JP4109205B2 - 被検体検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、局在プラズモン共鳴現象を利用したセンサによる被検体の検出方法に関する。

物質の検出や同定あるいは分子構造の検査などに用いられるセンサとして、局在プラズモン共鳴現象を利用したセンサが知られている。このセンサは、誘電体の表面に金属微粒子が層状に固定された構造のデバイスをセンサチップとして用い、そのセンサチップの金属微粒子の層に光を照射する手段と、金属微粒子の層で反射した光を分光して波長ごとの強度を測定する手段により構成される。

局在プラズモン共鳴現象は、光の波長よりも小さい金属微粒子に光が照射された場合に、金属微粒子内の自由電子が特定の波長の光の電場に共鳴して振動を始める現象である。電子が振動を始め、局在プラズモン共鳴が誘起されると、金属微粒子周辺に強い電場が生じ、その特定波長（以下、共鳴波長という）における散乱や吸収が著しく増大する。

共鳴波長は金属微粒子の周辺にある物質の屈折率に依存する。周辺にある物質の屈折率が大きいほど共鳴波長は長波長側にシフトし、反射光の散乱や吸収は増大する。したがって、被検体となる物質が金属微粒子の層に吸着あるいは堆積し得る状態で光の照射および反射光強度の測定を行えば、反射光強度の急激な変化が観察されたことをもって被検体を検出することができ、また急激な変化が観察された波長をもって被検体の種類を特定することができる。このようなセンサのセンサチップとしては、例えば特許文献１に開示されているように、基体の表面部分に金属コロイド単層膜を形成したものが知られている。

また、このようなセンサチップを用いて、溶液中に分散する被検体を検出する方法として、被検体側にも金属微粒子を結合しておく方法が提案されている（例えば、非特許文献１）。この方法では、被検体がセンサチップの表面に吸着された際に、センサチップ側の金属微粒子と被検体側の金属微粒子とが近接した状態となる。局在プラズモンの共鳴波長は金属微粒子間の近接状態によっても変化するため、被検体側にも金属微粒子が結合されていることで、共鳴波長の変化を観察しやすくなる。

一方、特許文献１に開示されているセンサチップに関しては、コロイド粒子が凝集しやすいためにチップの作製が難しく、また金属微粒子の大きさが不均一であるという問題が指摘されている。この問題を解決する方法としては、近年、基板上に予め規則的に配列された微細孔を形成しておき、その微細孔に金属微粒子を充填して、上記のようなセンサチップを作製する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
特開２０００−３５６５８７号公報 特開２００３−２６８５９２号公報 "Metal Nanoparticles, Synthesis, Characterization, and Applications", Daniel L. Feldheim, Colby A. Foss, Jr., MARCEL DEKKER Inc., p183-205

特許文献２に開示されている微細構造体は、均一な大きさの金属微粒子が規則正しく配列されており、安定した測定結果が得られるという点において、特許文献１に開示されているセンサチップよりも優れている。しかしながら、この微細構造体では、微細孔の内部に金属微粒子が配置されているため、非特許文献１に示されている方法の適用を考えた場合、センサチップ側の金属微粒子と被検体側の金属微粒子とが近接しにくいという問題がある。すなわち、センシングの方法によっては、特許文献２の微細構造体よりも特許文献１の微細構造体のほうが適している場合もある。

本発明は、上記事情に鑑みて、センサチップ側の金属微粒子と被検体側の金属微粒子とが近接することにより得られる効果と、均一な大きさの金属微粒子が規則正しく配列されていることにより得られる効果の、両方を享受することができるセンシング方法を提案することを目的とする。

本発明の方法では、まず、基体の一表面に分布形成された複数の微細孔内に局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの金属微粒子（第１の金属微粒子）が配置された構造の微細構造体(センサチップ)を用意し、この微細構造体を被検体を含んでいる可能性がある試料溶液中に設置する。

微細構造体は、金属微粒子の頭部が基体の表面よりも上に突出しているものを使用する。微細孔の孔径は２００ｎｍ以下、深さは１００ｎｍ以下であることが好ましい。また、微細孔の孔径のばらつきは１５％以下であることが好ましい。金属微粒子の頭部の径は２００ｎｍ以下であり、金属微粒子の材料は、金、銀、アルミニウムまたは銅のいずれかであることが好ましい。

この微細構造体は、金属微粒子の頭部に、被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で設置する。

さらに、その溶液中に、局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの複数の金属微粒子（第２の金属微粒子）を、被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で分散せしめて、溶液中の被検体が金属微粒子に固定された物質と特異的に結合し得る状態にしておく。第２の金属微粒子もまた、金、銀、アルミニウムまたは銅のいずれかを材料とするものであることが好ましい。

その状態で、微細構造体の金属微粒子の頭部が突出した面に対し光を照射し、その反射光または透過光の強度を測定する。溶液中に被検体が含まれていた場合、被検体は第１の金属微粒子の頭部に固定された物質と第２の金属微粒子に固定された物質とに挟み込まれるようにして、微細構造体表面に吸着される。この際、第１の金属微粒子と第２の金属微粒子が近接することにより局在プラズモンの共鳴波長が変化するため、測定された光の強度に基づいて、被検体を検出することができる。

微細構造体としては、アルミニウムを主成分とする材料を陽極酸化することにより形成されたアルミナ層の微細孔内に第１の金属微粒子が配置された構造の微細構造体を用いることが好ましい。このような微細構造体は、比較的容易に作製することができ、また、微細孔の孔径のばらつきが少なく均質な表面構造を有するので、反射光や透過光の測定において安定した結果を得ることができる。

また、微細孔の周囲に金属薄膜が形成された構造の微細構造体、あるいは、第１の金属微粒子の頭部の径が微細孔の孔径よりも大きい微細構造体を用いれば、さらに感度良く被検体を検出することができる。

本発明の方法では、均質な表面構造を有する微細構造体を用いることにより安定した測定結果を得ることができ、また、被検体が微細構造体の表面に吸着された際に、第１の金属微粒子と第２の金属微粒子とが十分近接してプラズモン共鳴波長が大きく変化するので、溶液中の被検体を高い感度で検出することができる。

アルミニウムを主成分とする材料を陽極酸化することによって上記微細孔を形成すれば、比較的容易に均質な構造の微細構造体が得られ、高感度なセンシングを実現できる。

また、微細構造体として、表面の微細孔周辺に金属薄膜が形成されたものや、第１の金属微粒子の頭部の径が微細孔の孔径よりも大きいものを使用すれば、センサの感度をさらに高めることができる。

以下、本発明の被検体検出方法の一実施の形態について、図面を参照して説明する。

図１は、本実施の形態において、被検体の検出に用いるセンサの概要を示す図である。図に示すように、このセンサは、透明窓４を備えた容器２と、容器２の底部に固定されたセンサチップ１と、容器２内のセンサチップ１に向けて白色光を照射する白色光源５と、センサチップ１の表面における反射光を分光してスペクトルを得、プラズモン共鳴波長の変化を検出する分光検出器６により構成される。センサチップ１の光が照射される面には、多数の金微粒子９が配列されている。

図２は、センサチップ１の構造を示す概略図である。センサチップ１は、基体７の表面に分布形成された微細孔８の中に、金微粒子９が配置された構造を有する。微細孔８の孔径は２００ｎｍ程度であり、深さは孔径の半分の１００ｎｍ程度である。孔径のばらつきは１５％以下であり、チップ表面は均質な構造をしている。金微粒子９の粒径は微細孔８の孔径よりも少し小さいが、概ね２００ｎｍ程度である。金微粒子９の粒径は微細孔８の深さよりも大きいため、金微粒子９の一部（頭部）は、図に示すように基体７の表面より上に突出している。

センサチップ１の作製方法は種々考えられるが、ここでは、その一例としてアルミニウムの基体を用いた作製方法を示す。図３（ａ）〜（ｄ）は、センサチップ１の作製過程において、作製途中のセンサチップ１の断面の一部を表した図である。

図３（ａ）は、センサチップ作製プロセスを開始する前の基体１０を表している。本実施の形態では、基体１０としてアルミニウム層１３のみからなる基体を用いる。但し、基体１０は、例えばガラスなど、アルミニウム以外の材料からなる支持部材の上に、アルミニウムやアルミニウム合金の層が設けられた構造でもよい。すなわち、表層がアルミニウムを主成分とする材料からなるものであれば、他の部分の構造は特に限定されない。

センサチップ１を作製するためには、まず、陽極酸化処理装置を用いて基体１０の表面を陽極酸化する。基体１０の表面を陽極酸化するには、まず基体１０をホルダに固定した状態で対向電極とともに反応容器内の電解液中に配置する。電解液は、例えばシュウ酸、燐酸、硫酸、クロム酸などの酸性電解液とする。あるいは、電解液は、２種類以上の酸性溶液を混合したものであってもよい。

次に、基体１０と対向電極の間に４０Ｖ程度の電圧を印加する。電圧を印加するときは、基体１０を電源のプラス側に、対向電極を電源のマイナス側に接続する。電圧を印加すると、まず基体１０の表面に酸化被膜が形成され、その酸化被膜の表面に酸による溶解作用で微小な孔が形成される。この中のいくつかの孔は、陽極酸化が進行すると優先的に成長し、ほぼ等間隔に配列される。孔が形成された部分は、他の部分よりも高い電場が加わるため溶解が促進され、アルミニウムの表面に対して略垂直方向に孔が成長する。一方で、孔の周辺は溶解されずに残る。自然形成された細孔が非常に高い規則性をもって配列されることは、陽極酸化により得られるアルミナの１つの特徴である。

図３（ｂ）は、陽極酸化処理により、表面に複数の微細孔１５を有するアルミナ層１４が形成された基体１１を表している。微細孔１５は、基体表面に、ほぼ全面にわたって規則的に配置される。微細孔の孔径、深さおよび間隔は、陽極酸化の条件（例えば陽極酸化に用いる電解液の濃度や温度、電圧の印加方法、電圧値、時間など）によって変化する。通常、微細孔の周期は１０〜５００ｎｍで、また微細孔の孔径は５〜４００ｎｍの範囲で、それぞれ正確に制御することができるが、本実施の形態では、微細孔の孔径は約２００ｎｍ、深さは約１００ｎｍ、微細孔の周期は約２００ｎｍになるように陽極酸化の条件を設定している。

なお、特開２００１−９８００号公報や特開２００１−１３８３００号公報には、微細孔の形成位置や孔径を、より細かく制御する方法が開示されている。これらの方法を用いれば、任意の孔径、深さの微細孔を、任意の周期で配列形成することができ、微細孔の孔径のばらつきを１５％以下に抑えることができる。

次に、陽極酸化処理により自然形成された微細孔１５に、蒸着、スパッタあるいはメッキ法などにより金を充填する。なお、電気メッキを行う場合には、微細孔底部の導通性を確保しておく必要がある。導通性を確保する方法としては、例えば陽極酸化処理を行う際に微細孔底部のアルミナ層が特に薄くなるように条件を制御する方法、陽極酸化処理を複数回繰り返すことにより微細孔底部のアルミナ層を薄くする方法、微細孔底部のアルミナ層をエッチングにより除去する方法などが考えられる。

基体表面と同位置まで金が充填された時点あるいはそれ以前に金の充填処理を終了すれば、図３（ｃ）に示すように、各微細孔１５の内部に金微粒子９が配置された構造体１２が得られる。

この構造体１２に対し、例えば燐酸とクロム酸の混合液などアルミナを選択的に溶解する酸性溶液を用いてエッチングを行い、構造体１２の表面のアルミナ層１４の上層を除去する。除去される層の厚みはエッチング時間により制御することができるので、金微粒子９の一部(例えば、上半分)が基体表面に突出した時点でエッチングを終了すれば、図３（ｄ）に示すようなセンサチップ１が完成する。

微細孔８に充填する金属、すなわち微粒子の材料は、例えば、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、コバルトなど、金以外の金属でもよい。金は耐食性に優れており、また比較的低い温度での蒸着が可能なので微細孔への充填が容易である。また、銀を採用すれば、他の金属に比べて高い感度が得られる。

なお、センサチップ１の他の作製方法としては、基体表面に電子線露光、ナノインプリント、近接場光リソグラフィなどの微細加工技術によって微細孔を形成した後、金属を蒸着、スパッタ、メッキ法などにより充填する方法が考えられる。この場合、基体の材料は、必ずしもアルミニウムである必要はない。

次に、上記センサチップ１を用いて被検体を検出する方法について、再び図１を参照して説明する。被検体の検出は、試料溶液３を容器２に充填し、試料溶液３に被検体が含まれる場合に、その被検体がセンサチップ１の表面に吸着し得る状態にして行う。この際、試料溶液３には、被検体と特異的結合し得る物質が固定された金微粒子を分散させておく。また、センサチップ１の金微粒子９にも、被検体と特異的結合し得る物質を固定しておく。被検体と特異的結合し得る物質は、被検体を抗原としたときの抗体であり、例えば、ストレプトアビジンとビオチンの組み合わせなどが、これに相当する。金微粒子に固定する物質の種類は、被検体の種類に応じて異なる。

図４は、試料溶液３に被検体が含まれていた場合の、センサチップ１の表面の様子を表す概念図であり、センサチップ１の断面の一部を表した図である。前述のように、試料溶液３には、被検体と特異的結合し得る物質が固定された金微粒子が分散している。金微粒子に固定された物質は試料溶液３中に含まれる被検体と特異的結合する。その結果、試料溶液３は、図の金微粒子１６ａのように、物質１８ａを介して被検体１９ａと結合された金微粒子が、多数分散された状態となる。

試料溶液３中に分散している金微粒子１６ａに固定された物質１８ａと結合した被検体１９ａは、センサチップ１の金微粒子９に固定された物質１７とも特異的に結合する。１つの被検体について２つの特異的結合が生じた場合、その被検体は、図の被検体１９ｂのように、センサチップ１の金微粒子９と試料溶液３中に分散している金微粒子１６ｂにより挟み込まれる。この状態では、金微粒子９と金微粒子１６ｂは、極めて近接した状態となる。

センサチップ１に対して、図１に示すように、透明窓４越しに白色光源５から光を照射すると、照射光はセンサチップ１の表面で反射され、反射光は分光検出器６により検出される。分光検出器６は、検出した反射光を分光し、反射光のスペクトルを生成する。生成されたスペクトルは、図示されない表示画面あるいはプリンタに出力される。

被検体が、図４に示す被検体１９ｂのように、２種類の金微粒子に挟み込まれるようにしてセンサチップ１の表面に吸着された場合、金微粒子が近接したことにより局在プラズモンの共鳴波長がシフトする。よって、反射光のスペクトルの変化から、試料溶液に含まれる被検体を検出することができる。

上記方法では、試料溶液３中に金微粒子１６ａや１６ｂが含まれていない場合に観察される共鳴波長の変化の約１０倍の変化が生じることが確認された。具体的には、試料溶液３中に金微粒子１６ａや１６ｂが含まれていない場合の共鳴波長のシフトが数ｎｍであるのに対し、本実施の形態の方法では、共鳴波長が１０ｎｍ以上シフトする。したがって、本実施の形態の方法を用いれば、被検体を高い感度で検出することが可能になる。

なお、本実施の形態では、白色光を照射して反射光を分光し、波長ごとの強度を表すスペクトルを得ているが、共鳴波長に相当する波長を有する単色光を照射し、その反射光の強度変化から、共鳴波長がシフトしたことを検出してもよい。

また、センサチップの構造としては、センサチップ１のような構造のほか、図５あるいは図６に示す構造も考えられる。

図５は、センサチップ１と異なる構造を有するセンサチップ２０の断面の一部を表した図である。センサチップ２０は、センサチップ１と同様、基体の表面に分布形成された微細孔の中に金微粒子９が配置された構造を有する。微細孔の孔径および金微粒子９の粒径は２００ｎｍ程度、微細孔の深さは孔径の半分の１００ｎｍ程度であり、金微粒子９の一部（頭部）は、図に示すように基体７の表面より上に突出している。センサチップ１と異なるのは、基体表面の微細孔周辺に、図に示すように金薄膜２１が形成されている点である。

センサチップ２０は、例えば、アルミニウムの基体を陽極酸化することによりアルミニウム層１３の上にアルミナ層１４を形成し、その微細孔に金を充填して金微粒子９を形成した後に、アルミナ層１４の上部をエッチングにより除去し、さらに蒸着、スパッタなどにより金薄膜２１を形成することによって作製することができる。但し、センサチップ１と同様、他の方法あるいは材料を用いて作製することも可能である。

センサチップ２０の構造では、金微粒子９に光が照射された際に生じる近接場光が金薄膜２１と相互作用し、電気多重極子による吸収スペクトルが発生する。局在プラズモン共鳴と電気多重極子との相乗効果により、金微粒子周辺の媒質の屈折率の変化に対する反射光の変化がさらに鋭敏になるので、センサチップ１よりも高感度なセンシングが可能になる。

さらに、センサチップ１と異なる構造を有する他のセンサチップ２２について説明する。図６は、センサチップ２２の断面の一部を表した図である。センサチップ２２は、センサチップ１と同様、基体の表面に分布形成された微細孔の中に、金微粒子が配置された構造を有するが、センサチップ１とは金微粒子の形状が異なる。センサチップ２２を構成する金微粒子２３は、図に示すように、頭部の径が微細孔の孔径よりも大きい、いわばマッシュルームのような形状を有する。

センサチップ２２は、例えば、アルミニウムの基体を陽極酸化することによりアルミニウムの層１３の上にアルミナ層１４を形成し、その微細孔に金を過剰にメッキすることにより作製することができる。センサチップ１などを作製する際の金充填プロセスでは、通常、基体の表面を越えて金が堆積することがないようメッキ時間を調整したり、余分に堆積した金を除去したりするが、センサチップ２２を作製する際には、敢えて基体表面を越えて金がメッキされるようにメッキ時間を調整する。これにより、図に示すように、頭部の径が微細孔の孔径よりも大きな金微粒子２３を、微細孔内に形成することができる。但し、センサチップ１と同様、他の方法あるいは材料を用いて作製することも可能である。

センサチップ２２の構造では、金微粒子２３の頭部が互いに近接して配置されている。金微粒子２３に光が照射された際、隣接する金微粒子２３同士の隙間部分に強い電場が生じ、この電場の影響で反射光が増強される。このため、センサチップ１よりも高感度なセンシングが可能になる。

以上、反射型のセンサを用いて被検体を検出する方法について説明したが、次に、センサチップを透過した光の強度を測定する透過型のセンサを用いる形態について説明する。

図７は、透過光強度の測定により被検体を検出するセンサの概要を示す図である。図に示すように、このセンサは、透明窓４を側面に備えた容器２と、容器２の中央に透明窓４と平行になるように配置されたセンサチップ２４と、容器の外側に設置された白色光源５および分光検出器６からなる。センサチップ２４の光が照射される面には、多数の金微粒子２６が配列されている。

白色光源５は、透明窓４を通して、センサチップ２４の金微粒子２６が配置された面に白色光を照射できる位置に設置されている。また、分光検出器６は、センサチップ２４を透過した光を受光できる位置に配置され、透過光を分光してスペクトルを得、共鳴波長の変化を検出する。

図８は、センサチップ２４の断面の一部を表した図である。センサチップ２４は、基体の表面に分布形成された微細孔２５の中に、金微粒子２６が配置された構造を有する。センサチップ１と異なるのは、微細孔２５が貫通孔であるという点である。微細孔の孔径は、２００ｎｍ程度であり、金微粒子２６の粒径はそれよりも少し小さい。金微粒子２６の一部（頭部）は、図に示すように基体表面より上に突出している。

センサチップ２４は、例えば、アルミニウムの基体を陽極酸化することによりアルミニウム層の上にアルミナ層１４を形成し、その微細孔に金を充填した後に、アルミナ層１４の上部をエッチングにより除去し、さらにアルミニウム層と微細孔底部のアルミナ層をエッチングにより除去することによって作製することができる。但し、センサチップ１と同様、他の方法あるいは材料を用いて作製することも可能である。

被検体の検出は、図７に示すように、対象となる試料溶液３を容器２内に充填し、試料溶液３に被検体が含まれる場合に、その被検体がセンサチップ２３の表面に吸着し得る状態にして行う。試料溶液３には、被検体と特異的結合し得る物質が固定された金微粒子を分散させておく。また、センサチップ２４の金微粒子２６にも、被検体と特異的結合し得る物質を固定しておく。

センサチップ２４に対して、白色光源５からの光を透明窓４越しに照射すると、照射光はセンサチップ２４の金微粒子２６を透過し、透過光は分光検出器６により検出される。分光検出器６は、検出した透過光を分光し、透過光のスペクトルを生成する。生成されたスペクトルは、図示されない表示画面あるいはプリンタに出力される。

透過型のセンサを用いる場合も、図８に示すように、金微粒子の頭部が基体表面より突出した構造のセンサチップを使用し、図４に示すように、被検体が試料溶液中に分散する金微粒子と結合し得る状態にしておけば、反射型のセンサを用いる場合と同様、被検体が、２種類の金微粒子により挟み込まれ、金微粒子が近接することによって共鳴波長が大幅に変化する。

なお、上記実施の形態における金微粒子の粒径はいずれも２００ｎｍ程度であったが、本発明において、金属微粒子の粒径は局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさであればよく、上記実施の形態に限定されない。局在プラズモン共鳴が誘起されるためには金属微粒子の粒径は光の波長よりも小さくなければならないので、粒径は２００ｎｍ以下であることが好ましい。但し、照射光の波長によっては、粒径が２００ｎｍより多少大きくても、局在プラズモン共鳴は誘起され得る。本発明は、そのような場合も含むものとする。

また、上記実施の形態では粒径２００ｎｍの微粒子の上半分が突出するように微細孔の深さを１００ｎｍとしているが、突出している部分の割合は必ずしも半分である必要はなく、それ以上あるいはそれ以下であってもよい。但し、多くの部分が突出しているほうが金属微粒子同士が近接しやすくなるため、共鳴波長の変化を観察しやすい。

また、金属微粒子の形状は、図５に示した球体形状、図６に示したマッシュルーム型の形状、図８に示した楕円体形状のほか、円柱、直方体、円錐型などでもよい。すなわち、頭部が基体表面より上に突出しており、試料溶液中に分散する金属微粒子と近接しやすい構造をしていれば、金属微粒子の形状は特に限定されない。

以上に示したように、本発明によれば、センサチップ側の金属微粒子と被検体側の金属微粒子とが近接することにより得られる効果と、均一な大きさの金属微粒子が規則正しく配列されていることにより得られる効果の、両方を享受することができ、高感度かつ安定したセンシングを実現することができる。

本発明の一実施の形態において被検体の検出に用いる反射型のセンサの概要を示す図 センサチップの構造の一例を示す図 センサチップの作製方法について説明するための図 センサチップ表面の様子を表す概念図 センサチップの構造の他の例を示す図 センサチップの構造のさらに他の例を示す図 本発明の一実施の形態において被検体の検出に用いる透過型のセンサの概要を示す図 透過型センサ用のセンサチップの構造の一例を示す図

符号の説明

１，２０，２２，２４ センサチップ(微細構造体)
２ 容器
３ 試料溶液
４ 透明窓
５ 白色光源
６ 分光検出器
７ 基体
８，１５，２５ 微細孔
９，２３，２６ 金微粒子(第１の金属微粒子)
１０ 陽極酸化処理前のアルミニウム基体
１１ 陽極酸化処理後のアルミニウム基体
１２ 金充填後のアルミニウム基体
１３ アルミニウム層
１４ アルミナ層
１６ａ，１６ｂ 金微粒子（第２の金属微粒子）
１７，１８ａ，１８ｂ 被検体と特異的結合し得る物質
１９ａ，１９ｂ 被検体
２１ 金薄膜

Claims (7)

1. 溶液に含まれる被検体を検出する方法であって、
   基体の一表面に分布形成された複数の微細孔内に局在プラズモンを誘起し得る大きさの第１の金属微粒子が該第１の金属微粒子の頭部が前記基体の表面よりも上に突出するように配置された構造の微細構造体を、前記第１の金属微粒子の前記頭部に前記被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で、前記溶液中に設置するとともに、
   前記溶液中に、局在プラズモンを誘起し得る大きさの複数の第２の金属微粒子を、前記被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で分散せしめ、
   前記微細構造体の前記第１の金属微粒子の頭部が突出した面に対し光を照射し、
   前記光の前記面における反射光または透過光の強度を測定し、
   測定された光の強度に基づいて前記溶液に含まれる被検体を検出する被検体検出方法。
2. 請求項１記載の被検体検出方法において、
   前記微細構造体として、アルミニウムを主成分とする材料を陽極酸化することにより形成されたアルミナ層の微細孔内に前記第１の金属微粒子が配置された構造の微細構造体を用いることを特徴とする被検体検出方法。
3. 請求項１または２記載の被検体検出方法において、
   前記微細構造体として、前記一表面の前記微細孔の周囲に金属薄膜が形成された構造の微細構造体を用いることを特徴とする被検体検出方法。
4. 請求項１または２記載の被検体検出方法において、
   前記微細構造体として、前記第１の金属微粒子の前記頭部の径が前記微細孔の孔径よりも大きい微細構造体を用いることを特徴とする被検体検出方法。
5. 請求項１から４のいずれか１項記載の被検体検出方法において、
   前記微細構造体として、前記第１の金属微粒子の前記頭部の径が２００ｎｍ以下の微細構造体を用いることを特徴とする被検体検出方法。
6. 請求項１から５のいずれか１項記載の被検体検出方法において、
   前記微細構造体として、前記微細孔の孔径のばらつきが１５％以下の微細構造体を用いることを特徴とする被検体検出方法。
7. 請求項１から６のいずれか１項記載の被検体検出方法において、
   前記第１の金属微粒子および／または前記第２の金属微粒子の材料が、金、銀、アルミニウムまたは銅のいずれかであることを特徴とする被検体検出方法。

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