JP2006064599A

JP2006064599A - 生体物質固定化基板

Info

Publication number: JP2006064599A
Application number: JP2004249294A
Authority: JP
Inventors: Yuichiro Yamaguchi; 雄一朗山口
Original assignee: Kyocera Corp
Current assignee: Kyocera Corp
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-03-09

Abstract

【課題】基体から発せられるバックグラウンドの蛍光を遮断するとともに、一般的に用いられている安価で安全な生体物質固定化膜を金属膜上に緻密かつ強固に保持させることが可能な生体物質固定化基板を提供すること。
【解決手段】生体物質固定化基板は、基体１１の上面に、金属膜１２，ガラス膜１３および生体物質固定化膜１４が順次積層されて成る。
【選択図】図１

Description

本発明はＤＮＡやＲＮＡなどの生体物質の配列を測定するための生体物質固定化基板に関し、より詳細には蛍光検出法による生体物質検出用基板からのバックグラウンドの蛍光を遮断すると共に、測定される生体物質に修飾された蛍光体からの蛍光の利得をより大きくする方法に関し、検出感度の向上と安定化を目的とする。

ＤＮＡマイクロアレーをはじめとする生体物質固定化基板は、ガラス基体上にアミノシラン、アミノアルキルシランまたはポリ−Ｌ−リジンなどの生体固定化膜を形成した上にオリゴヌクレオチドやｃＤＮＡが被着されており、これに予め蛍光修飾した検体ＤＮＡを反応させ、その反応レベルにより変化する蛍光レベルを検出することによって核酸配列の分析が行なわれている。このため、ガラス基体から発せられるバックグラウンドの蛍光は分解能の低下の原因となる。特にＤＮＡマイクロアレーではスタンフォード大学方式については安価ではあるが検出精度がアフィメトリックス社（Affimetrix）タイプに比較して劣るため、検出精度向上のための感度向上が必要とされている。

この対策として、アミノシラン、アミノアルキルシランまたはポリ−Ｌ−リジンなどの生体固定化膜を形成した上にガラス基体から発せられる蛍光を減衰させるためのブロッキング材や消光材を被着したりすることが検討されている。

例えば、下記の特許文献１には、図５に示すように、検出精度向上のために消光剤５４をコートすることが提案されており、また特許文献２には、図６に示すように、金属膜５２表面に金属と結合性の良い官能基を有する生体物質固定化膜５３を形成した生体物質固定化基板が提案されている。
特開2003−84002号公報特開2002−323498号公報

しかしながら、特許文献１に示されるような、消光剤やブロッキング剤５４をコートする方法は、消光剤やブロッキング剤５４が透光性の有機物質のため、バックグラウンドの蛍光を完全に除去できないという問題点を有していた。また、特許文献２に示されるような、金属膜５２表面に金属と結合性の良い官能基を有する生体物質固定化膜５３を形成する方法は、金属膜５２によりガラス基体５１の蛍光を遮断できるものの、ＡｕやＰｔ等の高価な貴金属を用いる必要があるとともに、生体物質固定化膜５３として金属と結合性のよい官能基を有する特殊な材料を用いる必要があり、比較的高価となることや、またＳやＳｅ等を含む毒性物質を用いるため、取り扱いに注意を要するという問題点を有していた。

従って、本発明は上記問題点を鑑みて完成されたものであり、その目的は、基体から発せられるバックグラウンドの蛍光を遮断するとともに、一般的に用いられている安価で安全な生体物質固定化膜を金属膜上に緻密かつ強固に保持させることが可能な生体物質固定化基板を提供することを目的とする。

本発明の生体物質固定化基板は、基体の上面に、金属膜，ガラス膜および生体物質固定化膜が順次積層されて成ることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記金属膜は、Ｔｉ，Ｃｒ，Ｎｉ−Ｃｒ合金およびＦｅ−Ｃｒ−Ｎｉ合金のうちの少なくとも１種を主成分とすることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記金属膜は、その上面の算術平均粗さＲａが０．０５μｍ以下であることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記ガラス膜は、その厚みが前記生体物質固定化膜に修飾される生体物質から発せられる蛍光の波長の１／４より小さいことを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記ガラス膜は、酸化珪素の含有量が７０質量％以上であることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記ガラス膜は、前記金属膜の上面に成長された多数のガラス柱状体から成ることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記基体の上面に、下側に向かうに伴って内寸法が漸次小さくなる窪みが直線状に複数配列形成されており、該窪みの内面に前記金属膜、前記ガラス膜および前記生体物質固定化膜が順次被着されていることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記窪みは、その内面の縦断面形状が放物線状であることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記生体物質固定化膜の上面で前記窪みの周縁部の上側に位置する部位に、平面視で前記窪みを全周にわたって取り囲むように疎水性膜が被着されていることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板において、好ましくは、前記生体物質固定化膜は、アミノ基，アルデヒド基，メルカプト基，シラン基およびカルボキシル基のうちの少なくとも１種を有していることを特徴とする。

本発明の生体物質固定化基板は、基体の上面に、金属膜，ガラス膜および生体物質固定化膜が順次積層されて成ることから、金属膜が基体からのバックグラウンドの蛍光を良好に遮断し、かつ、生体物質固定化膜に結合した生体物質から発する蛍光を高効率で反射させることができるため、蛍光の利得が高くなるとともに、金属膜上のガラス膜に生体物質固定化膜を簡便に被着させることができるようになる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、金属膜は、Ｔｉ，Ｃｒ，Ｎｉ−Ｃｒ合金およびＦｅ−Ｃｒ−Ｎｉ合金のうちの少なくとも１種を主成分とすることから、金属膜を安価に形成することができるとともに、金属膜の上面に形成されるガラス膜との密着性が高く、かつ、安定な自然酸化皮膜をもつため、耐薬品性にも優れている。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、金属膜の上面の算術平均粗さＲａが０．０５μｍ以下であることから、生体物質固定化膜に結合した生体物質に修飾された蛍光体から発する蛍光を高効率で反射することができ、蛍光の利得をより高めることができる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、ガラス膜の厚みが生体物質固定化膜に修飾される生体物質から発せられる蛍光の波長の１／４より小さいことから、生体物質固定化膜に結合した生体物質に修飾された蛍光体から発する蛍光は金属膜で反射されても光の干渉を生じないため、一定の安定した利得を得ることができる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、ガラス膜は、酸化珪素の含有量が７０質量％以上であることから、透明性に優れたガラス膜を安価に形成することが可能となるとともに、従来のガラス上に用いられる生体物質固定化膜をそのまま用いることができ、特殊な官能基を有する生体物質を用いる必要はなく、材料コストを低減することができる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、ガラス膜は、金属膜の上面に成長された多数のガラス柱状体から成ることから、ガラス膜の比表面積は単純な平滑面よりも大幅に大きくなる。このため、より高密度に生体物質を固定化できるため、さらに蛍光の利得が大きくなる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、基体の上面に、下側に向かうに伴って内寸法が漸次小さくなる窪みが直線状に複数配列形成されており、窪みの内面に前記金属膜、ガラス膜および生体物質固定化膜が順次被着されていることから、アレー状などに並べられた窪みの各々に異なる生体物質保持液を滴下して基板上に複数種の蛋白質や細胞を固定化することができ、検出の効率を向上させることができる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、窪みの内面の縦断面形状が放物線状であることから、窪みの底部に保持された生体物質からの蛍光を指向性高く窪みの上方の蛍光検出器に向けて発することができ、蛍光の利得をより高めることができる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、生体物質固定化膜の上面で窪みの周縁部の上側に位置する部位に、平面視で窪みを全周にわたって取り囲むように疎水性膜が被着されていることから、アレー状などに並べられた各窪みから生体物質保持液がはみ出しても隣接する別の窪みに混入することがなく、検出精度を高めることができる。

本発明の生体物質固定化基板は、好ましくは、生体物質固定化膜は、アミノ基，アルデヒド基，メルカプト基，シラン基およびカルボキシル基のうちの少なくとも１種を有していることから、蛋白質や細胞などの生体物質の吸着性を高めることができ、より多くの生体物質を固定して、検出精度を高めることができる。

次に本発明の生体物質固定化基板を添付の図面に従って詳細に説明する。

図１は本発明の生体物質固定化基板の実施の形態の一例の断面図である。図１に示すように１１は基体、１２は金属膜、１３はガラス膜、１４は生体物質固定化膜である。

基体１１はガラスや金属、セラミックス等の板であるが、これらに限定されず、表面を鏡面状に平坦化が可能であるとともに、生体物質の処理に関わる耐薬品性や耐熱耐湿性が満たされるならば何でも良い。

金属膜１２は、蛍光を反射可能であるとともに、ガラス物質との密着性がよく、耐薬品性を有する金属が用いられ、好ましくは、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｉ−Ｃｒ合金、Ｆｅ−Ｃｒ−Ｎｉ合金のうちの少なくとも一種を主成分とするものであるのがよい。これにより、蛍光の反射率を非常に高くすることができるとともに、ガラス物質と金属膜１２との密着性を非常に高くすることができ、さらに金属膜１２の表面に安定な不導体皮膜が形成されるので金属膜１２の耐薬品性を非常に高くすることができる。

また、金属膜１２の厚みについては、光を透過するアイランド構造から光を透過しない膜構造に成長する０．１μｍ以上が良い。特に０．２μｍ程度で有れば、比較的膜密着性も高く、また、薬液の浸透による基体のガラス１１のコロージョンが発生しなくなる。また、１μｍを超えると、成膜方法にもよるが膜の内部応力により基体のガラス１１の破壊による膜剥がれが生じやすくなるため、１μｍ以下の厚みがよい。

さらに成膜条件の選定に当たっては平滑性を考慮した成膜条件の限定が必要である。金属膜１２の平滑性は基体のガラス１１の平滑性も含めてＲａが０．０５μｍ以下であるのがよい。これにより、蛍光の乱反射を抑制して蛍光の利得を高めることができる。

ガラス膜１３は透明質であり、且つ、蛍光の波長の吸収が無く、生体固定化コート物質が良く固着される物質であれば何でも良い。特に生体物質に修飾される蛍光体の発光波長の１／２の厚みであれば干渉による吸収が生じ、また、蛍光体の波長の１／４の厚みであれば光の干渉による増幅が有るために僅かな膜厚みのばらつきが蛍光強度の測定のばらつきを大きくするので蛍光波長の４分の１よりも小さい厚みであるのがよい。

また、ガラス膜１３は、成分組成としてＳｉＯ_２が７０質量％以上含まれているのがよい。これにより、アミノアルキルシランやポリ−Ｌ−リジンなどの一般的な生体固定化膜はほとんどのものが使用可能である。

さらに、図２は本発明の生体物質固定化基板の実施の形態の他の例を示す部分断面図であるが、このようにガラス膜２３の成膜条件を制御して、金属膜２２上に隣接粒子との隙間の多い多数のガラス柱状体を成長させて成るガラス膜２３とするのがよい。これにより、ガラス膜２３の表面積がきわめて大きくなるため、固定化される生体物質量が飛躍的に増大して、蛍光の利得がより高まる。

このような金属膜２２の上面に成長された多数のガラス柱状体から成るガラス膜２３は、例えば、低温高ガス圧力スパッタリングや斜め蒸着することによって作製される。

生体物質固定化膜１４はアミノアルキルシランやポリ−Ｌ−リジン等から選ばれる。一般的にガラス基体上に用いられる生体物質固定化膜であれば何でも良い。

また、図３．は本発明の生体物質固定化基板の実施の形態の他の例を示す、窪み部分の断面図である。この構成により、基体３１に形成した窪みに生理性水溶物を滴下して窪みごとに種々の生体物質を保持することができる。窪みの内表面にも金属膜３２、ガラス膜３３、生体物質固定化膜３４が形成されているため、生体物質の固定化とバックグラウンドの蛍光遮光を良好に行なうことができる。

また、基体３１に形成された窪みは、下側に行くに伴って（深くなるに伴って）内寸法が小さくなるように形成されており、蛍光を窪みの上側に集光させる作用を持つため、スキャナーで蛍光を検出する際の利得が高くなる。

さらに、図４は本発明の生体物質固定化基板の他の例であるが、このように、深くなるに伴って内寸法が小さくなる窪みの縦断面形状が放物線状であるのがよい。これにより、生体物質に修飾された蛍光体から発する蛍光の反射光は指向性高く窪み直上に反射されるため、蛍光の利得は特に高くなる。

また、基体３１に直線状に配列されたり、あるいは直線状の配列を複数列並べてアレー状等に配列された窪みの間に、各窪みを全周にわたって取り囲むように疎水性膜を形成するのがよく、これにより、生体物質の未固着の物が別の窪みに混入することを防ぐことができる。

このような疎水性膜としては、例えば、テフロン（登録商標）樹脂やポリプロピレン樹脂、ノボラック樹脂、シリコーン樹脂等の疎水性の高い樹脂等が挙げられる。

本発明の生体物質固定化基板の実施例を以下に説明する。

基体１１のガラスは硼珪酸ガラスとして２６ｍｍ×７６ｍｍ×１．１ｍｍのものを準備した。

準備した硼珪酸ガラスはアルカリ脱脂を行って十分に純水洗した後、希塩酸にて中和処理を行い、十分に純水洗し、さらに希弗酸液にてガラス表面をライトエッチングして後、十分に純水洗を行った。乾燥はアルコール置換した後にアルコール蒸気乾燥を行った。

乾燥した基体１１はスパッタ装置にて金属膜１２としてＴｉ膜、また、ガラス膜１３としてＳｉＯ_２膜を順次、所定の厚みに成膜した。この際、ＳｉＯ_２の成膜に当たっては膜の緻密性にも考慮した。

成膜の終わった基体１１は硼珪酸ガラスはアルカリ脱脂を行って十分に純水洗した後、希塩酸にて中和処理を行い、十分に純水洗し、アルコール置換した後にアルコール蒸気乾燥を行った。

次に生体物質固定化膜１４として３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下ＡＰＳと略す。）のコート液を作成した。コート液は溶媒としてイソプロピルアルコール（以下ＩＰＡと略す。）を９４体積％、ＡＰＳを４体積％を混ぜ、その後、純水を２体積％添加して直ちに良く攪拌した後に成膜後の洗浄が終わったガラスを３０秒浸漬した。その後、ガラスはＩＰＡにて５秒のリンスを施した後、リンサードライヤーにて乾燥を行った。次にＡＰＳの固着化を進めるために１５０℃にて１０分間のキュアを行い、本発明の生体物質固定化基板とした。また、同様にして、他の本発明の生体物質固定化基板も作成した。

比較例としては硼珪酸ガラスに同様の洗浄を施した後に同様にＡＰＳコートを行った。評価については5’末端をCy3 蛍光体にて修飾した１５塩基長のオリゴDNAを用いた。オリゴDNAは０．５μＭとなるように純水に溶解してスポット液とした。準備した基板にスポットした後は湿潤箱に２５℃にて１２時間放置してオリゴDNAを作成した基板に固定した。次にクエン酸緩衝液にて洗浄した後に純水リンスを行い、ブロー乾燥した。

励起波長５３２ｎｍにて作成した基板をスキャニングして、蛍光強度を数値化した。なお、DNAの評価としては蛍光強度が５０以上有れば可能である。

以下、表１に基づき説明する。

表１には、反射膜としての金属膜１２の材料および厚み、ガラス膜１３の材料，厚みおよび測定に用いた蛍光波長５３８ｎｍに対するガラス膜１３の厚みの比率、測定した蛍光強度を示した。

金属膜１２は代表例としてＣｒにて評価した。厚みとしては０．０３μｍから０．３μｍは、蛍光強度が高く、好適な結果を得た。特に０．２μｍから０．３μｍは非常によい結果を示した。なお、０．５μｍ以上になると膜の内部応力のため、基体１１のガラスが破損して不適であった。

次に他の金属膜１２でも評価した。Ｔｉ，Ｎｉ−Ｃｒ，Ｆｅ−Ｎｉ−Ｃｒのどの金属膜１２でも良好な結果を得た。

次にガラス膜１３の厚みについて調査した。ガラス膜１３の厚みは２０ｎｍ〜１２５ｎｍは好適であった。さらに３０ｎｍ〜１２５ｎｍはきわめて良い結果であった。しかし、Ｃｙ３波長５３８ｎｍの４分の１波長となる１３５ｎｍ前後の厚みでは光の干渉による部分的な蛍光強度のばらつきが発生している。このばらつきは解析上不利なため、ガラス膜１３の厚みは生体物質から発せられる蛍光の波長の１／４より小さいことがより好ましいことがわかった。

次にガラス膜の材質について調査した。酸化珪素の質量が７０％以上では良い結果を示したが、６３％では蛍光強度が弱かったのでガラス膜の酸化珪素濃度は７０質量％以上がより好ましいことがわかった。

次に表２に基づいて説明する。

Ｒａは０．０５μｍ以下にて好適な結果を得た。また、０．１以上では蛍光強度が弱かったのでＲａは０．０５μｍ以下が好ましいことが分かった。

なお、本発明は上述の最良の形態および実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の変更を行うことは何等差し支えない。

本発明の生体物質検出用基板の実施の形態の一例を示す断面図である。本発明の生体物質検出用基板の実施の形態の他の例を示す断面図である。本発明の生体物質検出用基板の実施の形態の他の例を示す断面図である。本発明の生体物質検出用基板の実施の形態の他の例を示す断面図である。従来の生体物質検出用基板の断面図である。従来の生体物質検出用基板の断面図である。

符号の説明

１１，２１，３１，４１：基板
１２，２２，３２，４２：金属膜
１３，２３，３３，４３：ガラス膜
１４，３４，４４：生体物質固定化膜

Claims

基体の上面に、金属膜，ガラス膜および生体物質固定化膜が順次積層されて成ることを特徴とする生体物質固定化基板。
前記金属膜は、Ｔｉ，Ｃｒ，Ｎｉ−Ｃｒ合金およびＦｅ−Ｃｒ−Ｎｉ合金のうちの少なくとも１種を主成分とすることを特徴とする請求項１記載の生体物質固定化基板。
前記金属膜は、その上面の算術平均粗さＲａが０．０５μｍ以下であることを特徴とする請求項１または請求項２記載の生体物質固定化基板。
前記ガラス膜は、その厚みが前記生体物質固定化膜に修飾される生体物質から発せられる蛍光の波長の１／４より小さいことを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の生体物質固定化基板。
前記ガラス膜は、酸化珪素の含有量が７０質量％以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の生体物質固定化基板
前記ガラス膜は、前記金属膜の上面に成長された多数のガラス柱状体から成ることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の生体物質固定化基板。
前記基体の上面に、下側に向かうに伴って内寸法が漸次小さくなる窪みが直線状に複数配列形成されており、該窪みの内面に前記金属膜、前記ガラス膜および前記生体物質固定化膜が順次被着されていることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の生体物質固定化基板。
前記窪みは、その内面の縦断面形状が放物線状であることを特徴とする請求項７記載の生体物質固定化基板。
前記生体物質固定化膜の上面で前記窪みの周縁部の上側に位置する部位に、平面視で前記窪みを全周にわたって取り囲むように疎水性膜が被着されていることを特徴とする請求項７または請求項８記載の生体物質固定化基板。
前記生体物質固定化膜は、アミノ基，アルデヒド基，メルカプト基，シラン基およびカルボキシル基のうちの少なくとも１種を有していることを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれかに記載の生体物質固定化基板。