JP2012132778A - 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基板と、
該基板上のサンプル固定層と、
該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、
該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス。
【選択図】図1
Description
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のDNA断片又はRNA試料から逆転写反応を行い合成したcDNA断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
[1] 基板と、
該基板上のサンプル固定層と、
該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、
該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス。
[2] 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[1]の核酸分析用反応デバイス。
[3] 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[2]の核酸分析用反応デバイス。
[4] ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[1]〜[3]のいずれかの核酸分析用反応デバイス。
[5] ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[4]の核酸分析用反応デバイス。
[6] [1]〜[5]のいずれかの核酸分析用反応デバイスであって、
サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第1の基板;
第2の基板;並びに
流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第1の基板と第2の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析用反応デバイス。
[7] スペーサの厚さが1mm以下である、[6]の核酸分析用反応デバイス。
[8] (i) 基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
(ii) 該サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、並びに
(iii) 該核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[9] 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[8]の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[10] 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[9]の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[11] ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[8]〜[10]のいずれかの核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[12] ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、[11]の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[13] (ii) サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、と(iii) 核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程とが同時に行われる、[9]〜[12]のいずれかの核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[14] [8]の核酸分析用反応デバイスの製造方法であって、
(a) 第1の基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
(b) 第1の基板と第2の基板を、流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを介して貼り合わせる工程、
(c) 第1の基板、スペーサ若しくは第2の基板に開口している前記流路と連絡している液注入口から核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体を含む溶液を注入し、前記サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、
(d) 前記液注入口からブロッキング層を形成し得る化合物の溶液を注入し、前記核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程、を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。
基板と、該基板上のサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス;
前記核酸分析用反応デバイスに試薬を含む溶液を供給する試薬供給ユニット;並びに
前記核酸分析用反応デバイスに保持された試料を観察する検出ユニット
を含み、前記サンプル固定層が無機酸化物により形成されている核酸分析装置。
[16] 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、[15]の核酸分析装置。
[17] 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、[16]の核酸分析装置。
[18] ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、[15]〜[17]のいずれかの核酸分析装置。
[19] ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、[18]の核酸分析装置ス。
[20] [15]〜[19]のいずれかの核酸分析装置であって、
核酸分析用反応デバイスが、
サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第1の基板;
第2の基板;並びに
流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第1の基板と第2の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析反応用デバイスである、核酸分析装置。
図1に本発明の核酸分析用反応デバイスの例を示す。
図1Bは核酸分析用反応デバイスの基板101にサンプル固定層102が積層され、サンプル固定層102上に核酸試料103を含む担体104が結合している状態を示し、図1Aは核酸試料103を表面に有する担体104が核酸試料103を介してサンプル固定層102に結合している状態を側面から観察した状態を示す。核酸試料が結合している領域以外の領域にはブロッキング層105が形成されている。
本発明の核酸分析装置を用いた核酸分析方法を説明する。分析方法はScience 2005, vol. 309, pp.1728-1732(非特許文献2)に開示されている方法に準じる。
測定対象の核酸試料をDneasy Tissue kit(QIAGEN社)を用いて精製した後、核酸試料を断片化した。断片化DNAに対して、End-it DNA End Repair kit(EpiCentre社)を用いてテンプレートDNAの両端にタグ配列を付加した。タグ配列が付加したテンプレートを精製した後、スペーサ配列が付加されたテンプレートをエキソヌクレアーゼで処理して、RCA(Rolling Circle Amplification)用のテンプレートを作製した。得られたテンプレートに対して、ランダムヘキサマーを用いたRCAを行いテンプレートを増幅した。増幅産物をMicrocon-30(Millipore社)で精製した後、制限酵素で断片化した。断片化された産物に対してゲル精製を行い、70塩基長のタグライブラリーを抽出した。抽出されたタグライブラリーに対してプライマをライゲーションした後PCR増幅を行いライブラリーを作製した。
Light mineral oil(Sigma社)からなるオイル溶液にPCR溶液、MyOne(商標) paramagnetic streptavidin磁気ビーズ(Dynal社)、及びライブラリー溶液を加えてエマルジョンPCRを行った。増幅溶液に対して、界面活性剤を含む溶液を加えて高速遠心を行った後、マグネットを用いて溶媒置換を行い、表面に数多くの増幅産物を持つ測定用のDNAを表面に有するビーズ水溶液を作製した。
(2)で得られた核酸試料付きビーズに5'がリン酸化されたプライマをライゲーションし、ビーズ上の核酸試料末端に固定用の官能基であるリン酸基を付加した。サンプル固定層としてチタニアを持つ本発明の核酸分析用反応デバイスに5'がリン酸化された核酸試料付きビーズ水溶液を注入した。サンプル固定層を有する面が外側になるように遠心を行った後、サンプル固定層を有する面を下側にして40℃で12時間保持して、チタニア上にDNA付きビーズを固定した。
ソディウムドデシルサルファイト水溶液を液注入口より注入した後、40℃で12時間保持して、チタニア上にブロッキング層を導入した。
本発明の核酸分析装置714に核酸試料を表面に有するビーズが固定された核酸分析用反応デバイスを設置した。アンカープライマを含む水溶液をノズル720を介して核酸分析用反応デバイス715に注入した。ホルダユニット716を用いて反応デバイス715内の水溶液を60℃に加熱した後、42℃に保持した。配列決定用の色素でラベル化されたプライマ、ライゲーション酵素を含む水溶液を注入した後、35℃で30分保持した。バッファーで反応デバイス715内の流路を洗浄し、未反応のラベル化プライマを除去した。核酸分析用反応デバイス715をステージユニット717にて移動させた後、検出ユニット722にて励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料付きビーズに導入された蛍光を検出した。ライゲーション反応と洗浄、及び蛍光検出を複数サイクル繰り返した後、DNAウラシル化とエンドヌクレアーゼを用いてアンカープライマとラベル化プライマのライゲーション産物を分解除去した。新たなアンカープライマによるライゲーション反応、洗浄、検出の繰り返し、及びさらなるライゲーション産物の分解除去から新たなアンカープライマを用いた一連の検出を繰り返し行いDNA配列を決定した。
102,202,302,402,502,602 サンプル固定層
103,203,303,403,503,603 核酸試料
104,304,404,504,604 担体
105,205,305,405,505,605 ブロッキング層
506,606 スペーサ
507,607 第2の基板
508 液注入口
509 液排出口
510 流路エッジ部
511 流路
612 離型フィルム
613 くり貫き部
714 核酸分析装置
715 核酸分析用反応デバイス
716 ホルダユニット
717 ステージユニット
718 試薬容器
719 送液ユニット
720 ノズル
721 ノズル搬送ユニット
722 検出ユニット
723 廃液容器
Claims (20)
- 基板と、
該基板上のサンプル固定層と、
該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、
該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス。 - 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の核酸分析用反応デバイス。
- 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項2に記載の核酸分析用反応デバイス。
- ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸分析用反応デバイス。
- ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項4に記載の核酸分析用反応デバイス。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分析用反応デバイスであって、
サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第1の基板;
第2の基板;並びに
流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第1の基板と第2の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析用反応デバイス。 - スペーサの厚さが1mm以下である、請求項6記載の核酸分析用反応デバイス。
- (i) 基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
(ii) 該サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、並びに
(iii) 該核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。 - 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項8に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
- 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項9に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
- ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項8〜10のいずれか1項に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
- ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選択される、請求項11記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
- (ii) サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、と(iii) 核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程とが同時に行われる、請求項9〜12のいずれか1項に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
- 請求項8に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法であって、
(a) 第1の基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
(b) 第1の基板と第2の基板を、流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを介して貼り合わせる工程、
(c) 第1の基板、スペーサ若しくは第2の基板に開口している前記流路と連絡している液注入口から核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体を含む溶液を注入し、前記サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、
(d) 前記液注入口からブロッキング層を形成し得る化合物の溶液を注入し、前記核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程、を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。 - 核酸を分析する核酸分析装置であって、少なくとも
基板と、該基板上のサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス;
前記核酸分析用反応デバイスに試薬を含む溶液を供給する試薬供給ユニット;並びに
前記核酸分析用反応デバイスに保持された試料を観察する検出ユニット
を含み、前記サンプル固定層が無機酸化物により形成されている核酸分析装置。 - 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項15に記載の核酸分析装置。
- 無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項16に記載の核酸分析装置。
- ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項15〜17のいずれか1項に記載の核酸分析装置。
- ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項18記載の核酸分析装置。
- 請求項15〜19のいずれか1項に記載の核酸分析装置であって、
核酸分析用反応デバイスが、
サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第1の基板;
第2の基板;並びに
流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第1の基板と第2の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析反応用デバイスである、核酸分析装置。
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