KR101480780B1 - 단결정 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터 및 이를 포함하는 생체물질 전달장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단결정 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터, 이를 포함하는 생체물질 전달장치 및 상기 나노 인젝터를 이용하여 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법에 관한 것으로, 상기 나노 인젝터는 생활성 물질이 하기 금 나노선의 표면에 부착되거나 분리될 수 있는 단결정 금 나노선; 및 상기 금 나노선을 지지하여 고정시키고 외부의 전기신호를 상기 금나노선에 전달하며, 표면이 노출되지 않도록 절연체로 코팅된 금속 팁;을 포함하여 이루어진다.

Description

단결정 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터 및 이를 포함하는 생체물질 전달장치{NANO INJECTOR INCLUDING SINGLE-CRYSTALLINE AU NANOWIRE, AND EQUIPMENT FOR DELIVERING BIOMATERIAL INCLUDING THE SAME}

본 발명은 단결정 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터, 이를 포함하는 생체물질 전달장치 및 상기 나노 인젝터를 이용하여 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법에 관한 것이다.

생물학적으로 활성을 띄는 물질을 특정한 단일 세포에 정확하게 전달하는 것은 근본적인 세포 생물학적 현상을 이해하는데 귀중한 실마리를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 이를 제어함으로써 다양한 응용이 가능하여 가치가 있다. 예를 들어, 배아줄기 세포에 특정 유전자 또는 DNA를 주입하여 특정 유전자가 발현 또는 억제된 형질전환 동물을 만들 수 있다.

상기 세포 속으로 전달되는 생물학적으로 활성을 띄는 물질로서 DNA 또는 RNA를 포함한 유전자, 단백질 또는 생리활성을 보이는 단분자 화합물 등이 포함될 수 있다. 예를 들어 DNA 전달의 경우, 이는 DNA 백신 및 유전자 치료를 위한 연구에 응용될 수 있는 핵심적인 기술이며, 또한 유전자 기능을 조사하고 기초적인 생물학적 메커니즘을 이해하는데 있어 유용하게 응용될 수 있다. 또한 생리활성을 보이는 단분자 화합물의 경우 약물이 세포 소기관 또는 세포질 내 어디에 전달되었는지에 따라 다른 영향을 보이므로 세포내 특정 위치 또는 세포 소기관에 선택적으로 약물을 전달하는 것은 매우 중요한 가치를 지닌다.

상기 생활성 물질을 세포 안으로 직접적으로 전달하기 위한 이상적인 물리/화학적 방법은 세포 활성에 끼치는 손상을 최소화하면서 신속한 시간내에 전달이 가능하며 공간적으로 정교하게 필요한 위치에 물질전달이 이루어져야 하며 또한 정량적으로 원하는 함량만큼을 전달할 수 있어야 한다.

한편, 상기 생물학적으로 활성을 띄는 물질을 특정한 단일 세포에 정확하게 전달하기 위해 나노 바늘(nano needle)을 사용할 수 있는데, 이는 나노 스케일을 갖는 바늘로서 이의 표면에 생물학적으로 활성을 띄는 물질 또는 상기 생물학적으로 활성을 띄는 물질을 포함하는 지지체 등을 부착시켜 세포내로 전달하는 기능을 한다.

상기 나노 바늘을 이용하여 세포내 특정위치에 생물학적으로 활성을 띄는 물질을 전달하는 종래 기술로서, Nanomedicine: nanotechnology, Biology, and Medicine 4 (2008), 215-225 에서는 AFM 팁에 DNA를 부착하여 이를 이용하여 DNA를 단일 세포에 전달하는 기술에 관해 기재되어 있고, 또한 Nano Letters, 2009, vol.9, 2193-2198에서는 금 코팅된 질화붕소 나노바늘에 의해 양자점을 세포내 특정위치에 전달하는 기술에 관해 기재되어 있다.

그러나, 종래기술을 포함하는 상기와 같은 나노바늘을 이용한 세포내 특정위치에 전달하는 기술에도 불구하고, 나노 바늘의 소형화를 통해 세포 활성에 끼치는 손상을 최소화하면서 신속한 시간내에 전달이 가능하며 공간적으로 필요한 위치에 정교하게 물질전달이 이루어질 수 있는 나노 바늘을 포함하는 나노인젝터 및 이를 이용하여 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법에 관한 지속적인 연구 개발이 요구되고 있다.

Nanomedicine: nanotechnology, Biology, and Medicine 4 (2008), 215-225 Nanoletters, 2009, vol.9, 2193-2198

본 발명은 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하기 위한 나노 바늘의 소형화를 통해 세포 활성에 끼치는 손상을 최소화하면서도, 신속한 시간내에 전달이 가능하며 공간적으로 필요한 위치에 정량적으로 물질전달이 이루어질 수 있는 나노 바늘을 포함하는 나노인젝터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노인젝터를 포함하는, 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 장치 및 방법을 제공하는 것이다.

상기 일 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 생활성 물질이 하기 금 나노선의 표면에 부착되거나 분리될 수 있는 단결정 금 나노선; 및 상기 금 나노선을 지지하여 고정시키고 외부의 전기신호를 상기 금나노선에 전달하며, 표면이 노출되지 않도록 절연체로 코팅된 금속 팁;을 포함하는, 나노 인젝터를 제공한다.

일 실시예로서, 상기 생활성 물질은 DNA, RNA, 단백질, 생리 활성을 가지는 유기화합물, 또는 생리 활성을 가지는 유기금속 화합물일 수 있다.

일 실시예로서, 상기 단결정 금 나노선은 직경이 20 내지 300 nm이고, 그 길이는 1 내지 100 μm일 수 있다. 이 경우에 상기 단결정 금 나노선은 기상이송법에 의해 제조된 것일 수 있다.

일 실시예로서, 상기 금 나노선은 전도성 접착제에 의해 금속 팁에 고정될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 나노 인젝터는 나노 인젝터내 금 나노선에 전압을 공급함으로써 전압에 의해 분리되는 연결기(linker)로 금 나노선에 연결되어 있는 생활성 물질이 금 나노선으로부터 분리되는 것을 특징으로 할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 나노 인젝터는 일단부에 상기 금 나노선을 포함하는 금속팁이 부착되며, 내부에는 상기 금속팁으로 외부의 전기신호가 전달되도록 배선이 연결되되, 외부는 절연되어 있는 본체를 추가로 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 나노 인젝터는 기판을 포함하며, 상기 금나노선을 포함하는 금속팁이 기판상에 고정되고, 상기 기판상 또는 기판내에 형성된 배선이 상기 금속팁과 연결되고, 상기 금속팁과 연결되는 반대쪽의 배선을 외부와 연결함으로써 상기 나노 인젝터의 금속팁으로 외부의 전기신호가 전달되도록 할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 나노 인젝터를 포함하는 작동 전극, 상기 작동전극에 대응하는 상대(counter) 전극, 상기 작동전극내의 금 나노선과 생활성 물질이 주입되는 세포를 관찰가능한 광학 현미경, 및 상기 나노 인젝터내 금 나노선에 전기신호를 제공하는 전기신호 공급부를 포함하는, 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 장치를 제공할 수 있다.

이 경우에 상기 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 장치는 기준전극을 추가적으로 포함함으로써 3전극 시스템으로 구성될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 전기신호 공급부는 나노 인젝터내 금 나노선에 전압을 공급함으로써 전압에 의해 분리되는 연결기로 금 나노선에 연결되어 있는 생활성 물질이 금 나노선으로부터 분리되는 것을 특징으로 할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 나노 인젝터의 움직임은 상기 광학 현미경의 관찰하에 3차원 피에조일렉트릭 스테이지로 구성된 나노 조작기(nanomanipulator)를 이용하여 조절될 수 있다.

또한 본 발명은 생활성 물질을 단결정 금 나노선을 포함하는 상기 나노 인젝터(nano-injector)에 접촉시켜 금 나노선에 생활성 물질이 부착되도록 하는 단계; 상기 나노 인젝터내 생활성 물질이 부착된 금나노선 부분을 체외에서 세포내에 주입하는 단계; 및 상기 세포내에 주입된 금 나노선으로부터 상기 생활성 물질을 분리시키는 단계;를 포함하는, 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법을 제공한다.

일 실시예로서, 상기 금 나노선에 생활성 물질이 부착되도록 하는 단계는 상기 생활성 물질내 포함된 황원자가 금 나노선의 금 표면내 금원자와 결합함으로써 단결정 금나노선에 생활성 물질이 부착되거나, 생활성 물질이 전하를 띠는 경우 금 나노선 표면에 생활성 물질과 반대의 전하를 띄는 물질을 부착한 뒤, 정전기적 인력에 의해 상기 생활성 물질이 금 나노선에 부착될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 세포내에 주입된 금 나노선으로부터 상기 생활성 물질을 분리하는 단계는 전기펄스를 이용함으로써 생활성 물질이 분리될 수 있다.

일 실시예로서, 전기펄스를 이용하여 생활성 물질이 분리되는 경우에 상기 전기펄스는 기준 전극으로 포화 카로멜 전극 사용시 -0.7 내지 -1.0 V의 범위로 30초 내지 5분 적용될 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 실시예들에 따른 나노 인젝터를 이용하는 경우에 매우 작은 직경을 가짐으로써, 나노 바늘의 소형화를 통해 세포 활성에 끼치는 손상을 최소화할 수 있고 또한 공간적으로 필요한 위치에 정량적으로 물질전달이 이루어질 수 있는 장점이 있다.

또한 상기 나노 인젝터를 이용하여 전기적 펄스를 제공함으로써 생활성 물질을 분리하게 되면 생활성 물질을 세포내 정밀하게 제어된 특정한 위치로 전달하면서도, 신속한 시간내에 전달이 가능한 장점이 있다.

또한 본 발명의 상기 나노인젝터는 높은 유연성을 가짐으로써 기계적 특성이 우수하며, 또한 뛰어난 전기 전도성으로 인해 세포 안으로 생분자의 효율적 전기화학적 전달을 가능하게 하는 장점이 있다.

도 1(a) 내지 1(c)은 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이고, 도 1(d) 내지 1(g)는 이에 의해 제조되는 나노 인젝터의 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM) 사진 및 광학현미경 사진들이다.
도 2(a)는 본 발명에 의해 제작된 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터로서 금속팁이 절연체로 코팅되기 전의 SEM사진이고 도 2(b)는 상기 금 나노선의 끝 부분의 확대된 SEM 사진을 나타내며, 도 2(c)는 금속팁이 절연체로 코팅후의 SEM사진이다.
도 3a 내지 3c는 금 나노선을 포함하는 나노인젝터를 고체 표면에 대고 눌렀을 때 나노선이 유연하게 휘어지고, 다시 들어올렸을 때 나노선이 곧은 형태로 회복되는 것을 보여주는 광학 사진이고, 도 3d 내지 3f는 상기 나노인젝터내의 금 나노선이 세포에 삽입되었을 때 금 나노선 나노인젝터가 약간 휘어지는 것을 보여주는 광학 사진이다.
도 4는 생활성 물질이 부착된 본 발명의 나노 인젝터의 금 나노선이 세포의 핵내로 삽입된 것을 나타내는 광학 사진이다.
도 5는 본 발명에서의 나노 인젝터의 금 나노선에 생활성 물질로서 DNA가 부착된 금 나노선이 세포의 핵내로 삽입되어 방출되는 것을 나타내는 모식도이다.
도 6은 본 발명에 의해 제작된 나노인젝터를 포함하는 장치를 간략하게 도시한 그림이다.
도 7a는 본 발명에서 금 나노선 나노인젝터 표면에 Cy3-incorporated DNA를 부착시킨 후, 일정한 시간 동안 다양한 전압의 전기 pulse를 가한 뒤 관찰한 금 나노선 표면의 형광을 나타내고, 도 7b는 도 7a에서 전압을 고정시켜 펄스를 가하는 시간을 변화시키며 관찰한 금 나노선 표면의 형광을 나타내며, 도 7c는 전기 pulse를 가하기 전 Cy3-incorporated DNA가 부착된 금 나노선의 광학 및 형광 사진을 나타내고, 도 7d는 인가된 전기 pulse의 전압 및 펄스를 가한 시간과 금 나노선 표면에 남아있는 Cy3 형광 세기와의 관계를 도시한 그래프이다.
도 8은 본 발명에서 금 나노선 나노인젝터를 이용하여 DNA를 전달한 세포의 수와 전달된 DNA 양의 관계를 도시한 그래프이다.
도 9(a)는 본 발명의 금 나노선을 포함하는 나노인젝터를 이용하여 SK-N-SH 세포에 녹색 형광 단백질을 encoding 하고 있는 선형 DNA를 주입시킨 후 48 시간 동안 배양한 뒤에 측정한 세포의 형광사진이고, 도 9(b)는 도 9(a)의 광학사진이며, 도 9(c)는 상기 형광과 광학이 중첩된 사진을 도시하였고. 도 9(d)는 본 발명에서 상기 금 나노선을 포함하는 나노인젝터를 이용하여 SK-N-SH 세포에 녹색 형광 단백질을 encoding 하고 있는 플라스미드를 주입시킨 후 48 시간 동안 배양한 뒤에 측정한 세포의 형광사진이고, 도 9(e)는 도 9(d)의 광학사진이며, 도 9(f)는 상기 형광과 광학이 중첩된 사진을 도시한 그림이다.

본문에 개시되어 있는 본 발명의 실시예들에 대해서, 특정한 구조적 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본문에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 생활성 물질이 하기 금 나노선의 표면에 부착되거나 분리될 수 있는 단결정 금 나노선; 및 상기 금 나노선을 지지하여 고정시키고 외부의 전기신호를 상기 금나노선에 전달하며, 표면이 노출되지 않도록 절연체로 코팅된 금속 팁;을 포함하는, 나노 인젝터를 제공한다.

상기 본 발명의 나노 인젝터는 단결정 금 나노선(Single-Crystalline Au Nanowire)를 이용하여 구현될 수 있는데, 상기 금 나노선은 기판 상에 금(Au) 증기를 공급하여 에피택셜(epitaxial) 성장시키는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명에서의 상기 금 나노선은 촉매를 사용하지 않고 기판상에 금(Au) 증기를 공급하여 에피택셜(epitaxial) 성장시킴으로써 형성시킬 수 있다. 만약에 촉매를 사용하여 금 나노선을 형성하는 경우에는 촉매로 인해, 금 나노선의 합성이 끝난 후에도 전극 표면에 촉매 잔유물 등이 남아 있을 수 있고 이는 최종적으로 비효율적이거나 원치 않는 신호 전달이 일어날 수 있어 바람직하지 않은 결과를 보여줄 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 단결정 금 나노선은 상대적으로 매끄러운 표면을 가질 수 있다. 예를 들어, 탑-다운(top-down) 방식으로 제조된 종래의 금 나노선은 수 나노미터(㎚)수준의 표면 거칠기를 가지지만, 상기와 같은 제조방법을 이용하여 합성된 단결정 금 나노선은 원자 수준의 표면 거칠기, 즉 종래의 금 나노선에 비하여 매우 매끄러운(ultra-smooth) 표면을 가질 수 있다.

상기 단결정 금 나노선은 기판 상에 금 증기를 기상 이송법에 의해 공급하여 금 나노선을 에피택셜 방식으로 성장시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 기판으로서 c-cut 사파이어 기판을 사용할 수 있다. 상기 c-cut 사파이어 기판은 금과 우수한 격자 일치성을 가지므로 기판상에 수직으로 금 나노선이 용이하게 성장될 수 있다.

상기 기상 이송 방법을 수행하기 위한 장치인 반응로(Furnace)는 수평으로 배치된 석영관(Quartz tube)으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 석영관의 지름은 약 1인치일 수 있고, 상기 반응로는, 전단부에 선구물질(precursor)인 금 슬러그(Au slug)를 투입하기 위한 알루미나 재질의 보트형 용기(Alumina boat)를 포함하며, 후단부에 상기 단결정 금 나노선이 합성되는 단결정 기판(Substrate)(예를 들어, 사파이어 기판)을 포함할 수 있다. 불활성 기체(예를 들어, 아르곤(Ar) 기체)는 상기 반응로의 전단부로 투입되어 후단부로 배기될 수 있다. 상기 반응로는 후단부에 배치되는 진공 펌프를 더 포함할 수 있으며, 발열 장치 및 온도 조절 장치를 더 포함할 수 있다.

예시적인 실시예들에 따르면, 금 증기가 상기 기판 상에 도입되면서 상기 기판 표면 상에 반-팔면체(half-octahedral) 형상의 씨드(seed)가 지배적으로 형성될 수 있다. 이후, 상기 씨드로부터 금 나노선이 에피텍셜(epitaxial) 방식으로 성장될 수 있다.

예시적인 실시예들에 따르면, 상기 기판 상에 공급되는 금 증기의 유량을 조절함으로써, 상기 금 나노선의 성장 방향을 결정할 수 있다. 상기 금 증기의 유량이 상대적으로 작을 경우에는 상기 금 나노선은 상기 기판에 대해 실질적으로 수직한 방향으로 성장될 수 있다. 한편, 상기 금 증기의 유량이 상대적으로 클 경우에는 상기 금 나노선은 상기 기판에 대해 실질적으로 평행한 방향으로 성장될 수 있다.

예를 들어, 상기 금 증기의 유량이 1100 ℃, 약 100 내지 약 250 sccm인 범위인 경우 상기 기판에 대해 수직한 방향으로 성장된 금 나노선이 지배적으로 형성될 수 있다. 상기 금 증기의 유량이 약 400 sccm 이상으로 증가되는 경우, 상기 기판에 대해 평행한 방향으로 성장된 금 나노판이 지배적으로 형성될 수 있다.

도 1(a) 내지 1(c)은 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이고, 도 1(d) 내지 1(g)는 이에 의해 제조되는 나노 인젝터의 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM) 사진 및 광학현미경 사진들이다.

상기 도 1(a) 내지 1(c)에 따르면, 상기 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터는 기판 상에 단결정의 금 나노선을 형성하는 단계; 금속 팁의 단부에 전도성 접착제를 부착하는 단계; 상기 전도성 접착제가 부착된 금속 팁의 단부를 기판상에 형성된 금 나노선의 상단부와 접촉함으로써, 금 나노선을 기판으로부터 분리하여 상기 금속 팁에 부착시키는 단계; 및 상기 금 나노선이 부착된 금속 팁의 금속 표면이 노출되지 않도록 절연체로 코팅하는 단계;를 포함하여 이루어진다.

상기 기판 상에 단결정의 금 나노선을 형성하는 단계는 앞서 기재한 바에 의해 형성될 수 있고, 금속 팁의 단부에 전도성 접착제를 부착하는 단계에서의 금속팁은 금, 은, 백금, 구리, 텅스텐 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 합금이 사용될 수 있고, 바람직하게는 텅스텐이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 금속팁에 금 나노선을 부착하기 위해 사용되는 상기 전도성 접착제는 전도성을 띠며 두 종류의 금속을 접착에 의해 연결할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있으나, 바람직하게는 입자 형태의 은이 열경화성, 열가소성, 또는 자외선 경화성 수지에 배합되어 있는 혼합물 중에서 선택되는 어느 하나가 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 금속 팁에 금 나노선을 결합시켜 부착하는 단계는 피에조일렉트릭 스테이지로 구성된 나노 조작기(nanomanipulator)를 이용하여 결합시킬 수 있다. 상기 나노조작기는 x축, y축, z축 방향으로 나노미터(nm)의 단위로 움직임이 가능한 것으로서, 일예로서, 고정판 위에 설치된 x축, y축, z축 스테이지 및 상기 각 스테이지에 설치되어 각 스테이지를 나노미터(nm)의 단위로 이동시키는 압전 모터를 구비할 수 있다. 즉, x축 스테이지는 압전 모터에 의해 x축 방향으로 자유도를 가지며 이동되고, y축 스테이지는 압전 모터에 의해 y축 방향으로 자유도를 가지며 이동되며, z축 스테이지는 압전 모터에 의해 z축 방향으로 자유도를 가지면 이동될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 금속팁의 금속 표면을 절연체로 코팅하는 단계에서 사용되는 절연체는 열경화성 수지 또는 열가소성 수지를 용제에 녹인 바니시, 또는 열경화성 수지 또는 열가소성 수지를 용제에 녹이고 이에 안료를 포함하는 바니시, 또는 자외선에 의해 경화되는 절연성 접착제에서 선택되는 어느 하나를 금속표면에 코팅함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에서 금 나노 전극에 사용될 수 있는 금 나노선의 길이와 직경은 제조공정에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 20 내지 300 nm이고, 그 길이는 1 내지 100 μm일 수 있다.

본 발명에서 상기 나노 인젝터는 일단부에 상기 금 나노선을 포함하는 금속팁이 부착되며, 내부에는 상기 금속팁으로 외부의 전기신호가 전달되도록 배선이 연결되되, 외부는 절연되어 있는 본체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 본체는 사용자가 상기 금 나노선을 포함하는 금속팁을 외부의 전기신호를 제공하는 기기들과의 연결을 용이하게 할 수 있으며, 또한 실험조작의 편의를 위해 구비되는 것으로서 필요에 따라 선택될 수 있다.

상기 본체는 일반적으로 사용자가 다루기 쉽도록 길이방향으로 원통형 또는 다각형의 형태를 가지되, 내부에는 상기 금속팁으로 외부의 전기신호가 전달되도록 배선이 연결되며, 표면의 외부는 절연체로 코팅되거나 또는 절연체로 둘러쌓인 구조로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 나노 인젝터가 본체를 포함하는 경우에, 상기 금속팁과 금 나노선을 부착하는 단계는 상기 본체가 금속팁에 부착된 후에 나노조작기에 의해 부착될 수도 있고, 본체가 금속팁에 부착되기 전에 나노조작기에 의해 금속팁과 금 나노선이 부착되도록 한 후에 금 나노선을 포함하는 금속팁에 본체를 연결할 수 있다.

예시적으로 상기 본체의 길이는 0.5 내지 20 cm 의 범위를 가질 수 있고, 상기 금속팁의 길이는 1 mm 내지 20 mm의 범위를 가질 수 있다.

또한 상기 나노 인젝터는 기판을 포함하며, 상기 금나노선을 포함하는 금속팁이 기판상에 고정되고, 상기 기판상 또는 기판내에 형성된 배선이 상기 금속팁과 연결되고, 상기 금속팁과 연결되는 반대쪽의 배선을 외부와 연결함으로써 상기 나노 인젝터가 구성될 수 있다.

예시적으로, 상기 금 나노선을 포함하는 금속팁은 전기화학 측정장비 등의 외부 기기와 연결되기 위해 상기 본체 또는 기판의 배선부분이 상기 외부기기에서 제공되는 집게와 같은 연결수단과 결합할 수 있다.

상기 금 나노선 인젝터를 제조하기 위한 예시적인 방법을 실시예를 통하여 설명하면 다음과 같다. 본 발명에서 앞서 설명된 기상 이송법에 의해 기판상에 형성된 금 나노선을 광학 현미경을 이용한 관찰 하에서 피에조일렉트릭 스테이지로 구성된 나노 조작기(nanomanipulator)를 이용하여 상기 금 나노선을 텅스텐 팁에 붙이고 텅스텐 팁을 네일 바니시(nail varnish)로 절연하여 나노 인젝터를 제작할 수 있다.

이 경우 앞서 설명한 바와 마찬가지로, 상기 텅스텐 팁은 선택적으로 본체와 연결되거나 또는 기판상에 고정되며 배선을 통해 외부와 연결될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 금 나노선은 c-cut 사파이어 기판 상에, 알루미나 보트내 Au slug를 채우고 이를 1100도로 가열하면서, 챔버내 압력을 5-15torr 하에서 Ar가스를 100 sccm의 유량으로 흘려 금 증기를 공급하고, 촉매를 사용하지 않은 조건에서 기판에 실질적으로 수직한 방향으로 금 나노선을 애피택셜 성장시켜 얻을 수 있다.

c-cut 사파이어 기판은 Au (110) 면과 선호하는(favorable) 격자 관계를 가지고 있어서 기판 위에서 반정팔면체 금 시드(half-octahedral Au seed)가 형성되고 이 시드(seed)로부터 금 나노선이 수직 성장한다.

도 1(d)는 수직 성장한 금 나노선의 전자현미경 사진이다. 상기 도 1(d)에서의 스케일바(scale bar)는 2 ㎛를 표시한다. 금 나노선은 10 내지 300 nm의 직경과 1 내지 100 ㎛의 길이를 갖는다. 금 나노선이 충분히 길고 빛을 잘 산란시키므로 일반적인 광학 현미경으로 단일 금 나노선까지 관찰할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 금속 팁으로서 텅스텐을 사용하여, 텅스텐 팁에 금 나노선을 붙이기 위해 텅스텐 팁을 나노조작기(nanomanipulator)에 장착시키고, 텅스텐 팁끝에 전도성 접착체로서 은입자를 주성분으로 하는 수지 접착제를 묻힌 뒤, 기판상에 형성된 금 나노선으로 접근시키고, 부드럽게 접촉시켜서 집어낸다(도 1(a) 및 1(b) 참조)

상기 나노조작기를 이용하여 금 나노선이 부착된 텅스텐 팁을 네일 바니시(nail varnish)로 텅스텐 팁의 표면을 선택적으로 절연한다.(도 1(c) 참조)

상기 텅스텐 팁이 절연되지 않고 노출되면, 전극을 측정장치로서 사용하는 경우 원치 않는 신호가 측정되므로, 텅스텐 팁을 완전하게 절연하는 것이 중요하다. 한편, 상기 금 나노선이 부착된 텅스텐 팁은 광학적 관찰 하에서도 정밀하게 제어할 수 있으므로, 금 나노선을 제외하고 텅스텐 팁의 텅스텐 표면만을 쉽게 절연할 수 있다.

기존에 보고된 나노전극 제작법은 진공 환경, 금속 증착, 이온 집속빔을 이용한 절단, 금속 나노입자 코팅 또는 복잡한 절연 반응 등을 포함하는 데 비해, 본 발명의 금 나노선 제조 방법은 간단하면서도 빠른 시간안에 금 나노선 전극을 제조할 수 있는 장점이 있으며, 예컨대, 상기 금 나노선 전극은 광학적 모니터링 하의 상온/상압 조건에서 10분 이내에 제작될 수 있다.

도 1(e)는 제작된 금 나노선 전극의 광학 현미경사진을 보여주며, 도 1(f)는 제작된 금 나노선 전극의 전자 현미경 이미지를 보여주며, 스케일바(scale bar)는 20 ㎛를 표시한다. 또한 도 1(f)는 깨끗한 전자 현미경 이미지를 얻기 위해 이 나노선 전극은 절연 과정 이전에 관찰되었고, 금 나노선 전극의 확대된 전자 현미경 이미지인 도 1(g)는 기하학적으로 잘 정의된 전극 구조를 보여준다. 상기 도 1(g)에서의 스케일바(scale bar)는 100 nm를 표시한다.

도 2(a)에서는 본 발명에 의해 제작된 금 나노선을 포함하고 금속팁이 절연체로 코팅되기 전의 SEM사진이고 도 2(b)에서는 상기 금 나노선의 끝 부분의 확대된 SEM 사진을 나타내며, 도 2(c)에서는 금속팁이 절연체로 코팅후의 SEM사진을 보여준다. 상기 금 나노선은 기상 이송법에 의해 c-cut 사파이어 기판에 수직하게 성장되었다. 또한, 도 2(b)에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 금나노선은 결함없는 단결정이며 원자적으로 매끈한 Au (111) 표면에 의해 성장되었음을 알 수 있다.

도 3a 내지 3c는 금 나노선을 포함하는 나노인젝터를 고체 표면에 대고 눌렀을 때 나노선이 유연하게 휘어지고, 다시 들어올렸을 때 나노선이 곧은 형태로 회복되는 것을 보여주는 광학 사진이고, 도 3d 내지 3f는 상기 나노 인젝터내의 금 나노선이 세포에 삽입되었을 때 나노인젝터내 금 나노선이 약간 휘어지는 것을 보여주는 광학 사진이다.

상기 도3a 내지 3f를 통해 살펴보면 본 발명에서의 상기 금 나노선은 대단히 유연하며, 심지어 부러지지 않으면서 U자형으로 구부러질 수 있다. 상기 금 나노선의 뛰어난 유연성은 그것의 완벽한 결정성에 기인하며, 세포 관통시 세포 손상을 줄일 수 있는 장점이 있다.

또한, 도 3d 내지 3f는 보다 상세하게는, 상기 금 나노선이 세포의 표면 plane에 대해 ∼5°로, 세포질 내 15 내지 20 ㎛ 깊이까지 세포 막을 관통할 때 찍은 광학 이미지를 보여주는데, 세포 속으로 들어갈 때 나노선이 약간 휘어졌지만(도 3e), 세포로부터의 빠져나올 때 본래의 곧은 형태(도 3f)를 바로 회복하였다.

본 발명에서의 실시예에 사용되는 세포는 SK-N-CH(Neuroblastoma; 신경아세포종) 세포가 0.01% (w/v) 젤라틴이 코팅된 슬라이드 유리 위에 배양시켜 사용하였다. 이때 배양액은 penicillin (100 units/mL), streptomycin (0.1 mg/mL), 10% FBS 이 포함된 DMEM 용액을 사용하였고, 배양 환경은 5% CO₂, water-saturated atmosphere에서 37 ℃의 조건을 유지하였다.

상기 도 3d 내지 3f을 통해 유연한 금 나노선이 세포를 관통할 때 강한 세포골격을 이루는 액틴 섬유(actin fiber)보다는 더 부드러운 영역으로 통과하여 세포 변형을 최소화함을 시사한다.

도 4는 생활성 물질이 부착된 본 발명의 나노 인젝터의 금 나노선이 세포의 핵내로 삽입된 것을 나타내는 광학 사진이고, 도 5는 본 발명에서의 나노 인젝터의 금 나노선에 생활성 물질로서 DNA가 부착된 금 나노선이 세포의 핵내로 삽입되어 방출되는 것을 나타내는 모식도이다.

상기 도 4를 통해 본 발명의 나노 인젝터내 금 나노선은 100 ~ 150 nm로 길이 방향에 따라 일정한 직경을 유지하며, 종래기술에 의한 나노바늘들과는 달리 세포에 눈에 띄는 손상을 일으키지 않고 삽입될 수 있으며, 아울러, 도 5에 도시한 바와 같이, 금 나노선의 높은 전기 전도성에 의해 전기적 신호에 따라, 신속하고 정량적인 생활성 물질(도 5에서는 DNA)의 전달이 가능할 수 있다.

예를 들어, 종래 기술에 의한 세포질 내 환원적 환경에서의 디설파이드(disulfide) 결합 분해에 의존하는 전달 방법들이 결합 분해 반응을 위해 15분 이상을 필요로 하는 반면, 본 발명에서와 같이 금 나노선에 전기 펄스를 제공하는 경우 전극 표면에 부착된 생활성 물질들을 2분 이내에 단일 세포 내로 손쉽게 전달할 수 있다.

따라서 본 발명에서의 금 나노선은 이러한 전기화학적 전달에 있어 대단히 우수한 특성을 나타낼 수 있다.

일반적으로 나노바늘의 표면 구조는 전기화학적 방출에 중요한 영향을 주기 때문에, 금 나노선의 잘 정의되고 원자적으로 매끄러운 (111) 표면은 잘 정의되지 않은 표면에 비해 보다 잘 조절된 환원성 결합 분해를 일으킬 수 있다.

예를 들어, 50 mM 황산 용액에서 금 나노선에 의해 측정된 전기화학적 전류는 샤프한 피크(sharp peak) 형태로 일정한 전압에서 일어나는데, 이는 잘 정의된 단결정 금 (111) 표면의 산화 및 환원을 나타내는 것으로, DNA의 경우에는 금 나노선 전극을 통해 2분 동안 기준 전극으로 포화 카로멜 전극 사용시 -0.8 V의 전기 펄스를 가해줌으로써 도 5와 같이 직접적으로 세포 핵 내로 전달될 수 있다.

한편, 본 발명에서 나노 인젝터에 부착되거나 분리시킬 수 있는 생체내 또는 생체밖에서 생리활성을 가지는 물질이면 그 종류에 무관하게 사용가능하나, 바람직하게는 DNA, RNA, 단백질, 생리 활성을 가지는 유기화합물, 또는 생리 활성을 가지는 유기금속 화합물일 수 있다. 이 경우에 상기 단백질, 생리 활성을 가지는 유기화합물, 또는 생리 활성을 가지는 유기금속 화합물 등은 생체내에 투여될 수 있는 약물일 수 있다.

상기 DNA 및 RNA의 경우, 이는 DNA 백신 및 유전자 치료를 위한 연구에 응용될 수 있고, 또한 유전자 기능을 조사하고 기초적인 생물학적 메커니즘을 이해하기 위한 연구에 있어 유용하게 응용될 수 있다. 또한 상기 단백질, 생리활성을 보이는 유기화합물, 또는 생리 활성을 가지는 유기금속 화합물의 경우 약물이 세포내 특정 위치 또는 세포 소기관에 선택적으로 전달되는 과정 및 이에 관한 응용에 유용하게 적용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 나노 인젝터를 포함하는, 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 장치를 제공한다.

이를 도 6을 통해 상세하게 살펴보도록 한다.

도 6은 본 발명에 의해 제작된 나노 인젝터를 포함하며, 전기적 신호를 이용하여 생활성 물질을 세포내로 전달하는 장치를 간략하게 도시한 그림이다. 이를 살펴보면, 본 발명의 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 장치는 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터를 포함하는 작동 전극, 상기 작동전극에 대응하는 상대(counter) 전극, 상기 작동전극내의 금 나노선과 생활성 물질이 주입되는 세포를 관찰가능한 광학 현미경, 및 상기 나노 인젝터내 금 나노선에 전기신호를 제공하는 전기신호 공급부를 포함하여 이루어진다.

상기 작동 전극은 나노 인젝터내의 금 나노선을 포함하여 이루어지며, 상기 금 나노선에 상기 전기신호 공급부로부터 제공되는 전기신호에 의해 생활성 물질을 부착시키거나 또는 부착된 생활성 물질을 상기 전기 신호에 의해 분리시킬 수 있다.

또한 상기 광학 현미경은 본 발명에서의 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터의 움직임 또는 세포내 생활성물질이 전달되는 과정을 관찰할 수 있다.

한편, 상기 나노 인젝터의 움직임은 상기 광학 현미경의 관찰하에 3차원 피에조일렉트릭 스테이지로 구성된 나노 조작기(nanomanipulator)를 이용하여 조절될 수 있다. 상기 나노조작기는 x축, y축, z축 방향으로 나노미터(nm)의 단위로 움직임이 가능한 것으로서, 일예로서, 고정판 위에 설치된 x축, y축, z축 스테이지 및 상기 각 스테이지에 설치되어 각 스테이지를 나노미터(nm)의 단위로 이동시키는 압전 모터를 구비할 수 있다. 즉, x축 스테이지는 압전 모터에 의해 x축 방향으로 자유도를 가지며 이동되고, y축 스테이지는 압전 모터에 의해 y축 방향으로 자유도를 가지며 이동되며, z축 스테이지는 압전 모터에 의해 z축 방향으로 자유도를 가지면 이동될 수 있다.

상기 나노 조작기를 통해 광학 현미경의 해상도에 의해 제한될 수 있는 높은 공간 해상도(< 200 nm)에 의해 세포내 특정한 위치에 정확하게 삽입될 수 있다.

또한 상기 상대(counter) 전극은 작동전극에 대응하는 것으로서, 상대 전극과 작동 전극 사이에 전압이 인가되고, 통상 전기화학에서 사용되는 백금 전극 등이 사용가능하다.

또한 본 발명에서 상기 전기신호 공급부는 작동전극으로 사용되는 나노 인젝터내 금 나노선에 전기신호를 제공하는 역할을 하며, 본 발명에서는 상기 전기신호로서 전압을 제공함으로써, 금 나노선에 부착된 전압에 의해 분리되는 연결기(linker)로 금 나노선에 연결되어 있는 생활성 물질을 용이하게 분리할 수 있다. 이때 상기 전기신호 공급부가 제공하는 상기 펄스의 펄스폭은 1 ms 내지 10 분의 범위를 가질 수 있다.

또한 본 발명의 상기 장치는 기준전극을 추가적으로 포함함으로써 3전극 시스템으로 구성될 수 있다. 상기 기준 전극(reference electrode)은 전기화학적으로 통상 사용되는 포화 카로멜 전극이 사용될 수 있다.

상기 3 전극 시스템에 의해 본 발명의 나노인젝터는 전기적 전압을 정확하게 걸어주고 나노선에 부착된 DNA 분자를 세포 안으로 효율적으로 방출할 수 있게 한다.

또한 본 발명은 상기 나노 인젝터를 이용하여 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법을 제공한다.

이를 보다 상세히 설명하면, 본 발명은 생활성 물질을 본 발명에서의 단결정 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터(nano-injector)에 접촉시켜 금 나노선에 생활성 물질이 부착되도록 하는 단계; 상기 나노 인젝터내 생활성 물질이 부착된 금나노선 부분을 체외에서 세포내에 주입하는 단계; 및 상기 세포내에 주입된 금 나노선으로부터 상기 생활성 물질을 분리시키는 단계;를 포함하는 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법을 제공한다.

상기 금 나노선에 생활성 물질이 부착되도록 하는 단계는 상기 생활성 물질내 포함된 황원자가 금 나노선의 금 표면내 금원자와 결합함으로써 단결정 금나노선에 생활성 물질이 부착되거나, 생활성 물질이 전하를 띄는 경우 금 나노선 표면에 생활성 물질과 반대의 전하를 띄는 물질을 붙인 뒤, 정전기적 인력으로 생활성 물질이 금 나노선에 부착될 수 있다.

예시적으로, 상기 생활성 물질로서 선형의 DNA와 플라스미드를 모두 단결정 금나노선에 부착하여 세포 안으로 전달할 수 있다. 상기 선형의 DNA와 플라스미드는 생물학 및 의학 연구에서 DNA가 전형적으로 이러한 두 형태로 세포 안에 전달되기 때문에 중요한 의미를 갖는다.

본 발명에서는 서로 다른 방법을 이용하여 이 두 종류의 DNA를 금 나노선에 부착할 수 있다. 선형 DNA의 경우, 선형 DNA의 5' 끝을 thiol로 수정한 이후에, Au-S 결합을 이용하여, 생활성 물질(DNA)내 포함된 황원자가 금 나노선의 금 표면내 금원자와 결합함으로써 금 나노선에 부착할 수 있었다.

예시적으로, DNA를 부착시키기 위해 본 발명은 상기 금 나노선 나노인젝터를 100 nM thiolated 선형 DNA가 포함된 1 M KH2PO4 (pH 6.7) 용액에 넣고 상온에서 9시간 동안 유지한 뒤, 나노인젝터를 용액에서 빼내어 5분 동안 0.2% (w/v) sodium dodecyl sulfate 용액에 담궈서 금 나노선에 붙지 않은 과량의 DNA를 세척함으로써 DNA가 금 나노선에 부착될 수 있었다.

한편, 플라스미드의 경우, thiolated 플라스미드는 만들기가 어렵고 비효율적이므로 대신에 정전기적 부착을 이용할 수 있는데, 금 나노선 표면을 먼저 양전하를 띄는 분자형태(molecular species)에 의해 개질(modification)하고 이를 정전기적 인력에 의해 음전하를 띄는 플라스미드가 이 금 나노선에 부착되었다.

보다 구체적으로 상기 금 나노선 표면의 개질은 아미노티올과 같은 양전하를 띨수 있는 분자에 의해 이루어진다.

예시적으로 본 발명에서 플라즈미드를 부착시키기 위해, 상기 금 나노선 나노인젝터를 먼저 20 mM cysteamine 수용액에 넣고 상온에서 30분 동안 유지하여 금 나노선의 표면을 개질하고, 다음으로 100 nM 플라스미드가 포함된 1 M KH2PO4(pH6.7)용액에 넣고 상온에서 9시간 동안 유지한 뒤, 나노인젝터를 용액에서 빼내어 5분 동안 0.2% (w/v) sodium dodecyl sulfate 용액에 담궈서 금 나노선에 붙지 않은 과량의 DNA를 세척함으로써, 금 나노선에 부착될 수 있었다.

한편, 본 발명에서 상기 세포내에 주입된 금 나노선으로부터 상기 생활성 물질을 분리하는 단계는 전기펄스를 이용함으로써 생활성 물질이 분리될 수 있다.

본 발명에서 상기 전기펄스를 이용하는 경우에 전압범위는 기준 전극으로 포화 카로멜 전극 사용시 -0.7 내지 -1.0 V의 범위일 수 있고, 펄스를 가하는 시간은 30초 내지 5분 적용할 수 있다. 또한 상기 전기 펄스의 최적조건은 사용되는 생활성 물질의 종류와 개별적 분리조건에 따라 달라질 수 있다.

예시적으로, 상기 생활성 물질로서 형광물질을 포함하는, Cy3 dye-intercalated 선형 DNA가 부착된 금 나노선에서의 분리를 위한 최적조건을 찾기 위해 아래와 같이 실험하였다.

Cy3 dye-intercalated 선형 DNA가 부착된 금 나노선 나노인젝터를 버퍼 용액에 담근 후에 -0.7, -0.8, -0.9 V로 전기 전압을 변화하여 5분 동안 걸어주었다. 금 나노선 나노인젝터를 버퍼 용액에서 꺼낸 뒤, 금 나노선 위에 남아있는 Cy3의 형광 세기를 측정하였다.

도 7(a) 및 도 7(d)에서의 파란색 막대 그래프에서 보는 바와 같이 -0.8 V 및 -0.9 V 의 전기 펄스 전압에 의해 형광의 대부분이 제거되었으므로, -0.8 V 를 최적 전압으로 선택하였다.

한편 전압을 가해주는 최적 시간(duration)을 찾기 위해 -0.8 V의 전위를 0, 1, 2, 그리고 3 분 동안 걸어준 뒤 형광 세기를 측정하였다. 도 7(b) 및 도 7(d)의 붉은색 막대그래프에서 보여주는 바와 같이 2 분이 최적시간임을 알아냈다.

또한, 세포에서의 유사한 최적화는 2분 동안 -0.8 V 의 전기적 펄스 제공이 금 나노선 나노 인젝터 시스템을 이용한 DNA 전달에 가장 적합하다는 것을 확인하였으며, 플라스미드의 경우에도 플라스미드 DNA의 방출을 위해 같은 전기 펄스 조건이 사용되었다.

한편, 본 발명에서의 금 나노선 나노인젝터가 일정한 양의 DNA를 전달하는지에 관한 정량화 실험을 실시하였다. 이를 위해서 4개의 슬라이드 유리에 세포를 배양하였고, 각각의 슬라이드인 1번 슬라이드에서 0개, 2번 슬라이드에서 1개, 3번 슬라이드에서 3개, 4번 슬라이드에서 6개의 세포를 선택하였고, 각각의 세포 안으로 선형 DNA를 주입하였다. 주어진 슬라이드 위에 모든 세포를 각각 따로모은 뒤에 이들 세포들로부터 모든 DNA를 뽑아낸 후 전달된 DNA의 양을 qPCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)로 측정하였다.

도 8은 전달된 DNA의 양과 이 DNA가 주입된 세포의 수의 그래프를 보여준다. 상기 도 8에서의 선형비례성은 금 나노선 나노인젝터가 한번에 일정한 양으로, DNA를 각 세포에 매우 유사한 함량씩 전달할 수 있음을 나타낸다.

또한 본 발명에서의 나노 인젝터를 이용하여 생활성 물질이 세포 내로 전달될 때의 세포의 생활성(viability)을 조사하였다. 이는 생활성 물질이 세포 내로 전달될 때 세포가 살아있도록 유지하는 것이 극히 중요하므로 실험적 의미가 있다. 이를 위해 죽은 세포만 염색시키는 trypan blue를 이용하여 금 나노선 나노인젝터 기반의 DNA 전달 후 세포 viability를 검사하였다.

젤라틴이 코팅된 슬라이드 유리에 자란 SK-N-SH 세포 안으로 선형 DNA가 부착된 금 나노선 나노인젝터를 삽입하였고, 나노인젝터에 전기 펄스를 걸어주었다. 그리고 나서 trypan blue staining으로 세포 생활성을 조사하였다. 주입 후 7 시간경과시에, 조사된 13개의 세포 모두에서 intranuclear trypan blue staining이 관찰되지 않았다.

아울러, 같은 한 세포에 5 분 간격으로 3 번의 DNA 전달 후에도 trypan blue가 염색되지 않아 세포가 생존 가능함을 알 수 있었다. 이 결과들은 금 나노선 나노인젝터에 의한 반복적인 DNA 주입이 세포의 생활성에 명백한 악영향을 끼치지 않음을 보여주는 증거라 할 것이다.

또한 본 발명에서, 세포에 전달된 DNA의 발현의 관찰을 위한 실험을 하였다. 이는 금 나노선 나노인젝터에 의한 DNA 전달이 세포의 기능에 악영향을 끼치지 않는 것을 직접적으로 보여주는 것이며, 원하는 DNA를 전달한 후 세포 생리학을 연구하는데 있어 중요하다.

도 9(a) 내지 9(c)는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 encode 하고 있는 thiolated 선형 DNA를 세포에 전달한 후 배양액에서 48 시간 동안 성장시킨 세포의 형광, 광학 및 중첩된 이미지를 각각 보여준다. 상기 뚜렷한 형광 신호는 선형 DNA로 주입되었던 세포에서만 관찰되었다.

도 9(d) 내지 도 9(f)는 GFP 유전자를 포함한 플라스미드(plasmid) 인 pEGFP-N1을 전달한 뒤 48 시간 때의 세포의 형광, 광학 및 중첩 이미지를 각각 보여준다. 선형 DNA 전달의 경우와 유사하게, 뚜렷한 형광 신호는 플라스미드가 주입된 세포에서만 관찰되었다.

상기 결과들은 금 나노선을 포함하는 나노인젝터가 세포를 손상시키지 않고 선형 및 원형 DNA 모두를 성공적으로 전달하여 효율적인 유전자 발현을 시킬 수 있음을 증명한다.

즉, 본 발명에 의한 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터는 방출되는 DNA의 위치와 양의 정밀한 제어에 의해 DNA의 전달 효율을 최대화할 수 있다.

따라서 종래기술에서 유전자가 리포좀이나 고분자를 운반체로 사용하여 endocytosis 및 확산을 통해 핵으로 전달될 때에는 DNA 분해와 핵막 통과의 실패로 인해 주입된 DNA의 매우 낮은 비율(~ 0.3%)이 핵에 도달하나, 본 발명에 의한 나노 인젝터를 이용하여 정량적으로 조절된 DNA를 전달하게 되면 세포질에 남아있는 과량의 DNA에 의해 초래되는 세포 기능 또는 세포 주기에 끼치는 부정적인 영향을 최소화 할 수 있다.

이상 본 발명의 실시예들에 따른 단결정 금 나노선을 포함하는 나노 인젝터 및 이를 포함하는 장치에 관하여 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (16)

1. 생활성 물질이 하기 금 나노선의 표면에 부착되거나 분리될 수 있는 단결정 금 나노선 및
   상기 금 나노선을 지지하여 고정시키고 외부의 전기신호를 상기 금나노선에 전달하며, 표면이 노출되지 않도록 절연체로 코팅된 금속 팁을 포함하되,
   내부에는 상기 금속 팁으로 외부의 전기신호가 전달되도록 배선이 연결되고 외부는 절연되어 있는 본체 또는
   상기 금나노선을 포함하는 금속 팁이 상부에 고정되되, 상부 또는 내부에 형성된 배선이 상기 금속팁과 연결되고 상기 금속 팁과 연결되는 반대쪽의 배선이 외부와 연결되는 기판을 더 포함하여 상기 나노 인젝터의 금속 팁으로 외부의 전기신호가 전달되는 것을 특징으로 하는 나노 인젝터.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 생활성 물질은 DNA, RNA, 단백질, 생리 활성을 가지는 유기화합물, 또는 생리 활성을 가지는 유기금속 화합물인 것을 특징으로 하는, 나노 인젝터.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 단결정 금 나노선은 직경이 20 내지 300 nm이고, 그 길이는 1 내지 100 μm인 것을 특징으로 하는, 나노 인젝터.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 단결정 금 나노선은 기상이송법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는, 나노 인젝터.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 금 나노선은 전도성 접착제에 의해 금속 팁에 고정되는 것을 특징으로 하는, 나노 인젝터.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 나노 인젝터는 나노 인젝터내 금 나노선에 전압을 공급함으로써 전압에 의해 분리되는 연결기(linker)로 금 나노선에 연결되어 있는 생활성 물질이 금 나노선으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 나노 인젝터.
7. 삭제
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 나노 인젝터를 포함하는 작동 전극,
   상기 작동전극에 대응하는 상대(counter) 전극,
   상기 작동전극내의 금 나노선과 생활성 물질이 주입되는 세포를 관찰가능한 광학 현미경, 및
   상기 나노 인젝터내 금 나노선에 전기신호를 제공하는 전기신호 공급부를 포함하는, 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 장치.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 장치는 기준전극을 추가적으로 포함함으로써 3전극 시스템으로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 전기신호 공급부는 나노 인젝터내 금 나노선에 전압을 공급함으로써 전압에 의해 분리되는 연결기(linker)로 금 나노선에 연결되어 있는 생활성 물질이 금 나노선으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 장치.
11. 제 8 항에 있어서,
    상기 나노 인젝터의 움직임은 상기 광학 현미경의 관찰하에 3차원 피에조일렉트릭 스테이지로 구성된 나노 조작기(nanomanipulator)를 이용하여 조절되는 것을 특징으로 하는 장치.
12. 생활성 물질을 단결정 금 나노선을 포함하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 나노 인젝터(nano-injector)에 접촉시켜 금 나노선에 생활성 물질이 부착되도록 하는 단계;
    상기 나노 인젝터내 생활성 물질이 부착된 금 나노선 부분을 체외에서 세포내에 주입하는 단계 및
    상기 세포내에 주입된 금 나노선으로부터 전기펄스를 이용함으로써 상기 생활성 물질을 분리시키는 단계를 포함하되,
    상기 전기펄스는 기준 전극으로 포화 카로멜 전극 사용시 -0.7 내지 -1.0 V의 범위로 30초 내지 5분 적용하는 것을 특징으로 하는 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 금 나노선에 생활성 물질이 부착되도록 하는 단계는 생활성 물질을 단결정 금 나노선에 접촉시킴으로써 금 나노선에 생활성 물질이 자가조립(Self Assembled)되어 부착되는 것을 특징으로 하는, 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법.
14. 제 12 항에 있어서,
    상기 금 나노선에 생활성 물질이 부착되도록 하는 단계는 상기 생활성 물질내 포함된 황원자가 금 나노선의 금 표면내 금원자와 결합함으로써 단결정 금나노선에 생활성 물질이 부착되거나, 생활성 물질이 전하를 띠는 경우 금 나노선 표면에 생활성 물질과 반대의 전하를 띄는 물질을 부착한 뒤, 정전기적 인력에 의해 상기 생활성 물질이 금 나노선에 부착되는 것을 특징으로 하는, 생활성 물질을 세포내 특정한 위치로 전달하는 방법.
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