WO2012086450A1 - 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置 - Google Patents

核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置 Download PDF

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奈良原　正俊
太朗 中澤
伊名波　良仁
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention relates to a reaction device for nucleic acid analysis and a nucleic acid analysis apparatus.
  • a cDNA fragment sample synthesized in advance by reverse transcription reaction from a DNA fragment or RNA sample for sequencing is prepared, and a dideoxy reaction is performed by a well-known Sanger method. After that, electrophoresis is performed, and the molecular weight separation development pattern is measured and analyzed.
  • Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Documents 1 to 8 methods have been proposed in which a large number of DNA fragments as samples are fixed on a substrate and the sequence information of many fragments is determined in parallel.
  • Non-Patent Document 1 PCR is performed on microparticles using microparticles as a carrier for carrying DNA fragments. Thereafter, fine particles carrying PCR-amplified DNA fragments are put on a plate having a large number of holes in which the hole diameter is adjusted to the size of the fine particles, and read by a pyrosequencing method.
  • Non-Patent Document 2 PCR is performed on microparticles using microparticles as a carrier for supporting DNA fragments. Thereafter, the microparticles are dispersed and fixed on the glass substrate, an enzyme reaction (ligation) is performed on the glass substrate, a fluorescent dye is incorporated, and the sequence information of each fragment is obtained.
  • ligation enzyme reaction
  • Non-Patent Document 3 a large number of DNA probes having the same sequence are fixed on a substrate.
  • a DNA probe sequence and an adapter sequence of a complementary strand are added to the end of each DNA sample fragment.
  • the sample DNA fragments are immobilized on the substrate randomly one molecule at a time.
  • the DNA elongation reaction is performed on the substrate, the substrate with the fluorescent dye is taken in, the unreacted substrate is washed and the fluorescence is detected, and the sequence information of the sample DNA is obtained.
  • Patent Document 1 discloses a nucleic acid analysis reaction device and a method for immobilizing a nucleic acid sample, which are used in a method for determining a large amount of sequence information in parallel.
  • a reaction device for nucleic acid analysis a substrate having a sample fixing layer and a spacer with a central portion pulled out are installed in a chamber, and the upper portion of the chamber, the spacer, and the substrate are pressure-bonded by pressure.
  • a flow path is formed by the hollow formed by the chamber upper flat plate and the spacer and the substrate flat plate portion.
  • the liquid is taken in and out from the two tubes at the top of the chamber.
  • the sample fixing layer of Patent Document 1 improves the adhesion between the nucleic acid sample and the substrate. Adhesiveness is improved by introducing a functional group into the nucleic acid sample and allowing the functional group introduced into the nucleic acid sample to interact with the functional group of the sample fixing layer.
  • a functional group introduced into the nucleic acid sample an organic substance such as acrylamide, polylysine, streptavidin, or a silane coupling agent is used.
  • silane coupling agent functional groups such as amino groups, carboxylic acids, and aldehyde groups are introduced into the sample fixing layer.
  • the functional group introduced into the sample fixing layer and the functional group introduced into the nucleic acid sample are reacted via an optional linker reagent to fix the nucleic acid sample.
  • an acrydite, biotin, an amino group and the like are disclosed.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 allow efficient analysis in that the reaction is performed in a channel formed by a hollow formed by a chamber upper flat plate and a spacer and a substrate flat plate portion. .
  • the amount of spacer deformation depends on the thickness of the spacer.
  • the film thickness is large, the amount of deformation of the spacer is large, and the spacer easily follows the unevenness of the substrate, so that liquid leakage hardly occurs.
  • the reaction device described in Patent Document 1 has a problem that the spacer is thick and the flow path capacity is large.
  • the nucleic acid analysis system of Patent Document 1 since a reagent used for nucleic acid analysis is expensive, the nucleic acid analysis system of Patent Document 1 has a problem that the amount of reagent used is large and the running cost of analysis is high.
  • Patent Document 2 discloses a reaction device in which a chamber, a spacer, and a substrate are integrated.
  • the spacer material epoxy resin, acrylic resin, or polydimethylsiloxane is used.
  • the processing temperature of the spacer material and the bonding temperature between the spacer material and the sample layer are as high as 100 ° C. or more, and there is a problem in that the organic substance that is the sample fixing layer is deteriorated by thermal denaturation.
  • the nucleic acid sample is peeled off during the extension reaction due to deterioration.
  • Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5 disclose methods using an inorganic oxide such as titania or zirconia as a sample fixing layer. Inorganic oxides are stable even at temperatures of 100 ° C. or higher. For this reason, the thermal denaturation at the time of the process of spacer material and joining with a sample layer can be prevented.
  • an inorganic oxide such as titania or zirconia
  • Non-patent document 5 discloses phosphoric acid
  • non-patent document 6 discloses sulfuric acid
  • non-patent document 7 discloses acetic acid as such functional groups.
  • Non-Patent Document 5 discloses a method of immobilizing an oligonucleotide whose terminal is phosphorylated on zirconia.
  • adsorption of functional groups containing oxygen to inorganic oxides is a reversible reaction, and the substitution reaction with hydroxide ions, chloride ions and nitrate ions contained in the extension reaction solution proceeds, and the nucleic acid sample is peeled off. There was a problem.
  • the present invention solves the above-mentioned problems in the conventional reaction device for nucleic acid analysis, has a small internal volume of the flow path in which the nucleic acid reaction occurs, and does not deteriorate the layer for fixing the nucleic acid sample during device manufacture.
  • An object of the present invention is to provide a device and an apparatus that can efficiently perform nucleic acid analysis at low cost by preventing a nucleic acid sample from peeling off from a substrate during a nucleic acid reaction.
  • the inventor of the present invention has a small volume in the flow channel, and the nucleic acid reaction such as an extension reaction when performing a DNA sequence or the like without deteriorating the fixing layer for fixing the nucleic acid sample during production.
  • a reaction device for nucleic acid analysis was completed, in which a nucleic acid sample was not peeled off during the process.
  • the present invention provides a substrate, a sample fixing layer on the substrate, a nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface, and a blocking covering a region other than the region where the nucleic acid sample and the sample fixing layer are bonded.
  • a reaction device for nucleic acid analysis comprising a layer.
  • the blocking layer prevents the nucleic acid sample from coming off the sample fixing layer by preventing the reaction solution from penetrating the nucleic acid sample and the sample fixing layer bonding portion.
  • the sample fixing layer of the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention is formed of an inorganic oxide.
  • the inorganic oxide forming the fixed layer is selected from the group consisting of titania, zirconia, alumina, zeolite, vanadium pentoxide, silica, sapphire, tungsten oxide and tantalum pentoxide, and may be a mixture of at least two of these. .
  • titania, zirconia, alumina, zeolite, vanadium pentoxide, or a mixture thereof is desirable.
  • inorganic oxides bind to a phosphate site or a phosphate ester site in the nucleic acid sample molecule, thereby binding the nucleic acid sample to the sample fixing layer.
  • titania, zirconia, alumina, zeolite, and vanadium pentoxide contain many Lewis acid sites and Bronsted acid sites with high electrophilicity to which DNA can bind.
  • the blocking layer of the present invention is formed using a carboxylic acid compound, a phosphoric acid compound, a sulfuric acid compound, a nitrile compound, any salt thereof, or a mixture of at least two of them. These compounds bind specifically to the inorganic oxide and realize a high blocking effect that prevents the reaction solution from penetrating the binding site between the nucleic acid sample and the sample fixing layer.
  • the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention has a liquid inlet and a liquid outlet, and a flow path for feeding the liquid.
  • Inorganic oxides that do not undergo thermal denaturation enable processing of spacer materials and bonding of the sample fixing layer at high temperatures, making it possible to provide a reaction device in which a chamber, a spacer, and a substrate with a small flow volume are integrated. .
  • the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention fixes a nucleic acid sample or a carrier having a nucleic acid sample on a surface on a substrate having a sample fixing layer, and further covers a region other than the region where the nucleic acid sample and the sample fixing layer are bonded. It can be produced by introducing a layer. Regions other than the nucleic acid sample and the sample fixing layer binding site can be blocked with a high coverage.
  • the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention binds a nucleic acid sample or a carrier having a nucleic acid sample on the surface to a substrate having a sample fixing layer, and at the same time, the region other than the region where the nucleic acid sample and the sample fixing layer are bonded. It can be manufactured by introducing a covering blocking layer. Since the fixation of the nucleic acid sample and the blocking layer can be realized at the same time, the production time of the reaction device for nucleic acid analysis can be shortened.
  • An apparatus provided with the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention includes a substrate, a sample fixing layer on the substrate, a nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface, a nucleic acid sample, A reaction device for nucleic acid analysis comprising a blocking layer covering a region other than a region to which the sample fixing layer is bonded, means for injecting a solution containing a reagent into the reaction device for nucleic acid analysis, and a sample held in the reaction device for nucleic acid analysis It has a detection means etc. which observes. With this apparatus, a large number of nucleic acid samples can be analyzed in parallel at one time.
  • the present invention is as follows.
  • a substrate [1] a substrate; A sample fixing layer on the substrate; A nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface; A reaction device for nucleic acid analysis, comprising a blocking layer that covers a region other than a region where the nucleic acid sample or carrier and the sample fixing layer are bonded, and wherein the sample fixing layer is formed of an inorganic oxide.
  • the inorganic oxide is selected from the group consisting of titania, zirconia, alumina, zeolite, vanadium pentoxide, silica, sapphire, tungsten oxide, tantalum pentoxide, and a mixture of at least two of them. Reaction device for nucleic acid analysis.
  • reaction device for nucleic acid analysis wherein the inorganic oxide is selected from the group consisting of titania, zirconia, alumina, zeolite, vanadium pentoxide, and a mixture of at least two of them.
  • the blocking layer is selected from the group consisting of a carboxylic acid compound, a phosphoric acid compound, a sulfuric acid compound, a nitrile compound, a salt thereof, and a mixture of at least two of these compounds, Any nucleic acid analysis reaction device.
  • a reaction device for nucleic acid analysis according to any one of [1] to [5], A sample fixing layer, a nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface, and a blocking layer covering a region other than the region where the nucleic acid sample or carrier and the sample fixing layer are combined, A first substrate on which the sample fixing layer is formed of an inorganic oxide; A second substrate; and a spacer having a cut-through portion for forming a flow path, and the first substrate and the second substrate are bonded to form a flow path therebetween via the spacer, A sample fixing layer in the flow path, a nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface, and a blocking covering a region other than a region where the nucleic acid sample or the carrier and the sample fixing layer are combined.
  • Layers exist, A reaction device for nucleic acid analysis, comprising a liquid inlet and a liquid outlet connected to the flow path.
  • the inorganic oxide is selected from the group consisting of titania, zirconia, alumina, zeolite, vanadium pentoxide, silica, sapphire, tungsten oxide, tantalum pentoxide, and a mixture of at least two of them.
  • a method for producing a reaction device for nucleic acid analysis is selected from the group consisting of titania, zirconia, alumina, zeolite, vanadium pentoxide, silica, sapphire, tungsten oxide, tantalum pentoxide, and a mixture of at least two of them.
  • the blocking layer is selected from the group consisting of a carboxylic acid compound, a phosphoric acid compound, a sulfuric acid compound, a nitrile compound, a salt thereof, and a mixture of at least two of these compounds, A method for producing any one of the reaction devices for nucleic acid analysis.
  • a method for producing a reaction device for nucleic acid analysis according to [8], (a) forming a sample fixing layer on the first substrate; (b) bonding the first substrate and the second substrate through a spacer having a cut-through portion for forming a flow path; (c) A sample containing a nucleic acid sample or a solution containing a carrier having a nucleic acid sample on its surface is injected from a liquid inlet communicating with the first substrate, a spacer or the flow path opened in the second substrate, and the sample Immobilizing a nucleic acid sample on the immobilization layer or a carrier having the nucleic acid sample on the surface; (d) A solution of a compound capable of forming a blocking layer is injected from the liquid injection port, and a blocking layer covering the nucleic acid sample or a region other than the region where the carrier having the nucleic acid sample and the sample fixing layer are bonded to the surface is introduced.
  • a process for producing a reaction device for nucleic acid analysis wherein the sample
  • a nucleic acid analyzer for analyzing a nucleic acid comprising at least a substrate, a sample fixing layer on the substrate, a nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface, and the nucleic acid
  • a reaction device for nucleic acid analysis comprising a blocking layer that covers a region other than a region where the sample or carrier and the sample fixing layer are bonded, and wherein the sample fixing layer is formed of an inorganic oxide;
  • the blocking layer is selected from the group consisting of carboxylic acid compounds, phosphoric acid compounds, sulfuric acid compounds, nitrile compounds, salts thereof, and mixtures of at least two of these compounds A nucleic acid analyzer.
  • a nucleic acid analyzer according to any one of [15] to [19], A reaction device for nucleic acid analysis A sample fixing layer, a nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface, and a blocking layer covering a region other than the region where the nucleic acid sample or carrier and the sample fixing layer are combined, A first substrate on which the sample fixing layer is formed of an inorganic oxide; A second substrate; and a spacer having a cut-through portion for forming a flow path, and the first substrate and the second substrate are bonded to form a flow path therebetween via the spacer, A sample fixing layer in the flow path, a nucleic acid sample fixed on the sample fixing layer or a carrier having a nucleic acid sample on the surface, and a blocking covering a region other than a region where the nucleic acid sample or the carrier and the sample fixing layer are combined.
  • a reaction device for nucleic acid analysis that has a small volume in a channel and does not peel off a nucleic acid sample when performing a nucleic acid reaction. Since the reaction device for nucleic acid analysis has a small volume in the flow path in which the reaction is performed, the amount of reagent used can be reduced, and a large amount of analysis can be performed at a low cost with a high throughput. In addition, since the nucleic acid sample is hardly peeled off from the sample fixing layer during the reaction, the analysis can be performed accurately and efficiently.
  • the sample fixing layer for fixing the nucleic acid sample
  • the sample fixing layer is not affected even when the substrate on which the sample fixing layer is formed at the time of manufacture is bonded at a high temperature. There is no deterioration, and the device can be manufactured with a high yield.
  • FIG. 1 shows an example of the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention.
  • FIG. 1B shows a state in which a sample fixing layer 102 is laminated on a substrate 101 of a reaction device for nucleic acid analysis, and a carrier 104 including a nucleic acid sample 103 is bound on the sample fixing layer 102.
  • a blocking layer 105 is formed in a region other than the region where the nucleic acid sample is bound.
  • the sample fixing layer 102 is laminated on the substrate 101, and the carrier 104 including the nucleic acid sample 103 is immobilized on the sample fixing layer 102 via the nucleic acid sample 103.
  • Numerous nucleic acid samples 103 are bonded on the carrier 104, and some of the nucleic acid samples have one end bonded to the carrier and the other end bonded to the sample fixing layer 102. Only one end of the nucleic acid sample other than the nucleic acid sample is bonded to the sample fixing layer.
  • the nucleic acid bound to the carrier 104 reacts.
  • a region on the sample fixing layer 102 other than the region where the nucleic acid sample 103 is bonded is covered with the blocking layer 105.
  • the substrate 101 is made of glass, acrylic resin, cycloolefin polymer, or other resin that can transmit fluorescence.
  • the blocking layer is formed by fixing a blocking compound to the sample fixing layer. Since the blocking layer blocks the region other than the region where the nucleic acid sample is bonded on the sample fixing layer, it is possible to prevent the reaction solution from penetrating into the bonded portion between the nucleic acid sample 103 and the sample fixing layer 102. Peeling of the nucleic acid sample 103 from the fixed layer 102 can be prevented.
  • an inorganic oxide that is known to specifically adsorb functional groups containing oxygen is used.
  • a compound having a Lewis acid site or a Bronsted acid site on the surface is desirable.
  • Such an inorganic oxide is selected from the group consisting of titania, zirconia, alumina, zeolite, vanadium pentoxide, silica, sapphire, tungsten oxide and tantalum pentoxide, and may be a mixture of at least two of these.
  • a compound selected from titania, zirconia, alumina, zeolite, and vanadium pentoxide having a high density of Lewis acid sites and Bronsted acid sites on the surface is desirable.
  • these metal oxides may be added by doping with a dopant having a positive charge. Further, these dopants may be coordinated on the surface. Examples of such dopants include magnesium ions, iron ions, zinc ions, calcium ions, lithium ions, nickel ions, cobalt ions, copper ions, aluminum ions, and manganese ions. Inorganic oxides are unlikely to be thermally denatured, and are not denatured when the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention is produced and processed using heat. Although there is no particular limitation on the thickness of the sample fixing layer 102, in order to perform fluorescence observation, a thickness that increases the transmittance of the excitation light wavelength is desirable, and it is desirably 500 nm or less.
  • the carrier 104 containing the nucleic acid sample 103 can be prepared using emulsion PCR shown in Science 2005, vol. 309, pp.1728-1732 (Non-patent Document 2).
  • Emulsion PCR is a method of amplifying a nucleic acid on a microparticle by performing a PCR reaction in which a single molecule of nucleic acid is immobilized on a microparticle and a single particle of nucleic acid is immobilized in a water droplet in oil.
  • a functional group may be introduced into the end of the nucleic acid sample using a ligation reaction. Examples of such functional groups include phosphoric acid and carboxylic acid.
  • the carrier 104 is not particularly limited, but it is desirable to use fine particles, particularly magnetic fine particles (magnetic beads).
  • fine particles particularly magnetic fine particles (magnetic beads).
  • magnetic fine particles In the sample preparation method using the ligation, there are many processes for washing intermediate products. At this time, it is desirable to use magnetic fine particles because magnetic fine particles having a nucleic acid sample on the surface can be easily recovered at a high sample recovery rate using magnetism.
  • the magnetic fine particles fine particles obtained by forming a magnetic substance, fine particles whose surface is coated with a high molecular substance such as agarose, dextran, polystyrene, or acrylamide with the magnetic substance as a nucleus can be used.
  • the magnetic fine particles commercially available ones can be used, and examples include Dynabeads and Dynabeads Myone (trademark) (Dynal).
  • the particle size of the magnetic fine particles is 0.1 to 10 ⁇ m, preferably 0.5 to 5 ⁇ m.
  • a nucleic acid molecule of 10 3 to 10 30 molecules, preferably 10 6 to 10 21 molecules may be bound per magnetic fine particle.
  • the blocking layer 105 is formed using a Lewis base compound such as a carboxylic acid compound, a phosphoric acid compound, a sulfuric acid compound, a nitrile compound, or a salt thereof. A mixture of at least two of these compounds may be used. These Lewis base compounds are specifically adsorbed on the sample fixing layer 102 made of an inorganic oxide. As such a Lewis base compound, a compound having a hydrophobic site such as long-chain alkyl in the molecule is desirable. This is because the hydrophobic site prevents the reaction solution from entering the binding site.
  • Examples of phosphoric acid compounds include glyceraldehyde 3-sphingosine phosphate, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate, 3-sn-phosphatidic acid, O-phosphorylethanolamine dihydrogen phosphate
  • Examples include 2-aminoethyl and salts thereof.
  • Examples of the sulfuric acid compound include sodium decyl sulfate, sodium dodecyl sulfate, and sodium octyl sulfate.
  • Examples of the nitrile compound include dicyanopentane, dicyanohexane, (butylamino) acetonitrile, (dimethylamino) propionitrile, and hexynenitrile.
  • FIG. 2B shows a state in which the sample fixing layer 202 is laminated on the substrate 201 of the reaction device for nucleic acid analysis, and the nucleic acid sample 203 is bonded on the sample fixing layer 202.
  • FIG. 2A shows the nucleic acid sample 203 on the sample fixing layer 202. The state which observed the state which couple
  • a blocking layer 205 is formed in a region other than the region where the nucleic acid sample is bound.
  • the difference from the reaction device for nucleic acid analysis shown in FIG. 1 is that the carrier 104 is not used, and a free nucleic acid sample 203 not bound to the carrier is fixed to the sample fixing layer.
  • the nucleic acid sample 203 is fixed at an arbitrary position of the sample fixing layer 202 formed on the substrate 201 by performing an amplification reaction on the substrate in accordance with the method shown in US Pat. No. 7,115,400B1 (Patent Document 3). be able to. Moreover, it can also fix using the spotting system shown by Proc.
  • pp.-10614-10619 Nonpatent literature 8.
  • the blocking layer 205 after the nucleic acid sample 203 is fixed the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention can be produced.
  • the substrate, sample fixing layer, and blocking layer used are the same as those in the reaction device for nucleic acid analysis shown in FIG.
  • a sample fixing layer 302 is formed by forming an inorganic oxide film on the substrate 301 (FIG. 3A) (FIG. 3B).
  • FIG. 3A A sample fixing layer 302 is formed by forming an inorganic oxide film on the substrate 301 (FIG. 3A) (FIG. 3B).
  • a sputtering or vapor deposition method capable of forming a thin film with little variation in film thickness can be used.
  • the nucleic acid sample 303 is fixed (FIG. 3C).
  • the fixing conditions are not limited. For example, an aqueous solution containing the carrier 304 may be held at 4 ° C.
  • the carrier density in the aqueous solution containing the carrier 304 at this time may be appropriately determined depending on the purpose of nucleic acid analysis, and is, for example, 10 3 to 10 6 / ⁇ L.
  • the immobilization reaction of the nucleic acid sample 303 to the inorganic oxide competes with the coordination reaction of hydroxide ions in the aqueous solution. In order to increase the immobilization rate of the nucleic acid sample 303, it is desirable to perform under acidic conditions that can reduce the hydroxide ion concentration in the aqueous solution, that is, pH 1 to 7, preferably pH 3 to 7.
  • the carrier 304 having the nucleic acid sample 303 on the surface is bonded to the sample fixing layer 302 at a high density via the nucleic acid sample.
  • the amount of carrier bound at this time may be appropriately determined depending on the purpose of nucleic acid analysis, etc., for example, 10 2 to 10 6 , preferably 10 4 to 10 6 per 1 cm 2 of the sample fixing layer.
  • the nucleic acid sample binding per 1 cm 2 of the fixed layer is 10 6 to 10 180 molecules, preferably 10 10 to 10 150 molecules.
  • a blocking layer is formed in a region other than the region where the carrier 304 is bonded via the nucleic acid sample 303 on the sample fixing layer (FIG. 3D).
  • the blocking layer is formed by holding a solution of the compound used for forming the blocking layer on the sample fixing layer for a predetermined time.
  • the conditions for forming the blocking layer are not limited.
  • the compound used for forming the blocking layer may be held at 20 ° C. to 80 ° C. for 1 second to 24 hours.
  • a further method for producing the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention will be described with reference to FIG.
  • the difference from the manufacturing method shown in FIG. 3 is that the nucleic acid sample 403 is fixed and the blocking layer 405 is introduced simultaneously.
  • the fixation of the nucleic acid sample 403 and the formation of the blocking layer 405 are simultaneously performed.
  • Perform (FIG. 4C) The binding conditions of the carrier 404 and the conditions for forming the blocking layer are the same as described above.
  • FIG. 3 and FIG. 4 above show the case where the nucleic acid sample is bound to the surface of the carrier and bound to the sample fixing layer.
  • the nucleic acid sample may be bound to the sample fixing layer.
  • the nucleic acid sample to be bound per 1 cm 2 of the sample fixing layer is 10 6 to 10 180 molecules, preferably 10 10 to 10 150 molecules.
  • the reaction device for nucleic acid analysis of FIG. 5 is a device prepared so that the reaction device for nucleic acid analysis illustrated in FIGS. 1 and 2 is included in the flow path.
  • FIG. 5A shows the whole reaction device for nucleic acid analysis
  • FIG. 5B shows a cross-sectional view at cross-section X in FIG. 5A.
  • the reaction device for nucleic acid analysis in FIG. 5 is an integrated reaction device having a liquid inlet 508, a liquid outlet 509, and a flow path 511 for feeding a liquid.
  • the integrated reaction device is a device in which necessary components other than the reagent solution used for the reaction are integrally formed, and a series of reactions can be performed by supplying the necessary reagents to the flow path of the reaction device.
  • the reaction device for nucleic acid analysis is designed such that a carrier 504 having a nucleic acid sample 503 on the surface or a free nucleic acid sample is contained in the flow path, a sample fixing layer 502 is formed, and the nucleic acid sample 503 is placed on the surface.
  • a second substrate 507 is included in addition to the substrate 501 to which the carrier 504 or the free nucleic acid sample is bound.
  • a substrate on which a sample fixing layer 502 is formed and a carrier 504 having a nucleic acid sample 503 on the surface or a free nucleic acid sample is bonded is referred to as a first substrate.
  • a flow path 511 is formed between the first substrate 501 and the second substrate 507.
  • the flow path functions as a flow path for supplying a reagent necessary for a reaction for nucleic acid analysis and also functions as a reaction chamber in which the reaction occurs.
  • a spacer 506 is provided between the first substrate 501 and the second substrate 507 in order to secure a space for the flow path. That is, the nucleic acid analysis reaction device of FIG.
  • the reaction solution is injected through the liquid inlet 508 and discharged from the liquid outlet 509.
  • the openings of the liquid inlet 508 and the liquid outlet 509 are in communication with the flow path of the nucleic acid analysis reaction device, and may be on the top surface or the side surface of the first substrate.
  • the openings of the inlet 508 and the liquid outlet 509 may be in the spacer 506 or the second substrate 507.
  • the material of the second substrate 507 is not particularly limited, but when used in a nucleic acid analyzer in which the second substrate 507 is in contact with the temperature control element, an inorganic material such as silicon, glass, sapphire, quartz, Examples thereof include metal materials such as SUS, copper, and aluminum, or highly heat conductive resin materials containing carbon fibers and inorganic fillers.
  • the thickness of the second substrate 507 is not particularly limited, but is desirably 10 mm or less in order to increase thermal conductivity.
  • the material of the spacer 506 is not particularly limited, but it is possible to use an epoxy adhesive, an acrylic adhesive, etc., such as thermosetting and photocuring as disclosed in JP-A-2006-87974 (Patent Document 2). it can. Alternatively, a double-sided tape based on acrylic resin may be used. More preferable materials include glass, quartz, sapphire, or polydimethylsiloxane having high adhesive strength with a transparent resin. There is no particular limitation on the spacer thickness, but the thinner the thickness is, the more the channel capacity can be reduced and the amount of reagent used can be reduced.
  • the spacer 506 is preferably 1 mm or less in thickness.
  • the nucleic acid analysis device shown in FIG. 5 may be referred to as an integrated nucleic acid analysis reaction device or a flow chip.
  • the integrated nucleic acid analysis reaction device shown in FIGS. 1 and 2 can also be referred to as a diagram showing a part of the integrated nucleic acid analysis reaction device or flow chip shown in FIG.
  • FIG. 5 shows an example of a device in which three flow paths are formed, but the number of flow paths is not limited, and may be, for example, 1 to 1000, 1 to 100, and 1 to 10.
  • the number of channels is large, a large number of reactions can be performed at one time, and the device can be used as a device capable of high-throughput analysis.
  • FIG. 6A A spacer 606 (FIG. 6A) having a release film 612 on both sides is cut through the interior using die-cutting press processing, laser processing, or the like to form a cut-out portion 613 that becomes a flow path portion (FIG. 6B). After the release film 612 on one side is peeled off (FIG. 6C), the substrate 601 (FIGS. 6X and 6Y) having the sample fixing layer 602 is bonded to the spacer 606 (FIG. 6D).
  • the surface of the sample fixing layer 602 and the surface of the spacer 606 may be subjected to excimer treatment, oxygen plasma treatment, or atmospheric pressure plasma treatment immediately before bonding. In addition, heat treatment may be performed after bonding to improve adhesion.
  • the same processing is performed to bond the second substrate (FIG. 6F). After injecting a carrier 604 having a nucleic acid sample 603 on the surface or an aqueous solution containing a free nucleic acid sample from the liquid inlet 508 (FIG.
  • the nucleic acid sample 603 is fixed on the sample fixing layer 602 by holding for a certain period of time (FIG. 5). 6H).
  • the carrier 604 having the nucleic acid sample 603 on the surface or the free nucleic acid sample is fixed almost uniformly on the sample fixing layer.
  • a blocking layer 605 is formed by similarly injecting an aqueous solution of a compound selected from the group consisting of a carboxylic acid compound, a phosphoric acid compound, a sulfuric acid compound, a nitrile compound, their salts, and a mixture of at least two of these compounds. (FIG. 6I).
  • the reaction device for nucleic acid analysis thus prepared is set in a nucleic acid analyzer to perform nucleic acid analysis.
  • the present invention also includes a nucleic acid analyzer for performing a nucleic acid reaction by setting the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention.
  • the nucleic acid analyzer of the present invention comprises at least a reaction device for nucleic acid analysis of the present invention, means for injecting a solution containing a reagent into the reaction device for nucleic acid analysis, and detection means for observing a sample held in the reaction device for nucleic acid analysis including.
  • the nucleic acid analyzer includes at least a reaction device for nucleic acid analysis of the present invention, a holder unit for fixing the device, a stage unit for moving the device and the holder unit, a reagent supply unit for supplying a reagent, and a sample Includes a detection unit for observation.
  • the reagent supply unit for supplying the reagent includes a reagent container, a liquid feeding unit, a nozzle, and a nozzle transport unit described below.
  • the nucleic acid analyzer 714 includes a reaction device 715 for nucleic acid analysis of the present invention; a holder unit 716 that can fix the reaction device 715 for nucleic acid analysis and adjust the temperature of the reaction device 715 for nucleic acid analysis; a reaction device for nucleic acid analysis Stage unit 717 for moving 715 and holder unit 716; reagent container 718 containing a plurality of reagents and washing water; liquid feeding for aspirating the reagent contained in reagent container 718 and injecting it into reaction device 715 for nucleic acid analysis Unit 719; Nozzle 720 that actually accesses reagent container 718 and reaction device 715 for nucleic acid analysis during reagent aspiration and discharge; Nozzle transport unit 721 that transports nozzle 720; Sample fixed to reaction device 715 for nucleic acid analysis A detection unit 722 for observing the liquid, and a waste liquid container 723 for storing
  • the nucleic acid analyzer of the present invention operates as follows. First, a reaction device 715 for nucleic acid analysis that holds a nucleic acid sample to be measured is installed in the holder unit 716. Next, the nozzle 720 accesses the reagent container 718 and sucks the reagent by the liquid feeding unit 719. The nozzle 720 is transported to the upper surface of the nucleic acid analysis reaction device 715 by the nozzle transport unit 721 and injects the reagent into the nucleic acid analysis reaction device 715. The holder unit 716 causes the reaction by adjusting the temperature of the nucleic acid sample and the reagent contained in the flow path of the reaction device 715 for nucleic acid analysis.
  • the reaction device 715 for nucleic acid analysis is moved by the stage unit 717, and excitation light is applied to detect fluorescence of a plurality of nucleic acid samples in the detection region.
  • the washing water contained in the reagent container 718 is sucked by the liquid feeding unit 719 and injected into the nucleic acid analysis reaction device 715. Wash.
  • a nucleic acid sample can be read by repeating the operation
  • the nucleic acid analyzer is controlled by a computer and can automatically perform the above operation.
  • DNA sequencing and hybridization can be performed using the nucleic acid analyzer of the present invention.
  • DNA sequencing DNA sequencing
  • the DNA sequencing method is not limited, but DNA sequencing by a method using stepwise ligation (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) is preferred.
  • the stepwise ligation method is a technique in which a fluorescently labeled probe is sequentially bound using a single-stranded DNA on a fine particle as a template to determine a sequence by two bases.
  • stepwise ligation method parallel sequencing can be performed by repeatedly hybridizing fluorescently labeled oligonucleotides.
  • a sequencing method using stepwise ligation can be performed, for example, as described in Science S2005, vol. 309, pp.1728-1732.
  • Example 2 A nucleic acid analysis method using the nucleic acid analyzer of the present invention will be described. The analysis method is based on the method disclosed in Science 2005, vol. 309, pp.1728-1732 (Non-patent Document 2).
  • nucleic acid sample to be measured was purified using a Dneasy Tissue kit (QIAGEN), the nucleic acid sample was fragmented. Tag sequences were added to both ends of the template DNA using the End-it DNA End Repair kit (EpiCentre) to the fragmented DNA. After the template with the tag sequence added was purified, the template with the spacer sequence added was treated with exonuclease to prepare a template for RCA (Rolling Circle Amplification). RCA using random hexamer was performed on the obtained template to amplify the template. The amplified product was purified with Microcon-30 (Millipore) and then fragmented with a restriction enzyme. The fragmented product was subjected to gel purification to extract a 70-base long tag library. A primer was ligated to the extracted tag library, and then PCR amplification was performed to prepare a library.
  • RCA Rolling Circle Amplification
  • Emulsion PCR A PCR solution, MyOne (trademark) paramagnetic streptavidin magnetic beads (Dynal), and a library solution were added to an oil solution composed of light mineral oil (Sigma) to perform emulsion PCR. After adding a surfactant-containing solution to the amplification solution and performing high-speed centrifugation, solvent replacement is performed using a magnet, and an aqueous solution of beads having DNA for measurement having a large number of amplification products on the surface is obtained. Produced.
  • nucleic acid analysis reaction device for nucleic acid analysis in which beads having a nucleic acid sample on the surface thereof were fixed was installed in the nucleic acid analyzer 714 of the present invention.
  • An aqueous solution containing an anchor primer was injected into the reaction device 715 for nucleic acid analysis via a nozzle 720.
  • the aqueous solution in the reaction device 715 was heated to 60 ° C. using the holder unit 716 and then held at 42 ° C.
  • An aqueous solution containing a primer and a ligation enzyme labeled with a dye for sequencing was injected, and then kept at 35 ° C. for 30 minutes.
  • the flow path in the reaction device 715 was washed with a buffer to remove unreacted labeled primer.
  • excitation light was applied by the detection unit 722 to detect fluorescence introduced into a plurality of beads with nucleic acid samples in the detection region.
  • the ligation products of the anchor primer and the labeled primer were decomposed and removed using DNA urasylation and endonuclease.
  • the DNA sequence was determined by repeating a series of detections using a new anchor primer from repeated ligation reaction, washing and detection with a new anchor primer, and further degradation and removal of the ligation product.
  • the nucleic acid analysis reaction device or the nucleic acid analyzer of the present invention can be used to perform various nucleic acid reactions and to analyze nucleic acids such as DNA sequences.

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Abstract

　シーケンス反応時にサンプル固定層からの核酸試料のはがれを防止する。解析可能な核酸試料数を増やすことで、高スループット解析を可能とする核酸分析用反応デバイスを提供する。　基板と、 該基板上のサンプル固定層と、 該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、 該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス。

Description

核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置
　本発明は、核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置に関する。
　ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
　現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
　これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている（特許文献１～３及び非特許文献１～８）。
　非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担時する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
　また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
　さらに、非特許文献３では、基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄や蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。
　以上のように、基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。
　特許文献１には、パラレルに数多くの配列情報を決定する方法で用いられる、核酸分析用反応デバイスと核酸試料の固定方法が開示されている。核酸分析用反応デバイスは、サンプル固定層を有する基板と中央部が繰り抜かれたスペーサをチャンバに設置し、チャンバ上部、スペーサ、基板を加圧により圧着する。チャンバ上部平板とスペーサより形成された中空と基板平板部より流路が形成される。チャンバ上部の二つの管より液の出し入れが行われる。使用時は常にチャンバ上部平板と基板平板部を加圧することで、チャンバ上部平板とスペーサの界面、及びスペーサと基板平板部の界面からの液漏れを防止する。
　特許文献1のサンプル固定層は核酸試料と基板との接着性を向上する。核酸試料に官能基を導入し、核酸試料に導入された官能基とサンプル固定層の官能基が相互作用することで接着性を向上する。サンプル固定層としては、アクリルアミド、ポリリジン、ストレプトアビジン、又はシランカップリング剤などの有機物を用いる。シランカップリング剤を用いる方法では、アミノ基、カルボン酸、アルデヒド基などの官能基をサンプル固定層に導入する。任意のリンカー試薬を介して、サンプル固定層に導入された官能基と核酸試料に導入される官能基を反応させて核酸試料を固定する。核酸試料に導入される官能基としては、アクリダイト、ビオチン、アミノ基などが開示されている。
米国特許出願公開第2009/0062129号明細書 特開2006-87974号公報 米国特許第7115400B1号明細書
Nature 2005, vol. 437, pp.376-380. Science 2005, vol. 309, pp.1728-1732 Science 2008, vol. 320, pp.106-109. Langmuir 2007, vol. 23, pp.377-381 Analytica Chimica Acta Vol. 510, pp.163-168 Applied Catalysis A: General.2005, vol. 286, pp.128-136 J. Environ. Monit.2000, vol.2, pp.550-555 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1996, Vol. 93, pp.10614-10619
　上記特許文献１や特許文献２に記載の方法は、チャンバ上部平板とスペーサより形成された中空と基板平板部より形成された流路において反応が行われるという点で効率的な分析が可能である。
　一般に、スペーサ変形量はスペーサの膜厚に依存する。膜厚が大きい場合は、スペーサ変形量も大きく、スペーサが基板の凹凸に追従しやすくなるため、液漏れは生じにくい。しかしながら、スペーサを薄くすると加圧による変形量が少なくなるため、液漏れのリスクが高くなり、スペーサを薄くできない課題がある。このように、特許文献1に記載の反応デバイスは、スペーサが厚く流路内容量が大きいという問題があった。一般に、核酸分析に用いられる試薬は高価であるため、特許文献１の核酸分析システムは試薬使用量が多く、解析のランニングコストが高いという問題がある。
　流路内容量が少ない反応デバイスとして、特許文献２では、チャンバ、スペーサ、及び基板が一体化した反応デバイスが開示されている。スペーサ材料として、エポキシ樹脂やアクリル樹脂、又はポリジメチルシロキサンを用いる。しかしながら、上記スペーサ材料の加工温度、及びスペーサ材料とサンプル層との接合温度は100℃以上と高く、サンプル固定層である有機物が熱変性によって劣化するという問題があった。さらに、劣化によって、核酸試料が伸長反応時にはがれるという問題が生じていた。
　非特許文献４や非特許文献５にはサンプル固定層として、チタニアやジルコニアなどの無機酸化物を用いる方法が開示されている。無機酸化物は100℃以上の温度でも安定である。このため、スペーサ材料の加工、及びサンプル層との接合時の熱変性を防止できる。
　一般に、酸素を含む官能基が無機酸化物に特異的に吸着することが知られている。この様な官能基として、非特許文献５ではリン酸が、非特許文献６では硫酸が、非特許文献７では酢酸が、それぞれ開示されている。非特許文献５では、ジルコニア上に末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチドを固定する方法が開示されている。しかしながら、酸素を含む官能基の無機酸化物への吸着は可逆反応であり、伸長反応溶液に含まれる水酸化物イオン、塩素イオン及び硝酸イオンとの置換反応が進み、核酸試料がはがれてしまうという問題があった。
　本発明は、従来の核酸分析用反応デバイスにおける上記の問題点を解決し、核酸反応が生じる流路の内容量が少なく、デバイス製造時に核酸試料を固定するための層が劣化することなく、さらに、核酸反応時に核酸試料が基板からはがれないようにし、低コストで、効率的に核酸分析を行うことのできるデバイス及び装置の提供を目的とする。
　本発明の発明者は、鋭意研究の結果、流路内容量が少なく、製造時に核酸試料を固定するための固定層が劣化することなく、さらにDNAシーケンス等を行う際の伸長反応等の核酸反応を行う時に核酸試料がはがれない核酸分析用反応デバイスを完成させた。
　本発明は、基板と、該基板上のサンプル固定層と、サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、核酸試料とサンプル固定層が結合する領域以外を覆うブロッキング層とを備える核酸分析用反応デバイスである。ブロッキング層により、核酸試料とサンプル固定層結合部への反応溶液の浸透を防ぐことで、サンプル固定層からの核酸試料のはがれを防止することができる。
　本発明の核酸分析用反応デバイスのサンプル固定層は無機酸化物で形成されている。固定層を形成する無機酸化物はチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン及び五酸化タンタルからなる群から選択され、これらの少なくとも２種類の混合物であってもよい。この中でも、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、又はこれらの混合物が望ましい。これらの無機酸化物は核酸試料分子内のリン酸部位、又はリン酸エステル部位と結合することで、核酸試料をサンプル固定層へ結合する。特に、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウムは、DNAが結合し得る求電子性の大きいルイス酸サイトやブロンステッド酸サイトが多く含まれる。
　また、本発明のブロッキング層はカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらのいずれかの塩、又はそれらの少なくとも２種類の混合物を用いて形成される。これらの化合物は、無機酸化物に特異的に結合するものであり、反応液が核酸試料とサンプル固定層の結合部位に浸透するのを防ぐという高いブロッキング効果を実現する。
　また、本発明の核酸分析用反応デバイスは、液注入口及び液排出口、並びに液を送液するための流路を有する。熱変性が生じない無機酸化物は高温でのスペーサ材料の加工とサンプル固定層の結合を実現し、流路内容量が少ないチャンバ、スペーサ、及び基板が一体化した反応デバイスの提供を可能とする。
　本発明の核酸分析用反応デバイスは、サンプル固定層を有する基板上に、核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定し、さらに核酸試料とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入することにより製造することができる。核酸試料とサンプル固定層結合部位以外の領域を、被覆率の高い状態でブロッキングすることができる。
　また、本発明の核酸分析用反応デバイスは、サンプル固定層を有する基板上に、核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を結合すると同時に、核酸試料とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入することにより製造することができる。核酸試料の固定とブロッキング層を同時に実現することができるため、核酸分析用反応デバイスの製造時間を短縮することができる。
　また、本発明の核酸分析用反応デバイスを備えた装置は、基板と、該基板上のサンプル固定層と、サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体、核酸試料とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備える核酸分析用反応デバイス、前記核酸分析用反応デバイスに試薬を含む溶液を注入する手段、前記核酸分析用反応デバイスに保持された試料を観察する検出手段等を有する。該装置により一度に数多くの核酸試料をパラレルに解析することができる。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　基板と、
該基板上のサンプル固定層と、
該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、
該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス。
[２]　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[１]の核酸分析用反応デバイス。
[３]　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[２]の核酸分析用反応デバイス。
[４]　ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[１]～[３]のいずれかの核酸分析用反応デバイス。
[５]　ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[４]の核酸分析用反応デバイス。
[６]　[１]～[５]のいずれかの核酸分析用反応デバイスであって、
サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第１の基板；
　第２の基板；並びに
　流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第１の基板と第２の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析用反応デバイス。
[７]　スペーサの厚さが１mm以下である、[６]の核酸分析用反応デバイス。
[８]　(i)　基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
(ii)　該サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、並びに
(iii)　該核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[９]　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[８]の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[１０]　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[９]の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[１１]　ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[８]～[１０]のいずれかの核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[１２]　ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、[１１]の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[１３]　(ii)　サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、と(iii)　核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程とが同時に行われる、[９]～[１２]のいずれかの核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[１４]　[８]の核酸分析用反応デバイスの製造方法であって、
(a)　第１の基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
(b)　第１の基板と第２の基板を、流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを介して貼り合わせる工程、
(c)　第１の基板、スペーサ若しくは第２の基板に開口している前記流路と連絡している液注入口から核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体を含む溶液を注入し、前記サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、
(d)　前記液注入口からブロッキング層を形成し得る化合物の溶液を注入し、前記核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程、を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。
[１５]　核酸を分析する核酸分析装置であって、少なくとも
基板と、該基板上のサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス；
前記核酸分析用反応デバイスに試薬を含む溶液を供給する試薬供給ユニット；並びに
前記核酸分析用反応デバイスに保持された試料を観察する検出ユニット
を含み、前記サンプル固定層が無機酸化物により形成されている核酸分析装置。
[１６]　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、[１５]の核酸分析装置。
[１７]　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、[１６]の核酸分析装置。
[１８]　ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、[１５]～[１７]のいずれかの核酸分析装置。
[１９]　ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、[１８]の核酸分析装置。
[２０]　[１５]～[１９]のいずれかの核酸分析装置であって、
核酸分析用反応デバイスが、
サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第１の基板；
　第２の基板；並びに
　流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第１の基板と第２の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析反応用デバイスである、核酸分析装置。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-284855号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、流路内容量が少なく、核酸反応を行う時に核酸試料が剥がれない核酸分析用反応デバイスを提供することができる。該核酸分析用反応デバイスは反応が行われる流路内容量が少ないので、試薬の使用量を少なくすることができ、低コストで大量の分析をハイスループットで行うことができる。また、反応時に核酸試料がサンプル固定層から剥がれにくいので、正確かつ効率的に分析を行うことができる。さらに、核酸試料を固定するためのサンプル固定層に熱変性が生じない無機酸化物を用いているため、製造時にサンプル固定層を形成した基板の貼り合わせを高温で行っても、サンプル固定層が劣化することはなく、高い歩止まりでデバイスを製造することができる。
本発明の核酸分析用反応デバイス構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス製造方法の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス製造方法の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス製造方法の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析装置の一例を説明するための図である。
　以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
　ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
［実施例１］
　図１に本発明の核酸分析用反応デバイスの例を示す。
　図１Ｂは核酸分析用反応デバイスの基板101にサンプル固定層102が積層され、サンプル固定層102上に核酸試料103を含む担体104が結合している状態を示し、図１Ａは核酸試料103を表面に有する担体104が核酸試料103を介してサンプル固定層102に結合している状態を側面から観察した状態を示す。核酸試料が結合している領域以外の領域にはブロッキング層105が形成されている。
　基板101上にサンプル固定層102が積層されており、核酸試料103を含む担体104が核酸試料103を介してサンプル固定層102上に固定化される。担体104上には多数の核酸試料103が結合しており、一部の核酸試料は一端が担体に結合し、他端がサンプル固定層102に結合しているが、サンプル固定層に結合している核酸試料以外の核酸試料は一端のみがサンプル固定層に結合している。本発明の核酸分析用反応デバイスを用いて分析を行う場合、担体104に結合した核酸が反応する。サンプル固定層102上の、核酸試料103が結合している領域以外の領域がブロッキング層105で覆われている。
　基板101は、蛍光を透過し得るガラス、アクリル樹脂やシクロオレフィンポリマー等の樹脂製のものを用いる。
　ブロッキング層はサンプル固定層にブロッキング用の化合物を固定させることにより形成させる。ブロッキング層はサンプル固定層上の核酸試料が結合している領域以外の領域をブロッキングするので、核酸試料103とサンプル固定層102の結合部への反応溶液の浸透を防ぐことができ、このためサンプル固定層102からの核酸試料103のはがれを防止することができる。
　サンプル固定層102としては、酸素を含む官能基が特異的に吸着することが知られている無機酸化物を用いる。特に、表面にルイス酸サイトやブロンステッド酸サイトを持つ化合物が望ましい。この様な無機酸化物は、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン及び五酸化タンタルからなる群から選択され、これらの少なくとも２種類の混合物であってもよい。特に、表面のルイス酸サイトやブロンステッド酸サイトの密度が高い、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウムから選ばれる化合物が望ましい。核酸との結合力を高めるために、これらの金属酸化物に正の電荷を有するドーパントをドープすることにより加えても良い。また、表面にこれらのドーパントを配位させても良い。この様なドーパントとして、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、銅イオン、アルミニウムイオン、マンガンイオンなどが挙げられる。無機酸化物は熱変性が生じにくく、本発明の核酸分析用反応デバイスを熱を用いて製造加工する際も変性することがない。サンプル固定層102の厚さに特に制限はないが、蛍光観察を行うためには、励起光波長の透過率が高くなる厚さが望ましく、500nm以下とすることが望ましい。
　核酸試料103を含む担体104は、Science 2005, vol. 309, pp.1728-1732（非特許文献２）に示されるエマルジョンPCRを用いて作製することができる。エマルジョンPCRは、微粒子に核酸を１分子固定し、オイル中に存在する水滴内に１分子の核酸を固定した微粒子１個を含む状態でPCR反応を行うことにより、微粒子上で核酸を増幅する方法をいう。核酸試料103とサンプル固定層102の接着力を向上するために、核酸試料末端にライゲーション反応を用いて官能基を導入しても良い。この様な官能基として、リン酸、カルボン酸などが挙げられる。
　担体104としては、特に制限はないが、微粒子、特に磁気微粒子(磁気ビーズ)を用いることが望ましい。上記ライゲーションを用いたサンプル作製方法では、中間産物を洗浄するプロセスが数多く存在する。この際、磁気微粒子を用いることにより、磁気を利用して容易に高いサンプル回収率で核酸試料を表面に有する磁気微粒子を回収することができるので、望ましい。磁気微粒子としては、磁性体を粒子化した微粒子や磁性体を核として表面をアガロース、デキストラン、ポリスチレン、アクリルアミド等の高分子物質で被覆した微粒子等を用いることができる。磁気微粒子としては、市販のものを用いることができDynabeads、Dynabeads Myone（商標）（Dynal社）等を挙げることができる。磁気微粒子の粒子径は0.1～10μm、好ましくは0.5～５μmである。上記のエマルジョンPCRを用いることにより、磁気微粒子上に多数コピーの増幅した核酸試料が結合し得る。磁気微粒子１個当たり、103～1030分子、好ましくは106～1021分子の核酸分子を結合させればよい。
　ブロッキング層105は、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物を用いて形成する。これらの化合物の少なくとも２種類の混合物を用いてもよい。これらのルイス塩基化合物は、無機酸化物からなるサンプル固定層102に特異的に吸着する。この様なルイス塩基化合物としては、分子内に長鎖アルキルなどの疎水性部位を持つ化合物が望ましい。疎水性部位が結合部位への反応溶液の進入を防止するためである。ブロッキング層の形成に用い得るカルボン酸化合物として、イミノ二酢酸ナトリウムエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸、10-カルボキシ-1-デカンチオール、7-カルボキシ-1-ヘプタンチオール、5-カルボキシ-1-ペンタンチオール、10-カルボキシルジスルフィド、7-カルボキシルヘプチルジスルフィド、5-カルボキシルペンチルスルフィド、15-カルボキシル-1-ペンタデカンチオール、カルボキシ-EG6-ウンデカンチオール、カルボキシ-EG6-ヘキサデカンチオール、ギ酸ブチル、ギ酸シトロネリル、ギ酸エチル、ギ酸ゲラニルウンデカン酸、及びこれらの塩が挙げられる。また、リン酸化合物としては、グリセルアルデヒド 3-リン酸スフィンゴシン、1-リン酸1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸、3-sn-ホスファチジン酸、O-ホスホリルエタノールアミン　リン酸二水素2-アミノエチル及びこれらの塩が挙げられる。また、硫酸化合物としては、デシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及びオクチル硫酸ナトリウムが挙げられる。また、ニトリル化合物としては、ジシアノペンタン、ジシアノヘキサン、(ブチルアミノ)アセトニトリル、(ジメチルアミノ)プロピオニトリル、ヘキシンニトリルなどが挙げられる。
　本発明のさらなる形態を図２を用いて説明する。図２Ｂは核酸分析用反応デバイスの基板201にサンプル固定層202が積層され、サンプル固定層202上に核酸試料203が結合している状態を示し、図２Ａは核酸試料203がサンプル固定層202に結合している状態を側面から観察した状態を示す。核酸試料が結合している領域以外の領域にはブロッキング層205が形成されている。図１に示す核酸分析用反応デバイスとの違いは、担体104を用いない点であり、担体に結合していない遊離の核酸試料203がサンプル固定層に固定される。米国特許第7115400B1号明細書（特許文献３）に示された方法に従い、基板上で増幅反応を行うことで基板201上に形成させたサンプル固定層202の任意の位置に核酸試料203を固定することができる。また、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1996, Vol. 93, pp. 10614-10619（非特許文献８）に示されるスポッティング方式を用いて固定することもできる。核酸試料203の固定後にブロッキング層205を導入することで、本発明の核酸分析用反応デバイスを製造することができる。用いる基板、サンプル固定層、ブロッキング層は図１に示す核酸分析用反応デバイスと同様である。
　次に、本発明の核酸分析用反応デバイスの製造方法を図３を用いて説明する。基板301（図３Ａ）上に無機酸化物の膜を形成させて、サンプル固定層302を成膜する（図３Ｂ）。成膜方法に特に制限はないが、膜厚バラツキが少ない薄膜形成が可能なスパッタリングや蒸着方法を用いることができる。サンプル固定層302上に核酸試料303を表面に有する担体304を含む水溶液を一定時間保持することで、核酸試料303を固定する（図３Ｃ）。固定の条件は限定されないが、例えば、担体304を含む水溶液を４℃～８０℃で、１秒～24時間保持すればよい。この際の担体304を含む水溶液中の担体密度は、核酸分析の目的等により適宜決定すればよいが、例えば、103～106個/μLである。核酸試料303の無機酸化物への固定反応は、水溶液中の水酸化物イオンの配位反応と競争する。核酸試料303の固定化率を高めるためには、水溶液中の水酸化物イオン濃度を減らすことができる酸性条件下、すなわちpH1～7、好ましくはpH3～7で行うことが望ましい。この際、核酸試料303を表面に有する担体304が高密度でサンプル固定層302に核酸試料を介して結合する。この際の担体の結合量は、核酸分析の目的等により適宜決定すればよいが、例えば、サンプル固定層１cm2当たり、102～106個、好ましくは104～106個であり、サンプル固定層１cm2当たりに結合する核酸試料は、106～10180分子、好ましくは1010～10150分子である。
　次いで、サンプル固定層上の核酸試料303を介して担体304が結合した領域以外の領域にブロッキング層を形成させる（図３Ｄ）。ブロッキング層の形成は、ブロッキング層形成に用いる化合物の溶液をサンプル固定層上に一定時間保持することにより行う。ブロッキング層形成の条件は限定されないが、例えば、ブロッキング層形成に用いる化合物を２０℃～８０℃で、１秒～24時間保持すればよい。
　本発明の核酸分析用反応デバイスのさらなる製造方法を図４を用いて説明する。図３に示す製造方法との違いは、核酸試料403の固定とブロッキング層405の導入を同時に行う点である。サンプル固定層402上に核酸試料403を表面に有する担体404とブロッキング層405を形成するための化合物の両方を含む水溶液を一定時間保持することで、核酸試料403の固定とブロッキング層405形成を同時に行う（図４Ｃ)。担体404の結合条件、ブロッキング層形成の条件は、上記と同様である。
　上記の図３及び図４は、核酸試料を担体表面に結合させて、サンプル固定層に結合させる場合を示しているが、図２に示す核酸分析用反応デバイスのように、担体に結合させない遊離の核酸試料をサンプル固定層に結合させてもよい。この場合の、サンプル固定層１cm2当たりに結合する核酸試料は、106～10180分子、好ましくは1010～10150分子である。
　本発明のさらなる形態を図５を用いて説明する。図５の核酸分析用反応デバイスは、図１及び図２に例示する核酸分析用反応デバイスを流路内に含むように作製したデバイスである。図５Ａは核酸分析用反応デバイスの全体を示し、図５Ｂは図５Ａ中の断面Ｘにおける断面図を示す。図５の核酸分析用反応デバイスは、液注入口508と液排出口509並びに液を送液するための流路511を有する一体型反応デバイスである。ここで、一体型反応デバイスとは、反応に用いる試薬溶液以外の必要なコンポーネントが一体として形成され、必要な試薬を反応デバイスの流路に供給することにより一連の反応を行うことができるデバイスをいう。該核酸分析用反応デバイスは、核酸試料503を表面に有する担体504あるいは遊離の核酸試料が流路内に含まれるように設計されており、サンプル固定層502が形成され、核酸試料503を表面に有する担体504あるいは遊離の核酸試料が結合する基板501の他、第２の基板507を含む。図５に示す核酸分析用反応デバイスにおいて、サンプル固定層502が形成され、核酸試料503を表面に有する担体504あるいは遊離の核酸試料が結合する基板を第１の基板という。第１の基板501と第２の基板507との間に流路511が形成される。該流路は核酸分析のための反応に必要な試薬が供給される流路として機能するとともに、反応が起こる反応チャンバーとして機能する。また、流路のための空間を確保するために、第１の基板501と第２の基板507の間にはスペーサ506が備えられる。すなわち、図５の核酸分析用反応デバイスは、基板（第１の基板）501と一部がくり貫かれたスペーサ506と第２の基板507が貼り合わされた構造である。流路511は、基板501とスペーサくり貫き部と第２の基板507より形成される。反応溶液は、液注入口508よる注入されて、液排出口509より排出される。液注入口508及び液排出口509の開口部は、核酸分析用反応デバイスの流路と連絡しており、第１の基板の上面でもよいし、側面にあってもよい。また、注入口508及び液排出口509の開口部は、スペーサ506にあっても、第２の基板507にあってもよい。第２の基板507の材質に特に制限はないが、第２の基板507が温調素子と接触するような核酸分析装置に用いられる場合は、シリコン、ガラス、サファイア、石英などの無機材料や、SUS、銅、アルミニウムなどの金属材料、又はカーボンファイバや無機フィーラを配合した高熱伝導性の樹脂材料が挙げられる。第２の基板507の厚さも特に制限はないが、熱伝導性を高めるために、厚さ10mm以下が望ましい。
　スペーサ506の材質に特に制限はないが、特開2006-87974号公報（特許文献２）に示される様な、熱硬化性、光硬化性などのエポキシ接着剤、アクリル接着剤などを用いることができる。また、アクリル樹脂をベースとした両面テープなどを用いても良い。より好ましい材料として、ガラス、石英、サファイア、又は透明樹脂との接着強度が高いポリジメチルシロキサンを挙げることができる。スペーサ厚さに特に制限はないが、厚さが薄いほど流路内容量を低減することができ、使用する試薬量を少なくすることができる。スペーサ506は厚さ1mm以下が望ましい。
　図５に示す核酸分析用デバイスを一体型核酸分析用反応デバイスやフローチップと呼ぶことがある。図１及び図２に示す一体型核酸分析用反応デバイスは、図５に示す一体型核酸分析用反応デバイス又はフローチップの部分を示した図ということもできる。
　図５では、流路が３つ形成されたデバイスの例を示すが、流路の数は限定されず、例えば、１～1000個、１～100個、１～10個あればよい。流路の数が多い場合、一度に多数の反応を行うことができ、高スループットの分析が可能なデバイスとして用いることができる。
　本発明の図５に示す一体型反応デバイスの製造方法の一例を図６を用いて説明する。両面に離型フィルム612を有するスペーサ606（図６Ａ）を型抜きプレス加工やレーザ加工などを用いて内部をくり貫き、流路部となるくり貫き部613を形成する（図６Ｂ）。片面の離型フィルム612を剥離した後（図６Ｃ）、サンプル固定層602を有する基板601（図６Ｘ及び図６Ｙ）とスペーサ606を貼り合せる（図６Ｄ）。サンプル固定層602とスペーサ606の密着力を高めるために、貼り合せ直前にサンプル固定層602の表面、及びスペーサ606の表面を、エキシマ処理、酸素プラズマ処理、又は大気圧プラズマ処理しても良い。また、貼り合せ後に加熱処理を行い密着性を高めても良い。次に、残っている離型フィルム612を除去（図６Ｅ)した後に、同様の処理を行い第２の基板を貼り合せる（図６Ｆ)。液注入口508（図５）より核酸試料603を表面に有する担体604又は遊離の核酸試料を含む水溶液を注入した後、一定時間保持してサンプル固定層602上に核酸試料603を固定する（図６Ｈ)。この際、核酸試料603を表面に有する担体604又は遊離の核酸試料がサンプル固定層上にほぼ均一に固定される。その後、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる化合物の水溶液を同様に注入してブロッキング層605を形成する（図６Ｉ)。
　このようにして作製した核酸分析用反応デバイスを、核酸分析装置にセットし核酸分析を行う。本発明は、本発明の核酸分析用反応デバイスをセットして核酸反応を行うための核酸分析装置も包含する。本発明の核酸分析装置は、少なくとも本発明の核酸分析用反応デバイス、前記核酸分析用反応デバイスに試薬を含む溶液を注入する手段、前記核酸分析用反応デバイスに保持された試料を観察する検出手段を含む。さらに、前記核酸分析装置は、少なくとも本発明の核酸分析用反応デバイス、該デバイスを固定するためのホルダユニット、該デバイスとホルダユニットを移動させるステージユニット、試薬を供給するための試薬供給ユニット、試料観察用の検出ユニットを含む。試薬を供給するための試薬供給ユニットは、以下に示す、試薬容器、送液ユニット、ノズル、ノズル搬送ユニットを含む。
　本発明の核酸分析装置の一例を図７を用いて説明する。核酸分析装置714は、本発明の核酸分析用反応デバイス715；核酸分析用反応デバイス715を固定し、なおかつ核酸分析用反応デバイス715の温度を調整することができるホルダユニット716；核酸分析用反応デバイス715とホルダユニット716を移動させるステージユニット717；複数の試薬や洗浄水が収容された試薬容器718；試薬容器718に収容された試薬を吸引し核酸分析用反応デバイス715に注入するための送液ユニット719；試薬の吸引・吐出の際、実際に試薬容器718や核酸分析用反応デバイス715にアクセスするノズル720；ノズル720を搬送させるノズル搬送ユニット721；核酸分析用反応デバイス715に固定された試料を観察するための検出ユニット722；及び廃液を収容する廃液容器723等を有する。検出ユニットは、例えば、蛍光検出装置からなり、ステージユニット上の核酸分析用反応デバイスに励起光を照射し、発生した蛍光を検出することができる。
　本発明の核酸分析装置は以下の通りに動作する。まず、測定対象の核酸試料を保持した核酸分析用反応デバイス715をホルダユニット716に設置する。次に、ノズル720が試薬容器718にアクセスし、試薬を送液ユニット719により吸引する。ノズル720は、ノズル搬送ユニット721により核酸分析用反応デバイス715上面に搬送され、核酸分析用反応デバイス715に試薬を注入する。そして、ホルダユニット716にて、核酸分析用反応デバイス715の流路内に含まれた核酸試料と試薬を温度調整することで反応が起こる。反応した核酸試料を観察するために、核酸分析用反応デバイス715をステージユニット717にて移動させ、励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料の蛍光を検出する。この際、好ましくは、核酸試料又は核酸試料を表面に有する担体が固定された側の基板を通して励起光を当て、蛍光を検出すればよい。検出後、核酸分析用反応デバイス715を微小に動かし同様の方法で検出、という動作を複数回繰り返す。全ての検出領域で観察が終了したら、試薬容器718に収容された洗浄水を送液ユニット719により吸引し、核酸分析用反応デバイス715へ注入することで、核酸分析用反応デバイス715の流路内を洗浄する。また、別の試薬を注入し検出、という動作を複数回繰り返すことで、核酸試料を読み取ることが出来る。核酸分析装置は、コンピュータにより制御され、上記動作を自動的に行うことができる。
　本発明の核酸分析装置を用いて種々の核酸分析を実施することができ、例えば、DNA配列決定やハイブリダイゼーションを行うことができる。特に本発明の核酸分析装置を用いてDNA配列決定（DNAシークエンス）を行うことができる。DNAシークエンスの方法は限定されないが、段階的ライゲーションを利用した方法（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)によるDNA配列決定が好ましい。段階的ライゲーション法とは、微粒子上の１本鎖DNAを鋳型に蛍光標識されたプローブを順次結合させ、２塩基ずつ配列を決定する手法をいう。該方法により、１サイクルで数十～数百bpの解読を行うことができ、１ランで数十Gbのデータを解析することが可能である。段階的ライゲーション法においては、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを繰り返しハイブリダイズすることで並列シーケンシングすることができる。段階的ライゲーションを利用した配列決定法は、例えばScience 2005, vol. 309, pp.1728-1732の記載に従って行うことができる。
［実施例２］
　本発明の核酸分析装置を用いた核酸分析方法を説明する。分析方法はScience 2005, vol. 309, pp.1728-1732（非特許文献２）に開示されている方法に準じる。
（１）ライブラリー作製
　測定対象の核酸試料をDneasy Tissue kit(QIAGEN社)を用いて精製した後、核酸試料を断片化した。断片化DNAに対して、End-it DNA End Repair kit(EpiCentre社)を用いてテンプレートDNAの両端にタグ配列を付加した。タグ配列が付加したテンプレートを精製した後、スペーサ配列が付加されたテンプレートをエキソヌクレアーゼで処理して、RCA(Rolling Circle Amplification)用のテンプレートを作製した。得られたテンプレートに対して、ランダムヘキサマーを用いたRCAを行いテンプレートを増幅した。増幅産物をMicrocon-30(Millipore社)で精製した後、制限酵素で断片化した。断片化された産物に対してゲル精製を行い、70塩基長のタグライブラリーを抽出した。抽出されたタグライブラリーに対してプライマをライゲーションした後PCR増幅を行いライブラリーを作製した。
（２）エマルジョンPCR
　Light mineral oil(Sigma社)からなるオイル溶液にPCR溶液、MyOne（商標）　paramagnetic streptavidin磁気ビーズ(Dynal社)、及びライブラリー溶液を加えてエマルジョンPCRを行った。増幅溶液に対して、界面活性剤を含む溶液を加えて高速遠心を行った後、マグネットを用いて溶媒置換を行い、表面に数多くの増幅産物を持つ測定用のDNAを表面に有するビーズ水溶液を作製した。
（３）核酸分析用反応デバイスへのDNAを表面に有するビーズの固定
　（２）で得られた核酸試料付きビーズに5'がリン酸化されたプライマをライゲーションし、ビーズ上の核酸試料末端に固定用の官能基であるリン酸基を付加した。サンプル固定層としてチタニアを持つ本発明の核酸分析用反応デバイスに5'がリン酸化された核酸試料付きビーズ水溶液を注入した。サンプル固定層を有する面が外側になるように遠心を行った後、サンプル固定層を有する面を下側にして４０℃で１２時間保持して、チタニア上にDNA付きビーズを固定した。
（４）ブロッキング層導入
　ソディウムドデシルサルファイト水溶液を液注入口より注入した後、４０℃で１２時間保持して、チタニア上にブロッキング層を導入した。
（５）核酸分析
　本発明の核酸分析装置714に核酸試料を表面に有するビーズが固定された核酸分析用反応デバイスを設置した。アンカープライマを含む水溶液をノズル720を介して核酸分析用反応デバイス715に注入した。ホルダユニット716を用いて反応デバイス715内の水溶液を60℃に加熱した後、42℃に保持した。配列決定用の色素でラベル化されたプライマ、ライゲーション酵素を含む水溶液を注入した後、35℃で30分保持した。バッファーで反応デバイス715内の流路を洗浄し、未反応のラベル化プライマを除去した。核酸分析用反応デバイス715をステージユニット717にて移動させた後、検出ユニット722にて励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料付きビーズに導入された蛍光を検出した。ライゲーション反応と洗浄、及び蛍光検出を複数サイクル繰り返した後、DNAウラシル化とエンドヌクレアーゼを用いてアンカープライマとラベル化プライマのライゲーション産物を分解除去した。新たなアンカープライマによるライゲーション反応、洗浄、検出の繰り返し、及びさらなるライゲーション産物の分解除去から新たなアンカープライマを用いた一連の検出を繰り返し行いDNA配列を決定した。
　本発明の核酸分析用反応デバイス又は核酸分析装置を用いて、種々の核酸反応を行うことができ、DNAシーケンス等の核酸の分析を行うことができる。
101,201,301,401,501,601　基板
102,202,302,402,502,602　サンプル固定層
103,203,303,403,503,603　核酸試料
104,304,404,504,604　担体
105,205,305,405,505,605　ブロッキング層
506,606　スペーサ
507,607　第２の基板
508　液注入口
509　液排出口
510　流路エッジ部
511　流路
612　離型フィルム
613　くり貫き部
714　核酸分析装置
715　核酸分析用反応デバイス
716　ホルダユニット
717　ステージユニット
718　試薬容器
719　送液ユニット
720　ノズル
721　ノズル搬送ユニット
722　検出ユニット
723　廃液容器
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (20)

  1. 　基板と、
    該基板上のサンプル固定層と、
    該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、
    該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス。
  2. 　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  3. 　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の核酸分析用反応デバイス。
  4. 　ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  5. 　ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の核酸分析用反応デバイス。
  6. 　請求項１に記載の核酸分析用反応デバイスであって、
    サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第１の基板；
    　第２の基板；並びに
    　流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第１の基板と第２の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
    前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析用反応デバイス。
  7. 　スペーサの厚さが１mm以下である、請求項６記載の核酸分析用反応デバイス。
  8. 　(i)　基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
    (ii)　該サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、並びに
    (iii)　該核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。
  9. 　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
  10. 　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項９に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
  11. 　ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
  12. 　ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選択される、請求項１１記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
  13. 　(ii)　サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、と(iii)　核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程とが同時に行われる、請求項９に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法。
  14. 　請求項８に記載の核酸分析用反応デバイスの製造方法であって、
    (a)　第１の基板上にサンプル固定層を形成させる工程、
    (b)　第１の基板と第２の基板を、流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを介して貼り合わせる工程、
    (c)　第１の基板、スペーサ若しくは第２の基板に開口している前記流路と連絡している液注入口から核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体を含む溶液を注入し、前記サンプル固定層上に核酸試料又は表面に核酸試料を有する担体を固定する工程、
    (d)　前記液注入口からブロッキング層を形成し得る化合物の溶液を注入し、前記核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層を導入する工程、を含み、該サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイスの製造方法。
  15. 　核酸を分析する核酸分析装置であって、少なくとも
    基板と、該基板上のサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている核酸分析用反応デバイス；
    前記核酸分析用反応デバイスに試薬を含む溶液を供給する試薬供給ユニット；並びに
    前記核酸分析用反応デバイスに保持された試料を観察する検出ユニット
    を含み、前記サンプル固定層が無機酸化物により形成されている核酸分析装置。
  16. 　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項１５に記載の核酸分析装置。
  17. 　無機酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、及びそれらの少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項１６に記載の核酸分析装置。
  18. 　ブロッキング層がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項１５に記載の核酸分析装置。
  19. 　ブロッキング層がカルボン酸化合物、硫酸化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも２種類の混合物からなる群から選ばれる、請求項１８記載の核酸分析装置。
  20. 　請求項１５に記載の核酸分析装置であって、
    核酸分析用反応デバイスが、
    サンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層とを備え、前記サンプル固定層が無機酸化物で形成されている、第１の基板；
    　第２の基板；並びに
    　流路を形成するためのくり貫き部を有するスペーサを含み、スペーサを介して第１の基板と第２の基板がそれらの間に流路を形成するように貼り合わされ、該流路内にサンプル固定層と、該サンプル固定層上に固定された核酸試料若しくは表面に核酸試料を有する担体と、該核酸試料若しくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が存在し、
    前記流路に連絡している液注入口及び液排出口を供えた、核酸分析反応用デバイスである、核酸分析装置。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014021081A (ja) * 2012-07-24 2014-02-03 Hitachi High-Technologies Corp 分析用マイクロ流路チップの製造方法
JP6158042B2 (ja) * 2013-10-31 2017-07-05 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析用基板、及び核酸分析用フローセル
CN113549525B (zh) * 2014-11-04 2024-08-06 凸版印刷株式会社 核酸导入方法、核酸检测方法、生物体成分解析方法及试剂盒、生物体成分定量用阵列器件
KR101844048B1 (ko) 2015-07-22 2018-03-30 주식회사 스몰머신즈 분자 고정화 패턴 및 그를 형성하는 방법
WO2019207669A1 (ja) * 2018-04-25 2019-10-31 株式会社 日立ハイテクノロジーズ 核酸分析用基板、及び核酸分析用フローセル

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003009859A (ja) * 2001-05-23 2003-01-14 Nippon Sheet Glass Co Ltd 核酸固定用基板、核酸固定用基板の製造方法、及びガラスプレート、並びに核酸の解析方法
JP2006064599A (ja) * 2004-08-27 2006-03-09 Kyocera Corp 生体物質固定化基板
WO2007032236A1 (ja) * 2005-09-16 2007-03-22 Yamatake Corporation バイオチップ用基板、バイオチップ、バイオチップ用基板の製造方法、及びバイオチップの製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
JP3605039B2 (ja) * 2001-01-09 2004-12-22 株式会社日立製作所 核酸マイクロアレイ、その製造方法及びそれを用いた核酸検出方法
JP4148778B2 (ja) * 2001-03-09 2008-09-10 バイオミクロ システムズ インコーポレイティッド アレイとのミクロ流体的インターフェース機器
JP2006087974A (ja) 2004-09-21 2006-04-06 Ntt Advanced Technology Corp 微小流路基板と微小流路基板製造方法
JP2009538123A (ja) 2006-04-19 2009-11-05 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ゲル非含有ビーズベースの配列決定のための試薬、方法およびライブラリー

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003009859A (ja) * 2001-05-23 2003-01-14 Nippon Sheet Glass Co Ltd 核酸固定用基板、核酸固定用基板の製造方法、及びガラスプレート、並びに核酸の解析方法
JP2006064599A (ja) * 2004-08-27 2006-03-09 Kyocera Corp 生体物質固定化基板
WO2007032236A1 (ja) * 2005-09-16 2007-03-22 Yamatake Corporation バイオチップ用基板、バイオチップ、バイオチップ用基板の製造方法、及びバイオチップの製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GNAUCK M. ET AL.: "Carboxy-Terminated Oligo (ethylene glycol)-Alkane Phosphate: Synthesis and Self-Assembly on Titanium Oxide Surfaces.", LANGMUIR, vol. 23, no. 2, 2007, pages 377 - 381 *
ZHU N. ET AL.: "Electrochemical detection of DNA hybridization using methylene blue and electro- deposited zirconia thin films on gold electrodes.", ANALYTICA CHIMICA ACTA, vol. 510, no. 2, 2004, pages 163 - 168 *

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