WO2004102194A9 - 選択結合性物質固定化担体 - Google Patents

選択結合性物質固定化担体

Info

Publication number
WO2004102194A9
WO2004102194A9 PCT/JP2004/007060 JP2004007060W WO2004102194A9 WO 2004102194 A9 WO2004102194 A9 WO 2004102194A9 JP 2004007060 W JP2004007060 W JP 2004007060W WO 2004102194 A9 WO2004102194 A9 WO 2004102194A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
carrier
binding substance
selective binding
immobilized
immobilizing
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/007060
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004102194A1 (ja
Inventor
Kunihisa Nagino
Fumio Nakamura
Hitoshi Nobumasa
Original Assignee
Toray Industries
Kunihisa Nagino
Fumio Nakamura
Hitoshi Nobumasa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020057021996A priority Critical patent/KR101126845B1/ko
Application filed by Toray Industries, Kunihisa Nagino, Fumio Nakamura, Hitoshi Nobumasa filed Critical Toray Industries
Priority to US10/557,070 priority patent/US7795006B2/en
Priority to EP04733682.1A priority patent/EP1626276B1/en
Priority to PL04733682T priority patent/PL1626276T3/pl
Priority to CN2004800056001A priority patent/CN1839317B/zh
Priority to CA2525938A priority patent/CA2525938C/en
Priority to ES04733682T priority patent/ES2727785T3/es
Priority to JP2005506292A priority patent/JP4380631B2/ja
Priority to DK04733682.1T priority patent/DK1626276T3/da
Publication of WO2004102194A1 publication Critical patent/WO2004102194A1/ja
Publication of WO2004102194A9 publication Critical patent/WO2004102194A9/ja
Priority to US12/845,417 priority patent/US9358518B2/en
Priority to US12/845,433 priority patent/US9333478B2/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00504—Pins
    • B01J2219/00509—Microcolumns
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00576—Chemical means fluorophore
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00635—Introduction of reactive groups to the surface by reactive plasma treatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00653—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to electrodes embedded in or on the solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00677—Ex-situ synthesis followed by deposition on the substrate
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B01J2219/00707—Processes involving means for analysing and characterising the products separated from the reactor apparatus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00731—Saccharides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the present invention relates to a carrier on which a substance that selectively binds to a test substance (herein, a “selective binding substance”) is immobilized.
  • DNA microarray method DNA chip method
  • DNA chip method a new analysis method or methodology called the DNA microarray method
  • these methods are basically the same as conventional methods in that they are nucleic acid detection and quantification methods based on the hybridization reaction between nucleic acids / nucleic acids. It can also be applied to the detection and quantification of proteins and sugar chains based on interchain and between sugar chains / proteins.
  • the major feature of these techniques is that a large number of DNA fragments, proteins, and sugar chains are aligned and immobilized on a glass flat substrate piece called a microarray or chip.
  • microarray method examples include, for example, the expression of genes in A method in which a sample labeled with an element or the like is hybridized on a piece of a flat substrate, mutually complementary nucleic acids (DNA or RNA) are bound to each other, and the site is read at high speed by a high-resolution analyzer, There is a method of detecting a response such as a current value based on a chemical reaction. Thus, the amount of each gene in the sample can be quickly estimated.
  • a technique for immobilizing nucleic acids on a substrate such as a method for immobilizing nucleic acid on a flat substrate such as slide glass.
  • a method is disclosed in which lysine, aminosilane, or the like is coated, and each nucleic acid is immobilized using a spotter called a spotter.
  • a nucleic acid probe (a nucleic acid immobilized on a substrate) used in a DNA chip is a conventional one.
  • Oligo DNA oligo DNA
  • a synthesizer from cDNA and fragments of several hundred to several thousand bases in length. Is used when the number of bases is from 10 to 100 bases).
  • the oligo DNA and the glass substrate are bonded by a covalent bond.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-337089 (paragraph 17) describes a polymer composed of polymethyl methacrylate as a substrate.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-333089 does not describe any specific method for immobilizing DNA.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-30874 (paragraph 12) has a similar description, but does not describe a specific method for immobilizing DNA.
  • JP-A-2002-71693 discloses that fibers having nitrile groups, such as acrylic fibers, are derivatized into fibers having carboxyl groups by an alcohol treatment, and the carboxyl groups and DNA, etc. Are disclosed for binding and immobilizing.
  • alkali fibers are mainly composed of polyacrylonitrile, there is a problem that the material itself has a large autofluorescence and is not suitable as a substrate.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-71693 discloses that polymethacrylate is copolymerized with acrylic acid and methacrylic acid.
  • the problems to be solved by the present invention are as follows. First, when oligo DNA was immobilized on a flat glass substrate, there were the following problems. That is, 1) When hybridization is performed, the sample DNA is easily non-specifically adsorbed to the area other than the spot where the probe DNA is immobilized because the glass is hydrophilic, and fluorescence is emitted by a device called a scanner. When performing detection, this non-specifically adsorbed sample is also detected and noise is increased.2) Since the glass is rigid, the spatial freedom of oligo DNA covalently bonded to it is hindered. For this reason, there was a problem that the hybridization efficiency with the sample DNA was low, the signal intensity was low, and as a result, the S / N ratio was not sufficient.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a carrier in which DNA is immobilized firmly on a resin substrate with high hybridization efficiency. Further, the present invention provides a carrier on which a selective binding substance having high detection sensitivity is immobilized while preventing deterioration of SZN as described above.
  • the present invention relates to a carrier on which a selective binding substance is immobilized, wherein the surface of the carrier is made of a low autofluorescent resin, and the surface of the polymer is treated with an acid or an acid to form a carboxyl group.
  • a selective binding substance-immobilized carrier characterized in that the selective binding substance is then immobilized.
  • the present invention also relates to a carrier for immobilizing a selective binding substance on a surface of a carrier, wherein the carrier surface contains a structural unit represented by the following general formula (1):
  • a carrier for immobilizing a selective binding substance wherein the surface of the polymer is treated with an acid or an acid, and then the selective binding substance is immobilized.
  • RR 2 and R 3 in the general formula (1) represent an alkyl group, an aryl group or a hydrogen atom.
  • a carrier on which a selective binding substance having a good S / N ratio is immobilized which has a low nonspecific analyte adsorption and a good hybridization efficiency. can do.
  • Figure 1 is a diagram showing a reaction scheme when immobilizing a selective binding substance on the PMMA surface
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the carrier of the present invention
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view of the carrier of the present invention.
  • Figure 4 shows an example of a microarray abutment jig.
  • Figure 5 is a cross-sectional view of the carrier
  • FIG. 6 is a conceptual diagram of a carrier having a support layer and a selectively binding substance-immobilized layer
  • FIG. 7 is a view showing a reaction scheme when the selective binding substance is immobilized on the glass surface.
  • the carrier for immobilizing a selective binding substance according to the present invention has a carrier surface made of a low autofluorescent resin and immobilizes the selective binding substance, and generates a carboxyl group by treating the surface with an alkali or an acid.
  • the low autofluorescent resin is obtained by using GenePix400 B from Ax on Instruments. When a clean plate with a thickness of 1 mm was measured under the conditions of an excitation wavelength of 532 nm, a photomultiplier setting gain of 700, and a laser power of 33%, the fluorescence intensity was below 100,000. Say something. Resins that do not satisfy this are not preferable because S / N at the time of detection deteriorates. Examples of such a resin include a polymer represented by the following general formula (1).
  • the carrier for immobilizing a selective binding substance of the present invention has a carrier surface for immobilizing the selective binding substance, which has a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1). It is solid.
  • RRR 3 in the general formula (1) represents an alkyl group, an aryl group, or a hydrogen atom.
  • the polymer a homopolymer or a copolymer is used.
  • the polymer uses at least one type of monomer as a raw material, and the monomer includes a double bond capable of participating in polymerization and a functional group capable of participating in polycondensation, and a ketone or a carboxylic acid or a derivative thereof.
  • the polymer has a structure represented by the general formula (1).
  • the polymer when the polymer is a copolymer, the polymer preferably contains at least 10% of the structural units represented by the general formula (1) based on all monomer units. Represented by the general formula (1) When the content of the structural unit is 10% or more, many carboxyl groups can be generated on the surface and a large amount of probe nucleic acid can be immobilized in a step to be described later, resulting in an S / N ratio. Is more improved.
  • the polymer refers to a polymer having a number average degree of polymerization of 50 or more.
  • the preferred range of the number average degree of polymerization of this polymer is from 100 to 10,000. Particularly preferably, it is not less than 200 and not more than 500.
  • the number average degree of polymerization can be easily measured by measuring the molecular weight of the polymer by a conventional method using GPC (gel permeation chromatography).
  • R 1 and R 2 represent an alkyl group, an aryl group or a hydrogen atom, and may be the same or different.
  • the alkynole group may be linear or branched, and preferably has 1 to 20 carbon atoms.
  • the aryl group preferably has 6 to 18 carbon atoms, more preferably 6 to 12 carbon atoms.
  • the functional group X is arbitrarily selected from 0, NR 3 and CH 2 .
  • R 3 is a functional group defined similarly to R 1 and R 2 described above.
  • Preferred examples of the polymer containing the above-mentioned various functional groups include polymethyl methacrylate (PMMA), polyethyl methacrylate (PEMA) and polyalkyl methacrylate (PAM A) of polypropyl methacrylate. Etc.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PEMA polyethyl methacrylate
  • PAM A polyalkyl methacrylate
  • Etc. The most preferred of these is polymethyl methacrylate because it can be easily formed by injection molding or hot embossing and has a relatively high glass transition temperature.
  • poly (vinyl acetate), poly (cyclohexyl methacrylate), poly (phenyl methacrylate) and the like can be used.
  • a copolymer having a structure in which the constituents of the polymer are combined or a structure in which one or more kinds of the constituents of the polymer are added to the constituent of the polymer can also be used.
  • the other polymer include polystyrene.
  • the ratio of each component is preferably in the range of a monomer containing a sulfonic acid group, for example, the proportion of alkyl methacrylate is preferably 10 mol% or more.
  • the proportion of alkyl methacrylate is preferably 10 mol% or more.
  • a carboxyl group can be formed on the carrier surface.
  • carboxylic acid groups on the surface of the carrier not only the method of treating with alkali and acid, etc. alone, but also sonication at room temperature, exposure of carrier to oxygen plasma, argon plasma, and radiation It may be combined with the method.
  • the carrier is immersed in an aqueous solution of sodium hydroxide or sulfuric acid (preferably at a concentration of 1 N to 20 N), and preferably at a temperature of 30 to 80 ° C. for 1 hour. It may be held for 100 hours.
  • a carboxyl group is labeled with fluorine using a labeling reagent containing fluorine (eg, trifluoroethanol). Then, it is possible to estimate the amount of functional groups in consideration of the reaction rate in the C 1 s and F 1 s peak area intensities of the labeled sample. To further improve the accuracy, the distribution of fluorine on the surface of the sample labeled with trifluoroethanol was determined as T OF —S I M S
  • Time-of-flight secondary ion mass spectrometry can be used to confirm whether carboxyl groups are formed on the surface of the carrier.
  • a carboxyl group is formed on the surface of the carrier in this way, this can be used as a foothold to modify the body side with biotin or avidin, modify the selective binding substance with avidin or biotin, and selectively bind with avidin-biotin interaction
  • immobilize the substance by immobilizing the substance on a carrier, or by reacting the carrier with a linker such as ethylenediamine, and further reacting the linker with a selective binding substance.
  • linker such as ethylenediamine
  • DMT-MM (4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazine-12-yl) -14-methinole-morpholinium chloride (DMT-MM).
  • condensing agents such as EDC may be used by mixing with a solution of a selective binding substance, or a carrier having a carboxyl group formed on the surface may be immersed in an EDC solution in advance to activate the carboxyl group on the surface. It may be changed.
  • FIG. 1 shows a scheme for immobilizing the selective binding substance. (1 in Fig. 1 indicates a PMMA substrate, and 2 indicates a selective binding substance (DNA).)
  • the selective binding substance By immobilizing the selective binding substance on the polymer surface according to the method described above, since the carboxyl group with a negative charge exists except for the spot portion, the non-specificity of the sample (representative DNA) In addition, the selective binding substance can be immobilized firmly and with high density by covalent bonds, and the degree of spatial freedom of the immobilized selective binding substance is lower than that of glass. For this reason, it is possible to obtain a carrier having high hybridization efficiency with the specimen.
  • the advantage of having a high degree of freedom is that especially when the immobilized selective binding substance is oligo DNA, which is a DNA with a base length of 10 to 100 bases and a target, it can be used for hybridization with the sample. It provides excellent properties such that the efficiency of dicing is greatly improved.
  • a carrier is made of a polymer containing a structural unit represented by the general formula (1), finer particles can be obtained by using an injection molding method or a hot-emboss method than glass, ceramic, metal, or the like. It is possible to easily mass-produce carriers having various shapes. Thus, the shape of the carrier on which the selective binding substance is immobilized will be described.
  • the carrier on which the selective binding substance of the present invention is immobilized has an uneven portion, and it is preferable that the selective compatible substance is immobilized on the upper surface of the convex portion.
  • the S / N is a better selective binding substance.
  • the height of the plurality of protrusions of the uneven portion it is preferable that the height of the upper surface of the protrusion be substantially the same.
  • the selective binding substance is immobilized on the surface of the convex part with a slightly different height, this is reacted with the fluorescently labeled analyte, and then scanned with a scanner. In this case, the height at which the difference in signal level intensity does not matter.
  • the heights are substantially the same when the height difference is smaller than 100 m.
  • the carrier of the present invention is preferably provided with a flat portion.
  • a flat portion is a flat portion, and a selective binding substance (for example, nucleic acid) is immobilized on the upper surface of the convex portion of the concave and convex portion shown in 12.
  • the upper surface of the convex portion of the concave-convex portion is substantially flat.
  • the upper surface of the projection is substantially flat means that there is no unevenness of 50 m or more.
  • the height of the upper surface of the convex portion of the uneven portion and the height of the flat portion are substantially the same.
  • the phrase “the height of the flat portion and the height of the uneven portion are substantially the same” means a height at which the degree of decrease in the signal level does not cause a problem when scanning with a scanner.
  • the difference in height is substantially the same when the difference between the height of the upper surface of the convex and concave portions and the height of the flat portion is smaller than 100 m.
  • a microarray generally reacts a fluorescence-labeled sample with a selective binding substance immobilized on a carrier, and reads fluorescence using a device called a scanner.
  • the first step is to focus the laser light, which is the excitation light, with an objective lens and focus the laser light. This focused light is illuminated on the surface of the microarray, and the laser light is focused on the surface of the microarray. And of this condition By scanning the objective lens or the microarray itself, the fluorescence generated from the microarray is read.
  • the fluorescence (noise) of the sample DNA non-specifically adsorbed to the concave portion of the concave and convex portion is detected. It has the effect of being hard. The reason for this is that the laser beam is deformed in the concave portion because the laser light is focused on the upper surface of the concave portion. Conversely, the difference between the height of the highest convex surface and the height of the lowest convex surface among the multiple convexities on which the selective binding substance is immobilized is 50 ⁇ or less. Is preferred. This is because if the height of the upper surface of the convex portion is more than this, the fluorescence intensity may not be accurately measured due to the depth of focus of the scanner.
  • the difference between the height of the highest upper surface of the plurality of protrusions to which the selective binding substance is immobilized and the height of the lowest upper surface of the protrusions may be 50 ⁇ m or less. It is more preferably 30 ⁇ or less, and even more preferably the height is the same. Note that the same height in the present application includes an error due to a variation that occurs in production or the like.
  • the plurality of projections on which the selective binding substance is immobilized means a portion on which the selective binding substance (for example, nucleic acid) required as data is immobilized, and is merely a dummy selective binding. Excludes the area where the toxic substance is immobilized.
  • the method of adjusting the focus of the scanner is as follows. That is, when the scanner focuses the excitation light on the surface of the microarray, the scanner focuses the excitation light at the corner of the microarray or, as shown in Fig. 4, hits the jig with the microarray, Focus the light on the microarray surface. Then, the entire microarray is scanned under the same conditions. (13 in FIG. 4 is a microarray, 14 is an objective lens, 15 is excitation light, and 16 is a spring for abutting the microarray against the jig.) Therefore, the carrier of the present invention includes It is preferable that an uneven portion and a flat portion are provided. Specific examples are shown in Figs.
  • Reference numeral 11 denotes a flat portion, and a selective binding substance (for example, nucleic acid) is immobilized on the upper surface of the convex portion of the concave and convex portion indicated by 12. Further, the difference between the height of the upper surface of the projection and the height of the flat portion is preferably 50 ⁇ m or less. In this way, selective connectivity When scanning a carrier on which a substance is immobilized, it is possible to once focus the excitation light on the upper surface of the flat part, or to hit the flat part with a jig. That is, focusing of the scanner is facilitated.
  • a selective binding substance for example, nucleic acid
  • the excitation light is focused on the flat portion, so that the upper surface of the convex portion on which the selective binding substance is immobilized is flat, and the height of the upper surface of the convex portion and the height of the flat portion are different.
  • the difference is less than 50 ⁇ m. If the difference between the height of the top surface of the projection and the height of the flat portion is greater than 50 / zin, the following problems may occur.
  • the focal point of the excitation light on the top of the projection will vary, and as a result, the intensity of the fluorescence detected within the top of one projection will be uneven. appear. This makes subsequent analysis difficult. In the case of the present application, the above problems do not occur, and a good signal (fluorescence) can be obtained.
  • the difference between the height of the top surface of the projection and the height of the flat portion may be 50 m or less, but is more preferably 30 ⁇ m or less. More preferably, the heights are the same. Note that the same height in the present application includes an error due to a variation that occurs in production or the like.
  • the selective binding substance is immobilized only on the upper surface of the convex portion of the uneven portion, instead of spotting the selective binding substance on the flat carrier. Therefore, even if the sample sample is non-specifically adsorbed to the portion other than the upper surface of the convex portion, the focus of the excitation light is blurred at the portion other than the upper surface of the convex portion. No fluorescence is detected. For this reason, noise is reduced, and as a result, SZN is improved.
  • the mold is necessary and Naka, as a manufacturing method of this type, if prepared mold in LIGA (Litho g raphie Galvan oformung Abformung ) process, Mold that makes it easy to release the carrier after molding Is preferable because it can be produced.
  • LIGA Litho g raphie Galvan oformung Abformung
  • the area of the upper surface of the projection is substantially the same.
  • the area of the portion where various kinds of selective binding substances are immobilized can be made the same, which is advantageous for later analysis.
  • that the area of the upper portion of the convex portion is substantially the same means that the value obtained by dividing the largest upper surface area among the convex portions by the smallest upper surface area is 1.2 or less.
  • the area of the upper surface of the convex portion is not particularly limited, but in view of the fact that the amount of the selective binding substance can be reduced and the ease of handling, mm 2 or less, 10 Zm 2 or more Is preferred.
  • the height of the convex portion in the concave and convex portion is preferably not less than 0.01 mm and not more than 1 mm. If the height of the projections is lower than this, nonspecifically adsorbed specimens other than spots may be detected, resulting in poor S / N. If the height of the projection is 1 mm or more, the projection may be broken and may be easily damaged.
  • a conductive material is provided on at least a part of the side surface.
  • Preferable regions to be coated with the conductive material include the entire surface of the concave portion and the entire side surface of the convex portion.
  • Figure 5 shows an example. (21 in FIG. 5 indicates the upper surface of the convex portion, 22 indicates the conductive film, and 23 indicates the insulating film.)
  • the applied voltage range is 0.01 V or more when a current flows. A range below 2 V is preferred. A particularly preferred range is from IV to 1.5 V.
  • the material of the conductive material is not particularly limited, carbon, magnesium, aluminum, silicon, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, copper / nickel, nickel,
  • the projection is coated with a conductive material as described above, it is preferable to further provide a layer of an insulating material other than the upper surface of the projection. With a layer of insulating material, it is possible to draw the subject only to the upper surface of the projection when a current flows.
  • a metal oxide e.g., A 1-0, S i 0 2 , T i 0 2, VO, S n 0, C r _0, Z n- 0, G e 0 2, T a 2 Os, Z R_ ⁇ 2, such as N b- 0, Y 2 0 3
  • nitrides A 1
  • the carrier for immobilized selective binding substance obtained by the above-mentioned method can be subjected to an appropriate treatment after fixing the selective binding substance.
  • an appropriate treatment for example, heat treatment, alkali treatment, surfactant treatment, and the like can modify the immobilized selective binding substance.
  • a selective binding substance-immobilized carrier generally undergoes a hybridization reaction between a fluorescence-labeled sample and a selective binding substance immobilized on the carrier, and reads fluorescence using a device called a scanner. It is a target.
  • the scanner narrows down the laser light, which is the excitation light, with an objective lens and collects the laser light.
  • the polymer having the structural unit of the general formula (1) exhibits a black color, and contains a substance that does not emit light by laser irradiation to make the surface black, thereby reducing auto-fluorescence from the carrier itself.
  • the black carrier means that the spectral reflectance of the black portion of the carrier has a specific spectrum pattern (such as a specific peak) in the visible light range (wavelength from 400 nm to 800 nm). And the spectral transmittance of the black portion of the carrier does not have a specific spectral pattern and is uniformly low.
  • the spectral reflectance in the range of visible light is 7% or less, and the spectral transmittance in the same wavelength range is less than 7%. It is preferably at most 2%.
  • the spectral reflectance refers to the spectral reflectance when specularly reflected light from a carrier is taken in a light receiving optical system that satisfies JISZ8722 condition C.
  • Means for blackening can be achieved by including a black substance in the carrier.
  • the black substance include carbon black, graphite, titanium black, aniline black, Ru, Mn, N i, C r, F e , oxides of C o Oyo Pi C u, S i, T i , T a, can be black substance used such as carbides Z r and C r.
  • black substances can be contained alone or in combination of two or more.
  • carpump racks, graphite, and titanium black can be preferably contained, and carbon black can be particularly preferably used because it is easily dispersed uniformly in the polymer.
  • a resin that can withstand a relatively high temperature such as polycarbonate, polyimide, or polyamide may be used.
  • Figure 6 shows this conceptual diagram. (2 indicates a selective binding substance (DNA), 3 indicates a support layer (glass), and 4 indicates a selective binding substance-immobilized layer (PMM A).
  • the support layer glass, iron, chromium, etc.
  • the surface of the support layer is subjected to plasma treatment with argon, oxygen, or nitrogen gas and treatment with a silane coupling agent.
  • silane coupling agents include 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropylmethoxymethylsilane, and 3- (2-aminoaminoethylaminopropyl) trimethoxysilane.
  • Means for providing the selective binding substance immobilization layer on the support layer include dissolving the polymer in an organic solvent, spin coating, Known means such as divebing can be used. More simply, it can be attached to the support layer with an adhesive.
  • the term “selective binding substance” refers to a substance that can selectively or directly bind to a test substance, and is typically exemplified by nucleic acids, proteins, saccharides, and other antibodies. Primitive compounds can be mentioned.
  • the nucleic acid may be DNA, RNA or PNA.
  • the single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof.
  • examples of the protein include an antigen-binding fragment of an antibody such as an antibody and a Fab fragment ⁇ F (ab ') 2 fragment, and various antigens.
  • Antibodies and their antigen-binding fragments selectively bind to the corresponding antigen, and the antigen selectively binds to the corresponding antibody, and thus fall under the category of “selective binding substance”.
  • the saccharide is preferably a polysaccharide, and includes various antigens.
  • substances having antigenicity other than proteins and saccharides can be immobilized.
  • the selective binding substance used in the present invention may be a commercially available substance, or may be a substance obtained from living cells or the like. Particularly preferred as the “selective binding substance” is a nucleic acid.
  • nucleic acids having a length of 100 to 100 bases can be easily and artificially synthesized by a synthesizer, and the amino group at the end of the nucleic acid can be easily modified artificially. It is preferable because it is easy and it is easy to immobilize it on the carrier surface. Further, if it is less than 20 bases, 20 to 100 bases are more preferable from the viewpoint that the stability of the hybridization is low. In order to maintain the stability of hybridization, it is particularly preferably in the range of 40 to 100 bases.
  • the test substance to be subjected to the measurement method using the carrier of the present invention includes a nucleic acid to be measured, for example, a gene of a pathogenic bacterium or a virus, a gene causing a genetic disease, and a part thereof, which has antigenicity.
  • a nucleic acid to be measured for example, a gene of a pathogenic bacterium or a virus, a gene causing a genetic disease, and a part thereof, which has antigenicity.
  • examples include, but are not limited to, various biological components, antibodies against pathogenic bacteria, viruses, and the like.
  • samples containing these test substances include blood, serum, plasma, urine, stool, cerebrospinal fluid, saliva, various tissue fluids and other body fluids, various foods and drinks, and dilutions thereof. However, it is not limited to these.
  • the nucleic acid to be a test substance may be a nucleic acid extracted from blood or cells by a conventional method, or the nucleic acid may be used as a nucleic acid for PCR or the like. It may be amplified by the width method. In the latter case, the measurement sensitivity can be greatly improved.
  • amplified nucleic acid can be labeled by performing amplification in the presence of a nucleotide triphosphate labeled with a fluorescent substance or the like.
  • the test substance is an antigen or an antibody
  • the test substance antigen or antibody may be directly labeled by an ordinary method, or the test substance antigen or antibody may be bound to the selective binding substance. After that, the carrier is washed, and the antigen or antibody is reacted with a labeled antibody or antigen that reacts with the antigen, whereby the label bound to the carrier can be measured.
  • the step of allowing the test substance to interact with the immobilized substance can be performed in exactly the same manner as before.
  • the reaction temperature and the reaction time are appropriately selected depending on the chain length of the nucleic acid to be hybridized, the type of antigen and Z or antibody involved in the immune reaction, etc.In the case of nucleic acid hybridization, usually 50 ° is used. In the case of an immune reaction, the temperature is usually from room temperature to about 40 ° C for about 1 minute to several hours.
  • Transparent polymethyl methacrylate (PMMA) plate (manufactured by Kuraray Co., Ltd .; Comoglass extruded plate, thickness l mm, average molecular weight 150,000, that is, number average polymerization degree 1500) Wash thoroughly with ethanol and pure water Then, it was immersed in a 10 N aqueous sodium hydroxide solution at 70 ° C. for 12 hours. Next, washing was performed in the order of pure water, 0.1 IN HC1 aqueous solution, and pure water. Using the alkali-treated plate and the non-alkali-treated plate as samples, use a fluorine-containing labeling reagent (trifluoroethanol) to label carboxyl groups on the sample surface in the gas phase. did.
  • PMMA Polymethyl methacrylate
  • XPS measurement was performed using the monochromatic A 1 K a 1 and 2 wires (1 486.6 eV) under the conditions of an X-ray diameter of 1 mm and a photoelectron escape angle of 90 °.
  • the carboxyl group was estimated in consideration of the reaction rate for the s and F 1 s peak area intensities. As a result, the carboxyl group content was 0.013 (the ratio of carboxyl group carbon in the total carbon amount) in the case of the alkali-untreated sample, The value of the treated sample was 0.0015, indicating that the amount of carboxyl groups on the surface was large.
  • the count number of ions having a mass number of 69 corresponding to CF 3 was 1,200 for the untreated product, but was 7,000 for the sodium hydroxide-treated product. Furthermore, when the distribution of fluorine on the surfaces of both samples was measured two-dimensionally by T OF-SIMS, the localized distribution was observed in the 19 F- ion image for the sodium hydroxide-treated product.
  • Transparent polymethyl methacrylate (PMMA) plate manufactured by Kuraray Co., Ltd .; Comoglass extruded plate, thickness lmm, average molecular weight 150,000, that is, number average degree of polymerization 1,500
  • PMMA Transparent polymethyl methacrylate
  • This plate was measured using GenePix 4000 B from Ax on Instruments under the conditions of excitation wavelength of 532 im, gain setting of photomaniplier of 700, and laser power of 33%.
  • the auto-fluorescence intensity (without alkali treatment) is 650 Ivy 0
  • SEQ ID NO: 1 (70 bases, 5 'end amination), SEQ ID NO: 2 (60 bases, 5' end amination), SEQ ID NO: 3 (40 bases, 5 'end amination), SEQ ID NO: 4 (20 bases, 5 bases) 'Terminal amination) DNA was synthesized. These DNAs of SEQ ID NOS: 1 to 4 are aminated at the 5 'end.
  • the DNA of SEQ ID NO: 8 (968 bases) having a base sequence capable of hybridizing with the DNA-immobilized substrate was used.
  • the adjustment method is described below.
  • SEQ ID NOS: 5 and 6 were synthesized. This was dissolved in pure water to a concentration of 100 ⁇ . Next, pKF3 plasmid DNA (TAKARA BIO INC. Product number; 3100) (SEQ ID NO: 7: 2264 bases) was prepared and used as a template. DNAs of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 were used as primers. Amplification was performed by PCR reaction (polymerase chain reaction).
  • the PCR conditions are as follows. That is, ExTaq 2 ⁇ l, lOXExBuffer 40 / z 1, dNTP Mix 32 / z 1 (these are attached to product number RR001A manufactured by Takara Bio Inc.), solution of SEQ ID NO: 5 is 2 / X 1, sequence 2 ⁇ l of solution No. 6 0.21 was added to the plate (SEQ ID NO: 7), and the total volume was increased to 400 / i1 with pure water. The mixture was divided into four microtubes and PCR was performed using a thermal cycler. This was purified by ethanol precipitation and dissolved in 40/1 pure water. An aliquot of the solution after the PCR reaction was confirmed by electrophoresis. The amplified DNA had a base length of approximately 960 bases, and it was confirmed that SEQ ID NO: 8 (966 bases) was amplified. confirmed.
  • a 9-base random primer (manufactured by Takara Bisai Co., Ltd .; product number 38002) was dissolved at a concentration of 6 mg / ml, and 2 / zl was added to the purified DNA solution after the PCR reaction. This solution was heated to 100 ° C. and then quenched on ice. These were supplemented with the buffer supplied with K1 enow Fragment (Takara Bio Inc .; product number 2140 AK) and a dNTP mixture (dATP, dTTP and dGTP concentrations were 2.5 mM and dCTP, respectively). Concentration of 400 ⁇ M) was obtained by 2.5 ⁇ force 13.
  • Cy 3 -d CTP manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; product number P A53021
  • 10 U of Klenow Fragment was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 20 hours to obtain Cy3-labeled specimen DNA. Since random primers were used for labeling, the length of the sample DNA varies. The longest sample DNA is SEQ ID NO: 8 (966 bases). When the sample DNA solution was removed and confirmed by electrophoresis, the strongest band appeared near the base corresponding to 960 bases, and the area corresponding to the shorter base length was slightly smeared. Met. . This was purified by ethanol precipitation and dried.
  • the labeled sample DNA was combined with 1 wt% BSA (peroxidase albumin), 5 XSSC (53.8 XSSC is 43.8 g of NaC1 and trisodium citrate hydrate 22.1 g into pure water to make it up to 11.
  • BSA peroxidase albumin
  • 5 XSSC 5 XSSC is 43.8 g of NaC1 and trisodium citrate hydrate 22.1 g into pure water to make it up to 11.
  • the sample DNA was hybridized to the substrate on which the probe DNA obtained above was immobilized. Specifically, 10 ⁇ l of a solution for hybridization was dropped on the carrier on which the probe nucleic acid prepared above was immobilized, and a force glass was applied thereon. In addition, a paper pound was used to seal around the power glass to prevent the hybridization solution from drying out. This was placed in a plastic container and incubated at 65 ° C. and 100% humidity for 10 hours. After incubating, the cover glass was peeled off and washed and dried.
  • the fluorescence on the substrate after hybridization was observed with a fluorescence microscope (Olympus optical). Fluorescence emission indicating hybridization was observed in all the probe parts. Also, as the number of bases increased to 40, 60, and 70, the difference between the fluorescence on the spot and the background increased. That is, as the number of bases of the probe became longer, the S / N ratio was improved.
  • the carrier after the above treatment was set in a DNA chip scanner (GenePix 4000B from Axon Instruments), and the laser output was 33% and the photomultiplier gain was 500 The measurement was carried out in the state of the above.
  • the results are shown in Table 1.
  • the fluorescence intensity is the average value of the fluorescence intensity in the spot
  • the noise is the average value of the fluorescence intensity around the spot (the portion where the DNA is not spotted).
  • Example 1 An experiment was performed in which the substrate as in Example 1 was glass instead of PMMA.
  • the slide glass was immersed in a 1 ON NaNaOH aqueous solution for 1 hour, and then sufficiently washed with pure water.
  • APS 3-aminopropyltriethoxysilane; manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • APS was dissolved in pure water at a ratio of 2% by volume, and the above slide glass was immersed for 1 hour. After being removed from the container, it was dried at 110 ° C. for 10 minutes. In this way, amino groups were introduced on the surface of the glass.
  • DNAs having base sequences 1 to 4 were immobilized on the glass substrate in the same procedure as in Example 1.
  • This reaction scheme is shown in FIG. 7 (in FIG. 7, 2 indicates a selective binding substance (DNA) and 5 indicates a glass substrate).
  • hybridization was performed in the same procedure as in Example 1. This was observed under a fluorescent microscope under the same conditions as in Example 1.
  • the slide glass used was a coated slide glass for DNA microarrays, high-density amino-introduced type (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd .; product number SD0000111), and a MAS coated slide glass (Matsunami Glass Industry Co., Ltd.)
  • the product number S081110) was used.
  • the S / N ratio was inferior even when these slide glasses were used as compared with the case where the substrate was PMMA.
  • Table 1 Table 1
  • Example 1 PM A 23000 150 18400 155 12400 150 2500 145
  • aqueous solution (DNA concentration: 0.027 nmol Z) was prepared by using the same 5′-terminal amino acid as in Example 1 and dispersing it in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3). / i 1) 200 ⁇ 1 was spotted on the glass substrate obtained above. Immediately after leaving the glass substrate after immobilization at 25 ° C and 90% humidity for 1 hour, the glass substrate was washed twice with a mixed solution of 0.1 wt% SDS and 2XSSC. 2. Washed sequentially with XSSC aqueous solution once.
  • the glass substrate after the above-mentioned washing is immersed in a 0.1 M aqueous solution of dalysin (pH 10) for 1 hour and 30 minutes, washed with distilled water, dried at room temperature, and the DNA fragment is fixed. A glass substrate was obtained.
  • Hybridization was performed in the same manner as in the hybridization experiment of Example 1 and using the sample DNA. Table 2 shows the results. It can be seen that the S / N ratio is not sufficient compared to the case where the substrate of Example 1 is PMMA.
  • Comparative Example 2 4300 2000 3000 1500 1800 1220 1500 1200
  • a similar substrate was fabricated, and the spectral reflectance and spectral transmittance of this black substrate were measured.
  • the spectral reflectance was 5 at any wavelength in the visible light region (wavelength from 400 nm to 800 nm). %, And the transmittance was 0.5% or less in the same wavelength range.
  • the spectral reflectance was measured using specular light from a carrier using a device equipped with a light receiving optical system (CM-2002, manufactured by Minolta Cameras) that conforms to JISZ 8722 condition C. The reflectance was measured.
  • CM-2002 manufactured by Minolta Cameras
  • test was carried out by the same sample DNA preparation method and the hybridization method as in Example 1.
  • Example 2 Under the same conditions as in Example 1, the fluorescence was measured by a scanner. Table 3 shows the results of observation using a scanner. As in Example 1, the fluorescence intensity increased as the number of bases increased. In addition, the background decreased as compared with the result of Example 1. From this, it was confirmed that the noise was reduced when the substrate was made black, and the SZN ratio was further improved.
  • a slide glass having 3-aminopropyltriethoxysilane introduced on the surface was prepared in the same manner as in Comparative Example 1.
  • PMMA dissolved in black hole form is spin-coated, and kept at 100 ° C for 15 minutes and at 115 for 1 hour, and the support layer (glass) / selective binding substance fixed layer (PMMA) was prepared.
  • the thickness of the spin-coated PMMA was approximately 20; ⁇ m.
  • Example 1 the substrate was slightly warped, but the carrier of this example did not show any warpage.
  • Example 2 when the PMMA used in Example 2 in which the car pump racks were dispersed was spin-coated in the same manner, the same fluorescence intensity and noise as in Example 2 were obtained, and no warping of the carrier was observed in this case. .
  • Example 2 The same experiment as in Example 1 was performed except that 10 N sulfuric acid was used instead of using a 10 N aqueous solution of NaOH when generating a carboxyl group on the PMMA surface. As a result, the same results as in Example 1 were obtained.
  • a copolymer of styrene and MMA (methyl methacrylate) was prepared.
  • the prepared polymer composition was 10 mol% of MMA and 90 mol% of styrene.
  • a specific method for preparing this copolymer is to dissolve MMA and styrene in a ratio of 1: 9 (molar ratio) in dehydrated toluene, and then convert AIBN (azobisisobutylnitrile) to MMA and styrene.
  • the mixture was added at a ratio of 1/1000 of the total number of moles, and kept at 60 ° C. for 1 hour, at 65 ° C. for 3 hours, and at 90 ° C. for 20 hours under a nitrogen atmosphere. And it refine
  • the composition of the purified polymer was confirmed by NMR (nuclear magnetic resonance).
  • the molecular weight of this polymer was measured by GPC, and the number average degree of polymerization was calculated to be 1100.
  • the purified polymer was formed into a plate having a thickness of about 1 mm by a casting method.
  • the same experiment as in Example 1 was performed, except that only the DNA to be immobilized was SEQ ID NO: 2.
  • the fluorescence was measured by the scanner under the same conditions as in Example 1. As a result, the fluorescence intensity was 5200, the noise was 150, and even when the MMA content was 10%, the SZN ratio was improved compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • the excitation wavelength was 532 nm
  • the setting gain of the photomultiplier was 700
  • the laser power was 33%.
  • the autofluorescence intensity of this plate was 750 when the plate was measured.
  • a polystyrene homopolymer was prepared and cast into a plate with a thickness of about 1 mm. Using this plate, an experiment was performed in the same manner as in Example 1, but no fluorescence indicating hybridization of the probe DNA and the sample DNA was observed at all.
  • a mold for injection molding was prepared by using a known method, LIGA (Lithographie Galvanoformung Abfong) process, and a PMMA substrate having a shape as described later was obtained by the injection molding method.
  • the average molecular weight of PMMA used in this example was 150,000, and 1% by weight of carbon black (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) in PMMA.
  • the substrate is black.
  • the spectral reflectance and transmittance of this black substrate were measured, the spectral reflectance was 5% or less at any wavelength in the visible light region (wavelengths from 400 nm to 800 nm). At wavelength, the transmittance was less than 0.5%. In both the spectral reflectance and the spectral transmittance, there was no specific spectrum pattern (such as peaks) in the visible light region, and the spectrum was uniformly flat.
  • the spectral reflectance was measured using a device equipped with an illumination and light receiving optical system (Minolta Camera, CM-2002) that conforms to Condition C of JISZ8722, and the specular reflection light from the carrier was taken in. The spectral reflectance was measured.
  • the size of the board is 76 mm long, 26 mm wide, and 1 mm thick.
  • the surface was flat except for the central part.
  • At the center of the substrate there is a recess with a diameter of 10 mm and a depth of 0.2 mm.
  • a convex part with a top diameter of 0.2 mm and a height of 0.2 mm Are provided in 64 (8 X 8) places.
  • the diameter of the lowest part of the protrusion (the root of the protrusion) was 0.23 mm, and the upper part was tapered so that the substrate after injection molding could be easily released.
  • the difference between the height of the upper surface of the convex portion of the uneven portion (the average value of the heights of the 64 convex portions) and the height of the flat portion was measured and found to be 3 ⁇ or less.
  • variations in the height of the 64 convex top surfaces difference between the height of the highest convex top surface and the height of the lowest convex top surface
  • the average of the height of the convex top surfaces The difference in height of the upper surface of the flat part was measured and found to be 3 ⁇ m or less in each case.
  • the pitch of the four convex portions was 0.6 mm.
  • the above PMMA substrate was immersed in a 1 ON aqueous solution of sodium hydroxide at 65 ° C for 12 hours. This was washed with pure water, a 0.1N HC1 permanent solution, and pure water in this order to form a lipoxyl group on the substrate surface.
  • the plate of PMMA containing carbon black used in this example was subjected to photomultiplier treatment using an excitation wavelength of 532 nm using Genex Pix400B manufactured by Axon Instruments. The auto-fluorescence intensity of this plate was 250 when the gain was set at 700 and the laser power was measured at 33%.
  • DNA of SEQ ID NO: 2 (60 bases, 5 ′ terminal amination) was synthesized. This DNA is aminated at the 5 'end. This DNA was dissolved in pure water at a concentration of 0.27 nmo I / ⁇ to prepare a stock solution. When spotting on the substrate, the final concentration of the probe is adjusted to 0.027 nmol // l with PBS ( ⁇ ⁇ 5.5), and the carboxyl group on the carrier surface and the amino group at the end of the probe DNA are In order to condense this, 1-ethyl-13- (3-dimethylaminopropyl) phenol (EDC) was added, and the final concentration was adjusted to 5 O mg / m 1.
  • EDC 1-ethyl-13- (3-dimethylaminopropyl) phenol
  • the molecular weight of the sample DNA was the same as that of Example 1 and Comparative Example 1. This was placed in a plastic container and incubated at 100% humidity and 65 ° C for 10 hours. After the incubation, the glass was peeled off, washed and dried.
  • the convex portion of the PMMA injection molded product used in Example 6 was shaved with rubbing paper to provide a difference in the height of the convex portion upper surface. That is, a carrier (carrier) with a projection (four places) lower than the other projection upper surface (reference projection) by 30 / ⁇ ⁇ 1, 50 ⁇ m lower than the other projection upper surface Carriers with four projections (carriers) were prepared. The difference between the height of the upper surface of the convex portion other than the lower portion (the reference convex portion) and the height of the flat portion was 3 / X m or less.
  • Example 6 In the same manner as in Example 6, adjustment of the probe DNA to be spotted was performed. Next, the probe DNA solution was spotted at four locations on the upper surface of the convex portion serving as a reference and at four locations on the upper surface of the lower convex portion as in Example 6. Further, the preparation of DNA for hybridization and the operation of hybridization were performed in the same manner as in Example 6, and the measurement was performed in the same manner as in Example 6. Table 5 shows the average value of the fluorescence intensity on the upper surface of the projection and the average value of the noise around it, and the average value of the fluorescence intensity on the upper surface of the projection with a low height and the average value of the noise around it.
  • Fluorescence intensity noise Fluorescence intensity noise Carrier 21000 30 18 500 26
  • Example 6 Further, the case where there is a difference between the upper surface of the convex portion and the flat portion was examined.
  • the flat part of the PMMA injection molded product used in Example 6 was scraped with rubbing paper, and the difference between the height of the flat part upper surface and the height of the convex part was 30 ⁇ m (carrier ⁇ ) and 50 ⁇ (carrier Two types of carriers were prepared. That is, the height of the convex portion of the carrier ⁇ is 30 m higher than the height of the flat portion.
  • adjustment of the probe DNA to be spotted spotting of the probe DNA solution on the upper surface of the convex portion, adjustment of the DNA for hybridization, and operation of hybridization were performed, and the same operation as in Example 6 was performed. was measured.
  • the projections on which the DNA solution was spotted on the upper surface are four points for each substrate. Then, the average value of the fluorescence intensity of the spot where the DNA was spotted (4 places) and the noise around it (4 places) were calculated. Table 6 shows the results
  • Plates of polymethyl methacrylate, polyethyl methacrylate, and polyphenyl methacrylate were prepared by a casting method and immersed in a 10% aqueous solution of sodium hydroxide at 50 ° C. for 10 hours. Next, washing was performed in the order of pure water, 0.1N HC1 aqueous solution, and pure water. In this way, the side chains of the polymer on the plate surface were hydrolyzed to generate carboxyl groups.
  • the immobilization of the probe DNA (however, the immobilized probe DNA is only 60 bases long), the preparation of the sample DNA, the hybridization, and the measurement were performed in the same manner as in Example 1. Table 7 shows the results.
  • a substrate similar to that of Example 6 was produced. Then, N i by sputtering on the substrate - C r (composition N i 8 C r 2) and the prepared 50 nm. Separately, a solution was prepared by dissolving 1 g of the above-mentioned substrate (not provided with a Ni—Cr film) in 10 mL of black hole form. Then, this was applied by a spin coating method to form an insulating layer made of a black PMMA film on the Ni-Cr film.
  • the substrate was immersed in a 10 N NaOH solution at 65 ° C., and then purified water and 0.1 N The solution was washed with an aqueous HC1 solution and pure water in this order.
  • the immobilization of the probe DNA and the preparation of the sample DNA were performed in the same manner as in Example 6.
  • a gold wire and a commercially available silver paste are connected so that the Ni—Cr film of the carrier and the anode of the power supply are electrically connected to each other, and the gold (gold wire) of power glass is connected to the power supply. Connected to the cathode. This was placed in a 65 ° C oven and incubated for 15 minutes. Then, after applying a voltage of 1 V from the power supply for 5 minutes, the battery was taken out of the oven, the cover glass was peeled off, and then washed and dried.
  • Example 6 As a result, a result similar to that of Example 6 was obtained. Thus, even if the hybridization time is short, the hybridization time can be shortened by providing an electrode on the side surface of the projection and applying an electric field.
  • Comparative Example 4 A 1 mm thick plate (Zeklon, manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.) containing polyacrylonitrile as a main component was cut into a size of 75 mm ⁇ 25 mm. This was immersed in 10 N NaOH and left at 70 ° for 12 hours. After washing, immobilization of the probe DNA (probe DNA has a base length of 60 bases) and hybridization with the sample DNA were performed in the same manner as in Example 1. As a result of measurement in the same manner as in Example 1, autofluorescence was large, and it was impossible to detect the presence or absence of hybridization between the sample and the probe. This is because the plate itself is yellowish and the autofluorescence is very large.
  • the excitation wavelength was 532 nm
  • the setting gain of the photomultiplier was 700
  • the laser power was 33%.
  • the autofluorescence intensity of this plate was as high as 30,000.
  • MMA methyl methacrylate
  • methacrylic acid methacrylic acid
  • a 1 mm thick plate made of a polymer obtained by copolymerizing 99 parts by weight of methyl methacrylate (MMA) and 1 part by weight of methacrylic acid was prepared by a casting method. Alkaline treatment was performed using Gene Pix 400 B from Ruments at excitation wavelength of 532 nm, gain setting of photomultiplier of 700 and laser power of 33%. When the plate of the embodiment was measured, the autofluorescence intensity of this plate was 850.
  • Example 2 The same experiment as in Example 1 was performed except that the heat treatment (soaking in sodium hydroxide) was omitted. As a result, no fluorescence indicative of hybridization was observed. This is considered to be because carboxyl groups are not sufficiently generated unless surface treatment with an alkali-treated product or acid is performed, and as a result, the amount of probe DNA immobilized is extremely small. Industrial applicability
  • a carrier on which a selective binding substance having a good S / N ratio is immobilized which has a low non-specific sample adsorption, a good hybridization efficiency, and a good S / N ratio. be able to.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Description

明 細 書 選択結合性物質固定ィ匕担体 技術分野
本発明は、 被検物質と選択的に結合する物質 （本明細書において 「選択結合性 物質」） を固定化した担体に関する。 背景技術
各種生物の遺伝情報角军析の研究が始められており、ヒ ト遺伝子をはじめとして、 多数の遺伝子とその塩基配列、 また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれ ら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつあ る。 配列の明らかにされた遺伝子、 蛋白質、 糖鎖などの高分子体の機能について は、 各種の方法で調べることができる。 主なものとしては、 核酸についてはノー ザンハイプリダイゼ一ン 3ン、あるいはサザンハイプリダイゼーションのような、 各種の核酸/核酸間の申目補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係 を調べることができる。 蛋白質については、 ウェスタンハイブリダィゼーシヨン に代表されるような、 蛋白質/蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現 について調べることができる。
近年、 多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として D N Aマイクロアレイ法 ( D N Aチップ法） と呼ばれる新しい分析法、 ないし方法論が開発され、 注目を 集めている。 これらの方法は、 いずれも核酸/核酸間ハイプリダイゼーシヨ ン反 応に基づく核酸検出 ·定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、 蛋 白質 蛋白質間あるいは糖鎖ノ糖鎖間や糖鎖/蛋白質間のに基づく蛋白質や糖鎖 検出 '定量にも応用が可能ではある。 これらの技術は、 マイクロアレイ又はチッ プと呼ばれるガラスの平面基板片上に、 多数の D N A断片や蛋白質、 糖鎖が高密 度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。 マイクロア レイ法の具体的使用法としては、 例えば、 研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色 素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイプリダイゼーションさせ、 互 、に 相捕的な核酸 （DNAあるいは RNA) 同士を結合させ、 その箇所を高解像度解 析装置で高速に読みとる方法や、 電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出 する方法が挙げられる。 こうして、 サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推 定できる。 ■ 例えば、 特表平 1 0— 50384 1号公報 （特許請求の範囲） には、 核酸を基 板上に固定化するための技術として、 スライ ドガラス等の平坦な基板の上にポリ 一 L—リジン、 アミノシラン等をコーティングして、 スポッターと呼ばれる点着 装置を用い、 各核酸を固定化する方法などが開示されている。
また、 例えば、 特開 200 1— 1 086 83号公報 （特許請求の範囲およぴ実 施例） には、 DNAチップに用いられる核酸プローブ （基板上に固定化された核 酸） は、 従来の数百〜数千塩基の長さの c DNAおよびその断片から、 検出の際 のエラーを下げることと、 合成機で容易に合成できるという理由から、 核酸プロ ーブとしてオリゴ DN A (オリゴ D N Aとは塩基数が 1 0〜 100塩基までのも のをいう） を用いる方法が開示されている。 この際、 オリゴ DNAとガラス基板 とを共有結合にて、 結合させている。
その他、 DNAチップに用いるガラス以外の基板の材料としては、 樹脂製の基 板についていくつかの提案がある。 例えば、 特開 200 1— 337089号公報 (第 1 7段落） には基板として、 ポリメチルメタタリ レー トからなるポリマーに ついての記述がある。 しかしながら、 特開 200 1— 3 3 7089号公報には具 体的な DN Aの固定化方法については何ら述べられていない。 また、 特開 2 00 3 - 1 308 74号公報 （第 1 2段落） にも同様の記述があるが、 具体的な DN Aの固定化方法については何ら記述されていない。 特開 2002— 7 1 6 9 3号 公報 （第 7段落） にはアクリル繊維などの二トリル基を有する繊維をアル力 リ処 理によってカルボキシル基を有する繊維に誘導し、 このカルボキシル基と D N A などを結合して固定化する方法が開示してある。 しかし、 アルカリ繊維はポリア クリロニトリルが主成分であるため、 材料自体の自家蛍光が大きく基板としては 不適であるとの問題点がある。 さらに特開 200 2— 7 1 693号公報 （第 7段 落） には、 ポリメタクリレー トをアクリル酸、 メタクリル酸との共重合によって カルボキシル基を有する繊維に誘導し、 このカルボキシル基と D N Aとを結合す る方法が開示してあるが、 この方法では、 基板 （担体） 表面のカルボキシル基の 量が少なく、 固定できる D N Aの量が少なくなり、 結果的にハイブリダィゼーシ ヨンを示すシグナルが十分に得られないと言った問題点があった。 発明の開示
本発明が解決しょうとする課題は次のようなものである。 まず、 平坦なガラス の基板にオリゴ D N Aを固定化した場合、 以下のような問題点があった。 すなわ ち、 1 ) ハイブリダィゼーシヨンを行った時、 ガラスが親水的なので、 プローブ D N Aを固定したスポット以外の部分にも非特異的に検体 D N Aが吸着し易く、 スキャナーと呼ばれる装置で蛍光検出を行う際、 この非特異的に吸着した検体を も検出し、 ノイズが大きくなるという問題点と、 2 ) ガラスが剛体のため、 これ に共有結合したオリゴ D N Aの空間的な自由度が妨げられるという推定理由か ら、 検体 D N Aとのハイブリダィゼーシヨン効率が低いので、 シグナル強度が小 さく、 結果的に S / N比が十分でないといった問題があった。
本発明が解決しょうとする課題は、 樹脂製の基板に強固にかつ、 ハイブリダィ ゼーション効率の良い状態で D N Aを固定化した担体を提供するものである。 さ らには、 上記のような S Z Nの悪化を防ぎ、 検出感度の高い選択結合性物質が固 定化された担体を提供するものである。
すなわち本発明は、 選択結合性物質が固定化された担体であって、 該担体の表 面が低自家蛍光樹脂から成り、 アル力リもしくは酸でこのポリマーの表面を処理 し、 カルボキシル基を生成してから選択結合性物質を固定化したことを特徴とす る選択結合性物質固定化担体である。
また本発明は、 担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定 化担体であって、 担体表面が、 下記一般式 （1 ) で表される構造単位を含有して いるポリマーを有し、 アル力リもしくは酸でこのポリマーの表面を処理してから 選択結合性物質を固定化したことを特徴とする選択結合性物質固定化担体であ る。 ( 1 )
X=O, NR3， C¾
Figure imgf000006_0001
(一般式 （1 ) の R R2、 R3は、 アルキル基、 ァリール基もしくは水素原子 を表す。）
本発明により、 非特異的な検体の吸着が少なく、 かつ、 ハイブリダィゼーショ ン効率が良好であり、 結果的に S/N比が良好な選択結合物質が固定化された担 体を提供することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 PMMA表面に選択結合性物質を固定化する際の反応スキーム示すた めの図、
図 2は、 本発明の担体の模式図、
図 3は、 本発明の担体の断面模式図、
図 4は、 マイクロアレイ突き当て用治具の例を示す図、
図 5は、 担体凹凸部の断面図、
図 6は、 支持体層と選択結合性物質固定化層を有する担体の概念図、 図 7は、 ガラス表面に選択結合性物質を固定化する際の反応スキームを示すた めの図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の選択結合性物質の固定化担体について説明する。
本発明の選択結合性物質の固定化担体は、 選択結合性物質を固定化するため、 担体表面が低自家蛍光樹脂からなり、 かつ、 アルカリもしくは酸にて表面を処理 し、カルボキシル基を生成することを特徴とする。 ここで、低自家蛍光樹脂とは、 Ax o n I n s t r um e n t s社の G e n e P i x 4 0 0 0 Bを用レヽて、 厚み 1 m mの清浄な平板を、 励起波長 5 3 2 n m、 フォトマルチプライヤーの設 定ゲインを 7 0 0、 レーザーパワーを 3 3 %の条件で測定したとき、 蛍光強度が 1 0 0 0以下であるものを言う。 これを満たさない樹脂は、 検出の際の S / Nが 悪化するので、好ましくない。 このような樹脂としては、例えば下記一般式 ( 1 ) で表されるポリマーを挙げることができる。
Figure imgf000007_0001
また、 本発明の選択結合性物質の固定化担体は、 選択結合性物質を固定化する ための担体表面が、 下記一般式 （1 ) で表される構造単位を含有しているポリマ 一を有する固体である。
Figure imgf000007_0002
(一般式 （1 ) の R R R 3は、 アルキル基、 ァリール基もしくは水素原子 を表す。）
前記ポリマーとしては、 単独重合体あるいは共重合体が用いられる。 前記ポリ マーは、 少なくとも一つのタイプのモノマーを原料に用いており、 そのモノマー は、 重合に関与し得る二重結合および重縮合に関与し得る官能基ならびに、 ケト ンもしくはカルボン酸またはそれらの誘導体の形態で存在する。 また前記ポリマ 一は、 一般式 （1 ) の構造を有することがより好ましい。
なお、 前記ポリマーが共重合体の場合、 一般式 （1 ) で表される構造単位を全 モノマー単位の 1 0 %以上含有していることが好ましい。 一般式 （1 ) で表され る構造単位の含有量が 1 0 %以上であると、 後に説明するようなステップにて、 表面に多くのカルボキシル基を生成でき、プローブ核酸を多く固定化できるので、 結果的に S / N比がより向上する。
本発明において、 ポリマーとは、 数平均重合度が 5 0以上のものを言う。 この ポリマーの数平均重合度の好ましい範囲は、 1 0 0から 1万である。 特に好まし くは、 2 0 0以上、 5 0 0 0以下である。 なお、 数平均重合度は G P C (ゲルパ 一メイションクロマトグラフ） を用い定法にてポリマーの分子量を測定すること により、 容易に測定できる。
一般式 （1 ) において、 R 1および R 2はアルキル基、 ァリール基または水素原子 を表し、 それぞれ同一であっても異なっていても良い。 前記アルキノレ基は直鎖状 であってもまたは枝別れしていても良く、 好ましくは 1から 2 0の炭素数を有す る。 前記ァリール基は、 好ましくは 6から 1 8、 さらに好ましくは 6力 ら 1 2の 炭素数を有する。官能基 Xは 0、 N R 3 、または C H2の中から任意に選ばれる。 R 3は前記 R 1および R 2と同様に定義される官能基である。
前記各種のような官能基を含むポリマーで、 好ましいものとしては、 例えば、 ポリメチルメタクリ レー卜 ( P MMA )、 ポリェチルメタクリレート （P E M A) またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル （P AM A ) 等 がある。 これらの中で最も好ましいものは、 射出成形やホットエンボス法にて成 形が容易であり、 かつ、 比較的ガラス転移温度が高い点からポリメチルメタタリ レートである。 さらに、 ポリ酢酸ビュル、 ポリメタクリル酸シクロへキシルまた はポリメタクリル酸フエ二ル等も用いることができる。 また、 前記ポリマーの構 成要素を組み合わせた、 または前記ポリマーの構成要素に他の一種または複数種 のポリマーの構成要素を加えた構造の、 共重合体も用いることができる。 前記他 のポリマーとしては、 ポリスチレン等がある。
共重合体の場合、 各構成要素の比の範囲は、 力ルポ二ル基を含むモノマー、 例 えばメタクリル酸アルキルの割合は、 1 0モル％以上が好ましい。 こうすること により、 表面に多くのカルボン酸を生成できプローブ核酸を多く固定化できるの で、 結果的に S Z N比がより向上するからである。 ポリマーの構造単位のうち、 より好ましい該モノマーの割合は 5 0モル％以上である。 さらに本発明では、 一般式 （1 ) で表される構造単位を少なくとも 1つ有する ポリマーを有する担体に選択結合性物質を固定化するため、 これにアル力リもし くは酸で前処理を施すことが必要である。 こうすることにより、 担体表面にカル ボキシル基を形成させることができる。 担体表面に力ルポキシル基を生成する手 段としては、 アルカ リ、 酸などで処理する方法を単独で用いるだけではなく、 温 中での超音波処理、 酸素プラズマ、 アルゴンプラズマ、 放射線に担体を晒す方法 などと組み合わせても良い。 これらの方法の中でも、担体の損傷が少なく、 また、 容易に実施できるという点から温度を上げたアル力リ、 もしくは酸に担体を漬け 込んで表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、 水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液 （好ましい濃度は、 1 N〜 2 0 N ) に担体を漬 け込み、 好ましくは 3 0 から 8 0 °Cの温度にして、 1時間から 1 0 0時間の間 保持すればよい。
上記の方法にて、カルボキシル基が担体表面に生成したかどうカゝは、 X P S ( X 線光電子分光法） にて確認できる。 具体的には、 フッ素を含むラベル化試薬 （例 えばトリフルォロエタノール）を用いてカルボキシル基をフッ素でラベル化する。 そして、 ラベル化後の試料での C 1 s、 F 1 sピーク面積強度に反応率を考慮し て官能基量を推定することが可能である。 さらに精度を上げるためには、 トリブ ルォロエタノールで標識化された試料の表面のフッ素分布を T O F— S I M S
(飛行時間型二次イオン質量分析法） で観察することにより、 カルボキシル基が 担体表面に生成しているかどうかを確認すればよい。
このようにカルボキシル基を担体の表面に生成すれば、 これを足がかりに、 体側をピオチンもしくはアビチン修飾し、 選択結合性物質をアビチンもしくはビ ォチン修飾して、 アビチン · ピオチン相互作用にて選択結合性物質を担体に固定 化する方法や、 担体側をエチレンジァミン等のリンカーと反応させて、 さらにこ のリンカーと選択結合性物質を反応させ固定化することも考えられる。 しかし、 これらの方法では、 2段階の反応を行うため、 反応収率の関係から、 担体に固 化できる選択結合性物質が少なくなりがちである。 従って、 担体のカルボキシノレ 基と選択結合性物質との官能基とを直接反応させ、 選択結合性物質を固定化する ことが好ましい。 すなわち、 担体表面の力ルポキシル基と選択結合性物質のアミ ノ基ゃ水酸基とを共有結合により固定化することが好ましい。 一般的には、 これ らの結合の反応を助長するため、 ジシクロへキシルカルボジイミ ド、 N—ェチル 一 5—フエ二ルイソォキサゾリウム一 3 ' —スルホナートなどの様々な縮合剤が 用いられている。 これらの中でも、 1ーェチルー 3— （3—ジメチルァミ ノプロ ピル） カルポジイミ ド（E D C )は、 毒性が少ないことや、 反応系からの除去が比 較的容易なことから、 選択結合性物質と担体表面のカルボキシル基との縮合反応 にはもつとも有効な縮合剤の 1つである。 その他、 有望な縮合剤としては 4—
( 4 ， 6—ジメ トキシー 1 ， 3 , 5—トリアジン一 2—ィル) 一 4—メチノレ一モ ルホリニゥムクロリ ド （D M T—MM) がある。 これら E D Cなどの縮合剤は、 選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、 カルボキシル基が表面に生成 された担体を予め E D Cの溶液に浸漬しておき、 表面のカルボキシル基を活性化 しておいても良い。
このような縮合剤を用い、 担体表面の力ルポキシル基と選択結合性物質のアミ ノ基とを反応させた場合は、 アミ ド結合により担体表面と選択結合性物質が固定 化されることになり、 担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを 反応させた場合は、 エステル結合により担体表面と選択結合性物質とが固定化さ れることになる。 選択結合性物質を含む試料を担体に作用させる際の温度は、 5 °C〜 9 5 °Cが好ましく、 1 5 °C〜 6 5 °Cが更に好ましい。 処理時間は通常 5分〜 2 4時間であり、 1時間以上が好ましい。 なお、 選択結合性物質を固定化するた めのスキームを図 1に示す。 （図 1中の 1は P MM A基板を示し、 2は選択結合性 物質 （D N A ) を示す。）
前述した方法により、ポリマー表面に選択結合性物質を固定化することにより、 スポッ ト部分以外は、 電荷がマイナスのカルボキシル基が存在しているので、 検 体 （代表的な D N A ) の非特異的な吸着を抑え、 さらに、 共有結合で強固に、 か つ、 高密度に選択結合性物質を固定化でき、 さらに、 ガラスに比べ、 固定化され た選択結合性物質の空間的な自由度が髙いという推定理由のために、 検体とのハ イブリダイゼーション効率が高い担体を得ることができる。 空聞的な自由度が高 い利点は、 特に固定化されている選択結合性物質がオリゴ D N Aと呼ばれる塩基 長が 1 0塩基から 1 0 0塩基の D N Aとターゲットの場合に、 検体とのハイプリ ダイゼーション効率が非常に向上するという優れた特性を与える。
ところで、 一般式 （1 ) で示されるような構造単位を含むポリマーで担体を作 製する場合、 ガラス、 セラミック、 金属などに比較し、 射出成形方法やホッ トェ ンボス法などを用いることにより、 微細な形状を設けた担体をより簡単に大量生 産することが可能である。 そこで、 選択結合性物質が固定化される担体の形状に ついて述べる。 本発明の選択結合性物質が固定化される担体には凹凸部があり、 凸部上面に選択性適合物質が固定化されていることが好ましい。 このような構造 を取ることにより、 検出の際、 後述のように非特異的に吸着した検体を検出する ことがないので、 ノイズが小さく、 結果的により S / Nが良好な選択結合性物質 物質が固定化された担体を提供することができる。 そして、 凹凸部の複数の凸部 の高さに関しては、 凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。 こ こで、 高さが略同一とは、 多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化 し、 これと蛍光標識した被検体とを反応させ、 そして、 スキャナーでスキャンし た際、 その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。 具体的に高さが略 同一とは、 高さの差が 1 0 0 mより小さいことをいう。 さらに本発明の担体に は、 平坦部が設けられていることが好ましい。 具体例を図 2、 図 3に示す。 1 1 が平坦部であり、 かつ、 1 2で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質 （例 えば核酸） が固定化されている。 そして、 該凹凸部の凸部分の上面が実質的に平 坦であることが好ましい。 ここで凸部上面が実質的に平坦とは、 5 0 m以上の 凹凸がないことを意味する。 さらに、 凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の髙 さが略同一である。 ここで、 平坦部と凹凸部との高さが略同一とは、 スキャナー でスキャンした際、 その信号レベルの低下具合が問題とならない高さをいう。 具 体的に高さの差が略同一とは、 凹凸部凸部上面の高さと、 平坦部の高さとの差が 1 0 0 mより小さレヽことをいう。
すなわち、 一般にマイクロアレイは、 蛍光標識化された検体と担体に固定化さ れた選択結合性物質とを反応させ、 スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとる ことが一般的である。 スキヤづ "一は励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り 込み、 レーザー光を集光する。 この集光された光をマイクロアレイの表面に照 It して、 レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。 そして、 この条件の まま、 対物レンズもしくは、 マイクロアレイ自体を走査することによ りマイクロ アレイから発生する蛍光を読み込むような仕組みとなっている。
このような、 スキャナーを用いて本発明の凸部上面に選択結合性物質を固定化 した担体をスキャンすると、 凹凸部の凹部に非特異的に吸着した検体 D N Aの蛍 光 （ノイズ） を検出しがたいという効果を発揮する。 この理由は、 ώ部上面にレ 一ザ一光の焦点が合っているため、 凹部ではレーザー光がデフォー力スされるか らである。 逆に言えば、 選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、 最も高 ぃ凸部上面の高さと、 最も低い凸部上面の高さの差が 5 0 μ πι以下であることが 好ましい。 なぜなら、 凸部上面の高さにこれ以上のばらつきがあると、 スキャナ 一の焦点深度の関係で正確な蛍光強度を測定できないことが起こり う るからであ る。
なお、 選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、 最も高い ώ部上面の髙 さと、 最も低い凸部上面の高さの差は、 5 0 μ m以下であれば良いが、 3 0 πι 以下であることがより好ましく、 高さが同一であればなお好ましい。 なお、 本願 でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。 なお、 選択結合性物質が固定化された複数の凸部とは、 データとして必要な選 択結合性物質 （例えば核酸） が固定化された部分をいうのであって、 ただ単にダ ミーの選択結合性物質を固定化した部分は除く。
また、 一般にスキャナーの焦点を調整する方法は、 以下の通りである。 すなわ ち、 スキャナーがマイクロアレイの表面に励起光の焦点を合わせる際には、 マイ クロアレイの隅で励起光の焦点を合わせるか、 図 4に示すように、 治具にマイク ロアレイを突き当て、 レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。 そし て、 その条件のまま、 マイクロアレイ全体をスキャンする。 （図 4中の 1 3はマイ クロアレイ、 1 4は対物レンズ、 1 5は励起光、 1 6はマイクロアレイを治具に 突き当てるためのバネを示す。） したがって、 本発明の担体には、 特に凹凸部と平 坦部が設けられていることが好ましい。 具体例を図 2、 図 3に示す。 1 1が平坦 部であり、 かつ、 1 2で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質 （例えば核 酸） が固定化されている。 さらに、 凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さ の差が 5 0 μ m以下であることが好ましい。 このようにしておけば、 選択結合性 物質が固定化された担体をスキャンする場合は、 いったん平坦部の上面で励起光 の焦点を合わせたり、 平坦部を治具に突き当てることが可能である。 すなわち、 スキャナーの焦点合わせが容易になる。 このようにして、 平坦部で励起光の焦点 を合わせるので、 選択結合性物質が固定化された凸部の上面は、 平坦であり、 か つ、 凸部上面の高さと平坦部の高さの差が 5 0 μ m以下であることが好ましい。 凸部の上面の高さと平坦部の高さの差が 5 0 /z inより大きいと、 以下のような 問題点が生じることがある。 すなわち、 励起光の焦点は平坦部の上面で調整され ているので、 凸部の上面の高さが異なると、 凸部上面での威起光の焦点がぼやけ てしまい、 最悪の場合、 選択結合性物質と検体が反応したことによる蛍光が全く 検出されないことが起こり うる。 同様なことは、 凸部上面と高さが同じ平坦部が 設けられていない場合でも起こり うる。
また、 凸部の上面が平坦でない場合、 凸部上面での励起光の焦点の大きさにば らつきが起き、 結果的に 1つの凸部上面内で検出された蛍光の強さにむらが発生 する。 こうなると、 後の解析が困難となる。 本願の場合は、 上記のような問題は 起きず、 良好なシグナル （蛍光） を得ることが可能である。
なお、 凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差は、 5 0 m以下であればよい が、 3 0 μ m以下であることがより好ましく、 凸部の上面の高さと平坦部分の高 さが同一であればなお好ましい。 なお、 本願でいう同一の高さとは、 生産等で発 生するばらつきによる誤差も含むものとする。
また本発明では、 平面状の担体に選択結合性物質を点着するのではなく、 凹凸 部分の凸部上面にのみ選択結合性物質を固定化している。 したがって、 凸部上面 以外の部分に非特異的に検体試料が吸着しても、 凸部上面以外の部分では、 励起 光の焦点がぼやけてるため、 望まざる非特異的な吸着をした検体試料からの蛍光 を検出することがない。 このため、 ノイズが小さくなり、 結果的に S Z Nが良く なるという効果を発揮する。
このような形状の担体を作製するためには、 射出成型法を用いることが生産性 を鑑みると好ましい。 上記のような形状の担体を射出成型法により作製するため には、 型が必要となが、 この型の作製方法としては、 LIGA (Lithographie Galvan oformung Abformung)プロセスで型を作製すれば、成形後の担体の離型が容易な型 が作製可能であるので好ましい。
また、 凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。 このようにすること により、 多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、 後の解析に有利である。 ここで、 凸部の上部の面積が略同一とは、 凸部の中で最 も大きい上面面積を、 最も小さい上面面積で割った値が 1 . 2以下であることを 言う。
凸部の上面の面積は、 特に限定される物ではないが、 選択結合性物質の量を少 なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、 m m 2以下、 1 0 Z m 2以上が好ましい。
凹凸部における凸部の高さとしては、 0 . 0 1 m m以上、 1 m m以下が好まし い。 凸部の高さがこれより低いと、 スポット以外の部分の非特異的に吸着した検 体試料を検出してしまうことがあり、 結果的に S / Nが悪くなることがある。 ま た、 凸部の高さが 1 m m以上であると、 凸部が折れて破損しやすいなどの問題が 生じる場合がある。
また、 少なくとも ώ部の側面に導電性材料が設けられていることが好ましレ、。 こうすると、 例えば、 対抗電極を設け、 対抗電極とこの導電性材料の間に電琉、 電圧を印加することにより核酸の場合であるとハイブリダイゼーションの高速化 が可能となる。 導電性材料がコートされる好ましい領域としては、 凹部の全 § 、 凸部の側面全部である。 その例を図 5に示す。 （図 5中の 2 1は凸部上面、 2 2は 導電性膜、 2 3は絶縁膜を示す。） 印加する電圧の範囲としては、 電流が流れる場 合は、 0 . 0 1 V以上、 2 V以下め範囲が好ましい。 特に好ましい範囲は、 Ο . I V以上、 1 . 5 V以下である。 これより、 大きい電圧を印加すると水が電気分 解をおこし、 表面の選択結合性物質に悪影響を及ぼす場合がある。 導電性材料の 材質としては特に限定されないが、 炭素、 マグネシウム、 アルミ、 シリコン、 チ タン、 バナジウム、 クロム、 マンガン、 鉄、 コパ^/ト、 ニッケル、 |¾、 錫、 ジノレ コニゥム、 ニオブ、 モリプデン、 パラジウム、 銀、 ハフニウム、 タンタル、 タン ダステン、 白金、 金、 ステンレスやこれらの混合物や導電性ポリマーが挙げられ る。 この中でも、 白金、 金、 チタンが特に好ましく用いられる。 これらの導電性 材料の膜の作製方法としては、 蒸着、 スパッタ、 C V D、 メツキなどが挙げられ る。
上記のように凸部に導電性材料をコートした場合は、 凸部の上面以外はさらに 絶縁材料の層を設けることが好ましい。 絶縁材料の層があると、 電流を流した場 合凸部の上面にのみ被検体を引き寄せることが可能である。 絶縁材料の材料とし ては、 金属の酸化物 （例えば、 A 1—0、 S i 02、 T i 02、 VO、 S n 0、 C r _0、 Z n— 0、 G e 02、 T a 2Os、 Z r〇2、 N b— 0、 Y203など）、 窒化物 （A 1一 N、 S i 3N4、 T i N、 T a— N、 G e— N、 Z r— N、 Nb NTなど）、 硫化 物 （Z n S、 P b S、 S n S、 C u S)、 絶縁性のポリマーが挙げられる。
上述の方法により得られた選択結合性物質固定化担体は、 選択結合性物質を固 定した後、 適当な処理をすることができる。 例えば、 熱処理、 アルカリ処理、 界 面活性剤処理などを行うことにより、 固定された選択結合性物質を変性させるこ ともできる。
また、 選択結合性物質固定化担体は、 蛍光標識化された検体と担体に固定化さ れた選択結合性物質とをハイプリダイゼーション反応させ、 スキャナーと呼ばれ る装置で蛍光を読みとることが一般的である。 スキャナ一は励起光であるレーザ 一光を対物レンズで絞り込み、 レーザー光を集光する。 しかし、 担体表面から自 家蛍光が生じる場合、 その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがあ る。 これを防ぐため一般式 （1) の構造単位を有するポリマーに黒色を呈し、 ま たレーザー照射により発光を生じない物質を含有させて表面を黒色にすることに より、 担体自身からの自家蛍光を低減させることができるので好ましい。 このよ うな担体を用いることにより、 検出の際、 担体からの自家蛍光を低減できるので よりノイズが小さく、 結果的に SZN比が良好な選択結合性物質物質が固定化さ れた担体を提供することができる。
ここで、 担体が黒色とは、 可視光 （波長が 400 nmから 800 nm) 範囲に おいて、 担体の黒色部分の分光反射率が特定のスぺク トルパターン （特定のピー クなど） を持たず、一様に低い値であり、 かつ、担体の黒色部分の分光透過率も、 特定のスぺク トルパターンを持たず、 一様に低い値であることをいう。
この分光反射率、 分光透過率の値としては、 可視光 （波長が 40 0 nmから 8 00 nm) の範囲の分光反射率が 7 %以下であり、 同波長範囲での分光透過率が 2 %以下であることが好ましい。 なお、 ここでいう分光反射率は、 J I S Z 8 7 2 2 条件 Cに適合した、 照明 '受光光学系で、 担体からの正反射光を取り 込んだ場合の分光反射率をいう。
黒色にする手段としては、 担体に黒色物質を含有させることにより達成しうる が、 この黒色物質の好ましいものを挙げると、カーボンブラック、 グラフアイト、 チタンブラック、 ァニリンブラック、 R u、 M n、 N i、 C r、 F e、 C oおよ ぴ C uの酸化物、 S i、 T i、 T a、 Z rおよび C r の炭化物などの黒色物質 使用できる。
これらの黒色物質は単独で含有させる他、 2種類以上を混合して含有させるこ ともできる。 この中の黒色物質の中でも、 カーポンプラック、 グラフアイ ト、 チ タンブラックを好ましく含有させることができ、 ポリマーに一様に分散しやすい ことから特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。
また、 担体の形状としてガラス、 金属などの熱変形をし難い材料からなる支挣 体層の上に、 一般式 （1 ) で表される構造単位を少なくとも 1つ有するポリマー からなる選択結合性物質固定化層を設けると、 熱や外力による担体の形状変化を 防げることから好ましい。 その他支持体層としては、 ポリカーボネート、 ポリイ ミ ド、 ポリアミ ドなどの比較的高温に耐えられる樹脂などを用いても良い。 この 概念図を図 6に示す。 （ 2は選択結合性物質 （D N A )、 3は支持体層 （ガラス）、 4は選択結合性物質固定化層（P MM A ) を示す。）支持体層としては、ガラスや、 鉄、 クロム、 ニッケル、 チタン、 ステンレスなどの金属が好ましい。 また、 この 支持体層と選択結合性物質固定化層との密着性を良くするため、 支持体層の表面 を、 アルゴン、 酸素、 窒素ガスでのプラズマ処理ゃシランカップリング剤での処 理を施すことが好ましい。 このようなシラン力ップリング剤としては 3—ァミノ プロピルトリエトキシシラン、 3—ァミノプロピルトリメ トキシシラン、 3—ァ ミノプロピルジェ トキシメチルシラン、 3—（ 2—ァミノェチノレアミノプロピル） トリメ トキシシラン、 3一 ( 2—ァミノェチルァミノプロピル） ジメ トキシメチ /レシラン、 3—メルカプトプロピルトリメ トキシシラン、 ジメ トキシー 3—メノレ カプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。 支持体層の上に選択結合性物質 固定化層を設ける手段としては、 ポリマーを有機溶媒に溶解し、 スピンコートや デイツビングなどの公知の手段を用いることができる。 より簡単には、 支持体層 に接着剤で貼り付けることもできる。
ここで、 「選択結合性物質」 とは、 被検物質と直接的又は間接的に、 選択的に結 合し得る物質を意味し、 代表的な例として、 核酸、 タンパク質、 糖類及び他の抗 原性化合物を挙げることができる。核酸は、 D N Aや R N Aでも P N Aでもよい。 特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、 該塩基配列又はその一部と相補的な塩基 配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイプリダイズして結合するので、 本発明で いう 「選択結合性物質」 に該当する。 また、 タンパク質としては、 抗体及び Fabフ ラグメントゃ F (ab' ) 2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々 の抗原を挙げることができる。 抗体やその抗原結合性断片は、 対応する抗原と選 択的に結合し、 抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、 「選択結合性物質」 に該当する。 糖類としては、 多糖類が好ましく、 種々の抗原を挙げることができ る。 また、 タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもでき る。 本発明に用いる選択結合性物質は、 市販のものでもよく、 また、 生細胞など から得られたものでもよい。 「選択結合性物質」 として、 特に好ましいものは、 核 酸である。 この核酸の中でも、 オリゴ核酸と呼ばれる、 長さが 1 0塩基から 1 0 0塩基までの核酸は、 合成機で容易に人工的に合成が可能であり、 また、 核酸末 端のアミノ基修飾が容易であるため、 担体表面への固定化が容易となることから 好ましい。 さらに、 2 0塩基未満ではハイプリダイゼーシヨンの安定性が低いと いう観点から 2 0〜 1 0 0塩基がより好ましい。 ハイブリダイゼーションの安定 性を保持するため、 特に好ましくは 4 0〜 1 0 0塩基の範囲である。
本発明の担体を用いた測定方法に供せられる被検物質としては、 測定すべき核 酸、 例えば、 病原菌や'ウィルス等の遺伝子や、 遺伝病の原因遺伝子等並びにその 一部分、 抗原性を有する各種生体成分、 病原菌やウィルス等に対する抗体等を挙 げることができるが、 これらに限定されるものではない。 また、 これらの被検物 質を含む検体としては、 血液、 血清、 血漿、 尿、 便、 髄液、 唾液、 各種組織液等 の体液や、 各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに 限定されるものではない。 また、 被検物質となる核酸は、 血液や細胞から常法に より抽出した核酸を標識してもよいし、 該核酸を铸型として、 P C R等の核酸增 幅法によって増幅したものであってもよい。 後者の場合には、 測定感度を大幅に 向上させることが可能である。 核酸増幅産物を被検物質とする場合には、 蛍光物 質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、 増幅核 酸を標識することが可能である。 また、 被検物質が抗原又は抗体の場合には、 被 検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、 被検物質である抗 原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、 担体を洗浄し、 該抗原又は抗体と 抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、 担体に結合した標識を測定 することもできる。
固定化物質と被検物質を相互作用させる工程は、 従来と全く同様に行うことが できる。 反応温度及ぴ時間は、 ハイプリダイズさせる核酸の鎖長や、 免疫反応に 関与する抗原及び Z又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、 核酸のハイプ リダィゼーシヨンの場合、 通常、 5 0°C~ 7 0°C程度で 1分間〜十数時間、 免疫 反応の場合には、 通常、 室温〜 4 0°C程度で 1分間〜数時間程度である。 実施例
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。 もっとも、 本発明は下記 実施例に限定されるものではない。
参考例 1
透明なポリメチルメタクリレート （PMMA) 板 （（株） クラレ製； コモグラス 押し出し板、 厚さ l mm、 平均分子量 1 5万、 すなわち数平均重合度 1 5 0 0 ) を エタノールと純水で十分に洗浄した後、 1 0 Nの水酸化ナトリゥム水溶液に 7 0 °Cで 1 2時間浸漬した。 次いで、 純水、 0. I N HC 1水溶液、 純水の順で洗 浄した。 このアルカリ処理を施した板と、 アルカリ処理を施していない板とを試 料とし、 フッ素を含むラベル化試薬 （トリフルォロエタノール） を用いて気相状 態で試料表面のカルボキシル基をラベル化した。 そして、 単色化された A 1 K a 1 , 2線 （1 4 8 6. 6 e V) を用い、 X線径 1 mm、 光電子脱出角 9 0° の 条件にて、 X P S測定を行い、 C I s、 F 1 sピーク面積強度に反応率を考慮し てカルボキシル基を推定した。 その結果、 カルボキシル基量は、 アルカリ未処理 の試料の場合 0. 0 0 1 3 (全炭素量中のカルボキシル基炭素の割合）、 アルカリ 処理を行った試料の場合 0. 001 5であり、 表面のカルボキシル基量が多くな つていることが認められた。
また、 上記 2つのトリフルォロエタノールによって表面のカルボキシル基をラ ベル化した試料表面のフッ素量と分布を TOF—S I MS (飛行時間型 2次ィォ ン質量分析） によって測定したところ、 以下の結果が得られた。 すなわち 2つの 試料で比較すると、 水酸化ナトリゥム処理品では未処理品よりも19 F—や69 CF3 一が強く、水酸化ナトリゥム処理品では未処理品よりもカルボキシル基が多いこと が認められた。 具体的には、 未処理品では、 F—に相当する質量数 1 9のイオンの カウント数は 8000であったが、 水酸化ナトリゥム処理品では 25000であ つた。 また、 C F 3 に対応する質量数 6 9のイオンのカウント数は、 未処理品で は 1 200であったが、 水酸化ナトリウム処理品では、 7000であった。 さら に、 T OF— S I MSにより両試料表面のフッ素の分布を 2次元的に測定したと ころ、 水酸化ナトリゥム処理品では19 F—のイオン像に局在した分布がみられた
(30 /iir！〜 40 μηιφの円开や、 30 μπ！〜 40 μ πιφ畐の筋状にイオン強度の 弱い領域がみられた）。 上の結果から、 アルカリ処理を行ったサンプルでは、 表面 のカルボキシル基が局在した分布を持っていることが推察される。 一方、 未処理 品においては、 19F—のイオン像に特に局在した分布は認められなかった。 一方、 メ トキシ基によるものと思われる31 CH 3 O—のイオン像には 2つの試料ともに局 在した分布は特に認められなかった。
実施例 1
(DN A固定化担体の作製）
透明なポリメチルメタクリレート （PMMA) 板 （（株） クラレ製； コモグラス 押し出し板、 厚さ lmm、 平均分子量 1 5万、 すなわち数平均重合度 1 500) を 1 ONの水酸化ナトリゥム水溶液に 65°Cで 1 2時間浸漬した。 次いで、 純水、 0. 1 N HC 1水溶液、 純水の順で洗浄した。 このようにして、 板表面の PM MAの側鎖を加水分解して、 カルボキシル基を生成した。 なお、 Ax o n I n s t r u m e n t s社の G e n e P i x 4000 Bを用いて、 励起波長 5 32 ii m、 フォ トマノレチプライヤーのゲイン設定を 700、 レーザーパワーを 3 3%の 条件で測定したとき、 この板 （アルカリ処理無し） の自家蛍光強度は 6 5 0であ つた 0
(プローブ DNAの固定化）
配列番号 1 (70塩基、 5 ' 末端アミノ化）、 配列番号 2 (60塩基、 5 ' 末端 ァミノ化）、 配列番号 3 (40塩基、 5 ' 末端アミノ化）、 配列番号 4 (20塩基、 5 ' 末端アミノ化） の DNAを合成した。 これら配列番号 1から 4の DN Aは 5 ' 末端がァミノ化されている。
これらの DNAを、 純水に 0. 2 7 ηπι ο ΐ Ζμ 1の濃度で溶かして、 ストツ クソリユーションとした。 基板に点着する際は、 P B S (N a C lを 8 g、 N a 2 ΗΡ04 · 1 2Η20を 2. 9 §、 1：( 1を0. 2 g、 KH2P04を 0. 2 g純水 に溶かし 1 1にメスアップしたものに p H調整用の塩酸を加えたもの、 p H 5. 5)でプロープの終濃度を 0. 0 27 nmo l / z l とし、 かつ、 担体表面のカル ポキシル基とプローブ DNAの末端のァミノ基とを縮合させるため、 1一ェチル - 3 - ( 3—ジメチルァミノプロピル) カルポジイミ ド（E DC)を加え、 この終 濃度を 50 m g /m 1 とした。 そして、 これらの混合溶液をおよそ 200 n 1取 り出して、 これを基板に点着した。 すなわち、 4種類のプローブを PMMA基板 の上にそれぞれ 1箇所点着した。 次いで、 基板を密閉したプラスチック容器入れ て、 3 7°C、 湿度 1 00 %の条件で 20時間程度インキュベートして、 純水で洗 浄した。 この反応スキームを図 1に示す。
(検体 DNAの調整）
検体 DNAとして、 上記 DN A固定化基板とハイプリダイズ可能な塩基配列を 持つ配列番号 8の DNA ( 968塩基） を用いた。 調整方法を以下に示す。
配列番号 5と配列番号 6の DNAを合成した。 これを純水にとかして濃度を 1 00 μΜとした。 次いで、 pKF 3 プラスミ ド DNA (タカラバイオ （株） 製品 番号； 3 1 00) (配列番号 7 ： 2264塩基） を用意して、 これをテンプレート とし、 配列番号 5および配列番号 6の DNAをプライマーとして、 P CR反応 （P olymerase Chain Reaction) により増幅を行った。
P C Rの条件は以下の通りである。 すなわち、 ExTaq 2 μ 1、 lOXExBuffer 40 /z 1、 dNTP Mix 32 /z 1 (以上はタカラバイオ （株） 製 製品番号 RR0 0 1 Aに付属）、 配列番号 5の溶液を 2 /X 1、 配列番号 6の溶液を 2 μ 1、 テン プレート （配列番号 7 ) を 0 . 2 1を加え、 純水により トータル 4 0 0 /i 1に メスアップした。 これらの混合液を、 4つのマイクロチューブに分け、 サーマル サイクラ一を用いて P C R反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、 4 0 / 1の純水に溶解した。 P C R反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認し たところ、 増幅した D NAの塩基長は、 およそ 9 6 0塩基であり配列番号 8 ( 9 6 8塩基） が増幅されていることを確認した。
次いで、 9塩基のランダムプライマー (タカラバィ才 (株） 製；製品番号 3 8 0 2 ) を 6 m g /m 1の濃度に溶かし、 上記の P C R反応後精製した D N A溶液 にに 2 /z l加えた。 この溶液を 1 0 0 °Cに加熱した後、 氷上で急冷した。 これら に K 1 e n o w F r a g m e n t (タカラバイオ （株） 製；製品番号 2 1 4 0 AK) 付属のバッファーを 5 1、 d NT P混合物 （dATP、 dTTP、 dGTPの濃度は それぞれ 2. 5 mM、 dCTPの濃度は 4 0 0 μ M) を 2 . 5 μ ΐ力 13えた。 さらに、 C y 3 - d C T P (アマシャムフアルマシアバイオテク製；製品番号 P A 5 3 0 2 1 ) を 2 μ 1加えた。 この溶液に 1 0 Uの K l e n o w F r a g m e n tを 加え、 3 7 °Cで 2 0時間インキュベートし、 C y 3で標識された検体 D N Aを得 た。 なお、 標識の際ランダムプライマーを用いたので検体 D N Aの長さには、 ば らつきがある。 最も長い検体 D NAは配列番号 8 ( 9 6 8塩基） となる。 なお、 検体 D NAの溶液を取り出して、 電気泳動で確認したところ、 9 6 0塩基に相当 する付近にもっとも強いパンドが現れ、 それより短い塩基長に対応する領域に薄 くスメァがかかった状態であった。。 そして、 これをエタノール沈殿により精製 し、 乾燥した。
この標識化された検体 D N Aを、 1重量体積％B S A (ゥシ血清アルブミン）、 5 X S S C ( 5 X S S Cとは N a C 1を 4 3 . 8 g、 クェン酸 3ナトリウム水和 物 2 2. 1 gを純水にと力 し、 1 1にメスアップしたもの。 また N a C l を 4 3. 8 g、 クェン酸 3ナトリウム水和物 2 2. l gを純水にとかし、 5 1にメスアツ プしたものを 1 X S S Cと表記し、 これの 1 0倍濃縮液を 1 0 X S S C、 5倍希 釈液を 0. 2 X S S Cと表記する。）、 0. 1重量体積％S D S (ドデシル硫酸ナ トリウム）、 0. 0 1重量体積％サケ精子 D NAの溶液 （各濃度はいずれも終濃 度）、 4 0 0 1に溶解し、 ハイプリダイゼーシヨン用の溶液とした。 (ハイプリダイゼーション）
上記で得られたプローブ D N Aを固定化した基板に上記検体 D N Aをハイプリ ダイゼーションさせた。 具体的には、 先に用意したプローブ核酸が固定化されて いる担体にハイブリダィゼーシヨン用の溶液を 1 0 μ 1滴下し、 その上に力パー ガラスをかぶせた。 また、 力パーガラスの周りをペーパーポンドでシールし、 ハ ィプリダイゼーシヨンの溶液が乾燥しないようにした。 これを、 プラスチック容 器の中に入れ、 6 5 °C、 湿度 1 0 0 %の条件で 1 0時間インキュベートした。 ィ ンキュベート後、 カバーガラスを剥離後に洗浄、 乾燥した。
(測定）
ハイプリダイゼーションの有無を検出するために、 ハイブリダイゼーション後 の基板上の蛍光を蛍光顕微鏡 (ォリンパス光学) により観察した。 全てのプロ一 プ部分でハイプリダイゼーションを示す蛍光発光が観察された。 また塩基数が 4 0、 6 0、 7 0と増加するにつれてスポット上の蛍光とバックグラウンドの差が 大きくなつた。 すなわち、 プローブの塩基数が長くなるに従い、 S / N比が向上 した。
次いで、 定量的な議論を行うために、 D N Aチップ用のスキャナー （Axon Ins truments社の GenePix 4000B) に上記処理後の担体をセットし、 レーザー出力 3 3 %、 フォトマルチプライヤーのゲインを 5 0 0にした状態で測定を行った。 その 結果を表 1に示す。 ここで、蛍光強度とはスポッ ト内の蛍光強度の平均値であり、 ノイズとはスポッ ト周り （D N Aが点着されていない部分） の蛍光強度の平均値 とした。
比較例 1
実施例 1のような基板が P MM Aではなく、 ガラスの場合の実験を行った。 スライ ドガラスを 1 O N N a O H水溶液に 1時間浸漬したあと、 純水で十分 に洗浄した。 ついで、 A P S ( 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン；信越化 学工業 （株） 製） を 2重量体積％の割合で純水に溶解した後、 上記のスライ ドガ ラスを 1時間浸漬し、この溶液から取り出した後に 1 1 0 °Cで 1 0分間乾燥した。 このようにして、 ガラスの表面にアミノ基を導入した。
ついで、 5 . 5 gの無水コハク酸を 1 一メチル一 2—ピロリ ドン 3 3 5 m 1に 溶解させた。 1 Mの 5 0 m 1のホウ酸ナトリウム （ホウ酸 3 . 0 9 gと ρ H調整 用の水酸化ナトリゥムを加えて、純水で 5 0 m 1にメスアップしたもの。 ρ H 8 . 0 ) に上記コハク酸溶液に加えた。 この混合液に上記のガラス基板を 2 0分間浸 漬した。 浸漬後、 純水で洗浄および乾燥した。 このようにして、 ガラス基板の表 面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、 ガラス表面にカルボキシル基を導入 した。 これを D N A固定化用基板として用いた。 さらに、 塩基配列 1から 4の D N Aを実施例 1と同様の手順で上記ガラス基板に固定化した。 この反応スキーム を図 7に示す（図 7中、 2は選択結合性物質（D N A)、 5はガラス基板を示す）。 そして、 実施例 1 と同様の手順でハイプリダイゼーシヨンを行った。 これを、 実 施例 1と同様の条件で蛍光顕微鏡にて観察した。
蛍光顕微鏡にて観察したところ、 ガラス基板においてもプローブ部分が 4 0塩 基以上の時に発光が観察された。 しかし基板が P MM Aの場合と比較して比較例 の 3つのガラス基板では蛍光強度は明らかに微弱であることが観察された。 さら に定量的な議論を行うためにこれらの基板における発光強度をスキャナ一により 測定した。 その結果を実施例 1 と併せて表 1に示す。 表 1の結果からガラス基板 では蛍光が微弱であり、かつノイズも大きく S Z N比が劣っていることがわかる。 また、 その他の市販のアミノ基が導入されたスライ ドガラスを用い、 上記と同 様なスキームで D N Aの固定化、 ハイブリダィゼーシヨンまで行った。 用いたス ライ ドガラスは、 D N Aマイクロアレイ用コートスライ ド硝子 高密度アミノ基導 入タイプ （松浪硝子工業 （株） 製；製品番号 S D 0 0 0 1 1 ) と MA Sコートス ライ ドガラス （松浪硝子工業 （株） 製；製品番号 S 0 8 1 1 1 0 ) を用いた。 同 様に測定した結果、 これらのスライ ドガラスを用いても、 基板を P MM Aとした 場合よりも S / N比が劣っていた。 その結果を表 1に示す。 表 1
プローブの塩基長
70塩基 60塩基
¾板觀 40塩基 20塩基 蛍光 ノィ 蛍光 蛍光 蛍光
ノイズ ノイズ ノイズ 強度 ズ 強度 強度 強度
実施例 1 PM A 23000 150 18400 155 12400 150 2500 145
APSガラス 3000 1600 1800 1540 1200 1620 1680 1330
MASガラス 7500 2000 6700 2100 2000 1890 1530 1680 比較例 1
高密度ァミノ
基導入タイプ 8500 2300 7200 2000 3500 1800 1850 1500 ガラス
比較例 2
(スライ ドガラスの調整）
比較例 1と同様に、 3—ァミノプロピルトリエトキシシランを用いてスライ ド ガラスの表面にアミノ基を導入した。 そして、 比較例 1と同様に無水コハク酸を 用いて、 スライ ドガラスの表面に、 カルボキシル基を導入したあと、 ァセトニト リルで洗浄し、 1時間減圧下で乾燥した。 乾燥後の、 末端にカルボキシル基が導 入されたガラス基板を、 EDC ( 9 55 m g ) および N—ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド （575 mg) のァセ トニ ト リル （50m l ) 溶液に 2時間浸し、 ァセ トニ トリルで洗浄し、 1時間減圧下に乾燥し、 N-ヒ ドロキシスクシンィミ ドがエステ ル結合にて表面に導入されているガラス基板を得た。
(DNAの固定化）
実施例 1と同様の 5 ' 末端がァミノされた DNAを用い、 0. 1M炭酸緩衝液 (p H 9. 3) に分散してなる水性液 （DNAの濃度は 0. 0 2 7 nm o l Z/i 1 ) 200 η 1を、 上記で得たガラス基板に点着した。 直ちに、 固定化後のガラ ス基板を 25°C、 湿度 90 %にて 1時間放置した後、 このガラス基板を 0. 1重 量体積％ SD Sと 2 X S S Cとの混合溶液で 2回、 0. 2 X S S C水溶液で 1回 順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のガラス基板を 0. 1 Mダリシン水溶液（p H 1 0 ) 中に 1時間 30分浸積した後、 蒸留水で洗浄し、 室温で乾燥させ、 DN A断片が固定されたガラス基板を得た。
(検出）
実施例 1のハイプリダイゼーション実験と同様の手順、 および検体 DN Aでハ イブリダィゼーシヨ ンを行った。 結果を表 2に示す。 実施例 1の基板が PMMA の場合と比較して S/N比は十分でないことがわかる。
Figure imgf000026_0001
プローブの塩基長
70塩基 60塩基 40塩基 20塩基 蛍光 蛍光 蛍光 蛍光
ノイズ ノイズ ノイズ ノイズ 強度 強度 強度 強度
比較例 2 4300 2000 3000 1500 1800 1220 1500 1200
実施例 2
( D N A固定化担体の作製）
平均分子量が 1 5万の PMMA中に 3重量。 /0の割合でカーポンプラックを混合 して、 キャスト法により、 厚さ 1 mmの黒色基板を作製した。 この黒色 PMMA 基板を 1 O Nの水酸化ナトリゥム水溶液に 6 5°Cで 1 2時間浸漬した。 これを、 純水、 0. 1：^の11 1水溶液、 純水の順で洗浄した。 なお、 Ax o n I n s t r ume n t s社の G e n e P i x 4000 Bを用いて、励起波長 532 nm、 フォトマルチプライヤーの設定ゲインを 700、 レーザーパワーを 33 %の条件 で測定したとき、 この板（アル力リ処理無し） の自家蛍光強度は 250であった。 実施例 1と同様のプローブ DNAを 4種類用い、 同様な操作手順で、 黒色化した D N A固定化担体を作製した。
別途同様な基板を作製して、 この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定し たところ、 分光反射率は、 可視光領域 （波長が 400 n mから 800 n m) のい ずれの波長でも 5 %以下であり、 また、 同範囲の波長で、 透過率は 0. 5%以下 であった。 分光反射率、 分光透過率とも、 可視光領域において特定のスペク トル パターン （ピークなど） はなく、 スペク トルは一様にフラットであった。 なお、 分光反射率は、 J I S Z 8722の条件 Cに適合した照明♦受光光学系を搭 載した装置 （ミノルタカメラ製、 CM— 2002) を用いて、 担体からの正反射 光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
(検体 D N Aの調整およびハイプリダイゼーション）
実施例 1 と同様の検体 DN A調整法およびハイプリダイゼーション法により行 つた。
(測定）
実施例 1 と同じ条件で、 スキャナ一により蛍光測定を行った。 表 3にスキャナ 一により観察した結果を示す。 実施例 1と同様に塩基数が増加するにつれ蛍光強 度が増加した。 また、 実施例 1の結果と比較してパックグラウンドが減少した。 このことより、 基板を黒色にするとノイズが低減し、 より、 SZN比の向上が確 認された。
プローブの塩基長
基板の種 70塩基 60塩基 40塩基 20塩基 蛍光 蛍光 蛍光 蛍光
ノイズ ノイズ ノイズ ノイズ 強度 強度 強度 強度 実施例 2 黒色 PMMA 25000 50 21000 45 11800 66 1500 52
実施例 3
3—ァミノプロピルトリエトキシシランが表面に導入されたスライ ドガラスを 比較例 1の手順で作製した。 これに、 クロ口ホルムに溶解した PMMAをスピン コートして、 1 00°Cで 1 5分間、 1 1 5 で 1時間保持して、 支持体層 （ガラ ス） /選択結合性物質固定化層 （PMMA) から成る担体を作製した。 なお、 ス ピンコートされた PMMAの厚さは、 およそ 20； ί mであった。
次いで、 この担体を 1 0 Nの N a OHに 1 0時間浸漬し、 PMMAの表面に力 ルポキシル基を生成した。 実施例 1 と同様に、 プローブ DNAの固定化、 検体 D NA調整、 ハイブリダィゼーシヨン、 蛍光強度の測定を行った。 そのところ、 実 施例 1と同様な結果が得られた。 なお、実施例 1では、若干基板が反っていたが、 本実施例の担体には、 反りが見られなかった。
また、 実施例 2で用いた、 カーポンプラックが分散した PMMAを同様にスピ ンコートしても、 実施例 2と同様な蛍光強度とノイズが得られ、 この場合も担体 の反りは見られなかった。
実施例 4
PMMA表面のカルボキシル基生成の際、 10 Nの N a OH水溶液を用いる代 わりに、 1 0 Nの硫酸を用いた以外は、 実施例 1 と同様の実験を行った。 その結 果、 実施例 1 と同様の結果が得られた。
実施例 5
スチレンと MMA (メタクリル酸メチル） との共重合体ポリマーを作製した。 作製したポリマー組成は、 MMAが 1 0 m o 1 %、 スチレンが 90 m o 1 %であ つた。 この共重合体の具体的な作製方法は、 MMAとスチレンとを 1 ： 9 (モル 比） の割合で脱水トルエンに溶解した後、 A I BN (ァゾビスイソプチルニトリ ル） を MMAとスチレンを合わせたモル数の 1 / 1 000の割合で加え、 窒素雰 囲気下で 60 °Cで 1時間、 6 5 °Cで 3時間、 90°Cで 20時間保持した。 そして、 エタノール沈殿、 濾過により精製した。
精製したポリマーの組成は NMR (nuclear magnetic resonance) にて確認し た。 また、 このポリマーの分子量を GP Cで測定して、 数平均重合度を算出した ところ、 1 1 00であった。 ついで、 精製したポリマーをキャス ト法にて、 厚さ 1 mm程度の板状とした。 固定化する DNAを配列番号 2のみとした以外は、 実施例 1 と同様な実験を行つ た。 そして、 実施例 1と同じ条件で、 スキャナ一により蛍光測定を行った。 その 結果、 蛍光強度は 5200、 ノィズは 1 50であり、 MM Aの含有量が 1 0 %で あっても、 比較例 1、 比較例 2と比ぺ、 SZN比が向上できた。 なお、 Ax o n I n s t r ume n t s社の G e n e P i x 4000 Bを用いて、 励起波長 5 32 nm、 フォトマルチプライヤーの設定ゲインを 700、 レーザーパワーを 3 3 %の条件でアル力リ処理を未実施の平板を測定したとき、 この板の自家蛍光強 度は 750であった。
比較例 3
ポリスチレンのホモポリマーを作製し、 これをキャス ト法にて厚さ 1 mm程度 の板状とした。 この板を用いて、 実施例 1と同様に実験を行ったが、 プローブ D NAと検体 DNAとのハイプリダイゼーションを示す蛍光は全く観察されなかつ た。
実施例 6
(DN A固定化担体の作製）
公知の方法である LIGA(Lithographie Galvanof ormung Abfo進 ng)プロセスを用 いて、 射出成形用の型を作製し、 射出成型法により後述するような形状を有する PMMA製の基板を得た。 なお、 この実施例で用いた PMMAの平均分子量は 1 5万であり、 PMMA中には 1重量％の割合で、 カーボンブラック （三菱化学製
# 3050 B) を含有させており、 基板は黒色である。 この黒色基板の分光反 射率と分光透過率を測定したところ、 分光反射率は、 可視光領域 （波長が 400 nmから 800 nm) のいずれの波長でも 5 %以下であり、 また、 同範囲の波長 で、 透過率は 0. 5%以下であった。 分光反射率、 分光透過率とも、 可視光領域 において特定のスペク トルパターン （ピークなど） はなく、 スペク トルは一様に フラットであった。 なお、 分光反射率は、 J I S Z 8 722の条件 Cに適合 した照明 ·受光光学系を搭載した装置 （ミノルタカメラ製、 CM— 200 2) を 用いて、 担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
基板の形状は、 大きさが縦 76 mm、 横 26 mm, 厚み 1 mmであり、 基板の 中央部分を除き表面は平坦であった。 基板の中央には、 直径 1 0 mm、 深さ 0. 2 mmの凹んだ部分が設けてあり、 この凹みの中に、 最上部の直径 0. 2 mm、 高さ 0. 2 mmの凸部を 6 4 ( 8 X 8 ) 箇所設けた。 なお、 凸部の最低部 （凸部 の根本） の直径は 0. 2 3 mmと、 ώ部にテーパーを付け、 射出成形後の基板の 離型が容易となるようにした。 凹凸部分の凸部上面の高さ （6 4箇所の凸部の高 さの平均値） と平坦部分との高さの差を測定したところ、 3 μ πι以下であった。 また、 6 4個の凸部上面の高さのばらつき （最も髙ぃ凸部上面の高さと最も低い 凸部上面との高さの差）、 さらには、 凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さ の差を測定したところそれぞれ 3 μ m以下であった。 さらに、 四凸部凸部のピッ チ （凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離） は 0. 6 mmであった。 上記の PMMA基板を 1 O Nの水酸化ナトリゥム水溶液に 6 5 °Cで 1 2時間浸 漬した。 これを、 純水、 0. 1 Nの HC 1永溶液、 純水の順で洗浄し、 基板表面 に力ルポキシル基を生成した。 なお、 A x o n I n s t r um e n t s社の G e n e P i x 4 0 0 0 Bを用いて、 本実施例で用いたカーボンブラック入りの P MMAの平板を、 励起波長 5 3 2 n m、 フォ トマルチプライヤーの設定ゲインを 7 0 0、 レーザーパワーを 3 3 %の条件で測定したとき、 この板の自家蛍光強度 は 2 5 0であった。
(プローブ DNAの固定化）
そして、 配列番号 2 ( 6 0塩基、 5 ' 末端アミノ化） の DN Aを合成した。 こ の DN Aは 5 ' 末端がァミノ化されている。 この DNAを、 純水に 0. 2 7 n m o I / \ の濃度で溶かして、 ス トックソリューションとした。 基板に点着する 際は、 P B S (ρ Η 5. 5 )でプロープの終濃度を 0. 0 2 7 n m o l // l とし、 かつ、 担体表面のカルボキシル基とプローブ DN Aの末端のァミノ基とを縮合さ せるため、 1 -ェチル一 3— （ 3—ジメチルァミノプロピル） 力ルポジィミ ド（E D C)を加え、 この終濃度を 5 O m g /m 1 とした。 そして、 これらの混合溶液を ガラス製のキヤピラリーに取り、 顕微鏡下でこのプローブ DNAを PMMA基板 の凸部上の 4箇所に点着した。 次いで、 この基板を密閉したプラスチック容器入 れて、 3 7°C、 湿度 1 0 0 %の条件で 2 0時間程度インキュベートして、 その後 純水で洗浄した。 (検体 DNAの調整）
実施例 1 と同様に行った。
(ハイブリダイゼーショ ン）
前述の （検体 DN Aの調整） で調整した DN A溶液を 1 0 /z 1取りだし、 これ に 30 1の、 1重量体積0 /oB SA、 5 X S S C、 0. 1重量体積0 /。 S D S、 0. 01重量体積％サケ精子 DNAの溶液を加え、 トータルで 40 1 とした （すな わち、 実施例 1や 2と比較すると、 検体の濃度は 1 /4であるが、 トータルの検 体量は実施例 1と同じとなる）。そして、 これを前述した DN Aが固定化された担 体の凹凸部分に滴下して、 注意深くカバーガラスをかぶせた。 そして、 カバーガ ラスの周りをぺーパボンドでシーリングして、 ハイプリダイゼーション溶液が乾 かないようにした。 すなわち、 検体 DN Aの分子量を実施例 1や比較例 1 と同じ にした。 これをプラスチック容器に入れて、 湿度 1 00%、 温度 65°Cの状態で 1 0時間インキュベートした。 インキュベート後、 力パーガラスを剥離して、 洗 浄 ·乾燥した。
(測定）
実施例 1 と同じ条件にて、 スキャナ一により蛍光測定を行った。 その結果を表 4に示す。
表 4 スポット 1 スポット 2 スポット 3 スポッ卜 4 蛍光 蛍光 蛍光 蛍光
ノイズ ノイズ ノイズ ノイズ 強度 強度 強度 強度 黒色凹凸
実施例 6 21500 27 20500 26 20200 28 20800 22
PMMA
これから、 蛍光強度については実施例 2とほぼ同一であるが、 ノイズについて は実施例 2よりもさらに低下した。
実施例 7
次いで、 凸部の高さがばらついた場合について実験を行った。 実施例 6で用い た P MMAの射出成形品の凸部をラッビングペーパーで削り、 凸部上面の高さに 差を設けた。 すなわち、 他の凸部上面 （基準となる凸部） よりも、 3 0 /Ζ Π1低い 凸部（4箇所） がある担体（担体ァ）、他の凸部上面よりも、 5 0 μ m低い凸部（4 箇所） がある担体 （担体ィ） をそれぞれ作製した。 なお、 これら担体の低い部分 以外の凸部 （基準となる凸部） 上面の髙さと、 平坦部分の高さの差は 3 /X m以下 であった。実施例 6と同様に、点着するプローブ D N Aの調整を行った。ついで、 基準となる凸部上面に 4箇所、 低い凸部上面に 4箇所にプローブ D N A溶液の点 着を実施例 6と同様に行った。 さらに、 ハイブリダィゼーシヨン用の D N Aの調 整、 ハイプリダイゼーシヨンの操作を実施例 6と同様に行い、 測定も実施例 6と 同様に行った。 基準となる凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズの平 均値、 高さが低い凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズの平均値を表 5に示す。
基準となる凸部の結果 高さの低い凸部の結果 担体の種類
蛍光強度 ノイズ 蛍光強度 ノイズ 担体ァ 21000 30 18500 26 実施例 7
担体ィ 20800 25 16800 29
このように、 凸部の高さにばらつき （5 0 ιη以下） があっても、 比較例と比 ベると十分に大きな SZNが得られていることがわかる。
実施例 8
さらに、 凸部上面と平坦部の差がある場合について検討した。 実施例 6で用い た PMMAの射出成形品の平坦部をラッビングペーパーで削り、 平坦部上面と凸 部上面の高さの差が 3 0 μ m (担体ゥ）、 5 0 μ τα (担体ェ） の 2種類の担体を作 製した。 すなわち、 担体ゥは凸部の高さが平坦部の高さより 3 0 m高いことに なる。 実施例 6と同様に、 点着するプローブ DNAの調整、 凸部上面へのプロ一 ブ DNA溶液の点着、 ハイプリダイゼーシヨン用 DNAの調整、 ハイブリダィゼ ーシヨンの操作を行い、 実施例 6と同様に測定を行った。 なお、 上面に DNA溶 液をスポットした凸部はそれぞれの基板について 4力所である。 そして、 DNA を点着したスポット （4力所） の蛍光強度と、 その周りのノイズ （4力所） の平 均値を求めた。 その結果を表 6に示す。
Figure imgf000037_0001
基材ゥ 基材ェ 蛍光強度 ノイズ 蛍光強度 ノイズ 実施例 8 19100 32 16500 30
. このように、平坦部上面と凸部上面との高さに差（50 μιη以下） があっても、 比較例と比較するれば十分に大きな S/Nが得られていることがわかる。
実施例 9
ポリメチルメタクリレート、 ポリェチルメタクリレート、 ポリフエニルメタク リレートの平板をキャスト法で作製し、 これを 1 0 Νの水酸化ナトリゥム水溶液 に 50°Cで 10時間浸漬した。 次いで、 純水、 0. I N HC 1水溶液、 純水の 順で洗浄した。 このようにして、 板表面のポリマーの側鎖を加水分解して、 カル ボキシル基を生成した。
プローブ DNAの固定化 （ただし固定化したプロープ DNAは 60塩基長のみ である）、 検体 DN Aの調整、 ハイブリダィゼーション、 測定を実施例 1と同様に 行った。 その結果を表 7に示す。
表 7
担体の種類 蛍光強度 ノイズ ポリメチルメタ
13100 175 クリレー卜
ポリェチルメタ
実施例 9 12000 190 クリレー卜
ポリフエニルメ
15000 350 タクリレー卜
このように、 比較例と比べると十分に大きな S/Nが得られていることがわか る。
実施例 1 0
(DN A固定化担体の作製）
実施例 6と同様の基板を作製した。 ついで、 この基板上にスパッタ法により N i - C r (組成は N i 8C r 2) を 50 nm作製した。 別途、 クロ口ホルム 1 0m L中に上記基板 （N i— C r膜は設けていない） を粉砕したものを 1 gの割合で 溶かした溶液を用意した。 そして、 これをスピンコート法により塗布して、 N i 一 C r膜上に黒色の P MM A膜からなる絶縁層を作製した。 ついで、 研磨機によ り、 凸部上面の絶縁層、 N i— C r膜を除去した後、 65°Cの 1 0 Nの N a OH 溶液に浸漬したあと、 純水、 0. 1 Nの HC 1水溶液、 純水の順で洗浄した。 そ して、プロープ DNAの固定化、検体 DNAの調整は、実施例 6と同様に行った。
(ハイプリダイゼーション)
力パーガラスにクロムを 5 nm、 金を 1 00 nm蒸着した。 これに金線をはん だで付けた。 一方、 先に用意した核酸が固定化されている担体の凹 ώ部分に、 ハ イブリダィゼーシヨン用の溶液を 50 μ 1加え、 力パーガラスの金の面が担体の 凹凸部分に向くようにして、 上記の力パーガラスをかぶせた。 この時、 担体の金 とカバーガラスの金が電気的にショートしないように、 髙さ 0. 2mmのスぺー サーを間に入れた。 カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、 ハイブリ ダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。
ついで、 担体の N i— C r膜と電源の陽極が電気的に導通するように、 金線お ょぴ市販の銀ペース トを用いて接続し、 力パーガラスの金 （金線） を電源の陰極 につないだ。 これを 65 °Cのオーブンに入れ 1 5分間インキュベートした。 そし て、 電源から 1 Vの電庄を 5分間印加した後、 オーブンから取りだし、 カバーガ ラスを剥離後に洗浄、 乾燥した。
その結果、 実施例 6と同様な結果が得られた。 このように、 ハイプリダイゼー シヨン時間が短く とも、 凸部の側面に電極を設けて電界を印可することによりハ ィプリダイゼーションの時間を短くできる。
比較例 4 ポリアクリロニトリルを主成分とする 1 mm厚の板 （三井化学 （株） 製 ゼク ロン） を 7 5 mm X 25 mmの大きさに切断した。 これを 1 0 Nの N a O Hに浸 漬し、 70¾で1 2時間放置した。 これを洗浄後、 実施例 1 と同様にプローブ D NAの固定化（プローブ DNAの塩基長は 60塩基）、検体 DNAとのハイブリダ ィゼーシヨンとを行った。 実施例 1と同様に測定した結果、 自家蛍光が大きく、 検体とプローブとのハイプリダイゼーションの有無を検出することが不可能であ つた。 これは、 板自体が黄色みを帯ぴているいるため、 自家蛍光が非常に大きい ためである。 なお、 Ax o n I n s t r ume n t s社の G e n e P i x 40 0 O Bを用いて、 励起波長 5 3 2 nm、 フォトマルチプライヤーの設定ゲインを 700、レーザーパワーを 3 3 %の条件でアル力リ処理前の平板を測定したとき、 この板の自家蛍光強度は 30000と非常に大きかった。
比較例 5
メチルメタクリ レート （MMA) 9 9重量部とメタクリル酸 1重量部とを共重 合した。 これを精製した後、 溶媒にとかし、 デイツビング法により PMMAから なる板の上に、 このポリマーからなる膜を作製した。 アルカリに浸漬することを 省いたこと以外は、実施例 1 と同様にこの膜上でのプローブ DN A ( 6 0塩基長） の固定化、 検体 DN Aとのハイブリダィゼーシヨンとを行い、 実施例 1 と同様に 測定を行った。 その結果、 シグナルは 6000、 ノイズは 300であった。
実施例 1 1
メチルメタクリレート （MMA) 9 9重量部とメタクリル酸 1重量部とを共重 合した。 これを精製した後、 溶媒にとかし、 デイツビング法により PMMAの板 の上に、 この共重合ポリマーからなる膜を作製した。 これを 50°Cで 1 0時間ァ ルカリに浸漬した以外は、 実施例 1と同様にこの膜上でのプローブ DN A (60 塩基長） の固定化、 検体 DN Aとのハイプリダイゼーシヨンとを行い、 実施例 1 と同様に測定を行った。 その結果、 シグナルは 1 5000、 ノイズは 1 50であ つた。 比較例 5より本実施例が優れている理由は、 アルカリ処理を行うことによ り、 担体表面のカルボキシル基量が増えたためであると推定される。 なお、 メチ ルメタタリ レート （MMA) 9 9重量部とメタクリル酸 1重量部とを共重合した ポリマーからなる 1 mm厚の板をキャスト法により作製し、 Ax o n I n s t r um e n t s社の G e n e P i x 4 0 0 0 Bを用いて、 励起波長 5 3 2 nm、 フォ トマルチプライヤーの設定ゲインを 7 0 0、 レーザーパワーを 3 3 %の条件 でアルカリ処理を未実施の平板を測定したとき、 この板の自家蛍光強度は 8 5 0 であった。
比較例 6
実施例 1のアル力リ処理（水酸化ナトリゥムに浸漬すること）を省いた以外は、 同様な実験を行った。 そのところ、 ハイプリダイゼーシヨンを示す蛍光は観察さ れなかった。 これは、 アルカリ処理品や酸での表面処理を行わないと、 カルボキ シル基が十分に生成されず、 結果的に固定化されるプローブ D N Aが非常に少な いことが原因であると考えられる。 産業上の利用可能性
本発明により、 非特異的な検体の吸着が少なく、 かつ、 ハイプリダイゼーショ ン効率が良好であり、 結果的に S/N比が良好な選択結合物質が固定化された担 体を提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 選択結合性物質が固定化された担体であって、 該担体の表面が低自家蛍 光榭脂から成り、 アルカリもしくは酸でこのポリマーの表面を処理してカルポキ シル基を生成し、 そして選択結合性物質を固定化したことを特徴とする選択結合 性物質固定化担体。
2 . 担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体で あって、 担体表面が、 下記一般式 （1 ) で表される構造単位を含有しているポリ マーを有し、 アル力リもしくは酸でこのポリマーの表面を処理してから選択結合 性物質を固定化したことを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
Figure imgf000043_0001
(一般式 （1 ) の I 1、 R 2、 R 3は、 アルキル基、 ァリール基もしくは水素原子を 表す。）
3 . 担体表面のポリマーをアルカリもしくは酸にて処理して、 一般式 （1 ) からなる構造単位の側鎖をカルボキシル基とし、 このカルボキシル基と選択結合 性物質の官能基とを結合することにより選択結合性物質が固定化されていること を特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項記載の選択結合性物質固定化担体。
4 . 担体表面のポリマーが一般式 （ 1 ) の構造単位を全モノマー単位の 1 0 %以上含有していることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項に記載の選 択結合性物質固定化担体。
5 . 選択結合性物質のアミノ基もしくは水酸基と、 担体表面のカルボキシル 基との共有結合より、 担体に選択結合性物質が固定化されていることを特徴とす る請求の範囲第 1項または第 2項に記載の選択結合性物質固定化担体。
6 . 選択結合性物質が核酸である請求の範囲第 1項または第 2項に記載の選 択結合性物質固定化担体。
7 . 一般式 （1 ) の構造単位を有するポリマーがポリメチルメタクリレート であることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項に記載の選択結合性物質 固定化担体。
8 . 担体表面が黒色であることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項 に記載の選択結合性物質固定化担体。
9 . 一般式 （1 ) で表される構造単位を有するポリマーが、 カーボンブラッ クを含有していることを特徴とする請求の範囲第 8項に記載の選択結合性物質固 定化担体。
1 0 . 担体が少なく とも支持体層と選択結合性物質固定化層を有しており、 選択結合性物質固定化層表面が上記一般式 （1 ) で表される構造単位を有するポ リマーを有し、 かつ選択結合性物質は、 選択結合性物質固定化層の表面と結合し ていることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項に記載の選択結合性物質 固定化担体。
1 1 . 支持体層がガラスまたは金属であることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の選択結合性物質固定化担体。
1 2 . 選択結合性物質が固定化された担体であって、 該祖体には凹凸部が設 けられており、 選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部の上面に固定化されている ことを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項に記載の選択結合性物質固定化 担体。
1 3 . 該凹凸部の凸部上面が実質的に平坦であり、 選択結合性物質が固定化 された凸部上面の高さが、 略同一である請求の範囲第 1 2項に記載に記載の選択 結合性物質固定化担体。
1 4 . 該担体には平坦部が設けられていることを特徴とする請求の範囲第 1 2項に記載の選択結合性物質固定化担体。
1 5 . 選択性結合物質が固定化された複数の凸部の内、 最も髙ぃ凸部の高さ と、 最も低い凸部の高さの差が 5 0 μ m以下であることを特徴とする請求の範囲 第 1 2項に記載の選択結合性物質固定化担体。
訂正された用紙 （規則 91)
1 6 . 凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が 5 0 μ m以下であ ることを特徴とする請求の範囲第 1 4項に記載の選択結合性物質固定化担体。
1 7 . 担体表面が黒色であることを特徴とする請求の範囲第 1 2項に記載の 選択結合性物質固定化担体。
1 8 . —般式 （1 ) で表される構造単位を有するポリマーが、 カーポンプラ ックを含有していることを特徴とする請求の範囲第 1 7項に記載の選択結合性物 質固定化担体。
1 9 . 凸部の側面に導電性材料が設けられている請求の範囲第 1 2項に記載 の選択結合性物質固定化担体。
PCT/JP2004/007060 2003-05-19 2004-05-18 選択結合性物質固定化担体 WO2004102194A1 (ja)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2525938A CA2525938C (en) 2003-05-19 2004-05-18 Low-autofluorescence resin support for immobilizing a selective binding substance
US10/557,070 US7795006B2 (en) 2003-05-19 2004-05-18 Support having selectively bonding substance fixed thereto
EP04733682.1A EP1626276B1 (en) 2003-05-19 2004-05-18 Support having selectively bonding substance fixed thereto
PL04733682T PL1626276T3 (pl) 2003-05-19 2004-05-18 Podłoże obejmujące przyłączoną do niego selektywną substancję wiążącą
CN2004800056001A CN1839317B (zh) 2003-05-19 2004-05-18 选择结合性物质固定化载体
KR1020057021996A KR101126845B1 (ko) 2003-05-19 2004-05-18 선택 결합성 물질 고정화 담체
ES04733682T ES2727785T3 (es) 2003-05-19 2004-05-18 Soporte que tiene una sustancia de unión selectiva fijada al mismo
JP2005506292A JP4380631B2 (ja) 2003-05-19 2004-05-18 選択結合性物質固定化担体
DK04733682.1T DK1626276T3 (da) 2003-05-19 2004-05-18 Bærer med selektivt bindende substans fikseret derpå
US12/845,417 US9358518B2 (en) 2003-05-19 2010-07-28 Support carrying an immobilized selective binding substance
US12/845,433 US9333478B2 (en) 2003-05-19 2010-07-28 Support carrying an immobilized selective binding substance

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003140016 2003-05-19
JP2003-140016 2003-05-19
JP2003417661 2003-12-16
JP2003-417661 2003-12-16

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10557070 A-371-Of-International 2004-05-18
US12/845,417 Division US9358518B2 (en) 2003-05-19 2010-07-28 Support carrying an immobilized selective binding substance
US12/845,433 Division US9333478B2 (en) 2003-05-19 2010-07-28 Support carrying an immobilized selective binding substance

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004102194A1 WO2004102194A1 (ja) 2004-11-25
WO2004102194A9 true WO2004102194A9 (ja) 2005-05-26

Family

ID=33455500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/007060 WO2004102194A1 (ja) 2003-05-19 2004-05-18 選択結合性物質固定化担体

Country Status (10)

Country Link
US (3) US7795006B2 (ja)
EP (1) EP1626276B1 (ja)
JP (1) JP4380631B2 (ja)
KR (1) KR101126845B1 (ja)
CN (1) CN1839317B (ja)
CA (1) CA2525938C (ja)
DK (1) DK1626276T3 (ja)
ES (1) ES2727785T3 (ja)
PL (1) PL1626276T3 (ja)
WO (1) WO2004102194A1 (ja)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4380631B2 (ja) * 2003-05-19 2009-12-09 東レ株式会社 選択結合性物質固定化担体
JP4505581B2 (ja) * 2005-05-17 2010-07-21 独立行政法人理化学研究所 物質固定化方法
JP4967261B2 (ja) * 2005-06-24 2012-07-04 パナソニック株式会社 プローブ担体
JP4706396B2 (ja) * 2005-08-30 2011-06-22 パナソニック株式会社 検体反応装置
JPWO2007145228A1 (ja) * 2006-06-13 2009-11-05 独立行政法人産業技術総合研究所 マイクロアレイの作製方法
JP2008224327A (ja) * 2007-03-09 2008-09-25 Fujifilm Corp バイオチップ
WO2008111281A1 (ja) * 2007-03-12 2008-09-18 The University Of Tokushima アレルギー疾患の判定方法
JP2011033341A (ja) * 2007-09-18 2011-02-17 Nanobiotech Co Ltd 低結合性固相表面の作製方法
US9601530B2 (en) 2008-12-02 2017-03-21 Arizona Board Of Regents, A Body Corporated Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Dual active layer semiconductor device and method of manufacturing the same
US9721825B2 (en) 2008-12-02 2017-08-01 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Method of providing a flexible semiconductor device and flexible semiconductor device thereof
US9991311B2 (en) 2008-12-02 2018-06-05 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Dual active layer semiconductor device and method of manufacturing the same
WO2010138811A2 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Arizona Board Of Regents, For And On Behalf Of Arizona State University Method of providing a flexible semiconductor device at high temperatures and flexible semiconductor device thereof
WO2010119396A1 (en) * 2009-04-15 2010-10-21 Koninklijke Philips Electronics N.V. Cartridge for an amplification process
WO2011090653A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-28 National Health Research Institutes Microarray chips and methods of fabricating the same
WO2012021197A2 (en) 2010-05-21 2012-02-16 Arizona Board Of Regents, For And On Behalf Of Arizona State University Method of manufacturing electronic devices on both sides of a carrier substrate and electronic devices thereof
WO2012021196A2 (en) * 2010-05-21 2012-02-16 Arizona Board Of Regents, For And On Behalf Of Arizona State University Method for manufacturing electronic devices and electronic devices thereof
US10381224B2 (en) 2014-01-23 2019-08-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Method of providing an electronic device and electronic device thereof
WO2017034644A2 (en) 2015-06-09 2017-03-02 ARIZONA BOARD OF REGENTS a body corporate for THE STATE OF ARIZONA for and on behalf of ARIZONA STATE UNIVERSITY Method of providing an electronic device and electronic device thereof
WO2015156891A2 (en) 2014-01-23 2015-10-15 Arizona Board Of Regents, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Method of providing a flexible semiconductor device and flexible semiconductor device thereof
CN106663640B (zh) 2014-05-13 2020-01-07 代表亚利桑那大学的亚利桑那校董会 提供电子器件的方法及其电子器件
US9741742B2 (en) 2014-12-22 2017-08-22 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Deformable electronic device and methods of providing and using deformable electronic device
US10446582B2 (en) 2014-12-22 2019-10-15 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Method of providing an imaging system and imaging system thereof
CN108463287B (zh) * 2016-03-28 2021-01-15 亿明达股份有限公司 多平面微阵列
US20180028030A1 (en) * 2016-07-31 2018-02-01 Jayden Lee-Sin Vacuum Extension Apparatus
CN116783471A (zh) * 2021-01-15 2023-09-19 莱卡生物系统纽卡斯尔有限责任公司 用于多光谱成像中的组织样本载体

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5334466A (en) * 1991-10-24 1994-08-02 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. X-ray mask and process comprising convex-concave alignment mark with alignment reflection film
JPH06265447A (ja) 1993-03-16 1994-09-22 Hitachi Ltd 微量反応装置およびこれを使用する微量成分測定装置
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5750405A (en) * 1996-03-01 1998-05-12 Bayer Corporation Method for the detection for protein
US5993972A (en) 1996-08-26 1999-11-30 Tyndale Plains-Hunter, Ltd. Hydrophilic and hydrophobic polyether polyurethanes and uses therefor
JP3120453B2 (ja) 1997-06-19 2000-12-25 トヨタ自動車株式会社 微小液滴の保持方法、反応方法
EP1387390B1 (en) 1997-06-20 2009-02-18 Bio - Rad Laboratories, Inc. Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine
JP4313861B2 (ja) 1997-08-01 2009-08-12 キヤノン株式会社 プローブアレイの製造方法
JP2000063154A (ja) 1998-08-12 2000-02-29 Mitsubishi Chemicals Corp 核酸固定用ガラスプレート
JP2000304749A (ja) 1999-04-19 2000-11-02 Sumitomo Bakelite Co Ltd 特異結合免疫分析容器
JP3727882B2 (ja) * 1999-07-07 2005-12-21 マイラス コーポレーション 固体支持体への核酸固定化用担体
JP2001108683A (ja) 1999-10-14 2001-04-20 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法
CN1223851C (zh) * 1999-10-20 2005-10-19 内田和彦 基因检测芯片、检测装置及检测方法
US6711181B1 (en) 1999-11-17 2004-03-23 Sony Corporation System and method for packet parsing and data reconstruction in an IEEE 1394-1995 serial bus network
JP2001178460A (ja) 1999-12-27 2001-07-03 Fuji Photo Film Co Ltd 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
WO2001061383A1 (fr) * 2000-02-16 2001-08-23 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Corps a forme irreguliere, feuille reflechissante et element d'affichage a cristaux liquides de type reflechissant, et dispositif et procede de production correspondants
US6720157B2 (en) * 2000-02-23 2004-04-13 Zyomyx, Inc. Chips having elevated sample surfaces
US6444254B1 (en) * 2000-03-03 2002-09-03 Duke University Microstamping activated polymer surfaces
JP2001337089A (ja) 2000-05-26 2001-12-07 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法
EP1164011A3 (en) * 2000-06-16 2005-09-14 ROSSINI S.p.A. Multi-layered printing sleeve
JP3510882B2 (ja) * 2000-06-20 2004-03-29 三菱レイヨン株式会社 生体関連物質マイクロアレイ及びその製造方法
JP2002071693A (ja) 2000-09-05 2002-03-12 Mitsubishi Rayon Co Ltd 核酸結合繊維の製造方法
US6919046B2 (en) 2001-06-07 2005-07-19 Nanostream, Inc. Microfluidic analytical devices and methods
US6929944B2 (en) 2001-08-31 2005-08-16 Beckman Coulter, Inc. Analysis using a distributed sample
WO2003022421A2 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Corning Incorporated Microcolumn-platform based array for high-throughput analysis
JP2003130879A (ja) * 2001-10-26 2003-05-08 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａチップ
US20030143592A1 (en) * 2001-10-25 2003-07-31 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip
JP2003130874A (ja) 2001-10-29 2003-05-08 Sumitomo Bakelite Co Ltd マイクロチップ用プラスチック基板
US7276381B2 (en) 2002-01-25 2007-10-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Monomers and polymers having energy absorbing moieties of use in desorption/ionization of analytes
JP4380631B2 (ja) * 2003-05-19 2009-12-09 東レ株式会社 選択結合性物質固定化担体
JP4190371B2 (ja) * 2003-08-26 2008-12-03 Ｔｄｋ株式会社 凹凸パターン形成用スタンパー、凹凸パターン形成方法および磁気記録媒体
KR101159438B1 (ko) * 2007-11-16 2012-06-22 가부시키가이샤 아루박 기판 처리 방법, 및 이 방법에 의해 처리된 기판
JP2010080680A (ja) * 2008-09-26 2010-04-08 Bridgestone Corp 凹凸パターンの形成方法及び凹凸パターンの製造装置
JP5455142B2 (ja) * 2011-08-30 2014-03-26 エルシード株式会社 凹凸構造膜付きガラス基板のドライエッチングを用いた製造方法、凹凸構造膜付きガラス基板、太陽電池、及び、太陽電池の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101126845B1 (ko) 2012-03-28
US20070009958A1 (en) 2007-01-11
EP1626276A1 (en) 2006-02-15
US20110015097A1 (en) 2011-01-20
KR20060003112A (ko) 2006-01-09
CN1839317B (zh) 2012-05-30
JP4380631B2 (ja) 2009-12-09
EP1626276A4 (en) 2010-05-26
US7795006B2 (en) 2010-09-14
US20110028347A1 (en) 2011-02-03
CN1839317A (zh) 2006-09-27
EP1626276B1 (en) 2019-04-17
WO2004102194A1 (ja) 2004-11-25
ES2727785T3 (es) 2019-10-18
JPWO2004102194A1 (ja) 2006-07-13
US9333478B2 (en) 2016-05-10
CA2525938C (en) 2015-06-30
DK1626276T3 (da) 2019-07-29
PL1626276T3 (pl) 2019-09-30
CA2525938A1 (en) 2004-11-25
US9358518B2 (en) 2016-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2004102194A9 (ja) 選択結合性物質固定化担体
JP4420020B2 (ja) 溶液を攪拌する方法
EP3971305B1 (en) Low binding supports for improved solid-phase dna hybridization and amplification
US20210040534A1 (en) De novo surface preparation and uses thereof
US20120046187A1 (en) Analysis chip, analysis method and method for stirring solution
JP4244788B2 (ja) 選択結合性物質が固定化された基材
US7078172B1 (en) Substrate activation kit and method for detecting DNA and the like using the same
JP2006308307A (ja) 生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法および生体関連分子検出用キット
JP4797619B2 (ja) 分析チップおよび被検物質の分析方法
JP2003202343A (ja) 選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法およびハイブリダイゼーション装置および選択結合性物質配列基材
JP4259343B2 (ja) 選択結合性物質の固定化方法
JP2006201035A (ja) 選択結合性物質固定化担体の製造方法
JP2006078197A (ja) 選択結合性物質固定化担体
JP4492140B2 (ja) バイオチップ用基板およびバイオチップ
JP4877297B2 (ja) 選択結合性物質が固定化された基材を用いた被験物質の検出方法
JP2006184056A (ja) 選択結合性物質固定化担体の製造方法
JP2006010565A (ja) バイオチップおよびその製造方法、ならびにポリホルミルパラキシリレン膜およびその製造方法
JP2006266682A (ja) バイオチップ用基板およびバイオチップ
JP2007171168A (ja) 選択結合性物質固定化用基板の製造方法
JP2007285927A (ja) 選択結合性物質固定化基材
JP2006064599A (ja) 生体物質固定化基板
JP2007127556A (ja) 選択結合性物質固定化基材、選択結合性物質固定化基材キット及びこれを用いたシグナル検出方法
JP2006055065A (ja) 非対称ｐｃｒを用いた核酸の検出方法、ポリヌクレオチドプローブ、それを固定するプローブ固定化担体およびキット
JP2008014901A (ja) 選択結合性物質固定化複合基材

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PAGE 42, CLAIMS, REPLACED BY A NEW PAGE 42; AFTER RECTIFICATION OF OBVIOUS ERRORS AUTHORIZED BY THEINTERNATIONAL SEARCH AUTHORITY

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005506292

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20048056001

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004733682

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2525938

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020057021996

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007009958

Country of ref document: US

Ref document number: 10557070

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020057021996

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004733682

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10557070

Country of ref document: US