WO2019207669A1 - 核酸分析用基板、及び核酸分析用フローセル - Google Patents

核酸分析用基板、及び核酸分析用フローセル Download PDF

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nucleic acid
acid analysis
substrate
flow cell
spot
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奈良原　正俊
小林　紀子
雪夫 小野
板橋　直志
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株式会社 日立ハイテクノロジーズ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analysis substrate and a nucleic acid analysis flow cell.
  • a cDNA fragment sample synthesized by performing a reverse transcription reaction from a DNA fragment or RNA sample for sequencing in advance is prepared, and a dideoxy reaction is performed by a well-known Sanger method. Electrophoresis is performed, the molecular weight separation development pattern is measured, and the base sequence is determined.
  • Non-Patent Document 1 PCR is performed on microparticles using microparticles as a carrier for carrying DNA fragments. Thereafter, fine particles carrying PCR-amplified DNA fragments are put on a plate having a large number of holes in which the hole diameter is adjusted to the size of the fine particles, and read by a pyrosequencing method.
  • Non-Patent Document 2 a microparticle is used as a carrier for supporting a DNA fragment, and PCR is performed on the microparticle. Thereafter, the microparticles are dispersed and fixed on the glass substrate, an enzyme reaction (ligation) is performed on the glass substrate, a fluorescent dye is incorporated, and the sequence information of each fragment is obtained.
  • ligation enzyme reaction
  • Non-Patent Document 3 a large number of DNA probes having the same sequence are fixed on a substrate.
  • a DNA probe sequence and an adapter sequence of a complementary strand are added to the end of each DNA sample fragment.
  • the sample DNA fragments are immobilized on the substrate randomly one molecule at a time. In this case, the DNA elongation reaction does not occur on the substrate, and after loading the substrate with the fluorescent dye, the unreacted substrate is washed and the fluorescence is detected to obtain the sequence information of the sample DNA.
  • Non-Patent Document 4 discloses a sequence technique using a substrate in which measurement arrays are arranged in a lattice pattern on a silicon wafer. After the measurement sample DNA is fragmented, a plurality of circular templates derived from the sample DNA are prepared through cleavage with restriction enzymes and insertion of adapter sequences. A polymerase enzyme is added to the obtained circular template to produce a DNA ball in which measurement sequences derived from sample DNA are repeatedly connected. By loading the obtained solution containing the DNA balls onto a silicon wafer in which the binding sites are arranged in a crid shape, a measurement substrate in which measurement samples are arranged in a grid is manufactured. A ligation reaction is performed on the measurement substrate thus obtained to obtain an array of sample DNA.
  • Patent Document 1 spots to which sample DNA binds are arranged in a grid on a substrate.
  • a silicon wafer is used as the substrate, and is made by a photolithography technique and an etching technique.
  • HMDS Hexamethyldisizone
  • a positive resist is applied.
  • HMDS at the bottom of the opening is removed using oxygen plasma.
  • the wafer is held in the aminosilane gas phase, and aminosilane is introduced into the bottom of the opening.
  • dicing is performed to cut out the substrate.
  • a cover glass is pasted through a polyurethane adhesive to produce a flow cell for nucleic acid analysis.
  • aminosilane having high hydrophilicity and DNA immobilization is used as a DNA ball immobilization spot and hydrophobic HMDS that prevents adsorption of DNA is used in other regions, DNA solution is naturally introduced when a solution containing DNA balls is introduced onto a substrate. It makes it possible to fix the ball only on the spot.
  • aminosilane is coated on a slide glass, activated with a divalent cross-linking reagent 1,4-diphenylen-diisothiocynate, and then the 5 ′ end is aminated using a custom spotting apparatus.
  • DNA oligomers are arranged in a lattice pattern. Thereafter, the DNA oligomer and the DNA sample are hybridized to fix the DNA sample in a lattice shape.
  • the immobilization rate in this case is the ratio of the spot where only one DNA sample is immobilized with respect to the spot on the substrate.
  • the adjacent DNA sample is mixed and fixed at the time of detection because it is fixed in a row with the adjacent DNA sample. There is a problem that accuracy is lowered.
  • the present invention solves the above-mentioned problems of the conventional substrate, and the DNA sample is highly efficiently and densely separated and firmly fixed to each other without being peeled off during the sequence reaction.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid analysis substrate and a nucleic acid analysis flow cell that increase the number of DNA samples that can be analyzed per unit and that have high analysis accuracy.
  • the present invention provides a DNA sample that can be analyzed per unit area with high efficiency, high density, and separation and fixation of the samples, without causing the DNA samples to peel off during the sequence reaction.
  • the present invention has completed the provision of a nucleic acid analysis substrate and a nucleic acid analysis flow cell with an increased number of samples and high analysis accuracy.
  • the present application includes means for solving the above-described problem.
  • a region having a spot on which a nucleic acid sample is fixed in a nucleic acid analysis substrate used in a nucleic acid analyzer for determining a nucleic acid base sequence, a region having a spot on which a nucleic acid sample is fixed;
  • a nucleic acid analysis substrate and a flow cell for nucleic acid analysis characterized by comprising a region having a hydrophilic blocking film and a coating film containing a plurality of amino groups on the spot.
  • the DNA sample solution can be fixed on the spot by bringing the DNA sample solution into contact with the substrate and holding it for a predetermined time. At this time, by providing a hydrophilic blocking film in an area where there is no spot, the accessibility of the DNA sample to the substrate can be improved and the adsorption of the DNA sample to this area can be prevented, and the DNA sample is fixed to the existing spot. It is possible to increase the proportion of the spots that have been made.
  • the present invention is also characterized in that the hydrophilic blocking layer comprises a hydrophobic film and a hydrophilic blocking film. Since the hydrophobic film becomes the base film of the hydrophilic blocking layer, it is difficult for the sequence solution to penetrate the interface between the substrate and the hydrophilic blocking layer, and the interface between the hydrophobic film and the hydrophilic blocking film.
  • the hydrophilic blocking layer can be prevented from peeling off.
  • the present invention is characterized in that the coating film containing an amino group is made of a dendritic polymer. Since the dendritic polymer can have many DNA-binding functional groups in the molecule, the amino group density on the spot can be increased. Since the high amino group density can increase the binding density between the DNA sample and the spot, the DNA sample can be prevented from being peeled off during the sequencing reaction. In addition, a high amino group density can increase the contact probability between the DNA sample and the binding functional group on the spot, and can also increase the ratio of the spot where the DNA sample is fixed to the number of spots on the substrate.
  • the present invention is characterized in that a coating film containing an amino group is coated on the spot through a covalent bond.
  • the strong covalent bond can prevent the coating film from coming off the spot during the sequence.
  • the present invention is characterized in that the hydrophilic blocking film is formed on the hydrophobic film through a hydrophobic bond. Introducing a hydrophilic blocking layer in areas without spots using a hydrophobic bond formed between a hydrophobic group and a hydrophobic film by a simple method of contacting a surfactant solution having a hydrophobic group on a substrate Can do.
  • the hydrophilic blocking membrane is selected from the group of an anionic surfactant having a hydrophobic group in the molecule, an amphoteric surfactant, or at least a mixture thereof.
  • An anionic surfactant has a hydrophobic group in the molecule and a hydrophilic group that is negatively charged when dissolved in water.
  • the hydrophobic group is bonded to the hydrophobic film on the substrate, and the hydrophilic group on the opposite side changes the outermost surface on the substrate to be hydrophilic.
  • the negatively charged hydrophilic group on the substrate prevents the negatively charged DNA sample from adsorbing to this region by electrical repulsion.
  • the amphoteric surfactant of the present invention has a functional group that is negatively charged in the alkaline region and a functional group that is positively charged in the acidic region. Similarly, the adsorption of the DNA sample to the region where there is no spot can be prevented from the negatively charged hydrophilic group. Since the amphoteric surfactant has higher solubility in water than the anionic surfactant, the concentration in the solution brought into contact with the substrate can be increased, and a higher density hydrophilic blocking film can be formed.
  • the present invention is characterized in that the spots are arranged in a grid pattern.
  • the spot density can be increased by arranging in a grid pattern.
  • the present invention is characterized in that a pre-nucleic acid analysis substrate, a hollow sheet and a cover glass are bonded together. By reducing the thickness of the hollow sheet, the amount of sample and reagent required for one analysis can be reduced, and the cost required for one analysis can be reduced.
  • FIG. 1 shows an example of a reaction substrate for nucleic acid analysis of the present invention.
  • a spot 102 is formed on the substrate 101, a coating film 104 including a plurality of amino groups is formed on the spot 102, and a hydrophilic blocking layer 103 is coated on a region where the spot 102 is not present.
  • the DNA sample can be fixed on the spot at a high density.
  • the material used for the substrate 101 is not particularly limited, and examples thereof include inorganic materials such as silicon, glass, quartz, sapphire, ceramic, ferrite, alumina, and diamond, or metal materials such as aluminum, SUS, titanium, and iron, and phenol.
  • Resin epoxy resin, melamine resin, unsaturated polyester resin, alkyd resin, polyurethane, thermosetting polyimide, transparent polyimide, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polystyrene, polyvinyl acetate, ABS resin, AS resin, Acrylic resin, polyamide, nylon, polyacetal, polycarbonate, modified polyphenylene ether, polybutylene terephthalate, polyethylene terephthalate, glass fiber reinforced polyethylene terephthalate Resin materials such as cyclic polyolefin, polyphenylene sulfide, polysulfone, polyethersulfone, amorphous polyarylate, liquid crystal polymer, polyetheretherketone, and mixed materials thereof, and glass fiber or carbon fiber reinforced inorganic materials can also be used.
  • the spot 102 is formed by using a spotting device or a lift-off process.
  • the material used is preferably a material that can be formed on the substrate via a covalent bond.
  • a material when using an inorganic material such as silicon, glass, quartz, sapphire, ceramic, ferrite, or alumina having an oxide film on the substrate surface, or a metal material such as aluminum, SUS, titanium, or iron, silane is particularly used.
  • a coupling material is desirable.
  • silane coupling materials those having a highly reactive functional group that can form a coating film containing an amino group via a covalent bond are preferable. Examples of such a functional group include a vinyl group.
  • Ethoxysilane and methoxysilane having an epoxy group, styryl group, methacryl group, acrylic group, amino group, ureido group, isocyanate group, isocyanurate group, and mercapto group in the molecule.
  • the substrate may be formed using silicon and using alkenes or alkynes.
  • a cationic polymer such as polydiallyl diammonium or polylysine may be used.
  • the diameter of the spot 102 is preferably a spot size at which a single DNA sample can be fixed at a high fixing rate and the detection sensitivity is good.
  • the diameter size of such a spot is preferably a size larger than half of the DNA sample, for example, a diameter of 25 nm or more is mentioned, but a better spot diameter size is 50 nm or more and 1000 nm or less.
  • the size of the DNA sample is preferably larger than 1 ⁇ 2 of the spot diameter. If the size of the DNA sample is smaller than 1 ⁇ 2 of the spot diameter, a plurality of DNA samples may be fixed to one spot, which may cause a problem of erroneous detection.
  • the size of a DNA sample is as small as less than 50 nm, but the amplified DNA size used in the present invention is preferably 50 nm or more in order to obtain good detection sensitivity.
  • the pitch which is the distance between the centers of the spots, is slightly larger than at least the size of the DNA sample to be used. If the pitch is smaller than the size of the DNA sample, it may be fixed across a plurality of spots, which may cause a problem of the previous false detection. On the other hand, if the pitch is too large, the density of DNA samples to be fixed is lowered, which may cause a problem that the number of DNA samples that can be analyzed at one time is reduced. Therefore, it is desirable that the pitch is 50 nm or more and 1000 nm or less, like the spot size.
  • the hydrophilic blocking layer and the hydrophilic blocking film refer to a layer or film having hydrophilicity and difficult to adsorb nucleic acids such as DNA. It is preferable that the hydrophilic blocking layer 103 can prevent the DNA sample from being adsorbed to the substrate 101 and can enhance the accessibility of the DNA sample to the substrate to increase the fixation rate of the DNA sample to the spot.
  • a material for example, a material capable of making a negatively charged hydrophilic group the outermost surface is preferable.
  • the negatively charged hydrophilic group on the substrate prevents the negatively charged DNA sample from adsorbing to this region by electrical repulsion.
  • a silane coupling material whose terminal is treated with polyethylene glycol or carboxylic acid, such as PEG-Silane, can be mentioned.
  • polyethylene glycol or A hydrophilic functional group such as carboxylic acid may be introduced.
  • the coating film 104 containing a plurality of amino groups increases the contact ratio between the DNA sample and the functional groups on the spot when the DNA sample is fixed, and also prevents the DNA sample from being peeled off during analysis, so that the surface amino group density is high. It is desirable to use materials. As such a coating film, it is desirable to use, for example, polyamines having a functional group introduced on the spot and a plurality of amino groups in one molecule.
  • the polyamine include spermidine, putrescine, spermine and the like, and dendritic polymers having many amino groups present in the molecule are particularly preferable.
  • An example of such a dendritic polymer is a polyamidoamine dendrimer.
  • the polyamidoamine dendrimer has an alkyldiamine core and a tertiary amine branched structure.
  • the core and molecule include ethylenediamine, 1,12-diamidedecane, 1,4-diaminobutane, cystamine, and 1,6-diaminohexane.
  • Dendritic molecules can increase the functional groups in the molecule exponentially by increasing the number of generations surrounding the core molecule.
  • the amino group density on the coating surface can be greatly increased by using dendritic molecules from the first generation.
  • polyamines are desirable to form a covalent bond with the functional group on the spot from the viewpoint of preventing peeling at the interface between the spot and the coating film.
  • a material for forming such a spot a material having a functional group capable of reacting with an amino group in the molecule is desirable.
  • a vinyl group, an epoxy group, a methacryl group, an acrylic group, an isothiocyanurate group, an isocyanate group examples include silane coupling materials having an isocyanurate group, alkenes, alkynes, and the like.
  • an amine-reactive functional group may be introduced onto the spot using a polyvalent crosslinking reagent.
  • Examples of such amine-reactive functional groups include isothiocyanurate groups, isocyanate groups, isocyanurate groups, sulfonyl chloride groups, aldehyde groups, carbodiimide groups, acrylazide groups, fluorobenzene groups, carbonate groups, and N-hydroxy groups.
  • Examples include succinimide ester groups, imide ester groups, epoxy groups, fluorophenyl ester groups, and acid anhydrides.
  • FIG. 2 shows a further example of the reaction substrate for nucleic acid analysis of the present invention.
  • the hydrophilic blocking layer 203 includes a hydrophobic film 205 and a hydrophilic blocking film 206.
  • the hydrophobic film 205 covers the entire region where the spot 202 is not present, as well as the side surface of the spot 202.
  • the hydrophobic film 205 may cover the side surface of the coating film 204 containing amino groups.
  • a hydrophobic membrane has a property of repelling water. For this reason, since the hydrophobic film 205 serves as a protective film for the spot 202, damage to the spot 202 due to the solution used in the analysis can be suppressed.
  • Examples of a material for forming such a hydrophobic film include a fluororesin, a fluorinated silane coupling material, an alkylsilane coupling material, and an alkylating material such as HMDS.
  • the hydrophilic blocking film 206 is introduced using a surfactant.
  • a surfactant has a hydrophobic group and a hydrophilic group in a molecule, and a hydrophilic blocking film 206 is introduced using a hydrophobic bond formed between the hydrophobic group and the hydrophobic film 205.
  • an anionic surfactant having a hydrophobic group in the molecule, an amphoteric surfactant, or a surfactant selected from a mixture of at least two of them is desirable.
  • anionic surfactants have hydrophilic groups that are negatively charged when dissolved in water.
  • the hydrophobic group is bonded to the hydrophobic film on the substrate, and the hydrophilic group on the opposite side changes the outermost surface on the substrate to be hydrophilic.
  • the negatively charged hydrophilic group on the substrate prevents the DNA sample from adsorbing to this region by electrical repulsion against a DNA sample having a phosphate group that is also negatively charged.
  • amphoteric surfactants have a functional group that is negatively charged in the alkaline region and a functional group that is positively charged in the acidic region.
  • the negatively charged hydrophilic group can prevent the DNA sample from being adsorbed to a spot-free region.
  • amphoteric surfactants are more soluble in water than anionic surfactants, so the concentration of surfactant in the solution in contact with the substrate can be increased, resulting in a denser hydrophilic blocking membrane. can do.
  • hydrophobic group contained in the anionic surfactant or amphoteric surfactant a long alkyl chain capable of forming a higher-density hydrophilic blocking film is desirable.
  • Examples of such an alkyl chain include an octyl group, a decyl group, a dodecyl group, a tetradecyl group, and an octadecyl group having a carbon chain length of 8 or more.
  • the hydrophilic group contained in the activator is desirably one that can prevent the adsorption of the DNA sample, and examples of such a hydrophilic group include a sulfonate group and a carbonate group.
  • anionic surfactant examples include N-lauroyl sarcosine sodium salt, lithium dodecyl sulfate, sodium dodecyl sulfate, sodium octadecyl sulfate, sodium octyl sulfate and the like.
  • amphoteric surfactants include N, N-dimethyl-N-dodecylglycine betaine, octyl sulfobetaine, caprylyl sulfobetaine, N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfone.
  • FIG. 3 shows an example for producing the nucleic acid analysis substrate of the present invention.
  • the present invention can be fabricated using a Lift-off process.
  • a lithographic material 307 is further coated (FIG. 3-b).
  • a material for forming the spot 302 is deposited (FIG. 3-d).
  • a material for forming the coating film 304 containing amino groups (FIG. 3E)
  • the lithography material 307 is removed.
  • a hydrophilic blocking film 306 is introduced by contacting a solution containing a surfactant (FIG. 3-g).
  • a surfactant is dissolved in a solution containing a DNA sample, and this solution is brought into contact with the substrate for nucleic acid analysis of the present invention.
  • the hydrophilic blocking film 306 may be introduced simultaneously with fixing the sample on the spot.
  • an example using a photolithography technique is shown, but a nanoimprint lithography technique may be used.
  • FIG. 4 shows a flow cell for nucleic acid analysis of the present invention.
  • a nucleic acid analysis substrate 409 a nucleic acid analysis substrate 409, a hollow sheet 411 having a hollow portion 410 in which a central portion is hollowed, and a cover glass 412 are bonded.
  • a hollow portion surrounded by the hollow portion 410, the nucleic acid analysis substrate 409, and the cover glass 412 serves as a flow path.
  • the inlet 413 and the outlet 414 serve as a liquid inlet / outlet.
  • the holes of the nucleic acid analysis substrate 409 are the inlet 413 and the outlet 414, but in another embodiment, the holes of the cover glass 412 may be the inlet and outlet. .
  • holes formed in the side surface of the hollow sheet 411 may serve as an inlet and an outlet.
  • the nucleic acid analysis flow cell thus prepared is set in a nucleic acid analyzer and subjected to nucleic acid analysis.
  • the nucleic acid analyzer 715 is a holder unit 717 that can fix the nucleic acid analysis flow cell 716 and the nucleic acid analysis flow cell 716 and can adjust the temperature of the nucleic acid analysis flow cell 716, and the nucleic acid analysis flow cell 716 and the holder unit.
  • the nozzle 721 that actually accesses the reagent container 719 and the nucleic acid analysis flow cell 716, the nozzle conveyance unit 722 that conveys the nozzle 721, and the sample fixed to the nucleic acid analysis flow cell 716 are observed.
  • Detection unit 723 and waste containing waste liquid With the container 724 and the like.
  • the detection unit includes, for example, a fluorescence detection device, and can irradiate a flow cell for nucleic acid analysis on the stage unit with excitation light to detect generated fluorescence.
  • the nucleic acid analyzer operates as follows. First, a flow cell 716 for nucleic acid analysis holding a nucleic acid sample to be measured is installed in the holder unit 717. Next, the nozzle 721 accesses the reagent container 719 and sucks the reagent by the liquid feeding unit 720. The nozzle 721 is transported to the upper surface of the nucleic acid analysis flow cell 716 by the nozzle transport unit 722 and injects the reagent into the nucleic acid analysis flow cell 716. The holder unit 717 reacts by adjusting the temperature of the nucleic acid sample and the reagent contained in the flow path of the nucleic acid analysis flow cell 716.
  • the nucleic acid analysis flow cell 716 is moved by the stage unit 718, and excitation light is applied to detect fluorescence of a plurality of nucleic acid samples in the detection region. In this case, it is preferable to detect fluorescence by applying excitation light through the substrate on the side where the nucleic acid sample is fixed. After the detection, the operation of moving the nucleic acid analysis flow cell 716 minutely and detecting in the same manner is repeated a plurality of times.
  • the washing water stored in the reagent container 719 is sucked by the liquid feeding unit 720 and injected into the nucleic acid analysis flow cell 716, thereby washing the flow path of the nucleic acid analysis flow cell 716.
  • a nucleic acid sample can be read by repeating the operation
  • the nucleic acid analyzer is controlled by a computer and can automatically perform the above operation.
  • DNA sequencing can be performed using the nucleic acid analyzer of the present invention, and for example, DNA sequencing and hybridization can be performed.
  • DNA sequencing DNA sequencing
  • the DNA sequencing method is not limited, but can be used for a step-by-step synthesis method using a reversible terminator (Sequencing by synthesis). After injecting the solution in which the DNA sample is dissolved into the flow cell for nucleic acid analysis of the present invention, the DNA sample is fixed on the spot by holding for a certain time. Thereafter, a sequence primer is hybridized to the fixed DNA sample, and then the base sequence is determined using the sequencing by synthesis method. By this method, tens to hundreds of bps can be decoded in one cycle, and tens of Gb data can be analyzed in one run.
  • the substrate for nucleic acid analysis was prepared according to the Lift-off process.
  • a silicon wafer was coated with HMDS and then baked to introduce a hydrophobic film.
  • a positive type EB resist ZP-520A7
  • exposure was performed using an EB photolithography apparatus (Elionix ELS-7500).
  • development processing was performed using amyl acetate to form an opening having a diameter of 500 nm.
  • the obtained substrate was brought into contact with a third generation polyamidoamine dendrimer solution having ethylenediamine as a core and held for a certain period of time to form a coating film containing amino groups.
  • the concentration of the polyamidoamine dendrimer solution varies. For example, it was used at 0.01 mM to 100 mM. Thereafter, ultrasonic treatment was performed while the substrate was immersed in an organic solvent to remove the positive EB resist. The obtained substrate was dipped in an amphoteric surfactant (3- (N, N-dimethyloctadecylammonio) propanesulfonate) solution, and then the solution was removed from the substrate pulled up using a nitrogen blow, and hydrophilic blocking was performed. A membrane was introduced. Although the concentration of the amphoteric surfactant solution varies, for example, it was used at 0.001 wt% to 5 wt%.
  • nucleic acid analysis flow cell was formed by laminating the obtained nucleic acid analysis substrate, a double-sided tape with a hollow portion formed by laser processing, and a cover glass.
  • nucleic acid analysis The sequence primer solution was injected into the flow cell for nucleic acid analysis and held for a certain period of time, and then the flow cell was washed with a buffer solution to remove unreacted sequence primer. Then, after installing the flow cell 716 for nucleic acid analysis in the nucleic acid analyzer 715, nucleic acid analysis was performed. A solution containing a synthetic nucleotide labeled with a dye for sequencing and a DNA synthase (9 ° N mutant DNA polymerase) was injected, and then held at 68 ° C for 10 minutes in a holder unit.
  • a synthetic nucleotide solution not labeled with a dye was injected and kept at 68 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the flow path in the nucleic acid analysis flow cell 716 was washed with the SPSC buffer to remove unreacted nucleotides. After the nucleic acid analysis flow cell 716 was moved by the stage unit 718, the detection unit 723 applied excitation light to detect fluorescence introduced into a plurality of DNA samples in the detection region.
  • a Na 2 PdCl 2 / P (PhSO 3 Na) 3 aqueous solution was injected into the flow cell 716 for nucleic acid analysis, and then kept at 60 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the buffer solution was injected into the flow cell 716 for nucleic acid analysis and washed.
  • the DNA sequence was determined by repeating the above-described single-base extension reaction, additional single-base extension reaction, fluorescence detection, and fluorescent substance removal cycle.
  • DNA sample in this example can be similarly applied to other nucleic acids.
  • nucleic acid reactions can be performed using the flow cell for nucleic acid analysis or the nucleic acid analyzer of the present invention, and nucleic acids such as DNA sequences can be analyzed.

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Abstract

ＤＮＡなどの核酸の塩基配列を決定するシーケンス反応において、シーケンス反応中の反応基板上に固定化されたＤＮＡサンプルの剥がれを防止し、固定率が高く、分析精度が高い核酸分析用基板、核酸分析用フローセルが求められる。　本発明は、基板上にスポットを配置し、スポット上に樹状高分子からなるアミノ基を含むコーティング膜を備え、親水性ブロッキング層を備える核酸解析用基板を提供する。

Description

核酸分析用基板、及び核酸分析用フローセル
　本発明は、核酸分析用基板、及び核酸分析用フローセルに関する。
　ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
　現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して塩基配列決定する。
　これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。
　非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担時する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
　非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
　非特許文献３では、基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄や，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。
　非特許文献４では、シリコンウェハ上に測定配列を格子状に整列させた基板を用いたシーケンス技術が開示されている。測定サンプルＤＮＡ　を断片化した後、制限酵素による切断とアダプター配列の挿入を経てサンプルＤＮＡに由来する複数の環状テンプレートを作成する。得られた環状テンプレートにポリメラーゼ酵素を付与し、サンプルＤＮＡ由来の測定配列が繰り返し連なるＤＮＡボールを作製する。得られたＤＮＡボール含む溶液を結合サイトがクリッド状に配置されたシリコンウェハ上にローディングすることで、測定サンプルが格子配置した測定用基板を作製する。この様にして得られた測定基板上でライゲーション反応を行い試料ＤＮＡの配列状を得る。
　以上のように、基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。
　これらに使われる基板が、特許文献１や特許文献２に開示されている。特許文献１では、サンプルＤＮＡが結合するスポットが基板上に格子配置されている。基板にはシリコンウェハが用いられ、フォトリソグラフィ技術とエッチング技術で作られる。シリコンウェハ上に疎水性のＨＭＤＳ（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌｉｚａｎｅ）層を形成した後、ポジ型レジストを塗布する。フォトリソグラフィ技術を用いてレジストの所定の位置に開口部を設けた後、酸素プラズマを用いて開口部底のＨＭＤＳを除去する。その後、ウェハをアミノシラン気相中に保持し、開口部底にアミノシランを導入する。ウェハ上にレジスト塗布した後ダイシング加工し基板を切り出す。切り出された基板上のレジストを有機溶剤用いた超音波洗浄で除去した後、ポリウレタン製接着材を介してカバーガラスを貼りつけ核酸分析用のフローセルを作製する。親水性が高くＤＮＡ固定可能なアミノシランをＤＮＡボール固定スポットに用い、その他の領域にＤＮＡの吸着を防ぐ疎水性のＨＭＤＳを用いることで、ＤＮＡボール含む溶液を基板上に導入した時、自然にＤＮＡボールをスポット上にのみ固定することを可能にしている。特許文献２では、スライドガラス上にアミノシランをコ－ティングし、２価性の架橋試薬１，４－ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎ－ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅで活性化した後、カスタムスポッティング装置を用いて、５’末端がアミノ化されたＤＮＡオリゴマーを格子状に配置している。この後、ＤＮＡオリゴマーとＤＮＡサンプルをハイブリダイズさせてＤＮＡサンプルを格子状に固定している。
米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０２７０２７３号 米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００１８０２４号
Ｎａｔｕｒｅ　２００５，ｖｏｌ．４３７，ｐｐ．３７６－３８０． Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００５，ｖｏｌ．３０９，ｐｐ．１７２８－３２． Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００８，ｖｏｌ．３２０，ｐｐ．１０６－１０９． Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１０，Ｖｏｌ．３２７，ｐｐ．７８－８１．
　特許文献１や特許文献２の基板では、コーティングをされたアミノシラン中のアミノ基密度が低いため、固定化されたＤＮＡサンプルがシーケンス反応中にはがれてしまう課題がある。このはがれは、反応温度が６０℃以上の条件で大きな課題となる。また、読み取り塩基長が長い場合やｐａｉｅｄ－ｅｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇなど、反応時間がより長い場合にさらに大きな問題となる。また、増幅コピー数が多くそのサイズが大きいＤＮＡサンプルは、シーケンス反応で得られる信号強度が高いため、読み取り塩基長を長く分析の精度を高められるメリットがある。しかし、この様な大きなＤＮＡサンプルは、特許文献１の基板では固定率を高く固定できない課題がある。この場合の固定率とは、基板上のスポットに対して、ＤＮＡサンプルが一つだけ固定されたスポットの割合である。特許文献１や特許文献２の基板では、直径３００ｎｍを超える大きなＤＮＡサンプルを用いた場合、隣のＤＮＡサンプルと連なって固定されてしまうため、検出時に隣のＤＮＡサンプルの信号が混ざってしまい分析の精度が低くなってしまう課題がある。
　本発明は、従来の基板の上記の問題点を解決し、シーケンス反応中にＤＮＡサンプルがはがれることなく、ＤＮＡサンプルを高効率、高密度、且つサンプル同士を分離して強固に固定し、単位面積当たりに分析できるＤＮＡサンプル数を増やし、且つ分析精度が高い核酸分析用基板、核酸分析用フローセルを提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために本発明は、シーケンス反応中にＤＮＡサンプルがはがれることなく、ＤＮＡサンプルを高効率、高密度、且つサンプル同士を分離して強固に固定し、単位面積当たりに分析できるＤＮＡサンプル数を増やし、且つ分析精度が高い核酸分析用基板、核酸分析用フローセルを提供することを完成させた。
　本願は上記課題を解決する手段を含んでいるが、一例をあげるならば、核酸の塩基配列を決定する核酸分析装置に用いる核酸分析用基板において、核酸試料が固定されるスポットを備える領域と、親水性ブロッキング膜を備える領域とを有し、前記スポット上に複数のアミノ基を含むコーティング膜を備えることを特徴とする核酸分析用基板、核酸分析用フローセルを提供する。
　ＤＮＡサンプル溶液を基板上に接触させて、所定の時間保持することで、ＤＮＡサンプルをスポット上に固定することができる。この時、スポットがない領域に親水性ブロッキング膜を設けることで、ＤＮＡサンプルの基板へのアクセシビリティを高めるとともに、この領域へのＤＮＡサンプルの吸着を防ぐことができ、存在するスポットに対するＤＮＡサンプルが固定されたスポットの割合を高めることができる。
　また、本発明は、該親水性ブロッキング層が疎水性膜と親水性ブロッキング膜からなることを特徴とする。疎水性膜が親水性ブロッキング層の下地膜となることで、シーケンス溶液が基板と親水性ブロッキング層の界面、及び疎水性膜と親水性ブロッキング膜との界面に浸透しづらくなるため、シーケンス反応中の親水性ブロッキング層のはがれを防止することができる。
　また、本発明は、アミノ基を含むコーティング膜が樹状高分子からなることを特徴とする。樹状高分子にはその分子内に数多くのＤＮＡ結合性官能基を持たせることができるため、スポット上のアミノ基密度を高めることができる。高いアミノ基密度はＤＮＡサンプルとスポットとの間の結合密度を高めることができるため、シーケンス反応中にＤＮＡサンプルがはがれることを防ぐことができる。また、高いアミノ基密度はＤＮＡサンプルとスポット上の結合性官能基との接触確率を高めることができ、基板上のスポット数に対するＤＮＡサンプルが固定されたスポットの割合も高めることができる。
　また、本発明は、アミノ基を含むコーティング膜が共有結合を介してスポット上にコーティングされていることを特徴とする。強固な共有結合により、シーケンス中にコーティング膜がスポットからはがれることを防止することができる。
　また、本発明は、親水性ブロッキング膜が疎水性結合を介して疎水性膜上に形成されていることを特徴とする。疎水基を有する界面活性剤溶液を基板上に接触させる簡便な方法で、疎水基と疎水性膜の間で形成される疎水性結合用いて、スポットがない領域に親水性ブロッキング層を導入することができる。
　また、本発明は、親水性ブロッキング膜が分子内に疎水基を持つアニオン界面活性剤、または両性界面活性剤、あるいはそれらの少なくとも混合物の群から選択されることを特徴とする。アニオン界面活性剤は分子内に疎水基と水に溶かしたときにマイナスに帯電する親水基を持つ。本発明では、疎水基が基板上の疎水性膜と結合し、その反対側の親水基が基板上の最表面を親水性に変化させる。基板上のマイナスに帯電した親水基が、同じくマイナスに帯電するＤＮＡサンプルに対し、電気的な反発によりこの領域への吸着を防ぐ。また、本発明の両性界面活性剤は、アルカリ性領域ではマイナスに帯電する官能基と酸性領域ではプラスに帯電する官能基を持つ。同様に、マイナスに帯電する親水基より、スポットがない領域へのＤＮＡサンプルの吸着を防ぐことができる。両性界面活性剤はアニオン界面活性剤よりも水への溶解性が高いため、基板へ接触させる溶液中の濃度を高めることができ、より高密度な親水性ブロッキング膜を形成することができる。
　また、本発明は、スポットが格子状に配置されていることを特徴とする。格子状に配置することでスポット密度を高めることができる。
また、本発明は、前核酸分析用基板と中抜きシートとカバーガラスを貼り合わせたことを特徴とする。中抜きシートの厚さを薄くすることで、一回の分析に必要なサンプル量と試薬量を減らすことができ、１回の分析に必要なコストを低減することができる。
　また、上記した以外の課題、構成及び効果は以下の実施例の説明により明らかにされる。
本発明の核酸分析用基板の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用基板の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用基板を作製するための一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用フローセルを用いた核酸分析方法の一例を説明するための図である。
　以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
　ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
　図１に本発明の核酸分析用反応基板の一例を示す。基板１０１上にスポット１０２が形成され、このスポット１０２上に複数のアミノ基を含むコーティング膜１０４が形成されて、スポット１０２がない領域上に親水性ブロッキング層１０３がコーティングされる。この基板にＤＮＡサンプルを含む溶液を接触させることで、スポット上にＤＮＡサンプルを高密度に固定することができる。
　基板１０１に用いられる材料としては、特に制限なく、例えば、シリコン、ガラス、石英、サファイア、セラミック、フェライト、アルミナ、ダイヤモンドなどの無機材料、またはアルミニウム、ＳＵＳ、チタン、鉄などの金属材料、またフェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、透明ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリアミド、ナイロン、ポリアセタール、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、グラスファイバー強化ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィン、ポリフェニレンスルファイド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、非晶ポリアリレート、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、などの樹脂材料及びこれらの混合材料やガラス繊維や炭素繊維強化無機材料を用いることもできる。これらの材料のなかで、ＤＮＡサンプルを蛍光で分析する場合や、分析中に温度の上げ下げが行われる場合などは、自家蛍光が低く、熱膨張係数が小さく、且つ分析溶液の耐性が高いシリコン、ガラス、石英、ＳＵＳ、チタンなどが特に望ましい。
　スポット１０２は、スポッティング装置や、Ｌｉｆｔ－ｏｆｆプロセスを用いて形成される。用いられる材料としては、基板上に共有結合を介して形成できるようなものが良い。このような材料としては、基板表面に酸化膜を持つシリコン、ガラス、石英、サファイア、セラミック、フェライト、アルミナなどの無機材料やアルミニウム、ＳＵＳ、チタン、鉄などの金属材料を用いる場合は、特にシランカップリング材が望ましい。また、シランカップリング材のなかでも、共有結合を介してアミノ基を含むコーティング膜を形成できるような反応性が高い官能基を持つものが良く、この様な官能基としては、例えば、ビニル基、エポキシ基、スチリル基、メタクリル基、アクリル基、アミノ基、ウレイド基、イソシアネート基、イソシアヌレート基、メルカプト基を分子内に持つエトキシシランやメトキシシランが挙げられる。また、基板にシリコンを用いて、アルケン類やアルキン類を用いて形成しても良い。また、ポリジアリルジアンモニウムやポリリジンの様なカチオン性高分子を用いても良い。
　一つのスポット１０２に複数種類のＤＮＡサンプルが固定されると、複数種類のＤＮＡサンプルからの蛍光色素が検出されるので誤検出となる可能性がある。一方、サンプル固定用スポット１０２が小さいと溶液中のＤＮＡサンプルとの接触確立が低下し、ＤＮＡサンプルが固定されていないスポットが増え、ＤＮＡ塩基配列決定のスループットが低下する場合がある。そのため、スポット１０２の直径は、一個のＤＮＡサンプルが固定率高く固定でき、検出感度が良好となるスポットサイズが良い。この様なスポットの直径サイズとして、ＤＮＡサンプルの半分よりも大きいようなサイズが良く、例えば、直径２５ｎｍ以上のサイズが挙げられるが、より良好なスポット直径サイズとして直径５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下が挙げられる。
　用いられるＤＮＡサンプルには特に制限はないが、ＤＮＡサンプルの大きさはスポット直径の１／２よりも大きい方が望ましい。ＤＮＡサンプルのサイズが、スポット直径の１／２よりも小さいと一つのスポットに複数個のＤＮＡサンプルが固定されてしまう可能性があるため、誤検出の問題が生じる場合がある。一般に、ＤＮＡサンプルはそのサイズが５０ｎｍ未満と小さいが、本発明に用いられる増幅ＤＮＡサイズは、良好な検出感度を得るためにも５０ｎｍ以上がのぞましい。
　また、スポットの中心と中心の間の距離であるピッチは、少なくとも用いるＤＮＡサンプルのサイズよりも若干大きい方が望ましい。ピッチがＤＮＡサンプルのサイズよりも小さいと複数のスポットにまたがって固定されてしまう可能性があるため、先の誤検出の問題が生じる場合がある。一方、ピッチが大きすぎると固定されるＤＮＡサンプルの密度が下がり、一度に分析できるＤＮＡサンプルの個数が減ってしまう問題が生じる場合がある。従って、ピッチはスポットサイズと同様に５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下が望ましい。
　本発明における親水性ブロッキング層、親水性ブロッキング膜とは、親水性を持ち、ＤＮＡなどの核酸が吸着しにくい層や膜を指す。親水性ブロッキング層１０３は、ＤＮＡサンプルの基板１０１への吸着を防ぎ、且つＤＮＡサンプルの基板へのアクセシビリティを高めてスポットへのＤＮＡサンプル固定率を高められるものが良い。この様な材料としては、例えば、マイナスに帯電した親水基を最表面にすることが可能な材料が良い。基板上のマイナスに帯電した親水基が、同じくマイナスに帯電するＤＮＡサンプルに対し、電気的な反発によりこの領域への吸着を防ぐ。例えば、末端がポリエチレングリコールやカルボン酸で処理されたシランカップリング材、例えば、ＰＥＧ－Ｓｉｌａｎｅなどが挙げられる。
　その他、前述のスポット１０２で記述したシランカップリング材を用いて反応性が高い官能基を導入した後、これらの官能基を二価性の架橋試薬等で処理した後、最表面にポリエチレングリコールやカルボン酸などの親水性の官能基を導入しても良い。
　複数のアミノ基を含むコーティング膜１０４は、ＤＮＡサンプル固定時にＤＮＡサンプルとスポット上の官能基との接触率を高めるとともに、分析中にＤＮＡサンプルがはがれなくするために、表面のアミノ基密度が高い材料を用いることが望ましい。この様なコ－ティング膜としては、例えば、スポット上に導入された官能基と一分子内に複数のアミノ基を持つポリアミン類を用いることが望ましい。例えば、ポリアミンとしては、スペルミジン、プトレシン、スペルミンなどが挙げられるが、分子内に存在するアミノ基が多い樹状高分子が特に好ましい。この様な樹状高分子としては、例えばポリアミドアミンデンドリマーが挙げられる。ポリアミドアミンデンドリマーはアルキルジアミンのコアと三級アミンの分岐構造からなる。コアと分子としては、エチレンジアミン、１，１２－ジアミドデカン、１，４－ジアミノブタン、シスタミン、１，６－ジアミノヘキサンなどがある。樹状分子は、コア分子を取り巻く世代を増やすことで分子内の官能基を指数関数的に増やすことができる。本発明では、第一世代以降の樹状分子を用いることで、コーティング表面のアミノ基密度を大きく増やすことができる。
　これらのポリアミン類は、スポット上の官能基と共有結合を形成している方が、スポットとコ－ティング膜の界面でのはがれを防止できる点で望ましい。この様なスポットを形成する材料としては、分子内にアミノ基と反応可能な官能基を持つ材料が望ましく、例えば、ビニル基、エポキシ基、メタクリル基、アクリル基、イソチオシアヌレート基、イソシアネート基、イソシアヌレート基などを持つシランカップリング材、アルケン類、アルキン類などが挙げられる。また、スポット表面に反応性官能基を導入した後、多価性の架橋試薬を用いて、スポット上にアミン反応性の官能基を導入しても良い。この様な、アミン反応性の官能基としては、例えば、イソチオシアヌレート基、イソシアネート基、イソシアヌレート基、スルフォニルクロライド基、アルデヒド基、カルボジイミド基、アクリルアジド基、ルオロベンゼン基、カルボネート基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、エポキシ基、フルオロフェニルエステル基、酸無水物などが挙げられる。
　図２に本発明の核酸分析用反応基板の更なる一例を示す。図１との違いは、親水性ブロッキング層２０３が、疎水性膜２０５と親水性ブロッキング膜２０６からなる点である。本発明の形態では、疎水性膜２０５が、スポット２０２がない全ての領域、ならびにスポット２０２の側面を覆っている。また、図示はしていないが、疎水性膜２０５がアミノ基を含むコーティング膜２０４の側面まで覆ってもよい。一般に、疎水性膜は水をはじく性質がある。このため、疎水性膜２０５がスポット２０２の保護膜となるため、分析で用いられる溶液によるスポット２０２へのダメージを抑えることができる。この様な疎水性膜を形成する材料としては、フッ素樹脂、フッ素化シランカップリング材、アルキルシランカップリン材、ＨＭＤＳの様なアルキル化材料が挙げられる。
　親水性ブロッキング膜２０６は、界面活性剤を用いて導入される。一般に、界面活性剤は分子内に疎水基と親水基を持っており、この疎水基と疎水性膜２０５の間に形成される疎水性結合を用いて親水性ブロッキング膜２０６が導入される。界面活性剤としては、分子内に疎水基を持つアニオン界面活性剤、両性界面活性剤、あるいは、それらの少なくとも２種類以上の混合物から選択される界面活性剤が望ましい。一般に、アニオン界面活性剤は水に溶かしたときにマイナスに帯電する親水基を持つ。本発明では、疎水基が基板上の疎水性膜と結合し、その反対側の親水基が基板上の最表面を親水性に変化させる。基板上のマイナスイオンに帯電した親水基が、同じくマイナスに帯電するリン酸基を持つＤＮＡサンプルに対し、電気的な反発によりこの領域へのＤＮＡサンプルの吸着を防ぐ。一方、両性界面活性剤は、アルカリ性領域ではマイナスに帯電する官能基と酸性領域ではプラスに帯電する官能基を持つ。同様に、そのマイナスに帯電する親水基により、スポットがない領域へのＤＮＡサンプルの吸着を防ぐことができる。一般に、両性界面活性剤はアニオン界面活性剤よりも水への溶解性が高いため、基板へ接触させる溶液中の界面活性剤の濃度を高めることができ、より高密度な親水性ブロッキング膜を形成することができる。
　アニオン界面活性剤や両性界面活性剤に含まれる疎水基としては、より高密度な親水性ブロッキング膜を形成できる長鎖のアルキル鎖が望ましい。
　この様なアルキル鎖としては、例えば、炭素鎖の長さが８個以上のオクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。活性剤に含まれる親水基としては、ＤＮＡサンプルの吸着を防止できるものが望ましく、この様な親水基としては、例えば、スルホネート基やカルボネート基が挙げられる。この様なアニオン界面活性剤としては、例えば、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。一方、両性界面活性剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシンベタイン、オクチルスルホベタイン、カプリリルスルホベタイン、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホン酸、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナート、３－（ベンゼンメチルアンモニオ）プロパンスルホン酸などが挙げられる。
　図３に本発明の核酸分析用基板を作製するための一例を示す。本発明は、Ｌｉｆｔ－ｏｆｆプロセスを用いて作製することができる。基板３０１上に疎水性膜３０５をコーティングした後（図３－ａ）、さらにリソグラフィ材料３０７をコーティングする（図３－ｂ）。その後、リソグラフィを用いて開口部３０８を形成した後（図３－ｃ）、スポット３０２を形成する材料を蒸着する（図３－ｄ）。その後、アミノ基を含むコーティング膜３０４を形成するための材料を蒸着した後（図３－ｅ）、リソグラフィ材料３０７を除去する。最後に、界面活性剤を含む溶液を接触させて親水性ブロッキング膜３０６を導入する（図３－ｇ）。また、本発明のさらなる形態として、工程図３－ｇは行わずに、ＤＮＡサンプルを含む溶液中に界面活性剤を溶解させて、この溶液を本発明の核酸分析用基板に接触させて、ＤＮＡサンプルをスポット上に固定させるのと同時に、親水性ブロッキング膜３０６を導入しても良い。本実施例では、フォトリソグラフィ技術を用いた例を示したが、ナノインプリントリソグラフィ技術を用いても良い。
　図４に本発明の核酸分析用フローセルを示す。フローセルは、核酸分析用基板４０９、中央部がくり抜かれた中抜き部４１０を持つ中抜きシート４１１、カバーガラス４１２を貼合わせる。中抜き部４１０と核酸分析用基板４０９とカバーガラス４１２で囲まれた中空部が流路となる。注入口４１３と排出口４１４が液の出入口となる。図４の実施例では、核酸分析用基板４０９の穴が注入口４１３、排出口４１４となっているが、別の形態では、カバーガラス４１２の穴が注入口、及び排出口となっても良い。また、さらなる別の形態として、中抜きシート４１１の側面に開けられた穴が注入口、及び排出口となっても良い。
　このようにして作製した核酸分析用フローセルを、核酸分析装置にセットし核酸分析を行う。核酸分析装置７１５は、本発明の核酸分析用フローセル７１６、核酸分析用フローセル７１６を固定し、なおかつ核酸分析用フローセル７１６の温度を調整することができるホルダユニット７１７、核酸分析用フローセル７１６とホルダユニット７１７を移動させるステージユニット７１８、複数の試薬や洗浄水が収容された試薬容器７１９、試薬容器７１９に収容された試薬を吸引し核酸分析用フローセル７１６に注入するための駆動源である送液ユニット７２０、試薬の吸引・吐出の際、実際に試薬容器７１９や核酸分析用フローセル７１６にアクセスするノズル７２１、ノズル７２１を搬送させるノズル搬送ユニット７２２、核酸分析用フローセル７１６に固定された試料を観察するための検出ユニット７２３、及び廃液を収容する廃液容器７２４等を有する。検出ユニットは、例えば、蛍光検出装置からなり、ステージユニット上の核酸分析用フローセルに励起光を照射し、発生した蛍光を検出することができる。
　核酸分析装置は以下の通りに動作する。まず、測定対象の核酸試料を保持した核酸分析用フローセル７１６をホルダユニット７１７に設置する。次に、ノズル７２１が試薬容器７１９にアクセスし、試薬を送液ユニット７２０により吸引する。ノズル７２１は、ノズル搬送ユニット７２２により核酸分析用フローセル７１６上面に搬送され、核酸分析用フローセル７１６に試薬を注入する。そして、ホルダユニット７１７にて、核酸分析用フローセル７１６の流路内に含まれた核酸試料と試薬を温度調整することで反応が起こる。反応した核酸試料を観察するために、核酸分析用フローセル７１６をステージユニット７１８にて移動させ、励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料の蛍光を検出する。この際、好ましくは、核酸試料が固定された側の基板を通して励起光を当て、蛍光を検出すればよい。検出後、核酸分析用フローセル７１６を微小に動かし同様の方法で検出、という動作を複数回繰り返す。全ての検出領域で観察が終了したら、試薬容器７１９に収容された洗浄水を送液ユニット７２０により吸引し、核酸分析用フローセル７１６へ注入することで、核酸分析用フローセル７１６の流路内を洗浄する。また、別の試薬を注入し検出、という動作を複数回繰り返すことで、核酸試料を読み取ることが出来る。核酸分析装置は、コンピュータにより制御され、上記動作を自動的に行うことができる。
　本発明の核酸分析装置を用いて種々の核酸分析を実施することができ、例えば、ＤＮＡ配列決定やハイブリダイゼーションを行うことができる。特に本発明の核酸分析装置を用いてＤＮＡ配列決定（ＤＮＡシークエンス）を行うことができる。ＤＮＡシークエンスの方法は限定されないが、可逆的なターミネータを用いた段階的合成法（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に用いることができる。本発明の核酸分析用フローセルにＤＮＡサンプルが溶解した溶液を注入した後、一定時間保持してスポット上にＤＮＡサンプルを固定する。その後、固定されたＤＮＡサンプルにシーケンスプライマをハイブリダイゼーションさせた後にＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法を用いて塩基配列を決定する。該方法により、１サイクルで数十～数百ｂｐの解読を行うことができ、１ランで数十Ｇｂのデータを解析することが可能である。
　本発明の核酸分析用フローセルを用いた核酸分析方法の例を説明する。
　（１）核酸分析用基板の作製
　核酸分析用基板の作製は、Ｌｉｆｔ－ｏｆｆプロセスに準じた。シリコンウェハ上にＨＭＤＳをコーティングした後ベーキングして疎水性膜を導入した。ポジ型ＥＢレジスト（ＺＥＰ－５２０Ａ７）を塗布した後、ＥＢフォトリソグラフィ装置（Ｅｌｉｏｎｉｘ　ＥＬＳ－７５００）を用いて露光した。その後、酢酸アミルを用いて現像処理を行い直径５００ｎｍの開口部を形成した。３－イソシアネートプロピルトリエトキシシランを蒸着した後、得られた基板をエチレンジアミンをコアとする第３世代のポリアミドアミンデンドリマー溶液に接触させて一定時間保持し、アミノ基を含むコーティング膜を形成した。ポリアミドアミンデンドリマー溶液の濃度は様々であるが、例えば、０．０１ｍＭ～１００ｍＭで使用した。その後、有機溶剤中に基板を浸漬しながら超音波処理を行いポジ型ＥＢレジストを除去した。得られた基板を両性界面活性剤（３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナート）溶液中に浸漬した後、窒素ブローを用いて引き上げた基板から溶液を除去し、親水性ブロッキング膜を導入した。両性界面活性剤溶液の濃度は様々であるが、例えば０．００１ｗｔ％～５ｗｔ％で使用した。
　（２）核酸分析用フローセルの作製
　得られた核酸分析用基板とレーザ加工により中抜き部が形成された両面テープとカバーガラスを貼り合わせて核酸分析用フローセルを形成した。
　（３）ＤＮＡサンプル作製
　環状ＤＮＡテンプレートより得られた増幅ＤＮＡサンプルを作製した。２種類の９０塩基長の合成オリゴマーにポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、２６塩基長のオリゴヌクレオチドとＡｍｐＬｉｇａｓｅを用いて環状化した。環状化反応は、９４℃／２分と４０℃／１０分のサイクル反応を３サイクル行った。その後、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩとＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅIIIを加えて残っている直鎖のテンプレートを分解した。得られた環状テンプレートにＰｈｉ２９とｄＮＴＰを加えた後３０℃に７０時間保持し、増幅ＤＮＡサンプルを作製した。得られた増幅ＤＮＡサンプルはＭｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ－５０フィルターを用いて精製した。
　（４）核酸分析用フローセルへのＤＮＡサンプルの固定
　ＤＮＡサンプルを含む水溶液を本発明の核酸分析用フローセルに注入し、室温で２時間保持し、サンプル固定用スポット２０６にＤＮＡボールを固定した。その後、緩衝溶液を用いてフローセル内を洗浄し、未固定のＤＮＡサンプルを除去した。
　（５）核酸分析
　核酸分析用フローセル内にシーケンスプライマ溶液を注入して一定時間保持した後に、フローセル内を緩衝溶液で洗浄して未反応のシーケンスプライマを除去した。その後、核酸分析装置７１５に核酸分析用フローセル７１６を設置した後、核酸分析を行った。配列決定用の色素でラベル化された合成ヌクレオチドとＤＮＡ合成酵素（９°Ｎ　ｍｕｔａｎｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を含む溶液を注入した後、ホルダユニットで６８℃で１０分保持した。その後、未反応で残っているＤＮＡサンプルの１塩基伸長反応を終わらせるために、色素でラベル化されていない合成ヌクレオチド溶液を注入して、さらに６８℃で１０分間保持した。その後、ＳＰＳＣバッファーで核酸分析用フローセル７１６内の流路を洗浄し、未反応のヌクレオチドを除去した。核酸分析用フローセル７１６をステージユニット７１８にて移動させた後、検出ユニット７２３にて励起光を当てて検出領域内にある複数のＤＮＡサンプルに導入された蛍光を検出した。その後、ＤＮＡサンプルに導入された蛍光物質を除去するため、核酸分析用フローセル７１６にＮａ２ＰｄＣｌ２／Ｐ（ＰｈＳＯ３Ｎａ）３水溶液を注入した後６０℃で５分保持した。その後、核酸分析用フローセル７１６に緩衝溶液を注入して洗浄した。
前述の一塩基伸長反応、追加の一塩基伸長反応、蛍光検出、蛍光物質除去のサイクルを繰り返しＤＮＡ配列を決定した。
　また、本実施例におけるＤＮＡサンプルは他の核酸についても同様に実施可能である。
　本発明の核酸分析用フローセル又は核酸分析装置を用いて、種々の核酸反応を行うことができ、ＤＮＡシーケンス等の核酸の分析を行うことができる。
１０１，２０１，３０１　基板
１０２，２０２，３０２，４０２　スポット
１０３，２０３　親水性ブロッキング層
１０４，２０４，３０４　アミノ基を含むコ－ティング膜
２０５，３０５　疎水性膜
２０６，３０６　親水性ブロッキング膜
３０７　　リソグラフィ材料
３０８　開口部
４０９　核酸分析用基板
４１０　中抜き部
４１１　中抜きシート
４１２　カバーガラス
４１３　注入口
４１４　排出口
７１５　核酸分析装置
７１６　核酸分析用フローセル
７１７　ホルダユニット
７１８　ステージユニット
７１９　試薬容器
７２０　送液ユニット
７２１　ノズル
７２２　ノズル搬送ユニット
７２３　検出ユニット
７２４　廃液容器

Claims (15)

  1. 　核酸の塩基配列を決定する核酸分析装置に用いる核酸分析用基板において、
    　核酸試料が固定されるスポットを備える領域と、親水性ブロッキング膜を備える領域とを有し、
    　前記スポット上に複数のアミノ基を含むコーティング膜を備えることを特徴とする核酸分析用基板。
  2. 　請求項１において、
    　前記親水性ブロッキング膜がマイナスに帯電する親水基を最表面に配置することを特徴とする核酸分析用基板。
  3. 　請求項１において、
    　前記親水性ブロッキング膜の下に疎水性膜を備えることを特徴とする核酸分析用基板。
  4. 　請求項３において、
    　前記親水性ブロッキング膜が疎水性結合によって前記疎水性膜上に形成されていることを特徴とする核酸分析用基板
  5. 　請求項１において、
    　前記親水性ブロッキング膜は、界面活性剤の構造を持つことを特徴とする核酸分析用基板。
  6. 　請求項５において、
    　前記親水性ブロッキング膜がアニオン界面活性剤または、両性界面活性剤、または、少なくともそれらの混合物を含む構造を持つことを特徴とする核酸分析用基板。
  7. 　請求項１において、
    　前記コーティング膜が樹状高分子からなることを特徴とする核酸分析用基板。
  8. 　請求項１において、
    　前記コーティング膜が、共有結合を介して前記スポット上にコーティングされていることを特徴とする核酸分析用基板。
  9. 　請求項１において、
    　前記スポットが格子状に配置されていることを特徴とする核酸分析用基板。
  10. 　核酸試料が固定されるスポットを備える領域と、親水性ブロッキング膜を備える領域とを有し、前記スポット上に複数のアミノ基を含むコーティング膜を備える核酸分析用基板と、中抜きシートとカバーガラスを備えることを特徴とする核酸分析用フローセル。
  11. 　請求項１０において、
    　前記親水性ブロッキング膜がマイナスに帯電する親水基を最表面に配置することを特徴とする核酸分析用フローセル。
  12. 　請求項１０において、
    　前記親水性ブロッキング膜の下に疎水性膜を備えることを特徴とする核酸分析用フローセル。
  13. 　請求項１２において、
    　前記親水性ブロッキング膜が疎水性結合によって前記疎水性膜上に形成されていることを特徴とする核酸分析用フローセル。
  14. 　請求項１０において、
    　前記親水性ブロッキング膜は、界面活性剤の構造を持つことを特徴とする核酸分析用フローセル。
  15. 　請求項５において、
    　前記親水性ブロッキング膜がアニオン界面活性剤または、両性界面活性剤、または、少なくともそれらの混合物を含む構造を持つことを特徴とする核酸分析用フローセル。
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