수에 분산(0.1nM 몰농도)시키고, 분산액에 5mM HAuCl4 500μL와 pH7.2의 50mM HEPES 완충용액 2.5mL를 투입하고 1000rpm으로 30분간 교반한 후 과량의 탈이온수를 투입하여 반응을 종료시켰다. 이후 순착적으로 4000, 3000 및 2000 rpm 속도로 10분간 원심분리하여 제조된 라만 활성 입자를 회수하고, 50mM HEPES 완충용액 1ml에 투입하여 보관하였다.
도 1을 통해, Au 미립자들에 의해 표면 요철을 갖는 쉘이 형성된 라만 활성입자가 제조됨을 확인할 수 있다. 제조된 라만 활성입자의 평균 직경은 95nm 였으며, 쉘을 이루는 Au 미립자의 평균 크기는 22nm였다. 도 1과 같이, Au 미립자들이 돌출되며 쉘에 표면 요철이 형성됨을 알 수 있으며, 입자 중심을 기준으로 전 방위적으로 미립자의 돌출에 의한 요철이 고르게 형성된 것을 확인할 수 있다.
도 2는 제조된 라만 활성 입자를 관찰한 투과전자현미경 사진이다.
도 2를 통해, Au 코어와 Au 미립자들로 이루어진 다결정체의 Au 쉘 사이에 라만리포터의 자기조립단분자막이 위치하며, 입자 전 영역에 0.8nm 두께의 나노갭이 형성된 것을 확인할 수 있다.
도 3은 Au 코어 자체(도 3의 cpre AuNP), 자기조립단분자막이 형성된 Au 코어(도 3의 BDT-treated AuNP) 및 제조된 라만 활성 입자 각각의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 도시한 도면이다. 도 3에서 알 수 있듯이, Au 코어와 자기조립단분자막이 형성된 Au 코어는 실질적으로 거의 유사한 흡수 스펙트럼을 나타내나, 제조된 라만 활성 입자의 경우 흡수 피크가 약 620nm로 이동함을 알 수 있다. 또한, Au 코어나 자기조립단분자막이 형성된 Au 코어와 달리, 제조된 라만 활성 입자의 경우 피크의 반치폭이 200nm 이상으로 매우 브로드한 흡수 피크를 가짐을 알 수 있다. 또한, 제조된 라만 활성 입자가 약 620nm 부근에서 매우 큰 흡수도를 가지나, 750nm 이상, 구체적으로 780nm 이상의 근적외선에 대해서도 상당한 흡수도를 가짐을 알 수 있다.
도 4는 제조된 라만 활성 입자 자체의 라만 스펙트럼을 측정 도시한 도면으로, 532nm 레이저(5mW), 633nm 레이저(5mW) 또는 780 nm 레이저(5mW)를 조사하여 수득된 스펙트럼이다. 도 4에서 알 수 있듯이, 633nm 광을 조사하는 경우 가장 높은 강도의 라만 신호가 얻어지나, 780nm의 근적외선 광 조사시에도 여전히 강한 라만 신호가 얻어짐을 알 수 있다. 또한, 도 4에서 알 수 있듯이, 가시광 영역대의 광을 조사하는 경우 매우 큰 기저 형광이 발생한다. 그러나, 780nm의 근적외선 광 조사시 검출 시그널에 영향을 미칠 정도로 유의미한 기저 형광이 발생하지 않음을 알 수 있다. 이에, 본 발명의 일 구체예에 따른 라만 활성 입자에 근적외선을 조사하여 라만 분광 분석을 수행하는 경우, 별다른 신호 처리 없이, 검출된 시그널의 강도를 바로 라만 신호 강도로 사용할 수 있음을 알 수 있으며, 신뢰성 있는 라만 분석이 수행될 수 있음을 알 수 있다. 알려진 바와 같이, 기저 형광을 제거하기 위한 신호 처리 과정은 라만 신호의 왜곡을 야기할 수 있어, 특히 정량 분석시 문제가 된다.
도 5는 실리콘 기판에 제조된 라만 활성 입자(α, β, γ)를 위치시킨 후 관찰한 주사전자현미경 사진(도 5(a)) 및 주사전자현미경으로 관찰한 영역의 라만 맵핑(780nm 레이저, 5mW)을 도시한 도면이다. 도 5에서 알 수 있듯이, 제조된 라만 활성 입자가 매우 균일한 라만 활성을 가짐을 알 수 있다.
도 6은 도 5에서 라만 맵핑된 라만 활성 입자(α, β, γ) 각각의 라만 스펙트럼을 중첩 도시한 도면이다. 도 6에서 알 수 있듯이, 라만 활성 입자간 실질적으로 동일한 라만 스펙트럼이 얻어짐을 확인할 수 있다.
유사하게, 제조된 라만 활성 입자 60개를 대상으로 각 라만 활성 입자의 라만 스펙트럼을 얻은 후, 하나의 라만 피크를 대상으로 피크 강도의 평균값 및 표준편차를 측정한 결과, 87.6(a.u.) 평균 및 7.5(a.u.)의 표준편차를 가져, 입자간 극히 균일한 라만 활성을 나타냄을 확인하였다.
도 7은 타우(tau) 단백질을 검출 대상 물질로, 서로 다른 항원 결정기(epitope)를 갖는 단일 클론성 타우 안티바디(monoclonal tau antibody)를 제1수용체와 제2수용체로 하고, 타우(tau) 단백질을 1 pg/mL의 농도로 함유하는 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 완충용액을 시료로 하여 얻어진 라만 스펙트럼(도 7(a)) 및 라만 맵(1555 cm-1의 라만 신호를 이용, 도 7(b))을 도시한 도면이다.
상세하게, 제1수용체가 형성된 라만 활성 입자 및 제2수용체가 형성된 기판은 다음과 같이 제조되었다. 제1수용체가 형성된 라만 활성 입자: 도 1의 관찰 사진과 같이 제조된 라만 활성 입자의 분산액(입자 농도 1 nM) 1mL에 1 μM MUA(11-Mercaptoundecanoic acid)를 투입하고 밤새 방치한 후, 원심분리(3000rpm, 10분)하여 입자를 회수하였다. 이후 20μM EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 5μM NHS(N-hydroxysuccinimide)를 회수된 라만 활성 입자에 투입하고 15분 동안 반응시킨 후, 원심분리(3000rpm, 10분)하여 카르복실기로 표면 개질된 라만 활성 입자를 회수하였다. 이후, 카르복실기로 표면 개질된 라만 활성 입자를 10μg/mL 농도로 단일 클론성 타우 안티바디(제1수용체)를 함유하는 50mM HEPES 완충용액(pH 7.4) 1mL에 투입한 후 2시간 동안 반응시키고, 동일 용액에 1중량%가 되도록 BSA(Bovine serum albumin)을 투입한 후 1시간 동안 반응시킨 후, 원심분리(3000rpm, 10분)하여 제1수용체 및 블록킹 분자가 형성된 라만 활성 입자를 제조하였다. 제조된 라만 활성 입자(이하, 타우 프로브)는 50mM HEPES 완충용액 1mL에 분산 보관되었다.
제2수용체가 형성된 기판 : 금(Au) 표면을 갖는 기판을 1 mM MUA(11-Mercaptoundecanoic acid) 용액에 밤새 담근 후, 에탄올/탈이온수로 세척하였다. 이후, 200mM EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 50mM NHS(N-hydroxysuccinimide)를 탈이온수에 섞은 용액에 회수된 기판을 담궈 30분동안 반응시킨 후 다시 탈이온수로 세척하여, 카르복실기로 표면 개질된 금 기판을 제조하였다. 제조된 카르복실기로 표면 개질된 금 기판에 50μg/mL 농도로 제1수용체와 다른 항원 결정기를 갖는 단일 클론성 타우 안티바디(제2수용체)를 함유하는 50mM HEPES 완충용액(pH 7.4) 20mL를 도포하고 1 시간 동안 반응시킨 후, 1중량%의 BSA(Bovine serum albumin) 용액으로 세척하여, 제2수용체가 형성된 기판(이하, 타우 기판)을 제조하였다.
시료 검출은 다음과 같이 수행되었다. 제조된 타우 기판(기판 크기=1cmx1cm, 활성 표면 면적=1μmx1μm)에 0.1mL의 시료를 떨어뜨려 60분동안 반응시킨 후 탈이온수를 이용하여 미반응 시료를 세척 제거하였다. 이후, 시료와 반응한 타우 기판에 0.5nM 농도로 타우 프로브를 함유하는 50mM HEPES 완충용액 200μL를 떨어뜨린 후 1시간 동안 반응시킨 후, 탈이온수를 이용하여 미반응 타우 프로브를 세척 제거하였다.
라만 분석은 다음과 같이 수행되었다. 780nm 레이저 여기광, 5mW 레이저 파워, N.A.0.75 렌즈, 1초의 획득 시간(acquisition time), 1μm 맵핑 피치(Mapping pitch), 40μmx40μm 맵핑 영역 크기, 1555 cm-1 라만 신호의 맵핑 이미지
도 8은 타우 기판의 제2수용체에 타우 단백질이 결합하고, 기판에 결합된 타우 단백질에 타우 프로브가 결합된 구조를 도시한 일 모식도이다. 도 8에 도시한 일 예와 같이, 검출대상물질은 제2수용체에 의해 활성 표면에 고정되게 되며, 활성 표면에 고정된 검출대상물질에는 제1수용체에 의해 라만 활성 입자가 고정될 수 있다. 도 7의 라만 맵에서 라만 신호가 검출되는 포인트(도 7의 사각 점들)들 각각은 도 8과 같은 활성표면-검출대상물질-라만활성입자의 결합 구조가 형성된 영역에 상응한다.
도 9는 도 7과 동일한 타우 기판 및 타우 프로브를 이용하고, 동일한 라만 분석을 수행하되, 타우(tau) 단백질을 1 pg/mL, 100 fg/mL, 10 fg/mL 또는 1 fg/mL의 농도로 함유하는 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 완충용액을 시료하여 수행된 라만 맵핑 결과를 도시한 도면이다. 도 9에서 알 수 있듯이, 시료 내 분석대상물질의 농도가 증가할수록 활성 표면과 라만 활성 입자 각각 결합하여 활성 표면과 라만 활성 입자 사이에 고정되는 분석대상물질의 수가 증가하며, 도 9와 같은 라만 맵에서 라만 신호가 검출되는 포인트들의 수가 증가하게 된다.
도 10은 도 7 및 도 9와 같이 타우 단백질 농도를 달리한 시료(표준 시료)를 분석하여 수득된 타우 단백질 몰 농도의 로그 값-합산 강도의 기준 그래프(도 10에서 Tau in PBS=표준 시료의 측정값, 직선=기준 그래프) 및 인체에서 채취된 뇌척수액(도 10의 Tau in aCSF)이나 혈장(도 10의 Tau in plasma)을 시료로 검출된 결과를 도시한 도면이다. 이때, 합산 강도는 각 시료를 이용하여 측정된 라만 맵에서 라만 신호가 검출되는 포인트들 각각에서의 최대 강도를 합산한 강도이며, 표준 시료와 인체에서 채취된 시료의 타우 단백질 검출시, 라만 맵핑 영역이나 라만 분석 조건, 시료 검출 조건(도포되는 라만활성 입자 분산액의 농도 및 양등)등은 모두 동일하였다.
도 10에서 알 수 있듯이, 타우 단백질의 몰농도의 로그값-합산 강도의 세미 로그 그래프에서, 타우 단백질의 몰농도의 로그값(MC)과 합산강도(Isum)가 MC= aIsum + b(a, b는 실수)의 선형 관계를 가짐을 알 수 있으며, 결정계수(R2)가 0.983으로, 10-2~106 fM의 매우 넓은 농도 범위에서 극히 우수한 선형성을 유지함을 알 수 있으며, 검출 한계(LOD)가 약 20aM 수준으로, 하나의 타우 단백질도 검출 가능한 민감도를 가짐을 알 수 있다.
또한, 도 10에서, 기준 그래프를 이용하여 뇌척수액 시료(도 10의 Tau in aCSF)나 혈장 시료(도 10의 Tau in plasma) 내 타우 단백질 농도를 정량 검출한 결과와 각 시료에 실제 함유된 타우 단백질 농도를 비교한 결과, 약 97%에 이르는 정확도로 타우 단백질이 정량 검출됨을 확인하였다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자;를 검출 대상 물질을 함유할 수 있는 시료;와 접촉시키고, 여기광을 조사하여, 시료 내 검출 대상 물질을 검출하는 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 여기광은 근적외선인 검출 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    a) 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 제2수용체가 표면에 위치하는 기재와 시료를 접촉시키는 단계;
    b) 상기 시료와 접촉한 기재에 상기 라만 활성 입자를 접촉시키는 단계;
    c) 상기 라만 활성 입자와 접촉한 기재에 여기광을 조사하여 라만 스펙트럼을 얻는 단계; 및
    d) 상기 라만 스펙트럼을 기반으로, 시료 내 검출 대상 물질의 존재 여부 및 검출 대상 물질의 농도를 검출하는 단계;
    를 포함하는 검출 방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 여기광 조사시, 기 설정된 면적으로 라만 맵핑을 수행하여 일 라만 신호의 라만 맵을 얻는 단계;를 포함하며, 상기 라만 맵 상에서 상기 일 라만 신호에 대한 최대 강도를 합산한 합산 강도를 기반으로 시료 내 검출 대상 물질의 존재 여부 및 검출 대상 물질의 농도를 검출하는 검출 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 검출 대상 물질의 농도는 하기 식 1에 의해 산출되는 검출 방법.
    (식 1)
    MC= aIsum + b
    (식 1에서 MC는 검출 대상 물질의 몰 농도의 로그 값이며, Isum은 합산 강도이다)
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 식 1의 검출 한계(LOD; limit of detection)는 20 aM 이하인 검출 방법.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 a) 단계 후 미반응 시료를 제거하는 단계 및 b) 단계 후 미반응 라만 활성 입자를 제거하는 단계를 더 포함하는 검출 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 검출대상물질은 병변 특이성을 갖는 병변 표지 생체물질, 병원체, 단백질, 핵산, 당, 약물 및 생화학물질에서 하나 또는 둘 이상 선택되는 검출 방법.
  9. 제 4항에 있어서,
    상기 라만 맵은 기저 형광의 제거가 수행되지 않은 검출 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 플라즈모닉 금속 쉘은 금속 코어의 직경(D) 기준 0.1D 내지 0.6D의 평균 크기를 갖는 플라즈모닉 금속 미립자를 포함하며, 상기 플라즈모닉 금속 미립자에 의한 표면 요철을 갖는 검출 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 플라즈몬 금속 쉘에서, 상기 자기조립단분자막과 접하는 쉘의 내면 형상은 구형인 검출 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 자기조립단분자막의 두께는 0.5 내지 2.0nm인 검출 방법.
  13. 질병 진단을 위한 병변 표지 물질의 검출 방법으로,
    병변 표지 물질과 특이적으로 결합하는 제2수용체가 표면에 위치하는 기재와 병변 표지 물질을 함유할 수 있는 생체 유래 시료를 접촉시키는 단계;
    생체 유래 시료와 접촉한 기재와 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자를 접촉시킨 후 세척하는 단계;
    상기 라만 활성 입자와 접촉한 기재에 근적외선 여기광을 조사하고 기 설정된 면적으로 라만 맵핑을 수행하여 일 라만 신호의 라만 맵을 얻는 단계; 및
    상기 라만 맵 상에서 상기 일 라만 신호에 대한 최대 강도를 합산한 합산 강도를 기반으로 생체 유래 시료 내 병변 표지 물질의 존재 여부 및 병변 표지 물질의 농도를 검출하는 단계;
    를 포함하는 검출 방법.
  14. 구형의 플라즈모닉 금속 코어, 표면 요철을 갖는 플라즈모닉 금속 쉘, 상기 코어 및 쉘 각각과 결합하며 상기 코어와 쉘 사이에 위치하며 라만 리포터를 포함하는 자기조립단분자막 및 상기 플라즈모닉 금속 쉘의 표면에 위치하며 검출 대상 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1수용체를 포함하는 라만 활성 입자를 포함하는 표면증강라만산란-활성 시약; 및
    검출대상물질과 특이적으로 결합하는 제2작용기가 표면에 위치하는 기재;
    를 포함하는 검출 장치.
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